CN104263776B - 一种生物催化生产手性吡啶乙醇的方法 - Google Patents
一种生物催化生产手性吡啶乙醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种生物催化生产手性吡啶乙醇的方法,即用黄蓝状菌细胞生物催化制备光活性(S)‑1‑(3‑吡啶基)乙醇,反应罐中加入磷酸盐缓冲液,加入棉纱布调控底物、产物浓度。用黄蓝状菌细胞进行生物催化反应,产品收率高,对映体过量率(ee%)高,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域,特别涉及到黄蓝状菌细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-1-(3-吡啶基)乙醇的技术。
背景技术
手性(S)-1-(3-吡啶基)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-1-(3-吡啶基)乙醇具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物催化法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。生物细胞还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-1-(3-吡啶基)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块,由于有2个手性中心,使得化学合成较为困难,成本高。本发明将采用生物催化制备(S)-1-(3-吡啶基)乙醇。
发明内容
本发明采用黄蓝状菌细胞催化制备(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应式如下:
底物3-乙酰基吡啶(1)经黄蓝状菌催化反应,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇(2)。有多种微生物可以催化此反应,经过大量实验筛选,最终确定采用黄蓝状菌作为催化剂,因为其催化1反应的效果最好,反应收率、对映体过量率(ee%)均很高。
许多黄蓝状菌都可以进行生物催化本反应,然而,其效果不同,相差很大,经实验,本发明选用黄蓝状菌菌株为ATCC 52264,其催化本反应效果最佳。
培养介质:
1、培养液成分:玉米浆( 以干物质计)含量为35-45g/L, 黄豆粉3-4 g/L,酵母浸膏8-10 g/L,葡萄糖18-22 g/L,麦芽浸膏20-25 g,硫酸铵0.5-0.7g/L,硫酸镁0.3-0.4g/L,磷酸二氧钾1.8-2.3g/L,碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH4.0。
2、固体培养基成分: 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
黄蓝状菌湿细胞制备。黄蓝状菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液,装料系数为0.6-0.7,121℃高压灭菌30分钟,冷却至25-26℃,将黄蓝状菌ATCC52264种子液接种至发酵罐,接种比例为10-15%,通气比为0.5-1V/(V分钟),即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积,25-26℃培养32-40小时,用过滤式离心机离心得到湿黄蓝状菌细胞,用作生物催化反应催化剂。湿细胞制取技术为成熟技术。
由于底物、产物均对黄蓝状菌细胞有抑制作用,为了减少底物、产物对细胞的抑制,本发明采用棉纱布吸附底物,反应中,当底物被细胞催化反应,浓度降低时,底物从棉纱布溶出,补充反应消耗的底物。同时,产物被棉纱布吸附,减少了其在水中的浓度,从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与棉纱布的比率,决定了反应液中底物、产物的浓度,而且,浓度还与反应温度、反应液成分有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同,所以,要进行大量实验,才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明,对于本发明的菌株、反应液成分、反应温度,最佳的底物与棉纱布的比率为0.33-0.35。具体吸附时,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.33-0.35。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6-0.7,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为80-90 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为16-18g/L,葡萄糖含量为 11-13g/L,木糖7-8 g/L,吐温80含量为12-13g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至26-27℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为40-45g/L,通气比为0.2-0.24V/(V分钟),即每分钟通气量为0.2-0.24倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为25-29小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率96-98%,产品收率94-96%,对映体过量率(ee%)98-99%。
本发明所开展工作包括菌株选择(从近百个菌株中选择)、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反应介质选择和浓度优化(底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类(20多种选1)及浓度、其它多种成分选择排除),采用固体吸附控制底物产物浓度,从而减少对细胞的抑制,试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树脂等多种固体材料,还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大,尽管采用了响应面优化设计试验,大幅度减少了试验量,试验量仍然很大,全部试验进行2年多才完成,达成目前的技术方案。对于光活性产物而言,当反应转化率96-98%,产品收率94-96%时,对映体过量率(ee%)仍然高达98-99%,是非常不易的,我们的工作取得了显著进步。
具体实施方式
实施例1
用常规方法制取湿黄蓝状菌ATCC 52264细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.35。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为80 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为16g/L,葡萄糖含量为 11g/L,木糖7 g/L,吐温80含量为12g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至26℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为40g/L,通气比为0.2V/(V分钟),即每分钟通气量为0.2倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为25小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率96%,产品收率94%,对映体过量率(ee%)99%。
实施例2
用常规方法制取湿黄蓝状菌ATCC 52264细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.33。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为90 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为18g/L,葡萄糖含量为13g/L,木糖8 g/L,吐温80含量为13g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至27℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为45g/L,通气比为0.24V/(V分钟),即每分钟通气量为0.24倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为29小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率98%,产品收率96%,对映体过量率(ee%)98%。
实施例3
用常规方法制取湿黄蓝状菌ATCC 52264细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.35。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
500L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为85g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为17g/L,葡萄糖含量为 12g/L,木糖7.5 g/L,吐温80含量为12.5g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至26.5℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为43g/L,通气比为0.22V/(V分钟),即每分钟通气量为0.22倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为27小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率97%,产品收率95%,对映体过量率(ee%)98.5%。
实施例4
用常规方法制取湿黄蓝状菌ATCC 52264细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.34。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为88g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为18g/L,葡萄糖含量为13g/L,木糖7.5 g/L,吐温80含量为12.5g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至27℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为44g/L,通气比为0.23V/(V分钟),即每分钟通气量为0.23倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为28小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率98%,产品收率95%,对映体过量率(ee%)99%。
Claims (2)
1.一种黄蓝状菌ATCC 52264细胞生物催化制备(S)-1-(3-吡啶基)乙醇的方法,其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6-0.7,pH为5,加入吸附了底物3-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物3-乙酰基吡啶添加量为80-90 g/L,以干物质计玉米浆含量为16-18g/L,葡萄糖含量为 11-13g/L,木糖7-8 g/L,吐温80含量为12-13g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至26-27℃时,加入湿黄蓝状菌细胞使浓度为40-45g/L,每分钟通气量为0.2-0.24倍发酵液体积,进行生物催化反应,反应时间为25-29小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(3-吡啶基)乙醇,反应转化率96-98%,产品收率94-96%,对映体过量率(ee%)98-99%。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于所述吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物3-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.33-0.35。
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