JP7067868B2 - 免疫グロブリン遺伝子多様性の操作およびマルチ抗体治療薬 - Google Patents
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Description
(a)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、場合により、以下に記載される本発明の任意の構成に従う、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントと、1種または複数のヒトJ遺伝子セグメント[場合により、再配列されたVHJLCLまたはVHJλCL(式中、CLは、CλまたはCκである)]、または
(ii)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJH遺伝子セグメント[場合により、再配列されたVLDJHCLまたはVλDJHCL(式中、CLは、CλまたはCκである)]、または
(iii)定常領域の上流に、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVL遺伝子セグメントならびに1種または複数のヒトJL遺伝子セグメント
のいずれかを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と
を含む、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞が提供され、
重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスが重鎖遺伝子座の組換えによって製造される重鎖と軽鎖遺伝子座の組換えによって生じた軽鎖とを含む抗体を製造できる。
(b)(i)において、軽鎖遺伝子座のV遺伝子セグメントレパートリーが、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のVH遺伝子セグメントを含むか、もしくはそれからなるか、または、
(b)(iii)において、軽鎖遺伝子座V遺伝子セグメントレパートリーが、1種のVL遺伝子セグメントの種類(場合により、1種またはその突然変異体)からなり、VL遺伝子セグメントが、VL遺伝子セグメントの前記群から選択される。
(a)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む再配列されていない免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、各ヒトVH遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、抗体を発現する細胞から、ヒト抗体の重鎖可変領域をコードする再配列されたVDJを製造するために使用されるヒトVH遺伝子セグメントと同一(またはその突然変異体)であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、または
(ii)定常領域の上流に再配列されたVJ領域またはVDJ領域を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、抗体を発現する細胞から、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、ヒト抗体の重鎖可変領域をコードする再配列されたVDJを製造するために使用されるヒトVH遺伝子セグメントと同一(またはその突然変異体)であるヒトVH遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
(c)重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントまたはVJまたはVDJは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスは、重鎖遺伝子座の組換えによって製造される重鎖と、軽鎖遺伝子座に由来する軽鎖とを含む抗体を製造でき、
(d)場合により、(b)(i)が適用される場合には、軽鎖遺伝子座中の各前記VH遺伝子セグメントは、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択され、
(e)場合により、(b)(ii)が適用される場合には、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一である、
非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞を提供する。
-軽鎖遺伝子座のV遺伝子セグメントレパートリーが、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントからなるか、または
-軽鎖遺伝子座の組み換えられたVJまたはVDJレパートリーが、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合によりヒトD遺伝子セグメントと、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントの組換えによって製造される1種または複数のヌクレオチド配列と同一である配列からなる。
(a)任意の前記の構成または態様による脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を用意する工程と、
(b)前記抗原を用いて前記脊椎動物を免疫処置する工程(場合により、抗原は、感染性疾患病原体の抗原である)と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択されたBリンパ球またはその後代を、場合により、それからハイブリドーマを製造することによって不死化させる工程と、
(e)Bリンパ球によって発現される抗体(例えば、IgG型抗体)を単離する工程と
を含む、方法を提供する。
(i)脊椎動物は、同一抗原または異なる抗原を用いて免疫処置される(場合により、異なる抗原は、同一病原性生物(またはそのファミリーメンバー)によって発現される)こと、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子)および場合により、同一のJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される、方法を提供する。
(i)抗原は、同一病原性生物(またはそのファミリーメンバー)によって発現されること、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子)および場合により、同一のJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される、方法を提供する。
第2の方法において、
(a)第1および第2の抗原を用いて1種または複数の脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を免疫処置する工程(場合により、異なる抗原が同一病原性生物(またはそのファミリーメンバー)によって発現される)と、
(b)前記脊椎動物から得られるBリンパ球から、第1および第2の抗抗原抗体をコードする核酸を単離する工程と、
(c)第1の抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(d)第2の抗体の重鎖可変領域および場合により軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(e)各抗体の重鎖可変領域コード配列を、重鎖発現ベクターに挿入する工程であって、場合により、各重鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(f)第1の抗体の軽鎖可変領域コード配列を、軽鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第1の抗体の軽鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(g)場合により、第2の抗体の軽鎖可変領域コード配列を、軽鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第2の抗体の軽鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(h)各発現ベクターを宿主細胞中に導入し、前記宿主細胞の混合物中で抗体鎖を同時発現させて、各々、前記重鎖可変領域および軽鎖の一方または両方を含む抗体を製造する工程であって、場合により、発現ベクターは、細胞が、抗体軽鎖および重鎖を発現できるように同一宿主細胞(例えば、CHOまたはHEK293細胞)中に一緒に導入され、その結果、細胞または複数の宿主細胞が、各々、前記重鎖可変領域および軽鎖の一方または両方を含む抗体を発現する、工程とを含み、
(i)場合により、
免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子セグメント)および場合により、同一のJレパートリー(場合により、単一J遺伝子セグメント)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って、同一であるか、または
免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一である、方法を提供する。
(a)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメント(場合により、再配列されたVLDJHCHまたはVλDJHCH)、または
(ii)定常領域の上流に、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69および少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVH遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJH遺伝子セグメント
のいずれかを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含み、場合により、本発明の第1の構成の(b)(i)または(b)(ii)に従う免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスが重鎖遺伝子座の組換えによって製造される重鎖と軽鎖遺伝子座の組換えによって製造される軽鎖とを含む抗体を製造できる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞を提供する。
