CN112342223A - 一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用 - Google Patents

Abstract

一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用，包括源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示，优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分别与T7启动子和终止子融合，构建对应的基因表达盒，再连接入大肠杆菌表达载体，并转化至大肠杆菌，在大肠杆菌中成功表达，获得的阳性菌株对有机磷农药甲基对硫磷和甲基对氧磷具有良好的降解作用。

Description

一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用。

背景技术

现代农业生产中，农药在保证农业生产中有着不可估量的作用。使用最多的有机农药主要是有机氯农药和有机磷农药。但是，自20世纪60年代以来，许多国家开始禁止或限制使用有机氯农药。因此，高效、低成本的有机磷农药作为有机氯的替代农药而迅速在国内外大量生产和使用，并发展为目前应用最广、品种最多的农药之一。

有机磷农药，通常是指磷酸酯或硫代磷酸酯类有机化合物。甲基对硫磷是有机磷农药中的其中一种较为常见的杀虫剂，被广泛用于防治水稻、棉花、果树、茶叶、蔬菜等害虫。由于其具有高毒性的特点，我国已于2007年起禁止在农业范围使用，但仍保留部分企业出口生产的能力。虽然已停止甲基对硫磷的使用，但由于其在环境中残留仍然比较严重，并且部分地区仍有禁而不止的现象发生，故有机磷杀虫剂的残留污染问题认识目前亟待解决的严重问题之一。

微生物具有极强的变异性和适应性等特点，成为了自然环境中降解有机磷农药的主要成员。目前，已分离出的能降解有机磷的微生物有细菌、放线菌、真菌、藻类等。

微生物对甲基对硫磷和甲基对氧磷的代谢，初始反应一般为水解反应，即在水解酶的作用下一个磷硫酯键断裂，生成一种无毒化合物和对硝基苯酚PNP。PNP的毒性虽与母体相比下降了100倍，但由于其含有苯环结构，残留时间很长，对环境和人类的毒性也很大。目前已分离出的一些能够降解甲基对硫磷的细菌和真菌，并不能继续降解PNP。因此，需要寻求另一种方法来实现甲基对硫磷的完全降解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用，利用合成生物学技术将不同来源的基因片段进行设计、改造，将完整的异源分解代谢途径引入到大肠杆菌中，从而使大肠杆菌具备降解和耐受甲基对硫磷、甲基对氧磷的功能，提高细菌对有机磷农药的降解效率和耐受能力，丰富工业应用降解菌资源。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组，包括源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因。

进一步，按大肠杆菌的密码子偏好性优化后，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQID No.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明提供所述有机磷农药的基因组合在大肠杆菌中的应用。

一种多基因大肠杆菌转化载体，包括大肠杆菌表达载体，以及源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分别与T7启动子和终止子融合的基因表达盒。

优选地，所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。

一种可完全降解有机磷农药的转基因大肠杆菌的获得方法，包括以下步骤：

1)根据大肠杆菌的密码子偏好性，对源于黄杆菌的Opd基因、源于假单胞菌的PnpA基因、PnpB基因、PnpC基因、PnpD基因和PnpE基因按大肠杆菌表达模式优化，优化后分别获得OpdS基因、PnpAS基因、PnpBS基因、PnpCS基因、PnpDS基因和PnpES基因，利用重叠延伸PCR技术，将优化后的六段基因分别与T7启动子和终止子融合，分别构建基因表达盒；

2)将步骤1)中构建的六个基因表达盒按顺序依次连接入大肠杆菌表达载体，获得含OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES六基因表达盒的多基因大肠杆菌转化载体；

3)将步骤2)所述多基因大肠杆菌转化载体转入大肠杆菌，获得能完全降解有机磷农药甲基对硫磷和甲基对氧磷的大肠杆菌。

优选地，步骤1)中，所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述T7终止子序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，步骤2)中，所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。

