CN101063157A - 利用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2－芳基丙酸对映体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了沙雷氏菌脂肪酶用于拆分2－芳基丙酸对映体的方法。将沙雷氏菌脂肪酶与外消旋2－芳基丙酸酯接触，进行酶促反应，反应温度为20～60℃，反应的pH为5～11，然后从反应产物中收集水解生成的(S)－2－芳基丙酸以及未反应的(R)－2－芳基丙酸酯，后者可经外消旋化处理后重新用于酶促拆分。使用上述脂肪酶及其拆分工艺，不仅可以获得高光学纯度的单一对映体(S)－2－芳基丙酸，而且与传统的化学拆分工艺相比，可以减轻生产过程的劳动强度和环境污染，并降低生产的成本，可望在酮洛芬和萘普生等消炎镇痛药生产企业推广应用。

Description

利用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2-芳基丙酸对映体的方法

技术领域

本发明涉及2-芳基丙酸对映体的拆分方法，具体涉及采用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2-芳基丙酸对映体的方法。

背景技术

2-芳基丙酸可以用于制备重要的非甾体抗炎药，比如酮基布洛芬和萘普生。这些化合物都是手性化合物，而且其不同对映体的药理活性是不同的。右旋酮基布洛芬，或称为(S)-酮基布洛芬，在医药行业中有着十分广泛的应用；而左旋酮基布洛芬，或称为(R)-酮基布洛芬则可添加于牙膏中，用于防治骨质疏松。萘普生的(S)-(+)-对映体的活性是(R)-(-)-对映体的28倍。为提高药效，降低药物毒副作用，扩大用药安全范围，减少并发症及正确评价药物，需制备光学纯的单一对映体药物。

获得单一对映体的方法有化学方法和生物方法。化学方法包括不对称化学合成和立体选择性结晶等化学拆分方法。而利用微生物或酶所进行的生物催化拆分，由于操作简便，环境污染小而得到越来越多的开发和应用，成为许多科技人员所关注的新兴技术方法。

美国专利U.S.Pat.5 108 916，April.28，1992公开了一种较为切实可行的拆分方法。该方法采用商品酶Lipase MY(日本名糖产业公司生产)和Lipase AY(日本天野制药公司生产)作为拆分2-芳基丙酸和2-芳氧基丙酸的酶源，通过离子交换层析或等电聚焦等方法从MY或AY粗酶制剂中分离得到两种脂肪酶同工酶(CSC-1和CSC-2)，分别用于催化拆分2-芳基丙酸和2-芳氧基丙酸。由于该方法处理过程十分复杂，使催化剂的成本大幅度增加，给工业化应用带来了一定的困难。

中国专利ZL98121942.X直接使用日本名糖公司生产的Lipase OF粗酶作为酶促水解反应的催化剂，用于拆分外消旋酮基布洛芬，尽管该反应在高酸度条件下进行，可以进一步提高产品(S)-酮基布洛芬的光学纯度，但高的酸度使得酶的稳定性下降，并且使用商品酶也增加了工业化生产的成本。

专利HK 1006469A，June 18，1998用真菌Ophiostoma催化水解拆分外消旋酮基布洛芬酯，其(S)-酮基布洛芬的对映体过量值达93-96％，但其转化率不高，仅为15-25％。

专利U.S.Pat.5 037 751，Aug.6，1991公开了一种可以水解拆分萘普生和布洛芬的甲酯或乙酯而得到酸的Bacillus thai酯酶，对这个酶进行克隆表达，由于过量表达相对减少了杂酶的活性，因此其重组酶表现出更高的对映选择性。但对映选择性并不理想，(S)-构型产物的含量仅略大于90％，无法达到制药工业的高纯度要求。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种利用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2-芳基丙酸对映体的方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明的方法，包括下列步骤：将沙雷氏菌脂肪酶与外消旋2-芳基丙酸酯接触，进行酶促反应，反应温度为20～60℃，反应的pH为5～11，优选的酶促反应温度为25～50℃，反应时间为24～72小时，反应的pH为7～9，然后从反应产物中收集水解生成的(S)-2-芳基丙酸以及未反应的(R)-2-芳基丙酸酯，后者可经外消旋化处理后重新用于酶促拆分；

