CN102021219A - 检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 - Google Patents

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庄国强
于清
呼庆
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Abstract

本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器及其检测方法涉及一种利用恶臭假单胞菌降解基因的调控序列及调控蛋白基因跟商业化报告基因质粒序列，构建检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器以及检测方法。细菌宿主为大肠杆菌，使用于甲苯类有机物的检测。对甲苯的最低检测浓度为40微摩尔/升，最高浓度为1000微摩尔/升。

Description

检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
技术领域
本发明涉及一种检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的构建方法及其检测方法。细菌为大肠杆菌。该生物吸附剂用于检测环境中甲苯类有机污染物。
背景技术
近年来，随着工业化和农业现代化进程的加快，大量使用合成物质和化学农药等产品，人类不断向环境中排放大量污染物物质，这些都使人类的健康乃至生命受到威胁。甲苯类有机物的广泛使用，已经严重污染环境。甲苯类的有机物已经被列为污染水体，土壤的黑名单，必须进行检测控制。
目前监测和检测污染物主要有两种方法：一是物理化学分析法。其准确度和灵敏度都很高，但需要成套昂贵的精密分析仪器和专业化实验室，并且这种方法在一些污染物检测中无法实现on-site检测。另一种方法是直接利用生物体对特定污染物的响应进行检测，也就是近几年内引起关注的全细胞生物监测。
发明内容
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器提出了一种可以有效检测甲苯类有机污染物的方法。
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器是利用恶臭假单胞菌中的能够特异的降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因与商业化质粒中信号强度高的Luc报告基因一起构建出的一种有效检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器。
本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的具体操作步骤为：
1、扩增载体片断：
首先利用DELNot-Spe I引物以商业化质粒pEGMluc为模板扩增得到线性化片断，DELNot I-Spe I上游gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCACTAGTTCTTCC
GCTTCCTCGCTCAC；DEL Not I-Spe I：下游：GACTGAGCTCGGAAATTGTAAGCGTTAATAT；分别用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
2、扩增终止子片断；
利用下列引物RRNB Spe I：5′：ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3′RRNB NOT I：5′ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3′以大肠杆菌基因组为模版进行扩增得到RRNB终止子序列片断，利用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
3、终止子载体重组质粒构建：
将上述两步构建好的片断按照摩尔比为一比三的比例混合后利用T4连接酶在16度下进行连接；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重组质粒一；
4、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因：
将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为：ATCC 33015)接种于#1271Broth：苯甲酸钠培养基25mL中，30℃振荡培养24至48小时。当细菌生长达到对数生长期中期时，分别利用引物：Pu-Not IATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGATGAAC；Pu-BamH I：ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG；XylR-Luc Xho I：CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT；XylR-Luc Sac I：GTACGAGCTCTTTTCACACAACCTGGGGCG扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因；
5、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构建；
利用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化；利用相应的酶酶切重组质粒一中；连入启动子Pu的质粒命名为质粒二；在质粒二的基础上连入调控蛋白基因XylR命名为质粒三；
6、得到检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
以下通过具体实事例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：第一步：接种单菌落(载体细胞空白同时接种)于50ml三角瓶中；氨苄青霉素终浓度为100μg/ml；37度过夜培养
第二步：5ml的LB培养基加入设定浓度的诱导物(如二甲苯浓度500μm)；
第三步：菌体培养至OD600＝1.2；
第四步：稀释到OD600＝0.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培养液中；23度诱导；
第五步：对于细菌，将40μl未转化细胞(载体细胞)与50μl转化的培养物混合。(细胞浓度相同)加入10μl 1M K2HPO4(pH 7.8)，20mM EDTA(一个溶液)。用-70度冰箱快速冷冻混合物(冻融)(10min)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23度或置于室温下平衡30分钟)。加入300μl新鲜配制的裂解混合物(见附录)。混合并于室温孵育10分钟；
第五步：检测；每个九十六空板中加入20μl的裂解液后，加入100μl荧光素酶检测液，立刻检测；
第六步：数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即为每毫升菌液对应的数值了；对甲苯的最低检测浓度为40微摩尔/升，最高浓度为1000微摩尔/升。
10毫升裂解混合物配方：
5.5ml水
2ml 5×CCLR
加入25mg BSA
2.5ml溶菌酶混合液(配5ml配方：0.5ml 1M 1M K2HPO4(pH 7.8)，20mM EDTA+4.5ml无菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均匀。

Claims (8)

1.一种微生物传感器，由细菌作基本材料，通过基因工程手段构建用来检测甲苯类有机污染物。
2.根据权利要求1所述的微生生物传感器，其特征在于：细菌大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的微生生物传感器，其特征在于：材料为商业化质粒pEGMluc
4.根据权利要求1所述的微生生物传感器，其特征在于：基因来源为商业化菌株恶臭假单胞菌；
5.根据权利要求1所述的生物吸附剂，其制备方法：
a、扩增载体片断：
首先利用DELNot-Spe I引物以商业化质粒pEGMluc为模板扩增得到线性化片断，DEL Not I-Spe I上游gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCACTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC；DEL Not I-Spe I：下游：GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT；分别用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
b、扩增终止子片断；
利用下列引物RRNB Spe I：5′：ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3′RRNB NOT I：5′ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3′以大肠杆菌基因组为模版进行扩增得到RRNB终止子序列片断，利用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理；
c、终止子载体重组质粒构建：
将上述两步构建好的片断按照摩尔比为一比三的比例混合后利用T4连接酶在16度下进行连接；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重组质粒一；
d、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因：将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为：ATCC 33015)接种于#1271Broth：苯甲酸钠培养基25mL中，30℃振荡培养24至48小时。当细菌生长达到对数生长期中期时，分别利用引物：Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGATGAAC；Pu-BamH I：ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG；XylR-Luc Xho I：CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT；XylR-Luc Sac I：GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因；
e、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构建；利用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化；利用相应的酶酶切重组质粒一中；连入启动子Pu的质粒命名为质粒二；在质粒二的基础上连入调控蛋白基因XylR命名为质粒三；
f、得到检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器
g：接种单菌落(载体细胞空白同时接种)于50ml三角瓶中；氨苄青霉素终浓度为100ug/ml；37度过夜培养
h：5ml的LB培养基加入设定浓度的诱导物(如二甲苯浓度500um)；
i：菌体培养至OD600＝1.2；
j：稀释到OD600＝0.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培养液中；23度诱导；
k：对于细菌，将40μl未转化细胞(载体细胞)与50μl转化的培养物混合。(细胞浓度相同)加入10μl 1M K2HPO4(PH 7.8)，20mM EDTA(一个溶液)。用-70度冰箱快速冷冻混合物(冻融)(10min)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23度或置于室温下平衡30分钟)。加入300μl新鲜配制的裂解混合物(见附录)。混合并于室温孵育10分钟；
l：检测；每个九十六空板中加入20ul的裂解液后，加入100ul荧光素酶检测液，立刻检测；
m：数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即为每毫升菌液对应的数值了；
6.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于：所述蛋白胨水液体培养基为25mL；所述振荡培养的温度为37℃，酶切在37℃条件下进行；
7.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于：从美国普通微生物菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为：ATCC33015)在含有苯甲酸钠的培养基中经诱导，促进其甲苯类有机物降解基因表达。
8.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于：微生物传感器培养温度为37℃，微生物传感器诱导温度为23℃，检测数据采集利用发光检测仪检测。
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