CN115975894A

CN115975894A - 一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用

Info

Publication number: CN115975894A
Application number: CN202211143911.0A
Authority: CN
Inventors: 王丽娟; 姚泉洪; 彭日荷; 田永生; 高建杰; 李振军; 张文慧; 邓永东; 王波; 许晶; 王宇; 付晓燕; 韩红娟
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-20
Filing date: 2022-09-20
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明涉及一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用。将Terrequinone A合成途径所需的六个基因进行优化后获得tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，分别构建基因表达盒，并按T7tdiDS、T7tdiAS、T7sfpS、T7tdiBS、T7tdiCS和T7tidES的顺序串联构建重组质粒pC04，转化大肠杆菌，获得的重组工程菌通过发酵可合成具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A，其发酵液中Terrequinone A的含量为1.8mg/L，在生物制药领域具有潜在的应用价值。

Description

一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用。

背景技术

双吲哚醌类化合物是一类具有抗逆转录病毒、抗糖尿病或细胞毒性生物活性的真菌天然产物。双吲哚醌自可皆霉素(Cochliodinol)被发现以来，其家族成员不断壮大，而在这其中，从沙漠植物根际真菌土曲霉(Aspergillus terreus)中首次分离出来的Terrequinone A，对四种人类癌细胞(NCIH460、MCF-7、SF-268和MIA Pa Ca-2)具有中等细胞毒性，是一种潜在的抗癌药物(He et al.,Journal of Natural Products,2004,67(12):1985-1991)，也是唯一一种有生物合成信息的双吲哚醌类化合物。2004年，Bok等人利用转录调控因子LaeA对构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的次生代谢组进行了挖掘，识别了Terrequinone A的合成基因簇tdiABCDE(Bok et al.,Eukaryotic Cell,2004,3(2):527-535)。

Terrequinone A作为一种天然产物，其结构复杂、官能团较多，采用化学合成法所需步骤多、产率低以及环境不友好，随着Terrequinone A在生物体内进行合成和修饰的特殊途径被阐明，利用生物催化法合成Terrequinone A成为一种有效的尝试，Balibar等人分别过表达和研究了tdiABCDE基因簇中的5个基因，通过酶的体外分步反应成功合成了Terrequinone A(Carl J Balibar等人,Terrequinone A biosynthesis through L-tryptophan oxidation,dimerization and bisprenylation,Nature Chemical Biology,2007,3(9):584-592)。然而，体外合成需要外源性地添加昂贵的辅因子和辅因子再生酶系；另外，游离酶催化体系中一种酶催化的产物往往是下一个酶的底物，其底物产物的传递通常受到空间的限制，降低了产物的合成效率。因此，需要寻求更加高效的方法来生产Terrequinone A。大肠杆菌作为一种优良的生物反应器，通过对其进行合成途径的改造或引入新的代谢途径，可用于生物合成高价值天然产物，它能完美地规避上述两个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中Terrequinone A的体外合成方法存在的生产成本较高、合成效率低下的问题。

为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，将所述六个基因分别与T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7sfpS；S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7tdiCS和T7 tidES的顺序串联，连接入大肠杆菌表达载体，构建重组质粒pC04；S3：将步骤S2获得的重组质粒pC04转化入大肠杆菌BL21-AI中，获得一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。

优选地，步骤S2中，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。

优选地，步骤S2中，在T7 tdiDS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 tidES的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 tdiDS-T7tdiAS-T7 sfpS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tidES-HindⅢ。

根据本发明的第二方面，提供一种用于生产Terrequinone A的重组质粒pC04，所述重组质粒pC04由基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7tidES的顺序串联并连接入大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。

根据本发明的第三方面，提供一种根据上述制备方法获得的可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。

根据本发明的第四方面，提供一种利用重组大肠杆菌发酵合成Terrequinone A的方法，将所述重组大肠杆菌接种于含50μg/ml卡那霉素的M9液体培养基中进行发酵培养，加入L-阿拉伯糖诱导，以L-色氨酸为底物，即可发酵合成Terrequinone A。

优选地，所使用的M9液体培养基每升含有：15g甘油(glycerol)，6g Na₂HPO₄，3gKH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO₄，0.011g CaCl₂，2.9mg ZnSO₄·7H₂O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1(vitamin B1)以及5g水解酪蛋白(acid-hydrolyzed casein)。

