CN108823233A - 一种对硝基苯酚的快速降解方法 - Google Patents

一种对硝基苯酚的快速降解方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对硝基苯酚（p‑nitrophenol，PNP）的快速降解方法，根据细菌降解芳香类化合物代谢通路具有交叉性的特点，构建含有代谢通路中限速酶单加氧酶和双加氧酶两种酶的降解性质粒；将降解性质粒电转移进入强成膜细菌中形成工程性强成膜细菌；将工程性强成膜细菌投入到PNP污染的水体中，由于工程性强成膜细菌能够促使水体中稳定生物被膜的形成，而菌体内携带的降解性质粒能通过基因水平转移进入在生物被膜群落中各种不同种属的菌体内，提高了两种限速酶表达量，从而促进了PNP的代谢。本发明的对硝基苯酚降解方法不仅能够明显提高生物被膜的降解能力，大幅提高降解效率，而且生物性降解法的环境相容性高，可以避免二次污染，有效地保护了环境。

Description

一种对硝基苯酚的快速降解方法
技术领域
本发明属于环境保护及生物技术领域，具体涉及一种对硝基苯酚的快速降解方法。
背景技术
近年来，环境污染和安全问题日益成为关注的焦点，如何有效地减轻或避免污染物对环境及人类健康的损害已成为亟待解决的问题。芳香类化合物就是一类危害严重的污染物，它们一般具有芳香环，结构稳定，不易分解，在环境中累积后对人体危害极大。
硝基酚类属于芳香类化合物，是一类重要且常用的化工原料，作为原材料或中间体被广泛应用于炸药、医药、杀虫剂和染料的生产中。硝基酚可溶于水，在水中解离呈酸性，在生产和使用过程中，会随着工业废水的排放，对环境造成污染。从产量和危害性来讲，对硝基苯酚（PNP）是其中最重要的污染物，已经被美国环保局列入“优先控制污染物名单”里，因此促进工业废水中PNP的有效降解是保护环境的一个重要措施。
在工业废水中投加具有降解PNP功能的微生物促进PNP降解，是一种常见的环境友好性生物保护措施，即所谓的生物强化，这是目前常用的技术。但是我们知道，直接投加到环境中的降解菌往往会面临土著微生物的生长竞争，以及水流的冲散流失等不利因素，影响其生长与繁殖，从而达不到预期的目标。因此，将降解菌用包埋剂固定化，防止其流失是实践生产上为了保持生物修复系统降解能力的常用方法。不过，该方法选用的包埋剂主要是一类化学试剂，这种方式不但增加成本和操作难度，而且还在水体中引入包埋剂这类新的化学试剂污染。
利用水体中天然的生物被膜（biofilm）将降解菌定殖固定在水体中是一种新颖的固定方法。其方法就是在投加降解菌的同时，也投加强成膜菌（共凝聚指数比较高一类细菌，具有较强地形成生物被膜的能力）。强成膜菌被投加到新的环境时，能够结合土著菌和降解菌在水体中各种表面形成稳定的生物被膜，达到固定降解菌的目的不过，这一技术的缺点在于降解菌会面临土著细菌的生长竞争，容易退化为逆势菌群，而在生物被膜里消失。
生物被膜有一个重要的特性，就是在被膜群落里微生物之间基因水平转移的能力较强。基因水平转移（horizontal gene transfer, HGT）是上世纪90年代逐渐被重视的遗传现象，主要指微生物界普遍存在着的频繁地非亲代到子代的遗传物质交换传播，是相对于常规的从亲代到子代的基因垂直转移(vertical gene transfer,VGT)提出的。HGT现象不仅在原核生物中普遍存在，而且还是微生物适应环境，甚至是微生物进化的动力。功能基因通过HGT进入受体细胞中，一方面通过自身表型的作用改变微生物的生理特征，另一方面与受体菌的染色体相作用使微生物的多样性发生变化，进而改变微生物的群落结构。在水平转移过程中，这些可移动遗传因子上的基因片断(如编码抗性基因)能够以很高的速率转移到其他生物体中，促进其代谢、生理和生态学的转变，表现出新的性状，甚至演变成新的物种。
发明内容
