CN114641576A - 生物膜转化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于用异源核酸转化生物膜的宿主细胞的方法，其中，该宿主细胞在该生物膜的细胞外基质内，该方法包括：将该异源核酸添加至该生物膜；和在该异源核酸的存在下，向该生物膜施加惯性空化以促进用该异源核酸转化该生物膜内的宿主细胞。本发明还涉及用于转化生物膜的宿主细胞的相关方法、用途和试剂盒。

Description

生物膜转化
本发明涉及用完整生物膜内的异源核酸转化宿主细胞、用于转化的相关试剂、转化机制和该方法的工业应用。
生物膜是一种或多种类型的微生物诸如细菌、真菌和原生生物的群落，其可以在许多不同表面上形成。生物膜可以在包括植物和动物组织、水下、地上和海底热液附近的各种环境，中形成。适合形成生物膜的环境的共同特征是水分的存在。虽然一些生物膜被认为是不利的或有害的，诸如牙菌斑或在可植入医疗装置(例如起搏器)上形成的生物膜，但其他的被认为是有用的并可用于工业目的(例如生物修复)。
生物修复是使用生物机体或其产物来处理或降解有害化合物。生物膜目前用于诸如废水处理工艺和去除有害物质诸如重金属污染物、爆炸物和放射性物质。由于工业流出物的多变性质，需要改造生物膜的特性，使它们能够适应以变得更有承受力、处理特定污染物或被杀死。生物膜包括多种不同的组分，诸如细胞外聚合物质(EPS)，其使生物膜能够粘在一起，并充当抗UV、抗菌剂和漂白剂的保护屏障；耐药株，其是不分裂的并且对许多抗生素具有耐药性的细菌细胞；和休眠细胞，其不是由需要一定水平的细胞活性的抗生素靶向的。这导致在不需要首先破坏生物膜的情况下难以调节或完全破坏的细胞群落。
生物膜也是机体的重要特征。尤其，复杂和多变的部位依赖性细菌生态系统存在于整个人胃肠道中，并且生物膜生物被认为在调节宿主的免疫系统和导致一些慢性炎性疾病中很重要(Macfarlane et al.Adv Appl Microbiol.2011；75:111-43.doi:10.1016/B978-0-12-387046-9.00005-0，其通过援引并入本文)。在胃肠道病症诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩病)中，已经示出微生物群落结构中存在生态失调，并且存在推定的保护性粘膜生物诸如双歧杆菌的减少。因此，对粘膜群落的操纵可以有助于恢复肠道的正常功能性，从而改进宿主的免疫状态和整体健康。
将DNA转化至细胞是分子克隆的基本技术，并且已彻底改变分子生物学。然而，在环境微生物学中，自然环境中的绝大多数原核生物(>99％)是不可培养的，并且因此不适合使用传统的培养依赖性DNA递送方法进行DNA递送。即使能够将原核生物能够体外培养时，由于缺乏有效、非侵入性和简单的DNA递送方法，基因操纵经常受到阻碍。
用于细菌DNA转化的生物学方法包括缀合、基因转化和转导。基因转化的物理方法包括微注射、粒子轰击、电穿孔、激光照射和超声声致孔。在实践中，用于细菌基因转化的最常使用的方法是缀合和电穿孔，连同主要用于大肠杆菌(E.coli)细胞的热激转化。缀合和转导通常需要特定DNA供体或宿主菌株来实现细菌DNA转化，而基因转化限于少数天然感受态组。电穿孔效率高，但需要低离子强度介质和高电压进行操作。这两种方法均不适用于将DNA递送至生物膜中的细胞中，而不基本上破坏生物膜的结构。
近年来，超声DNA递送(UDD)作为质粒或DNA片段递送的方法已被深入研究。虽然UDD的确切机制仍难以确定，但超声的高频振动可能产生细胞的不均匀拉伸和压缩，从而在细胞膜中物理生成可逆和瞬时孔隙率。超声诱导的气体和蒸汽腔形成更有可能导致空间局部化的高能量现象诸如冲击波,而不对细胞膜施加压力，可以破坏边界层的微流，以及可以刺穿细胞膜的微喷射。UDD的吸引力之一在于，理论上它可以将DNA或RNA递送至任何类型的细胞，包括细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞。然而，UDD的主要缺点是转化靶细胞或宿主细胞的较高效率伴随较低存活率以及宿主中转化DNA和DNA两者的破坏。例如，关于涉及1MHz超声处理的超声处理技术参见Han W.Y.等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology,June 2007,p.3677-3683,Vol.73,No.11)报告，并发现靶标具核梭杆菌(Fuscobacterium nucleatum)经受双交叉等位基因交换，并且转化率为0.05/μg DNA。这些水平极低，并且即使在那时也需要使用造影剂。
专利GB 2452543中已描述用异源核酸转化浮游细菌细胞的工艺，理论上推断包括源自生物膜的那些。该工艺需要在用异源核酸超声辅助转化之前提取和洗涤生物膜细胞。虽然GB 2452543教导的技术可用于转化从生物膜中提取的细胞，但其应用受到限制。这是因为生物膜在细胞转化之前被破坏，这意指需要破坏已建立的生物膜。这种转化的细胞也难以接种回已建立的生物膜中。转化的生物膜衍生的细胞可用于建立新生物膜，但是这是耗时且效率低的。
需要转化生物膜细胞的改进方法，使得可以基因操纵生物膜。因此，本发明的目的是提供生物膜细胞转化的改进方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于用异源核酸转化生物膜的宿主细胞的方法，其中，所述宿主细胞在所述生物膜的细胞外基质内，所述方法包括：
-将异源核酸添加至所述生物膜；和
-在所述异源核酸的存在下，向所述生物膜施加惯性空化以促进用所述异源核酸转化所述生物膜内的宿主细胞，
本发明有利地提供了原位转化生物膜中的细胞的能力，而未导致生物膜的破坏或重建。本发明利用惯性空化，这是其中液体中压力的快速变化导致在压力相对较低的地方形成小的充满蒸汽的腔的现象。当受到更高压力时，被称为“鼓泡”或“气孔”的这些腔坍塌并可以生成强烈的冲击波。不受理论束缚，这种空化冲击波具有充分破坏生物膜和生物膜中的细胞膜以促进转化的能力，但重要的是它可以避免生物膜本身的解体。除了避免破坏生物膜以转化细胞外，生物膜本身还可以原位转化。原位转化生物膜的能力开辟了改造具有在工业过程中极少或没有停机时间的生物膜特性的可能性。先前的方法依赖于生物膜的破坏并且需要提取细胞、转化，并且然后重建生物膜，这既费时并且在不存在功能性生物膜的情况下导致更长的停机时间。
生物膜位置
在一种实施方式中，生物膜是原位的。例如，生物膜可以在其自然环境中。术语原位理解为意指生物膜不从其建立的位置提取/移除。
生物膜可以位于可以暂时封闭或至少部分封闭的任何位置，使得异源核酸可以被孵育，而不被洗掉，并且随后暴露于超声。
生物膜可以是在生物膜可以有益于自然或工业过程(例如净化过程)的任何位置的生物膜。在另一实施方式中，生物膜可能是非期望的，例如在生物淤积的情况下，其中需要控制、减少或消除生物膜。
生物膜可以在水道中，诸如在管道中。水道可以是开放的，诸如通道，或封闭的，例如管道中。水道可以是天然的或人造的。生物膜可以位于水下表面上或在气液界面(即表膜)中。生物膜可以在油或水进料中。在一种实施方式中，生物膜在自然环境，诸如水流、河流或水体，诸如池塘、湖泊、水库或海洋中。
在一种实施方式中，生物膜在废水处理流中，例如使进料水流过其中。在另一实施方式中，生物膜可以是在油或汽油流，诸如油或汽油管道中。
在另一实施方式中，生物膜可以在污染位点，诸如油或汽油污染位点。生物膜可以是在生物膜支持的浸出过程中，诸如堆置浸出，例如包括氧化矿石的细菌的生物膜，释放水溶性金属诸如铜离子(铜)。
在另一实施方式中，生物膜可以在反应器中，例如在家庭或工业废水处理厂中。例如，生物膜可以在分散/悬浮生长系统诸如活性污泥系统或扩展曝气系统中，或者生物膜可以是在附着生长系统诸如滴滤池、旋转生物接触器(RBC)系统或膜生物反应器中。
在另一实施方式中，生物膜可以是在包括受污染含水层、管道、船或艇的本体、土壤团粒、植物叶表面和植物根的任何组中。
在一种实施方式中，生物膜在微生物燃料电池(MFC)中。技术人员将认识到微生物燃料电池是生物电化学系统，其通过使用细菌和高能氧化剂(诸如O)来驱动电流，例如模拟自然界中发现的细菌相互作用。在MFC中，由从所述阳极室(负极柱)中的底物氧化的细菌释放的电子通过导电材料转移至所述阴极室(正极柱)。在阴极中，电子与氧结合并且质子通过质子交换膜扩散。
本发明认识到生物膜存在于体内，诸如遍及身体的胃肠道。因此，在一种实施方式中，生物膜可以在体内，例如在受试者的胃肠道中。本发明的方法可以在体内实施。生物膜可以在哺乳动物受试者诸如人或非人动物的胃肠道内。非人动物可以是牲畜或家畜。
生物膜特性
生物膜可以是完整的(例如，向生物膜施加惯性空化之前，它先前尚未被破坏)。生物膜可以包括以下项或者由以下项组成：细菌细胞或者细菌和真菌和/或原生生物细胞的组合。宿主细胞可以是细菌细胞，例如生物膜的细菌细胞。在另一实施方式中，宿主细胞可以是真菌或抗性的(protest)。
生物膜的细菌可以包括能够形成生物膜的任何细菌。生物膜的细菌可以包括产生细胞外聚合物质的细胞外基质并且可以驻留在细胞外聚合物质的细胞外基质内的任何细菌。细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性，或其混合物。细菌可以是蓝细菌(cyanobacteria)。革兰氏阳性细菌可以包括选自以下项的任何细菌的组：芽孢杆菌属(Bacillus spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp)和乳酸菌(诸如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))，或其组合。革兰氏阴性细菌可以包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和/或假单胞菌属(Pseudomonas spp.)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。假单胞菌属可以是恶臭假单胞菌(P.putida)，诸如恶臭假单胞菌UWC1。
生物膜的细菌可以包括希瓦氏菌属(Shewanella spp.)，诸如奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)。在一种实施方式中，生物膜的细菌包括奥奈达希瓦氏菌MR-1。
技术人员将认识到生物膜中细菌的成功转化取决于所选择的质粒，并且预期使用合适的质粒。域技术人员将进一步理解，虽然许多不同类型的细菌可以摄取选择的质粒，但仅那些可以利用该质粒的细菌才将引发表型或功能变化。
在一种实施方式中，待转化的细菌种属可以是选自包括以下项的组的任何细菌种类：芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium spp)、栖热菌属(Thermus spp)、假单胞菌属、醋杆菌属(Acetobacter spp)、微球菌属(Micrococcus spp)、明串珠菌属(Leuconostoc spp)、希瓦氏菌属、埃希氏菌属(Escherichia spp)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus spp)，或其组合。待转化的细菌可以选自变形菌(Proteobacteria)、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，或其组合。假单胞菌属可以是恶臭假单胞菌，诸如恶臭假单胞菌UWC1。
