CN115725621A - 一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用 - Google Patents
一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用。本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因,对L‑色氨酸作为底物生物合成褪黑素途径的4个基因进行结构优化和化学合成,并创制了含有4个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌,最后通过RT‑PCR验证这4个外源基因在转录水平均进行了正确的表达,进一步通过摇瓶发酵实验来检验其生成褪黑素的能力,最终通过UHPLC‑MS/MS测得其褪黑素产量达到1mg/L。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用。
背景技术
褪黑素又名褪黑激素,是松果腺体分泌的特有神经类激素,是色胺衍生物系列里重要成员。它的药理和生理活性越来越多已被临床试验证明,在免疫力提高、改善睡眠、抗氧化和延缓衰老等方面有着不可替代的作用,是天然药物产物成分。在欧美等发达国家被誉为生命机体的黄金活性元素。化学合成法一直是生产褪黑素的主要方法,但其费用偏高且会造成环境污染。生物合成法具有方便、快捷、稳定、产物单一、环境友好等优点,被广泛用于生物制造。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用,费用低、效率高、绿色环保。
本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因,所述融合基因包括mXcP4H、HsAADC、HsAANAT和HIOMT基因。
优选的,所述mXcP4H基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,HsAADC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,HsAANAT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,HIOMT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
优选的,所述融合基因的各组成基因在进行融合前,还包括进行密码子优化,经密码子优化后的mXcP4H基因(mXcP4HS)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,优化后的HsAADC基因(HsAADCS)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,优化后的HsAANAT基因(HsAANATS)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,优化后的HIOMT基因(HIOMTS)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种包含上述融合基因的表达盒,将每个经密码子优化后的基因分别与T7启动子和终止子融合,构建四个基因表达盒;
所述的T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,所述T7终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.10。
本发明还提供了一种包含上述表达盒的多基因表达盒。
优选的,所述多基因表达盒的连接顺序,从5’端至3’端为:mXcP4HS-mXcP4HS-HsAANATS-HIOMTS。
本发明还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组载体。
优选的,所述多基因表达盒经EcoRI和HindIII双酶切后,连入相同酶切的载体pBR326(GenbankNo:Z052603)中,得重组载体(pBR7992)。
本发明还提供了一种包含上述重组载体的工程菌。
优选的,所述重组质粒转入到大肠杆菌BL21-AI(DE3)中,得到大肠杆菌工程菌株BL7992。
本发明还提供了一种从L-色氨酸合成褪黑素的大肠杆菌工程菌,在所述大肠杆菌工程菌的基因组中包含上述重组质粒。
本发明还提供了一种利用上述大肠杆菌工程菌合成褪黑素的方法,包括以下步骤:将所述大肠杆菌工程菌在增菌培养基中进行摇菌培养,得种子液;
将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵,发酵液中检测到褪黑素;
所述发酵时以L-色氨酸为发酵底物。
有益效果:本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因,对以L-色氨酸作为底物生物合成褪黑素途径的4个基因进行结构优化和化学合成,并创制了含有4个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌,最后通过RT-PCR验证这4个外源基因在转录水平均进行了正确的表达,进一步通过摇瓶发酵实验来检验其生成褪黑素的能力,最终通过UHPLC-MS/MS测得其褪黑素产量达到1mg/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为从L-色氨酸到褪黑素的合成流程;
图2为质粒转化图;
图3为PCR鉴定结果图;
图4为褪黑素质谱图;
图5为褪黑素碎片离子质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因,所述融合基因包括mXcP4H、HsAADC、HsAANAT和HIOMT基因。
本发明所述mXcP4H基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示,HsAADC基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示,HsAANAT基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示,HIOMT基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.7所示。本发明所述融合基因的各组成基因在进行融合前,优选还包括进行密码子优化,经密码子优化后的mXcP4H基因(mXcP4HS)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,优化后的HsAADC基因(HsAADCS)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,优化后的HsAANAT基因(HsAANATS)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,优化后的HIOMT基因(HIOMTS)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种包含上述优化后的基因表达载体的构建方法。