针对现有对硝基苯酚降解技术中存在的缺陷，本发明旨在提供一种对硝基苯酚的快速降解方法，以提高对硝基苯酚的降解效率，有效地保护环境。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种对硝基苯酚的快速降解方法，具体步骤如下:
步骤1）利用基因工程技术构建降解性质粒。
以Methylobacterium sp.C1为例，Methylobacterium sp.C1是苏州大学环境微生物实验室早期分离到的一株对硝基苯酚的降解菌，是第一个被报道的类属于甲基杆菌属的对硝基苯酚降解菌。
对该对硝基苯酚降解菌（Methylobacterium sp.C1）进行基因测序，得知其基因组内含有降解功能的基因岛，从中克隆出单加氧酶基因（以4-nitrophenol monooxygenase为例）和双加氧酶基因（以hydroxyquinol 1,2-dioxygenase为例）；通过基因工程技术，将单加氧酶基因和双加氧酶基因克隆进组成型表达质粒，构建成一个含有单加氧酶和双加氧酶的双酶组成型表达质粒；将该双酶组成型表达质粒导入大肠杆菌体内，检测其降解活性，最终形成一个降解性质粒（pCDFduet-MH）。
步骤2）降解性质粒导入强成膜细菌菌体内，制备工程性强成膜细菌。
以Pseudomonas putida M9为例，Pseudomonas putida M9是苏州大学环境微生物实验室早期分离另一株功能细菌，具有通常较强的共凝聚能力，是一株革兰氏阴性细菌，其强的成膜性有利于稳定的生物被膜的形成。
将构建好的降解性质粒（pCDFduet-MH）经电击转化（2.1kv，1s）的方式转移至强成膜细菌（Pseudomonas putida M9）菌体内，利用抗生素平板选择性培养筛选，检测绿色荧光蛋白（GFP）基因，鉴定得到阳性克隆的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）。
步骤3）工程性强成膜细菌投入废水中降解对硝基苯酚。
先将填料投加到被对硝基苯酚污染的水体中，然后再将制得的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）投入到水体中，由于工程性强成膜细菌本身具有强成膜性，因此工程性强成膜细菌会在填料上成膜，能够促使其在水体中结合土著菌形成稳定生物被膜群落，而工程性强成膜细菌菌体内携带的降解性质粒（pCDFduet-MH）能通过基因水平转移（HGT）进入在生物被膜群落中各种不同种属的土著菌体内，提高了单加氧酶和双加氧酶两种限速酶表达量，从而促进了对硝基苯酚（PNP）的代谢，提高了降解效率。
本发明的对硝基苯酚的生物降解主要包括两个过程，初始的羟基化反应和芳香环的断裂反应，其中生成的各类中间化合物最终通过三羧酸循环生成CO2和H2O。加氧酶是这两个反应过程中关键酶类，其中单加氧酶能够把氧分子中的一个还原成水，并将另一个氧原子直接加到有机分子上，进行羟基化反应；双加氧酶能催化氧分子中的两个氧原子同时加到苯环上生成邻苯二酚类物质，后继的氧化反应使得苯环断裂。双加氧酶在降解芳香族化合物种起到决定性的作用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种针对PNP的高效生物性降解方法，通过构建PNP降解性质粒，导入强成膜菌中，形成工程性强成膜菌，将该工程性强成膜菌投加至工业废水后，其强成膜性促使它能在水体内结合土著菌形成稳定的生物被膜，避免水流冲击流失，再借助生物被膜内水平转移作用，把其体内的降解性质粒转移至土著菌体内，这样不仅能够明显提高生物被膜的降解能力，大幅提高降解效率，而且生物性降解法的环境相容性高，可以避免二次污染，有效地保护了环境。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的降解性质粒结构示意图；
图2为本发明的绿色荧光蛋白基因检测结果图；
图3为本发明在实验室微反应器内的PNP降解速度曲线图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
