CN116064599A - 一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用 - Google Patents

一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用，所述基因组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因，本发明通过将所述八个基因分别构建重组质粒pC02以及pU03，并将重组质粒pC02和pU03同时转化到大肠杆菌中，获得一种可生产具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A的重组工程菌，其发酵液中Terrequinone A的含量约为106.3mg/L，在生物制药领域具有潜在的应用价值。

Description

一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用。
背景技术
双吲哚醌类化合物是一类具有抗逆转录病毒、抗糖尿病或细胞毒性生物活性的真菌天然产物。双吲哚醌自可皆霉素(Cochliodinol)被发现以来，其家族成员不断壮大，而在这其中，从沙漠植物根际真菌土曲霉(Aspergillus terreus)中首次分离出来的Terrequinone A，对四种人类癌细胞(NCIH460、MCF-7、SF-268和MIA Pa Ca-2)具有中等细胞毒性，是一种潜在的抗癌药物(He et al.,Journal of Natural Products,2004,67(12):1985-1991)，也是唯一一种有生物合成信息的双吲哚醌类化合物。2004年，Bok等人利用转录调控因子LaeA对构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的次生代谢组进行了挖掘，识别了Terrequinone A的合成基因簇tdiABCDE(Bok et al.,Eukaryotic Cell,2004,3(2):527-535)。
Terrequinone A作为一种天然产物，其结构复杂、官能团较多，采用化学合成法所需步骤多、产率低以及环境不友好，随着Terrequinone A在生物体内进行合成和修饰的特殊途径被阐明，利用生物催化法合成Terrequinone A成为一种有效的尝试，Balibar等人分别过表达和研究了tdiABCDE基因簇中的5个基因，通过酶的体外分步反应成功合成了Terrequinone A(Carl J Balibar等人,Terrequinone A biosynthesis through L-tryptophan oxidation,dimerization and bisprenylation,Nature Chemical Biology,2007,3(9):584-592)。然而，体外合成需要外源性地添加昂贵的辅因子和辅因子再生酶系；另外，游离酶催化体系中一种酶催化的产物往往是下一个酶的底物，其底物产物的传递通常受到空间的限制，降低了产物的合成效率。因此，需要寻求更加高效的方法来生产Terrequinone A。大肠杆菌作为一种优良的生物反应器，通过对其进行合成途径的改造或引入新的代谢途径，可用于生物合成高价值天然产物，它能完美地规避上述两个问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合及其应用，从而解决现有技术中体外合成Terrequinone A存在的生产成本较高、合成效率较低的问题。
为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合，所述基因组合包括tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因，其中，所述tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。
根据本发明的第二方面，提供一种用于生产Terrequinone A的重组质粒pC02，所述重组质粒pC02由基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7sfpS按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。
优选地，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。
根据本发明的第三方面，提供一种用于生产Terrequinone A合成所需原料二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP的重组质粒pU03，所述重组质粒pU03由基因表达盒T7 ScCKS和T7AtIPKS按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7ScCKS和T7 AtIPKS由核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的ScCKS基因和AtIPKS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。
优选地，所述大肠杆菌表达载体为pUC19。
根据本发明的第四方面，提供一种可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因、sfp基因、ScCK基因和AtIPK基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因，所述tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，将八个基因分别与T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒T7tdiAS、T7 tdiBS、T7tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS、T7 ScCKS和T7 AtIPKS；S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS连接入大肠杆菌表达载体，获得含tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS的六个基因表达盒的重组质粒pC02；S3：将步骤S1获得的两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS连接入大肠杆菌表达载体，获得含ScCKS和AtIPKS的两个基因表达盒的重组质粒pU03；S4：将步骤S2获得的重组质粒pC02和步骤S3获得的重组质粒pU03同时转化到大肠杆菌中，获得可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌。
步骤S2中，将六个基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS按顺序串联，并在T7 tdiAS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 sfpS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7tdiAS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tdiDS-T7 tidES-T7sfpS-HindⅢ。
步骤S3中，将两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS按顺序串联，并在T7 ScCKS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 AtIPKS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7ScCKS-T7 AtIPKS-HindⅢ。