所说的外消旋2-芳基丙酸酯的结构通式如下：

其中：R为芳基，R优选3-苯甲酰苯基和6-甲氧基萘基，R₁为碳原子数为1-12的烷基或含氯的C1～C4的烷基；

所说的外消旋2-芳基丙酸酯选自酮基布洛芬酯或萘普生酯；

较佳的，所说的外消旋2-芳基丙酸酯为碳原子数为1～12的烷醇或卤代烷醇的2-芳基丙酸酯，优选甲醇、乙醇或氯乙醇的2-芳基丙酸酯；

优选的为酮洛芬甲酯、酮洛芬乙酯、酮洛芬氯乙酯、酮洛芬异丙酯、酮洛芬丁酯或酮洛芬辛酯；

所说的沙雷氏菌脂肪酶包括野生的沙雷氏菌脂肪酶或重组的沙雷氏菌脂肪酶；

沙雷氏菌脂肪酶的加入量，以外消旋2-芳基丙酸酯的重量为基准，为10～10⁴U/g，其中酶活单位U的定义为：标准条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位U。(对硝基苯酚乙酸酯法测活，即：2.87ml KPB，加100ul粗酶液，于紫外分光光度剂中保温3min之后，加入30ul二甲基亚砜溶解的对硝基苯酚乙酸酯溶液(pNPA/DMSO，浓度100mM)测上清液酶活(30℃，405nm测定酶活)；

较佳的，在酶促反应时，还添加非离子表面活性剂作为乳化剂，帮助底物酯在水相溶液中的分散；

乳化剂添加浓度，以反应体系的体积为基准为0.1～10％；

所说的乳化剂选自聚氧乙烯脂肪醇醚92V(Brij 92V)、烷氧基化脂肪醇PE/L61(Synperonic PE/L61)、聚乙二醇辛基苯基醚X-114(曲拉通X-114)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯-80(吐温-80)、聚乙二醇壬基苯基醚CA 630(Lgepal CA 630)、聚丙烯二醇二缩甘油醚350me(Pg 350me)、烷氧基化脂肪醇NP10(Synperonic NP10)或聚乙二醇辛基苯基醚X-45(曲拉通X-45)中的一种或多种；所用试剂均为国产分析纯。

优选的，乳化剂为Brij 92V，其浓度为体积百分比1～5％。

所说的沙雷氏菌脂肪酶，来源于沙雷氏菌(S.marcescens)ECU1010，菌种保藏号：CGMCC No.1219，或重组的沙雷氏菌脂肪酶；

将所说的沙雷氏菌(S.marcescens)ECU1010，在发酵培养基中采用本领域常规的方法，进行培养，收集上清发酵液，并采用常规的方法进行纯化，获得所说的沙雷氏菌脂肪酶，其亚基分子量为65kDa，等电点为4.2；

所说的培养基为常规的培养基，如液体培养基(LB)、固体培养基(LA)、透明圈鉴定培养基、液体培养基(LM)或固体培养基(SM)等；

所说的纯化方法为本领域常规的方法，文献[J]Journal of Fermentation andBioengineering.Vol.77，No.2，152-158.1994.有详细的报道；

本发明优选重组的沙雷氏菌脂肪酶，脂肪酶基因编码的蛋白已经在GENBANK中注册，注册号为DQ884880的S.marcescens ECU1010。

所得重组酶对外消旋的2-芳基丙酸酯的拆分性能优于野生型脂肪酶。特别是在反应体系中添加非离子表面活性剂Brij 92V之后，酶催化拆分外消旋酮基布洛芬乙酯的效果更佳，在转化率接近50％时，水解所得(S)-酮基布洛芬的对映体过量值仍然高达99％ee以上。

使用上述脂肪酶及其拆分工艺，不仅可以获得高光学纯度的单一对映体(S)-2-芳基丙酸，而且与传统的化学拆分工艺相比，可以减轻生产过程的劳动强度和环境污染，并降低生产的成本，可望在酮洛芬和萘普生等消炎镇痛药生产企业推广应用。