又，步骤3)中，所述大肠杆菌为BL21-AI。

本发明中，根据大肠杆菌密码子的偏好性对黄杆菌(Flavobacterium sp.ATCC27551)的Opd基因、假单胞菌(Pseudomonasputida)的PnpA、PnpB、PnpC、PnpD和PnpE基因进行优化，优化按照以下原则进行：(一)优化基因密码子，根据大肠杆菌密码子偏爱，提高基因翻译效率；(二)消除基因内部的限制性内切酶EcoRI和HindIII的识别位点，便于表达盒的构建；(三)消除与T7启动子或终止子相邻100bp以内的逆向重复序列和茎环结构；(四)消除两基因间相邻200bp以内的逆向重复序列和茎环结构；(五)消除转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(六)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(七)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中，将Opd基因、PnpA基因、PnpB基因、PnpC基因、PnpD基因和PnpE基因结合，按大肠杆菌表达模式进行优化，设计利用了同样的启动子构建载体，采用单顺反子转录模式，使多个基因在异源微生物背景下同时、稳定的协同表达。

本发明获得的阳性菌株对甲基对硫磷及甲基对氧磷具有良好的降解作用，将甲基对硫磷及甲基对氧磷降解为PNP后进一步降解至β-酮己二酸，最终产物β-酮己二酸可进入微生物的三羧酸循环，参与微生物体内物质的合成。

转入了本发明基因组的大肠杆菌可在2小时之内完全降解1mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷，8小时内完全降解5mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷，24小时内对10mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷也可降解10％。

利用本发明的基因组合，可用于制备降解有机磷农药的微生物，在废水处理和环境修复等领域具有应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例1中六基因(OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES)大肠杆菌转化载体结构示意图。

图2为本发明实施例3中阳性克隆质粒DNA的外源基因PCR检测结果，其中，BL-control为对照。

图3为本发明实施例3中阳性菌株的外源基因RT-PCR检测结果。

图4为本发明实施例4中阳性菌株对甲基对硫磷的去除效果。

图5为本发明实施例4中阳性菌株对甲基对氧磷的去除效果。

图6为本发明实施例4中阳性菌株中生成的最终产物β-酮己二酸的质谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例中所用大肠杆菌由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存，所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；本实施例中的HPLC分析采用安捷伦1100高效液相色谱系统；GC-MS检测采用Agilent 7890B-7000C气质联用仪。

实施例1六基因的优化合成

以黄杆菌(Flavobacterium sp.ATCC 27551)的Opd基因(GenBank No.AJ421424)、假单胞菌(Pseudomonasputida)的PnpA、PnpB、PnpC、PnpD和PnpE基因(GenBankNo.FJ376608.2)为模板，按照以下原则对上述六段基因进行优化：(一)优化基因密码子，根据大肠杆菌密码子偏爱，提高基因翻译效率；(二)消除基因内部的限制性内切酶EcoRI和HindIII的识别位点，便于表达盒的构建；(三)消除与T7启动子或终止子相邻100bp以内的逆向重复序列和茎环结构；(四)消除两基因间相邻200bp以内的逆向重复序列和茎环结构；(五)消除转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(六)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(七)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。

优化后，以黄杆菌(Flavobacterium sp.ATCC 27551)的Opd基因(GenBankNo.AJ421424)为模板，合成获得SEQ ID NO.1所示DNA序列OpdS，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以假单胞菌(Pseudomonas putida)的PnpA、PnpB、PnpC、PnpD和PnpE基因(GenBankNo.FJ376608.2)为模板，分别合成获得SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的DNA序列PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES，分别克隆到质粒载体，测序确定其序列。

序列的合成方法参照Nucleic Acids Research,2004，32(12)e98。

实施例2构建多基因大肠杆菌转化载体

1.构建六个基因表达盒元件

1.1以T7启动子为模板，合成获得SEQ ID NO.7所示DNA序列T7启动子，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以T7终止子为模板，合成获得SEQ ID NO.5所示DNA序列T7终止子，克隆到质粒载体，测序确定其序列。序列的合成方法参照Nucleic Acids Research,2004，32(12)e98。

按照改良的“重叠延伸PCR”技术进行元件的拼接(Appl MicrobiolBiotechnol.2006，73(1)：234-40)。

1.2 OpdS基因表达盒的构建

根据上述化学合成的T7启动子、OpdS基因和T7终止子序列设计一对引物P1F和P1R进行串联，引物长度为60bp，引物P1F上有EcoRI酶切位点和启动子，引物P1R上有终止子，具体序列如下：