根据本发明的第五方面，提供一种根据上述方法获得的可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌。
根据本发明的第六方面，提供一种利用重组大肠杆菌生产Terrequinone A的方法，将所述重组大肠杆菌接种于含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的M9液体培养基中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养14～18h，向发酵液中添加底物L-色氨酸和异戊烯醇，然后在30℃培养22～26h，即可生产Terrequinone A；其中，每升所述M9液体培养基包括：15g甘油，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO4，0.011g CaCl2，2.9mg ZnSO4·7H2O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1，5g水解酪蛋白。
根据本发明的一个优选方案，将重组大肠杆菌BL-3接种于含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的优化后的M9液体培养基(15g甘油(glycerol)，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO4，0.011g CaCl2，2.9mg ZnSO4·7H2O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1(vitamin B1)以及5g水解酪蛋白(acid-hydrolyzed casein)每升)中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养16h，向发酵液中添加底物L-色氨酸和异戊烯醇，然后在30℃培养24h，即可生产Terrequinone A。
优选地，向发酵液中添加底物L-色氨酸的浓度为0.75g/L，异戊烯醇的浓度为0.95g/L。
本发明中，根据大肠杆菌的密码子偏好性对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因、sfp基因、ScCK基因和AtIPK基因作为整体进行优化，优化原则包括：(一)按照大肠杆菌密码子偏爱性优化基因，优化基因密码子，提高基因翻译效率；(二)消除茎环结构、转录终止信号、同一基因或相邻基因200bp以内的逆向重复序列，并使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(三)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(四)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率；(五)在满足上述四个原则的基础上，选择消除四个基因内部的EcoRI和HindIII内切酶识别位点，便于构建重组质粒；优化后获得tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES、sfpS、ScCKS和AtIPKS基因。
本发明通过化学方法合成了编码非核糖体肽合成酶的tdiAS基因、编码甲代丙烯基-L-色氨酸合成酶的tdiBS基因、编码氧化还原酶的tdiCS基因、编码氨基转移酶的tdiDS基因、编码伴侣蛋白的tidES基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfpS基因、编码胆碱激酶的ScCKS基因和编码异戊烯基磷酸激酶的AtIPKS基因，首次将该八段基因分别与大肠杆菌T7启动子和终止子连接，构建成相应的基因表达盒。将六个基因表达盒T7 tdiAS、T7tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS连接入大肠杆菌表达载体，获得重组质粒pC02；将两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS连接入大肠杆菌表达载体，获得重组质粒pU03；将pC02和pU03同时转化到大肠杆菌中，获得的重组工程菌可用于生产具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A，在添加0.75g/L的L-色氨酸和0.95g/L的异戊烯醇的情况下，其发酵液中Terrequinone A的含量可达到106.3mg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用合成生物学技术，对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因、sfp基因、ScCK基因和AtIPK基因按大肠杆菌表达模式优化，优化后分别与大肠杆菌T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒，再与大肠杆菌表达载体连接获得多基因大肠杆菌转化载体，构建基因工程菌，编码非核糖体肽合成酶的tdiAS基因、编码甲代丙烯基-L-色氨酸合成酶的tdiBS基因、编码氧化还原酶的tdiCS基因、编码氨基转移酶的tdiDS基因、编码伴侣蛋白的tidES基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfpS基因、编码胆碱激酶的ScCKS基因和编码异戊烯基磷酸激酶的AtIPKS基因均能活性表达，以L-色氨酸和异戊烯醇为底物，可生产具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A，在生物制药领域具有潜在的应用价值。
在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的Terrequinone A合成途径中，每一分子terrequione A的合成需要消耗2分子的DMAPP，大肠杆菌中原有的MEP途径所产生的DMAPP无法满足Terrequione A合成的需求，本发明在大肠杆菌中同时转入了多基因转化载体pU03，获得的重组菌以异戊烯醇为底物，可为Terrequinone A合成提供充足的DMAPP。
He等人对土曲霉(Aspergillus terreus)经过28天的培养后，从5.4L的发酵液中分离得到6.0mg Terrequinone A粉末(He et al.,Journal of Natural Products,2004,67(12):1985-1991)。与天然菌株Aspergillus terreus相比，本发明的重组大肠杆菌在经过48h的培养后，发酵液中Terrequinone A的含量可达到106.3mg/L，在转化速率和产物浓度上均有显著提高。
附图说明
图1为本发明实施例3中重组质粒pC02和pU03的结构示意图；
图2为本发明实施例3中大肠杆菌BL-3转入的Terrequinone A合成途径；
图3为本发明实施例4中大肠杆菌BL-3外源基因的PCR检测结果，其中，M为Marker；
图4为本发明实施例5中Terrequinone A的质谱测定鉴定图(正离子m/z＝491.2)；
图5为本发明实施例5中菌培养液经氯仿萃取后的HPLC图谱；
图6为本发明实施例6中添加不同浓度底物后Terrequinone A的含量。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1八段基因的优化