参见图1所示，一种对硝基苯酚的快速降解方法，具体步骤如下:
步骤1）利用基因工程技术构建降解性质粒。
以Methylobacterium sp.C1为例，Methylobacterium sp.C1是苏州大学环境微生物实验室早期分离到的一株对硝基苯酚的降解菌，是第一个被报道的类属于甲基杆菌属的对硝基苯酚降解菌。
对该对硝基苯酚降解菌（Methylobacterium sp.C1）进行基因测序，得知其基因组内含有降解功能的基因岛，从中克隆出单加氧酶基因（以4-nitrophenol monooxygenase为例）和双加氧酶基因（以hydroxyquinol 1,2-dioxygenase为例）；通过基因工程技术，将单加氧酶基因和双加氧酶基因克隆进组成型表达质粒，构建成一个含有单加氧酶和双加氧酶的双酶组成型表达质粒；将该双酶组成型表达质粒导入大肠杆菌体内，检测其降解活性，最终形成一个如图1所示的降解性质粒（pCDFduet-MH）。
步骤2）降解性质粒导入强成膜细菌菌体内，制备工程性强成膜细菌。
以Pseudomonas putida M9为例，Pseudomonas putida M9是苏州大学环境微生物实验室早期分离另一株功能细菌，具有通常较强的共凝聚能力，是一株革兰氏阴性细菌，其强的成膜性有利于稳定的生物被膜的形成。
将构建好的降解性质粒（pCDFduet-MH）经电击转化（2.1kv，1s）的方式转移至强成膜细菌（Pseudomonas putida M9）菌体内，利用抗生素平板选择性培养筛选，参见图2所示，检测绿色荧光蛋白（GFP）基因鉴定，得到阳性克隆的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）。
步骤3）工程性强成膜细菌投入废水中降解对硝基苯酚。
先将填料投加到被对硝基苯酚污染的水体中，然后再将制得的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）投入到水体中，由于工程性强成膜细菌本身具有强成膜性，因此工程性强成膜细菌会在填料上成膜，能够促使其在水体中结合土著菌形成稳定生物被膜群落，而工程性强成膜细菌菌体内携带的降解性质粒（pCDFduet-MH）能通过基因水平转移（HGT）进入在生物被膜群落中各种不同种属的土著菌体内，提高了单加氧酶和双加氧酶两种限速酶表达量，增加了该群落降解底物的能力，从而促进了对硝基苯酚（PNP）的代谢，提高了降解效率。
本发明的对硝基苯酚的生物降解主要包括两个过程，初始的羟基化反应和芳香环的断裂反应，其中生成的各类中间化合物最终通过三羧酸循环生成CO2和H2O。加氧酶是这两个反应过程中关键酶类，其中单加氧酶能够把氧分子中的一个还原成水，并将另一个氧原子直接加到有机分子上，进行羟基化反应；双加氧酶能催化氧分子中的两个氧原子同时加到苯环上生成邻苯二酚类物质，后继的氧化反应使得苯环断裂。双加氧酶在降解芳香族化合物种起到决定性的作用。
本发明通过在实验室条件下构建微反应器内，其内投加工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH），与对照相比，验证本发明生物降解对硝基苯酚（PNP）的。具体实验方法如下：
1、材料
1.1活性污泥采自苏州市城东污水处理厂。
1.2培养基
无机盐培养基（MM）（g/L）：
pH 7.0-7.2、NH4NO3 1.0g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 1.5g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO40.2g/L；
PNP合成废水：
MM、葡萄糖 0.1g/L、蛋白胨 0.1g/L、PNP 600mg/L。
2、方法
2.1 菌悬液的制备