(a)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のJH遺伝子セグメントを含む再配列されていない免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、各ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、抗体を発現する細胞から、ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする再配列されたVJを製造するために使用されるヒトVL遺伝子セグメントと同一(またはその突然変異体)であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座、または
(ii)定常領域の上流に再配列されたVJ領域またはVDJ領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、抗体を発現する細胞から、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする再配列されたVJを製造するために使用されるヒトVL遺伝子セグメントと同一(またはその突然変異体)であるヒトVL遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメントと、1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
(c)軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントまたはVJまたはVDJは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスは、軽鎖遺伝子座の組換えによって製造される軽鎖と、重鎖遺伝子座に由来する重鎖とを含む抗体を製造でき、
(d)場合により、(a)(i)が適用される場合には、重鎖遺伝子座中の各前記VL遺伝子セグメントは、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIA2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれに対して少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択され、
(e)場合により、(a)(ii)が適用される場合には、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVL遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一である、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞を提供する。
-重鎖遺伝子座のV遺伝子セグメントレパートリーは、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVL遺伝子セグメントからなり、または
-重鎖遺伝子座の組み換えられたVJまたはVDJレパートリーは、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合によりヒトD遺伝子セグメントと、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVL遺伝子セグメントの組換えによって製造される1種または複数のヌクレオチド配列と同一の配列からなる。
定常領域の5'と作動可能に連結している1種または複数の可変性およびJ遺伝子セグメント(場合により、1種または複数のD遺伝子セグメント)を含み、以下の配置(5'から3'):-
(a)[V(重鎖、λまたはκ)]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[D]-[JH](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(b)[VH]-[D]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(c)[VH]-[D]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jκ]-(式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(d)[VHまたはVκ]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(e)[Vκ]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[JHまたはJλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(f)[V(重鎖、λまたはκ)]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[D]-[JH](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(g)[VH]-[D]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(h)[VH]-[D]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jκ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(i)[VHまたはVκ]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(j)[Vκ]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[JHまたはJλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)
のうち1種または複数を用いて構築され得る免疫グロブリン遺伝子座からなる群から選択される5'から3'V(D)J配置を含む、合成免疫グロブリン遺伝子座を提供する。
VHが、
VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01およびVH7-4-1*01
の群から選択され、
Dが、
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01およびD3-22*01、または
D2-2*02、D3-9*01およびD3-10*01、または
D3-9*01およびD3-10*01、または
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、または
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、またはD2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D1-26、D2-2、D3-10およびD6-19、または
D2-2、D3-9およびD3-10
の群から選択され、
場合により、JHがJH6(例えば、JH6*02)である、1種または複数の重鎖を含む抗体重鎖のレパートリー(例えば、抗体によって提供される)であって、
(a)重鎖可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)においてin vivoで製造されており、および/または
(b)重鎖可変ドメインが、対応するヒト生殖系列V、DおよびJ配列と比較される場合に非ヒト脊椎動物AIDパターン体細胞超突然変異、(例えば、マウスまたはラットAIDパターン突然変異)および/または対応するヒト生殖系列V、DおよびJ配列と比較される場合に非ヒト(例えば、マウスまたはラット)ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)パターン接合部突然変異を含む、抗体重鎖のレパートリー。
RPCI-11ヒト男性BACライブラリー(Osoegawa et al.、2001)は、Kazutoyo Osoegawaによって開発された、改善されたクローニング技術を使用して構築された(Osoegawa et al.、1998)。ライブラリーは、Kazutoyo Osoegawaによって作製された。構築は、国立ヒトゲノム研究所(National Human Genom Research Institute)(NHGRI、NIH)からの助成金(1R01RG01165-03号)によって資金援助された。このライブラリーは、新規NHGRI/DOE「Guidance on Human Subjects in Large-Scale DNA Sequencing...に従って作製された。
・Osoegawa K、Mammoser AG、Wu C、Frengen E、Zeng C、Catanese JJ、de Jong PJ; Genome Res. 2001年3月;11(3):483-96頁;「A bcterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome」;
・Osoegawa, K.、Woon, P.Y.、Zhao, B.、Frengen, E.、Tateno, M.、Catanese, J.J、and de Jong, P.J. (1998);「An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries」;Genomics 52、1-8。
ゲノムが、
(a)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント(場合により、複数のVH)、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、場合により、以下に記載される第2の構成の(a)に従う、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメント[場合により、再配列されたVHJLCLまたはVHJλCL(式中、CLは、CλまたはCKである)]、または
(ii)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJH遺伝子セグメント[場合により、再配列されたVLDJHCLまたはVλDJHCL(式中、CLは、CλまたはCKである)]、または
(iii)定常領域の上流に、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVL遺伝子セグメントならびに1種または複数のヒトJL遺伝子セグメントのいずれかを含み、場合により、1種または複数のVL遺伝子セグメントが、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と