在其中待转化的细菌种类是肠道细菌的实施方式中，待转化的细菌可以是选自包括以下项的组的任何细菌：变形菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，或其组合。在其中待转化的细菌是肠道细菌的实施方式中，待转化的细菌可以是病原菌。替代地，在其中待转化的细菌是肠道细菌的替代实施方式中，待转化的细菌可以是硬壁菌(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes)、放线菌(Actinobacteria)、变形菌。在其中待转化的细菌是肠道细菌的实施方式中，待转化的细菌可以是选自以下项的属：拟杆菌属、梭菌属、粪杆菌属真杆菌属(Faecalibacterium Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、埃希菌属和乳杆菌属。
生物膜的内容物可能是未知的，或部分未知的。例如，生物膜中存在的细菌种类在转化之前可能是未知的。异源核酸可以适用于转化和用于一种或多种不同的细菌种类，诸如多种细菌种类。在一种实施方式中，异源核酸可以普遍适用于转化和用于所有已知的细菌种类。将适用于转化理解为意指核酸在待转化的宿主细胞中具有功能，使得它具有期望作用。例如，核酸可以被甲基化以保护它一旦被内化到细胞中而不被降解。在另一实施方式中，任何启动子、编码基因、编码多肽或调控元件可以在细胞中具有功能。
在其中生物膜包括生物或种类的混合物的实施方式中，不同的生物或种类可以在生物膜中作为单独的小菌落、作为共聚集，或者它们可以是分层的。
在一种实施方式中，生物膜的细菌能够氧化还原(在根据本发明的转化之前和/或之后)以在微生物燃料电池(MFC)中发电。在一种实施方式中，生物膜的细菌具有细胞外电子传递途径(在根据本发明的转化之前和/或之后)以在微生物燃料电池(MFC)中发电。
惯性空化
惯性空化可以是声学诱导的。在一种实施方式中，惯性空化包括惯性声空化。技术人员将能够容易地为给定的生物膜情况提供惯性空化。例如，可以用超声诱导惯性声空化，由此以适当频率施加的超声将使生物膜区中的液体达到空化阈值。技术人员还将认识到，在生物膜中达到空化阈值所必需的超声参数可以取决于周围液体的确切性质、存在用于成核的颗粒以及生物膜的形状和大小而变化。
在一种实施方式中，空化活动的水平例如通过感测声空化噪声来监测，并且可以将该信息用于实时调整暴露参数。
在使用超声诱导惯性空化的实施方式中，可以从超声发生器施加超声。超声发生器可以包括产生1kHz至2MHz这件或更高的超声频率的仪器。一个或多个超声发生器可以保持在足够靠近生物膜的位置以有效地向生物膜施加惯性空化。
在生物膜在体内的实施方式中，超声发生器可以以胶囊提供以被吞咽并穿过胃肠道。在另一实施方式中，可以提供超声内镜探头以在生物膜中诱导惯性空化。
取决于声场的空间分布，由超声诱导的惯性空化可以施加于生物膜的面积或体积，而声场的空间分布又取决于声频、压力幅度以及暴露容器和超声发生器的几何形状。可以通过改变频率和超声发生器几何形状，以及通过使用多个发生器以增加范围和覆盖，来定制可以经受惯性空化的生物膜面积和体积的范围以满足用户的需求。
目的可能是将所有生物膜暴露于惯性空化和质粒，以增加转化细菌的百分比。转化效率为约10-5％，但由于选择压力，转化的细胞将生长超过未转化的细胞，以最终改变生物膜的特性。技术人员将认识到，在许多情况下，生物膜中仅需要小百分比的抗性细胞(<1％)来赋予整个生物膜具有抗性特征。因此，生物膜内小百分比的细胞的转化可以引起整个生物膜的表型和功能性的变化。
所述方法可以包括在添加异源核酸和施加超声之间的孵育时期。孵育时期可以为至少30秒。在另一实施方式中，孵育时期可以为至少1分钟。在另一实施方式中，孵育时期可以为至少3分钟。在另一实施方式中，孵育时期可以为至少5分钟。在另一实施方式中，孵育时期可以为至少10分钟。在另一实施方式中，孵育时期可以为约15分钟或更长。在另一实施方式中，孵育时期可以为约5秒至30分钟。在另一实施方式中，孵育时期可以为约5秒至20分钟。
围封物
在一种实施方式中，将生物膜或其部分通过围封物封闭并且将异源核酸被添加至围封物中用于转化。在一种实施方式中，当将异源核酸添加至生物膜时，向生物膜施加围封物。在已添加异源核酸之后的孵育时期期间，围封物可以保持在生物膜上的位置。围封物内的孵育时期可以为至少30秒。在另一实施方式中，围封物内的孵育时期可以为至少1分钟。在另一实施方式中，围封物内的孵育时期可以为至少3分钟。在另一实施方式中，围封物内的孵育时期可以为至少5分钟。在另一实施方式中，围封物内的孵育时期可以为至少10分钟。在另一实施方式中，围封物内的孵育时期可以为约15分钟或更长。可以在围封物内的孵育时期期间或之后施加超声。可以在移除围封物之前施加超声。
封闭生物膜或其部分有利地包含异源核酸以防止其从生物膜分散开。这在流动系统中，诸如在流动管道内，特别有益，以避免异源核酸被冲走。如果生物膜体积小于生物膜周围总液体体积的～5％，则提供围封物可以是更有利的，以减少使用的质粒的量并降低操作成本。在其中生物膜体积百分比大于总液体体积的5％或在其中操作成本不是其采用的主要关注的实施方式中，诸如在活体肠道中使用的医疗应用中，不能使用超出天然肠道壁的额外的围封物。
如果生物膜体积小于生物膜周围总液体体积的约5％，则可以使用围封物。
围封物可以包括不透水或部分可渗透的屏障，诸如玻璃、陶瓷、塑料或橡胶。围封物可以阻止核酸(诸如质粒)通过，但可以是可渗透水的。可以使用材料诸如阻止质粒但可渗透水的膜。围封物可以是端部开口的容器，诸如可以保持在生物膜上方的杯子或圆顶。例如，围封物可以是容器，该容器可以在原位保持与表面相对以封闭生物膜或其部分，并防止异源核酸免于分散开。在一种实施方式中，围封物至少部分是柔性的。围封物的柔性部分可以是被布置成接触生物膜表面或生物膜所在的表面上的部分。例如，围封物的边缘可以是柔性的或以其他方式贴合形状的，例如当被保持与表面相对时。围封物的柔性可以使其能够例如与表面原位贴合。
围封物可以包括用于将异源核酸和/或其他物质施用/递送至围封物中的进入端口。另外地或替代地，围封物可以包括次级围封物，所述次级围封物被布置成将异源核酸和/或其他物质保留和释放至所述围封物中。
技术人员将认识到围封物的大小取决于生物膜的大小或待转化的生物膜的面积。可以将它用于将生物膜与大部分的周围液体内容物分离。因此，在一种实施方式中，围封物的大小为约0.5cm3至约250cm3。在另一实施方式中，围封物的大小为约0.5cm3至约500cm3。在另一实施方式中，围封物的大小为约0.5cm3至约300cm3。在另一实施方式中，围封物的大小为约250cm3至约350cm3。在另一实施方式中，围封物的大小为约300cm3。
在一种实施方式中，将围封物附接至超声发生器。超声发生器可以被围封物包围，使得它伸进围封物中。在另一实施方式中，将围封物附接至一个或多个超声发生器。技术人员将认识到，所需发生器的数量取决于超声发生器的有效覆盖/范围和围封物的大小。
异源核酸
异源核酸可以是DNA或RNA。另外地或替代地，异源核酸可以包括核苷酸类似物，诸如锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)、吗啉和肽核酸(PNA)。
在一种实施方式中，异源核酸是质粒或载体。质粒可以是细菌质粒。在另一实施方式中，异源核酸可以是线性的。
异源核酸可以以至少约0.1至约10ng/μL封闭体积的浓度提供。
异源核酸可以编码能够修饰宿主细胞表型(即能够基因修饰)的基因和/或调控元件。异源核酸可以被布置成敲除宿主细胞的宿主细胞基因或其调控序列。异源核酸可以编码多于一种基因和/或调控元件。异源核酸可以是细菌来源或序列，或者可以被布置成在细菌细胞中表达多肽。异源核酸可以编码能够修饰细菌宿主细胞表型(即能够基因修饰)的细菌基因和/或细菌调控元件。
异源核酸可以编码基因和/或调控元件，该基因和/或调控元件参与以下项或者被布置成以下项：修饰、群体感应、细胞代谢、热/寒抗性、热激抗性、化学抗性、抗生素抗性、细胞聚集、细胞粘附、细胞输出、膜转运分子、细胞或EPS分散酶和应激调节子；或其组合。
异源核酸可以编码基因和/或调控元件，该基因和/或调控元件参与以下项或被布置成以下项：选自表面活性剂、脂质、多糖、蛋白和DNA的修饰、宿主细胞代谢、产生或输出。异源核酸可以编码基因和/或基因的调控元件，其可以促进污染物的代谢和/或对污染物的抗性。异源核酸可以编码基因和/或基因的调控元件，其可以促进石油烃和/或氯化有机物的代谢和/或对石油烃和/或氯化有机物的抗性。
异源核酸可以编码酶、膜转运蛋白、孔分子和/或与其相关的调控元件。
基因修饰可以包括增强基因或表型特性。尤其，可以增强宿主细胞的所述基因或表型特性，例如通过增加或减少基因表达。
异源核酸可以编码选自包括以下项的任何组的基因和/或基因的调控元件：蛋白降解酶，诸如蛋白酶和肽酶；多糖降解酶和寡糖降解酶，诸如内切纤维素酶、几丁质酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、N-乙酰基-β-d-氨基葡糖苷酶、壳二糖苷酶(chitobiosidase)和β-葡糖醛酸糖苷酶；脂质降解酶，诸如脂肪酶和酯酶；磷酸单酯酶，诸如磷酸酶；氧化还原酶，诸如酚氧化酶、过氧化物酶；和细胞外氧化还原活性；或其组合。
基因和/或基因的调控元件可以编码选自包括以下项的组的一种或多种功能：放射性化合物降解、金属氧化或还原、芳族化合物降解、表面活性剂产生或降解、核酸酶抗性、抗微生物剂抗性、金属抗性、芳族化合物抗性、表面活性剂抗性、生物膜粘性变化、促进/防止生物膜扩散、产生光/荧光发光物质、产生有机物质、产生有机金属物质、产生聚合物质和产生能源(诸如生物燃料、沼气、生物电等)。技术人员将认识到这些特征不包括转化的生物膜的功能的详尽列表，并且可以取决于生物膜的预期用途来选择由基因和/或调控元件编码的功能。
该基因可以编码酶。该基因可以编码选自包括以下项的组的酶：P450、细胞色素、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。
异源核酸可以编码氧化还原途径(诸如细胞外电子传递途径)的一种或多种或所有组分。异源核酸可以编码黄素合成途径的一种或多种或所有组分。例如，异源核酸可以编码基因簇ribADEHC，或其一个或多个个体基因。基因簇ribADEHC可以从任何合适的细菌诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))克隆。在另一实施方式中，异源核酸可以编码mtrCAB途径(细胞外电子传递途径)的一个或多个或所有组分。
异源核酸可以被布置成促进生物膜中选定的细菌种类相对于其他种类的存活或生长。例如，在特定种类对工业过程有益的情况下，促进该过程的种类对于在生物膜中存活或生长可能是提升的。
