CN111850024B

CN111850024B - 4-氯邻苯二酚降解基因簇的优化重组与应用

Info

Publication number: CN111850024B
Application number: CN202010742557.8A
Authority: CN
Inventors: 王波; 姚泉洪; 彭日荷; 田永生; 高建杰; 许晶; 付晓燕; 韩红娟; 李振军; 王丽娟; 张福建; 邓永东; 张文慧; 黄悠楠
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2040-07-29
Also published as: CN111850024A

Abstract

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的4‑氯邻苯二酚降解相关的基因簇及其应用。该基因簇包含四个基因，每个基因都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，表达这个基因簇的大肠杆菌不仅能够降解4‑氯邻苯二酚，还能够降解邻苯二酚和3‑氯邻苯二酚，因此该基因簇可用于制备降解邻苯二酚，3‑氯邻苯二酚和4‑氯邻苯二酚的微生物。

Description

4-氯邻苯二酚降解基因簇的优化重组与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的、包含4-氯邻苯二酚降解相关四个基因的基因簇序列。

背景技术

随着化学工业的高速发展，人工合成的各种自然界中本不存在的有机物日益增多。氯代芳香族化合物是由芳香烃及其衍生物上的一个或几个氢原子被氯原子取代后生成的，主要包括氯苯、氯酚、多氯联苯等。它们广泛应用于工农业生产过程中，但也不可避免的会进入环境造成污染。它们大多具有毒性，对生物具有致癌、致畸、致突变作用，是一类重要的环境污染物。

微生物对外来化合物的降解或转化具有巨大的应用潜力。由于氯代芳香族化合物多为人工合成，自然界中的微生物缺乏降解相关的酶。但它们通过长期的自然驯化，通过遗传变异，逐渐改变自身特性、适应外部环境的变化，产生新的酶系来获得新的代谢功能，因此引起了国内外研究者的广泛兴趣。通过生物处理将有毒物质转化为无毒物质，投资少、成本低、且无二次污染是近年来污染修复相关研究的热点。

研究发现，微生物对氯代芳香族化合物的降解，受氯原子取代的位置和数量影响，降解途径也存在明显差异，而部分氯代芳香族化合物的降解都能够先通过不同的代谢途径转化为3-氯邻苯二酚或4-氯邻苯二酚，再经过相同或相似的途径打开苯环，最终进入三羧酸循环为微生物所利用。例如，有研究发现，4-氯邻苯二酚是一种伯克氏菌(Burkholderiasp. RKJ 800)降解4-氯,2-氨基酚途径中的重要中间代谢产物（Environ Sci Pollut ResInt, 21(2014) :2298-2304）。

虽然，不断有新的能够降解氯代芳香族化合物的微生物被分离与鉴定。但面对复杂多样的生物修复需求，可供选择的降解微生物仍十分有限。通过生物技术手段，有目的的改造合适的微生物，使它们获得相应的生物修复能力，是一种可行的解决方案。为高效降解氯代芳香族化合物、修复污染场地、开发新的有机污染生物控制技术奠定技术基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供能够在大肠杆菌中表达的4-氯邻苯二酚降解基因簇，包含四个相关基因：

ccaA基因，编码氯代邻苯二酚1,2双加氧酶；

ccaB基因，编码氯代粘康酸环异构酶；

ccaC基因，编码二烯内酯水解酶；

ccaD基因，编码己烯二酸还原酶。

基于假单胞菌属Pseudomonas reinekei菌原始基因簇GenBank no. EF159980.1(全长5129bp)，该基因簇包含4个结构基因和1个转录因子基因，结构基因所编码的酶可以将4-氯邻苯二酚降解为β-酮己二酸。我们首先去除非编码序列及一个转录因子基因，只保留4个结构基因，缩短了序列长度、降低遗传操作的难度。针对ccaA、ccaB、ccaC和ccaD四个结构基因，对其进行结构优化与重组并分别连接上独立的T7启动子和终止子调控其表达。基因的结构优化遵循以下原则：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。

所述经优化的4-氯邻苯二酚降解相关四个基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1、SEQID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，全长序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。

将合成的基因片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-cca（参见图1），并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性株系BL-cca。

阳性菌株在100毫升M9(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)液体培养中37℃摇菌24小时，离心去上清，菌体用10毫升M9(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)液体培养基重悬，向其中添加1mM的邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚，结果证明阳性菌株能够有效去除培养基中的这三种底物。

