CN1771323A - L－肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(s)－链烷醇的制备 - Google Patents

L－肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(s)－链烷醇的制备 Download PDF

Info

Publication number
CN1771323A
CN1771323A CNA2004800092436A CN200480009243A CN1771323A CN 1771323 A CN1771323 A CN 1771323A CN A2004800092436 A CNA2004800092436 A CN A2004800092436A CN 200480009243 A CN200480009243 A CN 200480009243A CN 1771323 A CN1771323 A CN 1771323A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
gly
val
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800092436A
Other languages
English (en)
Inventor
H·阿尔特费赫
M·凯塞勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of CN1771323A publication Critical patent/CN1771323A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/008—Preparation of nitrogen-containing organic compounds containing a N-O bond, e.g. nitro (-NO2), nitroso (-NO)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及具有还原取代的链烷酮(如3－甲氨基－1－(2－噻吩基)－丙烷－1－酮)的酶活性的蛋白质。本发明另外还涉及编码所述蛋白质的核酸、核酸构建体、载体、遗传修饰微生物和制备取代的(S)－链烷醇(例如(S)－3－甲氨基－1－(2－噻吩基)－(S)－丙醇)的方法。

Description

L-肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(S)-链烷醇的制备
技术领域
本发明涉及具有还原取代的链烷酮(如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-1-酮)的酶活性的蛋白质。本发明另外还涉及编码所述蛋白质的核酸、核酸构建体、载体、遗传修饰微生物和制备取代的(S)-链烷醇例如(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的方法。
背景技术
脱氢酶是对映有择的将醛或酮还原成相应的醇的通用催化剂。(R)-和(S)-特异性脱氢酶之间存在区别。这些催化剂正日益用于旋光醇的工业合成。旋光性是许多药物及农药活性物质选择性作用的先决条件。本文中，一种对映体可能具有需要的作用而另一对映体可能具有遗传毒性。因此，药物和农药活性物质的合成中采用具有所需的立体专一性的催化剂制备旋光醇。
3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇(“度洛西汀醇”)是度洛西汀合成中的组成单元。度洛西汀是正在通过审批程序，预期用于抑郁和失禁适应症领域的药物活性化合物。
度洛西汀醇和度洛西汀的合成路线在文献(参阅EP-A-0 273 658)中有所描述。这些合成路线的缺点是合成产物为消旋醇的混合物，需要进一步通过与旋光性平衡离子成盐将外消旋物转变为非对映体混合物来拆分外消旋物。随后用物理方法分开非对映体。由于重复进行固体与液体的分离，导致了高过程成本，并且由于增添了用于分离的光学活性盐而加大了起始化合物的使用。
3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙酮的立体特异性还原可以为度洛西汀醇提供相对廉价的路线。
发明概述
本发明目的在于寻找立体特异的还原取代的链烷酮(如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-2-酮)的路径。
我们已经发现该目的可以通过这一令人吃惊的发现达到：具有L-肉碱还原酶活性的酶能够以立体特异的方式催化上述反应。
首先，本发明涉及用微生物制备(特别是对映有择的制备)式I的取代的(S)-链烷酮的方法，其中，在含有式II链烷酮的介质中
a)培养产生具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的微生物，或
b)孵育具有L-肉碱脱氢酶活性的酶，
式II的化合物被酶还原，得到式I的化合物，并分离生成的基本上对映异构纯的产物，
Figure A20048000924300061
其中
n为从0到5的整数，特别是0、1或2；
Cyc为未取代或取代的、单核或多核的、饱和或不饱和的碳环或杂环，特别是未取代或取代的、不饱和的单核杂环，且
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，特别是卤素或NR2R3，其中R2、R3和R4互不依赖的为H或低级烷基或低级烷氧基且X-为平衡离子，
其中n、Cyc、和R1如上文定义。
在具体的优选实施方案中，该方法用于制备式3的3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇，其中，在含有式IV的3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-2-酮的介质中，所述化合物被酶还原得到式III的化合物，并分离形成的基本上对映异构纯的产物。
Figure A20048000924300071
在这些方法中优选使用具有L-肉碱脱氢酶活性的酶，该酶选自L-肉碱脱氢酶(E.C.1.1.1.108)和3-羟酰基辅酶A脱氢酶(E.C.1.1.1.35)。
这类具有L-肉碱脱氢酶活性的酶具体选自产碱杆菌(Alcaligenes)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄单胞菌(Xanthomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、根瘤菌(Rhizobium)、农杆菌(Agrobacterium)、链霉菌(Streptomyces)和古球菌(Archaeglobus)属微生物的酶。
在本发明特别优选的实施方案中，具有L-肉碱脱氢酶活性的酶选自含有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列或来自它们的核酸序列编码的酶，或选自具有L-肉碱脱氢酶活性，催化对映有择地合成式I的化合物的所述酶的功能等效物。
例如，具有L-肉碱脱氢酶活性的酶可由SEQ ID NO：1的核酸序列或其功能等效物编码。
本发明的方法优选在添加还原等效物(NADH或NADPH)或在反应中消耗的还原等效物可再生的(生物化学或电化学)条件下进行。
另外，优选允许式II的化合物(例如式IV的化合物)在选自肠杆菌、假单胞菌、根瘤菌、链霉菌和诺卡氏菌科的微生物存在下反应。特别地，所述微生物可以是转化了编码如前述定义具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的核酸构建体的重组微生物。
具体而言，本发明涉及如前述定义的方法，其中
c)从天然来源中分离或重组制备产生具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的微生物，
d)繁殖所述微生物，
e)适当时，从所述微生物中分离所述具有L-肉碱脱氢酶活性的酶，或从该微生物中制备含有该酶的蛋白质级分，并
f)将符合步骤b)的所述微生物或符合步骤c)的所述酶转移到含有式I化合物的介质中。
本发明另外还涉及式V的化合物
Figure A20048000924300081
其中n、Cyc和R1如前文定义，且Ar为单核或多核的、未取代的或取代的芳基，且
其中
a)首先如前述任一项权利要求中所述微生物制备式I的化合物，并且
b)式I的化合物与式VI的芳香化合物反应
Ar-Y    (VI)
其中Ar如前述定义，Y为离去集团，且
c)分离式V的化合物并在适当时转换为可药用的酸加成盐，例如草酸盐。
本文优选制备式V的化合物，其中Ar为1-萘基、Cyc为2-噻吩基、R1为一甲基氨，且n为1。
本发明另外涉及含有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列或来自它们的核酸序列编码的多肽，以及具有L-肉碱脱氢酶活性并催化对映有择地合成式I和/或III化合物的这些酶的功能等效物。
本发明另外还涉及含有编码前述多肽的序列的核酸编码序列。
本发明另外还涉及含有前述定义的核酸编码序列并与至少一个核酸调节序列有效连接的表达盒。
本发明另外涉及含有至少一个这样的表达盒的重组载体。
本发明还涉及转化了至少一个本发明载体的原核或真核宿主。
最后，本发明涉及具有如前述定义L-肉碱脱氢酶活性的酶或产生该酶的微生物在制备式I或III的化合物，特别是制备式ⅥI的度洛西汀中的用途。
Figure A20048000924300091
发明详述
A.通用术语及定义
除非另外说明，应用以下通用含义：
“卤素”为氟、氯、溴或碘，特别是氟或氯。
“低级烷基”为含有1到6个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、2-或3-丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
“低级链烯基”为前文提到2到6个碳原子的烷基的单或多不饱和的，优选单或双不饱和的同型物，双键可在碳链的任何位置。
“低级烷氧基”为前述烷基的氧末端同型物。
“芳基”为单核或多核的，优选为单或双核的，未取代或取代的芳基，特别是通过任何环上位置结合的苯基或萘基，如1-或2-萘基。适当时，这些芳基可以携带选自前述的卤素、低级烷基、低级烷氧基或三氟甲基的1或2个相同或不同的取代基
B.取代的链烷酮、(S)-链烷醇及其衍生物
可由符合本发明的酶催化得到的链烷醇为前述式(I)的链烷醇，其中n为0到5的整数；
Cyc为未取代或取代的、单核或多核的、饱和或不饱和的碳环或杂环，且
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4互不依赖的为H或低级烷基或低级烷氧基，X-为平衡离子。
酶促合成中使用的前述式II的链烷醇为本身已知并可应用熟知的有机合成方法(参阅例如EP-A-0273658)得到的化合物。
前述化合物中，n优选为0、1或2，特别是1。
应该提到的碳环或杂环基团Cyc的实例具体为单核或双核的，优选为单核的基团，其具有选自O、N和S的最多4个，优选为1或2个相同或不同的环杂原子：
所述碳或杂环具体含有3到12个，优选为4、5或6个环碳原子。可以提到的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，其单或多不饱和同型物，如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基；以及含有从O、N和S选自1到4个杂原子的饱和的或者单或多不饱和的5员或7员杂环基，适当时，杂环可与另一杂环或碳环融合。本文应该提到的基团具体为衍生自吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪、吡嗪、香豆酮、吲哚和喹啉的基团。
Cyc基团可在环的任何位置，优选通过环碳原子与链烷酮或链烷醇合。
合适的Cyc基团的实例为2-噻吩基、3-噻吩基；2-呋喃基、3-呋喃基；2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基；4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基；3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基和4-氯-2-噻吩基。
Cyc基团另外还可以被单或多取代，例如单或双取代。取代基团优选位于环碳原子上。合适的取代基团的实例为卤素、低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或NR2R3，其中R2和R3如前述定义，优选卤素或低级烷基。
R1具体为卤素、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3或R2、R3和R4互不依赖的为H或低级烷基或低级烷氧基，且X-为平衡离子，R1、R2和R3中任一基团优选为H。合适的平衡离子的实例为得到的酸阴离子，例如从制备酸加成盐中得到的酸阴离子。其实例在例如此处引入为参考的EP-A-0273658中有所提及。R1基团的优选实例具体为氟或氯以及NR2R3，其中R2和R3相同或不同地为H或甲基、乙基或正丙基；特别优选R1为氯或-NH甲基。
C.具有L-肉碱脱氢酶活性的酶
具有L-肉碱脱氢酶活性的本发明酶具体选自L-肉碱脱氢酶(E.C.1.1.1.108)和3-羟酰基辅酶A脱氢酶(E.C.1.1.1.35)(还参阅Kleber HP，(1997)FEMS Microbiology Letters 1471-9)。
所述L-肉碱脱氢酶/羟酰基辅酶A脱氢酶可在生物体中发现，特别是微生物如细菌、酵母或真菌。该酶对还原的式II链烷酮具有高酶活性，如将3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-1-酮还原成3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇。脱氢酶同样转化其他底物，例如酮的二甲基衍生物和单甲基化合物。
优选(但不限于此)这类酶从选自产碱杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、葡萄球菌、根瘤菌、农杆菌、链霉菌和古球菌属的微生物中得到。
优选的具有L-肉碱脱氢酶活性的酶含有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列。
本发明同样包括明确公开的具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的“功能等效物”及它们在本发明方法中的用途。
就本发明的目的而言，明确公开的酶的“功能等效物”或类似物为例如与所述酶不同但仍保留需要的生物活性如底物特异性的多肽。因此，例如，“功能等效物”指将3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-1-酮还原成相应的S-醇的酶，其具有SEQ ID NO：2到10中列出的任一氨基酸序列的酶的至少20％、优选50％、特别优选75％、更特别优选90％的活性。此外，功能等效物优选在pH4到10之间稳定并且最适pH有利地在5到8之间，最适温度在从20℃到80℃的范围内。
根据本发明，“功能等效物”具体也指在前述氨基酸序列至少一个序列位置具有与明确提到的氨基酸不同的氨基酸，但仍然具有一项前述生物活性的突变体。“功能等效物”因此包含通过一个或多个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒置得到的突变体，只要得到的突变体具有本发明的特性谱，所述修饰可在任一序列位置发生。特别地，功能等效物也包括与未修饰多肽的反应型定性吻合，即，例如以不同速率转变相同底物的突变体。