附图说明

图1为S.marcescens ECU1010脂肪酶纯化后经TSK-GEL G3000SWXL柱HPLC检测图谱。

图2为S.marcescens ECU1010脂肪酶纯化后SDS-PAGE图谱：

1.低分子量蛋白标准+S.marcescens ECU1010脂肪酶

2.S.marcescens ECU1010脂肪酶。

图3为S.marcescens ECU1010脂肪酶纯化后二维电泳图谱

1.低分子量蛋白标准

2.S.marcescens.ECU1010脂肪酶。

图4为S.marcescens ECU1010脂肪酶反应温度曲线。

图5为S.marcescens ECU1010脂肪酶反应pH曲线。

图6为为S.marcescens ECU1010的2.2kb PCR产物核酸电泳图谱

M：1Kb DNA分子量标准

1：包含S.marcescens ECU1010脂肪酶基因的PCR扩增产物。

图7为利用三丁酸甘油酯平板筛选带有S.marcescens ECU1010脂肪酶基因的阳性克隆。

图8为表达质粒的双酶切核酸电泳图谱。

M：λ/HindIII DNA分子量标准

1：表达质粒的NdeI和HindIII双酶切片段。

具体实施方式

                            实施例1

培养野生菌：

将野生沙雷氏菌S.marcescens ECU1010(菌种保藏号：CGMCC No.1219)在发酵培养基中培养，培养时间为24小时，温度为30℃，摇床转速为160rpm，然后离心收集上清酶液2000ml，超滤浓缩至300ml，加入58.2克硫酸铵至硫酸铵饱和度为35％，使蛋白沉淀；

采用DEAE-Toyopearl 650M离子层析，再采用Sephadex G150凝胶层析，然后采用Pheneyl-Toyopearl 650M疏水层析，进行纯化，得到SDS电泳纯蛋白，并经HPLC检测显示其纯度几乎达100％，见图1。

对此酶的生物化学实验表明，其亚基分子量为65kDa，见图2脂肪酶SDS-PAGE电泳图谱；等电点为4.2，见图3.脂肪酶二维电泳图谱；酶活反应最适温度为45℃，见图4脂肪酶反应温度曲线，其测定方法为：在不同温度下，用本文所用测活方法测定酶活；酶活反应最适pH为8.5，见图5脂肪酶反应pH曲线，其测定方法为：在不同pH缓冲液内用本文所用酶活测定方法测定酶活。所说的培养基的组分和含量为：(g/L)吐温-80 10；糊精15；牛肉膏15；(NH₄)SO₄ 2；KH₂PO₄ 2；NaCl 1；MgSO₄·7H₂O0.5；FeSO₄·7H₂O 0.001；pH 7.0，所用试剂均为国产分析纯。

                            实施例2

S.marcescens ECU1010脂肪酶基因的提取和重组菌BL21(DE3)/pBCLipE1的获得：

(1)S.marcescens ECU1010脂肪酶基因的获取

培养野生菌S.marcescens ECU1010(菌种保藏号：CGMCC No.1219)，培养方法为：固体平板置于30℃培养箱倒置培养；液体培养在30℃，160rpm摇床上进行。

所说的培养基的组分和含量为：

液体培养基(LM)：(g/L)胰蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，pH 7.0

固体培养基(SM)：LM+1.5％(w/v)琼脂粉

所用试剂均为国产分析纯。

采用标准方法(参见Nucleic Acids Res.1993，21：2260-2263)提取细菌的总DNA。然后以总DNA为模板，根据文献资料J Bacterial.1994，176：1949-1956和Appl Environ.Microbiol.1995，61：2674-2680设计脂肪酶基因的扩增引物P1和P2：

P1：5′ccg cat acc aat aac gtt tca tca 3′(SEQ ID No.2)

P2：5′cag cag tgg ttc cgc ctt cgc aag 3′(SEQ ID No.3)

为了保证序列的准确性，使用高保真Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，最终获得了2.2Kb的目的片断，见图6琼脂糖凝胶核酸电泳图谱，2.2KbPCR产物中包含脂肪酶基因片段。

将PCR产物用PCR产物回收试剂盒纯化后，用Taq酶在片段两端加上碱基A，然后用胶回收试剂盒回收目标片段，所说的PCR产物回收试剂盒和胶回收试剂盒来源于华舜公司的产品；

将获得的PCR片段与pMD18-T载体(购自大连TaKaRa生物公司)在16℃连接16h后，用CaCl₂法(参见Molecular cloning：A laboratory manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York.1989)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用含Amp(氨卞青霉素)的LA平板筛选转化子。

