RS54367B2 - Miš sa zajedničkim lakim lancem - Google Patents

Miš sa zajedničkim lakim lancem

Info

Publication number
RS54367B2
RS54367B2 RS20150772A RSP20150772A RS54367B2 RS 54367 B2 RS54367 B2 RS 54367B2 RS 20150772 A RS20150772 A RS 20150772A RS P20150772 A RSP20150772 A RS P20150772A RS 54367 B2 RS54367 B2 RS 54367B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
gene
heavy chain
variable region
Prior art date
Application number
RS20150772A
Other languages
English (en)
Inventor
John Mcwhirter
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Samuel Davis
Andrew J Murphy
David R Buckler
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43663643&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS54367(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS54367B1 publication Critical patent/RS54367B1/sr
Publication of RS54367B2 publication Critical patent/RS54367B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast pronalaska
[0001] Opisan je genetski modifikovan miš koji eksprimira antitela koja imaju zajednički humani varijablni/mišji konstantan lak lanac povezan sa različitim delovima humanih varijablnih/mišjih konstantnih teških lanaca. Takođe je data metoda za dobijanje humanih bispecifičnih antitela od sekvenci gena humanih varijablnih regiona B ćelija miša.
Stanje tehnike
[0002] Antitela obično sadrže homodimerne komponente teškog lanca, gde je svaki monomer teškog lanca povezan sa identičnim lakim lancem. Antitela sa heterodimerinom komponentom teškog lanca (npr., bispecifična antitela) su poželjna kao terapeutska antitela. Međutim, dobijanje bispecifičnih antitela sa odgovarajućom komponentnom lakog lanca koja se na zadovoljavajući način mogu povezati sa svakim od teških lanaca bispecifičnog antitela pokazalo se kao sporno.
[0003] U jednom pristupu, lak lanac može da se odabere pregledom statističkog korišćenja varijabilnih domena lakih lanaca, čime se identifikuje najčešće korišćen lak lanac u humanim antitelima, i sparivanje ovog lakog lanca in vitro sa dva teška lanca različite specifičnosti.
[0004] U narednom pristupu, lak lanac se može odabrati posmatranjem sekvenci lakog lanca u biblioteci eksponiranoj na fazima (engl. a phage display library (npr., biblioteka eksponiranja na fazima koja sadrži sekvence varijabilnog regiona humanog lakog lanca, npr., biblioteka humanog ScFv)) i izborom najčešće korišćenog varijabilnog regiona lakog lanca iz biblioteke. Laki lanac se zatim može testirati na dva različita teška lanca od interesa.
[0005] U narednom pristupu, laki lanac se može odabrati testiranjem biblioteke varijabilnih sekvenci lakog lanca eksponiranih na fazima korišćenjem kao proba, varijabilnih sekvenci oba teška lanca od interesa. Laki lanac koji se vezuje sa varijabilnim sekvencama oba teška lanca, može se izabrati kao lak lanac za teške lance.
[0006] U sledećem pristupu, naznačen laki lanac može da bude usklađen sa srodnim lakim lancima koji pripadaju tim teškim lancima i vrše se modifikacije na lakim lancima tako da oni bolje odgovaraju karakteristikama sekvenci koje su zajedničke za srodne lake lance oba teška lanca. Ukoliko se verovatnoća za imunogenost treba svesti na minimum, modifikacije pretežno daju sekvence koje su prisutne u poznatim sekvencama humanih lakih lanaca, tako da je malo verovatno da će proteolitička obrada dovesti do stvaranja T ćelijskog epitopa zasnovanog na parameterima i metodama koje su poznate u tehnici za procenu verovatnoće imunogenosti (tj., in silico kao i (engl.wet assays )vlažne probe)).
[0007] Svi navedeni pristupi zasnivaju se na in vitro metodama koje uključuju brojna a priori ograničenja, npr. identičnost sekvenci, sposobnost da se vezuje sa specifičnim prethodno odabranim teškim lancima, itd.U tehnici postoji potreba za kompozicijama i metodama koje se ne oslanjaju na uslov manipulisanja in vitro, već umesto toga primenjuju biološki osetljivije pristupe za dobijanje humanih proteina koji vezuju epitop i koji uključuju zajednički laki lanac.
Kratak opis slika
[0008]
Slika 1 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom Vκ1-39Jκ5 gena čoveka.
Slika 2 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom Vκ3-20Jκ1 gena čoveka.
Slika 3 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom VpreB/Jλ5 gena čoveka.