以上意义中“功能等效物”也指所述多肽的“前体”，以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。
在该上下文中，“前体”为具有或不具有所需生物活性的多肽的天然或合成前体。
术语“盐”不仅指羧基盐，也指本发明蛋白质分子氨基的酸加成盐。羧基盐可以本质已知的方式制备，并包括无机盐(例如钠、钙、铵、铁和锌盐)，以及含有有机碱(例如胺)的盐，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。本发明同样涉及酸加成盐，例如含有无机酸(如盐酸或硫酸)的盐，以及含有有机酸(如乙酸和草酸)的盐。
本发明多肽的“功能衍生物”同样可以借助于已知技术在功能性氨基酸侧基或者其N-或C-端末端制备。这类衍生物包括例如羧酸基团的脂肪酯、通过与氨或与伯胺或仲胺反应得到的羧酸基团的酰胺、通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物，或者通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等效物”当然还包括从其他生物体得到的多肽及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较鉴定同源序列区，并可在本发明特定需求的基础上确定等效的酶。
“功能等效物”同样包括例如本发明多肽的片段，优选为独立结构域或序列模体，其具有需要的生物学功能。
另外，“功能等效物”为融合蛋白质，其具有任一前述多肽序列或其衍生的功能等效物以及至少一个与前述多肽功能不同并与其在N-或C-端功能连接的其他异源序列(即融合蛋白各部分间相互没有显著的功能损害)。这类异源序列的非限制性实例如信号肽或酶。
本发明还涉及与明确公开的蛋白质同源的“功能等效物”。按Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448.中的算法计算，它们与任一明确公开的氨基酸序列具有至少60％、优选70％、特别是至少85％，如90％、95％或99％的同源性。本发明的同源多肽的同源性百分率具体指基于本文明确描述的某一氨基酸全长的氨基酸残基一致性百分率。
在蛋白质可能糖基化的情况下，本发明的“功能等效物”包括前文指定类型的蛋白质的去糖基化或糖基化形式，以及通过改变糖基化模式得到的修饰形式。
本发明的蛋白质或多肽的同系物可以通过诱变产生，例如通过蛋白质的点突变或截短产生。
可以通过例如筛选突变体(例如截短突变体)的组合文库来鉴定本发明蛋白质的同系物。例如，可以通过核酸水平的组合诱变(例如酶连合成寡核苷酸混合物的酶连接)产生蛋白质变体的杂色文库(variegatedlibrary)。有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列制备可能的同系物的文库。可以在DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，接着可将合成基因连接入合适的表达载体。基因简并集的使用使得可能在一种混合物中提供编码需要的一组可能的蛋白质序列的全部序列。合成简并寡核苷酸的方法为技术人员所公知(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
在先技术公开了多种用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物的技术，以及多种用于筛选cDNA文库以寻找具有所选特性的基因产物的技术。可以使这些技术适用于快速筛选通过本发明同系物的组合诱变产生的基因文库。通过高通量分析筛选大基因文库最常使用的技术包括将基因文库克隆进可复制的表达载体、将得到的载体文库转化进合适的细胞并在所需活性的鉴定便于分离载体的条件下表达组合基因，所述载体编码其产物已被检测的基因。可与筛选实验组合应用提高文库中功能性突变体频率的递归系综诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)技术，以鉴定同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
D.核酸编码序列
在本发明的上下文中，术语“表达”或“过表达”描述了微生物中一种或更多由相应DNA编码的酶细胞内活性的产生或提高。为此，例如可能向生物体中引入基因、以不同基因来取代现有的基因、提高基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，适当时可以组合这些措施。
本发明具体涉及编码具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的核酸序列。优选包含SEQ ID NO：1序列的核酸序列或来自SEQ ID NO：2到10的氨基酸序列的核酸序列。
本文提到的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可通过化学合成以本身已知的方式由核苷酸组成单元制备，例如通过独立重叠的片段缩合、双螺旋的互补核酸组成单元。寡核苷酸可按已知方式化学合成，例如通过亚磷酰胺酸法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896页-897页)。合成寡核苷酸退火以及在DNA聚合酶Klenow片段的帮助下填补缺口、连接反应和通用克隆方法在Sambrook等(1989)，《Molecular Cloning：A laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press中有描述。
本发明还涉及编码上述任一多肽的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)以及使用例如人工核苷酸类似物得到的它们的功能等价物。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的核酸分子，以及可作为例如杂交探针或鉴定或扩增本发明编码核酸的引物应用的核酸片段。
本发明的核酸分子还可包含基因编码区3’和/或5’端的非翻译序列。
本发明还包含与明确描述的核苷酸序列或所述核酸分子的一段互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列可能产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物。这些探针和引物通常含有在“严谨”条件(见下文)下与本发明核酸序列有义链或相应反义链的至少约12、优选至约25(例如大约40、50或75)个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。
“分离的”核酸分子与核酸天然来源中存在的其他核酸分子分离，另外，如果通过重组技术产生，则基本上不含其他细胞材料或培养基；如果是化学合成则不含化学前体或其他化学成分。
本发明的核酸分子可按照标准分子生物学技术和按照本发明提供的序列信息来分离。例如，可通过使用任一明确公开的全长序列或其片段作为杂交探针和标准杂交技术(例如Sambrook.J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989中所述)从适当的cDNA文库中分离cDNA。另外，可使用基于任一公开序列产生的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离含有该序列或其片段的核酸分子。通过这种方法扩增的核酸可以克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析描述特征。此外本发明的寡核苷酸可使用标准合成方法(例如使用DNA合成仪)制备。
原则上可从所有生物中鉴定和分离本发明的核酸序列。有利地，可从真菌、酵母或细菌中分离本发明的核酸序列如SEQ ID NO：1或其同系物。此处可能提到的细菌指革兰氏阴性和革兰氏阳性菌。优选通过技术人员已知的方法，从革兰氏阴性菌中，有利的从α-蛋白菌(proteobacteria)、β-蛋白菌或γ-蛋白菌中，特别优选从肠杆菌、假单胞菌和根瘤菌科细菌中，更特别优选从农杆菌、假单胞菌或伯克霍尔德氏菌等属中分离核酸。
可使用例如普通杂交方法或PCR技术通过例如基因组或cDNA文库从真菌或细菌中分离本发明的核酸序列，如SEQ ID No：1或其衍生物、同系物或其序列片段。这些DNA序列在标准条件下与本发明序列杂交。可有利的使用保守区(如活性位点)的短寡核苷酸进行杂交，可以通过技术人员已知的方式与L-肉碱脱氢酶进行比较鉴定保守区。然而，也可以使用本发明核酸的较长片段或全序列进行杂交。所述标准条件根据使用的核酸(寡核苷酸、长片段或全序列)或根据用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)而变化。因此，例如DNA:DNA杂合体的解链温度比同样长度的DNA:RNA杂合体约低10℃。
标准条件指，例如，取决于核酸的，在42和58℃之间的温度，浓度在0.1和5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.2)之间的水性缓冲溶液或另外存在50％甲酰胺，例如42℃、5×SSC、50％甲酰胺。DNA:DNA杂合体的有利杂交条件为0.1×SSC且温度在20℃和45℃之间，优选在30℃和45℃之间。DNA:RNA杂合体的有利杂交条件为0.1×SSC且温度在30℃和55℃之间，优选在45℃和55℃之间。这些给出的杂交温度为通过约100个核苷酸长度且G+C含量为50％的核酸在不存在甲酰胺时的样本计算出的解链温度。DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学教科书，例如Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring HarborLaboratory，1989，并可使用技术人员所公知的公式计算，例如作为核酸长度、杂交类型或G+C含量的函数。技术人员可在以下教科书中找到杂交的其他信息：Ausubel等编，1985，《Current Protocols in MolecularBiology》，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins编，1985，《Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach》，IRL Press atOxford University Press，Oxford；Brown编，1991，《Essential MolecularBiology：A Practical Approach》，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本发明还涉及明确公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此，本发明的其他核酸序列也可能衍生自例如SEQ ID NO：1并通过添加、替换、插入或缺失一个或多个核苷酸与其相区别，且仍然编码具有需要的特性谱的多肽。
本发明还包括含有“沉默突变”或与明确提到的序列相比按照特定源生物或宿主生物的密码子选择进行修饰的核酸序列，以及其天然存在的变体例如剪切变体或等位变体。
本发明还涉及通过保守核苷酸替换(即所述氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸取代)得到的序列。
本发明还涉及明确公开的核酸通过序列多态性衍生的分子。由于天然变异，这些遗传多态性可存在于种群内的个体间。这些天然变异通常导致基因的核苷酸序列中1到5％的差异。
具有序列SEQ ID NO：1的本发明核酸序列的衍生物是指例如在推断的氨基酸水平上在完整序列区具有至少40％同源性、优选至少60％同源性、更特别优选至少80％同源性的等位变体(关于氨基酸水平的同源性，可以参考上文关于多肽的注解)。有利的是，在序列的某些部位同源性可以更高。
另外，衍生物也指本发明核酸序列特别是SEQ ID NO：1的同系物，例如真菌或细菌同系物、截短序列、编码或非编码DNA序列的单链DNA或RNA。因此，例如SEQ ID NO：1在DNA水平的同系物在SEQ ID NO：1所示的完整DNA区至少有40％、优选60％、特别优选70％、更特别优选80％的同源性。
另外，衍生物指例如与启动子的融合体。位于核苷酸序列上游的所述启动子可以通过一个或多个核苷酸的替换、插入、倒置和/或缺失被修饰，却对该启动子的功能或效率没有不利影响。另外，可以通过修饰其序列提高所述启动子的效率，或者该启动子可被更有效的启动子(包括不同种生物的启动子)完全取代。
衍生物还指改变了起始密码子上游从-1到-1000碱基或终止密码子下游从0到1000碱基区域的核苷酸序列，以修饰(优选为提高)基因表达和/或蛋白质表达的变体。
另外，本发明还包括在“严谨条件”下与前述编码序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可在筛选基因组或cDNA文库时鉴定出，并可在适当时使用合适的引物通过PCR方法从中扩增，接着使用例如合适的探针进行分离。另外，本发明的多核苷酸也可以化学合成。这一特性意味着多或寡核苷酸能在严谨条件下与基本互补的序列结合，而在这些条件下非互补的配偶体间没有非特异的结合。为此，序列应为70-100％，优选90-100％互补。互补序列能彼此特异结合的特性被利用，例如在Northen或Southen印迹技术或PCR或RT-PCR中引物的结合中。为此，通常使用长度可达30个碱基对的寡核苷酸。严谨条件是指，例如在Northen印迹技术中，为洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸，在温度55-70℃，优选为60-65℃下使用洗脱液，例如含有0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC：3M氯化钠、0.3M柠檬酸钠，pH7.0)。在该过程中，只有如前述高度互补的核酸仍然彼此结合。严谨条件的设置为技术人员所公知，并在例如Ausubel等，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有描述。
E.本发明的构建体
本发明还涉及在调控核酸序列的遗传控制下含有编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体；以及含有至少一个所述表达构建体的载体。
这些本发明的构建体优选含有特定编码序列5’上游启动子和3’下游终止子，并在适当位置含有其他通用调控元件，每种元件均与编码序列有效连接。
“有效连接”指启动子、编码序列、终止子和适当位置的其他调控元件以使每个调控元件均能在编码序列的表达中发挥自身作用的方式顺次排列。有效连接序列的实例如靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等等。其他调控元件包括可选择标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控序列在例如Goeddel，《Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185》，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有所描述。
本发明的核酸构建体具体指含有序列SEQ ID NO：1的L-肉碱脱氢酶基因及其衍生物和同系物和来自SEQ ID NO：2到10的核酸序列，其有利地与一个或多个控制(例如增强基因表达)的调控信号有效或功能性连接。
