CN110358768A - 一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用 - Google Patents

一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR‑Cas系统的基因组编辑方法及其应用。本发明的目的在于以Z.mobilis 4为模式菌株，利用其自身基因组编码的I‑F型CRISPR‑Cas系统搭建一套基因组编辑平台。为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。其技术方案要点包括：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；针对目标位点选取guideRNA序列；将guideRNA引物序列构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上；将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。

Description

一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑 方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用。
背景技术
近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis，Z.mobilis)具有理想微生物细胞工厂的相关特性：(1)能天然产酒精，对酒精耐受性高，可以利用玉米秸秆水解物生产10.7％(v/v)的高浓度纤维素酒精；(2)是目前已知的唯一可以在厌氧条件下通过Entner-Doudoroff(ED)途径代谢葡萄糖或果糖生产乙醇的微生物，其每代谢一分子的葡萄糖或者果糖只产生一分子的ATP，产能低，因而大部分碳源(>95％)被转化为产物乙醇，只有约2-2.6％的碳源用于细胞生长，目标产物产率非常高；(3)基因组大小仅为约2Mbp，在开展基因组精简工作，构建最适基因组细胞工厂方面具有很大优势。此外，运动发酵单胞菌可在广泛的温度(24-45℃)及pH范围(3.5-7.5)生长，是公认的GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株。因此，运动发酵单胞菌可作为生物质再生能源的模式生产菌株，已引起了研究者们的广泛关注；分析其生理和遗传等特性、理性设计与构建工程菌株、解析其代谢网络和调控机制等，也成为了研究的热点。
开展细胞生理和遗传特性分析、工程菌株理性设计与构建、代谢网络和调控机制解析等工作，需要在细胞内对基因组DNA序列进行可控改变。对于具有优良的微生物细胞工厂特性的运动发酵单胞菌，亟需一个高效且精确的基因组编辑系统来实现对其的充分研究和利用。
常规的遗传学方法直接利用宿主体内DNA重组修复系统，也能对基因进行突变，但通常只能单个单个地完成，耗时较长，效率太低，显然无法满足诸如构建复杂的代谢通路等研究的要求。而且，对于每一个目标基因的突变，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等等一些问题。此外，为了提高细胞体内DNA重组效率，可利用序列特异性核酸酶对目的基因进行定点剪切，促进基因组与供体DNA的重组，定点引入突变，实现基因组的精准编辑。例如，锌指核酸酶(Zinc fingernucleases，ZFNs)和转录激活样效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornucleases，TALENs)被成功用于对基因组进行定点剪切。但是，对每一个靶标位点的剪切，均需要对上述蛋白进行一次改造，实验步骤较为繁琐。
自2013年以来，基于CRISPR-Cas9与CRISPR-Cpf1系统的基因组编辑技术被广泛应用于包括人体细胞在内的各类生物(细胞)中，相比于ZFN和TALEN技术，CRISPR技术具有一个明显的优势：对不同目的DNA的靶定不需要进行蛋白改造，只需要简单改变单个介导RNA(gRNA)序列，易于操作。然而，截止目前为止，尚无相关应用在运动发酵单胞菌中实现，主要原因可能是：1)Cas9和Cpf1均为具有多个结构域的大核酸蛋白(大于1000氨基酸)，其在原核细胞中的有效转移存在较大的局限性；2)外源表达的Cas9或Cpf1等核酸酶可能无活性，或者有活性但对宿主产生了较大的细胞毒性。随着研究的深入，越来越多的结果显示，异源表达这些核酸酶会对宿主产生不同程度的细胞毒性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用。本发明的目的在于以Z.mobilis 4为模式菌株，利用其自身基因组编码的I-F型CRISPR-Cas系统搭建一套基因组编辑平台。为在该菌株及类似细胞中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。
本发明是这样实现的，一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，包括以下步骤：
步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；
步骤2：针对目标编辑靶位点选取guideRNA序列，并设计引物；
步骤3：将guideRNA引物序列构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；
步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；
步骤5：将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。
进一步，所述含人工CRISPR表达单元的质粒为在Z.mobilis-E.coli穿梭载体pEZ15Asp上构建人工CRISPR表达单元。
进一步，所述人工CRISPR表达单元包括启动子leader序列，CRISPR簇及终止子。
进一步，所述人工CRISPR簇包括两个repeat，且两个repeat中间插入了两个BsaⅠ的酶切位点。
进一步，步骤5中所述感受态细胞为运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞。
一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在基因敲除中的应用。
一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点插入DNA序列中的应用。