本发明所述基因表达载体的构建方法,优选包括:优化后的四个基因分别与T7启动子和终止子融合,构建得到四个基因表达盒;再将构建的四个基因表达盒按顺序依次连接,构成多基因表达盒;所述连接顺序为mXcP4HS-mXcP4HS-HsAANATS-HIOMTS;所述多基因表达盒经EcoRI和HindIII双酶切后,连入相同酶切的载体pBR326(Genbank No:Z052603)中,得重组载体(pBR7992);所述的T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,所述T7终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
本发明优选利用T7启动子和终止子控制所述优化后的4个基因的表达,完成优化后的4个基因原核表达单元的拼接;并选择在带有卡那霉素抗性质粒pBR326上组装了包含4个基因的从L-色氨酸生物成褪黑素的途径。在本发明中,T7噬菌体晚期转录系统是特殊的表达系统,也是目前用于表达外源基因的首选系统,其启动子为III型启动子,大肠杆菌RNA聚合酶无法识别,只能被噬菌体本身编码的T7 RNA聚合酶(T7RNAP)特异识别和调控;T7启动子是最强的原核启动子之一,高活性的T7 RNAP合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍。本发明选择T7启动子和终止子控制以上4个化学合成基因的表达,分别进行大肠杆菌表达单元的拼接,插入T-载体。
本发明还提供了一种包含上述重组载体的工程菌及其构建方法,所述工程菌优选包括大肠杆菌工程菌。在本发明实施例中,优选将上述重组载体转入到大肠杆菌BL21-AI(DE3)中,得到大肠杆菌工程菌株BL7992。
本发明在所述大肠杆菌工程菌进行构建时,优选先将上述重组载体pBR7992通过热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布在加有卡那霉素抗性的固体2YT平板上,37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序,测序结果和设计序列完全一致,最终构成的质粒定名为pBR7992。
本发明还提供了一种从L-色氨酸合成褪黑素的大肠杆菌工程菌,在所述大肠杆菌工程菌的基因组中包含上述重组载体。
本发明所述大肠杆菌工程菌所转入的外源基因在转录水平均进行正确的表达,且在所述大肠杆菌工程菌中可完成从L-色氨酸(L-Tryptophan)到褪黑素的生物合成(图1),mXcP4HS基因表达的L-色氨酸-5-单加氧酶将L-色氨酸转化为5-羟基-L-色氨酸(5-Hydroxy-L-tryptophan)、HsAADCS基因表达的L-色氨酸脱羧酶将5-羟基-L-色氨酸转化为血清素(Serotonin)、HsAANATS基因表达的芳烷基胺-N-乙酰转移酶将血清素转化为N-乙酰血清素(N-acetylserotonin)、HIOMTS基因表达的乙酰血清素甲基转移酶将N-乙酰血清素转化为褪黑素(Melatonin)。
本发明还提供了一种利用上述大肠杆菌工程菌合成褪黑素的方法,包括以下步骤:将所述大肠杆菌工程菌在增菌培养基中进行摇菌培养,得种子液;
将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵,发酵液中检测到褪黑素;
所述发酵时以L-色氨酸为发酵底物。
本发明所述摇菌培养优选包括在37℃摇菌24小时(150rpm),离心去上清,菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍,之后用发酵培养基进行发酵,所述增菌培养基以M9培养基(1L)为基础培养基,优选还包括1%甘油、50μg/ml卡那霉素。所述发酵培养基以M9培养基(1L)为基础培养基,优选还包括1g L-色氨酸、1%甘油、0.2%阿拉伯糖、1mM IPTG和50μg/ml卡那霉素。本发明所述发酵的温度优选为37℃。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
4个基因的结构优化和化学合成
4个优化合成前的基因为:mXcP4H、HsAADC、HsAANAT和HIOMT;其序列号分别对应为:SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7。
4个优化合成后的基因原核表达单元的名称分别定名为:mXcP4HS、HsAADCS、HsAANATS和HIOMTS;其序列号分别对应为:SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQID No.8。
基因化学合成遵循以下原则:优化基因密码子,提高基因翻译效率;消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点,便于表达盒构建;消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号,使基因内部的GC/AT均衡,提高RNA的稳定性;消除内含子识别序列,避免在编码区内发生内含子剪接,导致基因功能的丧失;RNA的使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias1991),以提高翻译蛋白的稳定性;避免6个或更多的连续的A+T序列,5个或更多的G+C序列;避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸,以上序列在植物中易造成甲基化,从而引起基因沉默;设计提高基因5’端的自由能,降低3’端的自由能,以提高基因翻译效率。
实施例2
表达载体的构建
优化后的四个基因分别与T7启动子和终止子融合,分别构建四个基因表达盒;再将构建的四个基因表达盒应用ClonExpress MultiS多片段一步无缝快速克隆试剂盒(诺唯赞)按顺序依次连接(mXcP4HS-mXcP4HS-HsAANATS-HIOM TS),构成一个含多基因表达盒的完整序列;在完整序列两端分别连接EcoRI和HindIII酶切位点,完整序列由生工生物工程(上海)股份公司进行核苷酸全序列分析测定。最后将测序正确的完整合成片段经EcoRI和HindIII双酶切后,连入相同酶切的载体pBR326(Genbank No:Z052603)中,得重组质粒(pBR7992);
