CN115896145B - 一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用 - Google Patents
一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法创制完全降解1,2‑二氯乙烷工程菌的方法及应用。本发明提供了一种完全降解1,2‑二氯乙烷的融合基因，对目前已知的降解1,2‑二氯乙烷功能的6个基因进行结构优化和化学合成，并创制了含有6个基因的多基因表达盒，以及表达所述融合基因的重组大肠杆菌工程菌。本发明实施例中通过PCR验证，所述融合基因的6个外源基因均完整整合进了大肠杆菌基因组中，进一步通过摇瓶发酵实验和同位素示踪法来验证其降解1,2‑二氯乙烷的能力，结果显示2mM1,2‑二氯乙烷在12h内被完全降解。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用。
背景技术
1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane；1,2-DCA)属卤代烃类化合物，无色透明油状液体，有类似氯仿的气味，能与甲醇等有机溶剂混溶，微溶于水，易挥发，高毒，可致癌，易燃，已被EPA列为优先控制的有毒污染物名单之中。工业上所用到的1,2-DCA都是由人工合成而来，在应用过程中的不正确处理常导致1,2-DCA通过废水的形式进入环境中，对环境造成严重的污染。此外，1,2-DCA还是一种潜在的诱变剂和致癌物质。随着工业的快速发展，1,2-DCA的应用带来的环境问题日益严重，因此，寻找高效处理1,2-DCA的方法具有广泛的应用前景。
传统的处理方法包括物理吸附和化学裂解，但是效率较低、成本较高，相比之下，生物处理法则具有显著的优势，效率高、能耗低且不会产生二次污染。1983年，1,2-DCA降解模式菌XanthobacterautotrophicusGJ10被成功分离，到目前为止，报道的1,2-DCA降解菌属有Ancylobactersp.、Pseudomonassp.等，但这些菌株存在着亲和力低、降解不稳定等自身缺陷，导致应用程度较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用，创制的工程菌可完全降解1,2-二氯乙烷，降解效率高。
本发明提供了一种完全降解1,2-二氯乙烷的融合基因，形成所述融合基因的原始基因包括XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因。
优选的，所述XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的，所述原始基因在进行融合前，还包括进行密码子优化，经优化后的XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经优化后的XaADH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，经优化后的XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，经优化后的XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经优化后的CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，经优化后的GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还提供了一种包含上述融合基因的多基因表达盒。
优选的，将每个经密码子优化后的原始基因分别与T7启动子和终止子融合，构建得到6个表达盒，并进行连接。
优选的，所述连接的顺序从5’端至3’端，包括：经密码子优化后的XaDhlA表达盒、经密码子优化后的XaADH表达盒、经密码子优化后的XaALDH表达盒、经密码子优化后的XaDhlB表达盒、经密码子优化后的CrGYD1表达盒和经密码子优化后的GmMS表达盒。
本发明还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组载体。
本发明还提供了一种表达上述融合基因或包含上述重组载体的重组工程菌。
本发明还提供了一种完全降解1,2-二氯乙烷的重组大肠杆菌工程菌，所述重组大肠杆菌工程菌表达上述融合基因或包含上述重组载体。
本发明还提供了上述重组工程菌或上述重组大肠杆菌工程菌在完全降解1,2-二氯乙烷中的应用。
有益效果：本发明提供了一种完全降解1,2-二氯乙烷的融合基因，对目前已知的降解1,2-二氯乙烷功能的6个基因进行结构优化和化学合成，并创制了含有6个基因的多基因表达盒，以及表达所述融合基因的重组大肠杆菌工程菌。本发明实施例中通过DNA的PCR验证，所述融合基因的6个外源基因均整合到大肠杆菌基因组中，进一步通过摇瓶发酵实验和同位素示踪法验证来检验其降解1,2-二氯乙烷的能力，结果显示2mM1,2-二氯乙烷在12h内被完全降解。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为1,2-二氯乙烷降解流程图；
图2为PCR鉴定结果图；
图3为1,2-二氯乙烷降解效果图；
图4为中间代谢产物乙醇酸检测图；
图5为同位素标记代谢检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种完全降解1,2-二氯乙烷的融合基因，形成所述融合基因的原始基因包括XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因。