P1F:5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGATGCAAACCAGAAGAGATGCCTTGAAGTCTGCTG-3’；

P1R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTATCTCTCAGTGTCT-3’。

1.3 PnpAS基因表达盒的构建

根据上述化学合成的T7启动子、PnpAS基因和T7终止子序列设计一对引物P2F和P2R，引物长度为60bp，引物P2F上有启动子，P2R上有终止子，具体序列如下：

P2F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATGGGTCGTGATCGTCGTCATAAGATGGAGACTATTGAGGG-3’；

P2R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTATGCACCAACCAGT-3’。

1.4 PnpBS基因表达盒的构建：

根据上述化学合成的T7启动子、PnpBS基因和T7终止子序列设计一对引物P3F和P3R进行串联，引物长度为60bp，引物P3F上有启动子，P3R上有终止子，具体序列如下：

P3F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATGACTACTAAAGTTCAAATCGTGTTCTACTCTTCATACGG-3’；

P3R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTCACGTTCTGC-3’。

1.5 PnpCS基因表达盒的构建

根据上述化学合成的T7启动子、PnpCS基因和T7终止子序列设计一对引物P4F和P4R进行串联，引物长度为60bp，引物P4F上有启动子，P4R上有终止子，具体序列如下：

P4F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATGACTGATCATTACAAGGCTGTGGAGGCACTGATCTCTGA-3’；

P4R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACTCTGCCTCCATC-3’。

1.6 PnpDS基因表达盒的构建

根据上述化学合成的T7启动子、PnpDS基因和T7终止子序列设计一对引物P5F和P5R进行串联，引物长度为60bp，引物P5F上有启动子，P5R上有终止子，具体序列如下：

P5F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATGCAAAACCTTCTTTTCATCGATGGTCGTTTTGTTGAGGC-3’；

P5R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAACGCTTGAAGTGT-3’。

1.7PnpES基因表达盒的构建

根据上述化学合成的T7启动子、PnpES基因和T7终止子序列设计一对引物P6F和P6R进行串联，引物长度为60bp，引物P6F上有启动子，P6R上有终止子和HindIII酶切位点，具体序列如下：

P6F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATGAATCCATTCGTGTACCAATCACTGCCAACTCGTGTTGT-3’；

P6R:5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTATGCAGGAGACCAA-3’。

2.构建多基因大肠杆菌转化载体

将上述合成的6个基因表达盒依次按OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS、PnpES的顺序进行连接，获得OpdS-PnpAS-PnpBS-PnpCS-PnpDS-PnpES重组基因表达盒。

将上述获得的OpdS-PnpAS-PnpBS-PnpCS-PnpDS-PnpES重组基因表达盒用EcoRI和HindIII酶切并连接到经同样酶切的pET-28a载体上，即可获得含有六个基因的多基因大肠杆菌表达载体pET-MP，其结构可表示为pET-OpdS-PnpAS-PnpBS-PnpCS-PnpDS-PnpES(如图1所示)。

实施例3大肠杆菌的转化

1.转基因大肠杆菌的获得与鉴定

1.1大肠杆菌的准备及转化

1)挑取大肠杆菌单菌落接种于20mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2)按1％接种量接种20mL LB培养基中，37℃230转/min振荡培养3h。

3)取1ml培养物，冰浴30min，4℃4000r/min离心3min，去上清。

4)加500ul体积的冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重新悬浮细菌沉淀，4℃4,000r/min离心3min，去上清。

5)加100ul体积的冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重新悬浮细菌沉淀，4℃4,000r/min离心3min，去上清。

6)50ul体积的冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重新悬浮细菌沉淀，该菌液可立即使用或冻于-70℃存放。

7)在1.5mL的eppendorf中，加入80μL菌液和1-2μL的质粒DNA(0.4pg-0.3μg)，冰上放置20分钟后，放入42℃水浴锅中热击90s，后迅速置于冰上。