除这些调控序列之外，所述序列的天然调控仍然存在于实际的结构基因上游，并在适当时可被遗传修饰，以关闭天然调控而提高基因的表达。然而，核酸构建体的构建也可以更简单，即没有额外的调控信号插入编码序列(例如SEQ ID NO：1及其同系物)的上游，且不去除原有启动子及其调控。反之，以使得调控不再发生并提高基因表达的方式突变天然调控序列。
优选的核酸构建体还有利地含有与使需要加强的核酸序列能够表达的启动子功能性连接的一个或多个已经提到的增强子序列。其他有利的序列(例如其他调控元件或终止子)也可被插入DNA序列的3’末端。构建体中可存在一个或更多拷贝的本发明核酸。为选择构建体，构建体适当时还可以含有其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷互补基因。
本发明方法的有利调控序列存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR的启动子中或可有利的用于革兰氏阴性菌的lambda-PL启动子中。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，酵母或真菌启动子ADC1、Mfalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在本文中，丙酮酸脱羧酶和例如来自汉森酵母(Hansenula)的甲醇氧化酶的启动子也是有利的。也可用人工启动子来调控。
核酸构建可通过插入到载体(例如使基因在宿主中得到最佳表达的质粒或噬菌体)而在宿主生物中有利的的表达。除了质粒和噬菌体以外，载体还指其他技术人员已知的载体，即例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒等)、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环形DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体构成了本发明的另一实施方案。合适的质粒为，例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。提到的质粒是可能的质粒的一小部分。其他质粒为技术人员所熟知并可以在例如《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN 0444904018)一书中找到。
为了表达更多存在的基因，核酸构建体有利地额外含有增强表达的3’和/或5’末端调节序列，为实现最佳表达而对它们的选择取决于宿主生物和选择的基因。
这些调控序列旨在使基因的特定表达及蛋白质表达成为可能。取决于宿主生物，这是指例如基因只在诱导后表达或过表达，或被瞬时表达和/或过表达。
调控序列或因子可优选具有正面影响，并因此提高引入基因的基因表达。因此，调节元件可通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)而在转录水平被有利地加强。然而，另外也可通过例如提高mRNA稳定性来增强翻译。
在载体的另一实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体还可以有利地以线性DNA的形式引入微生物，并通过异源或同源重组整合入宿主生物基因组。该线性DNA可由线性化载体(如质粒)或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了异源基因在生物体中的最佳表达，可有利地按照该生物使用的特定密码子选择来修饰核酸序列。密码子选择可以在所述生物其他已知基因的计算机评估基础上方便的确定。
本发明的表达盒通过将适当的启动子与适当的核苷酸编码序列以及终止子信号或多腺苷酸化信号融合而制备。为此，使用常规重组和克隆技术，例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook的《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《Experiments with Gene Fusions》Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和在Ausubel，F.M.等，《Current Protocols inMolecular Biology》，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所描述的。
通过将重组核酸构建体或基因构建体有利的插入能使基因在宿主中最佳表达的宿主特异载体而使其在适当的宿主生物中表达。载体为技术人员所熟知，并可以在例如《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
F.根据本发明可使用的宿主
可以借助本发明的载体制备转化了例如至少一种本发明载体并可用于产生本发明的多肽的重组微生物。有利地将前述本发明的重组构建体引入合适的宿主系统并表达。在本文中，优选使用技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以在特定表达体系中表达所述核酸。合适的系统描述于《Current Protocols inMolecular Biology》F.Ausubel等编辑，Wiley Interscience，New York 1997或Sambrook等的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
根据本发明，也可以通过同源重组制备微生物。为此，制备含有本发明基因或编码序列的至少一个片段的载体，为了修饰(例如功能性破坏)本发明的序列(“敲除”载体)，适当时在其中引入至少一个氨基酸的缺失、添加或替换。引入的序列也可以是例如来自相关微生物的同系物或可来自哺乳动物、酵母或是昆虫来源。另外，可以按如下方式设计用于同源重组的载体，其内源基因经同源重组突变或者修饰，而仍然编码功能蛋白质(例如，可修饰上游调控区以引起内源蛋白质的表达改变)。本发明基因的修饰片段存在于同源重组载体中。用于同源重组的适当载体的构建描述于如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503。
用于本发明核酸或核酸构建体的适当的重组宿主生物原则上是所有的原核或真核生物。使用的有利的宿主生物为微生物，如细菌、真菌或酵母。使用有利的为革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，优选肠杆菌、假单胞菌、根瘤菌、链霉菌和诺卡氏菌科的细菌，特别优选埃希氏菌(Escherichia)、假单胞菌、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌、伯克霍尔德氏菌、沙门氏菌、农杆菌和红球菌(Rhodococcus)属的细菌。极其优选大肠杆菌属和种。另外，其他有利的细菌可见于α-蛋白菌、β-蛋白菌或γ-蛋白菌的组。
依据本发明，宿主生物含有至少一种本发明所述编码具有L-肉碱脱氢酶活性的酶(Kleber HP(1997)FEMS Microbiology，147，1-9)的核酸序列、核酸构建体或载体。
取决于宿主生物，以技术人员公知的方法培养或生长本发明方法中所使用的生物。微生物一般在有氧条件下培养于含有通常以糖形式存在的碳源、通常以有机氮源形式(例如酵母提取物)或盐形式(如硫酸铵)存在的氮源、微量元素(如铁、锰、镁盐)，及适当时含有维生素的液体培养基中，温度为0℃到100℃之间，优选10℃到60℃之间。培养液的pH可保持恒定，即培养时可调节或不调节。培养可是分批的、半分批的或连续的。营养素可在发酵起始时引入或半连续或连续地加入。酮可直接加入培养物中或在培养后有利的加入。酶可依照实施例中所述方法从生物体中分离，或作为粗提取物用于反应。
宿主生物有利的包含1U/l酶活性，例如L-肉碱脱氢酶活性，优选100U/l，特别优选高于1000U/l。
G.多肽的重组制备
本发明另外涉及重组制备本发明多肽或其功能性、生物活性片段的方法，其中培养产生多肽的微生物，适当时诱导所述多肽的表达，将后者从培养物中分离出来。如果需要的话，也可以通过这种方法以工业规模生产多肽。
重组微生物可通过已知方法培养和发酵。例如，可以在20到40℃pH6到9的条件下在TB或LB培养基中繁殖细菌。合适的培养条件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook的《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)中有详细描述。
多肽不分泌进培养基中时，裂解细胞，通过已知蛋白质分离方法从裂解液中获得产物。可通过高频超声、通过高压(例如弗氏压碎器)、通过渗透压、通过去污剂、水解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆器或通过所列方法中两种或多种的组合裂解细胞。
多肽的纯化可通过已知的层析方法如分子筛层析(凝胶过滤)，例如Q-琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析，以及其他常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden的《The Tools of Biochemistry》，VerlagWalter de Gruyter，Berlin，New York或在Scopes，R.，ProteinPurification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中有所描述。
可以有利地通过例如载体系统或寡核苷酸有利的分离组合体蛋白质，它们通过特定的核苷酸序列延伸cDNA并因而编码修饰的多肽或融合蛋白质从而简化纯化。例如，这类合适的修饰为作为锚的“标签”，例如已知的6组氨酸锚，或可以作为抗原被抗体识别的表位(在例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中有所描述)的修饰。这些锚可用于将蛋白质附着于固体载体上，例如可以填充入层析柱或微滴定板上或其他任何支持物的聚合物基质。
同时，这些锚还可以用于鉴定蛋白质。此外，可以单独或与所述锚组合使用常用标记(如荧光染料、与底物反应后形成可检测的反应产物的酶标记或者放射性标记)，以鉴定蛋白质从而衍生所述蛋白质。
H.执行本发明的方法以制备(S)-链烷醇
具有L-肉碱脱氢酶活性的酶，例如肉碱脱氢酶或羟酰辅酶A脱氢酶，可以作为游离或固定化酶在本发明的方法中使用。
本发明的方法可有利地在0℃到95℃之间的温度下执行，优选在10℃到85℃之间，特别优选15℃到75℃之间。
本发明的方法的pH值有利地保持在pH4到pH12之间，优选pH4.5到pH9，特别优选pH5到pH8之间。
在本发明的方法中，对映异构纯或手性的产物如(3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇)指对映体中的一种得到富集的对映体。该方法优选得到对映异构纯至少为70％ee，优选至少80％ee，特别优选至少90％ee，尤其优选至少98％ee。
可以为本发明的方法使用含有本发明的核苷酸、核苷酸构建物或载体的生长细胞。也可以使用静息的或破碎的细胞。破碎的细胞是指例如通过如溶剂处理为可渗透的细胞，或通过酶处理、通过机械处理(如弗氏压碎器或超声)或通过其他方法破碎的细胞。通过这种方法获得的粗提取物有利地适用于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于该方法。可在反应中有利的使用的固定微生物或酶同样适用。
如果为本发明的方法使用游离的生物体或酶，在提取之前可通过如过滤或离心方便的将其去除。
在本发明方法中制备的产物(如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇)可从反应水溶液中通过萃取或蒸馏方便地分离。可以重复多次萃取以提高得率。合适的萃取剂的实例为溶剂，如甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二异丙醚、苯酚、MTBE或乙酸乙酯等，但并不仅限于此。
有机相被浓缩后，通常可以得到良好化学纯度的产物，即大于80％的化学纯度。然而，萃取后含有产物的有机相也只能部分浓缩，产物可以结晶出来。为此，溶液有利地冷却至0℃到10℃。也可以直接从有机溶液或水溶液中结晶。结晶产物可以被同样或不同的溶剂融解以重结晶，并再次结晶。必要时，可以通过随后至少进行一次有利的结晶而进一步提高产物的对映异构纯度。
采用所述工作类型时，本发明方法的产物可以60％到100％，优选80％到100％，特别优选90％到100％的产率分离，取决于反应所用底物，例如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-1-酮。通过大于90％，优选大于95％，特别优选大于98％的高化学纯度区别分离的产物。此外，必要时，可以通过所述结晶法方便地进一步提高产物具有的高对映体纯度。
本发明的方法可以分批、半分批或连续的进行。
本方法可以方便地在生物反应器中进行，如《Biotechnology》第三卷，第二版，Rehm等编，(1993)的第二章所述。
以上说明和以下实施例仅用于阐述本发明。本发明同样包括技术人员所显而易见的各种可能的修改。
实验部分：
实施例1：通过PCR扩增来克隆肉碱脱氢酶或羟氨辅酶A脱氢酶
将选自产碱杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、农杆菌、慢生根瘤菌(Mesorhizobium)和根瘤菌、链霉菌和古球菌属的细菌在25ml复合培养基(例如HFP＝1％蛋白胨、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％NaCl)中培养1-3天，收获，在缓冲液中洗涤，重悬(5ml 50mM Tris，pH 7.0)，使用Qiagen的QIAGEN基因组提取系统制备基因组DNA。然后通过PCR方法扩增肉碱脱氢酶和3-羟氨基辅酶A脱氢酶基因。为此，从N末端和C末端(各25-30碱基对)挑选技术人员可得到的属于SEQ ID 2-10的脱氢酶序列的，任意地，附加用于克隆的限制性切割位点，并合成相应的寡核苷酸。使用Pfu聚合酶(Stratagene)或Taq聚合酶(Roche)进行PCR反应。例如，PCR反应使用如下的温度程序：
95℃3分钟；95℃45秒、55℃45秒、72℃2分50秒的30个循环；72℃10分钟；4℃保存直到第一次使用。所有的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳(E-Gel，Invitrogen)和柱层析(GFX-Kit，Pharmacia)纯化。按照Maniatis T、Fritsch EF和Sambrook J(1989)的《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor(NY)，使用合适的限制性内切酶消化和连接，从而克隆进如pBluescript KSII，pKK223-3和pDHE19.2等载体。Taq-PCR产物直接克隆进pBADtopo载体。适用的宿主生物为大肠杆菌XL1B和TG1(Stratagene)。
实施例2：通过生长选择来克隆肉碱脱氢酶或羟氨辅酶A脱氢酶