优选地，加入的所述L-阿拉伯糖的浓度为0.2％，在25℃温度下诱导培养14～18h。

优选地，在诱导培养后，加入浓度为0.5g/L的L-色氨酸，在30℃培养22～26h，即可。

本发明中，根据大肠杆菌的密码子偏好性对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因作为整体进行优化，优化原则包括：(一)按照大肠杆菌密码子偏爱性优化基因，优化基因密码子，提高基因翻译效率；(二)消除茎环结构、转录终止信号、同一基因或相邻基因200bp以内的逆向重复序列，并使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(三)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(四)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率；(五)在满足上述四个原则的基础上，选择消除四个基因内部的EcoRI和HindIII内切酶识别位点，便于构建表达盒；优化后获得tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS基因。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用合成生物学技术，对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因按大肠杆菌表达模式优化，优化后分别与大肠杆菌T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒，再与大肠杆菌表达载体连接获得多基因重组质粒，构建基因工程菌，编码非核糖体肽合成酶的tdiAS基因、编码甲代丙烯基-L-色氨酸合成酶的tdiBS基因、编码氧化还原酶的tdiCS基因、编码氨基转移酶的tdiDS基因、编码伴侣蛋白的tidES基因和编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfpS基因均能活性表达，以L-色氨酸为底物，可生产具有抗癌细胞生物活性的Terrequinone A，在生物制药领域具有潜在的应用价值。

He等人对土曲霉(Aspergillus terreus)经过28天的培养后，从5.4L的发酵液中分离得到6.0mg(即1.1mg/L)Terrequinone A(He et al.,Journal of Natural Products,2004,67(12):1985-1991)。与天然菌株Aspergillus terreus相比，本发明的重组大肠杆菌在经过48h的培养后，发酵液中Terrequinone A的含量可达到1.8mg/L，大大缩短了Terrequinone A的合成周期，并提高了Terrequinone A在发酵液中的含量。

附图说明

图1为本发明实施例3中重组质粒pC04的结构示意图；

图2为本发明实施例3中大肠杆菌BL-4转入的Terrequinone A合成途径；

图3为本发明实施例4中大肠杆菌BL-4外源基因的PCR检测结果，M为Marker；

图4为本发明实施例5中Terrequinone A的质谱测定鉴定图(正离子m/z＝491.2)；

图5为本发明实施例5中菌培养液经氯仿萃取后的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1六段基因的优化

基于tdiA(Genbank:EF550581.1)、tdiB(Genbank:EF550582.1)、tdiC(Genbank:EF550583.1)、tdiD(Genbank:EF550584.1)、tidE基因(Genbank:(Genbank:EF550585.1)和sfp基因(GenBank:X65610.1，Bacillus subtilis)的编码序列，按照以下原则对上述六个基因作为整体进行优化：

(一)按照大肠杆菌密码子偏爱性优化基因，优化基因密码子，提高基因翻译效率；(二)消除茎环结构、转录终止信号、同一基因或相邻基因200bp以内的逆向重复序列，并使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(三)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(四)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率；(五)在满足上述四个原则的基础上，选择消除八个基因内部的EcoRI和HindⅢ内切酶识别位点，便于构建重组质粒。

优化后，获得tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS基因，所述tdiAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述tdiBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述tdiCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述tidDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述tdiES基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sfpS基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

实施例2基因表达盒的构建

在每个优化的基因序列前端连接大肠杆菌T7启动子序列，在每个优化的基因序列末端连接大肠杆菌T7终止子序列，构建基因表达盒T7tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS，由南京金斯瑞公司化学合成。

T7启动子序列(SEQ ID NO.7)为：

5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’。

T7终止子序列(SEQ ID NO.8)为：

5’-TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG-3’。

实施例3构建重组质粒并转化

利用“聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)介导的重叠延伸PCR”技术(彭日荷等人,Adirect and efficient PAGE-mediated overlap extension PCR method for genemultiple-site mutagenesis,Appl Microbiol Biotechnol.2006,73(1):234-40)，获得的六个基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7 tidES的顺序串联，并在T7 tdiDS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 sfpS的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 tdiDS-T7 tdiAS-T7 sfpS-T7 tdiBS-T7 tidCS-T7 tdiES-HindⅢ。