OPIS
[0009] Opisani su genetski modifikovani miševi koji eksprimiraju humane imunoglubulinske varijabilne domene teškog i lakog lanca, pri čemu miševi imaju ograničen repertoar varijabilnog lakog lanca. Posebno, opisan je miš koji sadrži:
(a) zamenu u endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih endogenih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša jednim preuređenim humanim segmentom Vκ1-39/Jκ gena ili jednim preuređenim humanim segmentom Vκ3-20/Jκ gena, gde je segment gena čoveka operativno vezan za endogeni konstantan κ gen miša i pri čemu miš nema endogeni lokus varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji može da se preuredi i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša; i
(b) zamenu endogenog genskog lokusa miša varijabilnog regiona teškog lanca različitim segmenatima gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni gen konstantnog teškog lanca miša i gde su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.
Takođe je data i ćelija izolovana iz genetski modifikovanog miša prema bilo kom od prethodnih realizacija, pri čemu ćelija sadrži:
(a) zamenu u endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih endogenih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulinska miša jednim segmentom Vκ1-39/Jκ gena čoveka ili jednim segmentom Vκ3-20/Jκ gena čoveka, pri čemu je segment gena čoveka operativno vezan za endogeni gen za konstantan deo κ miša i pri čemu ćelija nema endogeni lokus varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji je u stanju da se preuredi i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša; i,
(b) zamenu endogenog genskog lokusa miša varijabilnog regiona teškog lanca različitim segmenatima gena varijabilnog regiona humanog teškog lancapri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni gen konstantnog teškog lanca miša i gde su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.
Dalje je obezbeđena metoda za dobijanje antitela koje vezuje antigen od interesa, a koji obuhvata imunizaciju miša antigenom od interesa, dobijajući tako gensku sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulina miša i primenjujući gensku sekvencu imunoglobulinskog varijabilnog regiona za dobijanje antitela koje vezuje antigen. Dodatno je obezbeđena i emtoda za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, pri čemu metoda obuhvata imunizaciju miša i dobijanje bispecifičnog antitela koristeći genske sekvence humanog varijabilnog regiona B ćelija miša. Takođe je obezbeđena upotreba miša za selekciju varijabilnog domena ili genskog segmenta humanog imunoglobulinskog teškog lanca.
Takođe se odnosi i na biološki sistem za dobijanje varijabilnog domena humanog lakog lanca koji se povezuje i eksprimira sa različitim repertoarom afinitetno-zrelih varijabilnih domena humanog teškog lanca. Takođe upućuje i na metode za dobijanje vezujućih proteina koji sadrže varijabilne domene imunoglobulina, a obuhvataju imunizaciju miševa koji imaju ograničen repertoar imunoglobulinskog lakog lanca sa antigenom od interesa i primenu genske sekvence varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulina za vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa. Metode obuhvataju metode za dobijanje varijabilnih domena humanog imunoglobulinskog teškog lanca koji su pogodni za primenu u dobijanju multi-specifičnih antigen-vezujućih proteina.
[0010] Dobijeni genetski modifikovani miševi mogu da odaberu odgovarajuće afinitetno-zrele varijabilne domene humanog imunoglobulinskog teškog lanca izvedene iz repertoara ne preuređenih genskih segmenata varijabilnih regiona humanog teškog lanca, pri čemu afinitetno -zreli vrijabilni domeni humanog teškog lanca vezuju i eksprimiraju jedan varijabilni domen humanog lakog lanca izveden iz jednog genskog segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca.
[0011] Dobijeni genetski modifikovanim miševi eksprimiraju jedan varijabilni domen humanog lakog lanca, iz genskih segmenata varijabilnog regiona jednog humanog lakog lanca.
[0012] Takođe su dati genetski modifikovani miševi koji sadrže genski segment variajbilnog regiona (VL) jednog humanog imunoglobulinskog lakog lanca koji je sposoban da preuredi i kodira humani VL domen imunoglobulinskog lakog lanca. U narednoj realizaciji, miš sadrži ne više od dva humana VL genska segmenta koji su sposobni da preurede i kodiraju humani VL domen imunoglobulinskog lakog lanca.
[0013] Dobijeni genetski modifikovan miš sadrži jedan preuređen (V/J) segment varijabilnog regiona (V/L) humanog imunoglobulinskog lakog lanca (tj., V/J segment) koji kodira humani VL domen imunoglobulinskog lakog lanca.
[0014] U jednoj realizaciji, genski segment VL je humani Vκ1-39Jκ5 genski segment ili humani Vκ3-20Jκ1 genski segment.
[0015] U narednoj realizaciji, humani VL genski segment je operativno vezan za humanu ili mišju vodeću sekvencu. U jednoj realizaciji, vodeća sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnoj realizaciji, mišja vodeća sekvenca je mišja Vκ3-7 vodeća sekvenca.
[0016] U jednoj realizaciji, VL genski segment je operativno vezan za imunoglobulinsku promotor sekvencu. U jednoj realizaciji, promotor sekvenca je humana promotor sekvenca. U specifičnoj realizaciji, humani imunoglobulinski promotor je promotor Vκ3-15.
[0017] Takođe je dat i genetski modifikovani miš koji sadrži VL lokus koji ne sadrži endogeni mišji VL genski segment koji ima sposobnost preuređenja, tako da se formira gen imunoglobulinskog lakog lanca, pri čemu VL lokus sadrži jedan humani VL genski segment koji ima sposobnost preuređenja, tako da kodira VL region gena lakog lanca. U specifičnom slučaju, humani VL genski segment je humani Vκ1-39Jκ5 genski segment ili humani Vκ3-20Jκ1 genski segment.
[0018] U jednoj realizaciji, VL lokus sadrži vodeću sekvencu sa bočnim 5' (u odnosu na smer transkripcije VL genskog segmenta) sa humanim imunoglobulinskim promotorom i bočnim 3' sa humanim VL genskim segmentom koji rearanžira i kodira VL domen reverznog himernog lakog lanca koji /koja obuhvata konstantan region (CL) endogenog mišjeg lakog lanca. U posebnoj realizaciji, genski segment VL je na mišjem kapa (κ) VL lokusu, i mišji CL je mišji κ CL.
[0019] U jednoj realizaciji, miš sadrži nefunkcionalni lambda (λ) lokus imunoglobulinskog lakog lanca. U posebnoj realizaciji, λ lokus obuhvata deleciju jedne ili više sekvenci lokusa, pri čemu jedan ili više delecija čini da λ lokus nesposobnim za preuređenjetako da obrazuje gen lakog lanca. U sledećoj realizaciji, svi ili suštinski svi segmenti VL gena λ lokusa su uklonjeni.
[0020] U jednoj realizaciji, VL lokus modifikovanog miša je lokus κ, i lokus κ sadrži mišji κ intronski pojačivač, mišji κ 3' pojačivač, ili i introniski i 3' pojačivač.
[0021] U jednoj realizaciji, miš pravi laki lanac koji sadrži somatski mutiran VL domen izveden iz humanog VL genskog segmenta. U jednoj realizaciji, laki lanac sadrži somatski mutiran VL domen izveden iz humanog VL genskog segmenta i mišji κ CL region. U jednoj realizaciji, miš ne eksprimira λ laki lanac.
[0022] U jednoj realizaciji, genetski modifikovan miš je sposoban da somatski hipermutira humanu VL region sekvenu.
[0023] U jednoj realizaciji, miš sadrži ćeliju koja eksprimira lak lanac koji sadrži somatski mutiran humani VL domen povezan sa mišjim κ CL, pri čemu je laki lanac povezan sa teškim lancem koji sadrži somatski mutiran VH domen izveden iz humanog VH genskog segmenta i pri čemu težak lanac sadrži konstantni region mišjeg teškog lanca (CH).
[0024] Miš obuhvata zamenu endogenog genskog lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca većim brojem genskih segmenata varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu su genski segmenti varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni konstantni region mišjeg teškog lanca, i genski segmenti varijabilnog regiona humanog teškog lanca su sposobni za preuređenje i za formiranje preuređenih himernih gena humanog/mišjeg teškog lanca. Miš rearanžira humane VH genske segmente i eksprimira reverzni himerni imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VH domain i mišji CH. Endogeni genski lokus varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca je zamenjen većim brojem nearanžiranih humanih VH genskih segmenata. U jednoj realizaciji, zamanjeno je najmanje 19, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 nearanžiran humani VH genski segment. U sledećoj realizaciji, zamanjeno je najmanje 12 funkcionalnih nearanžiranih humanih VH genskih segmenata, najmanje 25 funkcionalnih nearanžiranih humanih VH genskih segmenata, ili najmanje 43 funkcionalnih nearanžiranih humanih VH genskih segmenata. U jednoj realizaciji, miš obuhvata zamenu svih mišjih D i J segmenata najmanje jednim nearanžiranim humanim D segmentom i najmanje jednim nearanžiranim humanim J segmentom. U jednoj realizaciji, najmanje jedan nearanžiran humani D segment je odabran od D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27, i njihovih kombinacija. U jednoj realizaciji, najmanje jedan nearanžiran humani J segment je odabran od J1, J3, J4, J5, J6, i njihovih kombinacija. U posebnoj realizaciji, jedan ili više humanih VH genskih segmenata odabrano je od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanog VH genskog segmenta i njihovih kombinacija.
