CN102574821B - 制备氨基甲酸(r)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法 - Google Patents

制备氨基甲酸(r)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法，包括相应芳基酮的对映体选择性酶还原以及所得醇的氨基甲酰化。

Description

制备氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法
技术领域
本发明涉及一种制备氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法。更具体地，本发明涉及一种制备氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法，其包括芳基酮的对映体选择性酶还原。
背景技术
如美国专利申请公开No.2006/0258718A1所公开，具有抗痉挛活性的氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯(以下简称“氨基甲酸酯化合物”)用于治疗中枢神经系统紊乱，尤其包括焦虑、抑郁、痉挛、癫痫、偏头痛、躁郁症、药物滥用、吸烟、注意缺陷多动障碍(ADHD)、肥胖、失眠、神经性疼痛、中风、认知障碍、神经变性、中风和肌肉痉挛。
根据其四唑部分中“N”的位置，氨基甲酸酯化合物分为两种位置异构体：四唑-1-基(以下简称“1N四唑”)和四唑-2-基(以下简称“2N四唑”)。制备氨基甲酸酯化合物时四唑的引入导致两种位置异构体1∶1的混合物，在药用时需要将其各自分离。
由于具有手性，氨基甲酸酯化合物用作药物时必须具有高光学纯度以及化学纯度。
基于此，美国专利申请公开No.2006/0258718A1采用纯对映体(R)-芳基-氧杂环丙烷((R)-aryl-oxirane)作为起始原料，于溶剂中在适当碱的存在下通过与四唑的开环反应将其转化为醇中间体，然后向醇中间体中引入氨基甲酰基团。为了分离和纯化由此制备的1N和2N位置异构体，可以在形成醇中间体或氨基甲酸酯后进行柱层析。
为用于上述制备方法，(R)-2-芳基-氧杂环丙烷可以通过各种途径从光学活性原料如取代的(R)-苦杏仁酸衍生物来合成，或者通过α-卤代芳基酮的不对称还原-成环反应来获得，或者通过将外消旋的2-芳基-氧杂环丙烷混合物分离为其单独的对映体来获得。就其本身而言，(R)-2-芳基-氧杂环丙烷是一种昂贵的化合物。
另外，由于四唑的低亲核性，(R)-2-芳基-氧杂环丙烷与四唑的开环反应需在相对高的温度下进行。但是，由于在110～120℃四唑开始自发地分解，开环反应仍然具有很高的失控反应风险。
就反应的选择性而言，由于(R)-2-芳基-氧杂环丙烷和四唑各自具有两个反应位点，它们之间的开环反应在苄基或末端位置得到1N-或2N-四唑的取代物，导致共计4种位置异构体的混合物。因此，单独的位置异构体产率较低，并且难以分离和纯化。
发明内容
技术问题
本发明的一个方面是提供一种新的制备(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法。
技术方案
为实现以上方面，本发明提供一种制备化学式1所示的氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法，包括：将化学式2所示的芳基酮进行对映体选择性酶还原；以及将化学式3所示的(R)-构型醇化合物氨基甲酰化：
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、全氟烷基、1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的硫代烷氧基和1-8个碳原子的烷氧基；以及
A1和A2中的一个为CH，另一个为N。
有益效果
根据本发明的一个方面，可经济地制备高光学纯度和高化学纯度的氨基甲酸酯化合物。
最佳实施方式
本发明的另一个方面是提供一种新的制备下述化学式3所示醇化合物的方法，通过下述化学式2所示芳基酮的对映体选择性酶还原：
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、全氟烷基、1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的硫代烷氧基和1-8个碳原子的烷氧基；
A1和A2中的一个为CH，另一个为N；以及
所述还原在反应混合物中进行，所述反应混合物包括：化学式2的所述化合物；与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4至少60％同源的氧化还原酶；还原过程中被氧化并连续再生的辅因子NADH或NADPH；包含化学式RxRyCHOH所示仲醇的共底物，其中Rx表示个数为x的碳，x为1-10的整数，Ry表示个数为y的氢，y为x值二倍加二的整数；以及适当的缓冲液。
本发明的一个实施方案提供了制备下述化学式1所示氨基甲酸(R)-1-芳基-2-四唑基-乙酯的方法，其包括下述化学式2所示芳基酮的对映体选择性酶还原以及下述化学式3所示醇化合物的氨基甲酰化。
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、全氟烷基、1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的硫代烷氧基和1-8个碳原子的烷氧基；以及
A1和A2中的一个为CH，另一个为N。
用作本发明制备方法中起始原料的化学式2的芳基酮，可以通过例如化学式4的芳基酮与化学式5的四唑之间的取代反应来合成：
[化学式4]
[化学式5]
其中，
R1和R2的定义如上；和
X为离去基团，如卤化物或磺酸盐。
从化学式4和5所示的化合物合成化学式2的芳基酮具有经济优势，因为它们是商业上易得的价廉化合物。另外，与(R)-2-芳基-氧杂环丙烷和四唑的开环反应相比，该取代反应可以在相对温和的条件下进行。尽管采用了潜在易爆炸的四唑，本发明所述的方法由此确保了工艺的安全性，并且保证了高产物收率和简单的纯化方法，产物在苄基位置没有产生不必要的位置异构体。