实施例1中提到的物种和其他细菌、酵母和真菌以及土壤样品分离物和从土壤样品中通过克隆DNA制备的大肠杆菌基因文库在合适的含有肉碱或甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的适当的基本培养基(例如1％D，L-肉碱、0.2％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％酵母提取物)上划线(stripped out)，或在液体培养基中孵育，并在一天、三天后、一周一次或一个月后(反复的)通过接种转移至新鲜的培养基。通过这种方法增殖的生物以单菌落形式或通过细胞分选仪的分选分离。它们表现出以肉碱或甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇作为唯一碳源和/或氮源生长的能力。可以使用得到的菌株通过PCR扩增(按照实施例1)产生新的重组脱氢酶菌株。
实施例3：甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的转化
在实施例1和2中得到的菌株生物质在有合适诱导物(例如0.5mMIPTG，2g/L鼠李糖，肉碱)存在下培养后收获，在缓冲液(例如50mMTris-HCl，pH 7.0)中洗涤并重悬，静息细胞与NADH或NADPH(0.1-5mM)、每毫升含1.6mg-50mg甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇和葡萄糖或异丙醇(例如1-100mol)的反应混合物混合，并在30℃孵育1-24小时。反应可通过340nm处消光系数的降低或HPLC分析来监控。菌株的活性在0和100U/l之间。
                      序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>L-肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(S)-链烷醇的制备
<130>M44098CDH
<160>10
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>966
<212>DNA
<213>产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(966)
<223>
<400>1
atg act ttt atc acc aac atc aaa acc ttc gcc gct ctg ggc agc ggc    48
Met Thr Phe Ile Thr Asn Ile Lys Thr Phe Ala Ala Leu Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
gtg atc ggc agt ggc tgg gtg gcc cgc gcc ctg gcc cac ggc ctg gac    96
Val Ile Gly Ser Gly Trp Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Leu Asp
            20                  25                  30
gtg gtg gcc tgg gac ccg gcg ccg ggc gct gaa gcc gcc ctg cgc cag    144
Val Val Ala Trp Asp Pro Ala Pro Gly Ala Glu Ala Ala Leu Arg Gln
        35                  40                  45
cgg gtc gcc aac gcc tgg ggc gct ctg gaa aaa cag ggc ctg gtc ccc    192
Arg Val Ala Asn Ala Trp Gly Ala Leu Glu Lys Gln Gly Leu Val Pro
    50                  55                  60
gga gcc tcg cca cag cgc cta cgc ttt gtc agc acc atc gaa gag tgt    240
Gly Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Phe Val Ser Thr Ile Glu Glu Cys
65                  70                  75                  80
gtg aaa gac gcc gac ttc atc cag gaa agc gct ccc gag cgc ctg gaa    288
Val Lys Asp Ala Asp Phe Ile Gln Glu Ser Ala Pro Glu Arg Leu Glu
                85                  90                  95
ctc aag ctg gaa ctg cac agc aag atc agc gcc gcg gcc aag ccc gac    336
Leu Lys Leu Glu Leu His Ser Lys Ile Ser Ala Ala Ala Lys Pro Asp
            100                 105                 110
gcc ctg atc ggc tcc agc acc tcg gcc ctg ctg ccc agc gaa ttc tat    384
Ala Leu Ile Gly Ser Ser Thr Ser Ala Leu Leu Pro Ser Glu Phe Tyr
        115                 120                 125
gag ggc tcg acc cac ccg caa cgc tgc gtg gtg ggc cat ccg ttc aac    432
Glu Gly Ser Thr His Pro Gln Arg Cys Val Val Gly His Pro Phe Asn
    130                 135                 140
ccg gtg tac ctg cta ccg ctg gtg gaa gtg gtg ggc ggc cag cac acc    480
Pro Val Tyr Leu Leu Pro Leu Val Glu Val Val Gly Gly Gln His Thr
145                 150                 155                 160
gca ccc gag gcg ata cag gcg gcg atc cag gtc tat gaa tcc ttg ggg    528
Ala Pro Glu Ala Ile Gln Ala Ala Ile Gln Val Tyr Glu Ser Leu Gly
                165                 170                 175
atg cgc ccc ttg cat gtg cgc aag gaa gtc ccg ggc ttc atc gcc gac    576
Met Arg Pro Leu His Val Arg Lys Glu Val Pro Gly Phe Ile Ala Asp
            180                 185                 190
cgt ctg ctc gaa gcc ctg tgg cgc gaa gcc ttg cac ctg gtc aat gac    624
Arg Leu Leu Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Leu His Leu Val Asn Asp
        195                 200                 205
ggg gtg gcg acc acc ggg gaa atc gac gac gcg atc cgc ttt ggc gcc    672
Gly Val Ala Thr Thr Gly Glu Ile Asp Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ala
    210                 215                 220
ggc ctg cgc tgg tcg ttc atg ggc acc ttc ctc acc tac acc ctg gcc    720
Gly Leu Arg Trp Ser Phe Met Gly Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Leu Ala
225                 230                 235                 240
gga ggc gac gcc ggc atg cgt cac ttc atg gcc cag ttc ggc ccg gcg    768
Gly Gly Asp Ala Gly Met Arg His Phe Met Ala Gln Phe Gly Pro Ala
                245                 250                 255
ctg caa ctg ccc tgg acc tac ctg ccg gcc ccg gag ctg acc gac aaa    816
Leu Gln Leu Pro Trp Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Leu Thr Asp Lys
            260                 265                 270
ctg atc gat gac gta gtc caa ggt acc gcc gag caa ctg ggc aac cac    864
Leu Ile Asp Asp Val Val Gln Gly Thr Ala Glu Gln Leu Gly Asn His
        275                 280                 285
agc att tcg gcc ctg gag cgc tat cgt gat gac tgc ctg ctg gcg gtg    912
Ser Ile Ser Ala Leu Glu Arg Tyr Arg Asp Asp Cys Leu Leu Ala Val
    290                 295                 300
ctg gag gcg gtg aaa acc acc aag gcc aag cac ggc atg cac ttt cac    960
Leu Glu Ala Val Lys Thr Thr Lys Ala Lys His Gly Met His Phe His
305                 310                 315                 320
gac taa                                                            966
Asp
<210>2
<211>321
<212>PRT
<213>产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)
<400>2
Met Thr Phe Ile Thr Asn Ile Lys Thr Phe Ala Ala Leu Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Val Ile Gly Ser Gly Trp Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Leu Asp
            20                  25                  30
Val Val Ala Trp Asp Pro Ala Pro Gly Ala Glu Ala Ala Leu Arg Gln
        35                  40                  45
Arg Val Ala Asn Ala Trp Gly Ala Leu Glu Lys Gln Gly Leu Val Pro
    50                  55                  60
Gly Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Phe Val Ser Thr Ile Glu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Val Lys Asp Ala Asp Phe Ile Gln Glu Ser Ala Pro Glu Arg Leu Glu
                85                  90                  95
Leu Lys Leu Glu Leu His Ser Lys Ile Ser Ala Ala Ala Lys Pro Asp
            100                 105                 110
Ala Leu Ile Gly Ser Ser Thr Ser Ala Leu Leu Pro Ser Glu Phe Tyr
        115                 120                 125
Glu Gly Ser Thr His Pro Gln Arg Cys Val Val Gly His Pro Phe Asn
    130                 135                 140
Pro Val Tyr Leu Leu Pro Leu Val Glu Val Val Gly Gly Gln His Thr
145                 150                 155                 160
Ala Pro Glu Ala Ile Gln Ala Ala Ile Gln Val Tyr Glu Ser Leu Gly
                165                 170                 175
Met Arg Pro Leu His Val Arg Lys Glu Val Pro Gly Phe Ile Ala Asp
            180                 185                 190
Arg Leu Leu Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Leu His Leu Val Asn Asp
        195                 200                 205
Gly Val Ala Thr Thr Gly Glu Ile Asp Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ala
    210                 215                 220
Gly Leu Arg Trp Ser Phe Met Gly Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Leu Ala
225                 230                 235                 240