有益效果：

本发明优化并合成了包含四个相关基因的4-氯邻苯二酚降解基因簇，并能在大肠杆菌中成功表达。阳性菌株能够有效去除培养基中的邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚，经本发明优化后的基因簇可用于制备降解邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚的微生物。在环境修复等领域具有应用潜力。

附图说明：

图1为用于在大肠杆菌中表达4-氯邻苯二酚降解基因簇的载体示意图。

图2为阳性株系对不同底物的降解效果。

图3 为培养基中终产物β-酮己二酸的GC-MS检测。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式来进一步阐述本发明。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版（黄培堂等译，中国，科学出版社，2002）中方法进行。所用大肠肝菌由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存，各类限制性内切酶、连接酶等购自上海皓嘉公司。未注明的化学药品为分析纯级，购自生工生物工程（上海）股份公司或上海国药集团有限公司。

实施例 1

4-氯邻苯二酚降解相关四个基因ccaA、ccaB、ccaC和ccaD的优化设计与合成

基于假单胞菌属Pseudomonas reinekei原始基因簇GenBank no. EF159980.1中的四个结构基因ccaA、ccaB、ccaC和ccaD基因，按以下原则进行结构优化：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。并为每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。

实施例 2

大肠杆菌表达载体的构建与转化

将合成的基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-cca。并将其通过热激转化大肠杆菌BL21(DE3)，在涂布在加有卡那霉素抗性的固体2YT平板上，37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。

实施例 3

阳性菌株对邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚的降解作用

阳性菌株接菌于100毫升M9液体培养中(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)，37℃摇菌24小时(150rpm)，离心去上清，菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍，之后用10毫升M9液体培养基重悬(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)，向其中添加1mM的4-氯邻苯二酚，37℃摇菌处理，不同时间取菌液，通过HPLC检测培养基中残余的4-氯邻苯二酚含量（参见图2）。并对终产物β-酮己二酸进行GC-MS检测（参见图3）。同时，检测阳性菌株对邻苯二酚和3-氯邻苯二酚的降解能力（参见图2）。

培养基中邻苯二酚、3-氯邻苯二酚和4-氯邻苯二酚的HPLC检测方法：

不同时间取500μL发酵液，12000rpm离心1分钟后取上清，过滤后经HPLC检测。

安捷伦1100高效液相色谱系统；C18柱（120Å，4.6×150mm，5μm）；流动相为10mM 磷酸溶液：乙腈=50：50，流速为1 ml/min；柱温为30℃；检测波长为203 nm；进样量为20 μL。

培养基中β-酮己二酸的GC-MS检测方法：

取10mL发酵液，使用液氮冻融的方法将细胞破壁，超声波提取后，离心取上清液，冻干后加入衍生化试剂BSTFA，60℃下衍生半小时，待GC-MS检测。

气相色谱-质谱联用仪（GC-MS/MS，7890B-7000C，美国Agilent公司）；HP-5 MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超声机（上海一恒科学仪器有限公司）、氮吹仪（上海安谱科技有限公司）、超纯水系统（美国Merck Millipore 公司）。

色谱条件：色谱柱：Agilent HP-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；载气He（99.999%），流速1.0mL/min；进样口温度290 ℃；升温程序：100 ℃以40 ℃/min升至160℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，最后以20 ℃/min升至300 ℃；进样量1.0 μL，分流比50:1。

GC-MS质谱分析条件：电子轰击离子源（EI），电离能量70 eV；全扫描（scan）模式，扫描范围m/z：50 ~ 400；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度300℃。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 4-氯邻苯二酚降解基因簇的优化重组与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> artifical synthesize