8)热击转化后，即在菌体中加入1.0mL表达培养液，在29℃下培养1小时，涂于加入抗菌素的2YT平板(卡那霉素50μg/mL，X-gel 30μg/ml)，37℃过夜培养后得到阳性克隆。利用以上转化程序，将多基因大肠杆菌表达载体pET-MP电击转入大肠杆菌BL21-AI，获得大肠杆菌阳性株系BL-MP。

2.转基因大肠杆菌的鉴定

2.1阳性克隆中质粒的DNA序列测定

对转入六个基因的多基因大肠杆菌表达载体pET-MP后获得的阳性克隆，用碱裂解法抽提质粒，以此为模板，用PCR扩增的方法，分别检测外源基因OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS、PnpES，所用引物如下：

OpdS：F:5’-ATGCAAACCA GAAGAGATGC-3’；

R:5’-ATCTCTCAGTGTCTTGTCTT-3’。

PnpAS：F:5’-GTCGTG ATCGTCGTCATAAG-3’；

R:5’-CACCAACCAGTTCATGCTC-3’。

PnpBS：F:5’-ATGACTACTA AAGTTCAAATC-3’；

R:5’-CACGTTCTGCTTCAGACG-3’。

PnpCS：F:5’-ATGACTGATC ATTACAAGGCTG-3’；

R:5’-CTCCATCACGAACTCGTAGT-3’。

PnpDS：F:5’-ATGCAAAACC TTCTTTTCATCG-3’；

R:5’-ACGCTTGAAGTGTGCAGGAATAG-3’。

PnpES：F:5’-ATGAATCCATTCGTGTACCAATC-3’；

R:5’-TGCAGGAGACCAACCGTTCCATG-3’。

所用扩增程序：94℃30s，54℃30s，72℃120s，共45个循环，最后72℃再延伸10min，以只转化空载体的菌株为对照菌株，结果参见图2。

由图2可见，对照组不能扩出上述外源基因，而阳性克隆中都能扩增出上述六个基因，表明外源基因均完整地整合到了大肠杆菌基因组中。

2.2阳性菌株的RT-PCR检测

用生工生物公司的RNA抽提试剂盒提取阳性菌株中的RNA，并用全式金生物公司的逆转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，用如下引物和扩增条件进行外源OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS、PnpES基因的RT-PCR检测，细菌16S rRNA作为内参，所用引物如下：

OpdS：F:5’-CCTTACTCTGCCATTGGTCTTG-3’；

R:5’-GACTCTAAGAGGAACGAAAGC-3’。

PnpAS：F:5’-CAACTGTGCGTGGTAAGATC-3’；

R:5’-CGACCACGACGGAACTCAG-3’。

PnpBS：F:5’-CAGATGCGTAACTTCCTTG-3’；

R:5’-CAGGACCAGCAAGAGTTG-3’。

PnpCS：F:5’-TGGTCGTTACCGTTCTGAC-3’；

R:5’-GTCTTCGTACTTCACTTGC-3’。

PnpDS：F:5’-TGGGTCCACTGACTTCTG-3’；

R:5’-GTCCACAGACCAGAACCCA-3’。

PnpES：F:5’-CGTGGATGACCCTGAACA-3’；

R:5’-GGGATACCAAGTTTCTCG-3’。

16S rRNA：F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

R:5’′-TACCTTGTTACGACTT-3’。

所用扩增程序：94℃30s，54℃30s，72℃30s，共45个循环，最后72℃再延伸10min，结果参见图3。

结果显示，阳性菌株都能扩增出上述6个基因，表明外源基因在转基因大肠杆菌中均进行了正确的转录表达，相对表达量在1.5倍以上。

实施例4阳性菌株对有机磷农药的降解作用

1.样品的准备

将实施例3中的阳性菌株(BL-MP)和对照菌株(只转化空载体的菌株)分别接种于100毫升M9液体培养基中，含1％甘油和50μg/ml卡那霉素，37℃摇菌24小时，150rpm，离心去上清，菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍，之后用10毫升含1％甘油、0.2％阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG的M9液体培养基重悬，向阳性菌株中添加浓度为1mM、5mM和10mM的有机磷农药甲基对硫磷或甲基对氧磷，向对照菌株培养基中添加浓度为1mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷，37℃摇菌处理，不同时间取菌液，通过HPLC检测其残余的有机磷含量；通过气相质谱检测最后生成的β-酮己二酸含量。