异源核酸可以进一步编码选择标志物和/或报道基因。选择标志物可以是抗生素抗性基因，诸如对卡那霉素的抗性。报道基因可以包括荧光标志物，诸如GFP或荧光素酶。可以将选择标志物和/或报道基因用于确定转化是否成功和/或维持对生物膜中修饰细胞的选择)。本文的方法或用途可以包括使用选择压力来选择生物膜中的成功转化体。异源核酸可以被布置成插入或另外敲除可以用作转化标志物的基因或调控序列。技术人员将认识到选定标志物或报道基因的选择取决于转化的生物膜的预期应用。
在一种实施方式中，异源核酸可以包括与宿主细胞核酸同源的同源序列。例如，可以提供同源序列用于同源重组，以将异源核酸整合至宿主细胞核酸，诸如染色体中。这种异源重组可以是插入功能基因和/或创建宿主细胞的一种或多种基因的敲除突变体。
异源核酸可以具有用于转化的任何适合大小。在一种实施方式中，异源核酸为500bp至20kbp之间。在另一实施方式中，异源核酸为1kbp至15kbp之间。在另一实施方式中，异源核酸小于40kbp、30kbp或20kbp。
其他方法变量
可以向在CaCl2溶液中的生物膜施加异源核酸。CaCl2溶液可以以约50mM的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约10mM至约200mM之间的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约10mM至约150mM之间的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约10mM至约100mM之间的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约20mM至约80mM之间的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约30mM至约70mM之间的浓度提供。在另一实施方式中，CaCl2溶液可以以约40mM至约60mM之间的浓度提供。
一旦实施转化，可以从生物膜中移除围封物。
转化后的生物膜特性
转化的生物膜可以包括转化的和未转化的细胞的混合物。当与未转化的生物膜相比，生物膜的修饰的功能性提高至少10％时，生物膜的转化被认为是成功的。例如，在进料溶液中引入/增加污染物浓度后，生物质损失减少≥10％。在另一个实例中，污染物降解增加≥10％。在一种实施方式中，并非生物膜的所有细胞均需要转化。例如，生物膜中小于5％的细胞可以被转化为具有抗生素抗性，以确保生物膜整体具有抗性。
生物膜中细胞转化的成功可以由其有益作用确定。例如，在工业废水处理厂中，当引入包含高于通常芳族化合物的水时，与未转化的对应物相比，成功转化的生物膜可以被认为能够存活并且不分离超过其生物质的30％。
其他方面
改造生物膜的方法
根据本发明的另一方面，提供了一种原位改造生物膜的方法，所述方法包括用异源核酸转化所述生物膜的细胞外基质内的宿主细胞，
其中，所述方法包括：
将所述异源核酸添加至所述生物膜，任选地在向所述生物膜施加的围封物内；和
在所述异源核酸的存在下，向所述生物膜施加惯性空化以促进用所述异源核酸转化所述生物膜内的宿主细胞，
其中，所述异源核酸编码能够修饰所述宿主细胞表型的基因和/或调控元件，或所述异源核酸被布置成敲除所述宿主细胞的宿主细胞基因或其调控序列。
在其中所述方法在体内(例如在哺乳动物受试者中)实施的实施方式中，所述方法可以是治疗性的或非治疗性的。
废水原料的净化方法
根据本发明的另一方面，提供了在废水处理过程中净化原料的方法，所述方法包括：
使所述原料流过生物膜，
其中，所述生物膜的细胞已被原位基因修饰以增加它们减少所述原料中污染物诸如芳族的能力，和/或增加所述生物膜对所述原料中污染物的抗性。
所述方法可以包括修饰根据本文中本发明的生物膜的细胞的步骤。修饰生物膜的细胞可以通过本文中本发明的方法提供。例如，可以封闭生物膜或其部分，并且可以将用于转化的质粒添加至封闭的生物膜中。所述方法可以进一步包括孵育封闭的生物膜和质粒，例如持续约15分钟，并且将封闭的生物膜和质粒暴露于超声。所述方法可以进一步包括从生物膜移除围封物并允许被污染的原料与生物膜相互作用。
该方法可以包括在生物膜的细胞转化之前和/或之后检测/监测原料中的污染物的步骤。
用于转化的质粒可以编码一种或多种基因或基因调控因子，其可以增加对污染物的抗性和/或增加生物膜降解污染物的能力。减少原料中的污染物可以包括降解污染物、螯合污染物、吸收污染物或转化污染物。例如，可以用编码异源多肽的核酸或编码用于上调内源多肽的调控元件的核酸转化生物膜的细胞，其中，这种多肽可以具有降解、螯合、吸收或转化污染物的能力。
根据本发明的另一方面，提供了修饰微生物燃料电池(MFC)的细菌的方法，其中，所述细菌在生物膜中，所述方法包括用编码氧化还原途径的一个或多个基因的异源核酸转化生物膜的细菌。
所述氧化还原途径可以是黄素生物合成途径。例如，异源核酸可以编码基因簇ribADEHC，或其一个或多个个体基因。基因簇ribADEHC可以从任何合适的细菌诸如枯草芽孢杆菌克隆。
根据本发明的另一方面，提供了一种从微生物燃料电池(MFC)发电的方法，所述方法包括：
-在所述MFC的阳极室中培养生物膜中的细菌，其中，所述生物膜的细菌已经用编码氧化还原途径的一个或多个基因的异源核酸转化；
-提供氧化剂和氧化底物，所述氧化剂和氧化底物是所述氧化还原途径的底物；
-通过以下发电：允许由从所述阳极室中的底物氧化的细菌释放的电子通过导电材料转移至所述MFC的阴极室，从而在所述阴极室中转移的电子与氧结合，并且质子通过质子交换膜扩散。
所述氧化还原途径可以是细胞外电子传递途径。
用途
根据本发明的另一方面，提供了在异源核酸的存在下，将对于生物膜的惯性空化用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的用途。
所述用途可以是用于原位转化生物膜的细胞。所述用途可以是用于在微生物燃料电池(MFC)中转化生物膜的细胞以用于发电。
试剂盒
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
-惯性空化发生器；
-围封物；和
-任选地，用于转化的核酸。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
-惯性空化发生器；
-用于转化的核酸；和
-任选地，围封物。
惯性空化发生器可以包括超声发生器。用于转化的核酸可以是细菌序列，或者被布置成表达细菌基因和/或细菌调控元件。
所述试剂盒可以进一步包括CaCl2。
所述试剂盒可以进一步包括用于确定成功转化的测试试剂盒，所属市测试试剂盒包括样品瓶和/或UV光(例如，如果使用荧光标志物，诸如GFP)。
根据本发明的另一方面，提供了微生物燃料电池(MFC)，其中，所述微生物燃料电池包括已经通过根据本文中所述方法用异源核酸转化至生物膜的细菌中而被修饰的生物膜。
微生物燃料电池(MFC)中生物膜的细菌可以用编码氧化还原途径(诸如细胞外电子传递途径)的一种或多种或所有组分的核酸转化。所述氧化还原途径可以包括黄素生物合成途径。例如，异源核酸可以编码基因簇ribADEHC，或其一个或多个个体基因。基因簇ribADEHC可以从任何合适的细菌诸如枯草芽孢杆菌克隆。在另一实施方式中，微生物燃料电池(MFC)中生物膜的细菌可以用编码mtrCAB途径(细胞外电子传递途径)的一个或多个或所有组分的核酸转化。
定义
术语“生物膜”描述了微生物的任何共生群落，其中，组成细胞相互粘附，并且通常还粘附在界面，诸如气-液、气-固和液-固界面上。组成细胞变得嵌入在由组成细胞产生的细胞外聚合物质组成的粘稠细胞外基质内。生物膜可以包括单一种类或不同组的微生物。生物膜的微生物可以包括但不限于细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。
技术人员将理解生物膜的细胞外基质包括细胞外聚合物质(EPS)。EPS组分通常是细胞外多糖、蛋白、脂质和DNA的聚合聚集物(conglomeration)。
如本文所用，术语“异源核酸”涉及期望被整合至宿主细胞中的核酸长度。例如，核酸可以是DNA或RNA，并且范围可以从低聚物至质粒。实际上，本发明特别适合将质粒整合至宿主细胞中。尤其，异源核酸是期望被引入宿主细胞中的任何核酸，并且通常未已经存在于宿主细胞中，或者，如果存在，那么它以不同于被引入的形式存在。
术语“转化”涉及将核酸序列引入宿主细胞，并且转化的宿主可以具有例如作为游离质粒存在的核酸，或者可以将核酸整合至宿主基因组中。在任何情况下，除非另有要求，否则优选核酸与宿主基因组具有相同类型。因此，例如，通常优选用DNA转化哺乳动物细胞。然而，还优选核酸可以包括线性或环状DNA或RNA。
技术人员将认识到超声是频率高于人听觉的可听上限的声波。该限值因人而异，并且在健康的年轻人中为大约20千赫兹(20,000赫兹)。超声发生器的操作频率可以从20kHz至最高达几千兆赫。
技术人员将认识到，向液体介质施加足够强的超声可以导致形成高能气体和蒸汽腔，该过程被称为声空化。这些腔可以在空间上集中能量，生成声冲击波，诱导微射流形成，并诱导可以破坏边界层的微流。所有这些作用促进转染并且还可以诱导细胞死亡。
技术人员将理解，在适当的情况下，本发明的一种实施方式或方面的任选特征可以适用于本发明的其他实施方式或方面。
现将参考附图更详细地描述本发明的实施方式，仅作为实例。
图1–(A)在用以可移动杯形式的屏障封闭的开放表面上生长的生物膜的基于超声的转化。(B)在两端处的用可移动屏障封闭的管道内生长的生物膜的基于超声的转化。(C)在用可移动屏障封闭的罐内生长的生物膜的基于超声的转化。
图2–(A)显示不同实验条件下流通池中生物膜转化的实验。(B)在10s的40kHz超声处理并且用～1ng/mL质粒后的GFP信号(左)和PI信号(右)。(C)在10s的40kHz超声处理并且无质粒后的PI信号(右)和缺失GFP信号(左)。(D)在无超声处理并且无质粒后的PI信号(右)和缺失GFP信号(左)。(E)在无超声处理并且用～1ng/mL质粒后的PI信号(右)和缺失GFP信号(左)。所有实验均在添加包含质粒的0.3mL CaCl2下实施，如相关。
图3–流通池实验后的废物瓶。仅在用超声和质粒处理的流通池的废物瓶中看到生长。
图4–用超声转化后0-5h。在5h内，一些转化的细胞开始表达sfGFP，但细胞复制有限。左图像，白色是转化并已经表达sfGFP的细胞。
图5–用超声转化后24h。在培养基+Km中，更多转化的细胞表达sfGFP(左图像；白色)并且转化的细胞可能生长成微集落。
图6–用超声转化后48h。(A)更多细胞表达sfGFP并且转化的细胞可能生长在培养基+Km中，(B)更多细胞表达sfGFP并且转化的细胞生长培养基+Km中。sfGFP表达在左图像中示出为白色。
图7–用超声转化后5天。未转化的死细胞或持留细胞中生长的转化细胞。sfGFP表达在左图像中示出为白色，并识别转化的细胞。
图8–未用超声的转化后5天。未转化的死细胞或持留细胞层在培养基+Km中无sfGFP表达。
图9–培养基包含抗生素，用于选择生物膜内的转化细胞而不选择非转化细胞。在用质粒但未用超声处理的流通池的废培养基瓶中未检测到生长。这是原生生物膜能够获得新特性(例如抗生素抗性)的概念验证。