<400> 1

atggcagttt cacgtttggc agaacttgtg actgcactgg agtctgacct gctggacttc 60

atgcgtcgtc atcgtgtgtc acatgatgag tatcgtgctg caactgactt gatcatcgac 120

tccatcaaga agggtgaaga gtcactgctg ttcgacgtgt tcttcgaggc acaggcaact 180

gacacctcca acatcggtcg tcaaggttca cctgaggcaa tcgaaggtcc attctacttc 240

gaaggtgcac cactgctgtc atcacctgct gtgatgccac aacgtcctga cgaacctggt 300

gacatcctgt tcttcaaggg tcatgtgtct gatgcacaag gtaacgctgt tgctgagatg 360

gagatcgatc tgtggcacgc tgatgctgaa ggtctgtact cacagatcca tcctggtatc 420

ccacacttca accttcgtgg tcgtttccac accaacgatc agggtgactt cgaggtgaag 480

actatcctgc caccaccata cgagatccct aagtctggtc ctactggtta cgtgcttggt 540

cagctgggtc gtcactactt ccgtcctgca catctgcaca tgaagctgcg tcatcctaag 600

catcatgaga tgacctcaca gctgtacttc tctggtggtg agtacctgga gactgacgtt 660

gctaacgctg ttcgtgaagg tttgattggt gaactggttc acgtgactga cactgctgag 720

atcgcacgtc gtggtctgtg caagccattc tacatctacc gttacgactt cgagatgcct 780

gcataa 786

<210> 2

<211> 1134

<212> DNA

<213> artifical synthesize

<400> 2

atgtcacagg gtttcgtgat tggtcgtgtt cttgcacaac gtctggacat cccattctca 60

cagcctatcc gtatgtcatt cggtactctt gatcgtctga acctgcttct ggttcgtctg 120

atcgatgaga atggtatcga aggtgttggt gaagcaactg tgatgggtgg tccatactgg 180

ggtggtgagt ctatcgaagc tgttgaagca gcagtggtga agtacctggg tccacagctg 240

atcggtcaac gtttccgtgg tctggaagag ttctcatacc gtctgtccaa gaccgtgaag 300

ggtaacgcag ctgcacgttc tgcactggag atggcagcat tcgacctggt tggtaagcag 360

ctgggtgtgt ctgcatcagc actgctgggt ggtcgttgtc gtgaccgtct tcaggttgca 420

tggactctgt caactggttc tgaaggtggt gacatcgctg aaggtgaacg tgcaatccaa 480

gcacgtggtc acactcgttt caagctgaag ttcggttctg gtgatcctga cgctgagttg 540

ttgcgtgttg ctggtatcgc tgaggcattc cgtggtcgtg catccatcat cctggacatc 600

aaccagggtt gggatctggg tactgcactg cgttacttcc ctgtgctgga agaagctggt 660

gttgagtgca ttgaacaacc actggcagca cttgacctgc atggtgcagc acgtctgaag 720

gcatcaacct caatggagat catcgctgat gaggtgttga ctgatctgcg ttctgcattc 780

gaagttgcaa ctgccaacgc tgcatctgcc gtgtcactga agcctaaccg tgatggtggt 840

atgctggctg ctaagcgtgt tgcaactgtt gcatctgcat ctggtctgaa aatctacggt 900

ggtactgcac tggagtcatc actgggtact gctgcatctg cactgatcta cgcatcactg 960

ccatcactgc aactgggtac tgaactgttc ggtccactgc gtcttcaggc tgacatcgtg 1020

aaggcaccac tgcttcctat cgatggtcac ttggacgtgc ctactggtga aggtcttggt 1080

gtggttctgg atgaagacct gatccgttca ctgtctgtgg acgtgctgca ctaa 1134

<210> 3

<211> 1011

<212> DNA

<213> artifical synthesize

<400> 3

atgactgaca cttctaagtc acttccaact tacaagcagc tgctggaacg taaggatgca 60

ccacctggtt catcatgggg tctgttcggt aaggacgatc aggttggtac tctgaacctg 120

attgacaatg ctgcacgtct gcgtggtatc gcatctgctg ttgaaggtaa ggcattctca 180

ctggacttgc catccacttc catctaccca tcactggcac ctactcgtaa gcctatcact 240

catcacatct tccaacgtaa cgacttccat catgatgagt ggctggacaa cttctacact 300