2.有机磷农药的残留检测及产物分析

2.1阳性菌株中有机磷农药的HPLC分析及含量测定

取1ml菌液，离心后收集上清，用0.22μm的有机滤膜过滤后备用。

甲基对硫磷的HPLC条件为：

C18柱(

4.6×150mm，5μm)；流动相为乙腈：水＝50：50，流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为278nm；进样量为20μL。

甲基对氧磷的HPLC条件为：

C18柱(

4.6×150mm，5μm)；流动相为甲醇：水＝85：15，流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为250nm；进样量为20μL。

检测结果参见图4-5，从HPLC的检测结果可以看出，阳性菌株可在2小时之内快速降解培养基中的甲基对硫磷或甲基对氧磷，而对照菌株无法降解或利用有机磷农药；浓度更高的有机磷农药，如5mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷，阳性菌株也可在8小时之内完全降解；10mM的甲基对硫磷或甲基对氧磷，阳性菌株也有较强的耐受性，并可在24小时内实现10％的降解。

2.2阳性菌株中最终产物β-酮己二酸的GC-MS检测：

取100μL样品于气相进样瓶，预冻后放置冻干机中进行冷冻干燥，在冻干后的样品中加入100μL的吡啶和100μL的BSTFA，放置于60℃烘箱反应2小时，反应后的样品经0.22μm滤膜过滤后进样分析。

气相色谱条件为：Agilent 7890B-7000C气质联用仪，采用HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气He(99.999％)，流速1mL/min；进样口温度280℃；柱温程序：初始温度80℃保持，20℃/min升至150℃，10℃/min升至280℃，进样量1μL，采用分流进样模式，分流比10：1。

GC-MS质谱分析条件为：电子轰击离子源(EI)，电离能70eV；离子源温度230℃，四级杆温度150℃，碰撞气为N₂，采用SIM监测模式，监测离子169。

质谱图参见图6，从质谱图中可以看出，在阳性菌株中明显检测出了β-酮己二酸的存在，表明甲基对硫磷已被完全降解，最终产物β-酮己二酸可进入微生物的三羧酸循环，参与微生物体内物质的合成。

而Mattozzi等(Appl Environ Microb.,2006,72(10),6699-6706)将未经优化的Opd基因连接入pMM11载体，电击转化入假单胞菌中，获得的阳性菌株经MOPS培养基(含1mM甘油)培养，其完全降解0.5mM的甲基对氧磷的时间为30小时。

因此，转入了本发明有机磷水解酶基因组的大肠杆菌，其对甲基对硫磷和甲基对氧磷的降解速率及浓度均大大提升。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用

<130> 2011219

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaaacca gaagagatgc cttgaagtct gctgctgcta tcactcttct tggtggcttg 60