基因与T7启动子和终止子融合采用改良重叠延伸PCR技术,该改良重叠延伸PCR技术具体参考文献:(Rihe Peng,Aisheng Xiong,Quanhong Yao;A direct and efficientPAGE-mediated overlap extension PCR method for gene multiple-sitemulagenesis,Applied Microbiology Biotechnology.2006,73:234-40),使用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的适合长基因高保真扩增的Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase。PCR扩增程序为:95℃预变性30s;95℃变性45s,56-72℃退火45s,72℃延伸5-20min(根据片段长度),扩增25-35个循环;72℃终延伸10min。
实施例3
大肠杆菌工程菌株的构建
得到上述重组质粒pBR7992,并将其通过热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布在加有卡那霉素抗性的固体2YT平板上,37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序,测序结果和设计序列完全一致,最终构成的质粒定名为pBR7992。随后将质粒pBR7992转化美国Invitrogen公司的BL21-AI(DE3)(命名EG61)大肠杆菌感受态,在LB加卡那霉素抗性固体平板筛选质粒转化子,37℃,培养12h后观察菌株生长情况,如图2所示。
实施例4
验证表达
分别设计4对引物对所转入的4个基因进行RT-PCR验证,以实施例3构建得到的大肠杆菌工程菌的RNA反转录得到的cDNA为模板。所设计的引物序列如下:
mXcP4HS:F(SEQ ID No.11):5’-TGT,TGA,ACA,ACC,TTG,GGA,ATC-3’;
R(SEQ ID No.12):5’-TCC,ACC,AGG,TGA,CAG,GGA,AAC-3’。
HsAADCS:F(SEQ ID No.13):5’-AGA,TCA,TCA,TGC,CTG,GTG,TCA-3’;
R(SEQ ID No.14):5’-CAG,CCA,GCA,GTG,CAA,CCA,GAG-3’。
HsAANATS:F(SEQ ID No.15):5’-CAC,TGT,ACC,TGG,ATG,AGA,TTC-3’;
R(SEQ ID No.16):5’-TGC,AGC,ACG,ACG,AAC,AGC,AGG-3’。
HIOMTS:F(SEQ ID No.17):5’-ACA,GAA,ACA,CCG,AAC,TCT,CCT-3’;
R(SEQ ID No.18):5’-GAG,GTC,GAA,AGC,AGT,GAGG,AC-3’。
大肠杆菌转化子的RNA抽提参照《分子克隆实验指南》。之后采用takara RNA反转录试剂盒获得cDNA。然后以cDNA作为模板,进行RT-PCR扩增。反应体系:1μL质粒,4μL2.5mmol/L dNTPs,5μL Buffer,Ex-Taq(Toyobo日本)0.5U,引物各1μL,加ddH2O至50μL;反应程序为:94℃30s,54℃30s,72℃30s,共45个循环,72℃再延伸10min,凝胶电泳拍照(图3)。证实所转入的外源基因在转录水平均进行了正确的表达。
实施例5
发酵实验
为了进一步验证褪黑素的生物合成,从上述转化的平板上(图3)挑取转化子带蓝色单菌落接种到80毫升增菌培养基中(含1%甘油、50μg/ml卡那霉素),37℃摇菌24小时(150rpm),离心去上清,菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍,之后用10毫升发酵培养基重悬(含0.01g L-色氨酸、1%甘油、0.2%阿拉伯糖、1mM IPTG、50μg/ml卡那霉素),37℃摇菌处理,不同时间取菌液,通过UHPLC-MS/MS检测培养基中褪黑素含量,质谱检测参考Lefevre,A.等人的方法(Lefevre,A.,et al.Validation of a global quantitative analysismethodology of tryptophan metabolites in mice using LC-MS[J].2019)。结果见图4和图5,最终测得该工程菌株能产生大约1mg/L的褪黑素。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种合成褪黑素的融合基因,其特征在于,所述融合基因包括mXcP4H、HsAADC、HsAANAT和HIOMT基因。
2.根据权利要求1所述融合基因,其特征在于,所述mXcP4H基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示,HsAADC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,HsAANAT基因的核苷酸序列如SEQID No.5所示,HIOMT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
3.根据权利要求1或2所述融合基因,其特征在于,所述融合基因的各组成基因在进行融合前,还包括进行密码子优化,经密码子优化后的mXcP4H基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示,优化后的HsAADC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,优化后的HsAANAT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,优化后的HIOMT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
4.一种包含权利要求3所述融合基因的表达盒,其特征在于,将每个经密码子优化后的基因分别与T7启动子和终止子融合,构建四个基因表达盒;
所述的T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,所述T7终止子的核苷酸序列如SEQID No.10。
5.一种包含权利要求4所述表达盒的多基因表达盒。
6.根据权利要求5所述多基因表达盒,其特征在于,所述多基因表达盒的连接顺序,从5’端至3’端为:经密码子优化后的mXcP4H表达盒、经密码子优化后的mXcP4H表达盒、经密码子优化后的HsAANAT表达盒和经密码子优化后的HIOMT表达盒。
7.一种包含权利要求5或6所述多基因表达盒的重组载体。
8.一种包含权利要求7所述重组载体的工程菌。
9.一种从L-色氨酸合成褪黑素的大肠杆菌工程菌,其特征在于,在所述大肠杆菌工程菌的基因组中包含权利要求7所述的重组载体。
10.利用权利要求9所述大肠杆菌工程菌从L-色氨酸合成褪黑素的方法,其特征在于,将所述大肠杆菌工程菌在增菌培养基中进行摇菌培养,得种子液;
将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵,发酵液中检测到褪黑素;
所述发酵时以L-色氨酸为发酵底物。
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