可与四唑通过取代反应合成的化学式2的芳基酮，可在包括下述化学式2a的1N芳基酮和下述化学式2b的2N芳基酮的位置异构体混合物中，其可以通过商业上可利用的结晶进行分离和纯化。
[化学式2a]
[化学式2b]
本发明采用的结晶可以包括：向取代反应产物也就是位置异构体的混合物中加入增溶剂，然后加入沉淀剂。可选地，所述结晶还可包括：沉淀之后过滤沉淀物，浓缩滤液，并加入额外的沉淀剂。
用于说明而非限制性的增溶剂的实例包括丙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、1，4-二噁烷和1-4个碳原子的低级醇或其组合。根据位置体异构体混合物的重量(g)，增溶剂的用量可以为0-20ml(v/w)。如本文所用，使用的增溶剂加入量为零ml(v/w)，是指不需要稀释滤液而直接加入后续沉淀剂。
沉淀剂的实例包括水、C1-C4低级醇、乙醚、戊烷、己烷、环己烷、庚烷或其组合，但不限于此。根据位置异构体混合物的重量(g)，可缓慢加入的沉淀剂量为0-40ml(v/w)。如本文所用，使用的沉淀剂加入量为零ml，是指不需要加入沉淀剂而静置或冷却以产生沉淀。
将通过加入沉淀剂而得到的沉淀物过滤，得到作为高纯度结晶体的化学式2a的1N芳基酮。
另一方面，过滤步骤后所得的滤液可以通过浓缩来增加沉淀剂对增溶剂的比率，由此得到高纯度的化学式2b的2N芳基酮。本领域普通技术人员可以恰当地确定滤液浓缩比率。例如，浓缩至溶剂被完全除去，然后按照以上所述加入增溶剂和沉淀剂。
与柱层析不同的是，该结晶商业化应用不会存在很多困难。
对映体选择性酶还原使化学式2的芳基酮转变为下述化学式3所示具有(R)-构型的醇化合物。
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、全氟烷基、1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的硫代烷氧基和1-8个碳原子的烷氧基；以及
A1和A2中的一个为CH，另一个为N。
对映体选择性酶还原可采用将氧化还原酶悬浮于反应混合物中或以常规方式固定来进行。所述酶可在完全纯化状态下、部分纯化状态下使用，或在表达其的微生物细胞中使用。细胞自身可以为天然状态、透性化状态(permeabilized state)或溶解状态。本领域普通技术人员知晓：本发明方法的实施优选使用细胞中的酶，因为其代表明显地节约了成本。最优选地，所述酶在大肠杆菌(E.coli)中表达并作为天然细胞的悬浮液使用。
化学式2的芳基酮化合物的酶还原过程可在反应混合物中进行，所述反应混合物包括：化学式2的所述化合物、氧化还原酶、作为辅因子的NADH或NADPH、共底物以及适当的缓冲液；其中所述氧化还原酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之一具有至少60％氨基酸一致性的氨基酸序列。
现已发现，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4之一的多肽，或包含与氨基酸序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之一具有至少60％、优选90％一致性的氨基酸序列并具有氧化还原酶活性的多肽，可以用于以高转化率和高对映体选择性将式2的化合物还原为式3的化合物(R-构型)。在对映体选择性酶中形成的R-醇的对映体过量至少约89％，优选至少约95％，最优选至少约99％。
产生用于对映体选择性酶还原的氧化还原酶多肽的生物体可为野生株或变异体，优选地选自木兰假丝酵母(Candida magnolia)、越橘假丝酵母(Candida vaccinii)和穴兔(Oryctolagus cuniculus)。优选假丝酵母属的酵母用于产生本发明方法使用的氧化还原酶。多肽的衍生物是与上述给出的序列SEQ IDs具有至少60％同源性并具有氧化还原酶活性的那些多肽。本领域技术人员知晓，可以获得那些用于准确确定序列同源性的体系和技术。
包含SEQ ID NO：1的多肽可以通过可获得的DNA序列SEQ IDNO：5编码，例如，来源于生物体穴兔(Oryctolagus cuniculus)，其根据布达佩斯条约保藏于Mascheroder路1b，38124的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen)，编号为DSMZ 22167，具体来源于兔DSMZ 22167，或通过与之杂交的核酸序列编码。包含SEQ ID NO：2的多肽可以通过可获得的DNA序列SEQ ID NO：6编码，例如，来源于生物体木兰假丝酵母DSMZ 22052，或通过与之杂交的核酸序列编码。
包含SEQ ID NO：3的多肽可以通过可获得的DNA序列SEQ IDNO：7编码，例如，来源于生物体越橘假丝酵母CBS7318，或通过与之杂交的核酸序列编码。包含SEQ ID NO：4的多肽可以通过可获得的DNA序列SEQ ID NO：8编码，例如，来源于生物体木兰假丝酵母CBS6396，或通过与之杂交的核酸序列编码。
通过本领域技术人员公认的常规步骤，可获得可用量的具有上述多肽序列之一的氧化还原酶。将用于编码所述氨基酸序列的多核苷酸克隆至适当的载体，然后引入到可以表达编码所述序列的基因的宿主生物体中。易感于转化的微生物可以表达此肽，这在本领域是公知的。优选的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。如上所述，通过转化的大肠杆菌表达的氧化还原酶可以从大肠杆菌细胞中提取，并且部分或完全纯化以用于本发明的方法中，或可以在细胞自身中使用，所述细胞可以为天然、透性化或溶解状态。对映体选择性酶还原的一个优选实施方案使用氧化还原酶的悬浮液，细胞为天然状态。这些形式中的任一种都可以以游离或固定的形式使用。