gctggttgtg cttctatggc tagacctatc ggtactggtg acttgatcaa cactgtcaga 120

ggtcctattc ctgtctctga agctggtttc actttgactc atgagcatat ctgtggctct 180

tctgctggct tcttgagagc ttggcctgag ttctttggtt ccagaaaggc tcttgctgag 240

aaggctgtca gaggcttgag acatgctcgt tctgctggtg ttcaaaccat cgtcgatgtc 300

tctaccttcg acatcggtag agacgtcaga ttgttggctg aagtctccag agctgctgat 360

gttcatatcg ttgctgctac tggcttgtgg tttgatcctc ctctttccat gagaatgaga 420

tccgtcgaag aactgactca gttcttcttg agagagatcc aacatggcat cgaagacact 480

ggcattagag ctggcatcat caaggttgct accactggta aggctactcc atactggtgt 540

tcctgtcact actcacactt ctgcttctca gagagatggt gaacagcagg ctgccatctt 600

cgaatccaag agttggtctt gaaggctgct gctagagctt ccttggcttc tgaaggcttg 660

tctccttcca gagtctgcat tggtcactct gacgacactg acgacttgtc ctatcttact 720

ggtcttgctg ccagaggcta tcttgttggc ttggacagaa tgccttactc tgccattggt 780

cttgaaggca atgcctctgc tttggctttg tttggcacta gatcctggca aactcgtgct 840

cttcttatca aggctcttat cgacagaggc tacaaggaca gaatcttggt ctctcatgac 900

tggttgtttg gcttctcctc ctatgtcacc aacatcatgg acgtcatgga cagaatcaat 960

cctgatggca tggctttcgt tcctcttaga gtcattccat tcttgagaga gaagggtgtt 1020

ccaccagaga ctcttgctgg tgttaccgtt gccaatcctg ctagattctt gtctccaacc 1080

gtcagagctg tcgtcacaag atccgaaact tccagacctg ctgctcctat tccaagacaa 1140

gacactgaga gataa 1155

<210> 2

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtcgtg atcgtcgtca taagatggag actattgagg gtgttgtggt tgttggtggt 60

ggtcctgttg gtctgctgac tgcactgaaa cttggtaagg ctggtgttcg tgttgttgtg 120

cttgagtctg agtctggtgt gtcaccatca ccacgtgctg ttgcatacat gccaccaact 180

gctgctgcac tggatcgttt cggtctgctt gatgacatcc gtaagcgtgc tgtgtggtgt 240

cctgacttcg cataccgtca tggtaacggt gaactgatcg caaagatgga ctgggctgtt 300

ctggcacagg atactgacta cccatacatg ttgttgcttg cacagaacca tgtgtctaac 360

gtgatcgtgg aacatctgcg taagttgcct aacgttgaga tccgttggaa tcacaaggtg 420

gaggagatcg accaggatga tgactatgtg actatggaaa cttctggtcc tgctggtaag 480

gcatcactgc gtgctaagtg ggttgcagca actgatggtg cacgttcaac tgtgcgtggt 540

aagatcggtc tgactttcga tggtatcact tggtctgaac gtctggttgc aactaacgtg 600

ttctacgact tctcactgca tggttactca cgtgcaaact tcgtgcacga tcctgtggac 660

tgggctgtgg tggtgcaact ggacaagact ggtctgtggc gtgtgtgcta tggtgaggac 720

cctgacatct ctgaggctga agttcgtcgt cgtcttcctg aacgtttcaa gcgtctgctt 780

cctggtgcac caactcctga tcagtaccgt gttgactacc tgaatccata ccgtgtgcat 840

caacgttgtg ctgctgagtt ccgtcgtggt cgtgtgatcc ttgcaggtga tgcagcacat 900

gcaactaacc ctatgggtgg tcttggtctg tctggtggtg tgcttgatgc tgaacatctt 960

gctgaggcac tgatcgctgt gatcaaggaa ggtgcatcaa ctaaggtgct ggatgagtac 1020

tctgttgatc gtcgtaaggt gttcctggag ttcacttcac caactgcaac tgctaacttc 1080

acttggatga aggagtctga cccagcacaa cgtgcacgtg acaatgcaat gttcgaccat 1140

gcaggtaagg acctgaaggt gatgcgtgag atcctgctgg acttcgagaa gctgaacggt 1200

cgtcgtgtga tcgcaccacg tcagcacgca cctgagcatg aactggttgg tgcataa 1257

<210> 4

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgactacta aagttcaaat cgtgttctac tcttcatacg gtcacatcta caagatggct 60

gaagcaatcg ctgctggtgc acgttctgtt ggtgatgttg aggtgactct gcttcagatt 120

cctgaactga tgcctgaaga agtgctggtg aagtctggta tcaagggtta tcgtgctgca 180

ttcgcatcaa tcccatacgc tactcctgag aagctggctg aagctgatgc tatcatcttc 240

ggtactccta ctcgtttcgg taacatgtgt tcacagatgc gtaacttcct tgatcaaact 300

ggtggtctgt ggatgtctgg tggtctgatc ggtaaggtgg gttctgtgtt catctcaact 360

gcatcacaac atggtggtca ggagactact atcacttcat tccatactac tctgcttcat 420

catggtatgg tgattgttgg tgttccatac tctgagcagg gtctggtgaa catgtctgaa 480

atctctggtg gtactccata cggtgcatca actcttgctg gtcctgatgg ttcacgtcag 540

ccatctgaga acgaacttca gatcgcacgt ttccagggtg agcatgtggc tggtatcgca 600

aagcgtctga agcagaacgt gaactaa 627

<210> 4

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgactgatc attacaaggc tgtggaggca ctgatctctg atcaggctgt tgactcattc 60