将保存的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）在LB培养基中进行活化，然后接种到三角瓶中，30℃、120rpm震荡培养24h；然后将培养液分装到离心管中，6000rpm离心10min，去上清，用生理盐水洗涤两次后重悬；最后，调节OD600至1.0左右备用。
2.2序批式膜反应器
2.2.1序批式膜反应器设置
序批式反应器是用5L，有效体积4L的矿泉水桶，多空悬浮球填料填充30%；设纯污泥组、M9（强成膜菌）+污泥组、M9-pCDFduet-MH（工程性强成膜细菌）+污泥组三组实验，每组设三个平行实验。
2.2.2反应器的挂膜培养
反应器1：活性污泥；
反应器2：活性污泥+ M9；
反应器3：活性污泥+M9-pCDFduet-MH；
其中，反应器2中添加600mL新鲜的M9菌悬液（OD600=1）；反应器 3中添加600mL新鲜的M9-pCDFduet-MH菌悬液（OD600=1）,然后挂膜培养，每天更换2L水。
2.2.3反应器的运行
经过5d的挂膜培养后，三个反应器均排空，并加入新鲜的PNP合成废水，定时取样检测水中的PNP含量。生物被膜培养和反应器运行的过程中，温度均控制在30-32℃。
2.2.4反应器出水水质的测定
出水中PNP的浓度测定采用分光光度法，于397 nm处测定吸光值。
3、实验结果
参见图3所示，在反应开始后的24h内，由于活性污泥的自身的降解作用，各反应器内PNP浓度均有下降，反应器3内的PNP浓度和反应器2内的PNP浓度均在进行平稳下降，且在这一阶段M9-pCDFduet-MH的PNP降解速度略快于野生型M9的PNP降解速度；当反应进行到24-40h时，反应器3内的PNP浓度相比与反应器2内的PNP浓度出现明显下降，说明在这一阶段M9-pCDFduet-MH的PNP降解速度远远快于野生型M9的PNP降解速度；当反应进行到40-48h时，反应器3内的PNP浓度几乎为零，反应器2的PNP浓度还处于180-80mg/L之间，说明在这一阶段M9-pCDFduet-MH已经将PNP降解完毕，而野生菌M9，包括对照还需要更多的时间进行PNP降解，说明携带的单加氧酶和双加氧酶基因的工程性细菌（M9-pCDFduet-MH）促进废水中PNP降解。
上述实验可以充分证明，与对照相比，采用本发明制备的工程性强成膜细菌（M9-pCDFduet-MH）进行PNP降解的速度明显更快，大大提高了PNP的代谢速率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种对硝基苯酚的快速降解方法，其特征在于，具体步骤如下:
步骤1）利用基因工程技术构建降解性质粒；
对对硝基苯酚降解菌进行基因测序，确定其基因组内含有的降解功能的基因岛，从中克隆出单加氧酶基因和双加氧酶基因；通过基因工程技术，将单加氧酶基因和双加氧酶基因克隆进组成型表达质粒，构建成一个含有单加氧酶和双加氧酶的双酶组成型表达质粒；将该双酶组成型表达质粒导入大肠杆菌体内，检测其降解活性，最终形成一个降解性质粒；
步骤2）降解性质粒导入强成膜细菌菌体内，制备工程性强成膜细菌；
将构建好的降解性质粒经电击转化的方式转移至强成膜菌体内，利用抗生素平板选择性培养筛选，检测绿色荧光蛋白基因，鉴定得到阳性克隆的工程性强成膜细菌；
步骤3）工程性强成膜细菌投入废水中降解对硝基苯酚；
先将填料投加到被对硝基苯酚污染的水体中，然后再将制得的工程性强成膜细菌投入到水体中，由于工程性强成膜细菌本身具有强成膜性，因此工程性强成膜细菌会在填料上成膜，促使其在水体中能够结合土著菌形成稳定生物被膜群落，而工程性强成膜细菌菌体内携带的降解性质粒能通过基因水平转移进入在生物被膜群落中各种不同种属的土著菌体内，提高了单加氧酶和双加氧酶两种限速酶表达量从而促进了对硝基苯酚的代谢，提高了降解效率。
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