还原反应可以在含有悬浮于其中并含所述酶的细胞的单一相体系中进行。或者，反应还可以在如美国专利申请公开No.2009/0017510和美国专利No.7,371,903所描述的两相水/有机溶剂体系中进行。所述反应的实施可以为常规的分批反应，或为连续反应。对映体选择性酶还原在商业上应用的重要优势之一即其可以顺应连续操作。
反应混合物加入的每千克反应物优选包含约35g-350g细胞。悬浮液为反应混合物的水相部分，其还包含缓冲液，例如TEA(三乙醇胺)、磷酸盐、Tris/HCl或甘氨酸缓冲液。缓冲液还可额外包含用于酶稳定化的离子，例如镁离子源。可存在于缓冲液中用于稳定酶的额外添加剂包括：多元醇，如甘油、山梨醇等；硫化合物，如1，4-DL-二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸等；氨基酸和肽；或洗涤剂(detergents)，如DMSO。优选的酶稳定剂为多元醇，特别是甘油，基于细胞悬浮液的重量，其按重量约为10％-80％，优选按重量约为50％。
对映体选择性酶还原过程可采用底物偶联机理(coupledsubstrate principle)有利地进行，其中反应混合物使用共底物用于再生辅因子或辅酶，其功能为向芳基酮底物的还原提供氢。辅因子优选为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，其以还原态即分别为NADPH或NADH使用。存在于反应混合物中的辅因子浓度为0.01mM-5mM，优选0.05mM-0.5mM。在反应中，共底物的功能为在NADPH或NADH辅因子的再生中被氧化。共底物为化学式RxRyCHOH表示的仲醇，其中Rx表示个数为x的碳，x为1-10的整数，Ry表示个数为y的氢，y为x值二倍加二的整数。合适的共底物实例包括2-丙醇、2-丁醇、4-甲基-2-戊醇、2-戊醇、2-庚醇、2-辛醇等。优选的共底物为2-丁醇。存在于反应混合物中的共底物按体积约为10％-80％，优选按体积约为40％-60％，最优选按体积约为50％。
形成于芳基酮还原期间的氧化辅因子通过共底物的氧化而再生，其也可由氧化还原酶催化。因此，本发明方法一个特别经济的优势为氧化还原酶可以同时作用于化学式1芳基酮的还原和共底物的氧化，因此无需其它酶用于辅因子再生。为了提高芳基酮的还原速度，向反应混合物中添加其它的酶用于辅因子的再生，也包含在本发明的范围内。
在另外的实施方案中，可向反应混合物中加入不参与辅因子再生的有机溶剂，还原过程在水-有机的两相体系中进行。此类溶剂的实例包括但不限于，乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或环己烷。基于反应混合物的体积，此类溶剂的存在按体积约为1％-50％。
反应混合物中芳基酮底物的量优选按重量高于约0.1％，并可增加至按重量约为50％，优选的浓度按重量约为5％-30％。底物的量将依据其纯度而变化，因为所述方法的实施可以在底物为纯化状态或为含有不同含量和种类杂质的粗产品。加入所有组分后的反应混合物pH值可以在5-10的范围内，优选7-9，最优pH值约为8。根据本发明的酶还原可以在约10-45℃的温度下进行，优选约20-40℃，最优选约25-35℃。
对映体选择性还原方法除了以高收率和极高对映体选择性提供化学式3的醇之外，其还是成本效益型和环境友好的方法。因此，在酶存在以及上述反应条件下，约12-96小时之内，优选约24-48小时之内，可获得高光学纯度的(R)-构型醇化合物。在孵育期间，通过周期性检测和分别加入常规酸性或碱性试剂如碳酸钠和氢氧化钠，可将混合物的pH值维持在上述给出的范围内。对映体选择性酶还原的效率可通过总转换数(total turnover number，TTN)表示，其为每摩尔最初加入的辅因子中产生的化学式2手性醇的摩尔数。对映体选择性酶还原的TTN值约为102-105，优选≥103。
当通过对映体选择性酶还原得到的醇化合物以化学式3a的1N醇和化学式3b的2N醇的位置异构体混合物形式存在时，可以通过结晶来分离和纯化成单独的高纯度位置异构体：
[化学式3a]
[化学式3b]
结晶可以包括，向由还原得到的位置异构体混合物中加入增溶剂；加入沉淀剂，和可选地过滤沉淀物；以及浓缩滤液并加入额外的沉淀剂。
用于结晶的增溶剂的实例包括丙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、1，4-二噁烷和1-4个碳原子的低级醇及其混合物，但不限于此。根据位置异构体混合物的重量(g)，增溶剂的添加量可以为0-20ml(v/w)。
沉淀剂的非限制性的实例包括水、1-4个碳原子的低级醇、乙醚、戊烷、己烷、环己烷、庚烷及其混合物。根据位置异构体混合物的重量(g)，沉淀剂可缓慢加入的量为0-40ml(v/w)。
加入沉淀剂后，通过过滤可以得到沉淀物形式的高纯度的1N醇(3a)。
此外，可以通过浓缩滤液并增加沉淀剂对增溶剂的比率以晶体形式得到非常高纯度的2N醇(3b)。
当化学式2芳基酮的位置异构体已经被分离和纯化时，这些结晶步骤可以省略。
向化学式3的(R)-构型醇化合物引入氨基甲酰基部分，产生化学式1所示的具有(R)-构型的氨基甲酸酯：
[化学式3]
[化学式1]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、全氟烷基、1-8个碳原子的烷基、1-8个碳原子的硫代烷氧基和1-8个碳原子的烷氧基；以及A1和A2中的一个为CH，另一个为N。
在氨基甲酰化步骤中，例如，无机氰酸盐-有机酸，异氰酸盐-水，或羰基化合物-氨可以用于引入氨基甲酰基部分。
采用无机氰酸盐-有机酸进行氨基甲酰化时，将化学式3的(R)-构型醇化合物溶于有机溶剂，例如乙醚、四氢呋喃、1，4-二噁烷、乙腈、二氯甲烷、氯仿或其混合物，并与1-4当量的无机氰酸盐如氰酸钠和有机酸如甲基磺酸或乙酸混合，然后在约-10℃至70℃下反应。
采用异氰酸盐-水时，将1-4当量的异氰酸酯，例如氯磺酸异氰酸酯、三氯乙酰基异氰酸酯、三甲基甲硅烷基异氰酸酯，加入到化学式3的(R)-构型醇化合物与有机溶剂如乙醚、四氢呋喃、1，4-二噁烷、乙腈、二氯甲烷、氯仿或其混合物形成的溶液中，并在约-50℃至40℃下反应。然后，不需要纯化，加入1-20当量的水进行水解。