を含む、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞であって、
重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスが重鎖遺伝子座の組換えによって製造された重鎖と軽鎖遺伝子座の組換えによって製造された軽鎖とを含む抗体を製造できる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞。
(k)[V(重鎖、λまたはκ)]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[D]-[JH](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(l)[VH]-[D]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(m)[VH]-[D]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jκ]-(式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(n)[VHまたはVκ]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(o)[Vκ]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[JHまたはJλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(p)[V(重鎖、λまたはκ)]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[D]-[JH](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(q)[VH]-[D]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(r)[VH]-[D]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[Jκ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(s)[VHまたはVκ]-[1ターンRSS]---[2ターンRSS]-[Jλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)、
(t)[Vκ]-[2ターンRSS]---[1ターンRSS]-[JHまたはJλ](式中、前記RSSは、反対の配向にある)。
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ゲノムが、
(a)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント(例えば、複数のVH)と、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントと、1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントと、1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む再配列されていない免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、各ヒトVH遺伝子セグメントは、抗体を発現する細胞からヒト抗体の重鎖可変領域をコードする再配列されたVDJを製造するために使用されるヒトVH遺伝子セグメント(例えば、生殖系列VH遺伝子セグメント;例えば、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される遺伝子セグメント)と同一である(または、例えば、ヒト遺伝子セグメントから最大15または10のヌクレオチド変化を有するその突然変異体である)ヒト遺伝子セグメントであり、ここで、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っている、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、または
(ii)定常領域の上流に、再配列されたVJ領域またはVDJ領域を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、ヒトJ遺伝子セグメントおよび、場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、抗体を発現する細胞からヒト抗体の重鎖可変領域をコードする再配列されたVDJを製造するために使用される、ヒトVH遺伝子セグメント(例えば、生殖系列VH遺伝子セグメント;例えば、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される遺伝子セグメント)と同一である(または例えば、ヒト遺伝子セグメントから最大15または10のヌクレオチド変化を有するその突然変異体である)ヒトVH遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
(c)重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントまたはVJまたはVDJは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスは、重鎖遺伝子座の組換えによって製造される重鎖と、軽鎖遺伝子座に由来する軽鎖とを含む抗体を製造でき、
(d)場合により、(b)(i)が適用される場合には、軽鎖遺伝子座中の各前記VH遺伝子セグメントは、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択され、場合により、各VH遺伝子セグメントは、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択され、
(e)場合により、(b)(ii)が適用される場合には、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一であり、場合により、各VH遺伝子セグメントは、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される、
非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞。
-軽鎖遺伝子座のV遺伝子セグメントレパートリーは、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVH遺伝子セグメントからなるか、または
-軽鎖遺伝子座の組み換えられたVJまたはVDJレパートリーは、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合によりヒトD遺伝子セグメントと、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントの組換えによって製造される1種または複数のヌクレオチド配列と同一である配列からなる。一実施形態では、軽鎖遺伝子座V遺伝子セグメントのすべては、この群に由来する。
(a)本発明の任意の構成、態様または実施形態による脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を用意する工程と、
(b)前記抗原(場合により、抗原は、感染性疾患病原体の抗原である)を用いて前記脊椎動物を免疫処置する工程(例えば、標準プライムブースト法を使用して)と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を採取し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と
(d)場合により、前記選択されたBリンパ球またはそ後代を、場合により、それからハイブリドーマを製造することによって不死化する工程と、
(e)Bリンパ球によって発現される抗体(例えば、IgG型抗体)を単離する工程と
を含む、第1の方法を提供する。
(i)脊椎動物は、同一抗原または異なる抗原を用いて免疫処置される(場合により、異なる抗原は、同一病原性生物(またはファミリーメンバーまたはその生物の異なる株によって)によって発現される)こと、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子)および場合により、同一のJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される。
(i)抗原は、同一病原性生物によって(またはファミリーメンバーまたはその生物の異なる株によって))発現されること、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子)および場合により、同一のJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される。
ポリクローナル抗体混合物を発現できる宿主細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)またはHEK293細胞)を製造する方法が提供され、本方法は、本発明の第1の方法の前記の第1の実施形態に従う方法において、
(a)第1および第2の抗原を用いて1種または複数の脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を免疫処置する工程(場合により、異なる抗原が同一病原性生物(またはそのファミリーメンバー)によって発現される)と、
(b)前記脊椎動物から得られるBリンパ球から、第1および第2の抗抗原抗体をコードする核酸を単離する工程と、