一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点突变DNA序列中的应用。
进一步，所述guideRNA序列位于编码链上。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明以运动发酵单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4为材料，开发其內源CRISPR-Cas系统作为基因编辑工具，进行一系列高效的遗传学操作。该技术有以下有益效果：(1)可有效避免外源Cas核酸蛋白对宿主产生的细胞毒性；(2)宿主自身CRISPR-Cas系统具有完整的功能，能加工成熟的crRNA用于介导Cas效应复合体对目标DNA序列的剪切，因此，将不同的介导序列克隆到同一个CRISPR簇中，即能实现对多个靶位点的同时编辑。而相对于传统遗传学操作方法，CRISPR-Cas系统能对预编辑的目标序列进行持续剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避免了传统操作方法中常遇到的可用选择标记有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患等等。
附图说明
图1是运动发酵单胞菌编码的CRISPR-Cas系统；
图2是C2S7和C3S4序列；
图3是CRISPR-Cas系统体内剪切活性检测结果；
图4是人工CRISPR表达单元；
图5是基因敲除中guideRNA构建到载体原理示意图；
图6是基因敲除中PCR克隆结果；
图7是基因敲除中PCR产物测序结果；
图8是定点插入DNA序列原理示意图；
图9是定点插入DNA序列PCR克隆结果；
图10是定点插入DNA序列PCR产物测序结果；
图11是定点突变DNA序列原理示意图；
图12是定点突变DNA序列PCR克隆结果；
图13是定点突变DNA序列PCR产物测序结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实现了一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas基因组编辑系统的构建
(1)运动发酵单胞菌基因组编码的CRISPR-Cas系统组学分析
本发明开展的前提是研究菌株需自身编码CRISPR-Cas系统，且具有DNA剪切活性，这就要求宿主基因组编码CRISPR簇和完整的Cas蛋白体系。
以运动发酵单胞菌Z.mobilis 4为模式菌株，对Z.mobilis 4测序数据进行了分析，结果显示，该菌株基因组编码4个CRISPR结构序列，根据其在基因组的排列顺序，我们将其依次命名为CRISPR1-CRISPR4，见图1。CRISPR1占据基因组113,783-114,170区域，包含7个repeat序列；CRISPR2占据1,244,355-1,245,866区域，包含9个repeat序列；CRISPR3占据1,598,754-1,599,144区域，包含7个repeat序列。CRISPR4由2个repeat和1个spacer组成，占据1,595,315-1,599,403区域。CRISPR2-4位于同一条链，而CRISPR1位于互补链上。这些CRISPR结构中repeat均为保守的28bp序列，spacer长度为32或33bp，其中32bp占70％。该基因组还编码一个cas基因簇，包括cas1，cas3，csy1，csy2，csy3和csy4基因，其中cas1，cas3形成一个操纵子，而所有csy基因以一个操纵子形式排列。上述结果中cas3基因是一个cas2和cas3基因的融合形式，是I-F型CRISPR-Cas系统的一个标志性特征。
(2)运动发酵单胞菌内源I-F型CRISPR-Cas系统体内剪切活性检测
为了检测Z.mobilis 4菌株I-F型CRISPR-Cas系统是否可在crRNA的介导下体内剪切DNA，根据转录组分析结果，我们分别选取了CRISPR2中spacer7(C2S7)和CRISPR3中spacer4(C3S4)，在其序列5’端加上5’-CCC-3’PAM，见图2。具体操作为：将Z.mobilis-E.col穿梭载体pEZ15Asp用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系见表1。与C2S7和C3S4的引物退火(表2)后用T4DNA连接酶连接(表3)。通过转化到E.coli DH5α中进行质粒扩增，然后对转化子进行菌落PCR验证(表4)，构建好的质粒均通过测序验证。同时，将5’加上5’-AAA-3’序列的spacer插入到载体，得到对应的参照质粒。穿梭载体pEZ15Asp上含有壮观霉素抗性编码基因。
表1：载体双酶切体系
载体双酶切程序：37℃保温3-4h。
C2S7和C3S4引物序列：
C2S7(CCC)-F：AATTCCCGATCGCGGGCAACGGTTTATTCAGCTATCCGCGC，见SEQ ID NO:1；
C2S7(CCC)-R：CTAGGCGCGGATAGCTGAATAAACCGTTGCCCGCGATCGGG，见SEQ ID NO:2；
C2S7(AAA)-F：AATTAAAGATCGCGGGCAACGGTTTATTCAGCTATCCGCG，见SEQ ID NO:3；
C2S7(AAA)-R：CTAGGCGCGGATAGCTGAATAAACCGTTGCCCGCGATCTT，见SEQ ID NO:4；
C3S4(CCC)-F：AATTCCCGTCTGGCTGAAATGAGGTCCGACGATTTGCAT，见SEQ ID NO:5；
C3S4(CCC)-R：GTTAATGCAAATCGTCGGACCTCATTTCAGCCAGACGGG，见SEQ ID NO:6；
C3S4(AAA)-F：AATTAAAGTCTGGCTGAAATGAGGTCCGACGATTTGCAT，见SEQ ID NO:7；
C3S4(AAA)-R：GTTAATGCAAATCGTCGGACCTCATTTCAGCCAGACTTT，见SEQ ID NO:8；
表2：引物退火体系
引物退火程序：95℃保温5min，然后常温退火。
表3：T4 DNA连接酶连接体系
T4DNA连接酶连接程序：22℃保温2h。
大肠杆菌DH5α的转化方法：取50μL感受态细胞于冰上，加入5μL的酶连产物，冰上静置10min，42℃热激35s，加入450μL液体LB，37℃复苏1h。取100μL涂布于100μg/mL壮观霉素抗性平板，37℃培养16h。
表4：菌落PCR体系和程序
PCR程序为：步骤1，98℃，3min；步骤2，98℃，10s；步骤3，55℃，15s；步骤4，72℃，30s；步骤2-步骤4循环25次；步骤5，72℃，2min。