采用羰基化合物-氨水时，将1-4当量的羰基化合物，例如，1，1’-羰基二咪唑、氨基甲酰氯、二琥珀酰碳酸酯、光气、三光气或氯甲酸酯，加入到化学式3的(R)-构型醇化合物与有机溶剂如乙醚、四氢呋喃、1，4-二噁烷、乙腈、二氯甲烷、氯仿或其混合物形成的溶液中，并在约-10℃至70℃下反应，然后加入1-10当量的氨水，不需要纯化。
氨基甲酰化以后，将由此得到的化学式1的氨基甲酸酯化合物通过接下来的结晶可以纯化至更高的光学和化学纯度。所述结晶包括向氨基甲酰化产物中加入增溶剂；然后加入沉淀剂，可选地过滤沉淀物并加入额外的沉淀剂。用于药用时，优选总是在使用前对氨基甲酰化产物进行最终纯化，但是在该过程的前期也可以进行结晶步骤。
增溶剂的非限制性实例包括丙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、1，4-二噁烷和1-4个碳原子的低级醇及其混合物。根据反应产物的重量(g)，增溶剂的用量可以为0-20ml(v/w)。
沉淀剂的非限制性实例包括水、1-4个碳原子的低级醇、乙醚、戊烷、己烷、环己烷、庚烷及其混合物。根据反应产物的重量(g)，沉淀剂可缓慢加入的量为0-40ml(v/w)。
包括对映体选择性酶还原，本发明的方法可以提供光学上高纯的氨基甲酸酯化合物。另外，本发明所需的温和反应条件保证了工艺的安全性。而且，在对映体选择性酶还原之前或之后，或者氨基甲酰化之后，适宜大规模生产的结晶步骤产生更高化学纯度的氨基甲酸酯化合物。如下述实施例所示，根据本发明制备的氨基甲酸酯化合物在治疗中枢神经系统(CNS)紊乱如痉挛中非常有用。
具体实施方式
通过下述用于详细说明但不应解释为对本发明限制的实施例，可以更好地理解本发明。
制备实施例1：1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-1-基)乙烷-1-酮的制备
室温下，向2-溴-2’-氯苯乙酮(228.3g，0.978mol)和碳酸钾(161.6g，1.170mol)的乙腈(2000mL)悬浮液中加入35w/w％的1H-四唑二甲基甲酰胺溶液(215.1g，1.080mol)。这些反应物在45℃下搅拌2h，减压蒸馏以除去约1500mL溶剂。浓缩物用乙酸乙酯(2000mL)稀释，并用10％盐水洗涤(3×2000mL)。将分离的有机层减压蒸馏得到216.4g油状固体残留物。向所述固体残留物的乙酸乙酯(432mL)溶液中缓慢加入庚烷(600mL)。室温下过滤所形成的沉淀物并洗涤得到90.1g(0.405mol)1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-1-基)乙烷-1-酮(下文简称“1N酮”)。
1H-NMR(CDCl3)8.87(s，1H)，d7.77(d，1H)，d7.39-7.62(m，3H)，d5.98(s，2H)。
制备实施例2：1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-酮的制备
在制备实施例1的过滤步骤之后，浓缩滤液，并溶于异丙醇(100mL)中，然后向其中加入庚烷(400mL)以完成结晶。5℃下过滤和洗涤得到固体1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-酮(下文简称“2N酮”)94.7g(0.425mol)。
1H-NMR(CDCl3)d8.62(s，1H)，d7.72(d，1H)，d7.35-7.55(m，3H)，d6.17(s，2H)。
制备实施例3：以不同氧化还原酶通过对映体选择性酶还原制备(R)-构型醇化合物
以下四种溶液制备如下：
酶溶液1
将感受态大肠杆菌StarBL21(De3)细胞(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen))用编码氧化还原酶SEQ ID NO 1的表达构建体pET21-MIX转化。然后将用所得表达构建体转化的大肠杆菌菌落培养于分别含有50微克/mL氨苄西林或40微克/mL卡那霉素的200mL LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母和1％氯化钠)中，直至550nm下检测光密度达到0.5。通过添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至浓度为0.1mM来诱导所需重组蛋白的表达。在25℃和220rpm下诱导16h之后，收获细胞并在-20℃下冷冻。在酶溶液的制备过程中，将30g细胞重悬于150mL三乙醇胺缓冲液(TEA100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)中，并在高压均化器中进行均质化。将得到的酶溶液与150mL甘油混合并于-20℃下储存。
酶溶液2
将RB791细胞(美国耶鲁大学大肠杆菌遗传储备库(E.coligenetic stock，Yale，USA))用编码氧化还原酶SEQ ID NO 2的表达构建体pET21-MIX转化。然后将用所得表达构建体转化的大肠杆菌菌落培养于分别含50微克/mL氨苄西林或40微克/mL卡那霉素的200mL LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母和1％氯化钠)中，直至550nm下检测光密度达到0.5。通过添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至浓度为0.1mM来诱导所需重组蛋白的表达。在25℃和220rpm下诱导16h之后，收获细胞并在-20℃下冷冻。在酶溶液的制备过程中，将30g细胞重悬于150mL三乙醇胺缓冲液(TEA100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)中，并在高压均化器中进行均质化。将得到的酶溶液与150mL甘油混合并于-20℃下储存。
酶溶液3
除采用编码氧化还原酶SEQ ID NO 3的表达构建体pET21-MIX代替编码氧化还原酶SEQ ID NO 1的表达构建体pET21-MIX之外，酶溶液3的制备与酶溶液1描述的方法相同。