图10.用或不用超声处理的生物膜中转化细胞的百分比。在处理前，将生物膜与1ng/mL质粒和50mM CaCl2孵育10分钟。
图11.关于转化效率和惯性空化信号相对于电压的数据。施加至超声系统的电压决定了空化活动的水平，如宽带噪声所示，并表示为空化指数。从图中，空化指数和转化效率遵循相同趋势，其中较高空化伴随较高转化效率，这表明惯性空化参与了生物膜中细胞的转化。
图12.不同电压下空化水平的定性描述。
图13.系统的频率响应作为共振器中水听器位置(深度)的函数的图。水听器位于声学节点处，用于在81.4kHz下测量空化噪声(图中由黄色“+”指示)。共振器的顶部(水面)位于-8mm。
图14.在30V、60V和190V下测量的空化噪声实例。左图＝无空化，中图＝不明显，右图＝明显空化或强空化。
图15.在15–210V的驱动电平下测量的空化噪声频率谱。数字对应于定性标记为“无空化”(1和2)、“不明显”(3、4和5)和“明显空化”或“强空化”(6、7和8)的区域。低端频率响应下降是由于高通滤波器所致。
图16.空化指数作为驱动电压函数的图。
图17.基于超声的DNA递送(UDD)至在a)微流体流通池和b)微生物燃料电池(MFC)中建立的成熟生物膜的细菌细胞中的示意图。在市售的40kHz超声清洁浴中施加超声处理。图表未按比例绘制。
图18.在用a)添加质粒和超声处理两者(+P/+U)，b)仅添加质粒(+P/-U)，c)仅超声处理(-P/+U)和d)无质粒且无超声处理120h后生物膜样品的绿色荧光信号和明场成像。在e)5h、f)24h、g)48h、h)120h后添加质粒和超声处理两者的生物膜样品的绿色荧光信号和明场成像。
图19.a)电流密度(I)随时间的变化，b)极化曲线(电流密度相对于电位)和c)MFC反应器的功率曲线，使用奥奈达希瓦氏菌MR-1WT(1)、MR-1/YYDT-C5突变体(2)和MR-1Δbfe菌株(3)，以20mM乳酸钠作为唯一碳源。一旦在1kΩ电阻器上达到稳态电流(～第6天)，经由线性扫描伏安法(E开始＝0.8V，E终止＝0.0V，E阶跃＝0.1V，扫描速率＝0.1mV/s)进行测量。误差棒代表三次测量的标准偏差。d)利用奥奈达希瓦氏菌MR-1WT、MR-1/YYDT-C5突变体和MR-1Δbfe菌株，以20mM乳酸钠作为单一碳源，在MFC反应器的阳极培养物在600nm(OD600)处的光密度。使用1cm吸收池(1mL样品大小)进行测量。e)使用结晶紫测定的生物膜定量：来自MFC反应器的阳极生物膜细胞的细胞结合结晶紫溶液在595nm(OD595)处的光密度。f)每个反应器消耗的乳酸盐的量。产生的代谢物主要是醋酸盐，与痕量的琥珀酸盐和丙酮酸盐(数据未示出)。图d)、e)和f)中的测量在MFC实验结束时(第13天)进行。误差棒代表三次测量的标准偏差。棒顶部的P值表示基于嵌套混合因子ANOVA检验和Tukey’s HSD事后检验的样品对之间的差异。示出统计学显著性(p<0.05)差异的P值以粗体显示。
图20.a)在1kΩ负载下运行，乳酸钠初始浓度为20mM下，双室MFC反应器的电流密度(I)；b)MFC反应器操作14天后的细胞外黄素浓度。四种不同类型的反应器：MR-1/YYDT-C5菌株(MR-1/YYDT-C5_US,4)，MR-1WT添加质粒和超声处理(WT_P_US,1)，MR-1WT仅超声处理(WT_US,2)，以及WT仅添加质粒(WT_P,3)。在第6天(箭头-A)进行超声30s用于适当的MFC设置。在第9天，将卡那霉素(10μg/mL)和10mM的额外的乳酸盐添加至每个反应器中(箭头-B)。在第13天，添加额外的卡那霉素以达到50μg/mL的最终浓度(箭头-C)。阴影区域代表三次测量的标准偏差。棒顶部的P值在测量的最后一天计算，并且表示基于嵌套混合因子ANOVA检验和Tukey’s HSD事后检验的样品对之间的差异。示出统计学显著性(p<0.05)差异的P值以粗体显示。
图21.流通池在各种条件下的生长培养基输出：存在质粒用超声处理(+P/+U)、存在质粒未用超声处理(+P/-U)、不存在质粒用超声处理(-P/+U)，以及不存在质粒和超声处理两者(-P/-U)。
实施例
实施例1-概念验证研究
生物膜在四种流通池中生长72小时。每种流通池接受不同的处理以确定超声处理在完整生物膜转化中的有效性。实验中使用的质粒编码有绿色荧光蛋白(gfp)和卡那霉素抗性。流通池处理如下：
流通池1：将包含～1ng/mL质粒的0.3mL CaCl2添加至流通池中，随后的40kHz超声处理10秒。
流通池2：将不包含质粒的0.3mL CaCl2添加至流通池中，随后40kHz超声处理10秒。
流通池3：将不包含质粒的0.3mL CaCl2添加至流通池中。未进行超声处理。
流通池4：将包含～1ng/mL质粒的0.3mL CaCl2添加至流通池中。未进行超声处理。
处理后，将卡那霉素添加至生长培养基中以选择转化的细胞。为了进一步确认成功转化，用PI染色所有流通池，并在共聚焦激光扫描显微镜下成像，每个流通池使用相同设置。只有用质粒和超声两者处理的流通池1示出gfp的表达(图3)。将来自流通池的废物收集在废物瓶中，在实验后评估废物瓶的细胞生长。只有用质粒和超声两者处理的流通池1中的废物瓶示出细胞生长的证据(图4)，这表明流通池1中的细胞对卡那霉素具有抗性。
实施例2–转化后的gfp表达和细胞生长。
将在50mM CaCl2中的1ng/μl质粒(pBBR1.MCS_sfGFP，携带超折叠绿色荧光蛋白和卡那霉素(Km)抗性基因)引入流通池并孵育10分钟之前，生物膜在流通池中生长3天以达到成熟。孵育的时长取决于生物膜的厚度。孵育时期后，用42kHz超声处理流通池10s。将1/10Luria-Bertani肉汤(LB)以20mL/h重新引入流通池持续2小时，然后用Km(5μg/mL)以20mL/h替换1/10LB，持续5天。
图4显示在转化5小时内开始表达sfGFP的细胞的初始转化。在随后的48小时内确定sfGFP表达水平增加，并且在5天后，在生物膜中转化的sfGFP细胞中可以识别未转化的死细胞或持留细胞(persister cell)(图5-7)。暴露于质粒但未经超声处理的生物膜在5天后未示出转化证据(图8)，并且在连接流通池的废物瓶中未看到生长(图9)。图10示出了在有和没有质粒下超声处理后生物膜中转化的细胞占总细胞的百分比。
实施例3-生物膜中基于超声的转化机制
在向产生空化的不同量/强度(空化指数)的超声换能器施加的不同电压下测量细胞的转化效率。空化指数和转化效率之间存在强相关性，这表明空化是生物膜中基于超声的转化的关键机制之一。(图11)。
实施例4–80kHz共振器中的空化噪声测量
引言
目的是对80kHz共振器系统中的空化噪声进行定量测量，并补充图12中示出的描述。
使用的设备
函数发生器–LeCroy Wavestation 2022
功率放大器–Amplifier Research 75A250A
水听器–Dynasen CA1136-6”带有CA1146电缆
示波器–LeCroyLT344
电压探头–LeCroy PP006 10:1
电流探头–Pearson
方法
将换能器和喇叭(带O形环)完全插入共振器，在换能器上方至圆柱形共振器顶部留出3.5-4cm的空间。在室温下共振器充满有脱气的水。
将函数发生器(LeCroy Wavestation 2022)、衰减器(-20dB；Digi-Key367-1120-ND)和功率放大器(Amplifier Research 75A250A)用于以接近系统标称设计共振的频率(80kHz)激发换能器。在示波器(分别为CH1和CH2；LeCroy LT344)上监测驱动电压(10:1探头PP006，LeCroy)和电流(1Volt/Ampere；Pearson 6016)。将由0.05”直径×0.020”厚度的PZT圆盘(Dynasen CA1136-6”带有CA1146电缆)组成的探测器用作水听器以测量原位声压和空化噪声。将水听器信号馈送至有源高通滤波器(Krohn-Hite 34A；-24dB/倍频程)，具有的截止频率(-3dB)设置为1MHz，输出增益为+20dB，并在示波器(CH4；5MS/s,20us/div,4.5ms触发延迟)上数字化。
选择使用与水直接接触的水听器的方法是为了产生快速且可靠地测量空化噪声的目的。应当注意的是，声场中水听器的存在可以影响系统的共振行为和空化阈值。初步实验表明，这种方法产生的共振频率/阈值与移除水听器时观察到的一致，然而这种影响未经定量。将水听器放置在声学节点处，以将在基频处的驻波听觉信号对空化噪声检测的作用最小化。将系统调谐至“凭听觉”的最佳频率，使得在中等驱动电平(120V)下可以检测到空化噪声，但使得改变向上或向下频率(例如，由0.1kHz引起空化噪声关闭)。发现最佳频率为81.4kHz。在随后的试验中，观察到换能器的电流在81.3-81.4kHz的频率范围内经历了相变，证实这是系统的共振频率。系统的频率响应图表作为水听器位置的函数是作为健全性检查获得的，如图13中示出。频率谱是使用频谱分析仪(HP3585A)(具有跟踪发生器和驱动电压设置为低电平(+0dBm输出→-20dB衰减器→功率放大器处于最低增益))连同机器人定位系统(Velmex)和自动化MATLAB脚本一起获得的。
结果
空化噪声
测量的听觉信号在图14中示出，并且频率谱在图15中示出。在低驱动电平下的频谱峰值出现在驱动频率的倍数处，并且这可能是由于机械系统中的非线性生成的谐波(例如，类似于引起可听“系统噪声”的振动机制)或可能是由于在PZT圆盘传感器诸如径向模式或应变饱和中的非线性，。听觉观察包括在15V、30V和60V下可听到的高音高振铃(ringing)“系统噪声”。在90V和120V下，空化噪声是间歇性的，并且可以听到“系统噪声”，但不一定比较低电平下更大。在160V、190V和210V下观察到强空化噪声，并且“系统噪声”大部分被空化噪声所掩盖。
可以将空化指数用于帮助解释空化噪声数据。在此将空化指数定义为100kHz至2.5MHz之间频谱值的算术平均值，并定量由微泡坍塌生成的宽带噪声(Sabraoui 2011,Inserra 2014)。空化指数已通过取反对数以线性比例在图16中制图。
参考文献
Cochrane,J.An acoustic cavitation reactor for quantifying the effectof cavitation on cell suspensions.M.Eng.Report,W adham College,University ofOxford,2018.
Inserra C,Labelle P,Der Loughian C,Lee J-L,Fouqueray M,Ngo J,PoizatA,Desjouy C,Munteanu B,Lo C-W,Vanbelle C,Rieu J-P,Chen W-S,Béra J-C.Monitoring and control of inertial cavitation activity for enhancingultrasound transfection:The SonInCaRe project.IRBM 2014；35:94–99.