(c)第1の抗体の重鎖および軽鎖可変領域(場合により、全重鎖および/または軽鎖配列)のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(d)第2の抗体の重鎖可変領域および場合により軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(e)各抗体の重鎖可変領域コード配列を、重鎖発現ベクターに挿入する工程であって、場合により、各重鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(f)第1の抗体の軽鎖可変領域コード配列を、軽鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第1の抗体の軽鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(g)場合により、第2の抗体の軽鎖可変領域コード配列を、軽鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第2の抗体の軽鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(h)各発現ベクターを宿主細胞中に導入し、前記宿主細胞の混合物中で抗体鎖を同時発現させて、各々、前記重鎖可変領域および軽鎖の一方または両方を含む抗体を製造する工程であって、場合により、発現ベクターは、細胞が、抗体軽鎖および重鎖を発現できるように同一宿主細胞(例えば、CHOまたはHEK293細胞)中に一緒に導入され、その結果、細胞または複数の宿主細胞が、各々、前記重鎖可変領域および軽鎖の一方または両方を含む抗体(例えば、2種、3種、4種またはそれ以上の異なる抗体)を発現する、工程とを含み、
(i)場合により、
免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一のVH遺伝子レパートリー(場合により、単一VH遺伝子セグメント)および場合により、同一のJレパートリー(場合により、単一J遺伝子セグメント)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って、同一であるか、または
免疫処置に先立って、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の軽鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であり、
(j)場合により、
前記抗体のモノクローナル抗体またはポリクローナル混合物を発現させる工程であって、場合により、続いて、第1および/または第2の抗体の重鎖可変領域を含む抗体を単離することによって、モノクローナルまたはポリクローナル抗体混合物を製造する工程をさらに含む。
(a)ヒト血液または組織(例えば、Bリンパ球(PBL)、末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、脾臓、扁桃腺またはリンパ節)サンプルから、所定の抗原(例えば、感染性疾患病原体によって発現される抗原であり、場合により、前記血清または組織は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた)と結合する抗体を発現するBリンパ球を単離する工程と、
(b)抗体の重鎖可変領域をコードする前記Bリンパ球のヌクレオチド配列を製造するために、ヒトにおいてどのヒト生殖系列VH遺伝子セグメントが組み換えられたかを決定する工程と、
(c)本発明の第1または第2の構成に従って、その軽鎖遺伝子座中に前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントが提供されるトランスジェニック脊椎動物を構築する工程と、
(d)本発明の第1の方法における免疫処置のために前記トランスジェニック脊椎動物を提供する工程と
によって提供される。
(a)ヒト血液または組織(例えば、Bリンパ球、PBMC、骨髄、脾臓、扁桃腺またはリンパ節)サンプルから、所定の抗原(例えば、感染性疾患病原体によって発現される抗原であり、場合により、前記血清または組織は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた)と結合する抗体を発現するBリンパ球を単離する工程と、
(b)抗体の再配列されたVDJまたはVJ領域をコードする前記Bリンパ球のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(c)本発明の第1または第2の構成に従って、その軽鎖遺伝子座中に前記の再配列されたVDJまたはVJ領域が提供されるトランスジェニック脊椎動物を構築する工程と、
(d)本発明の第1の方法における免疫処置のために前記トランスジェニック脊椎動物を提供する工程と
によって提供される。
本発明は、場合により、医薬における使用のための、場合により、感染性疾患の治療および/または予防のための、本発明の第2の方法(工程(j)を含む)によって得ることができるか、または得られる単離された抗体(例えば、IgG1型などのIgG型抗体)またはその突然変異体もしくは派生抗体であって、(i)単離された抗体が、前記の第1の抗体の軽鎖可変領域の2コピーと対を形成した、前記の第1の抗体の重鎖可変領域の2コピーを含むか、もしくは(ii)単離された抗体が、前記の第1の抗体の軽鎖可変領域の2コピーと対を形成した、前記の第2の抗体の重鎖可変領域の2コピーを含むか、もしくは(iii)単離された抗体が、第1の抗体の軽鎖可変領域の1コピーと対を形成した、前記の第1の抗体の重鎖可変領域の1コピーを含む二重特異性抗体であり、場合により、二重特異性抗体が、請求項24に記載の前記第1および第2の抗原と結合する、単離された抗体またはその突然変異体もしくは派生抗体を提供する。
ゲノムが、
(a)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメント(場合により、再配列されたVLDJHCHまたはVλDJHCH)、または
(ii)定常領域の上流に、VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69および少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数のヒトVH遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJH遺伝子セグメント(場合により、各VH遺伝子セグメント(および場合により各D)は、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される)
のいずれかを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント(例えば、複数のVL)および1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含み、場合により、本発明の第1の構成の(b)(i)または(b)(ii)に従う免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスが重鎖遺伝子座の組換えによって製造される重鎖と軽鎖遺伝子座の組換えによって製造される軽鎖とを含む抗体を製造できる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞。
ゲノムが、(a)(i)定常領域の上流に、1種または複数のヒトVL遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のJH遺伝子セグメントを含む再配列されていない免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、各ヒトVL遺伝子セグメントは、抗体を発現する細胞からヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする再配列されたVJを製造するために使用される、ヒトVL遺伝子セグメント(例えば、生殖系列VL遺伝子セグメント;例えば、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択されるVL遺伝子セグメント)と同一である(または例えば、ヒト遺伝子セグメントから最大15または10のヌクレオチド変更を有する突然変異体)ヒト遺伝子セグメントであり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座、または
(ii)定常領域の上流に再配列されたVJ領域またはVDJ領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、抗体を発現する細胞からヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする再配列されたVJを製造するために使用される、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、ヒトVL遺伝子セグメント(例えば、生殖系列VL遺伝子セグメント;例えば、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択されるVL遺伝子セグメント)と同一である(または例えば、ヒト遺伝子セグメントから最大15または10のヌクレオチド変更を有する突然変異体)ヒト遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一であり、前記抗体は、感染性疾患病原体の抗原と結合する(場合により、前記抗体の可変領域は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた抗体と同一である)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメント(例えば、複数のVL)と、1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含み、
(c)軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントは、その定常領域と作動可能に連結しており、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントまたはVJまたはVDJは、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスは、軽鎖遺伝子座の組換えによって製造される軽鎖と、重鎖遺伝子座に由来する重鎖とを含む抗体を製造でき、
(d)場合により、(a)(i)が適用される場合には、重鎖遺伝子座中の各前記VL遺伝子セグメントは、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIA2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれに対して少なくとも80%同一である遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択され;場合により、各VL遺伝子セグメントは、以下のリストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択され、