酶溶液4
除采用编码氧化还原酶SEQ ID NO 4的表达构建体pET21-MIX代替编码氧化还原酶SEQ ID NO 2的表达构建体pET21-MIX之外，酶溶液4的制备与酶溶液2描述的方法相同。
对包含不同氧化还原酶的各酶溶液1-4进行如下试验，分别将1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-1-基)乙烷-1-酮(1N酮)和1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-酮(2N酮)转化为相应的1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-1-基)乙烷-1-醇(下文简称“1N醇”)和1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-醇(下文简称“2N醇”)。
反应批次A
160μl缓冲液(TEA 100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)
100μl NADPH(40mg/ml)
40μl 2-丙醇
50μl酶溶液1
2mg 1N酮或2N酮
反应批次B
160μl缓冲液(TEA 100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)
100μl NADPH(40mg/ml)
40μl 2-丙醇
50μl酶溶液2
2mg 1N酮或2N酮
反应批次C
350μl缓冲液(TEA 100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)
0.05mg NADP
50μl酶溶液3
10mg 1N酮或2N酮
250μl 4-甲基-2-戊醇
50μl用于辅因子再生的酶(来自布氏热厌氧菌(Thermoanerobium brockii)的氧化还原酶)溶液
反应批次D
350μl缓冲液(TEA 100nM、2mM MgCl2、10％甘油，pH 8)
0.05mg NADP
50μl酶溶液4
10mg 1N酮或2N酮
250μl 4-甲基-2-戊醇
50μl用于辅因子再生的酶(来自布氏热厌氧菌(Thermoanerobium brockii)的氧化还原酶)溶液
每个反应批次A、B、C和D孵育24h之后，向离心后的每个反应批次中分别加入1ml乙腈，并转移至HPLC分析容器中分析对映体过量以及转化率。产物的转化率和ee-值列于下面表1中，用下述等式计算：
转化率(％)＝[(产物面积)/(反应物面积+产物面积)]×100
ee-值(％)＝[(R-构型面积-S-构型面积)/(R-构型面积+S-构型面积)]×100
表1
[表1]
制备实施例4：通过氧化还原酶SEQ NO：2的酶还原
为了将1N/2N酮转化为R-1N/R-2N醇，将300μl缓冲液(100mMTEA，pH 8，1mM MgCl2，10％甘油)、100mg 1N酮和2N酮的混合物(1N∶2N＝14％∶86％)、0.04mg NADP和300μl 2-丁醇混合，向所得混合物中加入30μl含有氧化还原酶SEQ NO：2的酶溶液2。将反应混合物在连续充分混合下于室温孵育。48h之后，98％以上的酮被还原为以下组成的醇混合物(R-2N醇80％；S-2N醇0％；R-1N醇20％；S-1N醇0％；1N酮0％；2N酮0％)。
常规的后处理以及用乙酸乙酯/己烷重结晶之后，得到如下光学纯的醇：
(R)-1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-1-基)乙烷-1-醇(1N醇)
1H-NMR(CDCl3)d8.74(s，1H)，d7.21-7.63(m，4H)，d5.57(m，1H)，d4.90(d，1H)，d4.50(d，1H)，d3.18(d，1H)；
(R)-1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-醇(2N醇)
1H-NMR(CDCl3)d8.55(s，1H)，d7.28-7.66(m，4H)，d5.73(d，1H)，d4.98(d，1H)，d4.83(d，1H)，d3.38(br，1H)。
氨基甲酸酯的制备
制备实施例5：氨基甲酸(R)-1-(2-氯苯基)-2-(四唑-2-基)乙酯的制备
将250mL缓冲液(100mM TEA，pH 8，1mM MgCl2，10％甘油)、50g(225mmol)1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-酮(2N酮)、4mg NAD、300mL 2-丙醇和150mL乙酸丁酯混合，向所得混合物中加入50mL含有氧化还原酶SEQ NO：2的酶溶液2。反应混合物在室温下搅拌。48h之后，98％以上的2N酮被还原成＞99％ee值的相应(R)-1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-醇(R-2N醇)。向所得混合物中加入500mL乙酸乙酯。经过分离后，将由此形成的有机层用10％盐水(3×500mL)洗涤。得到的有机层用硫酸镁干燥并过滤，滤液减压蒸馏得到50.4g(224mmol)1-(2-氯苯基)-2-(1，2，3，4-四唑-2-基)乙烷-1-醇(R-2N醇，光学纯度99.9％)油状残留物。向该所得粗产物中加入450mL四氢呋喃。冷却至-15℃后，缓慢加入38g(267mmol)氯磺酰异氰酸酯，并在-10℃下搅拌2h。缓慢加入水引发反应终止。所得溶液减压浓缩直至除去约300mL溶剂。浓缩液用600mL乙酸乙酯稀释，并用10％盐水(3×500mL)洗涤。有机层减压浓缩，并将浓缩液溶于异丙醇(90mL)中，向其中缓慢加入庚烷(180mL)引发结晶的完成。过滤所得的沉淀物并洗涤得到51.8g(194mmol)氨基甲酸(R)-1-(2-氯苯基)-2-(四唑-2-基)乙酯(光学纯度99.9％)。
1H-NMR(丙酮-d6)d8.74(s，1H)，d7.38-7.54(m，4H)，d6.59(m，1H)，d6.16(Br，2H)，d4.90(d，1H)，d5.09(m，2H)。