Sabraoui A,Inserra C,Gilles B,Bera JC,Mestas JL.Feedback loop processto control acoustic cavitation.Ultrason Sonochem 2011；18:589–94.
实施例2-生物膜工程化：基于超声的DNA递送(UDD)在已建立的生物膜中原位细菌转化中的应用
概要
增强原生和已建立的生物膜群落的能力长期以来一直是目标，但该技术仍难以掌握。在此项研究中，我们探索了基于超声的DNA递送(UDD)系统诱导由已建立生物膜的非感受态细菌细胞原位摄取质粒的潜力。将包含编码超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)和黄素合成途径的基因的DNA片段(即质粒)引入采用UDD分别在微流体流通池和微生物燃料电池(MFC)中培养的已建立的细菌生物膜中。观察到在已建立的生物膜中成功细菌转化的表型信号，其中，UDD处理的恶臭假单胞菌UWC1生物膜在流通池中产生绿色荧光信号，并且与对照组相比，UDD处理的奥奈达希瓦氏菌MR-1生物膜在MFC中生成更高的生物电生产。UDD的作用在选择压力下的后续生长中被放大。此项研究报告了用于首次对于环境、工业和医疗应用中已建立的生物膜的基因和表型控制而开发的扩展方法。
在此已开发更直接且紧密的方法来增强对许多工程化系统(例如生物反应器)的功能至关重要的生物膜。在先前的研究中，成功应用低频率40kHz超声将质粒转化至处于浮游状态的三种不同细菌种属中，获得基因摄取的高速率(9.8±2.3×10-6/mg)17。本研究的目的是确定基于超声的DNA递送(UDD)在用于微流体流通池和MFC中的生物膜的潜力，同时显示该技术的可扩展性。
结果
流通池生物膜中超声介导的DNA递送(UDD)
建立流通池系统以检查UDD将质粒转化至已建立的生物膜的有效性(图17a)。孵育3天后，UWC1生物膜在流通池中建立并在4种条件下处理：添加质粒且经超声处理两者(+P/+U)，仅经用超声处理(-P/+U)，仅添加质粒(+P/-U)，以及不添加质粒也不超声处理(-P/-U)。超声频率为40kHz。超声处理时间为10s。质粒pBBR1MCS-2_Plux_sfGFP(表1)包含广泛的宿主pBBR1骨架，并且超折叠gfp基因与组成型启动子融合。在添加质粒且经超声处理五小时后，在+P/+U生物膜样品中观察到绿色荧光信号的小斑点(图18e)，推测是由成功转化的UWC1细胞产生的。所有样品在包含卡那霉素的生长培养基的恒定流动下经历更长的孵育时期，以施加针对转化的细胞的选择压力，而不针对未转化的细胞。在+P/+U生物膜样品中在24小时后(图18f)形成绿色荧光信号簇，并且绿色荧光信号面积在48小时(图18g)和120小时(图18h)中持续扩大。在同一时期，未经超声处理(+P/-U，图2b)或未添加质粒(-P/+U，图2c)或未进行两者(-P/-U，2d)的样品没有示出sfGFP产生的迹象。还检查了流通池的生长培养基输出，并且仅+P/+U样品示出“浑浊”，表明细菌生长，而在其他样品中没有任何生长迹象(图21)。这表明已经发生超声介导的DNA递送转化质粒进入生物膜。
从四种处理中已建立的生物膜取出样品，并在具有卡那霉素的LB培养基中培养。仅+P/+U处理的样品可以生长，但其他三个对照的样品在卡那霉素的存在下不能生长。提取质粒，并且序列确认回收的质粒为pBBR1MCS-2_Plux_sfGFP。这些结果表明，细菌转化的发生需要超声和质粒两者，并提供了可以利用UDD对于在已建立的生物膜内原位细菌转化的概念验证。
黄素电子穿梭是奥奈达希瓦氏菌MR-1中电子转移的主要机制
在MFC系统中建立了奥奈达希瓦氏菌MR-1野生型(WT)、MR-1Δbfe(细菌黄素腺嘌呤二核苷酸[FAD]输出蛋白(exporter)的bfe基因敲除)18和MR-1/YYDT-C5(具有包含从枯草芽孢杆菌克隆的完整黄素生物合成基因簇ribADEHC的质粒pYYDT-C5的MR-1)19的生物膜。与MR-1Δbfe生成的稳态电流密度为7.6±0.1μA/cm2，以及MR-1/YYDT-C5突变体为31.5±1.8μA/cm2(p<0.05)相比,MR-1WT生成的稳态电流密度达到13.7±0.3μA/cm2(图19a；表2)。操作13天后，与MR-1WT和MR-1Δbfe相比，MR-1/YYDT-C5示出最高的电流密度相比于电位(图19b)。与MR-1Δbfe的最大功率输出为0.83±0.19μW/cm2相比，MR-1WT的最大功率输出为2.61±0.35μW/cm2，而MR-1/YYDT-C5达到5.25±1.18μW/cm2(p<0.05)(图19c)。MR-1WT反应器中阳极培养物的OD600达到0.129±0.005，而MR-1/YYDT-C5和MR-1Δbfe分别在0.098±0.005和0.114±0.005的密度下达到峰值(图19d)得出来自MR-1WT阳极生物膜细胞的细胞结合结晶紫溶液的OD595为0.411±0.030，以及MR-1/YYDT-C5为0.267±0.031，和MR-1Δbfe为0.458±0.030(图19e)。这转化为生物膜中附着细胞的数量，MR-1WT为(2.74±0.18)×105/cm2，MR-1/YYDT-C5为(1.78±0.24)×105/cm2，以及MR-1Δbfe为(3.05±0.20)×105/cm2。MR-1WT、MR-1/YYDT-C5和MR-1Δbfe中乳酸的消耗量分别测量为12.0±0.6mM、9.5±0.7mM和11.6±0.6mM(图19f)。与MR-1WT相比，在MR-1Δbfe中通过bfe基因敲除减少黄素仅产生31％功率，并且通过在MR-1/YYDT-C5中过表达ribADEHC增加黄素使功率提高至2倍(表2)。这些结果表明，黄素使电子穿梭成为可能是MR-1中生物电生成的主要机制，这与先前的研究18一致。还表明，将编码黄素生物合成的基因簇(例如pYYDT-C5)引入已建立的MFC生物膜具有显著增强发电量性能的潜能。
微生物燃料电池(MFC)中基于超声的DNA递送(UDD)
采用图17b中所示的设置研究在MFC中经由UDD将pYYDT-C5质粒转化至MR-1WT生物膜中。在MFC系统中研究了pYYDT-C5对建立的生物膜中生物电生成的作用。处理包括超声和添加质粒(WT_P_US)、阳性对照MR-1/YYDT-C5菌株(MR-1/YYDT-C5_US)和两个阴性对照：添加质粒(WT_P)但无超声和经超声处理但无质粒(WT_US)。
如同先前的实验，MR-1/YYDT-C5阳性对照系统的发电(28.0±3.3μA/cm2)在整个实验中始终高于MR-1WT系统(图20a)。对于所有MFC系统，在大约4天后电流生成达到稳定状态后，在第5天和第6天之间添加质粒和/或超声处理。所有处理的MFC系统中的电流生产在进行超声处理后立即下降，但电流生产在大约24小时后完全恢复(图20)。该观察表明，超声处理可以导致MFC系统的暂时性干扰，可能对生物膜结构造成轻微的物理破坏，但生物膜中的细胞能够自我重组并完全恢复，之后未出现永久性可检测到的危害。
超声处理48小时后，WT_P_US系统开始生成比WT_US更高的电流。实验结束时，WT_P_US系统生成的电流为21.9±1.2μA/cm2，比WT_US系统(13.6±1.6μA/cm2)高61％(p<0.05)(图20a；表3)。这表明UDD在MFC内建立的生物膜中成功应用，导致WT_P_US系统产生的黄素随时间增加。WT_P系统产生与WT_US相似的电流(14.9±0.6μA/cm2)，表明细菌转化仅发生在组合质粒和超声添加的处理中。超声处理三天后，将卡那霉素(10μg/mL)和乳酸盐(10mM)添加至所有反应器中，作为转化细胞生长的选择压力，并分别保持高电子供体浓度。我们估计3天的时间间隔足以使维持在室温下的转化细菌细胞能够在低生长的最低培养基中产生必需蛋白以抵抗抗生素。在第13天添加额外的卡那霉素(40μg/mL)。在不同的时机添加抗生素对于由对照产生的电流没有可检测到的作用，因为卡那霉素的作用方式未引发立即杀死细胞，而是替代的干扰蛋白合成并阻止细胞复制16。这表明在这些反应器中建立的细胞密度在添加抗生素之前已达到最佳浓度，并且该过程不受催化剂限制。在第9天注入额外的乳酸盐对于生物电生产也没有改进性能的可检测到的作用，表明该反应也不受底物限制。
由希瓦氏菌菌株分泌的黄素的量在影响于MFC系统中生成的电流发挥显著作用13。操作14天后，定量每个MFC反应器中的细胞外黄素的量。与WT_US和WT_P系统(分别为70.9±5.9μM和74.8±7.3μM)相比，WT_P_US系统生成的细胞外黄素浓度(103.3±8.3μM)高约50％(p<0.05)(图4b，表3)。WT_P_US系统中黄素生产的增加归因于编码pYYDT-C5质粒的额外的合成途径，该质粒经由UDD引入奥奈达希瓦氏菌生物膜。这种黄素的量分析证实了质粒经由超声转化。MR-1/YYDT-C5阳性对照系统包含最高浓度的黄素(289.7±57.7μM)，其与电流生成的结果一致。
在WT_P_US MFC系统(表8)中从转化的细胞提取和质粒测序为pYYDT-C5质粒成功转化至MFC生物膜中的奥奈达希瓦氏菌提供了额外的证据。组合这些结果为UDD将期望基因原位递送至细菌生物膜中的能力提供了强有力的证据。这表明这种UDD能够增强MFC中基于生物膜的生物电化学性能，而无需重建生物膜，这对于工业大规模应用而言是高度期望的。
讨论
细菌细胞经由UDD在流通池生物膜中原位摄取质粒
生物膜中的原位细菌转化通常仅限于感受态细胞20。在这项研究中，我们尝试使用超声介导的基因转化(UDD)将基因非侵入性且远程地原位引入成熟的生物膜。
使用广泛宿主范围的克隆载体骨架pBBR1MCS-2和编码sfGFP的DNA片段以及正反馈luxI和luxR系统构建pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP质粒(8822bp)。21此处使用sfGFP和正反馈luxI和luxR系统是因为它们在转化的细菌细胞中提供了强绿色荧光信号。22应用此pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP质粒作为用于在商购微流体流通池系统中生长的恶臭假单胞菌UWC1生物膜的递送DNA(图17a)。UWC1被用于超声介导的DNA递送(UDD)，因为它是环境和工业相关的细菌，并且不具备天然能力。24我们已经示出，在质粒的存在下向生物膜施加低频率超声(40kHz)导致细菌细胞原位摄取pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP质粒，其在孵育5小时后在生物膜内产生绿色荧光信号(图18)。
然而，所有转化技术(包括传统技术诸如电穿孔和化学转化)的关键瓶颈是转化效率低，其通常范围在每个细胞10-9至10-5个转化体之间17。由于与生物膜内的非转化细胞相比，转化体具有这样的低比率，因此将预期UDD不会对生物膜的整体功能具有太大影响。为了克服这一挑战，一种选择是在UDD应用后使用选择压力来限制非转化细胞的生长，并允许具有选定适应性的转化细胞在生物膜内更自由地繁殖。
在此项研究中，将卡那霉素用作选择压力，以增强UDD对生物膜一般功能性的影响，从绿色荧光信号随时间增加的幅度可见(图18a、b、c和g)。此种方法在诸如工业废水处理的应用中特别有用，其中，不同的污染物可能在生物反应器内的生物膜中诱导中毒性休克。例如，废水中铜含量的突然激增可能在生物膜中诱导中毒性休克25并扰乱其生物反应器，从而导致生物反应器长停机时间和未经处理的废水释放到环境中。当前保护环境和防止政府监管处罚的缓解方法包括稀释以降低每单位废水的铜浓度和/或采购特殊配方的污泥来处理高铜，这两者都会产生巨大的财政成本和显著的生物反应器停机时间。所描述的UDD技术可能通过在选择压力(例如铜)的存在下随时间转化生物膜和污泥生物反应器中的细菌来表达适当的功能(例如铜抗性)以弥补差距。
我们已经开发了用于在微流体流通池中建立的生物膜内进行细菌转化的UDD方法。使用这种方法，已建立的生物膜内的细菌细胞可以通过细菌转化获得特定的目的基因(在这种情况下为luxI、luxR和sfGFP)，从而使生物膜显示出新的表型和功能。我们先前的工作重点是悬悬浮液中细胞的细菌转化17，并且在这项工作之前，UDD尚未在生物膜中得到证实。此后，其他人已经示出，相同的方法能够将核酸转化至革兰氏阳性细菌中26，但与悬浮液中的细胞类似。与传统方法诸如电穿孔和化学转化相比，用于基因转化的超声的优势在于它更适用于放大工业用途。
UDD在MFC中诱导原位细菌转化
采用不同黄素产量和生物电生成能力的奥奈达希瓦氏菌MR-1菌株，能够建立双室MFC反应器系统，从而允许可靠地评价菌株的生物电输出。它为采用MFC系统评价UDD对由MR-1的生物电生成的潜在影响奠定了基础。选择MR-1作为模式生物，是由于它的独特的细胞外电子转化能力27以及它不具备天然能力的事实。将pYYDT-C5质粒用于将DNA递送至奥奈达希瓦氏菌MR-1WT，因为该质粒包含从枯草芽孢杆菌克隆的整个黄素生物合成基因簇ribADEHC，与MR-1WT相比，其先前已示出改进转化MR-1的生物电生成13。