cagtatggtt cacagatcga tggtctgcgt cacatcggtc atcctgagta cggtttctac 360

aacggttacg accacactca gttcaagcct ggtactgata ctctgtcaat ccatcacttc 420

gctgcacttc ctattgctac tcgtggtgtg ttgatcgatg tgcagcgtta catggctaag 480

gcaggtctgg atcttgatca agcatctggt caggcaatct cagcacaagt gctggaggct 540

gcacgtgtgt cacaaggtgt gactatcgaa cctggtgatg ctgtgatcat ccgtttcggt 600

tggctggact actacctgaa ccgtgcatct gaagaagcac gtaccaacct ggtgactgaa 660

cagttccatc ctggtctgga gcagtctgag aagactctgg catggctgtg ggacaatcgt 720

atctctatca tcgctgctga caacttcgca ctggagtgct ggcctgctaa gcctgaatca 780

ccattcttca ctccagcaga ggttcgtcat gaggcttgct ctgttcatgc tggtatcatg 840

caccgtgcaa tcatcccact gttgggtatg ccaatcggtg aactgtgggc aatcgatgca 900

ctggcagaag catgtgctgc tgatggtcgt tacactttca tgctgactgc tgcaccactt 960

ccaatcgttg gtggtgtggg ttcaccagca aacgcaatcg caatccgtta a 1011

<210> 4

<211> 921

<212> DNA

<213> artifical synthesize

<400> 4

atggaagcac tgaaggaagt gattggtgct aacgctgttg cactgttcga tggtgcagct 60

atgcatactc ctgttgctgt gactgaacaa gcaatggcaa tcgtggcaca gctggacatc 120

gatggtgttg tgggtcttgg tggtggttca tccatcggtc tgtccaaggc aatcgcattc 180

cgtactggtc ttccacagat cgttgtgcct actacttact ctggttctga gatgactgca 240

atcctgggtg agactcaaga cggtctgaag atcaccaagt ctgacccacg tatccgtcct 300

gagactgtga tctacgacgt tgagctgacc actactctgc ctgtggacat ctctgtgact 360

tctggtatga acgcaatcgc acatgctgtg gaagcactgt atgcacacga caccaaccct 420

gtgattgcag cactggctga agagggtgtt cgttcactgg ctgctgcact gcctaagctg 480

gctaagtcac ctgacaacat ctctgcacgt gagcaggcac tgtatggttc atggctgtgt 540

ggtatctgcc tgggttccac tgcaatggca atccaccaca agctgtgtca tactctgggt 600

ggtactttcg atctgccaca tgcacctact cacactgcac tgctgccaca tgcactggca 660

tacaacgctg gtcatgcacc tcaagctatc gaacgtctga agcgtgcact gaaccatgac 720

aaccctgctg ttgcactgtt cgatctggca cagtcacttg gtgctgagat gtcactgaag 780

aacctgggta tgcctgaaga aggtatcgac cgtgcaaccg atcttgcatt caagaacgtg 840

tatcctaacc cacgtcgtct tgagcctgaa ggtgttcgtc aagtgatctc tgacgcatgg 900

aacggtaagc gtcctgcata a 921

<210> 5

<211> 261

<212> PRT

<213> artifical synthesize

<400> 5

Met Ala Val Ser Arg Leu Ala Glu Leu Val Thr Ala Leu Glu Ser Asp

1 5 10 15

Leu Leu Asp Phe Met Arg Arg His Arg Val Ser His Asp Glu Tyr Arg

20 25 30

Ala Ala Thr Asp Leu Ile Ile Asp Ser Ile Lys Lys Gly Glu Glu Ser

35 40 45

Leu Leu Phe Asp Val Phe Phe Glu Ala Gln Ala Thr Asp Thr Ser Asn

50 55 60

Ile Gly Arg Gln Gly Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gly Pro Phe Tyr Phe

65 70 75 80

Glu Gly Ala Pro Leu Leu Ser Ser Pro Ala Val Met Pro Gln Arg Pro

85 90 95

Asp Glu Pro Gly Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly His Val Ser Asp Ala

100 105 110

Gln Gly Asn Ala Val Ala Glu Met Glu Ile Asp Leu Trp His Ala Asp

115 120 125

Ala Glu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Pro Gly Ile Pro His Phe Asn

