CN101358183B - 红豆羰基还原酶、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用红豆(Phaseolus angularis(Willd.)W.F.Wight)作为催化剂，不对称还原前手性芳基酮制备手性芳基醇的绿色合成方法。本发明公开了红豆酶催化剂的制备方法，以及利用红豆粗酶不对称还原前手性芳基酮的生物催化反应工艺。本发明所公开的方法具有催化剂制备简单、价格低廉、不妨碍生态环境、能耐受高底物浓度、产物手性醇的光学纯度高等优点，是很有应用潜力的绿色化学合成方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种红豆羰基还原酶、制备方法和用途。利用红豆(Phaseolusangularis(Willd.)W.F.Wight)中提取的羰基还原酶作为催化剂，不对称还原前手性芳基酮制备手性芳基醇的绿色化学合成方法。本发明公开了酶催化剂的制备方法，以及利用红豆粗酶作为催化剂不对称还原前手性芳基酮的反应工艺。本发明所述的方法具有催化剂制备简单、价格低廉、不妨碍生态环境、能耐受高浓度的底物、产物手性醇的光学纯度高等优点，是很有应用潜力的绿色化学合成方法。
背景技术
手性是自然界特别是有机体中普遍存在的重要特征。随着对手性现象研究的深入，越来越多的单一对映体被应用于药物、香精香料、农药和液晶产品。手性醇的手性中心接有一个活泼的官能团“-OH”，使该类物质成为许多手性产品合成时的关键中间体。芳基手性醇是许多药物的的重要手性中间体，例如：2-氯-1-苯乙醇，就是合成氟西汀(Fluoxetine)、托莫西汀(Tomoxetine)和尼索西汀(Nisoxetine)的重要前体。氟西汀(Fluoxetine)也是一种强效抗抑郁药，而且对许多病症，如焦虑、酒精中毒、慢性痛、肥胖、善饥、厌食均有很好的疗效。托莫西汀(Tomoxetine)是首例去甲肾上腺素再摄取抑制剂，与α-或β-肾上腺能受体无强结合力，是一种抗抑郁药，其(R)-(-)-异构体的药效比其(S)-对映体高9倍。从前手性羰基化合物不对称还原为手性醇，可以获得100％的理论产率，具有重要的理论意义和应用前景。虽然化学催化已经取得了很大的进展，但生物催化以其高选择性、安全性和环境相容性等优点，已经引起了广泛关注。生物催化还原反应在实际生产中还存在着底物耐受性较低、辅酶再生成本较高等复杂问题，使得目前在工业上获得应用的氧化还原酶类催化剂的比率不足总量的14％。
植物细胞或组织代表了对有机化合物进行生物转化反应的重要方法。与其它生物催化剂相比，植物催化剂具有不易引起微生物污染、容易获得、有的还可以食用等优点，因此是更加绿色环保的生物催化剂。用生长的或固定化的植物细胞培养物催化生物还原反应已经有几十年的历史了，但是与其它生物催化剂一样，现在仍然存在许多缺陷。
在利用红豆作为催化剂不对称还原前手性芳基酮制备手性芳基醇的过程中，本发明人发现该方法具有催化剂制备简单、价格低廉、不妨碍生态环境、耐受高底物浓度、产物手性醇的光学纯度高等优点，是非常有应用潜力的绿色化学合成方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种红豆羰基还原酶；
本方面的目的还一个一种上述的红豆羰基还原酶的制备方法；
本发明的另一目的是提供一种上述红豆羰基还原酶的用途，即作为生物催化剂高对映选择性催化还原高浓度前手性芳基酮制备高光学纯度手性芳基醇的方法。
本方面的红豆羰基还原酶是从植物种子红豆(Phaseolus angularis(Willd.)W.F.Wight)中采用下述的提取方法获得：
a.将红豆机械破碎为小颗粒，浸泡于去离子水，获得粗酶液；
b.加入丙酮使酶从粗酶中沉淀析出；
c.过滤并干燥制备具有催化活力的酶粉。
本方面的红豆羰基还原酶的制备方法，包括下列步骤：
a.将红豆机械破碎为小颗粒，浸泡于去离子水，获得粗酶液；
b.加入丙酮使酶从溶液中析出；
c.过滤并干燥制备具有催化活力的酶粉。
红豆羰基还原酶的制备方法中，红豆小颗粒与去离子水的重量比为1:5～2:5，浸取时间为1～24小时，优选3～10小时。
所述的浸取条件为30℃，160rpm。
所述的丙酮是使用预冷至-20℃的丙酮进行沉淀，酶液与丙酮的体积比例为1:1～1:1.5。
本发明的红豆羰基还原酶的用途是将所述红豆羰基还原酶的水溶液或缓冲溶液与芳基酮接触，在适当条件下反应一定时间后，通过常规的分离方法提取，制备光学活性的手性化合物(S)-或(R)-芳基醇。
上述的一种生物还原前手性芳基酮的方法，包括下列步骤：
a.将用上述方法制备的红豆羰基还原酶，悬浮于添加了葡萄糖的缓冲溶液中；
b.向上述缓冲溶液中加入芳基酮，经不对称还原产生相应的光学纯手性芳基醇；
c.反应液经分离、纯化得到目标产物--光学纯(S)-或(R)-芳基醇。
上述反应体系中所述粗酶粉浓度为10～200g(干重)/L。
反应体系中所述芳基酮的浓度为10～200mmol/L。
步骤b的反应温度控制为20～50℃，反应时间为3～96小时。
所述缓冲溶液为pH值为6～9的磷酸缓冲溶液。
所述的缓冲溶液中添加质量浓度为1～10％的葡萄糖。
上述反应体系中可加或不加入有机助溶剂，如果加入有机助溶剂，有机助溶剂的体积为反应体系体积1％～10％，所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或一种以上的混合物。