(e)場合により、(a)(ii)が適用される場合には、組み換えられた領域のヌクレオチド配列は、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合により、ヒトD遺伝子セグメントの、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVL遺伝子セグメントとの組換えによって製造されるヌクレオチド配列と同一である、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)または脊椎動物細胞。
-重鎖遺伝子座のV遺伝子セグメントレパートリーは、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択される1種または複数(またはそれのみからなる)のヒトVL遺伝子セグメントからなり、
-重鎖遺伝子座の組み換えられたVJまたはVDJレパートリーは、ヒトJ遺伝子セグメントおよび場合によりヒトD遺伝子セグメントと、VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトVL遺伝子セグメントの組換えによって製造される1種または複数のヌクレオチド配列と同一の配列からなる。
(a)本発明の第3または第4の実施形態による脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)を用意する工程と、
(b)前記抗原を用いて前記脊椎動物を免疫処置する工程と(例えば、標準プライムブーストを使用して)(場合により、抗原は、感染性疾患病原体の抗原である)、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択されたBリンパ球またはその後代を、それからハイブリドーマを製造することによって不死化する工程と、
(e)Bリンパ球によって発現される抗体(例えば、IgG型抗体)を単離する工程と、
を含み、
(f)場合により、第3の方法は、前記抗原と結合する前記抗体をコードする前記Bリンパ球核酸から単離する工程、場合により、抗体の重鎖定常領域ヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換する工程、および場合により、前記抗体の可変領域を親和性成熟させる工程、および場合により、前記核酸を発現ベクター、場合により、宿主に挿入する工程を含む、方法を提供する。
(i)脊椎動物は、同一抗原または異なる抗原を用いて免疫処置される(場合により、異なる抗原は、同一病原性生物(またはその異なるファミリーメンバーまたはその生物の異なる株)によって発現される)こと、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一のVL遺伝子レパートリー(場合により、単一VL遺伝子)および場合により、同一のDおよび/またはJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される、方法を提供する。
(i)抗原は、同一病原性生物(またはその異なるファミリーメンバーまたはその生物の異なる株)によって発現されること、
(ii)免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一のVL遺伝子レパートリー(場合により、単一VL遺伝子)および場合により、同一のDおよび/またはJレパートリーを含有し、場合により、哺乳類の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること、
(iii)免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一であること
が個別に、または組み合わせて((i)および(ii)または(i)および(iii))適用される、方法を提供する。
(a)第1および第2の抗原を用いて1種または複数の脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を免疫処置する工程(場合により、異なる抗原が同一病原性生物(またはそのファミリーメンバー)によって発現される)と、
(b)前記脊椎動物から得られるBリンパ球から、第1および第2の抗抗原抗体をコードする核酸を単離する工程と、
(c)第1の抗体の重鎖および軽鎖可変領域(場合により、全重鎖および/または軽鎖配列)のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(d)第2の抗体の軽鎖可変領域および場合により、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(e)各抗体の軽鎖可変領域コード配列を、軽鎖発現ベクターに挿入する工程であって、場合により、各軽鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(f)第1の抗体の重鎖可変領域コード配列を、重鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第1の抗体の重鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(g)場合により、第2の抗体の重鎖可変領域コード配列を、重鎖発現ベクター中に挿入する工程であって、場合により、第2の抗体の重鎖の定常領域コード配列は、ヒトまたはヒト化定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換される、工程と、
(h)各発現ベクターを宿主細胞中に導入し、前記宿主細胞の混合物中で抗体鎖を同時発現させて、各々、前記軽鎖可変領域および重鎖の一方または両方を含む抗体を製造する工程であって、場合により、発現ベクターは、細胞が、抗体軽鎖および重鎖を発現できるように同一宿主細胞(例えば、CHOまたはHEK293細胞)中に一緒に導入され、その結果、細胞または複数の宿主細胞が、各々、前記軽鎖可変領域および重鎖の一方または両方を含む抗体(例えば、2種、3種または4種の異なる抗体)を発現する、工程とを含み、
(i)場合により、
免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一のVL遺伝子レパートリー(場合により、単一VL遺伝子セグメント)および場合により、同一のDおよび/またはJレパートリー(場合により、単一DおよびJ遺伝子セグメント)を含有し、場合により、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って、同一であるか、または
免疫処置に先立って、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、同一の再配列されたVJまたはVDJレパートリー(場合により、単一VJまたはVDJ)を含有し、場合により、脊椎動物の重鎖遺伝子座は、免疫処置に先立って同一である、方法を提供する。
(a)ヒト血液または組織(例えば、Bリンパ球、PBMC、骨髄、脾臓、扁桃腺またはリンパ節)サンプルから、所定の抗原(例えば、感染性疾患病原体によって発現される抗原であり、場合により、前記血清または組織は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた)と結合する抗体を発現するBリンパ球を単離する工程と、
(b)抗体の軽鎖可変領域をコードする前記Bリンパ球のヌクレオチド配列を製造するために、ヒトにおいてどのヒト生殖系列VL遺伝子セグメントが組み換えられたかを決定する工程と、
(c)本発明の第3または第4の構成に従って、その重鎖遺伝子座中に前記ヒト生殖系列VL遺伝子セグメントが提供されるトランスジェニック脊椎動物を構築する工程と、
(d)本発明の第4、第5または第6の方法における免疫処置のために前記トランスジェニック脊椎動物を提供する工程と
によって提供される。
(a)ヒト血液または組織(例えば、Bリンパ球、PBMC、骨髄、脾臓、扁桃腺またはリンパ節)サンプルから、所定の抗原(例えば、感染性疾患病原体によって発現される抗原であり、場合により、前記血清または組織は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られた)と結合する抗体を発現するBリンパ球を単離する工程と、
(b)抗体の再配列されたVDJまたはVJ領域をコードする前記Bリンパ球のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(c)本発明の第3または第4の構成に従って、その重鎖遺伝子座中に前記の再配列されたVDJまたはVJ領域が提供されるトランスジェニック脊椎動物を構築する工程と、
(d)本発明の第4、第5または第6の方法の方法における免疫処置のために前記トランスジェニック脊椎動物を提供する工程と
によって提供される。
本発明は、場合により、医薬における使用のための、場合により、感染性疾患の治療および/または予防のための、第7の方法によって得ることができるか、または得られる単離された抗体(例えば、IgG型抗体)またはその突然変異体もしくは派生抗体であって、(i)単離された抗体が、前記の第1の抗体の軽鎖可変領域の2コピーと対を形成した、前記の第1の抗体の重鎖可変領域の2コピーを含むか、もしくは(ii)単離された抗体が、前記の第1の抗体の軽鎖可変領域の2コピーと対を形成した、前記の第2の抗体の重鎖可変領域の2コピーを含むか、もしくは(iii)単離された抗体が、第1の抗体の軽鎖可変領域の1コピーと対を形成した、前記の第1の抗体の重鎖可変領域の1コピーおよび第1の抗体の軽鎖可変領域の1コピーと対を形成した前記抗体の重鎖可変領域の1コピーを含む二重特異性抗体であり、場合により、二重特異性抗体が、上記の前記の第1および第2の抗原と結合する、単離された抗体またはその突然変異体もしくは派生抗体を提供する。
上記の種々の構成、態様、実施形態および実施例では、本発明は、当業者に、感染性疾患を治療および/または予防するために抗体を作製する適用のためにレパートリーを目的に合わせるか、または偏らせる方法で、免疫グロブリン遺伝子セグメントを選択する可能性を提供する。本発明者らは、得られた抗体の所望の適用に従って、本発明において使用するために以下の遺伝子セグメントの群を分類した。
病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメント。
(b)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)Kv325、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVK遺伝子セグメント。
(d)VH遺伝子セグメント VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(e)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