130 135 140

Leu Arg Gly Arg Phe His Thr Asn Asp Gln Gly Asp Phe Glu Val Lys

145 150 155 160

Thr Ile Leu Pro Pro Pro Tyr Glu Ile Pro Lys Ser Gly Pro Thr Gly

165 170 175

Tyr Val Leu Gly Gln Leu Gly Arg His Tyr Phe Arg Pro Ala His Leu

180 185 190

His Met Lys Leu Arg His Pro Lys His His Glu Met Thr Ser Gln Leu

195 200 205

Tyr Phe Ser Gly Gly Glu Tyr Leu Glu Thr Asp Val Ala Asn Ala Val

210 215 220

Arg Glu Gly Leu Ile Gly Glu Leu Val His Val Thr Asp Thr Ala Glu

225 230 235 240

Ile Ala Arg Arg Gly Leu Cys Lys Pro Phe Tyr Ile Tyr Arg Tyr Asp

245 250 255

Phe Glu Met Pro Ala

260

<210> 6

<211> 377

<212> PRT

<213> artifical synthesize

<400> 6

Met Ser Gln Gly Phe Val Ile Gly Arg Val Leu Ala Gln Arg Leu Asp

1 5 10 15

Ile Pro Phe Ser Gln Pro Ile Arg Met Ser Phe Gly Thr Leu Asp Arg

20 25 30

Leu Asn Leu Leu Leu Val Arg Leu Ile Asp Glu Asn Gly Ile Glu Gly

35 40 45

Val Gly Glu Ala Thr Val Met Gly Gly Pro Tyr Trp Gly Gly Glu Ser

50 55 60

Ile Glu Ala Val Glu Ala Ala Val Val Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Leu

65 70 75 80

Ile Gly Gln Arg Phe Arg Gly Leu Glu Glu Phe Ser Tyr Arg Leu Ser

85 90 95

Lys Thr Val Lys Gly Asn Ala Ala Ala Arg Ser Ala Leu Glu Met Ala

100 105 110

Ala Phe Asp Leu Val Gly Lys Gln Leu Gly Val Ser Ala Ser Ala Leu

115 120 125

Leu Gly Gly Arg Cys Arg Asp Arg Leu Gln Val Ala Trp Thr Leu Ser

130 135 140

Thr Gly Ser Glu Gly Gly Asp Ile Ala Glu Gly Glu Arg Ala Ile Gln

145 150 155 160

Ala Arg Gly His Thr Arg Phe Lys Leu Lys Phe Gly Ser Gly Asp Pro

165 170 175

Asp Ala Glu Leu Leu Arg Val Ala Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Gly

180 185 190

Arg Ala Ser Ile Ile Leu Asp Ile Asn Gln Gly Trp Asp Leu Gly Thr

195 200 205

Ala Leu Arg Tyr Phe Pro Val Leu Glu Glu Ala Gly Val Glu Cys Ile

210 215 220

Glu Gln Pro Leu Ala Ala Leu Asp Leu His Gly Ala Ala Arg Leu Lys

225 230 235 240

Ala Ser Thr Ser Met Glu Ile Ile Ala Asp Glu Val Leu Thr Asp Leu

245 250 255

Arg Ser Ala Phe Glu Val Ala Thr Ala Asn Ala Ala Ser Ala Val Ser

260 265 270

Leu Lys Pro Asn Arg Asp Gly Gly Met Leu Ala Ala Lys Arg Val Ala

275 280 285

Thr Val Ala Ser Ala Ser Gly Leu Lys Ile Tyr Gly Gly Thr Ala Leu

290 295 300

Glu Ser Ser Leu Gly Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ile Tyr Ala Ser Leu

305 310 315 320

Pro Ser Leu Gln Leu Gly Thr Glu Leu Phe Gly Pro Leu Arg Leu Gln

325 330 335

Ala Asp Ile Val Lys Ala Pro Leu Leu Pro Ile Asp Gly His Leu Asp

340 345 350

Val Pro Thr Gly Glu Gly Leu Gly Val Val Leu Asp Glu Asp Leu Ile

355 360 365

Arg Ser Leu Ser Val Asp Val Leu His

370 375

<210> 7

<211> 336

<212> PRT

<213> artifical synthesize

<400> 7

Met Thr Asp Thr Ser Lys Ser Leu Pro Thr Tyr Lys Gln Leu Leu Glu

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Arg Lys Asp Ala Pro Pro Gly Ser Ser Trp Gly Leu Phe Gly Lys Asp

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Gly His Pro Glu Tyr Gly Phe Tyr Asn Gly Tyr Asp His Thr Gln Phe

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Lys Pro Gly Thr Asp Thr Leu Ser Ile His His Phe Ala Ala Leu Pro

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Ile Ala Thr Arg Gly Val Leu Ile Asp Val Gln Arg Tyr Met Ala Lys