本发明所述融合基因的组成基因中，XaDhlA基因编码的卤代烷烃脱卤酶将1,2-二氯乙烷转化为2-氯乙醇、XaADH基因编码的乙醇脱氢酶将2-氯乙醇转化为2-氯乙醛、XaALDH基因编码的乙醛脱氢酶将2-氯乙醛转化为氯乙酸、XaDhlB基因编码的卤乙酸脱卤酶将氯乙酸转化为乙醇酸、莱茵衣藻CrGYD1基因编码乙醇酸脱氢酶，催化乙醇酸生成乙醛酸、大豆GmMS基因编码苹果酸合成酶，催化乙醛酸和乙酰coA生成苹果酸，苹果酸直接进入TCA循环，为细菌所利用，从而完成1,2-二氯乙烷的完全降解。
在本发明中，各原始基因的核苷酸序列分别如下所述：所述XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述XaADH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述GmMS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。本发明所述原始基因在进行融合前，优选还包括进行密码子优化，经密码子优化后的XaDhlA基因(XaDhlAS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，优化后的XaADH基因(XaADHS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，优化后的XaALDH基因(XaALDHS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，优化后的XaDhlB基因(XaDhlBS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。优化后的CrGYD1基因(CrGYD1S)的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，优化后的GmMS基因(GmMSS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明对所述优化后的基因进行化学合成，且基因化学合成遵循以下原则：优化基因密码子，提高基因翻译效率；消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；消除内含子识别序列，避免在编码区内发生内含子剪接，导致基因功能的丧失；RNA的使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias1991)，以提高翻译蛋白的稳定性；避免6个或更多的连续的A+T序列，5个或更多的G+C序列；避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸，以上序列在植物中易造成甲基化，从而引起基因沉默；设计提高基因5’端的自由能，降低3’端的自由能，以提高基因翻译效率。
本发明还提供了一种包含上述融合基因的多基因表达盒。
本发明在构建所述多基因表达盒前，优选首先构建基因表达盒，并将各基因表达盒进行连接，即构建得到所述多基因表达盒。本发明优选优化后的六个基因分别与T7启动子和终止子融合，构建得到六个基因表达盒；再将构建的六个基因表达盒按顺序依次连接，构成多基因表达盒；所述连接顺序为XaDhlAS-XaADHS-XaALDHS-XaDhlBS-CrGYD1S-GmMSS。本发明所述T7启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.13所示，所述T7终止子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组载体。
本发明所述重组载体的基础载体优选包括pBR326(GenbankNO:Z052603)。本发明在构建所述重组载体时，优选将上述多基因表达盒经EcoRI和HindIII双酶切后，连入相同酶切的载体pBR326中，得重组载体(pBR5763)。
本发明优选利用T7启动子和终止子控制所述优化后的6个基因的表达，完成优化后的6个基因原核表达单元的拼接；并选择在带有卡那霉素抗性质粒pBR326上组装了包含6个基因的完全降解1,2-二氯乙烷的途径。在本发明中，T7噬菌体晚期转录系统是特殊的表达系统，也是目前用于表达外源基因的首选系统，其启动子为III型启动子，大肠杆菌RNA聚合酶无法识别，只能被噬菌体本身编码的T7RNA聚合酶(T7RNAP)特异识别和调控；T7启动子是最强的原核启动子之一，高活性的T7RNAP合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍。本发明选择T7启动子和终止子控制以上6个化学合成基因的表达，分别进行大肠杆菌表达单元的拼接，插入T-载体。
本发明所述基因与T7启动子和终止子融合优选采用改良重叠延伸PCR技术，该改良重叠延伸PCR技术具体参考文献：(RihePeng,AishengXiong,QuanhongYao；AdirectandefficientPAGE-mediatedoverlapextensionPCRmethod forgenemultiple-sitemulagenesis,AppliedMicrobiologyBiotechNOlogy.2006,73:234-40)，使用南京诺唯赞生物科技有限公司(VazymeBiotechCo.,Ltd)的适合长基因高保真扩增的PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase。PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性45s，56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(1000bp/min)，扩增25-35个循环；72℃终延伸10min。