将转化子转移到透明圈鉴定培养基上，培养24h后筛选阳性克隆，见图7，透明圈平板含有三丁酸甘油酯为不透明平板，产脂肪酶的菌株由于脂肪酶水解三丁酸甘油酯，而在菌株周围产生透明圈。Escherichia coli的培养方法为：固体平板置于37℃培养箱倒置培养；液体培养在37℃，160rpm的摇床上进行。挑取其中一个产透明圈的单菌落进行培养、提取质粒(提取方法参见Nucleic Acids Res.1979，7：1513-1518)，之后用质粒做模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3为引物进行PCR验证，证实连接有目标DNA片段。将该质粒命名为pBCLipC1，含有该质粒的阳性菌落为DH5α/pBCLipC1。

基于LA的体积，所说的透明圈鉴定培养基的的组分和含量为：三丁酸甘油酯1％(v/v)+Tween-80 1％(v/v)+LA；

基于LB的体积，(LA)培养基为：LB+1.5％(w/v)琼脂粉；

(LB)：(g/L)胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH 7.0

将质粒pBCLipC1送到大连TaKaRa生物工程公司测序，获得长度为2218个碱基对(bp)的DNA序列(SEQ ID No.1)，其中的碱基264～2108是编码脂肪酶的开放阅读框，基因全长1845bp，编码614个氨基酸。

SEQ ID NO.1(下划线部分为脂肪酶基因的起始密码子和终止密码子)