Gly Gly Asp Ala Gly Met Arg His Phe Met Ala Gln Phe Gly Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Gln Leu Pro Trp Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Leu Thr Asp Lys
            260                 265                 270
Leu Ile Asp Asp Val Val Gln Gly Thr Ala Glu Gln Leu Gly Asn His
        275                 280                 285
Ser Ile Ser Ala Leu Glu Arg Tyr Arg Asp Asp Cys Leu Leu Ala Val
    290                 295                 300
Leu Glu Ala Val Lys Thr Thr Lys Ala Lys His Gly Met His Phe His
305                 310                 315                 320
Asp
<210>3
<211>321
<212>PRT
<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400>3
Met Pro Phe Ile Thr Glu Ile Lys Thr Phe Ala Ala Leu Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Val Ile Gly Ser Gly Trp Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Leu Asp
            20                  25                  30
Val Val Ala Trp Asp Pro Ala Pro Gly Ala Glu Gln Ala Leu Arg Lys
        35                  40                  45
Arg Val Ala Asn Ala Trp Pro Ala Leu Glu Lys Gln Gly Leu Ala Pro
    50                  55                  60
Gly Ala Ser Gln Asp Arg Leu Lys Phe Val Ala Thr Ile Glu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Val Arg Asn Ala Asp Phe Ile Gln Glu Ser Ala Pro Glu Arg Leu Asp
                85                  90                  95
Leu Lys Leu Asp Leu His Ala Lys Ile Ser Ala Ala Ala Lys Pro Asp
            100                 105                 110
Ala Ile Ile Gly Ser Ser Thr Ser Gly Leu Leu Pro Ser Glu Phe Tyr
        115                 120                 125
Glu Ser Ser Thr His Pro Glu Arg Cys Val Val Gly His Pro Phe Asn
    130                 135                 140
Pro Val Tyr Leu Leu Pro Leu Val Glu Ile Val Gly Gly Ser Arg Thr
145                 150                 155                 160
Ser Pro Glu Ala Ile Glu Ala Ala Lys Thr Ile Tyr Thr Ala Leu Gly
                165                 170                 175
Met Arg Pro Leu His Val Arg Lys Glu Val Pro Gly Phe Ile Ala Asp
            180                 185                 190
Arg Leu Leu Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Leu His Leu Val Asn Asp
        195                 200                 205
Gly Val Ala Thr Thr Gly Glu Ile Asp Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ala
    210                 215                 220
Gly Leu Arg Trp Ser Phe Met Gly Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Leu Ala
225                 230                 235                 240
Gly Gly Asp Ala Gly Met Arg His Phe Met Ser Gln Phe Gly Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Lys Leu Pro Trp Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Leu Thr Asp Lys
            260                 265                 270
Leu Ile Asp Asp Val Val Ser Gly Thr Ser Glu Gln Gln Gly Glu Arg
        275                 280                 285
Ser Ile Ala Ala Leu Glu Arg Tyr Arg Asp Asp Thr Leu Leu Ala Val
    290                 295                 300
Leu Glu Ala Val Lys Ser Ser Lys Ala Ser His Gly Leu Ser Phe Ser
305                 310                 315                 320
Asp
<210>4
<211>321
<212>PRT
<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>4
Met Ser Phe Val Thr Glu Ile Lys Thr Phe Ala Ala Leu Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Val Ile Gly Ser Gly Trp Ile Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Leu Asp
            20                  25                  30
Val Val Ala Trp Asp Pro Ala Pro Gly Ala Glu Ala Ala Leu Arg Ala
        35                  40                  45
Arg Val Ala Asn Ala Trp Pro Ala Leu Arg Lys Gln Gly Leu Ala Pro
    50                  55                  60
Gly Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Phe Val Ala Ser Ile Glu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Val Gly Asp Ala Asp Phe Ile Gln Glu Ser Ala Pro Glu Arg Leu Asp
                85                  90                  95
Leu Lys Leu Asp Leu His Ala Arg Ile Ser Ala Ala Ala Arg Pro Asp
            100                 105                 110
Val Leu Ile Gly Ser Ser Thr Ser Gly Leu Leu Pro Ser Glu Phe Tyr
        115                 120                 125
Ala Glu Ala Ser His Pro Glu Arg Cys Leu Val Gly His Pro Phe Asn
    130                 135                 140
Pro Val Tyr Leu Leu Pro Leu Val Glu Val Val Gly Gly Glu Arg Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Glu Ala Val Arg Ala Ala Met Arg Val Tyr Glu Ser Leu Gly
                165                 170                 175
Met Arg Pro Leu His Val Arg Lys Glu Val Pro Gly Phe Ile Ala Asp
            180                 185                 190
Arg Leu Leu Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Leu His Leu Val Asn Asp
        195                 200                 205
Gly Val Ala Thr Thr Gly Glu Ile Asp Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ala
    210                 215                 220
Gly Leu Arg Trp Ser Phe Met Gly Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Leu Ala
225                 230                 235                 240
Gly Gly Asn Ala Gly Met Arg His Phe Met Ala Gln Phe Gly Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Gln Leu Pro Trp Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Leu Thr Glu Ala
            260                 265                 270
Leu Ile Asp Arg Val Val Glu Gly Thr Ala Glu Gln Gln Gly Ala Arg
        275                 280                 285
Ser Ile Ala Glu Leu Glu Arg Tyr Arg Asp Asp Cys Leu Leu Ala Val
    290                 295                 300
Leu Gly Ala Ile Arg Glu Thr Lys Ala Arg His Gly Phe Ala Phe Ala
305                 310                 315                 320
Glu
<210>5
<211>256
<212>PRT
<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)
<400>5
Met Gln Pro Ser Ser Val Leu Ala Ile Val Thr Gly Gly Val Ser Gly
1               5                   10                  15
Leu Gly Leu Ala Val Ala Gln Arg Ile Val Ala Asp Gly Gly Arg Val
            20                  25                  30
Ala Leu Phe Asp Val Asn Ala Asp Lys Ala Asp Ala Ala Leu Ala Leu
        35                  40                  45
Leu Gly Ala Gly Asn Ala His Tyr Phe Ala Thr Asp Val Thr Asp Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Val Ala Ala Asn Val Ala Gln Ala Ala Gln Ala Leu Gly Gly
65                  70                  75                  80
Leu Asn Leu Ala Val Asn Cys Ala Gly Ile Leu Gly Ala Gly Arg Val
                85                  90                  95
Leu Gly Lys Glu Ala Ala Met Pro Leu Ala Thr Phe Arg Thr Thr Val
            100                 105                 110
Met Val Asn Leu Val Gly Ser Phe Asn Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp
        115                 120                 125
Val Met Gln His Asn Ala Ala Gly Glu Asp Gly Glu Arg Gly Val Ile
    130                 135                 140