本发明还提供了一种表达上述融合基因或包含上述重组载体的重组工程菌。
本发明所述重组工程菌的基础菌株优选包括大肠杆菌。在本发明实施例中，优选将上述重组载体转入到大肠杆菌BL21-AI(DE3)中，得到大肠杆菌工程菌株BL5763。
本发明还提供了一种完全降解1,2-二氯乙烷的重组大肠杆菌工程菌，所述重组大肠杆菌工程菌表达上述融合基因或包含上述重组载体。
本发明在所述大肠杆菌工程菌进行构建时，优选先将上述重组载体pBR5763通过热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在加有卡那霉素抗性的固体2YT平板上，37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果和设计序列完全一致，最终构成的质粒定名为pBR5763。本发明所述重组大肠杆菌工程菌所转入的外源基因全部整合到大肠杆菌基因组中，且在所述大肠杆菌工程菌中可完全降解1,2-二氯乙烷，其降解途径如图所示(图1)。
本发明还提供了上述重组工程菌或上述重组大肠杆菌工程菌在完全降解1,2-二氯乙烷中的应用。
在本发明实施例中还在诱导培养基中加入2mM1,2-二氯乙烷，验证所述重组工程菌的降解1,2-二氯乙烷的作用，具体包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌工程菌在增菌培养基中进行摇菌培养，得种子液；
将所述种子液接种到诱导培养基中进行发酵，诱导4小时后添加2mM1,2-二氯乙烷。
本发明所述摇菌培养优选包括在37℃摇菌24小时(150rpm)，离心去上清，菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍，之后用发酵培养基进行发酵，所述增菌培养基以M9培养基(1L)为基础培养基，优选还包括1％甘油、50μg/ml卡那霉素。所述诱导培养基以M9培养基(1L)为基础培养基，优选还包括2mM1,2-二氯乙烷、1％甘油、0.2％阿拉伯糖、1mMIPTG和50μg/ml卡那霉素。本发明所述发酵的温度优选为37℃。结果显示所述重组工程大肠杆菌能在12h内完全降解2mM的1,2-二氯乙烷。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、6个基因的结构优化和化学合成
6个优化合成前的基因为：XaDhlA、XaADH、XaALDH、XaDhlB、CrGYD1和GmMS；其序列号分别对应为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.9，SEQID NO.11。
6个优化合成后的基因原核表达单元的名称分别定名为：XaDhlAS、XaADHS、XaALDHS、XaDhlBS、CrGYD1S和GmMSS；其序列号分别对应为：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8。SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.12。
2、表达载体的构建
优化后的六个基因分别与T7启动子和终止子融合，分别构建六个基因表达盒；再将构建的六个基因表达盒应用ClonExpressMultiS多片段一步无缝快速克隆试剂盒(诺唯赞)按顺序依次连接(XaDhlAS-XaADHS-XaALDHS-XaDhlBS-Cr GYD1S-GmMSS)，构成一个含多基因表达盒的完整序列；在完整序列两端分别连接EcoRI和HindIII酶切位点，完整序列由生工生物工程(上海)股份公司进行核苷酸全序列分析测定。最后将测序正确的完整合成片段经EcoRI和HindIII双酶切后，连入相同酶切的载体pBR326(GenbankNO:Z052603)中，得重组质粒(pBR5763)。
实施例2
大肠杆菌工程菌株的构建
得到上述重组质粒pBR5763，并将其通过热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在加有卡那霉素抗性的固体2YT平板上，37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果和设计序列完全一致，最终构成的质粒定名为pBR5763。随后将质粒pBR5763转化美国Invitrogen公司的BL21-AI(DE3)(命名EG61)大肠杆菌感受态，在LB加卡那霉素抗性固体平板筛选质粒转化子，37℃，培养12h后挑选带蓝色的单菌落进行进一步验证。
实施例3
验证表达
分别设计6对引物对所转入的6个基因进行PCR验证，以实施例2构建得到的大肠杆菌工程菌的DNA为模板。所设计的引物序列如下：XaDhlAS、XaADHS、XaALDHS、XaDhlBS、CrGYD1S和GmMSS。
XaDhlAS：F(SEQ ID NO.15):5’-GGT,TTC,GGT,AAG,AAG,CTT,GAC-3’；R(SEQ IDNO.16):5’-CAC,CAC,CGA,TAC,GTG,CAT,GTG-3’。
XaADHS：F(SEQ ID NO.17):5’-AGA,TTC,GGT,ATG,CCA,GTC,TGA-3’；R(SEQ IDNO.18):5’-GTG,CAC,GAC,CAT,CCA,GAC,ATG-3’。