1    ccgcatacca ataacgtttc atcaatcagt ctccttaatg actatatcga gctatcagta

61   taggagagcc tgcgccggca ctgttaacca acgcacaatc tcgccaattt gattcgcaga

121  cctaatattt ggcactaata ataattctac  cgatgttggt cctccgacca gctgtcgttc

181  ggctaacgtt gtttccctgt ttccaccgcc  ggcgcatgag agttcgcttc caggccaggc

241  ggcatacttc ataaggaact gat atgggca tctttagcta taaggatctg gacgaaaacg

301  cgtcgaaggc gctgttttcc gacgccttgg  ccatctctac ctacgcttac cacaatatcg

361  ataacggctt cgatgaaggc tatcaccaga  ccggtttcgg gctgggtctg ccgctgacgc

421  tggtcactgc gctcatcggc agcacccagt  cgcagggcgg cctgccgggc ctcccctgga

481  atcccgactc cgaacaggcc gcgcaggagg  cggtaaacaa tgccggctgg tcggtgatca

541  gcgccgcgca gctcggttac gccggcaaaa  ccgatgcgcg cggcacctac tacggcgaga

601  ccgccggtta caccaccgca caggccgagg  tgctgggcaa atatgacagc gaaggcaatc

661  tcaccgccat tggcatctca tttcgcggca  ccagcggccc gcgcgagtcg ttgatcggcg

721  ataccatcgg cgatgtgatt aacgatctgc  tggccgggtt cgggccgaaa ggctacgccg

781  acggctacac gctgaaggcc ttcggcaact  tgctgggcga cgtggcgaaa ttcgcgcagg

841  cccacgggct gagcggcgag gacgtggtgg  tcagcggcca cagcctcggc gggctggcgg

901  tcaacagcat ggcggcgcag agcgacgcca  gctggagcgg cttctacgcg cagtccaact

961  atgtcgcctt cgcctcgccg acccagtacg  aaaccggtgg caaggtgctc aacatcggct

1021 acgagaacga cccggtgttc cgcgcgctcg  acggcaccac gctgaccggg gcgtcgttgg

1081 gcgttcacga tgcgccccat acctccgcca  ccaacaatat cgtcaacttc aacgatcact

1141 acgcctcgga cgcctggaac ctgctgccgt  tttccattct caacattccg acctggctgt

1201 cgcacctgcc gttcttctat caggacggcc  tgatgcgggt gctgaactcc gagttttatt

1261 cgctgaccga caaagactcg accatcatcg  tctccaacct gtcgaacgtc acgcgcggca

1321 atacctgggt ggaagacctg aaccgcaacg  cggaaacgca cagcgggccg acgtttatca

1381 tcggcagcga cggcaatgat ttgatcaagg  gcggcaaagg caacgactat ctcgagggcc

1441 gcgacggcga cgatatcttc cgcgacgccg  gcggctataa cctgatcgcc ggcggcaaag

1501 gccacaatat cttcgatacc cagcaggcgt  tgaaaaatac cgaggtcgcc tacgacggca

1561 acacgcttta cctgcgcgat gccaagggcg  gcattacgct ggcggacgac atcagcaccc

1621 tgcgcagcaa agaaacctcc tggcttatct  tcaacaaaga agtggatcat caggtaaccg

1681 ccgccggatt gaaatcggac tcaggcctca  aagcctatgc cgccgccgcc accggcggtg

1741 acggcgatga cgtcctgcag gctcgcagcc  acgacgcctg gctgttcggc aacgccggca

1801 acgacacgct gatcggccac gccggcggca  acctgacctt cgtcggcggc agcggcgatg

1861 acgttctgaa gggcgtcggc aacggcaaca  ccttcctgtt cagcggcgat ttcggccgcg

1921 atcagctgta tggcttcaac gccagcgata  aactggtgtt tatcggcacc gaaggcgcca

1981 gcggcaatat ccgcgattac gccacgcagc  aaaacgacga tctggtgctg gccttcggcc

2041 acagccaggt  cacgctgatc ggcgtctcgc tcgatcactt cagcaccgat caggtggtgt

2101 tggcc taagc atcggcataa aaaaagccgg gcgctttcgc cgcccggctt tcctctttct

2161 gcccgcctta  aggcacgtca taccccagcg ccgccttgcg aaggcggaac cactgctg

(2)重组大肠杆菌BL21(DE3)/pBCLipE1的获得

噬菌体T7表达系统是原核细胞中表达外源蛋白最常用的表达系统，被广泛用于大肠杆菌中合成外源蛋白。选择含有T7启动子的pET表达系统，构建重组的粘质沙雷氏菌脂肪酶表达质粒和表达菌株。

选择大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)作为宿主菌株，pET-24a(+)(Novagen公司)作为表达载体，用以表达完整的脂肪酶基因。根据克隆的脂肪酶基因序列，在起始密码子和终止密码子两端设计PCR引物P3和P4：

P3：5′- ACTCATATGGGCATCTTTAGCTATAAGGATCTG-3′(SEQ ID No.4)

P4：5′- TGCAAGCTTTTAGGCCAACACCACCTGATCGGT-3′(SEQ ID No.5)并在引物两端分别加上Nde I和Hind III酶切位点(参见所用试剂公司华舜公司提供的说明书)。

培养重组菌株DH5α/pBCLipC1，提取质粒，以质粒pBCLipC1作为模板，以上述序列为PCR引物进行PCR扩增，获得了1.8Kb大小的目标片段。将获得的PCR产物和表达载体pET-24a(+)分别用Nde I和Hind III进行双酶切，然后进行胶回收，制备了用以连接的外源DNA和表达载体，在16℃连接16h，用CaCl₂法将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用含Km(卡那霉素)的LA平板筛选转化子。挑取阳性克隆提取质粒用Nde I和HindIII进行双酶切鉴定，见图8.质粒双酶切核酸电泳图谱，“1”中大片段为酶切质粒部分，小片段为酶切脂肪酶基因片段，获得重组表达质粒pBCLipE1，含有该质粒的阳性菌落为BL21(DE3)/pBCLipE1。

将菌株BL21(DE3)/pBCLipE1在37℃，LB培养基中培养至对数期后，在30℃用0.1mM IPTG诱导3h(不加IPTG的作为对照)，收集菌体进行超声破碎，离心，用对硝基苯酚乙酸酯法，即：2.87ml KPB，加100ul粗酶液，于紫外分光光度剂中保温3min之后，加入30ul二甲基亚砜溶解的对硝基苯酚乙酸酯溶液(pNPA/DMSO，浓度100mM)测上清液酶活(30℃，405nm测定酶活，以每分钟生产1μmol的对硝基苯酚所需酶量定义为1个酶活单位)，发现经过诱导的菌液有脂肪酶酶活，而对照样品没有酶活，表明已经成功地将该脂肪酶在大肠杆菌中进行了表达，也表明该脂肪酶可以在大肠杆菌中进行可溶性表达。将质粒pBCLipE1送到大连TaKaRa生物工程公司测序，结果表明所表达的脂肪酶基因与前面所克隆的脂肪酶基因在DNA水平上100％同源，所编码的氨基酸序列也完全一致。因此认定已经获得了重组菌BL21(DE3)/pBCLipE1。