基于tdiA(Genbank:EF550581.1)、tdiB(Genbank:EF550582.1)、tdiC(Genbank:EF550583.1)、tdiD(Genbank:EF550584.1)、tidE基因(Genbank:EF550585.1)、sfp基因(GenBank:X65610.1，Bacillus subtilis)、ScCK基因(GenBank:AAA34499.1，Saccharomyces cerevisiae)和AtIPK基因(GenBank:AY150412.1，Arabidopsis thaliana)的编码序列，按照以下原则对上述八个基因作为整体进行优化：
(一)按照大肠杆菌密码子偏爱性优化基因，优化基因密码子，提高基因翻译效率；(二)消除茎环结构、转录终止信号、同一基因或相邻基因200bp以内的逆向重复序列，并使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(三)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(四)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率；(五)在满足上述四个原则的基础上，选择消除八个基因内部的EcoRI和HindIII内切酶识别位点，便于构建重组质粒。
优化后，获得tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES、sfpS、ScCKS和AtIPKS基因，所述tdiAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述tdiBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述tdiCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述tidDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述tdiES基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sfpS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述ScCKS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述AtIPKS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2基因表达盒的构建
在每个优化的基因序列前端连接大肠杆菌T7启动子序列，在每个优化的基因序列末端连接大肠杆菌T7终止子序列，构建基因表达盒T7tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS、T7 ScCKS和T7 AtIPKS，由南京金斯瑞公司化学合成。
T7启动子序列(SEQ ID NO.9)为：
5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’；
T7终止子序列(SEQ ID NO.10)为：5’-TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTT TG-3’。
实施例3构建重组质粒并转化
利用“聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)介导的重叠延伸PCR”技术(彭日荷等人，Adirect and efficient PAGE-mediated overlap extension PCR method for genemultiple-site mutagenesis,Appl Microbiol Biotechnol.2006,73(1):234-40)，将构建的六个基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS按顺序串联，并在T7 tdiAS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 sfpS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 tdiAS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tdiDS-T7 tidES-T7 sfpS-HindⅢ。将两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS按顺序串联，并在T7 ScCKS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 AtIPKS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 ScCKS-T7 AtIPKS-HindⅢ。
为获得EcoRⅠ-T7 tdiAS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tdiDS-T7 tidES-T7sfpS-HindⅢ，设计的引物序列(SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.22)如下：
T7 tdiAS：
P1：5’-GAATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGCACCATCTAAG-3’；
P2：5’-GTATTCAGTAGCCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 tdiBS：
P3：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGCTACTGAATAC-3’；
P4：5’-AAGAGCTGCGTGCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 tdiCS：
P5：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGCACGCAGCTCTT-3’；
P6：5’-ACCAATAGAACCCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 tdiDS：
P7：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGGTTCTATTGGT-3’；
P8：5’-ATGGTCTGTTAACCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 tdiES：
P9：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGTTAACAGACCAT-3’；
P10：5’-ACCGTAGATTTTCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 spfS：
P11：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGAAAATCTACGGT-3’；
P12：5’-AAGCTTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3’。
第一步PCR：分别以T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7tidES和T7 sfpS基因片段为模板，添加对应的引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃30s，68℃60s，共10个循环；