Ile His Thr Ala Ser Val Ala Ala Tyr Glu Gly Gln Ile Gly Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Val Val Gly Met Thr Leu Pro Met
                165                 170                 175
Ala Arg Glu Leu Ala Arg Phe Gly Ile Arg Val Met Thr Ile Ala Pro
            180                 185                 190
Gly Val Phe Trp Thr Pro Met Leu Asp Gly Met Pro Glu Thr Val Gln
        195                 200                 205
Gln Ser Leu Ala Ala Ser Ile Pro Phe Pro Ser Arg Leu Gly Gln Pro
    210                 215                 220
Asp Glu Tyr Ala Glu Thr Val Ala Phe Ile Leu Arg Thr Arg Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Asn Gly Glu Val Ile Arg Leu Asp Gly Gly Val Arg Leu Ala Pro Lys
                245                 250                 255
<210>6
<211>321
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)
<400>6
Met Lys Phe Ala Val Val Gly Thr Gly Val Ile Gly Ser Gly Trp Ile
1               5               10                  15
Thr Arg Met Leu Ala His Gly His Glu Val Ile Ala Thr Asp Pro Ser
            20                  25                  30
Glu Gly Ala Tyr Glu Arg Met Leu Thr Gln Val Lys Gln Asn Trp Pro
        35                  40                  45
Tyr Ala Glu Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Ala Ser Ile Gln Asn Leu
    50                  55                  60
Thr Phe Thr Pro His Leu Glu Glu Ala Val Lys Asp Ala Asp His Ile
65                  70                  75                  80
Gln Glu Asn Val Pro Glu Val Glu Glu Ile Lys Asp Ala Val Leu Lys
                85                  90                  95
Glu Ile Asp Phe Tyr Ala Lys Pro Glu Ala Thr Ile Gly Ser Ser Thr
            100                 105                 110
Ser Gly Ile Met Pro Ser Glu Leu Gln Ala Asn Leu Ser His Pro Glu
        115                 120                 125
Arg Leu Val Val Ala His Pro Phe His Pro Val Tyr Ile Leu Pro Leu
    130                 135                 140
Val Glu Ile Val Pro Gly Lys Gln Thr Ser Glu Glu Thr Thr Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Glu Gln Ile Tyr Glu Ser Ile Gly Met Asp Val Leu His Val Arg
                165                 170                 175
His Glu Ile Glu Gly His Ile Ala Asp Arg Leu Met Glu Ala Leu Trp
            180                 185                 190
Arg Glu Ser Leu His Ile Val Asn Asp Gly Ile Ala Thr Thr Glu Glu
        195                 200                 205
Val Asp Lys Ala Phe Thr His Ala Ala Gly Leu Arg Tyr Ala Gln Tyr
    210                 215                 220
Gly Pro Phe Met Thr Phe His Leu Ala Gly Gly Glu Gly Gly Met Arg
225                 230                 235                 240
His Met Leu Lys Gln Phe Gly Pro Ala Leu Lys Lys Pro Trp Thr Lys
                245                 250                 255
Leu Ile Ala Pro Glu Leu Thr Asp Asp Leu Tyr His Lys Val Val Ser
            260                 265                 270
Gly Ser Glu Ala Ser Ser Gln Gly Tyr Thr Met Ser Glu Leu Asp Gln
        275                 280                 285
Lys Arg Asn Glu Phe Leu Ile Lys Val Lys Glu Leu Ala Glu Gln Tyr
    290                 295                 300
Trp Pro Ser Asp Ser Lys Ala Met Lys Lys Ser Asn Gly Ala Glu Leu
305                 310                 315                 320
Gln
<210>7
<211>364
<212>PRT
<213>百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)
<400>7
Met Ser Ile Ile Asn Lys Ala Ala Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Trp Val Ala Arg Leu Leu Leu Asn Gly Ile Asp Val Ser Ile
            20                  25                  30
Phe Asp Pro Asp Pro Glu Ala Ser Arg Lys Val Ser Glu Val Met Lys
        35                  40                  45
Gly Ala Arg Arg Ala Tyr Lys Gln Met Val Pro Gly Gly Leu Pro Lys
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Leu Thr Phe Ala Lys Thr Ile Ala Glu Ala Val Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ala Asp Phe Ile Gln Glu Ser Val Pro Glu Arg Leu Asp Leu Lys His
                85                  90                  95
Arg Val Leu Ala Glu Ile Asp Ala His Ala Pro Ala Asn Ala  Ile Val
            100                 105                 110
Gly Ser Ser Thr Ser Gly Ile Lys Pro Thr Asp Met Gln Val Ala Met
        115                 120                 125
Lys Lys His Pro Glu Arg Leu Val Val Gly His Pro Phe Asn Pro Val
    130                 135                 140
Tyr Leu Leu Pro Leu Val Glu Ile Val Gly Gly Asp Gln Thr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Ile Glu Val Ala Lys Glu Ile Tyr Ala Ser Ile Gly Met Lys
                165                 170                 175
Pro Val Val Ile Arg Lys Glu Ile Glu Ala Phe Val Gly Asp Arg Leu
            180                 185                 190
Leu Glu Ala Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Leu Ile Lys Asp Gly Ile
        195                 200                 205
Cys Thr Val Glu Glu Leu Asp Asp Ile Met Arg Tyr Gly Phe Gly Leu
    210                 215                 220
Arg Trp Ala Gln Met Gly Met Phe Gln Val Tyr Arg Val Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Glu Ala Gly Met Arg His Phe Met Ala Gln Phe Gly Pro Cys Leu Lys
                245                 250                 255
Trp Pro Trp Thr Lys Leu Met Asp Val Pro Glu Phe Asn Asp Glu Leu
            260                 265                 270
Val Asp Leu Ile Ala Thr Gln Ser Asp Asp Gln Ala His Gly Leu Ser
        275                 280                 285
Ile Arg Glu Leu Glu Lys Ile Arg Asp Asp Asn Leu Val Ala Ile Met
    290                 295                 300
Asp Ala Leu Ser Lys Gln Asn Lys Gly Lys Gly Trp Gly Ala Gly Ala
305                 310                 315                 320
Leu His Lys Asp Tyr Thr Lys Gln Leu Ala Lys Leu Ala Ala Lys Lys
                325                 330                 335
Pro Ala Ala Ser Thr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ala Ser Lys Pro Val
            340                 345                 350
Lys Lys Ala Glu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Lys Gly
        355                 360
<210>8
<211>488
<212>PRT
<213>根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400>8
Met Val Ala Gly Met Lys Ile Ala Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Trp Ile Ala Arg Phe Ile Leu Ala Gly His Asp Val Thr Val
            20                  25                  30
Phe Asp Pro His Pro Glu Ala Asn Arg Ile Val Thr Glu Val Met Ala
        35                  40                  45
Asn Ala Ala Glu Ala Trp Gly Arg Leu Tyr Gln Ser Pro Leu Pro Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Ser Ile Asn Trp Ala Ser Ser Ile Ala Glu Ala Val Ala Gly
65                  70                  75                  80
Ala Asp Tyr Ile Gln Glu Ser Val Pro Glu Arg Leu Asp Leu Lys His
                85                  90                  95
Arg Ile Ile Ala Glu Ile Glu Ala Thr Ala Ser Pro Gln Ala Ile Ile
            100                 105                 110