(f)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
細菌病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4Aおよびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(b)VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVk遺伝子セグメント。
(c)VH遺伝子セグメント VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(d)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
(e)JH2、JH3、JH4およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
Hインフルエンザによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4Aおよびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(b)VkIIファミリーメンバー、VkIIIファミリーメンバー、VkI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VkII A2(場合により、A2a対立遺伝子)、VkA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVk遺伝子セグメント。
(c)VH遺伝子セグメント VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIbファミリーメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(d)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
大腸菌(E Coli)または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VH遺伝子セグメント VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHH11、VHIII VH26(VH3-23)それらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント、例えば、VHIII9.1+JH3;またはVHH11+JH4;またはVHIII VH26+JH2。
(b)VKI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVk遺伝子セグメント。
(c)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλII2.1およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(d)JH2、JH3、JH4およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
ウイルス性病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VHIII遺伝子ファミリーメンバー、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)Kv325およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVk遺伝子セグメント。
(d)JH3、JH5、JH6およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
(e)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
(f)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
ヘルペスウイルス(Herpes Virus)ファミリー(例えば、VZVまたはHSV)によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VHIII遺伝子ファミリーメンバー、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)JH3、JH5、JH6およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
(d)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
(e)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
CMVによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)Hv1051およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Kv325およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVk遺伝子セグメント。
HIVによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
インフルエンザウイルスによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VH1-69およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用される1種または複数のV、Dおよび/またはすべてのJ遺伝子セグメントは、リストA1から選択され得る。したがって、例えば、本発明の第1の構成の(a)では、列挙される重鎖V遺伝子セグメントは、場合により、そのリスト中のDを含むリストA中のVH遺伝子セグメントから選択される。
本発明のこの態様は、比較的長いHCDR3結合部位を有する脊椎動物、細胞、方法および抗体の開発に関する。ゲノムおよび抗体が、結合または中和についてより長いHCDR3の長さを用いると有利に対処される感染性疾患病原体抗原またはその他の抗原に対応するためのその遺伝子セグメント使用の点で目的に合わせられる実施形態も提供される。抗体は、非病原体標的抗原、例えば、接触のために長いCDRを必要とするクレフト中にエピトープを有する抗原または有害なヒト疾患もしくは状態を引き起こすか、もしくは関与している病原体に由来する抗原を用いる免疫処置によって脊椎動物において作製されることがある。例として、細菌性またはウイルス性病原体があり、標的抗原は細菌性細胞表面抗原またはウイルス性表面露出型抗原(例えば、コートタンパク質)であり得る。さらに、またはあるいは、抗原は、病原性細菌またはウイルスから放出される(例えば、分泌される)抗原であり得る。本発明は、病原体抗原に対処することに限定されず、長いCDR3が結合にとって有用であろうその他の抗原(例えば、酵素活性部位または受容体のクレフト)に対処することにとっても有用である。
(a)ヒトVHに偏った本発明の脊椎動物を用意する工程と、
(b)前記HIV抗原、インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)b型多糖、サイトメガロウイルス抗原またはロタウイルス抗原を用いて前記脊椎動物を免疫処置する工程と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択されたBリンパ球またはその後代を、場合により、それからハイブリドーマを製造することによって不死化する工程と、
(e)Bリンパ球によって発現される抗体(例えば、IgG型抗体)を単離する工程とを含み、ここで、抗体は、20個のアミノ酸またはそれ以上のHCDR3の長さを有する、
HIV抗原、インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)b型多糖、サイトメガロウイルス抗原またはロタウイルス抗原と結合する抗体を単離する方法を提供する。
ヒト(例えば、乳児ヒト)においてHIVを治療および/または予防するための、抗HIV抗体を含む医薬組成物。
Dの偏り
1. ゲノムは、ヒトD2および/またはD3ファミリーに偏っているか、またはD1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19の群から選択される1種、複数またはすべてのヒトD遺伝子セグメントに偏っているヒト免疫グロブリンD遺伝子セグメントレパートリーを含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
8. ゲノムは、VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1およびVH7-4-1の群から選択される遺伝子セグメントのうち1種、複数またはすべてに偏っているヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントレパートリーを含む、場合により、条項1から7のいずれか一項に記載の、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
25. ゲノムは、ヒトJH6に偏っているヒト免疫グロブリンJH遺伝子セグメントレパートリーを含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
(i)いくつかの脊椎動物種にわたって保存されているYYGおよびYYGXDXモチーフを含有すること、
(ii)その他のヒトJH6変異体よりも1つ少ないTACコドン(停止コドンを危険にさらすAIDホットスポット)ならびにYYGおよびYYGXDXモチーフを保存するコドンの代わりの選択を提供すること、
(iii)HCDR3/FW4接合部の領域におけるGGCA AIDホットスポットを避けること、
(iv)JH6*02変異体のヒトにおけるよくある出現(したがって、保存および許容性)
に基づいてヒトJH6*02を選択した。
Dは、
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01およびD3-22*01、または
D2-2*02、D3-9*01およびD3-10*01、または
D3-9*01およびD3-10*01、または
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、または
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、またはD2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D1-26、D2-2、D3-10およびD6-19、または