基于LB的体积，所说的(LA)培养基为：LB+1.5％(w/v)琼脂粉

(LB)：(g/L)胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 10，pH 7.0

将所说的重组菌BL21(DE3)/pBCLipE1采用如下的方法培养：37℃，LB培养基中培养至对数期后，在30℃用0.1mM IPTG诱导3h，收集菌体进行超声破碎，离心，获得上清酶液，用于下一步的拆分。

                          实施例3～8

以实施例1的S.marcescens ECU1010和实施例2的重组菌BL21(DE3)/pBCLipE1所产的脂肪酶作生物催化剂，拆分不同碳链长度的外消旋酮基布洛芬酯，得到光学纯的(S)-酮基布洛芬。

反应条件为：实施例1和2得到的酶液1ml，其中含6U的酶量，加入2.8mg外消旋酮洛芬酯，使其终浓度为10mM，再加入50ul的DMSO(二甲基亚砜)(终浓度为5％(v/v))助溶，30℃，1000rpm条件下反应24小时。

所得样品用6mol/L HCl酸化至pH＝1，然后用等体积乙酸乙酯萃取后，用手性色谱柱Chiracel OJ-H柱(日本Daicel公司，Φ0.45×25cm)，以正己烷-异丙醇-乙酸(体积比为90∶10∶0.2)为流动相(1ml/min)，在高效液相色谱仪(SHIMADZU LC-10AT；紫外检测器波长254nm；流速0.8ml/min)上对样品进行分析，结果如表1。

表1：S.marcescens ECU1010野生菌及其重组菌BL21(DE3)脂肪酶拆分不同碳链长度酮基布洛芬酯

实施例号	底物	S.marcescens ECU1010野生菌脂肪酶			BL21(DE3)/pBCLipE1重组菌脂肪酶
								转化率(％)	eep(％)	选择率E	转化率(％)	eep(％)	选择率E
		实施例3	酮洛芬甲酯	47.6	78.6	18	51.3							69.1	12
实施例4	酮洛芬乙酯							45.1	93.5	70	47.8	90.6	54
		实施例5	酮洛芬氯乙酯	38.3	61.0	6	41.0							50.4	4

实施例6	酮洛芬异丙酯	28.9	67.4	7	31.1	59.2	5
								实施例7	酮洛芬丁酯	39.4	84.3	20	42.4	78.8	15
实施例8	酮洛芬辛酯	41.8	88.7	32	47.9	85.2	30

其中，以S.marcescens ECU1010野生菌脂肪酶作催化剂，酮基布洛芬乙酯作底物，转化率为45.1％时，(S)-酮基布洛芬的光学纯度＝93.5％ee(即(S)-对映体占97％)。

                          实施例9～16

取1ml实施例2的重组菌培养所得酶液，其中含6U酶量，加入2.8mg外消旋酮洛芬乙酯，使其终浓度为10mM，再加入30ul的不同种类的表面活性剂(终浓度为3％(v/v))助溶，在30℃，1000rpm条件下反应24小时。采用与实施例3～8相同的分析方法，所得结果如表2。

表2：不同表面活性剂对重组菌脂肪酶拆分效果的影响

实施例号	添加的表面活性剂	转化率(％)	对映体过量(％)	对映选择率(E值)
					实施例9	Brij 92V	42.6	99.6	1084
实施例10	Synperonic PE/L61	40.4	98.2	221
					实施例11	Tween-80	21.0	98.6	183
实施例12	Triton X-114	27.1	97.5	114
					实施例13	Lgepal CA 630	28.0	96.6	84
实施例14	Pg 350me	35.2	95.2	69
					实施例15	Synperonic NP10	22.4	96.1	66
实施例16	Triton X-45	33.1	86.8	22