Ala Ser Ser Thr Ser Gly Phe Lys Pro Ser Glu Leu Arg Glu Gly Ser
        115                 120                 125
Val His Ser Glu Arg Val Ile Val Ala His Pro Phe Asn Pro Val Tyr
    130                 135                 140
Leu Leu Pro Val Val Glu Val Val Gly Gly Gly Val Ala Ala Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ala Ser Asp Ile Leu Val Ser Val Gly Met Lys Pro Val Gln Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Glu Ile Asp Ala His Ile Gly Asp Arg Leu Leu Glu Ala Ile Trp
            180                 185                 190
Arg Glu Ala Leu Trp Leu Val Lys Asp Gly Ile Ala Thr Thr Gln Glu
        195                 200                 205
Ile Asp Asp Ile Ile Arg Tyr Gly Phe Gly Leu Arg Trp Ala Gln Met
    210                 215                 220
Gly Leu Phe Glu Thr Tyr Arg Ile Ala Gly Gly Glu Ala Gly Met Arg
225                 230                 235                 240
His Phe Leu Ala Gln Phe Gly Pro Ala Leu Lys Trp Pro Trp Thr Lys
                245                 250                 255
Leu Met Asp Val Pro Glu Phe Asn Asp Glu Leu Ile Asp Leu Ile Ala
            260                 265                 270
Gly Gln Ser Asp Ala Gln Ser Gly Ala Tyr Ser Ile Arg Glu Leu Glu
        275                 280                 285
Arg Ile Arg Asp Ser Asn Leu Ile Gly Ile Phe His Ala Leu Lys Ala
    290                 295                 300
Asn Asp Trp Gly Ala Gly Gln Thr Val Lys Ala Met Glu Asn Arg Phe
305                 310                 315                 320
Tyr Ala Arg Asn Gly Lys Val Gln Ala Asp Tyr Pro Leu Arg Leu His
                325                 330                 335
Glu Ala His Val Asn Gly Gly Trp Val Asp Tyr Asn Gly His Met Thr
            340                 345                 350
Glu Phe Arg Tyr Leu Gln Val Leu Gly Asp Ala Thr Asp Ala Leu Leu
        355                 360                 365
Ile His Ile Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Arg Ala Ala Gly His Ser Ala
    370                 375                 380
Tyr Thr Val Glu Thr His Ile Arg His Leu Ala Glu Val Lys Ala Gly
385                 390                 395                 400
Ala Arg Leu Thr Val Glu Thr Arg Leu Leu Gly Tyr Asp Asp Lys Arg
                405                 410                 415
Leu Arg Leu His His Ala Ile Leu Asn Glu Asp Gly Glu Thr Val Ala
            420                 425                 430
Thr Gly Glu His Met Leu Leu His Val Asp Thr Lys Ala Asn Arg Thr
        435                 440                 445
Val Ala Met Pro Pro Ala Leu Met Arg Ala Leu Asp His Leu Asn Ala
    450                 455                 460
Gln Glu Glu Gly Pro Leu Pro Asp His Ala Gly Ser Gly Ile Arg Ala
465                 470                 475                 480
Val Arg Leu Lys Glu Thr Ser Ala
                485
<210>9
<211>307
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>9
Met Ser Thr Val Thr Val Ile Gly Ala Gly Thr Ile Gly Leu Gly Trp
1               5                   10                  15
Ile Asn Leu Phe Ser Ala Arg Gly Leu Thr Val Arg Val Asn Ser Arg
            20                  25                  30
Arg Pro Asp Val Arg Arg Val Val His Glu Ala Leu Glu Leu Phe Ser
        35                  40                  45
Pro Gly Arg Val Asp Glu Leu Ala Ala Arg Ile Glu Tyr Glu Pro Asp
    50                  55                  60
Val Gly Arg Ala Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ser Glu Asn Ala Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Leu Pro Leu Lys Gln Arg Leu Phe Ala Glu Ile Gly Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Pro Asp His Ala Leu Val Leu Ser Ser Thr Ser Lys Leu Leu Pro
            100                 105                 110
Asp Glu Leu Ser Arg Asp Met Pro Gly Pro Gly Arg Leu Val Val Ala
        115                 120                 125
His Pro Phe Asn Pro Pro His Ile Val Pro Leu Val Glu Val Val Arg
    130                 135                 140
Gly Glu Arg Thr Asp Pro Glu Ala Val Glu Arg Thr Leu Ala Phe Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Val Gly Arg Thr Pro Val Val Val Arg Arg Ala Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Phe Ala Ala Asn Arg Leu Gln Ser Ala Leu Leu Arg Glu Ser Ile His
            180                 185                 190
Leu Val Leu Glu Gly Val Val Thr Val Glu Glu Leu Asp Arg Ile Val
        195                 200                 205
Thr Asp Ser Ile Gly Leu Arg Trp Ser Thr Ile Gly Pro Phe His Ala
    210                 215                 220
Phe His Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Leu Arg Lys Trp Leu Glu His
225                 230                 235                 240
Leu Gly Ser Gly Leu Glu Gln Gly Trp Arg Gly Leu Gly Gln Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Thr Pro Gln Ala Val Glu Ala Leu Val Ala Gln Thr Glu Ala Ala
            260                 265                 270
Tyr Gly His Arg Pro Tyr Ala Glu Leu Val Arg Asp Arg Asp Asp Arg
        275                 280                 285
His Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Glu Arg Thr Glu Gln Pro Gln Glu
    290                 295                 300
Glu Thr Lys
305
<210>10
<211>315
<212>PRT
<213>火焰色古球菌(Archaeoglobus fulgidus)
<400>10
Met Gly Val Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Gly Thr VaI Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Trp Ala Ser Leu Phe Ala Trp Arg Gly Cys Asp Val Ala Val Tyr Asp
            20                  25                  30
Pro Phe Pro Glu Ala Leu Asn Arg Ala Glu Ala Ser Ile Ala Arg Thr
        35                  40                  45
Val Ser Thr Leu Ser Glu Ile Phe Ser Gly Ser Glu Asp Asp Val Lys
    50                  55                  60
Ser Ala Leu Ser Arg Val Lys Phe Thr Glu Asn Leu Glu Glu Ala Leu
65                  70                  75                  80
Lys Gly Ala Tyr Tyr Val Gln Glu Ser Ala Val Glu Lys Leu Glu Val
                85                  90                  95
Lys Arg Asp Leu Phe Glu Lys Met Asp Ala Ile Ala Glu Pro Glu Thr
            100                 105                 110
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Ser Gly Leu Ser Ile Ser Glu Ile Gln Thr
        115                 120                 125
Ala Ala Arg Lys His Pro Glu Arg Cys Ile Thr Ala His Pro Tyr Asn
    130                 135                 140
Pro Pro His Leu Ile Pro Leu Val Glu Val Val Pro Arg Lys Gln Thr
145                 150                 155                 160
Asp Glu Ser Cys Thr Glu Lys Thr Val Glu Phe Met Glu Arg Met Gly
                165                 170                 175
Lys Lys Pro Ile Val Val Lys Lys Asp Val Pro Gly Met Val Ala Asn
            180                 185                 190
Arg Leu Ala Ala Ala Leu Trp Arg Glu Ala Val Asn Leu Val Tyr Gln
        195                 200                 205
Gly Ile Ala Thr Pro Glu Glu Ile Asp Val Ala Val Lys Tyr Gly Pro
    210                 215                 220