D2-2、D3-9およびD3-10
の群から選択される。
(a)条項1から32のいずれか一項に記載の脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を用意する工程と、
(b)前記抗原を用いて前記脊椎動物を免疫処置する工程と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択されたBリンパ球またはその後代を、場合により、それからハイブリドーマを製造することによって不死化させる工程と、
(e)Bリンパ球によって発現される抗体(例えば、IgG型抗体)を単離する工程と
を含む、方法。
VHは、
VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01およびVH7-4-1*01
の群から選択され、
Dは、
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01およびD3-22*01、または
D2-2*02、D3-9*01およびD3-10*01、または
D3-9*01およびD3-10*01、または
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、または
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13およびD6-19、またはD2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01、または
D1-26、D2-2、D3-10およびD6-19、または
D2-2、D3-9およびD3-10
の群から選択され、
場合により、JHはJH6(例えば、JH6*02)である、1種または複数の重鎖を含む抗体重鎖のレパートリー(例えば、抗体によって提供される)であって、
(a)重鎖可変ドメインは、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)においてin vivoで製造されており、および/または
(b)重鎖可変ドメインは、対応するヒト生殖系列V、DおよびJ配列と比較される場合に非ヒト脊椎動物AIDパターン体細胞超突然変異、(例えば、マウスまたはラットAIDパターン突然変異)および/または対応するヒト生殖系列V、DおよびJ配列と比較される場合に非ヒト(例えば、マウスまたはラット)ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)パターン接合部突然変異を含む、抗体重鎖のレパートリー。
IGHV6-1
IGHV3-7
IGHV1-8
IGHV3-9
IGHV3-11
IGHV3-13
IGHV1-18
IGHV3-30
IGHV4-31
IGHV4-39
IGHV4-59
場合により、同様に(i)および/または(ii)
(i)
IGHV1-2
IGHV2-5および
IGHV3-21
(ii)
IGHV1-2
IGHV2-5
IGHV3-21
IGHV1-24
を含む。
IGHV6-1*01
IGHV3-7*01
IGHV1-8*01
IGHV3-9*01
IGHV3-11*01
IGHV3-13*01
IGHV1-18*01
IGHV3-30*18
IGHV4-31*03
IGHV4-39*01および
IGHV4-59*01、
場合により、同様に(iii)または(iv)
(ii)
IGHV1-2*04
IGHV2-5*10および
IGHV3-21*03
(iv)
IGHV1-2*02
IGHV2-5*01
IGHV3-21*01および
IGHV1-24*01
を含む。
IGHJ2*01
IGHJ3*02
IGHJ4*02
IGHJ5*02および
IGHJ6*02
IGHD1-1
IGHD2-2
IGHD3-9
IGHD3-10
IGHD5-12
IGHD6-13
IGHD1-14
IGHD2-15
IGHD3-16
IGHD4-17
IGHD6-19
IGHD2-21
IGHD5-24
IGHD1-26および
IGHD7-27
場合により、同様に(v)または(vi)
(v)
IGHD3-3
(vi)
IGHD3-3
IGHD4-4
IGHD5-5
IGHD6-6
IGHD1-7
IGHD2-8および
IGHD2-8
を含む。
(実施例1)
「マウスゲノムに多型V領域を付加するようリコンビニアリングされたBACベクター」
図1から3は、多型V遺伝子領域をゲノムDNA中に導入するために使用され得るリコンビニアリング方法(上記の参考文献を参照のこと)を表す。一実施形態では、標準技術によってヒト重鎖領域に由来するゲノム断片を、細菌人工染色体(BAC)ベクター中に挿入する。20kb~200kbまたはそれ以上の大きさの範囲であり得るこのようなBACは、市販のライブラリーの配列検索を含めた標準技術によってか、または対象とするBACを有するものを同定するためのBACを含有する細菌コロニーとのハイブリダイゼーションによって、BACのライブラリーから単離できることが好ましい。
「改変されたBACのSRMCEを使用して、ゲノムに多型V領域を付加すること」
実施例1に記載された方法を使用して作製された多型V遺伝子セグメントを有する改変されたBACを使用して、非ヒト哺乳類のゲノムを変更できる。これらの変更は、正常な免疫グロブリン領域組換えが、ヒトV遺伝子セグメントを含むVDJまたはVJの組合せをもたらす無傷のIG遺伝子座をもたらし得る。このような動物が作製され得る方法の一例は、例えば、図4に概説された戦略を使用して、マウス胚性幹(ES)細胞のゲノムを変更することによってである。
「13種のVH1-69対立遺伝子のアラインメント」
さらなるV遺伝子セグメント多型を組み込むことによってより多様な抗体レパートリーを築くことは、V遺伝子セグメントの多型対立遺伝子を入手できることが必要である。このような対立遺伝子の1つの供給源として、配列データベースが挙げられる。この実施例では、VH1-69遺伝子セグメントの13種の別個の対立遺伝子が提供される。これらの対立遺伝子配列および比較は、「IMmunoGeneTics」IMGT Information System (www.imgt.com)データベースから取り出されている。図5は、対立遺伝子*02から*13の、*01対立遺伝子とのアラインメントの略図である。VH1-69*01ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図の頂部に提供されている。残りの対立遺伝子が、*01対立遺伝子配列と同一である場合は、ダッシュが配列の下に挿入される。ヌクレオチドの相違は、適当な対立遺伝子と並んで記されており、配列変更が、タンパク質コーディング変更をもたらす場合には、トリプレットの上にアミノ酸変更が示されている。
「ヒトJH6*02に基づいた、トランスジェニックマウス、B細胞、ハイブリドーマ、抗体および重鎖」
機能的ヒト遺伝子セグメントレパートリー(VH2-26からJH6、ヒトIgH遺伝子座の構造のIMGTデータベース;http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGK)を本発明者らによってセクターとし、2種の異なるトランスジェニック重鎖対立遺伝子(S2FおよびS3Fと示される)および対応するマウスを製造した。トランスジェニック対立遺伝子は、マウスにおいて発現させ、RNA転写物レベルで重鎖レパートリーを評価した。生物情報科学方法を使用して深い配列分析を実施して、少なくとも20個のアミノ酸のHCDR3の長さを有する可変ドメイン配列中に含むV、DおよびJH遺伝子使用を評価した。内因性マウス可変領域遺伝子セグメントは、反転によって不活化した(WO2011004192に記載される方法のように、この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。
口腔粘膜検体を採取することによって、9人の匿名の同意したヒトドナーからDNAサンプルを入手した。
一連のヒト細菌人工染色体(BAC)クローンは、遺伝子名(IGH)または位置(染色体14:106026574-107346185)に基づく、Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html)またはUCSC(http://genome.ucsc.edu/)ヒトデータベース検索から同定された。7種のヒトRP11 BACクローン、ヒトJH6*02を保持するRP11-1065N8 BACを選択した。ヒトIgH遺伝子座DNAの供給源として、合わせて、以下のBACを同定した:RP11-1065N8、RP11-659B19、RP11-141I7、RP-112H5、RP11-101G24、RP11-12F16およびRP11-47P23。
第1のIGH BAC(RP11-1065N8)に由来するヒト重鎖遺伝子セグメントの、マウスAB2.1 ES細胞(Baylor College of Medicine)のIGH遺伝子座への挿入を実施して、S1対立遺伝子と示される重鎖対立遺伝子を作製した。挿入されるヒト配列は、ヒト染色体14位置106494908から位置106328951の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6(5'から3'の順序で)を含み、ここで、JH6は、ヒトJH6*02変異体であるよう選択される。挿入は、マウスCμ領域の上流である、マウス染色体12上の位置114666435と114666436の間で行った。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントは、挿入されたヒト重鎖DNAのすぐ上流(の5')の遺伝子座中に保持された。
VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01およびVH7-4-1*01
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01およびD6-19*01
S2FまたはS3F遺伝子型のトランスジェニックマウスを、商業的に入手したか、または社内で製造した、フロイントの完全アジュバント(Sigma F 5881)および10μg/動物CpG(CpG oligo; Invivogen、San Diego、California、USA)中でip経路によって、抗原1(OVA(Sigma A7641);抗原2(ヒト感染性疾患病原体抗原)および抗原3(ヒト抗原)を用いて20~40μgの組換えタンパク質を用いてプライムし、次いで、フロイントの不完全アジュバント(Sigma F 5506)および10μg/動物CpG中のおよそ半量の抗原を用いて、およそ2週間の間隔で2回ブーストした。最後のブーストは、あらゆるアジュバントを伴わずに2週間後にiv投与し、これはPBS中に5~10μgのタンパク質を含有していた。