上述步骤b中所述芳基酮结构通式为：
在化合物(1)中，R1可选自-Cl、-NO2或-OCH3，R2可自-CH3、-C2H5、-CH2Cl或-CH2Br；
在化合物(2)中，Ar可选为2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶或2-噻吩。
还原的底物前手性芳基酮可选自苯环或芳香杂环的邻、间、或者对位被取代的芳基酮，或者侧链被取代的芳基酮。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述，其目的仅在于更好地理解本发明内容，而非限制本发明的保护范围。
实施例1
将红豆(Phaseolus angularis(Willd.)W.F.Wight)机械破碎为小颗粒后，称取16g红豆颗粒放入250mL三角烧瓶，浸泡于40mL去离子水，30℃，160rpm条件下浸取6～7小时，过滤或离心分离获得粗酶液；用预冷至-20℃的丙酮，以酶液与丙酮的体积比例1:1进行沉淀，获得粗酶；然后冷冻干燥获得粗酶粉。
实施例2
取1g红豆粗酶粉溶解于10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和0.155g2-氯-1-苯乙酮(加5％v/v乙醇助溶)，在30℃，160rpm条件下反应6小时。反应结束后离心(8,000rpm，10min)，收集上清液用乙酸乙酯萃取三次后，再加饱和NaCl溶液洗一次。取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜，减压浓缩后使用硅胶柱层析(洗脱剂为：石油醚/乙酸乙酯：2:1～10:1，v/v)后，真空干燥后得到产物(R)-2-氯-1-苯基乙醇。产物可用气相色谱(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOL DEXβ-120)测定其对映体过量值(e.e.)。
收率：74.8％；ee：99.3％；[α]D 21＝-58.3(c1.36，CHCl3)。
实施例3
取1g红豆粗酶粉溶解于10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和0.199g2-溴-1-苯乙酮(加5％v/v乙醇助溶)，在30℃、160rpm条件下反应6小时。反应结束后离心(8,000rpm，10min)收集上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再用饱和NaCl溶液洗涤一次。取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜，减压浓缩后使用硅胶柱层析(洗脱剂为：石油醚/乙酸乙酯：2:1～10:1，v/v)纯化，真空干燥获得目标产物(R)-2-溴-1-苯基乙醇。产物可用气相色谱(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOL DEXβ-120)分析测定其对映体过量(e.e.)值。
收率：38.7％；ee：99.6％；[α]D 21＝-41.5(c1.00，CHCl3)。
实施例4
取2g红豆粗酶粉溶解于10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和0.120g苯乙酮(加5％v/v乙醇助溶)，在30℃、160rpm条件下反应72小时。反应结束后离心(8,000rpm，10min)收集上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加饱和NaCl溶液洗涤一次。取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜，减压浓缩后使用硅胶柱层析(洗脱剂为：石油醚/乙酸乙酯：2:1～10:1，v/v)后，真空干燥获得目标产物(S)-1-苯基乙醇。产物可用气相色谱(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOL DEXβ-120)分析测定其对映体过量(e.e.)值。
收率：40.8％；ee：98.6％；[α]D 21＝-58.6(c1.00，CHCl3)。
实施例5
取2g红豆粗酶粉溶解于10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和0.165g4’-硝基苯乙酮(加5％v/v乙醇助溶)，在30℃、160rpm条件下反应72小时。反应结束后离心(8,000rpm，10min)，收集的上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加饱和NaCl溶液洗涤一次。取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜，减压浓缩后使用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：石油醚/乙酸乙酯：2:1～10:1，v/v)，经真空干燥获得目标产物(S)-1-(4’-硝基苯基)乙醇。产物可用气相色谱(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOLDEXβ-120)分析测定其对映体过量(e.e.)值。
