CN115960872A - 一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用，角蛋白酶是如下(a)或(b)所示的蛋白质：(a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的，具有角蛋白降解活性的蛋白质。所述角蛋白酶与酸性蛋白酶顺序分批使用，降解鸡毛、猪毛等废弃角蛋白，所制备的低分子量角蛋白水解物具有两个特征分子量分布，即：3‑6kDa与小于1kDa。利用本发明制备的角蛋白水解物具有更高的毛发结合稳定性，在温和表面活性剂存在条件下，不易从毛发表面洗脱。

Description

一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用

技术领域

本发明涉及酶工程领域。更具体地，涉及一种角蛋白酶及其编码基因以及利用酶催化制备精细化学品(角蛋白水解物)的应用。

背景技术

角蛋白酶作为一种独特的蛋白酶，可以特异性水解角蛋白废弃物，如废弃羊毛，禽类羽毛和其他类型畜毛等。禽畜角蛋白副产品每年在全球范围内大量生产，但由于其结构紧密和高二硫键含量，很难处理。这种废物的积累引起了环境问题和资源浪费。相较于酸碱处理、高压蒸煮、机械喷爆等角蛋白回收利用工艺，角蛋白酶介导的角蛋白水解工艺具有条件温和、低污染排放、高效率、低加工成本等优势。

角蛋白酶可以由自然界中的多种微生物产生。这些微生物中的大多数是从富含角蛋白的环境中分离出来的，例如羽毛堆场，家禽粪便和屠宰场废物填埋场等。海洋环境也是产生角蛋白酶的菌株的重要来源，从海洋褐藻中分离出淀粉样芽孢杆菌S13，发现可产生两种角质酶。近年来，研究人员发现动物肠道消化系统还含有产生角蛋白酶的菌株。从狼蛛的肠道中分离出一种新的枯草芽孢杆菌菌株，并显示出角蛋白酶对羽毛，羊毛，杂草和油脂的降解活性。通过环境微生物中新型角蛋白的识别与功能发掘，以及已知角蛋白结构改造，可以开发出在催化效率、底物亲和性、产物专一性、条件耐受性等方面更具优势的角蛋白酶产品，服务于工农业生产。

废弃角蛋白经角蛋白酶部分或完全水解后，水溶性大幅提高。这类角蛋白水解产物的利用方式包括：(1)以氨基酸和小分子蛋白肽形式用于饲料添加剂，提供动物营养；(2)与壳聚糖、聚羟基丁酸等生物材料复合加工，制造可降解的包装与填充材料；(3)角蛋白水解物可作为功效成分应用于护发类产品如香波、护发素等。其中，角蛋白水解物作为护发功效成分的潜在作用机制包括，富含半胱氨酸的小分子角蛋白水解物可以深入毛发真皮层(Cortex)通过与皮层角蛋白之间的相互作用，改善发质。此外角蛋白水解物还可以附着于毛发表皮层(Cuticle)，防御染烫过程的发质损失，以及改善毛发的保水性等。

作为护发及个人护理品添加剂使用的角蛋白水解物产品，分子量分布至关重要，决定了该产品的主用应用场景及使用效果。通过新型角蛋白酶的筛选及水解工艺优化，制造具有特定分子量分布的角蛋白水解物具有重要的应用价值，这是由于：(1)小分子肽的活性作用取决于角蛋白的水解部位，这往往在宏观上关联于角蛋白水解物的分子量分布特征；(2)使用酶解组合工艺直接制备具有特定分子量分布的角蛋白水解物产品，能够避免采用凝胶色谱、精密超滤等昂贵的蛋白质分离纯化技术，大大降低角蛋白水解物的生产制备成本。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种角蛋白酶及其编码基因以及制备方法和应用，该角蛋白酶具有水解角蛋白并产生具有特殊分子量分布角蛋白水解物的特性。

本发明的另一个目的在于提供上述角蛋白酶用于制备护发类角蛋白水解物的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供一种角蛋白酶，被命名为KerA-WJ-072。该角蛋白酶原始结构基因，克隆获取于浙江舟山污水处理厂厌氧池分离得到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。原始角蛋白酶编码基因，经易错PCR介导的对Inhibitor-I9结构域的随机突变，筛选得到本发明所述角蛋白酶蛋白酶KerA-WJ-072，即如下(a)或(b)所示的蛋白质：