脾臓を、最後のブーストの3日後に採取し、脾臓細胞をCpG(25μm最終濃度)で処理し、翌日まで静置した。次いで、細胞をSP0/2 Ag14骨髄腫細胞(HPA Culturesカタログ番号85072401)と融合した。融合した細胞を20分間回復させ、翌朝までT75フラスコ中に播種した。次いで、細胞を遠心沈殿させ、段階希釈によって96ウェル培養プレート上にプレーティングし、約10日間静置し、その後、スクリーニングした。この期間の間に、培地を1~3回変更した。
上記のハイブリドーマウェルの培養上清を、ユウロピウムクリプテート標識した抗マウスIgG(Cisbio抗マウスIgユウロピウムクリプテート)およびビオチンタグをつけた標的抗原を市販のストレプトアビジンがコンジュゲートしているドナー(Cisbio;ストレプトアビジンコンジュゲートD2)とともに使用する均一時間分解蛍光アッセイ(htrf)を使用してか、またはIgG特異的384ウェルELISAによってスクリーニングした。htrfによって同定された陽性ウェルを24ウェルプレートにスケールアップし、直ちに、IgG特異的検出ELISA方法を使用して対比スクリーニングした。第一次ELISAスクリーニングによって同定された陽性を、24ウェルプレートに直ちに拡大した。培養物が24ウェルプレートの段階に拡大され、コンフルエンシーに達すると、htrfまたはIgG特異的ELISAを使用して上清を再試験して、標的抗原との結合を確認した。次いで、このように確認された培養物の上清をまた、BioRad ProteOn XPR36機器を使用する表面プラズモン共鳴によって分析した。このために、バイオセンサーチップ表面に共有結合によってカップリングされた抗マウスIgG(GE Healthcare BR-1008-38))を有していたバイオセンサーGLMチップ(BioRad 176-512)上にハイブリドーマ培養物中で発現された抗体を捕獲した。次いで、抗原を分析物として使用し、捕獲されたハイブリドーマ抗体表面上を通過させた。抗原2および抗原3には、256nM、64nM、16nM、4nMおよび1nMの濃度を通常使用し、抗原1には、1028nM、256nM、64nM、16nMおよび4nMの濃度を通常使用し、結合曲線は、0nM注入(すなわち、バッファー単独)を使用して、二重参照した。動態学および全体的な親和性は、BioRad ProteOn XPR36分析ソフトウェアに備わっている1:1モデルを使用して決定した。
分析のための配列は、2つの異なる方法から入手した:
・第1は、脾臓から抽出されたRNAからである:PCR鋳型としてマウスIGH遺伝子座のCmu領域に基づいてオリゴを使用して第1のcDNA鎖を合成した。PCRは、オリゴdT-アンカープライマーとともにこのオリゴを使用して実施した。次いで、PCR産物をpDriveベクター(Qiagen)中にクローニングし、次いで、配列決定した。
Claims (16)
- 少なくとも20アミノ酸長のHCDR3配列を有する抗体を産生する方法であって、前記抗体が、感染性疾患病原体の抗原に結合し、
(a)ゲノムが、
内因性のマウスまたはラット定常領域の上流に、1種または複数のヒトVH遺伝子セグメント、1種または複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、
VH遺伝子セグメントIGHV1-2*02、IGHV1-18*01、IGHV3-7*01、IGHV6-1*01、IGHV3-9*01、IGHV2-5*10、IGHV7-4-1*01、IGHV1-3*01、IGHV4-4*02、IGHV3-13*01、IGHV3-23*04、IGHV1-8*01、IGHV3-21*03およびIGHV3-11*01を含み、かつ、DセグメントIGHD2-2*02、IGHD3-9*01、IGHD3-10*01、IGHD6-13*01、IGHD4-17*01、IGHD6-19*01、IGHD3-22*01およびIGHD1-26*01を含む、20アミノ酸長以上のHCDR3を産生することができるVHおよびD遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
定常領域の上流に、1種または複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1種または複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含むトランスジェニックマウスまたはラットを用意する工程であって、
重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、その定常領域と作動可能に連結しており、その結果、免疫処置の際に、マウスまたはラットが、重鎖遺伝子座の再構成によって生じた重鎖と軽鎖遺伝子座の再構成によって生じた軽鎖とを含む抗体を製造できるようになる、工程と、
(b)前記抗原を用いて前記マウスまたはラットを免疫処置する工程であって、
標的抗原で免疫されたマウスまたはラットが、標的抗原に特異的な重鎖を含む抗体を産生し、重鎖の可変ドメインが、VH、DおよびJH遺伝子セグメント間の再構成の産物であり、VH遺伝子セグメントが、IGHV1-2*02、IGHV1-18*01、IGHV3-7*01、IGHV6-1*01、IGHV3-9*01、IGHV2-5*10、IGHV7-4-1*01、IGHV1-3*01、IGHV4-4*02、IGHV3-13*01、IGHV3-23*04、IGHV1-8*01、IGHV3-21*03およびIGHV3-11*01から選択され、Dセグメントが、IGHD2-2*02、IGHD3-9*01、IGHD3-10*01、IGHD6-13*01、IGHD4-17*01、IGHD6-19*01、IGHD3-22*01およびIGHD1-26*01から選択され、可変ドメインHCDR3が、20アミノ酸長以上を有する、工程と
(c)マウスまたはラットからBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1種または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)1種または複数のBリンパ球によって発現される、少なくとも20アミノ酸長のHCDR3配列を有する抗体を単離する工程と
を含み、
前記方法は、その可変ドメインが、VH、DおよびJH遺伝子セグメント間の再構成の産物である重鎖を含む抗体を選択する工程であって、VH遺伝子セグメントが、IGHV1-2*02、IGHV1-18*01、IGHV3-7*01、IGHV6-1*01、IGHV3-9*01、IGHV2-5*10、IGHV7-4-1*01、IGHV1-3*01、IGHV4-4*02、IGHV3-13*01、IGHV3-23*04、IGHV1-8*01、IGHV3-21*03およびIGHV3-11*01から選択され、Dセグメントが、IGHD2-2*02、IGHD3-9*01、IGHD3-10*01、IGHD6-13*01、IGHD4-17*01、IGHD6-19*01、IGHD3-22*01およびIGHD1-26*01から選択され、可変ドメインHCDR3が、20アミノ酸長以上を有する、工程を含む、方法。 - 前記選択された1種または複数のBリンパ球またはその後代を不死化させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 不死化させたBリンパ球またはその後代から、ハイブリドーマを製造する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記Bリンパ球から前記抗原と結合する前記抗体をコードする核酸を単離する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 抗体の重鎖定常領域が非ヒトであり、重鎖定常領域ヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と交換する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体の可変領域を親和性成熟させる工程をさらに含む、請求項4または5に記載の方法。
- 前記核酸を発現ベクターに挿入する工程を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸を宿主細胞に挿入する工程を含む、請求項7に記載の方法。
- 請求項1から8のいずれか項に方法によって製造される抗体の突然変異体または派生体を作製する工程をさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- (a)ヒト血液または組織サンプルから、抗原と結合する抗体を発現するBリンパ球を単離する工程と、
(b)抗体の重鎖可変領域をコードする前記Bリンパ球のヌクレオチド配列を製造するために、ヒトにおいてどのヒト生殖系列VH遺伝子セグメントが再構成されたかを決定する工程と、
(c)請求項1に従って、その軽鎖遺伝子座中に前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントが提供されるトランスジェニックマウスまたはラットを構築する工程と、
(d)請求項1から9のいずれか一項に記載の方法における免疫処置のために前記トランスジェニックマウスまたはラットを提供する工程と
によって、免疫処置に使用される各マウスまたはラットが提供される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - 工程(a)のBリンパ球が、Bリンパ球、PBMC、骨髄、脾臓、扁桃腺またはリンパ節から単離されたものである、請求項10に記載の方法。
- 前記血液または組織は、前記抗原を有するか、または分泌する生物によって引き起こされるか、または媒介される疾患または状態を患っているか、それに対して感受性であるか、またはそれから回復したヒト個体から得られた、または前記生物を有するヒト個体から得られたものである、請求項10または11に記載の方法。
- 抗原が、細菌感染性病原体によって発現される抗原である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原が、ウイルス感染性病原体によって発現される抗原である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原が、HIVの抗原である、請求項14に記載の方法。
- 抗原が、マラリア病原体の抗原である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
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