145 150 155 160

Ala Gly Leu Asp Leu Asp Gln Ala Ser Gly Gln Ala Ile Ser Ala Gln

165 170 175

Val Leu Glu Ala Ala Arg Val Ser Gln Gly Val Thr Ile Glu Pro Gly

180 185 190

Asp Ala Val Ile Ile Arg Phe Gly Trp Leu Asp Tyr Tyr Leu Asn Arg

195 200 205

Ala Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asn Leu Val Thr Glu Gln Phe His Pro

210 215 220

Gly Leu Glu Gln Ser Glu Lys Thr Leu Ala Trp Leu Trp Asp Asn Arg

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Ile Ser Ile Ile Ala Ala Asp Asn Phe Ala Leu Glu Cys Trp Pro Ala

245 250 255

Lys Pro Glu Ser Pro Phe Phe Thr Pro Ala Glu Val Arg His Glu Ala

260 265 270

Cys Ser Val His Ala Gly Ile Met His Arg Ala Ile Ile Pro Leu Leu

275 280 285

Gly Met Pro Ile Gly Glu Leu Trp Ala Ile Asp Ala Leu Ala Glu Ala

290 295 300

Cys Ala Ala Asp Gly Arg Tyr Thr Phe Met Leu Thr Ala Ala Pro Leu

305 310 315 320

Pro Ile Val Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Asn Ala Ile Ala Ile Arg

325 330 335

<210> 8

<211> 306

<212> PRT

<213> artifical synthesize

<400> 8

Met Glu Ala Leu Lys Glu Val Ile Gly Ala Asn Ala Val Ala Leu Phe

1 5 10 15

Asp Gly Ala Ala Met His Thr Pro Val Ala Val Thr Glu Gln Ala Met

20 25 30

Ala Ile Val Ala Gln Leu Asp Ile Asp Gly Val Val Gly Leu Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Ser Ile Gly Leu Ser Lys Ala Ile Ala Phe Arg Thr Gly Leu

50 55 60

Pro Gln Ile Val Val Pro Thr Thr Tyr Ser Gly Ser Glu Met Thr Ala

65 70 75 80

Ile Leu Gly Glu Thr Gln Asp Gly Leu Lys Ile Thr Lys Ser Asp Pro

85 90 95

Arg Ile Arg Pro Glu Thr Val Ile Tyr Asp Val Glu Leu Thr Thr Thr

100 105 110

Leu Pro Val Asp Ile Ser Val Thr Ser Gly Met Asn Ala Ile Ala His

115 120 125

Ala Val Glu Ala Leu Tyr Ala His Asp Thr Asn Pro Val Ile Ala Ala

130 135 140

Leu Ala Glu Glu Gly Val Arg Ser Leu Ala Ala Ala Leu Pro Lys Leu

145 150 155 160

Ala Lys Ser Pro Asp Asn Ile Ser Ala Arg Glu Gln Ala Leu Tyr Gly

165 170 175

Ser Trp Leu Cys Gly Ile Cys Leu Gly Ser Thr Ala Met Ala Ile His

180 185 190

His Lys Leu Cys His Thr Leu Gly Gly Thr Phe Asp Leu Pro His Ala

195 200 205

Pro Thr His Thr Ala Leu Leu Pro His Ala Leu Ala Tyr Asn Ala Gly

210 215 220

His Ala Pro Gln Ala Ile Glu Arg Leu Lys Arg Ala Leu Asn His Asp

225 230 235 240

Asn Pro Ala Val Ala Leu Phe Asp Leu Ala Gln Ser Leu Gly Ala Glu

245 250 255

Met Ser Leu Lys Asn Leu Gly Met Pro Glu Glu Gly Ile Asp Arg Ala

260 265 270

Thr Asp Leu Ala Phe Lys Asn Val Tyr Pro Asn Pro Arg Arg Leu Glu

275 280 285

Pro Glu Gly Val Arg Gln Val Ile Ser Asp Ala Trp Asn Gly Lys Arg

290 295 300

Pro Ala

305

Claims

1.人工优化后的基因簇，包含4-氯邻苯二酚降解相关的四个基因，其特征在于，这四个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示；

每段基因序列均与T7启动子和终止子相连组成一个表达单元，将四个表达单元串连插入表达载体；

所述载体转化大肠杆菌后，阳性菌株能够有效去除培养基中的4-氯邻苯二酚。