我们已经示出，在质粒的存在下，向对在电极上生长的奥奈达希瓦氏菌生物膜施加低频超声(40kHz)导致细菌细胞原位摄取pYYDT-C5质粒，其与阴性对照相比，孵育8天后，在MFC中生成的生物电是阴性对照的几乎两倍。此处使用的pYYDT-C5质粒是相对较大的质粒(10450Bp)。虽然熟知随着质粒大小的增加，转化效率降低28，但我们的结果示出，UDD技术不仅限于小质粒的递送，而且对相对较大的质粒也有效。由于UDD似乎是其中细胞膜渗透性在声学上得到增强的物理现象17，有可能可以实现经由涉及摄取大质粒的UDD的细菌转化29。
直至第14天，MFC中UDD处理的生物膜仅能够匹配由MR-1/YYDT-C5阳性对照系统生成的生物电水平的约70％。与在流通池生物膜中应用UDD的结果相比，很明显的是细菌转化效率可以是阻止处理的生物膜达到最大理论生产率的限制因素。为了减轻这种限制，可以将使用适当使用的选择压力用于放大UDD处理对生物膜的作用，以表现出高生产率。
先前表明，使用低频超声诸如20kHz的经皮蛋白递送的机制主要归因于空化效应。30,31,32类似地，生物膜中UDD的机制可能是经由声空化，其中在生物膜的表面和/或内部形成的微泡可以振荡或压破33,34，从而导致细胞膜中的暂时孔隙率。包含细胞外聚合物质诸如脂质、多肽和带不同化学电荷的多糖的生物膜基质，是用于将细胞外DNA或目的质粒引入生物膜的理想吸附材料。生物膜中的高细胞密度，可能与细菌和生物膜基质中目的质粒之间的接近性相结合，为在非感受态细菌生物膜群落中进行声学增强水平基因转化提供了合适的环境。
为工业应用扩大生物膜中的UDD
本研究的目标是经由原位UDD在不同规模的生物反应器中的建立的生物膜中引入新功能性。在微生物流通池和MFC系统两者中生长的生物膜上的UDD诱导的基因转化被成功证明，具有的工作体积分别为0.16cm3和300cm3，表明操作体积放大至1875倍。这些结果提供了UDD在工业规模的细菌转化方面具有巨大的前景的很好证据。可以将包含目的基因的DNA片段原位引入在生物反应器中培养的已建立的生物膜中，从而减少停机时间并确保连续操作。UDD也可以部署在以下的领域中，在领域中，受污染土壤中建立的原生生物膜群落可以通过已知对生物降解或金属抗性有效的基因来增强。使用这种方法也有可能影响动物和人的肠道微生物组以用于农业或医疗目的。因此，影响已建立生物膜表型的能力为控制其在环境、工业以及甚至医疗环境中的行为创建了新可能性。
材料与方法
化学品、细菌和质粒
所有化学品均来自Sigma-Aldrich(英国)，并且除非另有说明，否则未经修改即可使用。此研究中使用的菌株和质粒列于表1中。
pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP质粒(8822bp)，包含广泛宿主范围的克隆载体骨架pBBR1MCS2、sfGFP以及正反馈luxI和luxR系统，被应用作为为恶臭假单胞菌UWC1递送DNA，而pYYDT-C5(10450bp，由Yang等人13提供)，包含全黄素生物合成基因簇ribADEHC，被应用作为为奥奈达希瓦氏菌MR-1WT递送DNA。简言之，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN，德国)从处于细菌培养物各自指数中期的细菌培养物中提取和纯化质粒DNA。使用NanoQuant PlateTM和Spark酶标仪(TECAN，瑞士)确定DNA浓度。有关质粒制备的更多信息可见于补充信息(SI)。
pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP质粒的构建
使用BglII然后AvrII经由限制性消化将将pTD103luxl_sfGFP(来自Jeff Hasty,Addgene质粒#48885；http://n2t.net/addgene:48885；RRID:Addgene_48885)切割。包含sfGFP以及正反馈luxI和luxR系统的Plux_sfGFP片段在经由凝胶电泳分离后被分离。将Plux_sfGFP连接至pBBR1MCS-2质粒骨架(来自Kenneth Peterson，Addgene质粒#85168；http://n2t.net/addgene:85168；RRID:Addgene_85168)，其已通过BamHI和XbaI限制性消化而线性化。将得到的pBBR1MCS-2_Plux_sfGFP质粒转化至C2987 NEB-5α大肠杆菌中，其经由M13菌落PCR筛选。从阳性转化体中提取质粒。
恶臭假单胞菌UWC1生物膜的生长
使用通过蠕动泵连续供应的1/10浓度的LB培养基(Lennox)，使得恶臭假单胞菌UWC1的生物膜在三通道流通池(通道尺寸，1×4×40mm3；Merck，德国)中生长。流动系统由2L玻璃瓶(Fisher Scientific，英国)、Masterflex硅胶管和蠕动泵(Cole-Palmer，英国)、气泡捕集器和流通池(Merck，德国)组成，如先前描述的组装和消毒。23使用1mL注射器和26G针头(BD，美国)在每个流通池通道中接种0.3mL过夜培养物(稀释至OD600为0.1)。接种后，停止培养基流1h以允许初始附着，随后以10mL/h的流速连续培养基流。
超声DNA递送至流通池生物膜中
总计使用四组流通池培养生物膜，其中，将3天时长的生物膜在4种条件下处理：添加质粒并超声处理两者(+P/+U)，仅用超声处理(-P/+U)，仅添加质粒(+P/-U)，以及不添加质粒和无超声处理(-P/-U)。在超声处理之前关闭连接至流通池的蠕动泵。将具有或不具有1ug/mL的pBBR1MCS-2_Plux_sfGFP质粒(编码绿色荧光蛋白)的0.3mL的10mM CaCl2溶液注入至适当的流通池中。夹住流通池两端的管，并且将流通池在室温下孵育10分钟。将流通池完全浸没在40kHz Branson 3510超声水浴(Emerson Electric，美国)中，并对适当的流通池进行超声处理10秒。再静置另外的10分钟后，取下流通池两端的夹子，并以10mL/h的流速重新打开蠕动泵。流动2小时后，将生长培养基更换为包含10μg/mL卡那霉素的1/10浓度的LB培养基，用于其余的实验，并在需要时替换废物瓶。使用ZEISS LSM 900with Airyscan 2激光共聚焦扫描显微镜(Carl Zeiss AG，德国)观察流通池内的生物膜样品的绿色荧光信号的迹象。
使用无菌针头和注射器从流通池内收集细菌的样品，重悬于无菌0.9％NaCl溶液中，并且然后涂覆在包含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上。根据生产商的说明，将琼脂板上形成的任何菌落重悬于无菌0.9％NaCl溶液中，并使用
Figure BDA0003623744040000321
Plasmid Miniprep试剂盒(New England Biolabs，英国)进行质粒提取程序。使用NanoQuant PlateTM和Spark酶标仪(TECAN，瑞士)确定质粒样品的浓度，同时根据生产商的说明，使用水平凝胶电泳系统(Bio-Rad，英国)将样品中的质粒大小与pBBR1MCS-2_PLux_sfGFP进行比较。
MFC反应器设置
将具有工作体积为300mL的双室MFC反应器用于研究电流生产。阳极由3.0×3.0cm2碳布(H23，95g/m2，Quintech)制成。阴极是带有Pt催化剂的碳布(1mg/cm2，PtC60％，2.5×4.0cm2；FuelCellStore)。将钛丝用于将电极连接至反应器的外部。将
Figure BDA0003623744040000322
117用作交换膜以分隔两个室。
组装反应器并最初装满去离子水，然后高压灭菌以达到无菌度。然后用适当的培养基替换水；选择补充有痕量的矿物质、氨基酸和维生素的标准M9微量盐作为阳极室培养基，并根据稍作修改的Cao等人17的方法制备。表4、5和6中给出了每种储备液中的化学品及其相应浓度的列表。将M9盐溶液高压灭菌，之后将痕量元素经由20um孔径的膜无菌过滤从它们的储备液以1:100的稀释度添加。最终培养基补充有20mM DL-乳酸钠和0.75mM IPTG作为pYYDT-C5质粒诱导剂。阴极室培养基是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通过以下制备：将两片500mg PBS片剂溶解在1L去离子水中，然后高压灭菌以达到无菌度。
将1kΩ的固定电阻器用于完成电路。将Keithley Instrument Datalogger2701用于每10分钟测量通过电阻器两端的电压。在细菌注入之前，将阳极室用氮气鼓泡15分钟以创建厌氧条件。在整个实验中，阳极室和阴极室分别连续通入氮气和空气。每个不同的系统运行三个独立的复制反应器。
极化和功率曲线构建
经由极化曲线构建测量野生型奥奈达希瓦氏菌MR-1及其黄素缺陷/增强突变体对应物的功率生产。使用恒电位仪(PalmSens 4通道Multi EmStat3+)对MFC反应器进行线性扫描伏安法(LSV)，电压在理论开路电位至零之间变化。(E开始＝0.8V，E终止＝0.0V，E阶跃＝0.1V，扫描速率＝0.1mV/s)。功率曲线根据欧姆定律通过将所得电流乘以相应的电位来构建，功率由阳极表面积归一化
P＝IV
(1)
其中，P是功率，I是电流，以及V是施加的电位。
浮游的和生物膜细胞定量
通过使用光谱仪(UV-1800Shimadzu)在600nm的处的光密度来确定反应器中浮游细胞的浓度。使用1cm长度的吸收池(具有1mL样品大小)，以新鲜的阳极培养基作为空白，以排除背景读数。
使用结晶紫测定测量生物膜细胞浓度。将阳极浸入20mL的0.1％结晶紫溶液中，然后用20mL无菌去离子水洗涤两次。最后，将细胞结合的结晶紫溶解在20mL的70％异丙醇中。在595nm处测量最终溶液的100μL等分试样的四个独立重复的吸光度，并用源自无细胞正极的结晶紫的背景读数进行归一化。OD595值与附着在生物膜上的细胞数成正比，使用已知细胞密度的标准曲线计算OD至细胞数的转换。
代谢物定量和库仑效率
经由配备有酸性柱Hi Plex–H(250×4.6mm，粒径8μm，Agilent)的高效液相色谱法(HPLC)对剩余乳酸盐和产生的代谢物的量进行定量。洗脱液为0.005M H2SO4，流速为0.6mL/min，并且使用UV检测器在55℃下在210nm处下检测信号。使用0.2ul孔径膜过滤器对1mL反应器培养基进行取样和过滤，以去除细胞，之后测量其化学浓度。在MFC实验之前，构建乳酸盐和可能的代谢物(醋酸盐、丙酮酸盐、甲酸盐(format)和琥珀酸盐)的标准曲线。
将库仑效率计算为作为电流回收的电荷与可从乳酸盐氧化成醋酸盐获得的总理论电荷数的比率。将作为电流回收的电子测量为电流随时间的积分
Figure BDA0003623744040000341
其中，Qr是作为电流回收的总电荷，并且t是操作的总持续时间。可从乳酸盐氧化获得的电子总数为
QA＝zFVΔC
(3)
其中，QA是总可用电荷，z是每个乳酸盐氧化分子释放的电子数(z＝4)，F是法拉第常数(96,485C mol-1)，V是阳极室体积，以及ΔC是乳酸盐浓度的变化。
在MFC中将质粒原位转化至奥奈达希瓦氏菌MR-1
在其MFC系统的电流生产方面，研究经由超声将pYYDT-C5质粒转化至奥奈达希瓦氏菌MR-1中的作用。将MR-1的后期静止期培养物注入至反应器中以实现初始OD为0.01。在通过1kΩ电阻器达到稳定的电流生成后，将0.1μg/mL的质粒注入至适当的反应器(WT_P_US)。然后以42kHz(±6％)的频率进行超声30s以将质粒转化至细胞中，并继续监测电流生产。作为对照，将具有野生型(WT_US)和MR-1/YYDT-C5菌株(MR-1/YYDT-C5_US)未进一步添加质粒的反应器也作为对照进行实验。还测量了添加质粒但未超声处理的WT菌株另一对照以排除这种处理的作用(WT_P)。每个系统运行三个独立的重复反应器(靶标和三个对照；总计12个反应器)。使用无菌注射器和针头通过反应器侧面的端口之一进行卡那霉素和乳酸盐的注入。添加来自50mg/mL储备液的卡那霉素，以在反应器中达到期望的最终浓度。添加来自其1M储备液的乳酸盐，经预过滤灭菌以达到无菌度。
在实验结束时计算质粒转化的效率。对20mL的阳极培养物进行取样并离心以获得细胞沉淀。将细胞重悬于100μL无菌水中，然后铺板在具有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂上。计数形成的菌落数，并且这代表已获得质粒的细胞。基于其OD值以及先前已确定的OD至细胞数的转换，参照转化和未转化的细胞总数计算质粒转化效率。
黄素定量