将第一步PCR获得的6个基因片段进行凝胶电泳，胶回收；
第二步PCR：以胶回收获得的6个基因片段的混合物作为模板，以P1和P12为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性1min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共25个循环；最后72℃再延伸10min。为获得EcoRⅠ-T7 tdiAS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tdiDS-T7 tidES-T7sfpS-HindⅢ，设计的引物序列(SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.26)如下：
T7 ScCKS：
P13：5’-GAATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGTTCAAGAGT-3’；
P14：5’-CTTCTCCAGCTCGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；
T7 AtIPKS：
P15：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGGAACGAGCTGGAGAAG-3’；
P16：5’-AAGCTTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3’。
第一步PCR：分别以T7 ScCKS和T7 AtIPKS基因片段为模板，添加对应的引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃30s，68℃60s，共10个循环；
将第一步PCR获得的2个基因片段进行凝胶电泳，胶回收；
第二步PCR：以胶回收获得的2个基因片段的混合物作为模板，以P13和P16为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性1min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共25个循环；最后72℃再延伸10min。将上述串联的六个基因片段EcoRⅠ-T7 tdiAS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7tdiDS-T7tidES-T7 sfpS-HindⅢ用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切并连接到经同样酶切的载体pCAMBIA1301上，获得含有六个基因的重组质粒pC02；将两个基因片段EcoRⅠ-T7 ScCKS-T7AtIPKS-HindⅢ用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切并连接到经同样酶切的载体pUC19上，获得含有两个基因的重组质粒pU03(如图1所示)。
采用热激法同时将pC02和pU03转入大肠杆菌BL21-AI中，涂布在含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素抗性的固体LB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆，即重组大肠杆菌BL-3，其转入的Terrequinone A合成途径如图2所示。
实施例4重组大肠杆菌的鉴定
通过PCR鉴定外源基因在大肠杆菌中的成功转入，挑取单菌落接种于50ml含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，4℃10000rpm离心1min收集菌体，将菌体用Trizol方法抽提质粒DNA，以抽提的质粒为PCR模板，用如下引物和扩增条件进行外源tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES、sfpS、ScCKS和AtIPKS基因的PCR检测。
根据各基因的特异性片段设计的PCR检测所用引物序列(SEQ ID NO.27～SEQ IDNO.42)如下：
tdiA-F：5’-TCCGTCAAGTGCATGGATGTC-3’；
tdiA-R：5’-CAGACCACGCTCACGCAGGAC-3’；
tdiB-F：5’-GCACTGAAGAAGCTGGGTAAC-3’；
tdiB-R：5’-ACGGAAACCGAAGTCACCAGC-3’；
tdiC-F：5’-ATCTCTCGTAAGCCAATCTGC-3’；
tdiC-R：5’-GACGATGACGACACGGGAACC-3’；
tdiD-F：5’-ATGTTCGTCTGGCTGGAACTC-3’；
tdiD-R：5’-GCAACGATCGACCAGACCAGC-3’；
tdiE-F：5’-AAGACCTTGGGTTTGTGGAAC-3’；
tdiE-R：5’-GACGTCGGAACCAGGTGCAGC-3’；
sfp-F：5’-TCTCACTCTGGACGTTGGGTG-3’；
sfp-R：5’-TGCAGATGCGATGAGACGTTG-3’；
ScCK-F：5’-GGTCCTAACGGCAAGAAGTAC-3’；
ScCK-R：5’-GGAGGAGAAGTTCTTGCACTC-3’；
AtIPK-F：5’-CCACTGTTGGAGCACACTGAC-3’；
AtIPK-R：5’-GGAGAAACGGATGATAGTACC-3’。
所用扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min。结果参见图2。
图3结果显示，本发明的重组大肠杆菌BL-3扩增出上述八个基因tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES、sfpS、ScCKS和AtIPKS，表明两个重组质粒pC02和pU03都转入了大肠杆菌中，所获得的重组大肠杆菌BL-3中包含该八个外源基因。
实施例5重组大肠杆菌BL-3生产Terrequinone A
挑取实施例3中转化了本发明多基因的重组质粒pC02和pU03的单菌落，接种于50ml含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的优化后的M9液体培养基(15g甘油(glycerol)，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO4，0.011g CaCl2，2.9mg ZnSO4·7H2O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1(vitamin B1)以及5g水解酪蛋白(acid-hydrolyzed casein)每升)中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖，继续在25℃培养16h，向发酵液中添加0.5g/L的L-色氨酸和等物质的量的异戊烯醇，然后在30℃培养24h，即可。
取200μl发酵液，加入两倍体积甲醇，用超声波破碎细胞(功率为400W，超声4s，间歇8s，重复99轮)，4℃10000rpm离心1min，取上清，用等体积氯仿萃取，减压蒸馏后用甲醇重溶，用于Terrequinone A检测。
通过LC-MS检测，将样品质谱图(如图4所示)与文献报道的Terrequinone A质谱图(Balibar et al.,Nature Chemical Biology,2007,3(9):584-592)作比较，鉴定为Terrequinone A。具体LC-MS检测条件：TSQ Quantum-Accela型液质联用仪；岛津Shim-packGIST C18色谱柱(150mm×2.1mm，3μm)；流动相为A为含0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％的甲酸乙腈，采用梯度洗脱：0-3min：20％B；3min-13min：20％B-90％B。流速0.2μL/min。柱温为35℃。进样量为1μL。离子源采用ESI+模式，电喷雾电压为3500V，鞘气流速为13mL/min，离子传输管温度为275℃，扫描模式为全扫描模式，扫描分辨率选择为0.4Da，采集的质荷比范围为m/z＝300-500Da，扫描时间为0.5s。