为获得EcoRⅠ-T7 tdiDS-T7 tdiAS-T7 sfpS-T7 tdiBS-T7 tidCS-T7tdiES-HindⅢ，设计的引物序列(SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.20)如下：

T7 tdiDS：

P1：5’-GAATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGGTTCTATTG-3’；

P2：5’-CTTAGATGGTGCCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；

T7 tdiAS：

P3：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGCACCATCTAAG-3’；

P4：5’-ACCGTAGATTTTCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；

T7 sfpS：

P5：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGAAAATCTACGGT-3’；

P6：5’-GTATTCAGTAGCCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；

T7 tdiBS：

P7：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGCTACTGAATAC-3’；

P8：5’-AAGAGCTGCGTGCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；

T7 tdiCS：

P9：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGCACGCAGCTCTT-3’；

P10：5’-ATGGTCTGTTAACCATCCTATAGTGAGTCGTATTACAAAAAACCCCTC-3’；

T7 tdiES：

P11：5’-TTGAGGGGTTTTTTGTAATACGACTCACTATAGGATGGTTAACAGACCAT-3’；

P12：5’-AAGCTTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3’。

第一步PCR：分别以T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7 sfpS、T7 tdiBS、T7 tidCS和T7 tdiES基因片段为模板，添加对应的引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃30s，68℃60s，共10个循环；

将第一步PCR获得的6个基因片段进行凝胶电泳，胶回收；

第二步PCR：以胶回收获得的6个基因片段的混合物作为模板，以P1和P12为引物进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性1min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共25个循环；最后72℃再延伸10min。

将上述串联的六个基因片段用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切并连接到经同样酶切的载体pCAMBIA1301上，获得含有六个基因的重组质粒pC04(图1)。

采用热激法将pC04转入大肠杆菌BL21-AI中，涂布在含50μg/ml卡那霉素抗性的固体LB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆，即重组大肠杆菌BL-4，其转入的TerrequinoneA合成途径如图2所示。

实施例4重组大肠杆菌的鉴定

通过PCR鉴定外源基因在大肠杆菌中的成功转入，挑取单菌落接种于50ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀达到0.6时，4℃10000rpm离心1min收集菌体，将菌体用Trizol方法抽提质粒DNA，以抽提的质粒为PCR模板，用如下引物和扩增条件进行外源tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS基因的PCR检测。

根据各基因的特异性片段设计的PCR检测所用引物序列(SEQ ID NO.21～SEQ IDNO.32)如下：

tdiA-F：5’-TCCGTCAAGTGCATGGATGTC-3’；

tdiA-R：5’-CAGACCACGCTCACGCAGGAC-3’；

tdiB-F：5’-GCACTGAAGAAGCTGGGTAAC-3’；

tdiB-R：5’-ACGGAAACCGAAGTCACCAGC-3’；

tdiC-F：5’-ATCTCTCGTAAGCCAATCTGC-3’；

tdiC-R：5’-GACGATGACGACACGGGAACC-3’；

tdiD-F：5’-ATGTTCGTCTGGCTGGAACTC-3’；

tdiD-R：5’-GCAACGATCGACCAGACCAGC-3’；

tdiE-F：5’-AAGACCTTGGGTTTGTGGAAC-3’；

tdiE-R：5’-GACGTCGGAACCAGGTGCAGC-3’；

sfp-F：5’-TCTCACTCTGGACGTTGGGTG-3’；

sfp-R：5’-TGCAGATGCGATGAGACGTTG-3’。

所用扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min。

图3结果显示，本发明的重组大肠杆菌BL-4扩增出上述六个基因tdiAS、tdiBS、tdiCS、tdiDS、tidES和sfpS，表明重组质粒pC04转入了大肠杆菌中，所获得的重组大肠杆菌BL-4中包含该六个外源基因。