将荧光光谱术用于检测和定量由奥奈达希瓦氏菌在MFC反应器中分泌的核黄素和黄素单核苷酸(FMN)。将阳极培养基的无细胞上清液100μL转化至透明96孔板中，并在440nm激发和525nm发射处读数。每个反应器运行四个独立的重复等分样品，并通过使用新鲜的阳极培养基作为空白来校正背景荧光。使用先前用已知浓度的FMN构建的标准曲线确定黄素浓度(浓度范围：1mg mL-1至1ng mL-1)。
质粒测序和验证
在MFC实验结束时，收集阳极生物膜并离心以获得细胞沉淀。使用
Figure BDA0003623744040000351
Plasmid Miniprep试剂盒进行质粒提取方案，并使用NanoDrop和酶标仪定量获得的质粒。将引物PRTac-SF3_for和ribC-02_R8_rev(表7)用于测序和鉴定必要的质粒片段，以确认pYYDT-C5质粒成功转化至奥奈达希瓦氏菌中。
统计分析
对于涉及复制的所有测量，进行嵌套混合因子ANOVA检验，随后进行Tukey’s HSD事后检验，以研究不同处理组之间的显著性。P值小于0.05表示目的系统之间存在统计学上的显著差异。
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本文中的所有参考文献均通过援引并入本文。
表
表1.本研究中使用的细菌菌株和质粒。
Figure BDA0003623744040000401
Figure BDA0003623744040000411
表2.与MR-1野生型和突变体运行的MFC的稳态电流密度和最大功率输出
Figure BDA0003623744040000412
表3.UDD处理的MFC系统的最终电流密度和细胞外黄素浓度
Figure BDA0003623744040000413
表4：维生素储备液的成分(×100)
Figure BDA0003623744040000421
表5：矿物质储备液的成分(×100)
Figure BDA0003623744040000431
表6：氨基酸储备液的成分(×100)
Figure BDA0003623744040000441
表7：将通过PRTac-SF3_for和ribC-02_R8_rev检测pYYDT-C5片段以确认MFC中的UDD
正向(SEQIDNO:1):
NNNNGGNNNNNNNNAGAGGAGAATCTAGTATGTTCCACCCAATCGAAGAAGCTTTAGATGCTTTAAAAAAAGGTGAAGTTATCATCGTTGTTGATGATGAAGATCGTGAAAACGAAGGTGATTTCGTTGCTTTAGCTGAACACGCTACTCCAGAAGTTATCAACTTCATGGCTACTCACGGTCGTGGTTTAATCTGTACTCCATTATCTGAAGAAATCGCTGATCGTTTAGATTTACACCCAATGGTTGAACACAACACTGATTCTCACCACACTGCTTTCACTGTTTCTATCGATCACCGTGAAACTAAAACTGGTATCTCTGCTCAAGAACGTTCTTTCACTGTTCAAGCTTTATTAGATTCTAAATCTGTTCCATCTGATTTCCAACGTCCAGGTCACATCTTCCCATTAATCGCTAAAAAAGGTGGTGTTTTAAAACGTGCTGGTCACACTGAAGCTGCTGTTGATTTAGCTGAAGCTTGTGGTTCTCCAGGTGCTGGTGTTATCTGTGAAATCATGAACGAAGATGGTACTATGGCTCGTGTTCCAGAATTAATCGAAATCGCTAAAAAACACCAATTAAAAATGATCACTATCAAAGATTTAATCCAATACCGTTACAACTTAACTACTTTAGTTGAACGTGAAGTTGATATCACTTTACCAACTGATTTCGGTACTTTCAAAGTTTACGGTTACACTAACGAAGTTGATGGTAAAGAACACGTTGCTTTCGTTATGGGTGATGTTCCATTCGGTGAANAACCAGTTTTAGTTCGTGTTCNNTCTGAATGTTTAACTGGTGATGTTTTCGGTTCTCANCGTTGTGATTGTGGTCCACAATTACNCGCTGCTTTAAACCAAATCGCTGCTGAAGGTCGNGGNGTTTNNTAAACTTACGTCANNNAGGTCNNNGTATCGGTTTAATCANNAAATTAAAAGCTTANAAATTANNNNAACAAGGTTANAANNNNGNTNNNNCTANNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNANNNNNNNNNNTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAA
反向(SEQ ID NO:2):
NNNNNGCTTCNNNGTNNNCCNTTTTCNNNTTGTTCAGTTAATTCTTTTGATACCGTTGAATTTACGTTCAGAACGGATACGTTTGTACCATTCGATTTTGATAGCAGCACCGTAAACTTCTTTGGTTGAAATCGAATAAGTTAACTTCGATAGATGGTTGTTTCTGGACGTTTTTCGTAGAAAGTTGGTTTGTAACCGATGTTACAAACACCGTTTGTAAACTTCACCGTTAACTTCAGCTTTAACAGCGTAAACACCAGTTGGTGGAACGATGTAAGAGTTGTTTAAACCAACGTTAGCAGTTGGGAAACCGATAGTACGACCACGTTTATCACCGTGGATAACGATACCTTTGATGAAGTATGGTTGACCTAATAAAACGTTAGCTAATTCAACATCACCGTTTTGTAAAGCAGTACGGATGTAAGAAGAAGAGATTTTTTTATCTTGTTCAGTTAATTTTTCAACCATAGTACAACCAGCTTTACCATCTAAATCATCTGGCATAGTTTTCATAGTACCTTTACCGTATTTACCGTAAGTGAAATCGAAACCAGCAACAGCGTGTTGAACGTTTAAACCGATGATGTATTGATCGATGAATTGTTTTGGAGATAAAGAAGCGAAAACTTCGTTGAATTTAACAACGTATAAAACTTCAGTACCTAATTGTTCGATTTGGTTGATTTTATCTTCTAATGGAGTGATTAAATCTTTTGGTTCTTTATCACGACCTAAAACGTGAGATGGGTGTGGGTGGAAAGTCATAACAGCTAAAGTTAAACCTTTTTCTTCAGCGATTTGTTTAGCAGTACCGATAACTTTTTGGTGACCTAAGTGAANNCCATCGAAGTAACCTAAAGCCNNAACAGATTTAGCTTGNTCTCNTTGATAATGGNGGGGNNNNNNNNNNGGGGAAANTNTNNNCNNNAGTTNNNNCNNNNNNNNNNNNNTANNNNAAANAACGGTTANNTNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNTTGACTANNNNACANATNNNNNNN
表8：UDD处理的MFC-生物膜质粒的测序结果
正向(SEQ ID NO:3):
NNNNGGGNNNNGAAGAGGAGAATCTAGTATGTTCCACCCAATCGAAGAAGCTTTAGATGCTTTAAAAAAAGGTGAAGTTATCATCGTTGTTGATGATGAAGATCGTGAAAACGAAGGTGATTTCGTTGCTTTAGCTGAACACGCTACTCCAGAAGTTATCAACTTCATGGCTACTCACGGTCGTGGTTTAATCTGTACTCCATTATCTGAAGAAATCGCTGATCGTTTAGATTTACACCCAATGGTTGAACACAACACTGATTCTCACCACACTGCTTTCACTGTTTCTATCGATCACCGTGAAACTAAAACTGGTATCTCTGCTCAAGAACGTTCTTTCACTGTTCAAGCTTTATTAGATTCTAAATCTGTTCCATCTGATTTCCAACGTCCAGGTCACATCTTCCCATTAATCGCTAAAAAAGGTGGTGTTTTAAAACGTGCTGGTCACACTGAAGCTGCTGTTGATTTAGCTGAAGCTTGTGGTTCTCCAGGTGCTGGTGTTATCTGTGAAATCATGAACGAAGATGGTACTATGGCTCGTGTTCCAGAATTAATCGAAATCGCTAAAAAACACCAATTAAAAATGATCACTATCAAAGATTTAATCCAATACCGTTACAACTTAACTACTTTAGTTGAACGTGAAGTTGATATCACTTTACCAACTGATTTCGGTACTTTCAAAGTTTACGGTTACACTAACGAAGTTGATGGTAAAGAACACGTTGCTTTCGTTATGGGTGATGTTCCATTCGGTGAANAACCAGTTTTAGTTCGNGTTCACTCTGAATGTTTAACTGNNGATGTTTTCGGTTCTNACCGTTGTGATTGTGGTCCACAATTACNCGNTGCTTTAAACCAAATCGCTGCTGAAGGTCGNNNTNTTTTATNANACTTACGTCANNNAGGTNNNGGTNTCGGTTNAATCAACAAATTAAAAGCTTACAATTACANNNACAAGGTTANAAANNNNNNNNNNNTAANNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA
反向(SEQ ID NO:4):
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序列表
<110> 牛津大学创新有限公司(OXFORD UNIVERSITY INNOVATION LIMITED)
<120> 生物膜转化
<130> PPI22170427US
<150> GB1913045.9
<151> 2019-09-10
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
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ctttaaaaaa aggtgaagtt atcatcgttg ttgatgatga agatcgtgaa aacgaaggtg 120
atttcgttgc tttagctgaa cacgctactc cagaagttat caacttcatg gctactcacg 180
gtcgtggttt aatctgtact ccattatctg aagaaatcgc tgatcgttta gatttacacc 240
caatggttga acacaacact gattctcacc acactgcttt cactgtttct atcgatcacc 300
gtgaaactaa aactggtatc tctgctcaag aacgttcttt cactgttcaa gctttattag 360
attctaaatc tgttccatct gatttccaac gtccaggtca catcttccca ttaatcgcta 420
aaaaaggtgg tgttttaaaa cgtgctggtc acactgaagc tgctgttgat ttagctgaag 480
cttgtggttc tccaggtgct ggtgttatct gtgaaatcat gaacgaagat ggtactatgg 540
ctcgtgttcc agaattaatc gaaatcgcta aaaaacacca attaaaaatg atcactatca 600
aagatttaat ccaataccgt tacaacttaa ctactttagt tgaacgtgaa gttgatatca 660
ctttaccaac tgatttcggt actttcaaag tttacggtta cactaacgaa gttgatggta 720
aagaacacgt tgctttcgtt atgggtgatg ttccattcgg tgaanaacca gttttagttc 780
gtgttcnntc tgaatgttta actggtgatg ttttcggttc tcancgttgt gattgtggtc 840
cacaattacn cgctgcttta aaccaaatcg ctgctgaagg tcgnggngtt tnntaaactt 900
acgtcannna ggtcnnngta tcggtttaat cannaaatta aaagcttana aattannnna 960
acaaggttan aannnngntn nnnctannnn nnnntnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1080