正如到目前为止所述，根据本发明可以经济效益地制备具有高光学和化学纯度的氨基甲酸酯化合物。
尽管出于说明目的本发明公开了优选的实施方式，但是本领域技术人员将理解，在不偏离如所附权利要求书公开的本发明的范围和精神下，各种改变、增添和替换都是可行的。
序列表自由文本
氨基酸序列
SEQ ID NO 1：来源于兔(rabbit)DSMZ 22167的穴兔(Oryctolagus cuniculus)
1    massgvtrrd plankvaivt astdgiglai arrlaqdgah vvissrkqqn vdravaalqa
61   eglsvtgtvc hvgkaedrer lvatalnlhg gidilvanaa vnpffgkimd vteevwdkil
121  dinvkamalm tkavvpemek rgggsvviva siaafnpfsg lgpynvskta lvgltknlal
181  elaaqnirvn clapglikts fskalwedka qeeniiqklr irrlgkpeec agivsflcse
241  dasyitgetv vvaggapsrl
SEQ ID NO 2：木兰假丝酵母(Candida magnoliae)DSMZ22052蛋白序列羰基还原酶
1    msatsnalit gasrgmgeat aiklalegys vtlasrgieq lnaikeklpi vkkgqqhyvw
61   qldlsdieaa stfkgaplpa ssydvffsna gvvdfapfad qsetaqkdlf tvnllspval
121  tktivkaiad kpretpahii ftssivgirg vpnvavysat kgaidsfars larefgpkni
181  hvncvnpgtt rtemtkgvdl aafgdvpikg wievdaiada vlflikskni tgqslvvdng
241  fgv
SEQ ID NO 3：越橘假丝酵母(Candida vaccinii)CBS7318蛋白序列羰基还原酶
1    mrstpnalvt ggsrgigaaa aiklaeagys vtlasrgldk lnevkaklpv vkqgqehhvw
61   qldlsdvqaa lefkgaplpa skydlfvsna gvatfsptae hddkdwqnii avnltspiai
121  tkalvkavge rsndnpfqia f1ssaaalrg vpqtavysat kagldgftrs lakelgpkgi
181  hvnivhpgwt qtemtagvde prdtpipgwi qpeaiaeaiv ylaksknitg tnivvdnglt
241  i
SEQ ID NO 4：木兰假丝酵母(Candida magnoliae)CBS6396蛋白序列羰基还原酶
1    mnalvtggsr gigeaiatkl aedgysvtia srgidqlnkv kaklpvvreg qthhvwqldl
61   sdaeaassfk gaplpassyd vlvnnagvtd pspiakqsds eihklfsvnl lspva1tkty
121  vqavtgkpre tpahiifiss gvairgypnv avysatksgl dgfmrslare lgpegvhvnt
181  vspgltktem asgvslddfp pspiggwiqp eaiadavrvl vksknitgti lsvdngitv
核酸序列
SEQ ID NO 5：来源于兔DSMZ 22167的穴兔(Oryctolaguscuniculus)
1    atggcttcat ctggcgtaac acgccgtgat ccgctggcca acaaagtcgc tattgtcact
61   gcgtcgaccg atggcatcgg actggcgatt gcgcgtcgcc ttgctcagga cggggctcac
121  gtggtaatct cttcgcgtaa acagcaaaat gtagatcgtg ccgttgctgc cctgcaagca
181  gaaggtctgt ccgtaactgg tactgtgtgc catgtcggga aagccgagga ccgtgaacgt
241  ctggttgcga cggcccttaa tcttcatggc ggtatcgata tcctggtgag taacgcggcc
301  gtcaatccgt ttttcggtaa gttaatggac gtcaccgaag aggtgtggga taaaattctg
361  gacatcaacg tgaaagcaat ggcgttgatg accaaagcgg tggttccaga aatggaaaaa
421  cgcggtgggg gctcagttgt cattgtggcc agcattgcag cctttaatcc atttagcggc
481  ttaggtccgt acaatgtgag taaaacggca ttggttggcc tgaccaagaa cctggcattg
541  gagttagcag cgcagaacat tcgtgttaac tgtttagcgc cgggcctgat taagacatca
601  ttcagtaagg cactgtggga ggataaagct caggaggaaa atatcattca gaaactgcgt
661  attcgccgtc tgggaaaacc ggaagaatgt gcaggtatcg ttagctttct gtgctctgaa
721  gatgcgtcct atattacggg tgaaaccgta gtggttgccg gcggagcgcc gagccgcctg
SEQ ID NO 6：木兰假丝酵母(Candida magnoliae)DSMZ22052核酸序列羰基还原酶