用提取的质粒对ZM4进行电转化。取ZM4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RMG液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去上清。加入200μL新鲜的RMG培养基，取100μL涂布于100μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃孵育2天。
预测，将质粒分别转化到宿主后，如果I-F型CRISPR-Cas系统有活性，插入的protospacer将被剪切，在含有100μg/mL壮观霉素的RMG培养基平板上进行筛选，则会造成平板上形成少数几个菌落；而转化参照质粒的平板上则会形成大量菌落。
实验结果如图3，转化干涉质粒的效率相比于转化参照质粒要低103倍，由此说明，基因组上CRISPR中表达的crRNA介导I-F型系统的DNA活性对干涉质粒中protospacer进行了剪切，从而确定该系统可被用于DNA序列的定点靶向和切割。
(3)基因组编辑质粒的组成
在质粒pEZ15Asp上构建了一个人工CRISPR表达单元，见图4，由启动子leader序列，CRISPR簇及终止子组成。该人工CRISPR表达单元由三方基因合成公司人工合成。人工CRISPR簇包括两个repeat中间插入了两个BsaⅠ的酶切位点，这两个BsaⅠ的酶切位点的功能是为了方便目标基因上选取的guideRNA序列的插入。其次是供体DNA的提供，根据不同的基因组编辑形式，供体DNA的设计也不同，但都是通过融合PCR技术对供体DNA进行扩增和连接。本实施例中启动子Leader序列、RgR模块序列以及T7终止子序列分别见SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:36。
在基因敲除的应用中，将目标基因上、下游各300bp左右的序列进行扩增和连接。在基因定点突变的应用中，则是将突变位点引入到引物上，在供体DNA中引入突变。纯化后的供体DNA克隆到对应的编辑质粒上进行转化。
实施例2基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在基因敲除中的应用
本实施例中选定目标基因为运动发酵单胞菌基因组编码的ZMO0038基因，具体步骤如下：
(1)guideRNA序列选取：从目标基因序列ZMO0038中截取任意5’-CCC-3’下游紧邻的32bp序列作为guideRNA，该序列可位于基因组任一条链上。
ZMO0038-guideRNA引物序列：
0038-gRNA1-F：GAAAATGCCGCTTTCGATCAGGCCGCCGCCAAGATT，见SEQ ID NO:9；
0038-gRNA1-R：GAACAATCTTGGCGGCGGCCTGATCGAAAGCGGCAT，见SEQ ID NO:10；
(2)guideRNA引物序列构建到载体上，见图5：将上述含有人工CRISPR表达单元的质粒用BsaⅠ线性化(表5)，与guideRNA引物退火(同上，表2)后用T4DNA连接酶连接(同上，表3)，通过转化到E.coli DH5α中进行质粒扩增(方法同上)，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，构建好的质粒均通过测序验证。
表5：载体单酶切体系
载体单酶切程序：37℃保温3-4h。
菌落PCR验证引物序列：
pEZ15A-F:GGCAAAGCCACCCTATTTTTAG，见SEQ ID NO:11；
0038-gRNA1-R:GAACAATCTTGGCGGCGGCCTGATCGAAAGCGGCAT，见SEQ ID NO:10；
(3)供体DNA序列构建到载体上(编辑质粒的构建)
供体DNA序列选取目标基因上、下游各300bp左右的序列，通过融合PCR技术(表6)对其进行扩增和连接。将上一步构建好的载体用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切(同上，表1)，再与供体DNA序列通过Gibson装配的方法转化E.coli DH5α，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，构建好的编辑质粒均通过测序验证。
表6：融合PCR反应体系
PCR程序为：步骤1，98℃，3min；步骤2，98℃，10s；步骤3，55℃，15s；步骤4，72℃，30s；步骤2-步骤4循环25次；步骤5，72℃，2min。
供体DNA引物序列：
0038-up-F：AGGTCACCAGCTCACCGTCTGAATTCCCGACCATTTGTATGACCCG，见SEQ ID NO:12；
0038-up-R：TCTATCTGAATATTTAACGACTTGACTCCCTCCATGCACT，见SEQ ID NO:13；
0038-down-F：AGTGCATGGAGGGAGTCAAGTCGTTAAATATTCAGATAGA，见SEQ ID NO:14；
0038-down-R：CTCGAGAGATCTGATATCACTCTAGAATCGGTTCTTTCAGGCGGAC，见SEQ IDNO:15。
(4)编辑质粒电转化ZM4感受态细胞
编辑质粒电转化ZM4方法同上，再用引物0038-check-F,0038-check-R进行菌落PCR筛选(同上，表4)阳性克隆。
0038-check-F：GAATTATTGCGTCACGGCGC，见SEQ ID NO:16；
0038-check-R：GCGCATCACGAGAGCCAGCC，见SEQ ID NO:17。
(5)菌落PCR筛选阳性克隆结果见图6，ZMO0038基因敲除的效率达到了100％，充分的说明了该发明是一种高效的基因编辑方法。利用上述PCR产物进行测序分析，结果如图7，通过测序结果与野生型菌株基因组序列进行比对，发现编辑方式完全按照实验设计的方案，进一步说明了该发明是一种精确的基因编辑方法。
实施例3基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点插入DNA序列中的应用
本实施例中在目标基因ZMO0038起始密码ATG后面定点插入一个His-Tag标签，见图8，使其编码的蛋白可以通过镍柱纯化出来。此方法可以延伸到任意一个拟纯化的蛋白。具体步骤如下：
(1)ZMO0038(His-Tag)-guideRNA序列选取：从目标基因序列ZMO0038起始密码ATG附近截取5’-TCC-3’下游紧邻的32bp序列作为guideRNA，该序列可位于基因组任一条链上。
ZMO0038(His-Tag)-guideRNA引物序列：
0038His-gRNA-F：GAAAATCTTGACTCCCTCCATGCACTTAAAAAATCT，见SEQ ID NO:18；
0038His-gRNA-R：GAACAGATTTTTTAAGTGCATGGAGGGAGTCAAGAT，见SEQ ID NO:19。
(2)guideRNA构建到载体上：将含有人工CRISPR表达单元的质粒用BsaⅠ线性化(同上，表5)，与guideRNA引物退火后用T4DNA连接酶连接(同上，表3)，通过转化(方法同上)到E.coli DH5α中进行质粒扩增，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，验证引物为：pEZ15A-F和0038His-gRNA-R，序列分别见SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:20，构建好的质粒均通过测序验证。
(3)供体DNA序列构建到载体上(编辑质粒的构建)
定点插入His-Tag标签的供体DNA序列是利用引物设计带入了His-Tag的DNA序列，供体DNA的上游臂和下游臂选取了定点插入His-Tag标签的位置上下游各300bp左右的序列，通过融合PCR技术(同上，表6)对其进行扩增和连接。将上一步构建好的载体用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切(同上，表1)，再与供体DNA序列通过Gibson装配的方法转化E.coli DH5α，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，构建好的编辑质粒均通过测序验证。
His-Tag标签序列：CATCATCATCATCATCAC，见SEQ ID NO:20；
供体DNA引物序列：
0038His-up-F：AGGTCACCAGCTCACCGTCTGAATTCCCGACCATTTGTATGACCCG，见SEQ IDNO:21；
0038His-up-R：GTGATGATGATGATGATGCATCTTGACTCCCTCCATGCACT，见SEQ ID NO:22；
0038His-down-F：ATGCATCATCATCATCATCACGATATCCGTATTTCCGGCCA，见SEQ ID NO:23；
0038His-down-R：cTCgagAGATCTGatATcactctagaCGGCAATGACGGGAGGATGA，见SEQID NO:24。
(4)编辑质粒电转化ZM4感受态细胞
取50μL感受态细胞于冰上，加入1μg的编辑质粒，待感受态细胞融化后转入0.1cm的电转杯中。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去上清。加入200μL新鲜的RM培养基，取100μL涂布于200μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。再用引物His-F,0038His-check-R进行菌落PCR(同上，表4)筛选阳性克隆。
His-F：ATGCATCATCATCATCATCAC，见SEQ ID NO:25；
0038His-check-R：AAACAGCATCGGAAACGCTG，见SEQ ID NO:26。
(5)结果与分析
菌落PCR筛选阳性克隆结果见图9，结果显示定点插入的效率达到了100％，又从另外一个方面证实了该发明是一种高效的基因编辑方法。利用上述PCR产物进行测序分析，结果如图10，通过测序结果与野生型菌株基因组序列进行比对，发现His-Tag标签的插入方式完全按照实验设计的方案，进一步说明了该发明的准确性。
实施例4基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点突变DNA碱基序列中的应用
本实施例以上述插入一个His-Tag标签的ZMO0038基因为目标，在其基因的编码区定点突变几个碱基序列，从而引入终止密码5’-AAA-3’，使其编码的蛋白提前终止，如图11。此方法也可以延伸应用到蛋白的活性位点的研究中。具体步骤如下：
(1)ZMO0038(PM)-guideRNA序列选取：从目标基因序列His-ZMO0038编码区5’-CCC-3’下游紧邻的32bp序列作为guideRNA，该序列只能位于编码链上。
ZMO0038(PM)-guideRNA引物序列：
0038PM-gRNA-F:GAAAATGCCGCTTTCGATCAGGCCGCCGCCAAGATT，见SEQ ID NO:27；
0038PM-gRNA-R:GAACAATCTTGGCGGCGGCCTGATCGAAAGCGGCAT，见SEQ ID NO:28。
(2)guideRNA构建到载体上：将含有人工CRISPR表达单元的质粒用BsaⅠ线性化(同上，表5)，与guideRNA引物退火后用T4DNA连接酶连接(同上，表3)，通过转化到E.coli DH5α中进行质粒扩增(方法同上)，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，验证引物为：pEZ15A-F和0038PM-gRNA-R，构建好的质粒均通过测序验证。
(3)供体DNA序列构建到载体上(编辑质粒的构建)
定点突变的供体DNA序列是利用引物设计带入了突变的碱基序列，供体DNA的上游臂和下游臂选取了定点突变位置上下游各300bp左右的序列，通过融合PCR技术(同上，表6)对其进行扩增和连接。将上一步构建好的载体用XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切(同上，表1)，再与供体DNA序列通过Gibson装配的方法转化E.coli DH5α(方法同上)，然后对转化子进行菌落PCR验证(同上，表4)，构建好的编辑质粒均通过测序验证。
供体DNA引物序列：
0038(PM)-up-F：AGGTCACCAGCTCACCGTCTgaattcAACAAAATCTAGGTTTCTGA，见SEQ IDNO:29；
0038(PM)-up-R：GGCCTGATCGAAAGCGGCATTTTAGTCTTTGTCTATGCCGCCTG，见SEQ IDNO:30；
0038(PM)-down-F：CAGGCGGCATAGACAAAGACTAAAATGCCGCTTTCGATCAGGCC，见SEQ IDNO:31；
0038(PM)-down-R：cTCgagAGATCTGatATcactctagaGCGACCTCTCTCCCGTTTAT，见SEQID NO:32。
(4)编辑质粒电转化ZM4感受态细胞
取50μL感受态细胞于冰上，加入1μg的编辑质粒，待感受态细胞融化后转入0.1cm的电转杯中。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去上清。加入200μL新鲜的RM培养基，取100μL涂布于200μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。再用引物0038-check-F,0038(PM)-check-R进行菌落PCR(同上，表4)，产物全部送测序，确定突变效率。
0038-check-F：GAATTATTGCGTCACGGCGC，见SEQ ID NO:16；
0038(PM)-check-R：AAACAGCATCGGAAACGCTG，见SEQ ID NO:33。
(5)结果与分析
PCR电泳结果见图12，菌落PCR产物测序结果分析见图13，送测序的16个样品结果全部都为突变株，定点突变的效率达到了100％，证实了该发明是一种高效切精确的基因编辑方法。
综合以上三个方面对运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas基因组编辑系统的应用，不难看出本发明的高效性和稳定性。为开展运动发酵单胞菌及类似微生物的细胞生理和遗传特性分析、工程菌株理性设计与构建、代谢网络和调控机制解析等工作提供了一个高效且精确的基因组编辑平台。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法及其应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7CCC-F)
<400> 1
aattcccgat cgcgggcaac ggtttattca gctatccgcg c 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7CCC-R)
<400> 2
ctaggcgcgg atagctgaat aaaccgttgc ccgcgatcgg g 41
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7AAA-F)
<400> 3
aattaaagat cgcgggcaac ggtttattca gctatccgcg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(C2S7AAA-R)
<400> 4
ctaggcgcgg atagctgaat aaaccgttgc ccgcgatctt 40
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4CCC-F)
<400> 5
aattcccgtc tggctgaaat gaggtccgac gatttgcat 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4CCC-R)
<400> 6
gttaatgcaa atcgtcggac ctcatttcag ccagacggg 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4AAA-F)
<400> 7
aattaaagtc tggctgaaat gaggtccgac gatttgcat 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(C3S4AAA-R)
<400> 8
gttaatgcaa atcgtcggac ctcatttcag ccagacttt 39
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-gRNA1-F)
<400> 9
gaaaatgccg ctttcgatca ggccgccgcc aagatt 36
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-gRNA1-R)
<400> 10
gaacaatctt ggcggcggcc tgatcgaaag cggcat 36
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(pEZ15A-F)
<400> 11
ggcaaagcca ccctattttt ag 22
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-up-F)
<400> 12
aggtcaccag ctcaccgtct gaattcccga ccatttgtat gacccg 46
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-up-R)
<400> 13
tctatctgaa tatttaacga cttgactccc tccatgcact 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-down-F)
<400> 14
agtgcatgga gggagtcaag tcgttaaata ttcagataga 40
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-down-R)
<400> 15
ctcgagagat ctgatatcac tctagaatcg gttctttcag gcggac 46
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-check-F)
<400> 16
gaattattgc gtcacggcgc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0038-check-R)
<400> 17
gcgcatcacg agagccagcc 20
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-gRNA-F)
<400> 18
gaaaatcttg actccctcca tgcacttaaa aaatct 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-gRNA-R)
<400> 19
gaacagattt tttaagtgca tggagggagt caagat 36
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> His-Tag(His-Tag)
<400> 20
catcatcatc atcatcac 18
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-up-F)
<400> 21
aggtcaccag ctcaccgtct gaattcccga ccatttgtat gacccg 46
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-up-R)
<400> 22
gtgatgatga tgatgatgca tcttgactcc ctccatgcac t 41
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-down-F)
<400> 23
atgcatcatc atcatcatca cgatatccgt atttccggcc a 41
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-down-R)
<400> 24
ctcgagagat ctgatatcac tctagacggc aatgacggga ggatga 46
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(His-F)
<400> 25
atgcatcatc atcatcatca c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0038His-check-R)
<400> 26
aaacagcatc ggaaacgctg 20
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-gRNA-F)
<400> 27
gaaaatgccg ctttcgatca ggccgccgcc aagatt 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-gRNA-R)
<400> 28
gaacaatctt ggcggcggcc tgatcgaaag cggcat 36
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-up-F)
<400> 29
aggtcaccag ctcaccgtct gaattcaaca aaatctaggt ttctga 46
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-up-R)
<400> 30
ggcctgatcg aaagcggcat tttagtcttt gtctatgccg cctg 44
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-down-F)
<400> 31
caggcggcat agacaaagac taaaatgccg ctttcgatca ggcc 44
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-down-R)
<400> 32
ctcgagagat ctgatatcac tctagagcga cctctctccc gtttat 46
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0038PM-check-R)
<400> 33
aaacagcatc ggaaacgctg 20
<210> 34
<211> 148
<212> DNA
<213> 启动子leader(启动子leader)
<400> 34
tttgaccctt tatttgaccc tctttttttg gcatgtaaaa aaatccttta aaatcaatag 60
gttaaaaata ggctctattt ttagggttat ttggctattt ttgcccgata ttcctttcat 120
ttagggggat ttttaattat ttactcta 148
<210> 35
<211> 72
<212> DNA
<213> RgR(RgR)
<400> 35
gttcactgcc gcacaggcag cttagaaagg agaccgaggt ctcagttcac tgccgcacag 60
gcagcttaga aa 72
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> T7终止子(T7终止子)
<400> 36
ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcg 28

Claims (9)

1.一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；
步骤2：针对目标编辑靶位点选取guideRNA序列，并设计引物；
步骤3：将guideRNA引物序列构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；
步骤4：将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；
步骤5：将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。
2.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，其特征在于：所述含人工CRISPR表达单元的质粒为在Z.mobilis-E.coli穿梭载体pEZ15Asp上构建人工CRISPR表达单元。
3.根据权利要求2所述的一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR表达单元包括启动子leader序列，CRISPR簇及终止子。
4.根据权利要求3所述的一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，其特征在于：所述人工CRISPR簇包括两个repeat，且两个repeat中间插入了两个BsaⅠ的酶切位点。
5.根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法，其特征在于：步骤5中所述感受态细胞为运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞。
6.一种如权利要求1-5任一所述的基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在基因敲除中的应用。