ncnnnnannn nnnnnnntan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140
nnnnnnnaa 1149
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<400> 3
nnnngggnnn ngaagaggag aatctagtat gttccaccca atcgaagaag ctttagatgc 60
tttaaaaaaa ggtgaagtta tcatcgttgt tgatgatgaa gatcgtgaaa acgaaggtga 120
tttcgttgct ttagctgaac acgctactcc agaagttatc aacttcatgg ctactcacgg 180
tcgtggttta atctgtactc cattatctga agaaatcgct gatcgtttag atttacaccc 240
aatggttgaa cacaacactg attctcacca cactgctttc actgtttcta tcgatcaccg 300
tgaaactaaa actggtatct ctgctcaaga acgttctttc actgttcaag ctttattaga 360
ttctaaatct gttccatctg atttccaacg tccaggtcac atcttcccat taatcgctaa 420
aaaaggtggt gttttaaaac gtgctggtca cactgaagct gctgttgatt tagctgaagc 480
ttgtggttct ccaggtgctg gtgttatctg tgaaatcatg aacgaagatg gtactatggc 540
tcgtgttcca gaattaatcg aaatcgctaa aaaacaccaa ttaaaaatga tcactatcaa 600
agatttaatc caataccgtt acaacttaac tactttagtt gaacgtgaag ttgatatcac 660
tttaccaact gatttcggta ctttcaaagt ttacggttac actaacgaag ttgatggtaa 720
agaacacgtt gctttcgtta tgggtgatgt tccattcggt gaanaaccag ttttagttcg 780
ngttcactct gaatgtttaa ctgnngatgt tttcggttct naccgttgtg attgtggtcc 840
acaattacnc gntgctttaa accaaatcgc tgctgaaggt cgnnntnttt tatnanactt 900
acgtcannna ggtnnnggtn tcggttnaat caacaaatta aaagcttaca attacannna 960
caaggttana aannnnnnnn nnntaannan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnannnn nnncnnnnnn 1080
nnnnnnnnan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnna 1126
<210> 4
<211> 923
<212> DNA
<213> 奥奈达希瓦氏菌
<220>
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<222> (876)..(876)
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<222> (920)..(920)
<223> n是a、c、g或t
<400> 4
nnnnncttct ttgtttatct ttttcgattt gttcagttaa ttctttgata ccgttgaatt 60
tacgttcaga acggatacgt ttgtaccatt cgattttgat agcagcaccg taaacttctt 120
ggttgaaatc gaataagtta acttcgatag atggttgttc tggacgtttt tcgtagaaag 180
ttggtttgta accgatgtta caaacaccgt tgtaaacttc accgttaact tcagctttaa 240
cagcgtaaac accagttggt ggaacgatgt aagagttgtt taaaccaacg ttagcagttg 300
ggaaaccgat agtacgacca cgtttatcac cgtggataac gatacctttg atgaagtatg 360
gttgacctaa taaaacgtta gctaattcaa catcaccgtt ttgtaaagca gtacggatgt 420
aagaagaaga gattttttta tcttgttcag ttaatttttc aaccatagta caaccagctt 480
taccatctaa atcatctggc atagttttca tagtaccttt accgtattta ccgtaagtga 540
aatcgaaacc agcaacagcg tgttgaacgt ttaaaccgat gatgtattga tcgatgaatt 600
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ctaattgttc gatttggttg attttatctt ctaatggagt gattaaatct tttggttctt 720
tatcacgacc taaaacgtga gatggggtgt ggggtggaaa gtcataacag ctaaagttaa 780
acctttttct tcagcgattt gtttagcagt accgataact ttttggtgac ctaagtgaac 840
accatcgaag taacctaaag cnataacnnn tttagnttgn tcttctttga ttaanngngg 900
gggtgaatga nnnnnaaaan ttt 923

Claims (26)

1.一种用于用异源核酸转化生物膜的宿主细胞的方法，其中，所述宿主细胞在所述生物膜的细胞外基质内，所述方法包括：
将所述异源核酸添加至所述生物膜；和
在所述异源核酸的存在下，向所述生物膜施加惯性空化以促进用所述异源核酸转化所述生物膜内的宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，惯性空化活动的水平通过感测声空化噪声来监测，并且将该信息用于实时调整暴露参数。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述生物膜是原位的。
4.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中，在将所述异源核酸添加至所述生物膜时，向所述生物膜施加围封物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述围封物包括用于将所述异源核酸和/或其他物质施用/递送至所述围封物中的进入端口。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，所述围封物包括次级围封物，所述次级围封物被布置成将所述异源核酸和/或其他物质保留和释放至所述围封物中。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在添加所述异源核酸和施加超声之间的至少30秒的孵育时期。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物膜位于水道、通道、管道、表膜、油或水进料、水流、河流、水体、反应器、分散/悬浮生长系统、附着生长系统、含水层、船或艇的内部和/或外部本体、土壤团粒、植物叶面或植物根；或其中，所述生物膜在微生物燃料电池(MFC)中。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述惯性空化通过施加超声来诱导。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中,所述异源核酸是质粒或载体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源核酸编码能够修饰所述宿主细胞表型的基因和/或调控元件。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源核酸编码基因和/或基因的调控元件，所述基因和/或基因的调控元件参与修饰来自包括以下项的组的一种或多种功能或者被布置成修饰来自包括以下项的组的一种或多种功能：群体感应、细胞代谢、热/寒抗性、热激抗性、化学抗性、抗生素抗性、细胞聚集、细胞粘附、细胞输出、膜转运分子、细胞或EPS分散酶和应激调节子；或其组合；或其中，所述异源核酸编码氧化还原途径或者其一个或多个部分。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源核酸编码酶、膜转运蛋白、孔分子和/或与其相关的调控元件。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源核酸编码选自包括以下项的组任何的基因：蛋白降解酶，诸如蛋白酶和肽酶；多糖降解酶和寡糖降解酶，诸如内切纤维素酶、几丁质酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、N-乙酰基-β-d-氨基葡糖苷酶、壳二糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶；脂质降解酶，诸如脂肪酶和酯酶；磷酸单酯酶，诸如磷酸酶；氧化还原酶，诸如酚氧化酶、过氧化物酶；和细胞外氧化还原活性；或其组合；或者其中，所述异源核酸编码基因簇mtrCAB或ribADEHC的一个或多个或所有基因。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源核酸被布置成促进所述生物膜中的选定细菌种属相对于其他种属的存活或生长。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在CaCl2溶液中或在CaCl2的存在下向所述生物膜施加所述异源核酸。
17.一种原位改造生物膜的方法，所述方法包括用异源核酸转化所述生物膜的细胞外基质内的宿主细胞，
其中，所述方法包括：
将所述异源核酸添加至所述生物膜；和
在所述异源核酸的存在下，向所述生物膜施加惯性空化以促进用所述异源核酸转化所述生物膜内的宿主细胞，
其中，所述异源核酸编码能够修饰所述宿主细胞表型的基因和/或调控元件，或所述异源核酸被布置成敲除所述宿主细胞的宿主细胞基因或其调控序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，向所述生物膜施加围封物，并且将所述异源核酸添加至所述围封物内。
19.一种在废水处理过程中净化原料的方法，所述方法包括：
使所述原料流过生物膜
其中，所述生物膜的细胞已被原位基因修饰以增加它们减少所述原料中污染物诸如芳族的能力，和/或增加所述生物膜对所述原料中污染物的抗性。
20.超声用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述用途是用于原位转化生物膜的细胞。
22.空化用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述空化能够由超声或其他物理方法产生。
24.一种用于转化生物膜的细胞外基质内的宿主细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
-惯性空化发生器；
-围封物；和
-任选地，用于转化的核酸。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括CaCl2。
26.一种从微生物燃料电池(MFC)发电的方法，所述方法包括：
-在所述MFC的阳极室中培养生物膜中的细菌，其中，所述生物膜的细菌已经用编码氧化还原途径的一个或多个基因的异源核酸转化；
-提供氧化剂和氧化底物，所述氧化剂和氧化底物是所述氧化还原途径的底物；
-通过以下发电：允许由从所述阳极室中的底物氧化的细菌释放的电子通过导电材料转移至所述MFC的阴极室，从而在所述阴极室中转移的电子与氧结合，并且质子通过质子交换膜扩散。
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