gaaacttcac caaacccacg tttcaagcag atcatgcagt cactggttcg tcatctgcac 120

gatttcgtgt ctgaggttga actgactgaa caggagtggt tcgagggtat ccgtttcctg 180

actgcaactg gtcagaagtg tgatggtaag gttcgtcagg agttcatcct gctgtctgat 240

actctgggtg tgtcaatgct ggtggatgca atcaaccatc gtcagtcaac taacgcaact 300

gagactactg tgttcggtcc attcttcatc gaaggtatgc ctgatcgtgg ttatggtgag 360

aacatggcac tgactgatgg tgtgcctgca ctggtgtacg gtcgtgtgct tgatgtgcaa 420

ggtcgtccag tggttggtgc agtgcttgat gtgtggcaga ctgctgacaa cggtatgtac 480

tctggtcaag accctgatca accattcggt aatctgcgtg gtcgttaccg ttctgacaac 540

gatggttgct tcgcaatcca aactactgtg cctgtgtgct atccaatccc tactgatggt 600

cctgttggtg agatgcttga tgctgcaaac cgtcatgcat ggcgtccagc acatctgcac 660

ttcatgattc aagcaccagg ctaccgtaag ctggtgactc acctgttcaa ctctgatgac 720

ccatacctgg actctgatgc tgtgttcggt gtgaagggtt cactgcaagt gaagtacgaa 780

gaccgtcctg cacacgatga agatgcaggt ggtctggaca tgccataccc atacaagtct 840

gcatactacg agttcgtgat ggaggcagag taa 873

<210> 5

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcaaaacc ttcttttcat cgatggtcgt tttgttgagg cagttggtgg tggtatgatc 60