其中当添加3％的Brij 92V后，转化率为42.6％，(S)-酮基布洛芬的光学纯度＞99.6％ee(即(S)-对映体占99.8％)，对映选择率E＞1000。

                            实施例17

将1ml实施例2的重组菌培养所得酶液，其中含6U酶量，加入28mg外消旋酮洛芬乙酯，使其终浓度为100mM，再加入50ul Brij 92V(终浓度为5％(v/v))助溶，30℃，1000rpm条件下反应24小时。采用与实施例3-16相同的分析方法。结果如下：

酮基布洛芬乙酯的水解转化率为45％，(S)-酮基布洛芬的光学纯度＞99％ee，即(S)-对映体占99.5％。

                           实施例18

将1ml实施例1的野生菌发酵酶液，其中含20U酶量，加入2.4mg萘普生甲酯，使其终浓度为10mM，以及50ul DMSO(二甲基亚砜)(终浓度为5％(v/v))助溶，在30℃，1000rpm条件下反应16小时。用手性色谱柱Chiracel OD-H柱(日本Daicel公司，Φ0.45×25cm)，以正己烷-异丙醇-乙酸(体积比为90∶10∶0.2)为流动相(1ml/min)，在高效液相色谱仪(SHIMADZU LC-10AT；紫外检测器波长254nm；流速0.8ml/min)上对样品进行分析。结果如下：

萘普生甲酯的水解转化率为40％，(S)-萘普生的光学纯度＞95％ee，即(S)-对映体占97.5％。

根据本发明所公开的技术方案和实施例，有关的工程技术人员可以方便地将本发明所说的S.marcescens ECU1010及其重组菌脂肪酶酶液或其相关制剂，举一反三地应用于其它类型的芳基丙酸如布洛芬、氟布洛芬、硫布洛芬等非甾体抗炎药的对映体拆分。

                            序列表

<110>  华东理工大学

<120>  利用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2-芳基丙酸对映体的方法

<130>  070521

<160>  5

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  2218

<212>  DNA

<213>  Serratia marcescens

<400>  1

ccgcatacca ataacgtttc atcaatcagt ctccttaatg actatatcga gctatcagta    60

taggagagcc tgcgccggca ctgttaacca acgcacaatc tcgccaattt gattcgcaga    120

cctaatattt ggcactaata ataattctac cgatgttggt cctccgacca gctgtcgttc    180

ggctaacgtt gtttccctgt ttccaccgcc ggcgcatgag agttcgcttc caggccaggc    240

ggcatacttc ataaggaact gatatgggca tctttagcta taaggatctg gacgaaaacg    300

cgtcgaaggc gctgttttcc gacgccttgg ccatctctac ctacgcttac cacaatatcg    360

ataacggctt cgatgaaggc tatcaccaga ccggtttcgg gctgggtctg ccgctgacgc    420

tggtcactgc gctcatcggc agcacccagt cgcagggcgg cctgccgggc ctcccctgga    480

atcccgactc cgaacaggcc gcgcaggagg cggtaaacaa tgccggctgg tcggtgatca    540

gcgccgcgca gctcggttac gccggcaaaa ccgatgcgcg cggcacctac tacggcgaga    600

ccgccggtta caccaccgca caggccgagg tgctgggcaa atatgacagc gaaggcaatc    660

tcaccgccat tggcatctca tttcgcggca ccagcggccc gcgcgagtcg ttgatcggcg    720

ataccatcgg cgatgtgatt aacgatctgc tggccgggtt cgggccgaaa ggctacgccg    780

acggctacac gctgaaggcc ttcggcaact tgctgggcga cgtggcgaaa ttcgcgcagg    840

cccacgggct gagcggcgag gacgtggtgg tcagcggcca cagcctcggc gggctggcgg    900

tcaacagcat ggcggcgcag agcgacgcca gctggagcgg cttctacgcg cagtccaact    960

atgtcgcctt cgcctcgccg acccagtacg aaaccggtgg caaggtgctc aacatcggct    1020

acgagaacga cccggtgttc cgcgcgctcg acggcaccac gctgaccggg gcgtcgttgg    1080

gcgttcacga tgcgccccat acctccgcca ccaacaatat cgtcaacttc aacgatcact    1140

acgcctcgga cgcctggaac ctgctgccgt tttccattct caacattccg acctggctgt    1200

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tcggcagcga cggcaatgat ttgatcaagg gcggcaaagg caacgactat ctcgagggcc    1440