实施例5利用重组大肠杆菌BL-4发酵合成Terrequinone A

挑取实施例3中重组大肠杆菌BL-4的单菌落，接种于50ml含50μg/ml卡那霉素的优化后的M9液体培养基(15g甘油(glycerol)，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO₄，0.011g CaCl₂，2.9mg ZnSO₄·7H₂O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1(vitamin B1)以及5g水解酪蛋白(acid-hydrolyzed casein)每升)中，37℃培养至菌液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖，继续在25℃培养16h，向发酵液中添加0.5g/L的L-色氨酸，然后在30℃培养24h，即可。

取200μl发酵液，加入两倍体积甲醇，用超声波破碎细胞(功率为400W，超声4s，间歇8s，重复99轮)，4℃10000rpm离心1min，取上清，用等体积氯仿萃取，减压蒸馏后用甲醇重溶，用于Terrequinone A检测。

通过LC-MS检测，将样品质谱图(图4)与文献报道的Terrequinone A质谱图(Balibar et al.,Nature Chemical Biology,2007,3(9):584-592)作比较，鉴定为Terrequinone A。具体LC-MS检测条件：TSQ Quantum-Accela型液质联用仪；岛津Shim-packGIST C18色谱柱(150mm×2.1mm，3μm)；流动相为A为含0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％的甲酸乙腈，采用梯度洗脱：0-3min：20％B；3min-13min：20％B-90％B。流速0.2μL/min。柱温为35℃。进样量为1μL。离子源采用ESI+模式，电喷雾电压为3500V，鞘气流速为13mL/min，离子传输管温度为275℃，扫描模式为全扫描模式，扫描分辨率选择为0.4Da，采集的质荷比范围为m/z＝300-500Da，扫描时间为0.5s。

通过HPLC检测Terrequinone A含量，具体HPLC检测条件：安捷伦1100高效液相色谱系统；C18柱(

4.6×150mm，5μm)；流动相为0.1％三氟乙酸乙腈水溶液，20min内从5％到100％梯度洗脱，流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为280nm；进样量为20μL。测得其发酵液中Terrequinone A的含量约为1.8mg/L(图5)。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：对tdiA基因、tdiB基因、tdiC基因、tdiD基因、tidE基因和sfp基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因，将优化后的上述六个基因分别与T7启动子和终止子连接，构建基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7 tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS；

S2：将步骤S1获得的六个基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7tdiCS和T7 tidES的顺序串联，连接入大肠杆菌表达载体，构建重组质粒pC04；

S3：将步骤S2获得的重组质粒pC04转化入大肠杆菌BL21-AI中，获得一种可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述大肠杆菌表达载体为pCAMBIA1301。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在T7 tdiDS的5’-端连接EcoRⅠ内切酶位点，在T7 tidES的3’-端连接HindⅢ内切酶位点，获得EcoRⅠ-T7 tdiDS-T7tdiAS-T7 sfpS-T7 tdiBS-T7 tdiCS-T7 tidES-HindⅢ。

4.一种用于生产Terrequinone A的重组质粒pC04，其特征在于，所述重组质粒pC04由基因表达盒按T7 tdiDS、T7 tdiAS、T7sfpS、T7 tdiBS、T7 tdiCS和T7 tidES的顺序串联并连接入大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒T7 tdiAS、T7 tdiBS、T7tdiCS、T7 tdiDS、T7 tidES和T7 sfpS由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的tdiAS基因、tdiBS基因、tdiCS基因、tdiDS基因、tidES基因和sfpS基因分别与T7启动子和终止子连接而成。

5.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的制备方法获得的可发酵合成Terrequinone A的重组大肠杆菌。

6.一种利用重组大肠杆菌发酵合成Terrequinone A的方法，其特征在于，将根据权利要求5所述的重组大肠杆菌接种于含50μg/ml卡那霉素的M9液体培养基中进行发酵培养，加入L-阿拉伯糖诱导，以L-色氨酸为底物，即可发酵合成Terrequinone A。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所使用的M9液体培养基每升含有：15g甘油，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，0.12g MgSO₄，0.011g CaCl₂，2.9mgZnSO₄·7H₂O，0.2mL 1％(w/v)维生素B1，以及5g水解酪蛋白。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，加入的所述L-阿拉伯糖的浓度为0.2％，在25℃温度下诱导培养14～18h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在诱导培养后，加入浓度为0.5g/L的L-色氨酸，在30℃培养22～26h，即可。