Gly Ile Arg Trp Ala Ile Thr Gly Val Tyr Leu Thr Tyr His Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Gly Gln Gly Gly Met Lys Tyr Phe Leu Glu Phe Phe Asp Asp His
                245                 250                 255
Tyr Arg Arg Leu Trp Ser Asp Leu Ala Asn Trp Ser Glu Tyr Pro Glu
            260                 265                 270
Gly Ser Phe Asp Ala Ile Leu Lys Ser Met Glu Gly Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Lys Arg Met Ser Tyr Asp Glu Leu Ala Lys Trp Arg Asp Asp Gln Leu
    290                 295                 300

Claims (19)

1.用微生物制备式I取代的(S)-链烷酮的方法，其中，在含有式II链烷酮的介质中：
a)培养产生具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的微生物，或
b)孵育具有L-肉碱脱氢酶活性的酶，
式II化合物被酶还原得到式I化合物，并分离形成的产物，
Figure A2004800092430002C1
其中
n为从0到5的整数；
Cyc为未取代或取代的、单核或多核的、饱和或不饱和的碳环或杂环，且
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4互不依赖的为H或低级烷基或低级烷氧基且X-为平衡离子，
Figure A2004800092430002C2
其中n、Cyc和R1如上文定义。
2.权利要求1所要求的制备式III 3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的方法，其中，在含有式IV 3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙烷-2-酮的介质中，所述化合物被酶还原得到式III化合物，并分离形成的(基本对映异构纯的)产物。
Figure A2004800092430002C3
3.前述任一项权利要求中要求的方法，其中具有L-肉碱脱氢酶活性的酶选自L-肉碱脱氢酶(E.C.1.1.1.108)和3-羟酰基辅酶A脱氢酶(E.C.1.1.1.35)。
4.前述任一项权利要求中要求的方法，其中具有L-肉碱脱氢酶活性的酶选自产碱杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、葡萄球菌、根瘤菌、农杆菌、链霉菌和古球菌属微生物的酶。
5.前述任一项权利要求中要求的方法，其中具有L-肉碱脱氢酶活性的酶选自含有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列或来自它们的核酸序列编码的酶，以及具有L-肉碱脱氢酶活性、催化对映有择地合成式I化合物的所述酶的功能等效物。
6.前述任一项权利要求中要求的方法，其中具有L-肉碱脱氢酶活性的酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或其功能等效物编码。
7.前述任一项权利要求中要求的方法，其中反应在添加还原等效物或在再生消耗的还原等效物的条件下进行。
8.前述任一项权利要求中要求的方法，其中式II化合物在选自肠杆菌、假单胞菌、根瘤菌、链霉菌和诺卡氏菌家族细菌的微生物存在下反应。
9.前述任一项权利要求中要求的方法，其中微生物为转化了核酸构建体的重组微生物，所述核酸构建体编码如权利要求3到6中任一项所定义的具有L-肉碱脱氢酶活性的酶。
10.前述任一项权利要求中要求的方法，其中
a)从天然来源中分离或重组制备产生具有L-肉碱脱氢酶活性的酶的微生物，
b)繁殖所述微生物，
c)适当时，从所述微生物分离所述具有L-肉碱脱氢酶活性的酶或从该微生物中制备含有该酶的蛋白质级分，并且
d)将符合步骤b)的所述微生物或步骤c)的所述酶转移到含有式I化合物的介质中。
11.制备式V化合物的方法，其中
a)首先如前述任一项权利要求所定义微生物制备式I化合物；并且，
b)式I化合物与式VI芳香化合物反应，
c)分离式V化合物，
Figure A2004800092430004C1
其中n、Cyc和R1如上定义且Ar为单核或多核的、未取代或取代的芳基，
                        Ar-Y    (VI)
其中Ar如前文定义且Y为离去基团。
12.权利要求11的方法，其中制备了Ar为1-萘基、Cyc为2-噻吩基、R1为一甲基苯胺且n为1的式V化合物。
13.含有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列或来自它们的核酸序列编码的多肽，以及具有L-肉碱脱氢酶活性，催化对映有择地合成式I化合物的这些酶的功能等效物。
14.核酸序列，其含有编码权利要求13要求的多肽的序列。
15.含有权利要求14要求的核酸序列的表达盒，其中核酸序列与至少一个核酸调节序列有效连接。
16.含有至少一个权利要求15的表达盒的重组载体。
17.转化了至少一种权利要求16的载体的原核或真核细胞。
18.权利要求3到6中任一项所定义的具有L-肉碱脱氢酶活性的酶或产生所述酶的微生物在制备式I或III化合物中的用途。
19.权利要求18要求的制备度洛西汀的用途。
CNA2004800092436A 2003-04-07 2004-04-06 L－肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(s)－链烷醇的制备 Pending CN1771323A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10315760A DE10315760A1 (de) 2003-04-07 2003-04-07 L-Carnitin Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von substituierten (S)-Alkanolen
DE10315760.3 2003-04-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1771323A true CN1771323A (zh) 2006-05-10

Family

ID=33016185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800092436A Pending CN1771323A (zh) 2003-04-07 2004-04-06 L－肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(s)－链烷醇的制备

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20060211099A1 (zh)
EP (1) EP1613745B1 (zh)
JP (1) JP2006521800A (zh)
CN (1) CN1771323A (zh)
AT (1) ATE389714T1 (zh)
CA (1) CA2521288A1 (zh)
DE (2) DE10315760A1 (zh)
WO (1) WO2004090094A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102574821A (zh) * 2009-10-15 2012-07-11 爱思开生物制药株式会社 制备氨基甲酸(r)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法
CN103436503A (zh) * 2013-08-27 2013-12-11 宁波赛克生物技术有限公司 L-肉碱脱氢酶的提纯方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004022686A1 (de) 2004-05-05 2005-11-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole
DE102005010804A1 (de) * 2005-03-07 2006-09-14 Basf Ag Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole
DE102005044736A1 (de) * 2005-09-19 2007-03-22 Basf Ag Neue Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen
DE102005062662A1 (de) * 2005-12-23 2007-06-28 Basf Ag Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole
CN101484435A (zh) 2006-07-03 2009-07-15 兰贝克赛实验室有限公司 制备n-甲基-3-（1-萘氧基）-3-（2-噻吩基）丙胺及其纯对应异构体盐的方法
US8426178B2 (en) 2008-08-27 2013-04-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
WO2010025287A2 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
RU2508290C2 (ru) * 2009-06-22 2014-02-27 ЭсКей БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ КО., ЛТД. Способ получения (r)-1-арил-2-тетразолилэтилового эфира карбаминовой кислоты
JP6067204B2 (ja) * 2010-04-20 2017-01-25 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス細菌のためのランダムゲノム挿入及び欠失ツール
JP5740955B2 (ja) * 2010-12-10 2015-07-01 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌の形質転換のためのランダム遺伝子導入用ツール

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1142201B (it) * 1980-06-24 1986-10-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina
IE56322B1 (en) * 1982-12-06 1991-06-19 Sigma Tau Ind Farmaceuti Process for preparing l-carnitine and chemical intermediates employed therein

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102574821A (zh) * 2009-10-15 2012-07-11 爱思开生物制药株式会社 制备氨基甲酸(r)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法
CN102574821B (zh) * 2009-10-15 2015-03-18 爱思开生物制药株式会社 制备氨基甲酸(r)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法
CN103436503A (zh) * 2013-08-27 2013-12-11 宁波赛克生物技术有限公司 L-肉碱脱氢酶的提纯方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE502004006579D1 (de) 2008-04-30
US20060211099A1 (en) 2006-09-21
DE10315760A1 (de) 2004-10-21
WO2004090094A2 (de) 2004-10-21
ATE389714T1 (de) 2008-04-15
EP1613745A2 (de) 2006-01-11
WO2004090094A3 (de) 2005-03-17
EP1613745B1 (de) 2008-03-19
CA2521288A1 (en) 2004-10-21
JP2006521800A (ja) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1177926C (zh) 产l-谷氨酸棒状细菌及生产l-谷氨酸的方法
CN1182250C (zh) 用于制备抗坏血酸、2-酮-l-古洛糖酸及2-酮-l-古洛糖酸酯的酶促方法
CN1260363C (zh) 由腈化合物生产酰胺的方法
CN1950513A (zh) 使用固氮弓菌的脱氢酶由链烷酮制备旋光醇的方法
CN1183252C (zh) 新型细胞色素p450单加氧酶及其在有机化合物的氧化方面的应用
CN1678742A (zh) 新型醛缩酶和取代α－酮酸的制备方法
CN1196789C (zh) 经修饰的细胞色素p450单加氧酶
CN1610749A (zh) 谷氨酸衍生物的制备方法
CN1993464A (zh) 新羰基还原酶、其基因及它们的使用方法
CN1723281A (zh) 突变的d－氨基转移酶和使用它们生产旋光性谷氨酸衍生物的方法
CN1860110A (zh) 产生3－甲基氨基－1－(噻吩－2－基)丙－1－醇的方法
CN1771323A (zh) L－肉碱脱氢酶、其衍生物以及取代的(s)－链烷醇的制备
CN1571843A (zh) 腈水合酶和生产酰胺的方法
CN1675371A (zh) 具有α－H－α－氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽和编码该多肽的核酸
CN1836044A (zh) 头孢菌素c酰基转移酶突变体及用其制备7－aca的方法
CN1656225A (zh) 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法
CN1203173C (zh) 转谷氨酰胺酶的制备方法
CN101045664A (zh) 分离和纯化的方法
CN1795270A (zh) 编码具有d－乳酸脱氢酶活性蛋白质的dna及其用途
CN1224697C (zh) 氨基醇及其衍生物的制备方法
CN1529756A (zh) 环状l-氨基酸的立体选择性制备
CN1753990A (zh) 经修饰的腈水解酶及它们在产生羧酸的方法中的用途
CN101056984A (zh) 制备旋光醇的方法
CN1223604C (zh) 牝牛分枝杆菌甲酸脱氢酶突变体及其用途
CN1639320A (zh) 冷休克诱导的异源多肽的表达和生产

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication