CN115896149A - 运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用 Download PDF

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CN115896149A CN202211027834.2A CN202211027834A CN115896149A CN 115896149 A CN115896149 A CN 115896149A CN 202211027834 A CN202211027834 A CN 202211027834A CN 115896149 A CN115896149 A CN 115896149A
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杨世辉
耿碧男
伍欣艳
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Abstract

本申请公开了运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用。该类基因编辑质粒设置有标记基因区、重复区、先导区和至少两个间隔区，重复区、间隔区和先导区组成CRISPR簇。该基因编辑质粒还进一步设置供体区，提供用于插入、替换或删除目的基因的序列。如此根据标记基因区、供体区和CRISPR簇的不同，将该基因编辑质粒进行多种配置和组合成基因编辑试剂盒，间隔区可以靶向不同的目的基因和标记物基因，可以实现对运动发酵单胞菌的多个基因连续无痕编辑，编辑效率高，为运动发酵单胞菌基因组精简及菌株工厂构建提供了强有力的基因编辑或敲入工具。

Description

运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用
技术领域
本申请涉及运动发酵单胞菌的基因组遗传操作技术领域，尤其涉及运动发酵单胞菌基因编辑质粒、试剂盒、方法及应用。
背景技术
运动发酵单胞菌基因组遗传操作通常采用自杀型质粒或不稳定复制载体进行同源重组，这一方法通常需要使用同源重组的方法在Z.mobilis的基因组上进行基因编辑和插入后，使用自杀质粒(如SacB反筛系统)消除筛选标记，从而在特定位点实现靶基因“无痕”敲除或插入。运动发酵单胞菌多株基因失活菌株，如ndh失活菌株、SacC失活菌株和限制修饰系统失活菌株，就是基于同源重组方法获得，用FLP重组酶或SacB筛选的方法消除引入的抗性标记。另外，在运动发酵单胞菌ZM4菌株中利用同源重组原理实现了2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径(ED途径)两个关键酶基因的敲除：丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB)，获得了生产丁二酸的重组工程菌株。这些方法为在运动发酵单胞菌中进行遗传操作奠定了基础。
但同源重组效率往往偏低，并且只能对目标基因单个逐一进行，存在耗时长、效率低等问题。此外，每一次遗传操作均需要引入特定的筛选标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等问题。
发明内容
本申请发明人创造性地发现了一类基因编辑质粒和基因编辑试剂盒及利用该基因编辑质粒或试剂盒进行基因编辑的方法及应用。该类基因编辑质粒具有：两个复制起始区；标记基因区；至少两个间隔区，其中一个间隔区靶向消除作用于其基因编辑质粒的标记基因区，其他间隔区靶向目的基因；用于分隔间隔区的重复区，以及先导区，并将先导区、间隔区和重复区组成一个CRISPR簇，并进一步在基因编辑质粒中设置供体区，以提供用于插入、替换或删除目的基因的序列。如此根据标记基因区、供体区和CRISPR簇的不同，将这些基因编辑质粒进行多个设置和组合成基因编辑试剂盒，每一质粒中的间隔区可以靶向不同的目的基因，依次对转入运动发酵单胞菌中，可以实现对运动发酵单胞菌的多个基因连续敲除或敲入，敲除或敲入效率高，为运动发酵单胞菌基因组精简及菌株工厂构建提供了强有力的基因编辑或敲入工具。以此构建基因编辑或敲入试剂盒在得到特殊表型的菌株过程中，通过其中质粒的间隔区对其他质粒的标记物基因的靶向消除作用，将基因编辑质粒进行组合还能相互消除或者循环消除，能够进行“无痕”编辑，实现该质粒在宿主体内自行相互消除或循环消除，从而得到的重组宿主无需传代实现质粒消除，极大地缩短了多基因编辑时基因编辑质粒消除的时间，也可降低基因组自发突变的可能性。
为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种基因编辑质粒，包含：
具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；
具有如SEQ ID NO.2～5任一所示核苷酸序列的第二复制起始区；
标记基因区，用于对所述基因编辑质粒进行标记和筛选；
CRISPR簇，所述CRISPR簇包括至少两个间隔区、用于分隔所述间隔区的重复区以及用于启动所述CRISPR簇的先导区，所述重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或7所示，所述先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或9所示，其中一个间隔区用于形成与CRISPR核酸酶结合以对另一所述基因编辑质粒进行靶向消除的第一向导RNA，另一间隔区用于形成与CRISPR核酸酶结合以靶向编辑目的基因的第二向导RNA；
供体区，提供用于插入、替换或删除所述目的基因的序列。
第二方面，本申请实施例公开了一种基因编辑试剂盒，包含两种第一方面的基因编辑质粒，其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有位于另一所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。
第三方面，本申请实施例公开了一种基因编辑试剂盒，包括至少三种第一方面所述的基因编辑质粒，其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有至少一个位于另一种所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。
第四方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因编辑方法，利用第一方面所述的基因编辑质粒或第二方面所述的基因编辑试剂盒进行。
第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的基因编辑质粒、或第二方面的基因编辑试剂盒在运动发酵单胞菌或大肠杆菌基因编辑中的应用。
附图说明
图1为本申请一实施例提供的基因编辑质粒结构示意图，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，CRISPR簇中的箭头代表转录方向。
图2为本申请一实施例提供的基因编辑质粒结构示意图，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，CRISPR簇中的箭头代表转录方向。
图3为本申请一实施例提供的基因编辑质粒制备过程示意图，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图4为本申请一实施例提供的基因编辑质粒制备过程示意图，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图5为本申请一实施例提供的基因编辑质粒制备过程示意图，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图6为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合(两种质粒)结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图7为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合(两种质粒)结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图8为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合(三种质粒)结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图9为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合(三种质粒)结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，菱形代表重复区，弯折箭头区代表先导区，箭头方向代表转录方向。
图10为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，质粒名称中用带箭头的实线代表对应的区域，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，CRISPR簇中的箭头代表转录方向。
图11为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，质粒名称中用带箭头的实线代表对应的区域，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，CRISPR簇中的箭头代表转录方向。
图12为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒中的基因编辑质粒组合结构示意图，图中带箭头的虚线代表质粒消除，质粒名称中用带箭头的实线代表对应的区域，第一复制起始区和第二复制起始区的箭头代表复制方向，CRISPR簇中的箭头代表转录方向。
图13为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒对进行基因编辑的结果图：
(A)为第二基因编辑质粒敲除ZMO1650的结果。M泳道为DNA maker。1泳道表示验证第三基因编辑质粒是否电转成功，条带大小813bp。2泳道表示采用ZMO1650外侧引物验证ZMO1650是否成功敲除，显示2299bp条带表示成功敲除。3泳道表示采用ZMO1650内部引物验证ZMO1650否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3436bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1756bp条带表示未敲除。
(B)为第一基因编辑质粒敲除ZMO0038同时消除第二基因编辑质粒的结果。M泳道为DNAmaker。1泳道表示验证第一基因编辑质粒是否电转成功，显示763bp条带表示电转成功。2泳道表示采用ZMO0038外侧引物验证ZMO0038是否成功敲除，显示2330bp条带表示成功敲除。3泳道表示采用ZMO0038内部引物验证ZMO0038是否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示2933bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1277bp条带表示未敲除。7泳道表示第一基因编辑质粒消除第二基因编辑质粒的验证，无条带表示消除。8泳道表示采用ZMO1650外侧引物验证ZMO1650是否成功敲除，显示2299bp条带表示成功敲除。9泳道表示采用ZMO1650内部引物验证ZMO1650是否成功敲除，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示813bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示3436bp条带表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1756bp条带表示未敲除。图13(B)中，左下图为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
(C)为第三基因编辑质粒敲除ZMO0055同时消除第一基因编辑质粒的结果。M泳道为DNA maker。1泳道表示验证第三基因编辑质粒是否电转成功，显示763bp条带表示电转成功。2泳道表示采用ZMO0055外侧引物验证ZMO0055是否成功敲除，显示2482bp条带表示成功敲除。3泳道：ZMO0055内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3268bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1098bp条带表示未敲除。7泳道表示第三基因编辑质粒消除第一基因编辑质粒的验证结果，无条带表示成功消除。8泳道表示采用ZMO0038外侧引物验证ZMO0038是否成功敲除，显示2330bp条带表示成功敲除。9泳道表示采用ZMO0038内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示813bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示2933bp条带表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1277bp条带表示未敲除。图13(C)中，左下图为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
图14为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒对进行基因编辑的结果图：
(A)为第五基因编辑质粒敲除ZMO1650的结果。M泳道为DNA maker。1泳道为验证第五基因编辑质粒是否电转成功结果，显示813bp条带表示电转成功。2泳道表示采用ZMO1650外侧引物验证ZMO1650是否成功敲除，显示2299bp条带表示成功敲除。3泳道表示采用ZMO1650内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3436bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1756bp条带表示未敲除。
(B)为第四基因编辑质粒敲除ZMO0028同时基因编辑质粒第五基因编辑质粒的结果。M泳道为DNA maker。1泳道为验证第四基因编辑质粒是否电转成功，显示763bp条带表示电转成功。2泳道表示采用ZMO0028外侧引物验证ZMO0028是否成功敲除，显示2107bp条带表示成功敲除。3泳道表示采用ZMO0028内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3031bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1442bp条带表示未敲除。7泳道为第四基因编辑质粒消除第五基因编辑质粒的验证结果，无条带表示成功消除。8泳道表示采用ZMO1650外侧引物验证ZMO1650是否成功敲除，显示2299bp表示成功敲除。9泳道表示采用ZMO1650内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示813bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示3436bp条带表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1756bp条带表示未敲除。图14(B)中，左下图为显示为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
(C)为第六基因编辑质粒敲除ZMO1933同时消除第四基因编辑质粒的结果。M泳道为DNA maker。1泳道为验证第六基因编辑质粒是否电转成功结果，显示389bp条带表示电转成功。2泳道表示采用ZMO1933外侧引物验证ZMO1933是否成功敲除，显示1803bp条带表示成功敲除。3泳道表示采用ZMO1933内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3183bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1738bp条带表示未敲除。7泳道为第六基因编辑质粒消除第四基因编辑质粒的验证结果，无条带表示成功消除。8泳道为采用ZMO0028外侧引物验证ZMO0028是否成功敲除的结果，显示2107bp条带表示成功敲除。9泳道为采用ZMO0028内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示389bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示3031bp条带表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1442bp条带表示未敲除。图14(C)中，左下图为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
图15为本申请一实施例提供的基因编辑试剂盒对进行基因编辑的结果图；
(A)为第四基因编辑质粒敲除ZMO0028同时消除第二基因编辑质粒结果。M泳道为DNA maker。1泳道为验证第四基因编辑质粒是否电转成功结果，显示763bp条带表示电转成功。2泳道为采用ZMO0028外侧引物验证ZMO0028是否成功敲除结果，显示2107bp条带表示成功敲除。3泳道为采用ZMO0028内部引物验证是否成功敲除结果，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3031bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1442bp条带表示未敲除。7泳道为第四基因编辑质粒消除第二基因编辑质粒的验证结果，无条带表示成功消除。8泳道为采用ZMO1650外侧引物验证ZMO1650是否成功敲除的结构，显示2299bp条带表示成功敲除。9泳道为采用ZMO1650内部引物验证是否成功敲除的结果，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示813bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示3436bp条带表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1756bp条带表示未敲除。图15(A)中，左下图为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
(B)为第三基因编辑质粒敲除ZMO0055的同时消除第四基因编辑质粒。M泳道为DNAmaker。1泳道为第三基因编辑质粒是否电转成功的验证结果，显示763bp条带表示电转成功。2泳道为采用ZMO0055外侧引物验证ZMO0055是否成功敲除结果，显示2482bp条带表示成功敲除。3泳道为采用ZMO0055内部引物验证是否成功敲除结果，无条带表示成功敲除。4泳道为1泳道的对照。5泳道为2泳道的对照，显示3268bp条带表示未敲除。6泳道为3泳道的对照，显示1098bp条带表示未敲除。7泳道为第三基因编辑质粒消除第四基因编辑质粒的验证结果，无条带表示成功消除。8泳道为采用ZMO0028外侧引物验证ZMO0028是否成功敲除的结果，显示2107bp条带表示成功敲除。9泳道为采用ZMO0028内部引物验证是否成功敲除，无条带表示成功敲除。10泳道为7泳道的对照，显示813bp条带表示未消除。11泳道为8泳道的对照，显示3031bp泳道表示未敲除。12泳道为9泳道的对照，显示1442bp条带表示未敲除。图15(B)中，左下图为液体培养验证结果，右下图为RMG2平板验证结果。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
术语
本申请中，“基因编辑”是对目标基因及其转录产物进行编辑(定向改造)，实现特定DNA片段或特定DNA碱基的敲入、敲除和代替，以得到改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能的菌株、菌株系或生物体，例如使得该目的基因或调控元件的功能改变、丧失或部分丧失、功能屏蔽，功能重组或功能突变等等。
本申请中，“CRISPR核酸酶”是指可对特异性核酸序列进行靶向切割的酶，是指来源于包括CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统的酶，例如来源于I-F型CRISPR-Cas系统的Csy1、Csy2、Csy3，来源于II型CRISPR-Cas系统的Cas9，来源于II型CRISPR-Cas系统的Cas12。以Cas9/CRISPR系统为例，其利用RNA指导的DNA结合对靶DNA进行序列特异性切割，由crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白再与crRNA配对的靶序列上的特定位置处剪切双链DNA。与crRNA配对的靶序列通常是位于基因组PAM(原间隔区邻近基序)位点(NNG)上游的约20个核苷酸的序列。
在本申请中，“CRISPR簇”一般由“先导区”、“重复区”和“间隔区”组成。“先导区”为CRISPR簇中的先导序列，“重复区”即为CRISPR簇中的重复序列，“间隔区”是至CRISPR簇中的被“重复区”分隔的区域。“先导区”能够发挥其启动功能转录出一段前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，经“CRISPR核酸酶”催化加工并剪接成成熟的crRNA，最后“CRISPR簇”转录成为pre-crRNA并加工成成熟的crRNA，crRNA和“CRISPR核酸酶”形成一个蛋白核酸复合物(RNP)，crRNA中的间隔序列可与外源DNA中相应序列互补配对，随后引导Cas蛋白对靶序列的特定位点进行切割。每一类型的CRISPR簇以及其“CRISPR核酸酶”能够特异性地识别目的基因的不同PAM序列(原间隔序列临近基序，protospacer adjacent motif)，例如I-F型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-NCC-3’，来源于II型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-TTTN-3’。“PAM序列”，PAM序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，其为目的基因身份识别序列，与目的基因对应。
其中，“间隔区”为一双链DNA区，其能够转录形成为向导RNA(可为单链RNA或双链RNA)，向导RNA由crRNA和trancrRNA融合而成；向导RNA能够引导“CRISPR核酸酶”对靶位点进行切割，其通常包括crRNA上与靶序列互补的核苷酸和由crRNA与tracrRNA碱基配对形成的RNA支架(Scaffold)，能够识别与crRNA配对的靶序列。向导RNA可以与CRISPR核酸酶(例如Cas9蛋白)形成复合体并将CRISPR核酸酶带至靶序列并切割其中的靶位点。在本申请中，“间隔区”是位于“基因编辑质粒”或“基因编辑质粒”中的双链DNA序列，其能够被转录形成单链的向导RNA，以与“CRISPR核酸酶”形成一个蛋白核酸复合物(RNP)，实现目的基因的靶位点的识别和切割。每一类型的CRISPR簇以及其“CRISPR核酸酶”能够特异性地识别目的基因的不同PAM序列(原间隔序列临近基序，protospacer adjacent motif)，例如I-F型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-NCC-3’，来源于II型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-TTTN-3’。“PAM序列”，PAM序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，其为目的基因身份识别序列，与目的基因对应。
在本申请中，“供体区”提供用于插入、替换或删除目的基因的DNA序列。在“间隔区”引导下，“CRISPR核酸酶”能够靶向识别目的基因的PAM位点，定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后细菌、菌株或生物体自动启动其同源重组修复途径，将具有一段高度同源的DNA模板(供体区)时，会以“供体区”为模板进行修复，从而达到将用于插入、替换或删除目的基因的目的片段进行定点引入。
基因编辑质粒
由于CRISPR-Cas系统在基因编辑中的广泛应用，现有技术中已有利用CRISPR-Cas系统应用于运动发酵单胞菌中，例如Shen等“Shen W,Zhang J,Geng B,etal.Establishment and application of a CRISPR-Cas12a assisted genomeeditingsystem in Zymomonas mobilis[J].Microb Cell Fact,2019,18(1):162.”将来源于弗朗西斯菌(F.novicida)的核酸酶Cas12a基因与用于筛选的壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到运动发酵单胞菌菌株ZM4菌株基因组ZMO0038位点，构建了重组菌株ZM-Cas12a。然而这些基因编辑质粒及试剂盒，只能对目标基因单个逐一进行，存在耗时长、效率低等问题，每一次遗传操作均需要引入特定的筛选标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等问题，并且同源重组效率低。
为此，本申请实施例公开了一种基因编辑质粒，应用于运动发酵单胞菌和大肠杆菌的基因编辑。如图1所示，该基因编辑质粒包含具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2～5任一所示核苷酸序列的第二复制起始区、用于对所述基因编辑质粒进行标记和筛选的标记基因区、供体区和CRISPR簇。其中，CRISPR簇包括至少两个间隔区、用于分隔间隔区的重复区以及用于启动CRISPR簇的先导区。重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或7所示，先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或9所示。其中一个间隔区用于形成第一向导RNA与CRISPR核酸酶结合以对另一所述基因编辑质粒进行靶向消除，另一间隔区用于形成第二向导RNA与CRISPR核酸酶结合以靶向编辑目的基因。
本申请实施例公开的基因编辑质粒利用第一复制起始区和第二复制起始区能够在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中的穿梭，实现对大肠杆菌或运动发酵单胞菌的基因编辑。该基因编辑质粒利用其多个间隔区的靶向作用，可使得其中一个间隔区用于靶向基因编辑质粒的抗性标记，以在对大肠杆菌或运动发酵单胞菌的基因编辑后起到质粒消除作用，做到编辑完成即可基因编辑质粒，实现“无痕”基因编辑。另外，该基因编辑质粒利用其的多个间隔区，可使得其每一间隔区靶向相同或不同的目的基因，或者多个质粒进行组合分别靶向不同的目的基因，能够实现同时或者连续对多个目的基因或片段进行基因编辑，基因编辑效率高，为运动发酵单胞菌基因组精简及菌株工厂构建提供了强有力的基因编辑工具。
在本申请中，该“基因编辑质粒”的种类根据其具有“第二复制起始区”、“先导区”、“间隔区”、“重复区”、“供体区”、“标记物”的种类决定；当“第二复制起始区”、“先导区”、“间隔区”、“重复区”、“供体区”、“标记物”均相同时，则两个“基因编辑质粒”为“同种”；否则，两个“基因编辑质粒”为“不同种”。
在一些实施方式中，如图1所示，该供体区提供用于插入、替换或删除目的基因的序列，以实现对宿主(例如运动发酵单胞菌)的目的基因进行预设方式的基因编辑。在将该基因编辑质粒导入运动发酵单胞菌或大肠杆菌后，CRISPR簇启动编辑，靶向定位目的基因进行切割，再利用宿主菌株的同源修复作用，以供体区为模板，将用于插入、替换或删除目的基因的序列导入宿主菌基因组目的基因靶位点，从而完成基因编辑。在一个实施例中，为更加有利于对供体区提供的序列对宿主菌基因组目的基因靶位点进行修复，“供体区”的一端或两端均设置与目的基因上下游序列具有同源性的同源臂，以便提高同源重组的修复效率；例如，该“同源臂”长度为500～1000bp，该“供体区”用于敲除、替换或插入的序列长度为500～1000bp。
在一些实施方式中，如图1所示，CRISPR簇位于第一复制起始区的复制起始端和第二复制起始区的复制起始端之间；标记基因区位于第一复制起始区的复制终端与第二复制起始区的复制终端之间。经过试验表明，如此设置的CRISPR簇能够有利于其启动。
在一些实施例中，如图1所示，CRISPR簇包括如SEQ ID NO.6所示的重复区和如SEQID NO.8所示的先导区，位于所述CRISPR簇转录终端的一个间隔区的两端分别配置一如SEQID NO.6所示的重复区。
在一些实施例中，如图2所示，CRISPR簇包括如SEQ ID NO.7所示的重复区和如SEQID NO.9所示的先导区，位于CRISPR簇转录终端的一个间隔区仅于远离第一复制起始区复制起始端的一端配置如SEQ ID NO.7所示的一重复区。换言之，该基因编辑质粒位于该CRISPR簇转录末端并未配置如SEQ ID NO.7所示的一重复区。
本申请中，能够进行编辑的目的基因均选自选自限制修饰系统相关基因、膜渗透相关基因、β-内酰胺酶相关基因、σ54样蛋白相关基因、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因、固氮基因或木糖代谢途径相关酶基因中的至少一种。可选地，限制修饰系统相关基因选自ZMO0028和/或ZMO1933。可选地，膜渗透相关基因选自ZMO0055。可选地，β-内酰胺酶相关基因选自ZMO1650。可选地，σ54样蛋白相关基因选自ZMO0038。可选地，2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因、葡萄糖激酶编码基因、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因、丙酮酸脱羧酶基因或乙醇脱氢酶基因。可选地，固氮相关基因选自nifL、nifA或固氮酶编码基因。可选地，异丁醇代谢途径相关酶基因选自Als、IlvC和IlvD。
本申请中，“标记物基因”是指其表达可以被选择或富集的任何标记物基因，即当该标记物基因在宿主中表达时，可以通过一定方式选择和富集表达该标记物基因的宿主菌株或细菌。可用于本申请的标记物基因包括在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因。可用于本申请的抗性基因包括但不限于针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素庆大霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素(Blasticidin)、遗传霉素(Geneticin，G-418)、潮霉素(Hygromycin B)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、嘌呤霉素(Puromycin)、博莱霉素(Zeocin)或新霉素(Neomycin)的等抗性基因中的一种。可用于本申请的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、人生长激素基因(hGH)、绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因、蓝色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein)的编码基因、黄色荧光蛋白(Yellow FluorescentProtein)的编码基因、橙色荧光蛋白(Orange Fluorescent Protein)的编码基因、红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein)的编码基因、远红色荧光蛋白(Far-Red FluorescentProtein)的编码基因或可切换荧光蛋白(Switchable Fluorescent Proteins)的编码基因中的一种。
在一些实施方式中，本申请实施例提供的基因编辑质粒转入运动发酵单胞菌ZM4中，利用ZM4中自身携带的CRISPR核酸酶基因的表达能够有效表达Cas1、Cas2/3、Cas8、Cas5、Cas7和Cas6(参照“Yanli Zheng,et al.Characterization and repurposing ofthe endogenousType I-FCRISPR-Cas system of Zymomonas mobilis for genomeengineering[J]Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.21,11461-11475”)，从而实现与基因编辑质粒上的间隔区形成复合体，对目的基因的靶位点进行靶向切割，实现基因编辑。
在一些实施方式中，该基因编辑质粒中的CRISPR簇包括三个间隔区，一个间隔区用于转录形成一向导RNA，以便与CRISPR核酸酶结合以对另一所述基因编辑质粒进行靶向消除。另两个间隔区转录的向导RNA，分别与CRISPR核酸酶结合以靶向编辑不同的目的基因，从而实现同一种基因编辑质粒同步编码两种不同的目的基因，提高基因编辑效率。
基于此，本领域技术人员应当理解的是，本申请实施例提供的上述基因编辑质粒可用任何分子生物学的技术手段合成得到或者基于化学合成得到。
在一些实施方式中，本申请提供的基因编辑质粒的制备方法包括：
获得基础质粒，所述基础质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区、位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制终端之间的标记基因区、以及位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制起始端之间的初始CRISPR簇；
获得用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述标记物基因、和/或对携带有目的基因进行靶向切割的间隔区的寡聚核酸片段；
将该寡聚核酸片段插入至该初始CRISPR簇中，使得其变成包含具有上述靶向作用的间隔区的CRISPR簇，以得到基因编辑质粒。
在该实施方式的一些实施例中，该基础质粒是在pEZ15Asp上插入一个初始CRISPR簇，并且替换成为具有不同的第二复制起始区得到的。其中，pEZ15Asp(核苷酸序列如SEQID NO.29所示)参照“Yang S,Mohagheghi A,Franden M A,et al.Metabolic engineeringof Zymomonas mobilis for 2,3-butanediol production from lignocellulosicbiomass sugars[J].Biotechnol Biofuels,2016,9(1):189.”方法获得，pEZ15Asp具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区和位于第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的标记基因区。在一个实施例中，此过程可以参照“基因敲除质粒载体的构建及其在幽门螺杆菌基因敲除中的应用[J]中国病原生物学杂志，2016年，第12期”公开的方法进行标记基因区替换的步骤。
在该实施方式的一些实施例中，将运动发酵单胞菌ZM4菌株采用不同的第二引物对进行扩增得到如SEQ ID NO.3～5所示的不同第二复制起始区的片段，再分别与采用第三引物对对pEZ15Asp进行PCR扩增的产物进行酶切连接反应，以得到不同的基础质粒。具有如SEQ ID NO.3～5所示的不同第二复制起始区的基础质粒中使用的第二引物对和第三引物对分别见序列表。
在一个具体的基础质粒的制备实施例中，如图3所示，由GenScript(南京中国)合成一个初始CRISPR簇的核酸片段，该初始CRISPR簇包括一个先导区(如SEQ ID NO.8所示)、两个重复(如SEQ ID NO.6所示)，两个重复区之间包含两个反向的BsaI酶切位点(5’.....GGTCTCN^NNNNN.....3’；3’.....CCAGAGNNNNN^N......5’)。例如一个初始CRISPR簇的序列如SEQ ID NO.10所示，利用如SEQ ID NO.11～12所示的上下游引物对其进行PCR扩增，回收扩增产物；将扩增产物用XbaI和EcoRI酶切，插入pEZ15Asp载体中，生成基础质粒。进而，利用BsaI酶切基础质粒得到一个线性化的基础质粒，其两端均具有一个4nt的突出的重复序列；将具有靶向作用的间隔区的寡核苷酸退火到95℃加热5min，然后逐渐冷却到室温，制备了与该间隔区杂交配合的双链DNA，将该双链DNA与线性化的基础质粒在T4DNA连接酶作用下与其4nt的突出端互补，从而得到基因编辑质粒。
在该实施方式的一些实施例中，如图3所示，该初始CRISPR簇包括一个先导区(如SEQ ID NO.8所示)、两个重复区(如SEQ ID NO.6所示)、以及位于两个重复区之间的一段间隔区，该间隔区具有两段反向排列的限制性内切酶识别序列及位于限制性内切酶识别序列之间的保护序列。在一些实施例中，该限制性内切酶选自BsaI、XbaI、EcoRI、BglI、BsaBI或BspQI；优选地，该限制性内切酶选自BsaI、XbaI、EcoRI，以便在酶切后在间隔区不留下多余序列，从而影响间隔区专利形成的向导RNA的靶向作用。具有如此结构的初始CRISPR簇，能够被限制性内切酶从切开后，与具有靶向作用的间隔区的寡聚核酸片段进行酶连接(例如T4DNA连接酶)。在一些实施例中，在此基础上，再通过酶切位点在此插入一个包括重复区和间隔区组成的单元序列，并通过连续酶切和插入，使得最终的基因编辑质粒能够具有多个间隔区。
在一些实施例中，如图4所示，该初始CRISPR簇包括依次连接的一个先导区(如SEQID NO.9所示)、重复区(如SEQ ID NO.7所示)以及包含两个反向的酶切位点的序列。在该实施例中，其余步骤与如图3所示的实施例大致相同，在其基础上，通过酶切位点在此插入一个包括重复区和间隔区组成的单元，从而通过连续酶切和插入，使得最终的基因编辑质粒能够具有多个间隔区。
在一些实施例中，如图5所示，该初始CRISPR簇可以包括一个先导区(如SEQ IDNO.8所示)、多个重复区(如SEQ ID NO.6所示)以及在每两个重复区之间插入的不同类型的两个反向的限制性酶切位点，该限制性酶选自BsaI、XbaI、EcoRI、BglI、BsaBI或BspQI。在该实施例中，便于在基因编辑质粒中形成多个具有不同靶向作用的间隔区，其步骤与如图3所示的实施例大致相同，通过每次使用不同的限制性酶进行酶切后插入不同间隔区。
在一些实施例中，如图3～5所示，该基因编辑质粒还具有供体区，在上述实施例提供的基因编辑质粒的基础上，在CRISPR簇先导区的复制前端插入该供体区。在一个实施例中，可在CRISPR簇先导区的复制前端配置限制性内切酶(如XbaI、EcoRI)识别序列，被酶切后与供体区的寡聚核苷酸进行酶连接(例如T4DNA连接酶)。在一个实施例中，将反扩后的在上述实施例提供的基因编辑质粒，再将其与具有同源臂的供体区的寡聚核苷酸片段，进行Gibson组装，以形成最终的基因编辑质粒，具体步骤可参照“Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造[J]病毒学报,发表于2018年09月28日”。
基因编辑试剂盒
通过对这类基因编辑质粒中的供体区的序列进行选择，能够对不同目的基因进行编辑；通过此类基因编辑质粒中的标记物基因进行选择，能够选用不同的标记物对此类基因编辑质粒转入宿主的阳性转化子进行标记和筛选；从而对应于不同标记物基因配置不同的第一向导RNA、对应于不同的目的基因配置不同的第二向导RNA，从而能够得到不同的基因编辑质粒，以将该类基因编辑质粒应用于运动发酵单胞菌或大肠杆菌的不同目的基因的无痕编辑。
下方实施例将对本申请提供的“基因编辑质粒”的种类形成的组合应用于基因编辑试剂盒的实施方式进行详细阐述。
为此，本申请实施例还公开了一种基因编辑试剂盒，包括两种上述实施例提供的基因编辑质粒、和CRISPR核酸酶或提供CRISPR核酸酶表达的载体，其中任一种基因编辑质粒携带的标记基因区具有位于另一基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。通过将两种上述实施例的两种基因编辑质粒转入运动发酵单胞菌或大肠杆菌(例如ZM4或DH5ɑ)中，能够对利用两种基因编辑质粒对至少两种目的基因进行基因编辑，提高基因标记效率。同时，在至少两种目的基因进行编辑的同时，此两种质粒能够利用其间隔区进行相互消除，消除率为100％，实现无痕敲除，以检索对宿主菌的基因组影响。在一些实施例中，该CRISPR核酸酶为运动发酵单胞菌ZM4内源性的CRISPR核酸酶或者外源性的CRISPR核酸酶，或者内源性I-F型CRISPR核酸酶(例如Cas1、Cas2/3、Cas8、Cas5、Cas7和Cas6)，外源性II型CRISPR核酸酶，例如Cas12。
在该实施方式的一些实施例中，该基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒。第一基因编辑质粒包含：第一复制起始区、第二复制起始区、第一供体区、至少两个第一间隔区、重复区、先导区和第一标记基因区。第二基因编辑质粒包含：第一复制起始区、第二复制起始区、第二供体区、至少两个第二间隔区、重复区、先导区和第二标记基因区。如此，第一基因编辑质粒的一个第一间隔区用于编辑第一目的基因，另一个第一间隔区靶向第二标记物基因；第二基因编辑质粒的一个第二间隔区用于编辑第二目的基因，另一个第二间隔区靶向第一标记物基因。具有如此组合的基因编辑试剂盒，能够对两种目的基因进行连续编辑，还能使得编辑后的质粒彼此消除。
在该实施方式中，如图6或7所示，对第二复制起始区从如SEQ ID NO.2～5所示核苷酸序列中选取，对重复区从如SEQ ID NO.6或7所示核苷酸序列中选取，对先导区从如SEQID NO.8或9所示核苷酸序列中选取，能够得到不同第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒，进而形成不同的基因编辑试剂盒。同样地，下述实施例中，第一基因编辑质粒中的CRISPR簇可以配置如图1所示的结构或如图2所示的结构，第二基因编辑质粒中可以配置如图1所示的结构或如图2所示的结构。为此，该基因编辑试剂盒至少具有如下的实施例。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第一标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。
为此，本申请实施例还公开了一种基因编辑试剂盒，包括至少三种上述实施例提供的基因编辑质粒、和CRISPR核酸酶或提供CRISPR核酸酶表达的载体，其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有至少一个位于另一种所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。通过将此三种基因编辑质粒转入宿主菌中，能够对三个及以上目的基因进行编辑的同时，此三种及以上的质粒能够利用其间隔区进行相互消除，做到无痕编辑，以检索对宿主菌的基因组影响。在一些实施例中，该CRISPR核酸酶为运动发酵单胞菌ZM4内源性的CRISPR核酸酶或者外源性的CRISPR核酸酶，或者内源性I-F型CRISPR核酸酶(例如Cas1、Cas2/3、Cas8、Cas5、Cas7和Cas6)，外源性II型CRISPR核酸酶，例如Cas12。
在一些实施方式的一些实施例中，如图8或9所示，该基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒。第一基因编辑质粒携带的一间隔区靶向消除第二基因编辑质粒携带的第二标记基因区，第二基因编辑质粒携带的一间隔区靶向消除第三基因编辑质粒携带的第三标记基因区，第三基因编辑质粒携带的一间隔区靶向消除所述第一基因编辑质粒携带的第一标记基因区。第一基因编辑质粒用于编辑第一目的基因、第二基因编辑质粒用于编辑第二目的基因、第三基因编辑质粒用于编辑第三目的基因，如此组合的基因编辑试剂盒，能够对三种目的基因进行连续编辑，还能使得编辑后的质粒彼此循环消除。
在该实施方式中，如图8或9所示，对第二复制起始区从如SEQ ID NO.2～5所示核苷酸序列中选取，对重复区从如SEQ ID NO.6或7所示核苷酸序列中选取，对先导区从如SEQID NO.8或9所示核苷酸序列中选取，能够得到不同第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因基因编辑质粒，进而形成不同的基因编辑试剂盒。同样地，下述实施例中，第一基因编辑质粒中的CRISPR簇可以配置如图1所示的结构或如图2所示的结构，第二基因编辑质粒中可以配置如图1所示的结构或如图2所示的结构，第三基因编辑质粒中可以配置如图1所示的结构或如图2所示的结构。为此，该实施方式的基因编辑试剂盒至少具有如下的实施例。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
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在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个第一间隔区靶向第二标记基因区，其他第一间隔区靶向第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个第二间隔区靶向第三标记基因区，其他第二间隔区靶向第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个第三间隔区靶向第一标记基因区，其他第三间隔区靶向第三目的基因。
在该实施方式的一些实施例中，第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因。第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因。第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因。
在上述实施方式中，目的基因、第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因中的任一项分别选自限制修饰系统相关基因、膜渗透相关基因、β-内酰胺酶相关基因、σ54样蛋白相关基因、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因、固氮基因或木糖代谢途径相关酶基因中的至少一种。可选地，所述限制修饰系统相关基因选自ZMO0028和/或ZMO1933；可选地，所述膜渗透相关基因选自ZMO0055；可选地，所述β-内酰胺酶相关基因选自ZMO1650；可选地，所述σ54样蛋白相关基因选自ZMO0038。
在该实施方式的一些实施例中，如图10～12所示，该基因编辑试剂盒可以包括4种、5种、6种或者更多中的上述实施例提供的基因编辑质粒。其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有至少一个位于另一种所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。这些质粒每一种用于一个目的基因的编辑，将4种、5种、6种或更多的上述实施例的基因编辑依次或者同时转入运动发酵单胞菌中，能够利用每一种质粒的间隔区依次连续对宿主菌的多个目的基因进行“无痕”编辑，即每一编辑质粒能够被其他至少一个编辑质粒中的间隔区进行靶向标记基因区进行切割，从而进行有效消除，提高基因编辑效率。
在上述实施方式中，CRISPR核酸酶可以以蛋白质的形式被引入菌株，以可以通过提供CRISPR核酸酶载体，以其编码核酸序列(例如mRNA或cDNA)的形式被引入菌株。编码CRISPR核酸酶的核酸可以被包含在质粒或病毒载体中被引入菌株，例如通过转染被引入菌株。编码CRISPR核酸酶的核酸也可以通过电穿孔、脂质体、显微注射等方式被直接递送到菌株中。
应用
为此，本申请实施例还提供了一种运动发酵单胞菌的基因编辑方法，利用上述实施例提供的基因编辑质粒或基因编辑试剂盒进行。该基因编辑方法包括：将一种上述实施例提供基因编辑质粒转入运动发酵单胞菌中，利用标记物基因进行筛选的步骤；或者将两种及以上的上述实施例提供的基因编辑质粒依次转入运动发酵单胞菌中，分别利用标记物基因进行筛选的步骤。
实施例1
在一个实施例1中，采用如图10所示的方法构建了第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒，依次用于敲除ZMO0038、ZMO1650和ZMO0055。三个质粒的结构如图8所示，并将该第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒依次转入该ZM4菌株中，成功实现了三个基因ZMO0038、ZMO1650和ZMO0055的“无痕”基因敲除。具体步骤如下：
在本实施例1中，第一基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；氯霉素抗性基因区(SEQ ID NO.39)；靶向作用第二基因编辑质粒的壮观霉素抗性基因区的一个第一间隔区(如SEQ ID NO.13所示)以及靶向ZMO0038的一个第一间隔区(如SEQ ID NO.16所示)；第一供体区，提供用于敲除ZMO0038基因的序列，如SEQ ID NO.17所示。将第一基因编辑质粒命名为pE1-Cm-RNASpe-RNA38。
在本实施例1中，第二基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；壮观霉素抗性基因区(SEQ ID NO.38)；靶向作用该第三基因编辑质粒的卡拉霉素抗性基因区的一个第二间隔区(如SEQ ID NO.15所示)以及靶向ZMO1650的一个第二间隔区(如SEQ ID NO.20所示)；第二供体区，提供用于敲除ZMO1650基因的序列，如SEQ ID NO.21所示。将第二基因编辑质粒命名为pE2-Spe-RNAkana-RNA1650。
在本实施例1中，第三基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；卡拉霉素抗性基因区(SEQ ID NO.40)；靶向作用第一基因编辑质粒的氯霉素抗性基因区的一个第三间隔区(如SEQ ID NO.14所示)以及靶向ZMO0055的一个第三间隔区(如SEQ ID NO.18所示)；第三供体区，提供用于敲除ZMO0055基因的序列，如SEQ ID NO.19所示。将第三基因编辑质粒命名为pE3-Kana-RNACm-RNA55。
在本实验例中，由于初始CRISPR的序列过长而需要合成过长的引物，如此可能在引物退火时其自身形成发卡结构，而不和另一条互补配对，从而形成不了DNA双链，为此优选地，pE1-Cm-RNASpe-RNA38、pE2-Spe-RNAKana-RNA1650和pE3-Kana-RNACm-RNA55的构建过程采用如图3所述的方法实施例进行。
首先，将pE2-Spe-RNAKana-RNA1650电转到ZM4菌株并涂布在添加壮观霉素抗性的RMG2平板上。约48h后进行菌落PCR检测，将正确的转化子在添加壮观霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养，并进行菌液PCR验证再次确认ZMO1650被成功敲除，得到的菌株命名为ZM-2并制备为感受态细胞(图13A)。
然后，将pE1-Cm-RNASpe-RNA38电转到ZM-3并涂布在添加氯霉素抗性的RMG2固体平板上。菌落PCR验证结果显示，ZMO0038被成功敲除，pE2-Spe-RNAKana-RNA1650也被消除，将正确的转化子在添加氯霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养，并进行菌液PCR验证再次确认ZMO0038被成功敲除，得到的菌株命名为ZM-1并制备为感受态细胞。为了进一步验证结果的可靠性，将ZM-1转化子分别在添加有氯霉素、壮观霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养，在添加有氯霉素抗性的RMG2液体培养基正常生长，而在添加有壮观霉素抗性的RMG2液体培养基无法生长，结果说明pE2-Spe-RNAKana-RNA1650被成功消除；同时将在在添加有氯霉素抗性的RMG2液体培养基的培养物进行稀释涂布后的结果也说明pE2-Spe-RNAKana-RNA1650被成功消除(图13B)。
最后，将pE3-Kana-RNACm-RNA55电转到ZM-1并涂布在添加卡那霉素抗性的RMG2固体平板上。菌落PCR验证结果显示，ZMO0055被成功敲除，同时pE1-Cm-RNASpe-RNA38被成功消除。将正确的转化子在添加卡那霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养，并进行菌液PCR验证再次确认ZMO0055被成功敲除，得到的菌株命名为ZM-1并制备为感受态细胞。为了进一步验证结果的可靠性，将ZM-1转化子分别在添加有卡那霉素、氯霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养，在添加有卡那霉素抗性的RMG2液体培养基正常生长，而在添加有氯霉素抗性的RMG2液体培养基无法生长，结果说明pE1-Cm-RNASpe-RNA38被成功消除；同时将在在添加有卡那霉素抗性的RMG2液体培养基的培养物进行稀释涂布后的结果也说明pE1-Cm-RNASpe-RNA38被成功消除(图13C)。
实施例2
在本实施例2中，采用如图3所示的方法构建了第四基因编辑质粒、第五基因编辑质粒和第六基因编辑质粒，依次用于靶向敲除运动发酵单胞菌ZM4菌株的三个非必需基因ZMO0028、ZMO1650和ZMO001933。
在本实施例2中，如图11所示，第四基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的第一复制起始区；如SEQ ID NO.2所示的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；氯霉素(Cm)抗性基因区(SEQ IDNO.39)；靶向作用第五基因编辑质粒的壮观霉素(Spe)抗性基因区的一个第四间隔区(如SEQ ID NO.23所示)以及靶向ZMO0028的另一个第四间隔区(如SEQ ID NO.25所示)；第四供体区，提供用于敲除ZMO0028基因的序列，如SEQ ID NO.26所示。将第四基因编辑质粒命名为pE4-Cm-RNASpe-RNA28。pE4-Cm-RNASpe-RNA28中位于该CRISPR簇转录末端并未配置如SEQ ID NO.7所示的一重复区。
在本实施例中，如图11所示，第五基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的第一复制起始区；如SEQ ID NO.3所示的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示的先导区；壮观霉素(Spe)抗性基因区(SEQ ID NO.38)；靶向作用该第六基因编辑质粒的卡拉霉素(Kana)抗性基因区的一个第五间隔区(如SEQ ID NO.22所示)以及靶向ZMO1650的一个第五间隔区(如SEQ ID NO.20所示)；第五供体区，提供用于敲除ZMO1650基因的序列，如SEQ ID NO.21所示。将第五基因编辑质粒命名为pE5-Spe-RNAKana-RNA1650。pE5-Spe-RNAKana-RNA1650中位于该CRISPR簇转录末端并未配置如SEQID NO.7所示的一重复区。
在本实施例中，如图11所示，第六基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的第一复制起始区；如SEQ ID NO.5所示的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示的先导区；卡拉霉素(Kana)抗性基因区(SEQ ID NO.40)；靶向作用第四基因编辑质粒的氯霉素(Cm)抗性基因区的一个第六间隔区(如SEQ ID NO.24所示)以及靶向ZMO1933的一个第六间隔区(如SEQ ID NO.27所示)；第六供体区，提供用于敲除ZMO1933基因的序列，如SEQ ID NO.28所示。将第二基因编辑质粒命名为pE6-Kana-RNACm-RNA1933。pE6-Kana-RNACm-RNA1933中位于该CRISPR簇转录末端并未配置如SEQ IDNO.7所示的一重复区。
在本实施例2中，pE4-Cm-RNASpe-RNA28、pE5-Spe-RNAKana-RNA1650和pE6-Kana-RNACm-RNA1933的构建过程优选地采用如图4所述的方法实施例进行，由编码插入的初始CRISPR的序列过长，而需要合成过长的引物，从而长引物在引物退火的时候，可能会自己发生互补配对形成发卡结构，而不和另一条互补配对，从而形成不了DNA双链。
首先将pE5-Spe-RNAKana-RNA1650电转到ZM4菌株，ZMO1650被成功敲除(图14A)，得到的菌株命名为ZM-5；然后电转pE4-Cm-RNASpe-RNA28到ZM-5感受态细胞，ZMO0028被成功敲除，pE5-Spe-RNAKana-RNA1650被成功消除(图14B)，将得到的菌株命名为ZM-4；最后电转pE6-Kana-RNACm-RNA1933到ZM-4感受态细胞，ZMO1933被成功敲除，pE4-Cm-RNASpe-RNA28被成功消除(图14C)。结果表明，将pE4-Cm-RNASpe-RNA28、pE5-Spe-RNAKana-RNA1650和pE6-Kana-RNACm-RNA1933组合成试剂盒，依次转入至的ZM4菌株中，最后分别成功敲除了ZMO0028、ZMO1650和ZMO1933三个基因，并且转入的三个基因编辑质粒相互完成消除，消除率100％。
实施例3
在一个实施例3中，将应用pE2-Spe-RNAKana-RNA1650电转到ZM4菌株并涂布在添加壮观霉素的RMG2固体平板上，将菌落PCR验证得到ZMO1650被成功敲除的菌株ZM-2制备为感受态细胞；然后电转pE4-Cm-RNASpe-RNA28到ZM-2并涂布在添加氯霉素抗性的RMG2固体平板上，PCR验证结果显示，pE4-Cm-RNASpe-RNA28在敲除ZMO0028的同时成功将质粒pN-33消除，经在RMG2液体培养基培养和固体平板稀释涂布，也证明pE2-Spe-RNAKana-RNA1650被消除(图15A)，所得的菌株命名为ZM-4并制备为感受态细胞；最后将pE3-Kana-RNACm-RNA55电转到ZM-4菌株并涂布在添加卡那霉素的RMG2固体平板上，PCR验证、RMG2液体培养基培养和固体平板稀释涂布结果显示，ZMO0055被成功编辑的同时pE4-Cm-RNASpe-RNA28被消除(图15B)。
在一些实施例中，如图12所示，将上述实施例中的pE1-Cm-RNASpe-RNA38、pE2-Spe-RNAKana-RNA1650、pE3-Kana-RNACm-RNA55，以及pE4-Cm-RNASpe-RNA28、pE5-Spe-RNAKana-RNA1650和pE6-Kana-RNACm-RNA1933组合成试剂盒，导入至ZM4菌株中，依然实现ZMO0038、ZMO0055、ZMO0028、ZMO1933和ZMO1650基因的有效敲除，并且还能实现这些质粒之间的相互消除。由此说明，采用上述6种质粒的部分质粒或者全部质粒进行组合形成试剂盒，能够不受编辑质粒及类型差异的影响，在成功敲除目的基因的同时，还能有效消除基因编辑质粒，实现无痕编辑。另外，由于每一基因编辑质粒至少携带一个靶向目的基因的间隔区，因此，该组合的基因编辑试剂盒能够实现六种不受限制的目的基因的编辑，能够大大提高基因编辑效率。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种基因编辑质粒，所述基因编辑质粒包含：
具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；
具有如SEQ ID NO.2～5任一所示核苷酸序列的第二复制起始区；
标记基因区，用于对所述基因编辑质粒进行标记和筛选；
供体区，提供用于插入、替换或删除所述目的基因的序列；
CRISPR簇，所述CRISPR簇包括至少两个间隔区、用于分隔所述间隔区的重复区以及用于启动所述CRISPR簇的先导区，所述重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或7所示，所述先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或9所示，其中一个间隔区用于形成与CRISPR核酸酶结合以对另一所述基因编辑质粒进行靶向消除的第一向导RNA，另一间隔区用于形成与CRISPR核酸酶结合以靶向编辑目的基因的第二向导RNA。
2.根据权利要求1所述的基因编辑质粒，其中，所述CRISPR簇位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制起始端之间；所述标记基因区位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制终端之间。
3.根据权利要求2所述的基因编辑质粒，其中，所述供体区位于所述第二复制起始区的复制起始端与所述CRISPR簇的转录起始端之间。
4.根据权利要求1所述的基因编辑质粒，其中，所述CRISPR簇包括三个间隔区，其中一个间隔区用于转录形成一向导RNA，与CRISPR核酸酶结合以对另一所述基因编辑质粒进行靶向消除；另两个间隔区转录形成的向导RNA，分别与CRISPR核酸酶结合以靶向编辑不同的目的基因。
5.根据权利要求1所述的基因编辑质粒，其中，所述CRISPR簇包括如SEQ ID NO.6所示的重复区和如SEQ ID NO.8所示的先导区，每一所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；或者
所述CRISPR簇包括如SEQ ID NO.7所示的重复区和如SEQ ID NO.9所示的先导区，所述重复区的数量等于所述间隔区，且靠近所述第一复制起始区复制终端的一所述间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
6.根据权利要求1所述的基因编辑质粒，其中，所述目的基因选自限制修饰系统相关基因、膜渗透相关基因、β-内酰胺酶相关基因、σ54样蛋白相关基因、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因、固氮基因或木糖代谢途径相关酶基因中的至少一种；
可选地，所述限制修饰系统相关基因选自ZMO0028和/或ZMO1933；
可选地，所述膜渗透相关基因选自ZMO0055；
可选地，所述β-内酰胺酶相关基因选自ZMO1650；
可选地，所述σ54样蛋白相关基因选自ZMO0038；
可选地，所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因、葡萄糖激酶编码基因、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因、丙酮酸脱羧酶基因或乙醇脱氢酶基因；
可选地，所述固氮相关基因选自nifL、nifA或固氮酶编码基因；
可选地，所述异丁醇代谢途径相关酶基因选自Als、IlvC和IlvD。
7.根据权利要求1所述的基因编辑质粒，其中，所述标记物基因选自抗性基因或报告基因；
可选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、庆大霉素、壮观霉素和卡那霉素的抗性基因中的至少一种；
可选地，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、人生长激素基因和绿色荧光蛋白基因中的至少一种。
8.一种基因编辑试剂盒，包括两种如权利要求1～7任一所述的基因编辑质粒，其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有位于另一所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。
9.根据权利要求8所述的基因编辑试剂盒，选自如下(1)～(26)任一项：
(1)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(2)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(3)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(4)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(5)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(6)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(7)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(8)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(9)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(10)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(11)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(12)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(13)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(14)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(15)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(16)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(17)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(18)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(19)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(20)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(21)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(22)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(23)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(24)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(25)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
(26)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒和第二基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因。
10.一种基因编辑试剂盒，包括至少三种如权利要求1～7任一所述的基因编辑质粒，其中任一种所述基因编辑质粒携带的标记基因区具有至少一个位于另一种所述基因编辑质粒中具有靶向消除作用的间隔区。
11.根据权利要求10所述的基因编辑试剂盒，选自如下(1)～(44)任一项：
(1)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(2)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(3)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(4)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(5)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(6)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(7)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(8)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(9)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(10)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(11)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(12)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(13)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(14)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(15)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(16)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(17)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(18)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(19)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(20)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(21)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(22)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(23)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(24)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(25)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(26)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(27)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(28)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(29)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(30)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(31)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(32)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(33)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(34)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(35)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(36)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(37)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(38)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(39)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(40)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(41)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(42)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(43)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因；
(44)所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒：
所述第一基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第一供体区，提供用于插入、替换或删除第一目的基因的序列；第一标记基因区，用于对所述第一基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第一间隔区，其中一个所述第一间隔区靶向所述第二标记基因区，其他所述第一间隔区靶向所述第一目的基因；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第二供体区，提供用于插入、替换或删除第二目的基因的序列；第二标记基因区，用于对所述第二基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第二间隔区，其中一个所述第二间隔区靶向所述第三标记基因区，其他所述第二间隔区靶向所述第二目的基因；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；第三供体区，提供用于插入、替换或删除第三目的基因的序列；第三标记基因区，用于对所述第三基因编辑质粒进行标记和筛选；至少两个第三间隔区，其中一个所述第三间隔区靶向所述第一标记基因区，其他所述第三间隔区靶向所述第三目的基因。
12.根据权利要求9或11所述的基因编辑试剂盒，其中，所述第一目的基因、所述第二目的基因和所述第三目的基因分别独立地选自ZMO0038、ZMO0055、ZMO1650、ZMO1933或ZMO0028中的一种。
13.根据权利要求8～12任一所述的基因编辑试剂盒，还包括CRISPR核酸酶或提供CRISPR核酸酶表达的载体，以提供目的基因进行靶向切割的酶。
14.一种运动发酵单胞菌的基因编辑方法，所述基因编辑方法利用如权利要求1～7任一所述的基因编辑质粒、或如权利要求8～13任一所述的基因编辑试剂盒进行。
15.根据权利要求14所述的基因编辑方法，其中，所述基因编辑试剂盒包括第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒和第三基因编辑质粒；
所述第一基因编辑质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.39所示核苷酸序列的氯霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的一个第一间隔区和具有如SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的一个第一间隔区；具有如SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的第一供体区；每一所述第一间隔区两侧均分别配置一所述重复区；
所述第二基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.38所示核苷酸序列的壮观霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的一个第二间隔区和具有如SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的的一个第二间隔区；具有如SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的第二供体区；每一所述第一间隔区两侧均分别配置一所述重复区；
所述第三基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.40所示核苷酸序列的卡拉霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的一个第一间隔区和具有如SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的的一个第一间隔区；具有如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的第三供体区；每一所述第一间隔区两侧均分别配置一所述重复区。
16.根据权利要求14所述的基因编辑方法，其中，所述基因编辑试剂盒包括第四基因编辑质粒、第五基因编辑质粒和第六基因编辑质粒；
所述第四基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.39所示核苷酸序列的氯霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.23所示核苷酸序列的一个第四间隔区和具有如SEQ IDNO.25所示的一个第四间隔区；以及具有如SEQ ID NO.26所示核苷酸序列的第四供体区，具有如SEQ ID NO.25所示的一个第四间隔区仅于远离所述第一复制起始区的复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第五基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.38所示核苷酸序列的壮观霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.22所示核苷酸序列的一个第五间隔区和具有如SEQ IDNO.20所示的一个第五间隔区；以及具有如SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的第五供体区；具有如SEQ ID NO.20所示的一个第五间隔区仅于远离所述第一复制起始区的复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第六基因编辑质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的第二复制起始区；具有如SEQ ID NO.7所示的重复区；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的先导区；具有如SEQ ID NO.40所示核苷酸序列的卡拉霉素抗性基因区；具有如SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的一个第六间隔区和具有如SEQ IDNO.27所示的一个第六间隔区；以及具有如SEQ ID NO.28所示核苷酸序列的第六供体区；具有如SEQ ID NO.27所示的一个第六间隔区仅于远离所述第一复制起始区的复制终端一侧配置一所述重复区。
17.根据权利要求15或16所述的基因编辑方法，其中，所述基因编辑试剂盒包括所述第一基因编辑质粒、第二基因编辑质粒、第三基因编辑质粒、第四基因编辑质粒、第五基因编辑质粒或第六基因编辑质粒中的至少一种。
18.权利要求1～7任一所述的基因编辑质粒、或权利要求8～13所述的基因编辑试剂盒在运动发酵单胞菌或大肠杆菌基因编辑中的应用。
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