XaALDHS：F(SEQ ID NO.19):5’-CAC,TTC,CGA,CAC,GAC,CTC,GCA-3’；R(SEQ IDNO.20):5’-TCA,CCA,GTG,CAG,CCA,GAT,CCA-3’。
XaDhlBS：F(SEQ ID NO.21):5’-AAG,CTA,CAA,GTC,AGA,CAA,CGA-3’；R(SEQ IDNO.22):5’-CAC,GCT,TCA,GTG,GTG,CCA,GTT-3’。
CrGYD1S：F(SEQ ID NO.23):5’-GGA,CGT,TAG,TTC,CAA,CTG,GAA-3’；R(SEQ IDNO.24):5’-GGA,GAC,GTT,CAG,CGA,TAG,GCA-3’。
GmMSS：F(SEQ ID NO.25):5’-TTC,TTC,TAA,CTC,AGT,ATG,ATA-3’；
R(SEQ ID NO.26):5’-CAG,TGA,TCT,CAA,CCT,TAC,GAT-3’。
大肠杆菌转化子的DNA抽提参照《分子克隆实验指南》。然后以DNA作为模板，进行PCR扩增。反应体系：1μL质粒，4μL2.5mmol/LdNTPs，5μLBuffer，Ex-Taq(Toyobo日本)0.5U，引物各1μL，加ddH2O至50μL；反应程序为：95℃变性45s；56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(1000bp/min)，扩增25-35个循环；72℃终延伸10min。凝胶电泳结果(图2)证实所转入的外源基因完整整合进了大肠杆菌基因组中。
实施例4
降解实验
为了进一步验证1,2-二氯乙烷的完全降解，从上述转化的平板上挑取转化子带蓝色单菌落接种到80毫升增菌培养基中(含1％甘油、50μg/ml卡那霉素)，37℃摇菌24小时(150rpm)，离心去上清，菌体用灭菌的蒸馏水洗一遍，之后用10毫升发酵培养基重悬(含2mM1,2-二氯乙烷、1％甘油、0.2％阿拉伯糖、1mM IPTG、50μg/ml卡那霉素)，37℃摇菌处理，不同时间取菌液，通过气相色谱检测培养基中1,2-二氯乙烷含量，色谱检测按照HJ810-2016《水质挥发性有机物的测定顶空/气相色谱-质谱法》进行检测，最终测得该工程菌株能在12h内完全降解2mM的1,2-二氯乙烷(见图3)。同时检测到中间代谢产物乙醇酸(见图4)，说明1,2-二氯乙烷按照本发明构建的代谢途径进行降解，培养基中乙醇酸含量通过高效液相色谱检测，色谱检测参考Zhou,Y.等人的方法(Zhou,Y.,etal.DeterminationofGlycolicAcidinMethylGlycollateHydrolysateby HPLC[J].2020)。最后采用同位素示踪法来验证1,2-二氯乙烷能被完全代谢，增菌培养基不变，发酵培养基中用2mM13C标记的乙醇酸代替2mM1,2-二氯乙烷。按照本发明构建的代谢通路，1,2-二氯乙烷降解的最后一个物质是苹果酸，苹果酸可以在TCA循环中被大肠杆菌利用。通过检测TCA循环中的有机酸，检测到了13C丰度草酰乙酸(见图5)，证明了乙醇酸能被大肠杆菌代谢，从而表明了该通路的完整性，同时也证明了1,2-二氯乙烷能被完全降解。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种完全降解1,2-二氯乙烷的融合基因，其特征在于，形成所述融合基因的原始基因为XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因；
所述原始基因在进行融合前，还包括进行密码子优化，经优化后的XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经优化后的XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，经优化后的XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，经优化后的XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经优化后的CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，经优化后的GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2.一种包含权利要求1所述融合基因的多基因表达盒。
3.根据权利要求2所述多基因表达盒，其特征在于，将每个经密码子优化后的原始基因分别与T7启动子和终止子融合，构建得到6个表达盒，并进行连接。
4.根据权利要求3所述多基因表达盒，其特征在于，所述连接的顺序从5’端至3’端，包括：经密码子优化后的XaDhlA表达盒、经密码子优化后的XaADH表达盒、经密码子优化后的XaALDH表达盒、经密码子优化后的XaDhlB表达盒、经密码子优化后的CrGYD1表达盒和经密码子优化后的GmMS表达盒。
5.一种包含权利要求2～4任一项所述多基因表达盒的重组载体。
6.一种表达权利要求1所述融合基因或包含权利要求5所述重组载体的重组工程菌。
7.一种完全降解1,2-二氯乙烷的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌表达权利要求1所述融合基因或包含权利要求5所述重组载体。
8.权利要求6所述重组工程菌或权利要求7所述重组大肠杆菌工程菌在完全降解1,2-二氯乙烷中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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