gatgtggtgt caccacatga tggtgcactg ctgactcgta tcgctgctgc tgaagctgag 120

gatgttgatc ttgcagttgc tgctgcaaag cgtgcattcc ctgcatgggc agctatgggt 180

gctgcacaac gtggtcgtct gctgatgaag ctggcagaca agatcgaaga gtgtgctgaa 240

gaactggcac aactggagtc acttgacact ggtcatccaa tccgtgactc acgtggtctg 300

gatgtgccac gtactgctgc ttgcttccgt tacttcggtg gtatggctga caaggtggaa 360

ggttctgtga tccctgttga tcctggtttc ctgaactacg ttcaacgtaa gcctgttggt 420

gttgttggtc agatcgttcc ttggaacttc ccactgatgt tcacttcatg ggagatgggt 480

ccagcactgg cagcaggtaa cactgttgtg ctgaagccat ctgagatcac tccactgtca 540

actctgcgta ttgctgagct gatgaaggag gttggtttcc ctgatggtgt ggtgaacatc 600

gtgcctggtt acggtcatac tgctggtcaa cgtctggctg aacatcctga tgttggtaag 660

attgcattca ctggttcaac tgctactggt cgtcgtgtgg ttgaagcatc acaaggtaat 720

ctgaagcgtg tgcaactgga acttggtggt aagggtgcaa acatcgtgtt cgctgatgct 780

aaccttgatg ctgctgtgaa tggtgctgca tgggcaatct tccataacca gggtcaggca 840

tgtatcgctg gttcacgtct gatcctgcac aaggacattg ctgatgagtt cctggaacgt 900

ttcatcactc ttgcacgttc aatccgtctt ggtgatccaa tgaaccctga gactgagatg 960

ggtccactga cttctgcact gcatcgtgat cgtgttctgg catacgtgga catctgtcgt 1020

gaacaaggtg gtcgtgtgct tactggtggt cgtgcacctg ctgatcctgc actggctaac 1080

ggtttctacg tggaaccaac tgtggttgaa gcagcaccat ctgatcgtgt gtcacaggag 1140

gaagtgttcg gtccattcgt gactgttctt cgtttcgaga ctgacgagga agcactggca 1200

atcgcaaact caactgagta tggtctgggt tctggtctgt ggactcagaa tctgactcgt 1260

gcacacaaga tggctgatgc aatccatgct ggtatgtgct ggatcaactg ctacaagcgt 1320

gtttcacctg gttcaccatt cggtggtgtt ggtcgttctg gttacggtcg tgagatgggt 1380

ttcgaagcaa tgcatgacta cactgaagca cgttctgtgt gggtgaacgt tgatgcaact 1440

attcctgcac acttcaagcg ttaa 1464

<210> 6

<211> 1070

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaatccat tcgtgtacca atcactgcca actcgtgttg tgttcggttg gggtaagctg 60

tctgaactgg gtcaggagat tgatcgtctt ggtgcacgtc gtgcactgat tctgactact 120

cctgagcaga aggaactggg tgagcaggtt gctgcaatgc tgggttcacg ttctgctggt 180

gtgtatccta acgctgtgat gcatgttcca atcgaggttg cacaagcagc acgtatcgag 240

gctgcacgtc tggacgctga ctgctgtgtt gctgttggtg gtggttcaac tatcggtctt 300

ggtaaggcaa tcgcaatgga ctctggtctg ccaatccttg ctgtgccaac tacttacgct 360

ggttctgaga tgactccaat ctacggtctg actgaagatc gtctgaagcg tactggtcgt 420

gatccacgtg tgctgcctaa gactgtgatc tacgatccac aactgactct gtcacttcct 480

ggtcaggtgt ctgcttgctc tggtatgaac gcaatggcac atgcagtgga agcactgtac 540

gcacaggatg caaacccaat catctcattc atggcagagg agtcaatccg tgcactggca 600

tcacaggcac tgtacggtgc atggctggca ggtatctgtc tgggttctgt gggtatggca 660

tgtacggtgc atggctggca ggtatctgtc tgggttctgt gggtatggca ctgcaccaca 720

agctgtgtca cactcttggt ggtactttca accttccaca tgcacaggca catgcaatcg 780

ttctgccaca tgcagcacac tacaactgcg aagcagcagc acaaccactg caacgtgctg 840

cacgtgcact tggtggtgat gatgctaagg acgtgggtca actgctgttc gcactgaacg 900

agaaacttgg tatcccactt gcactgtctg agttgggtat gcctaaggat ggtcctgctg 960

aagcagcacg tatcgcatgt gctaacccat actacaaccc acgtccattc gaacaggcac 1020

caatcgaagc actgctgact cgtgcatgga acggttggtc tcctgcataa 1070

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactatagg 19

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttg 47

Claims (10)

1.一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组，包括源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因。

2.根据权利要求1所述的有机磷水解酶基因组，其特征在于，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.如权利要求1所述的基因组合在大肠杆菌中的应用。

4.一种多基因大肠杆菌转化载体，包括大肠杆菌表达载体，以及源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分别与T7启动子和终止子融合的基因表达盒。

5.根据权利要求4所述的多基因大肠杆菌转化载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。

6.一种可完全降解有机磷农药的转基因大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：

1)根据大肠杆菌的密码子偏好性，对源于黄杆菌的Opd基因、源于假单胞菌的PnpA基因、PnpB基因、PnpC基因、PnpD基因和PnpE基因按大肠杆菌表达模式优化，优化后分别获得OpdS基因、PnpAS基因、PnpBS基因、PnpCS基因、PnpDS基因和PnpES基因，利用重叠延伸PCR技术，将优化后获得的六段基因分别与T7启动子和终止子融合，分别构建基因表达盒；

2)将步骤1)中构建的六个基因表达盒连接入大肠杆菌表达载体，获得含OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES六基因表达盒的多基因大肠杆菌转化载体；

3)将步骤2)所述多基因大肠杆菌转化载体转入大肠杆菌，获得能完全降解有机磷农药甲基对硫磷和甲基对氧磷的大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述T7终止子序列如SEQ ID NO.8所示。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述大肠杆菌为BL21-AI。

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