收率：67.8％；ee：>99.9％；[α]D 21＝-27.5(c1.00，C2H5OH)。
实施例6
取2g红豆粗酶粉溶解于10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和0.121g4’-乙酰吡啶(加5％v/v乙醇助溶)，在30℃、160rpm条件下反应24小时。反应结束后离心(8,000rpm，10min)，收集的上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加饱和NaCl溶液洗涤一次。取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜，减压浓缩后使用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：石油醚/乙酸乙酯：2:1～10:1，v/v)，再经真空干燥获得目标产物(S)-1-(4’-吡啶)乙醇。产物可用气相色谱(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOL DEXβ-120)分析测定其对映体过量(e.e.)值。
收率：47.3％；ee：>99.9％；[α]D 21＝-44.8(c1.32，C2H5OH)。
实施例7～13
取50mg红豆粗酶粉溶解于0.5mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)中，添加5％葡萄糖和下表所列的任一种底物酮(10mM，加1％v/v乙醇助溶)，在30℃、1100rpm条件下反应一定时间。反应结束后离心(12,000rpm，5min)，收集的上清液，用乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，用无水Na2SO4干燥过夜后，进行气相色谱分析(采用岛津气相色谱仪GC-14，手性毛细管柱SUPCOL DEXβ-120)，测定产物含量和对映体过量(e.e.)值。
本发明的主要优势在于：
1)所述方法能以高对映选择性生物还原相对较高浓度的底物酮制备手性芳基醇。
2)用作羰基还原酶提取原料的红豆价格低廉而且容易获得，且其粗酶的制备方法简便易行。
3)所述生物还原反应温和、安全，对环境友好，且红豆粗酶在反应之后可用作肥料。
Claims (10)
1.一种红豆羰基还原酶，其特征是从植物种子红豆Phaseolus angularis(Willd.)W.F.Wight中采用下述的提取方法获得：
a.将红豆机械破碎为小颗粒，浸泡于去离子水，获得粗酶液；
b.加入丙酮使酶从粗酶中沉淀析出；
c.过滤并干燥制备具有催化活力的酶粉。
2.一种如权利要求1所述的红豆羰基还原酶的制备方法，包括下列步骤：
a.将红豆机械破碎为小颗粒，在室温下浸泡于去离子水，浸取的时间为1～24小时，红豆小颗粒与去离子水的重量比为1∶5～2∶5，获得粗酶液；
b.加入丙酮使酶从粗酶液溶液中沉淀析出；粗酶液与丙酮的体积比例为1∶1～1∶1.5；
c.过滤并干燥获得具有催化活力的酶粉。
3.根据权利要求2所述的红豆羰基还原酶的制备方法，其特征在于：步骤a中所述的红豆颗粒在水中浸取的时间为3～10小时。
4.根据权利要求2或3所述的红豆羰基还原酶的制备方法，其特征在于：所述的红豆颗粒在水中浸取的条件为30℃，160rpm。
5.根据权利要求2所述的红豆羰基还原酶的制备方法，其特征在于：所述的丙酮是采用预冷过-20℃的丙酮进行沉淀。
6.一种根据权利要求1所述的红豆羰基还原酶的用途，其特征在于：所述红豆羰基还原酶作为催化剂催化芳基酮合成光学活性的手性产品(S)-或(R)-芳基醇。
7.根据权利要求6所述的红豆羰基还原酶的用途，其特征在于：在20～50℃和存在或不存在机助溶剂时，将所述红豆羰基还原酶的水溶液或悬浮于添加了葡萄糖的缓冲溶液与芳基酮经不对称还原反应3～96小时，通过常规的分离、纯化方法提取，获得光学活性的手性产品(S)-或(R)-芳基醇；反应体系中红豆羰基还原酶的浓度为10～200g干重/L；所述芳基酮的浓度为10～200mmol/L。
8.根据权利要求7所述的红豆羰基还原酶的用途，其特征在于：所述的缓冲液为pH 6～9的磷酸盐缓冲溶液；所述的缓冲溶液中添加重量浓度为1～10％的葡萄糖。
9.根据权利要求7所述的红豆羰基还原酶的用途，其特征在于：在反应体系中添加反应液体积1％～10％的有机助溶剂，所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或一种以上的混合物。
10.根据权利要求7所述的红豆羰基还原酶的用途，其特征在于：所述的芳基酮结构通式为：
在化合物(1)中，R1选自-Cl、-NO2或-OCH3，R2选自-CH3、-C2H5、-CH2Cl，或-CH2Br；
在化合物(2)中，Ar选自2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶或2-噻吩。
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