gcgacggcga cgatatcttc cgcgacgccg gcggctataa cctgatcgcc ggcggcaaag    1500

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acacgcttta cctgcgcgat gccaagggcg gcattacgct ggcggacgac atcagcaccc    1620

tgcgcagcaa agaaacctcc tggcttatct tcaacaaaga agtggatcat caggtaaccg    1680

ccgccggatt gaaatcggac tcaggcctca aagcctatgc cgccgccgcc accggcggtg    1740

acggcgatga cgtcctgcag gctcgcagcc acgacgcctg gctgttcggc aacgccggca    1800

acgacacgct gatcggccac gccggcggca acctgacctt cgtcggcggc agcggcgatg  1860

acgttctgaa gggcgtcggc aacggcaaca ccttcctgtt cagcggcgat ttcggccgcg  1920

atcagctgta tggcttcaac gccagcgata aactggtgtt tatcggcacc gaaggcgcca  1980

gcggcaatat ccgcgattac gccacgcagc aaaacgacga tctggtgctg gccttcggcc  2040

acagccaggt cacgctgatc ggcgtctcgc tcgatcactt cagcaccgat caggtggtgt  2100

tggcctaagc atcggcataa aaaaagccgg gcgctttcgc cgcccggctt tcctctttct  2160

gcccgcctta aggcacgtca taccccagcg ccgccttgcg aaggcggaac cactgctg    2218

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  artificial sequence

<220>

<223>  引物

<400>  2

ccgcatacca ataacgtttc atca              24

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  artificial sequence

<220>

<223>  引物

<400>  3

cagcagtggt tccgccttcg caag              24

<210>  4

<211>  33

<212>  DNA

<213>  artificial sequence

<220>

<223>  引物

<400>  4

actcatatgg gcatctttag ctataaggat ctg    33

<210>  5

<211>  33

<212>  DNA

<213>  artificial sequence

<220>

<223>  引物

<400>  5

tgcaagcttt taggccaaca ccacctgatc ggt    33

Claims (10)

1.沙雷氏菌脂肪酶用于拆分2-芳基丙酸对映体的方法，包括下列步骤：

将沙雷氏菌脂肪酶与外消旋2-芳基丙酸酯接触，进行酶促反应，反应温度为20～60℃，反应的pH为5～11，然后从反应产物中收集水解生成的(S)-2-芳基丙酸以及未反应的(R)-2-芳基丙酸酯；

所说的外消旋2-芳基丙酸酯的结构通式如下：

其中：R为芳基，R₁为碳原子数为1-12的烷基或含氯的C₁～C₄的烷基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，R为3-苯甲酰苯基和6-甲氧基萘基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的外消旋2-芳基丙酸酯选自酮洛芬酯或萘普生酯。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的外消旋2-芳基丙酸酯为碳原子数为1～12的烷醇或卤代烷醇的2-芳基丙酸酯。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，外消旋2-芳基丙酸酯为酮洛芬甲酯、酮洛芬乙酯、酮洛芬氯乙酯、酮洛芬异丙酯、酮洛芬丁酯或酮洛芬辛酯。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的沙雷氏菌脂肪酶包括野生的沙雷氏菌脂肪酶或重组的沙雷氏菌脂肪酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，沙雷氏菌脂肪酶的加入量，以外消旋2-芳基丙酸酯的重量为基准，为10～10⁴U/g。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于酶促反应时，还可添加非离子表面活性剂，添加浓度以反应体系的体积为基准为0.1～10％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所说的乳化剂选自聚氧乙烯脂肪醇醚92V(Brij 92V)、烷氧基化脂肪醇PE/L61(Synperonic PE/L61)、聚乙二醇辛基苯基醚X-114(曲拉通X-114)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯-80(吐温-80)、聚乙二醇壬基苯基醚CA 630(Lgepal CA 630)、聚丙烯二醇二缩甘油醚350me(Pg 350me)、烷氧基化脂肪醇NP10(Synperonic NP10)或聚乙二醇辛基苯基醚X-45(曲拉通X-45)中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重组的的沙雷氏菌脂肪酶的基因序列为SEQ ID NO：1。

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