1      atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca
61     gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag
121    ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg
181    cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc
241    agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac
301    caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg
361    accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc
421    ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc
481    aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc
541    cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc
601    gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct
661    gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga
721    ttcggtgttt aa
SEQ ID NO 7：越橘假丝酵母(Candida vaccinii)CBS7318核酸序列羰基还原酶
1    atgaggtcga cacctaacgc ccttgtgact ggcggcagcc gcggcattgg cgcggccgct
61   gcaattaaac tcgccgaggc aggctacagc gtgacgctcg cgtcgcgcgg tctcgacaag
121  ctcaacgagg tgaaggccaa gcttcctgtc gtgaagcagg gccaggagca ccatgtatgg
181  cagcttgatc tcagcgacgt gcaggccgcg ctcgagttca agggcgcacc gctgcccgcg
241  agtaagtacg atttgtttgt ctcgaacgcc ggcgtggcta ctttctcgcc aacggctgag
301  catgacgaca aggactggca gaacattatt gccgtgaact tgacatcgcc cattgccatt
361  acgaaggcgc tcgttaaggc cgttggcgag cgctcaaacg ataacccgtt tcagatcgcg
421  ttcctgtcat cggcggccgc cctgcgcggt gtgccgcaga ccgctgttta cagcgctacg
481  aaggccggcc tcgacggctt cacgcgctcg ctcgccaagg agctcggccc aaagggcatc
541  catgtgaaca tcgtacaccc tggatggacg cagaccgaga tgactgcggg tgtagatgag
601  cctagggata cgcccatccc gggctggatc cagccggaag ccatcgccga ggccattgtg
661  tatctcgcga agtcaaagaa catcacggga acgaacatcg ttgtcgacaa cggcctgact
721  atttaa
SEQ ID NO 8：木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)CBS6369核酸序列羰基还原酶
1    atgaacgctc tagtgaccgg tggtagccgt ggcattggcg aggcgatcgc gaccaagctg
61   gccgaagatg gctacagcgt gacaatcgcc tcgcgcggaa tcgatcagct caacaaggta
121  aaggctaaac ttccggttgt gagggagggc cagacccacc acgtgtggca gcttgatttg
181  agcgacgccg aggccgcgtc gtccttcaag ggcgctcctt tgccagcaag cagctacgat
241  gtccttgtca acaacgccgg agtaacggat ccgagtccca ttgcgaagca gtcggatagc
301  gagattcaca agctgtttag cgtgaatctg ctgtcaccag ttgctttgac aaagacgtac
361  gtccaggcgg ttaccggaaa gcctcgtgag acgccagctc acattatttt tatctcgtca
421  ggcgttgcca ttcgaggcta cccaaacgtc gctgtatact cggctactaa gagcgggctc
481  gacggtttca tgaggtctct ggcgcgcgag cttggccccg agggcgtcca tgtgaacact
541  gtcagcccgg gtctcaccaa aaccgagatg gccagcggcg tcagcctcga cgacttcccg
6O1  ccatcgccga ttgggggctg gatccagccc gaggccatcg ctgatgcagt gaggtacctg
661  gtgaagtcga agaacatcac aggcacgatt ctgtcagttg acaacggaat cacggtttaa

Claims (19)

1.一种制备化学式1所示的氨基甲酸芳基-2-四唑基-乙酯的方法，包括：