(a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的具有角蛋白降解活性的蛋白质。

其中，所述序列表SEQ ID NO.1所述氨基酸序列由381个氨基酸残基组成。

在本发明中上述角蛋白酶的编码基因也属于本发明的保护范围，所述编码基因如(a)或(b)所示：

(a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列由1146个碱基组成(含终止子)，其编码序列为自5’端第1到第1146位碱基，编码如序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。

需要注意的是，含有本发明上述编码基因的表达载体、细胞系、工程菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种表达上述角蛋白酶的方法，是将含有上述角蛋白酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到角蛋白酶。

其中，所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物、昆虫、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌等，优选为酵母菌。

所述酵母菌优选为巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)，例如巴氏德毕赤酵母X33。

用于构建所述重组枯草杆菌载体及重组酵母菌表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，用于构建重组表达载体的出发载体为pBR322、pHT01、pEB、pPIC9K、pPIC9、pGAPza载体。如可在枯草杆菌中表达的pBE-S载体，以及在巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9K、pPIC9、pGAPza等。

上述重组表达载体均可按常规方法构建。

本发明还提供了所述角蛋白酶单独或与酸性蛋白酶顺序批次使用降解角蛋白的应用。

本发明进一步还提供了经所述角蛋白酶与酸性蛋白酶联用，水解角蛋白制备角蛋白水解物的分子量分布特征，以及该分布特征下作为护发功效成分的应用特性。

本发明中，角蛋白酶的底物可以是各类禽类羽蛋白及畜类毛蛋白的单一品种或组合。优选的，所述角蛋白可以为鸡毛蛋白，猪毛蛋白。

所述角蛋白酶在与酸性蛋白酶顺序批次使用，降解废弃角蛋白，制备低分子量角蛋白水解物的应用，包括：

(a)所选废弃角蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛等禽类羽蛋白以及牛毛、羊毛、猪毛等畜类毛蛋白的单一成分或混合物；

(b)所选废弃角蛋白经加热前处理，提高角蛋白的催化活力的处理方法。所述前处理方法，技术特征在于常压下加热废弃角蛋白与水的混合物，加热温度60-100℃，处理时间0.1-6小时。

(c)所选角蛋白酶催化水解温度为10-60℃，水解pH为5-11；

(d)经角蛋白酶水解后，使用酸性蛋白酶二次水解，酸性蛋白酶为黑曲霉酸性蛋白酶、宇佐美曲霉酸性蛋白酶等微生物来源酸性蛋白酶或猪胃蛋白酶等动物源胃蛋白酶(单一组分或混合物)，水解温度为10-60℃，水解pH为2-7，得到角蛋白水解物。

所述角蛋白酶的编码基因，由重组微生物工程菌原位表达，直接降解废弃角蛋白的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明角蛋白酶具有高效的角蛋白降解活性，能够用于角蛋白废弃物的生物处理，且和酸性蛋白酶联合使用，水解产生的角蛋白水解物具有独特的分子量分布特征3-5kDa及小于1kDa。

本发明所制备的低分子量角蛋白水解物具有两个特征分子量分布，即：3-6kDa与小于1kDa。与常规市售产品相比，利用本发明制备的角蛋白水解物具有更高的毛发结合稳定性，在温和表面活性剂存在条件下，不易从毛发表面洗脱，具有独特的应用优势。

附图说明

下面结合附图、附表对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出携带有Inhibitor-I9区域三重突变的角蛋白突变体KerA-WJ-072在蛋白酶测试奶粉平板上显示出蛋白酶活性优势

图2示出重组表达载体pGAPZa-KerA-WJ072电转化毕赤酵母X33，重组工程菌表达产物的SDS-PAGE图，目标条带分子量35kDa与36kDa理论分子量(切除信号肽区域)接近一致。

图3示出以鸡毛角蛋白为底物，顺序分批使用角蛋白酶KerA-WJ-072以及米黑霉酸性蛋白酶水解下，经凝胶色谱检测角蛋白水解物的分子量分布特征，蓝色实线为实验组(KerA-WJ-072+黑曲霉酸性蛋白酶)呈显著的双分子量分布特征(3.6-5kDa及<1kDa双组份)，浅色虚线为对照组1(地衣芽孢杆菌角蛋白酶+黑曲霉酸性蛋白酶)水解物仅分布于1kDa以下分子量区间，接近于市售1kDa角蛋白酶水解物(深色虚线对照组2)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1枯草杆菌角蛋白酶基因的获得及基于易错PCR的随机突变

1、原始枯草杆菌角蛋白酶基因的获取

采集自舟山污水处理厂的活性污泥样品，经角蛋白培养基(M9基础盐液体培养基+2g/L脱脂羽毛粉)室温富集培养10天，并在同种培养基连续传代5代以上(接种比1/1000)。富集液上清涂布于脱脂奶粉LB平板，观察挑取具有较大透明圈的菌株WJJ-13，接种入LB液体培养基扩大培养，并检测其角蛋白酶活力。经Biolog生化鉴定平板(美国，Hayward)比对，阳性菌株WJJ-13为枯草芽孢杆菌(B.Subtilis),菌株送华大基因(中国，深圳)Hiseq3000平台，完成二代测序，经序列拼接比对分析，得到候选角蛋白酶KerA-WJ-00原始序列，该序列与现有枯草芽孢杆菌角蛋白酶及碱性蛋白酶编码基因序列尽管同属S8-peptidase蛋白酶家族，但在核酸序列水平及氨基酸序列水平与已知实验验证的蛋白酶序列存在较大差异，为深入研究该蛋白的酶学性质，并挖掘其角蛋白酶潜力，对该酶的Inhibitor-I8区域做随机突变研究。根据深度测序所得全基因组序列结果，设计引物F1(5’-GTGAGAAGCAAAAAATTGTGG-3’)及R1(5’-TTATTGCGCTGCTGCCTGAA-3’)，用于扩增目标基因，扩增试剂采用TakaraEXTaq扩增试剂盒(中国，大连)，基因扩增条件按照试剂盒说明推荐条件。

2、易错PCR介导的Inhibitor-I9区域随机突变与活性筛选

以步骤1获取的角蛋白酶KerA-WJ-00原始编码序列为模板，借助百奥来博公司可调式易错PCR对该序列C端信号肽以下序列做随机突变研究。扩增引物F2(5’-GTCTGCACAGGCTGCCGGA-3’)和R2(5’-CAGTTCTTTTACAGCT-3’)，易错PCR扩增，文库构建及扩增文库与枯草杆菌表达载体pBE-S之间的无缝克隆(Seamlesscloning)连接均参考试剂盒推荐的实验条件。

插入突变文库的重组表达载体pBE-S-WJJ以电转化方式转入枯草杆菌表达宿主B.subtilisRIK1285(Takara.日本)，筛选平板为含脱脂奶粉(5g/L)的LB琼脂培养基(卡那霉素+)。筛选得到的高表达阳性克隆如图1所示。挑取阳性克隆，分别转接于液体LB培养基，37℃下，摇瓶隔夜培养(转速250rpm)，培养上清依照标准方法测试角。

3.角蛋白酶活性测定

步骤1及步骤2所述角蛋白酶标准测试方法及活力定义简述如下：将2.0ml含有10mg底物羽毛粉的硼砂-氢氧化钠缓冲液(100mmol/L，pH 10.0)与1.0ml待测酶液混合。在其最适温度下180rpm振荡反应1h后立即加入2.0ml终止剂(10％三氯乙酸)。待反应液放置3-5min后，9000rpm离心10min。取上清液测紫外吸收A280，空白对照为提前加终止剂的样品。酶活定义：与空白对照相比，在酶促反应1h中A280每增加0.01个单位为1U。作为角蛋白酶的重要酶学性质参数(K/C)，则被定义为上述羽毛粉为底物的角蛋白酶活力与酪蛋白酶活力之比。酪蛋白酶活测定仅需将上述羽蛋白粉替换为同浓度酪蛋白纯品(沪试，中国，上海)。

利用上述方法，对RIK1285-WJJ-072等四株酶活正向进化重组枯草杆菌菌株的摇瓶发酵上清液，及对照组RIK1285-WJJ-00(克隆有原始KerA-WJ-00角蛋白酶编码序列)的摇瓶发酵上清液，做角蛋白酶酶活测定，结果见表1。结果显示经Inhibitor-I8区域的随机突变，部分菌株呈现酶活正向进化特征，显示出该方法的有效性。另外，出发原始角蛋白酶和各突变体K/C值都显著大于0.5，呈现高角蛋白酶酶学特征。对Inhibitor-I8区域的突变，对K/C值，无显著影响。

蛋白酶活力，结果见表1。

表1

表1示出携带原始KerA-WJ-00角蛋白酶序列，以及携带四种突变体角蛋白酶序列的重组B.subtilis摇瓶发酵上清液的角蛋白酶活性测试结果。结果显示经过Inhibitor-I9区域突变与平板活性筛选，能够获取在角蛋白活力上显著增加的突变株。所有突变株的测试上清，酶活水平均高于20U/ml,K/C>0.5,具有潜在的工业应用价值。

对利用pBE-S表达载体上推荐的双向测序引物，对正向进化突变体表达质粒中插入序列(RIK1285-WJJ-072)做双向测定，与原始序列(KerA-WJ-00)比较，发生三处有效突变，列于表2。突变体KerA-WJ-072的蛋白质核酸序列及编码基因DNA序列分别录于本发明SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。

表2

编码基因突变位置	对应氨基酸改变
		c.119T>C	p.40I>T
c.240G>C	p.80L>F
		c.245A>T	p.82E>V

表2显示出本发明提交的KerA-WJ-072相比于出发原始角蛋白酶编码序列的核苷酸及氨基酸突变位点。

实施例2高活力角蛋白酶突变体(KerA-WJ-072)编码基因在毕赤酵母宿主中的重组表达

1、角蛋白酶高活力突变体的克隆与序列验证

以实施例1中获得的高表达菌株B.subtilisRIK1285-WJJ-072的全DNA提取物为模板，利用引物F3、R3扩增角蛋白酶阳性突变体基因的序列。其中引物F3：5’-CTCGAGGCCGGAAAAAACAGTGAAGAAAA-3’(划线部分碱基为Xho I位点)，引物R3：5’-GCGGCGCCTTATTGCGCTGCTGCCTGAA-3’(划线部分碱基为Not I识别位点)，扩增产物不含角蛋白酶自身信号肽，借助酵母重组表达载体携带的信号肽编码序列，引导重组蛋白分泌表达。

在PCR反应参考试剂盒推荐反应条件。通过琼脂糖电泳分析获得约1.3kb的单一带，PCR产物检测之后经PCR产物纯化试剂盒纯化，并检测浓度。PCR产物经TA克隆，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pMD18-WJJ-072测序鉴定。该角蛋白酶基因DNA序列和序列表SEQ ID NO.2一致，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示一致。

2、角蛋白酶编码基因序列的重组表达载体的构建

步骤1克隆产物两端具有Xho I和Not I限制性内切酶位点，用Xho I和Not I限制性内切酶对质粒pMD18-WJJ-072和质粒pGAPZAα同时进行双酶切反应。酶切体系50μL：目的片段或质粒20μL，10×Buffer 5μL，Xho I2μL，Not I 2μL，ddH₂O 21μL，酶切条件是37℃反应3h。酶切产物经柱回收后测序验证。目的片段和载体片段用T4DNA连接酶进行体外连接。连接反应体系10μL：目的片段5μL，pGAPZAα载体2μL 10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶(350U/μL)1μL,ddH₂O 1μL，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM109，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后pGAPZAα-KerA-WJ072。对其进行测序，证明克隆连接的DNA序列与序列表SEQ ID NO.2所示序列相同，构建含有角蛋白酶基因序列的重组表达载体pGAPZAα-KerA-WJ072正确无误。

3、角蛋白酶在毕赤酵母中的表达

将重组表达载体pGAPZAα-KerA-WJ072用BspHI限制性内切酶酶切使之线性化后，采用电击方式，将线性化的载体pGAPZAα-KerA-WJ072导入毕赤酵母X33中，经选择性培养基培养，筛选抗博来霉素的高表达菌株。挑取选择性培养基上长出的单菌落接种于5ml YPD液体培养基(酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，28℃培养12-24小时后，转入500mlBMGY培养基(1％酵母膏、2％蛋白胨、酵母氮源(YNB)1.34％、100mM磷酸缓冲液pH6.0、4×10^-5生物素，1％甘油)中继续培养至菌液的OD600＝2-3，调整培养温度为15℃，补加葡萄糖诱导培养，并在此后每隔24小时补加葡萄糖至终浓度为1％，培养至120小时即可停止培养。离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图2所示：泳道1为蛋白标准分子量marker；泳道2为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株在葡萄糖低温诱导下表达的蛋白质的分子量约35KDa，与从氨基酸推段出的理论分子量(36kd)大小一致。

在毕赤酵母中表达的角蛋白酶可以直接分泌到培养液的上清中，上清液中蛋白成分单一，可直接用于酶活性测定。对上述发酵上请，利用Millipore10ml离心式超滤装置(切割分子量10kDa)做浓缩处理，浓缩液冷冻干燥，得KerA-WJ-072角蛋白酶粗品。利用100目脱脂羽蛋白粉，及脱脂猪毛粉分别作为底物，做酶活测试，结果见表3。

表3

表3显示出KerA-WJ-072经毕赤酵母重组表达后，发酵上清经超滤浓缩后，冻干粗品的角蛋白酶比活。测试底物分别为脱脂羽蛋白粉及猪毛粉。

实施例3KerA-WJ-072用于制备角蛋白水解物的生产方法及该方法下角蛋白水解物的应用特性

1、鸡毛原料的预处理

作为原料的白羽鸡鸡毛，0.5％(W/V)氢氧化钠溶液浸泡脱脂2h，期间间歇性机械搅拌混匀。清水洗净、晾干后经小型锤片式粉碎机(山东圣鲁机械厂)粉碎，过筛称量，羽粉分布于30-100目之间。羽粉于常压蒸锅下，蒸制10分钟，室外通风处晾干备用。

2、角蛋白酶与酸性蛋白酶顺序批次水解

取步骤1鸡毛粉10g，与100ml磷酸缓冲液(pH9.0，0.5M)混合，50℃快速磁力搅拌条件下，加入KerA-WJ-072角蛋白酶冻干粉1g，水解2h。随酶反应进行，不溶性羽蛋白粉逐步溶解，溶液呈淡黄色。角蛋白酶水解结束，加盐酸调节pH＝4终止反应，调节水浴温度为40℃，继续快速磁力搅拌，加入10万U黑曲霉酸性蛋白酶粉(广西，庞博生物)1g，酸性条件下水解1h，调节pH至中性，终止反应。

3、角蛋白水解物的分子量分布测定(凝胶色谱法)

角蛋白水解物采用凝胶色谱分析分子量分布特征。使用LC-20A高效液相色谱(HPLC)系统(日本，岛津)配置TSK凝胶G2000 SWXL色谱柱(日本Tosoh)来评估分子量分布。乙腈/水(45：55，v/v)与0.1％(v/v)三氟乙酸作为流动相。样品洗脱以0.5mL/min的流速进行，并在220nm和30℃下监测。分子量标准品使用了超低范围分子量标记物(Sigma-Aldrich，美国)(磷酸三糖异构酶26.6kDa；肌红蛋白17kDa；α-乳清蛋白14.2kDa；抑肽酶6.5kDa；胰岛素3.5kDa和缓激肽1.06kDa)。结果如图3所示。实线为实验组(KerA-WJ-072+黑曲霉酸性蛋白酶)呈显著的双分子量分布特征(3.6-5kDa及<1kDa双组份)，浅色虚线为对照组1(地衣芽孢杆菌角蛋白酶+黑曲霉酸性蛋白酶)水解物仅分布于1kDa以下分子量区间，接近于市售1kDa角蛋白酶水解物(深色虚线对照组2)。

4、角蛋白水解物的抗洗脱性能评价

首先对步骤2制备的角蛋白水解物做侧链NH基荧光标记，标记试剂盒采用

荧光素Fluor488标记试剂盒(中国，武汉)标记。荧光标记条件严格按照试剂盒操作说明。

经标记后，按照如下溶液体系做毛发预浸泡处理(10ml水，0.15g碎发(平均长度2mm)，pH7.0 Tris-HCl，荧光标记角蛋白水解物2mg)。设置三个实验组别，实验组1为KerA-WJ-072角蛋白酶+黑曲霉酸性蛋白酶处理组，实验组2为地衣芽孢杆菌角蛋白酶KerA-BL(Sigma，美国)+黑曲霉酸性蛋白酶处理组，实验组3为对照样品，市售标注1000kDa角蛋白水解物。所有角蛋白水解物的制备及荧光标记均严格按照同样实验条件。开始与浸泡实验前，及加入毛发样品室温下在脱色摇床预浸泡2h后，分别测试溶液荧光强度，计算角蛋白水解物的一次附着率。一次附着率定义为，(原始荧光强度-浸泡实验结束后上清液残余荧光强度)/原始荧光强度。

预浸泡实验结束，10ml浸泡液加入终浓度0.5％SDS，1g玻璃微珠，进入洗脱评价环节。设置激烈洗脱及温和洗脱；两种测试方式：(1)激烈洗脱：在Biospec微珠自组织研磨器中激烈搅拌1分钟，迅速吸取上清液，离心后测试上清荧光强度；(2)温和洗脱：同样洗脱溶液配制，洗脱条件位脱色摇床上轻微混匀20分钟(15rpm)。分别计算角蛋白水解物在表面活性剂存在及不同运动条件下的保留能率。角蛋白水解物的保留率定义为：(毛发一次附着后的所吸附荧光值-洗脱后上清中残余荧光值)/毛发一次附着后的所吸附荧光值。

本研究中三个样品的一次附着率及洗脱实验下的保留率实验结果见表4。

表4

表4示出经本发明双酶顺序分批水解收获的角蛋白水解物(具有双分子量特征分布)，在毛发保留率上的相对优势。与其他市售角蛋白酶酶解工艺产品，或市售1000kDa角蛋白水解物产品相比，本方法制造的角蛋白水解物在表面活性剂存在条件下的毛发保留率显著高于其他实验对照样品组。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶是如下(a)或(b)所示的蛋白质：

(a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的具有角蛋白降解活性的蛋白质。

2.如权利要求1所述角蛋白酶的编码基因。

3.一种如权利要求2所述角蛋白酶的编码基因，其特征在于，所述角蛋白酶的编码基因如(a)或(b)所示：

(a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达载体、细胞系、工程菌或宿主菌。

5.一种表达权利要求1所述的角蛋白酶的制备方法，其特征在于，将含有权利要求2或3所述的角蛋白酶的编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到角蛋白酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用于构建重组表达载体的出发载体为pBR322、pHT01、pEB、pPIC9K、pPIC9或pGAPza载体。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物、昆虫、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌。

8.权利要求1所述角蛋白酶在与酸性蛋白酶联合使用降解废弃角蛋白制备角蛋白水解物的应用，其特征在于，包括：

(a)选用禽类羽蛋白、畜类毛蛋白中的至少一种作为废弃角蛋白；

(b)将废弃角蛋白经加热前处理，所述前处理包括：加热废弃角蛋白与水的混合物，加热温度60-100℃，处理时间0.1-6小时。

(c)加入角蛋白酶催化水解，水解温度为10-60℃，水解pH为5-11；

(d)经角蛋白酶水解后，使用酸性蛋白酶二次水解，水解温度为10-60℃，水解pH为2-7，得到角蛋白水解物。

9.权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，所述的禽类羽蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛等中的至少一种，所述的畜类毛蛋白为牛毛、羊毛、猪毛等中的至少一种；

步骤(d)中，所述的酸性蛋白酶为黑曲霉酸性蛋白酶、宇佐美曲霉酸性蛋白酶、猪胃蛋白酶中的至少一种。

10.权利要求2或3所述角蛋白酶的编码基因，由重组微生物工程菌原位表达，直接降解废弃角蛋白的应用。

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