7.一种如权利要求1-5任一所述的基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点插入DNA序列中的应用。
8.一种如权利要求1-5任一所述的基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点突变DNA序列中的应用。
9.根据权利要求8所述的基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法在定点突变DNA序列中的应用，其特征在于：所述guideRNA序列位于编码链上。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110408642A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 湖北大学 基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用
CN111454981A (zh) * 2020-03-27 2020-07-28 华中农业大学 一种dna双链断裂修复工具及其应用
CN113528408A (zh) * 2021-06-08 2021-10-22 湖北大学 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用
CN114231552A (zh) * 2020-09-09 2022-03-25 中国科学院微生物研究所 一种新的I型CRISPR/Cas系统及其应用
CN115806922A (zh) * 2022-09-19 2023-03-17 湖北大学 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用
CN115896149A (zh) * 2022-08-25 2023-04-04 湖北大学 运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用
CN115976058A (zh) * 2022-12-08 2023-04-18 湖北大学 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781634A (zh) * 2009-12-04 2010-07-21 天津大学 能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法
CN101974547A (zh) * 2010-07-30 2011-02-16 天津大学 含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781634A (zh) * 2009-12-04 2010-07-21 天津大学 能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法
CN101974547A (zh) * 2010-07-30 2011-02-16 天津大学 含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GE DONG等: "Functional Characterization of CRISPR-Cas System in the Ethanologenic Bacterium Zymomonas mobilis ZM4", 《ADVANCES IN MICROBIOLOGY》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110408642A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 湖北大学 基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用
CN111454981A (zh) * 2020-03-27 2020-07-28 华中农业大学 一种dna双链断裂修复工具及其应用
CN114231552A (zh) * 2020-09-09 2022-03-25 中国科学院微生物研究所 一种新的I型CRISPR/Cas系统及其应用
CN113528408A (zh) * 2021-06-08 2021-10-22 湖北大学 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用
CN113528408B (zh) * 2021-06-08 2022-03-01 湖北大学 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用
CN115896149A (zh) * 2022-08-25 2023-04-04 湖北大学 运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用
CN115806922A (zh) * 2022-09-19 2023-03-17 湖北大学 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用
CN115806922B (zh) * 2022-09-19 2023-08-11 湖北大学 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用
CN115976058A (zh) * 2022-12-08 2023-04-18 湖北大学 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用
CN115976058B (zh) * 2022-12-08 2023-09-19 湖北大学 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用

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Patentee after: Wuhan Ruijiakang Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 430062 368 Friendship Avenue, Wuchang District, Wuhan, Hubei.

Patentee before: Hubei University

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