通过HPLC检测Terrequinone A含量，具体HPLC检测条件：安捷伦1100高效液相色谱系统；C18柱(
Figure BDA0003854711690000121
4.6×150mm，5μm)；流动相为0.1％三氟乙酸乙腈水溶液，20min内从5％到100％梯度洗脱，流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为280nm；进样量为20μL。测得Terrequinone A含量为41.9mg/L(图5)。
实施例6底物添加量对重组大肠杆菌BL-3生产Terrequinone A的影响
挑取实施例3中获得的重组大肠杆菌BL-3单菌落，接种于50ml含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的优化后的M9液体培养基中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养16h，向发酵液中添加0.75g/L的L-色氨酸和不同浓度(0.32g/L、0.63g/L、0.95g/L、1.27g/L)的异戊烯醇，使L-色氨酸与异戊烯醇物质的量比分别为1:1、1:2、1:3和1:4，然后在30℃培养24h，分别检测不同底物添加量下BL-3发酵液中Terrequinone A的含量。如图6所示，本发明的重组大肠杆菌在L-色氨酸与异戊烯醇物质的量比为1:3时(0.75g/L的L-色氨酸和0.95g/L的异戊烯醇)，发酵液中Terrequinone A的含量可达到106.3mg/L，而天然菌株土曲霉Aspergillus terreus经过28天的培养后，从5.4L的发酵液中可分离得到6.0mg Terrequinone A粉末。结果表明，本发明的重组大肠杆菌BL-3在转化速率和Terrequinone A产物浓度上均有显著提高。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种在大肠杆菌中表达生产Terrequinone A的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因，其中，所述tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。
2.一种用于生产Terrequinone A的重组质粒pC02，其特征在于，所述重组质粒pC02由基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。
3.根据权利要求2所述的重组质粒pC02，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。
4.一种用于生产Terrequinone A合成所需原料二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP的重组质粒pU03，其特征在于，所述重组质粒pU03由基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS由核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的ScCKS基因和AtIPKS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。
5.根据权利要求4所述的重组质粒pU03，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pUC19。
6.一种可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因、sfp基因、ScCK基因和AtIPK基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因、sfpS基因、ScCKS基因和AtIPKS基因，将所述八个基因分别与T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES、T7 sfpS、T7 ScCKS和T7 AtIPKS；
S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7tidES和T7 sfpS按顺序串联并连接入大肠杆菌表达载体，获得含tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS的六个基因表达盒的重组质粒pC02；
S3：将步骤S1获得的两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS按顺序串联并连接入大肠杆菌表达载体，获得含ScCKS和AtIPKS的两个基因表达盒的重组质粒pU03；
S4：将步骤S2获得的重组质粒pC02和步骤S3获得的重组质粒pU03同时转化到大肠杆菌中，获得一种可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，步骤S2中，将六个基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS按顺序串联，并在T7tdiAS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 sfpS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 tdiAS-T7tdiBS-T7 tdiCS-T7 tdiDS-T7 tidES-T7 sfpS-HindⅢ。
8.根据权利要求6所述重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将两个基因表达盒T7 ScCKS和T7 AtIPKS按顺序串联，并在T7 ScCKS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 AtIPKS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 ScCKS-T7 AtIPKS-HindⅢ。
9.一种根据权利要求6～8中任意一项所述的制备方法获得的可生产Terrequinone A的重组大肠杆菌。
10.一种利用重组大肠杆菌生产Terrequinone A的方法，其特征在于，将根据权利要求9所述的重组大肠杆菌接种于含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的M9液体培养基中，37℃培养至菌液OD600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养14～18h，向发酵液中添加底物L-色氨酸和异戊烯醇，然后在30℃培养22～26h，即可生产Terrequinone A；其中，每升所述M9液体培养基包括：15g甘油，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO4，0.011g CaCl2，2.9mg ZnSO4·7H2O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1，5g水解酪蛋白。
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