将化学式2所示的芳基酮进行对映体选择性酶还原以形成化学式3所示的(R)-构型醇化合物；以及氨基甲酰化所述醇；
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、-CF3和1-8个碳原子的烷基；
A1和A2中的一个为CH，另一个为N-，以及
所述对映体选择性酶还原在反应混合物中进行，所述反应混合物包括：化学式2的所述化合物；氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氧化还原酶；还原过程中被氧化并连续再生的辅因子NADH或NADPH；包含化学式RxRyCHOH所示仲醇的共底物，其中Rx表示个数为x的碳，x为1-10的整数，Ry表示个数为y的氢，y为x值二倍加二的整数；以及适当的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶分别通过核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8编码。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述氧化还原酶分离自木兰假丝酵母、越橘假丝酵母或穴兔。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶以完全纯化状态、部分纯化状态存在于反应混合物中，或存在于表达其的微生物细胞中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述氧化还原酶存在于表达其的微生物细胞中，其细胞为天然、透性化或溶解状态。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述微生物细胞为转化的大肠杆菌细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化辅因子的再生来自于所述共底物的氧化。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述共底物为选自下组的仲醇：2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇和2-辛醇。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶作用于化学式2芳基酮的还原和共底物的氧化。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基甲酰化步骤是通过将化学式3的(R)-构型醇化合物与无机氰酸盐和有机酸进行反应实施的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基甲酰化步骤是通过水解化学式3的(R)-构型醇化合物与异氰酸酯化合物之间的反应产物实施的，所述异氰酸酯化合物选自下组：氯磺酸异氰酸酯、三氯乙酰基异氰酸酯和三甲基甲硅烷基异氰酸酯。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基甲酰化步骤是通过将氨引入到化学式3的(R)-构型醇化合物与羰基化合物之间的反应产物实施的，所述羰基化合物选自1,1’-羰基二咪唑、氨基甲酰卤化物、二琥珀酰碳酸酯、光气和三光气或氯甲酸酯。
13.根据权利要求1所述的方法，在对映体选择性酶还原步骤和氨基甲酰化步骤中至少一个之后还包括结晶步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述结晶步骤包括：
向反应产物中加入选自下组的增溶剂：丙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、1,4-二噁烷、1-4个碳原子的低级醇及其混合物；和
向其中加入选自下组的沉淀剂：水、1-4个碳原子的低级醇、乙醚、戊烷、己烷、环己烷、庚烷及其混合物。
15.根据权利要求1所述的方法，还包括制备化学式2的芳基酮的步骤，其通过下述化学式4的芳基酮与下述化学式5的四唑之间的取代反应制备：
[化学式4]
[化学式5]
R1和R2如权利要求1中所定义；和
X为选自卤化物和磺酸盐的离去基团。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括结晶步骤，其包括：
向取代反应得到的产物中加入选自下组的增溶剂：丙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、1,4-二噁烷、1-4个碳原子的低级醇及其混合物；和
加入选自下组的沉淀剂：水、1-4个碳原子的低级醇、乙醚、戊烷、己烷、环己烷、庚烷及其混合物。
17.制备下述化学式3所示醇化合物的方法，通过下述化学式2所示芳基酮的对映体选择性酶还原：
[化学式2]
[化学式3]
其中，
R1和R2独立地选自下组：氢、卤素、-CF3和1-8个碳原子的烷基；
A1和A2中的一个为CH，另一个为N；以及
所述还原在反应混合物中进行，所述反应混合物包括：化学式2的所述化合物；氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的氧化还原酶；还原过程中被氧化并连续再生的辅因子NADH或NADPH；包含化学式RxRyCHOH所示仲醇的共底物，其中Rx表示个数为x的碳，x为1-10的整数，Ry表示个数为y的氢，y为x值二倍加二的整数；以及适当的缓冲液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述氧化还原酶分别通过核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8编码。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述氧化还原酶分离自木兰假丝酵母、越橘假丝酵母或穴兔。
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