[0025] U jednoj realizaciji, miš sadrži B ćeliju koja eksprimira vezujući protein koji specifično veže antigen od interesa, pri čemu vezujući protein sadrži laki lanac izveden od preuređenog humanog Vκ1-39/Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20/Jκ1 i pri čemu ćelija sadrži preuređen gen imunoglobulinskog teškog lanca izveden iz preuređenih humanih segmenata gena odabranih od VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH 4-39, VH4-59 i VH5-51 genskih segmenata. U jednoj realizaciji, jedan ili više humanih segmenata VH gena je preuređeno sa humanim segmentom teškog lanca J odabranim od J1, J3, J4, J5, i J6. U jednoj realizaciji, tjedan ili više humanih VH i J genskih segmenata je preuređeno humanim D genskim segmentom odabranim od D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, i D7-27. U posebnoj realizaciji, gen lakog lanca sadrži 1, 2, 3, 4, ili 5 ili više somatskih hipermutacija.
[0026] U jednoj realizaciji, miš sadrži B ćeliju koja eksprimira preuređenu gensku sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca koja sadrži VH, JH, i DH genskisegment odabran od VH 2-5 JH1 D6-6, VH3-23 JH4 D3, VH3-23 JH4 D3-10, VH3-30 JH1 D6-6, VH3-30 JH3 D6-6, VH3-30 JH4 D1-7, VH3-30 JH4 D5-12, VH3-30 JH4 D6-13, VH3-30 JH4 D6-6, VH3-30 JH4 D7-27, VH3-30 JH5 D3-22, VH3-30 JH5 D6-6, VH3-30 JH5 D7-27, VH4-39 JH3 D1-26, VH4-59 JH3 D3-16, VH4-59 JH3 D3-22, VH4-59 JH4 D3-16, VH5-51 JH3 D5-5, VH5-51 JH5 D6-13 i VH5-51 JH6 D3-16. U posebnoj realizaciji, B ćelija eksprmira vezujući protein koji sadrži varijabilni region humanog imunoglobulinskog teškog lanca koji je spojen sa konstantnim regionom mišjeg teškog lanca i varijabilni region humanog imunoglobulinskog lakog lanca koji je spoje sa konstantnim regionom mišjeg lakog lanca.
[0027] U jednoj realizaciji, humani VL genski segment je humani Vκ1-39Jκ5 genski segment, i miš eksprimira reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) VL domen izveden od humanog VL genskog segmenta i (ii) mišji CL; pri čemu laki lanac je povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CH i (ii) somatski mutiran humani VH domen izveden iz humanog VH genskog segmenta koji je odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1 humanog VH genskog segmenta i njihovih kombinacija. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. CL je mišji κ CL.
[0028] U jednoj realizaciji, humani VL genski segment je humani Vκ3-20Jκ1 genski segment, i miš eksprimira reversni himerni laki lanac koji sadrži (i) VL domen izveden iz humanog VL genskog segmenta, i (ii) mišji CL; pri čemu je laki lanac povezan sa reversnim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CH, i (ii) somatski mutiran human VH izveden iz humanog VH genskog segmenta koji je odabran od 1-2, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 4-59, i 5-51 humanog VH genskog segmenta i njihovih kombinacija. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. CL je mišja κ CL.
[0029] Takođe je dat miš koji sadrži i humani Vκ1-39Jκ5 genski segment i humani Vκ3-20Jκ1 genski segment, i miš eksprimira reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) VL domen izveden od humanog Vκ1-39Jκ5 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20Jκ1 genskog segmenta, i (ii) mišji CL; pri čemu je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CH, i (ii) somatski mutiran humani VH izveden od humanog VH genskog segmenta odabranog od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanog VH genskog segment i njihovih kombinacija. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom slučaju CL je mišji κ CL.
[0030] Ovde dobijen miš sadrži zamenu endogenog genskog lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca većim brojem genskih segmenata varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu su genski segmenti varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni konstantni gen mišjeg teškog lanca i genski segmenti varijabilnog regiona humanog teškog lanca su sposobni da rearanžiraju i formiraju preuređeni himerni gen humanog/mišjeg teškog lanca. Endogeni genski lokus varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca zamenjen je većim brojem nearanžiranih humanih VH genskih segmenata. U jednoj realizaciji, zamenjeno je sa najmanje 18, najmanje 39, najmanje 80, ili 81 nearanžiranim humanim VH genskim segmentom. U jednoj realizaciji, zamenjeno je sa najmanje 12 funkcionalnih nearanžiranih humanih VH genskih segmenata, najmanje 25 funkcionalnih nearanžiranih humanih VH genskih segmenata, ili najmanje 43 nearanžirana humana VH genska segmenta.
[0031] U jednoj realizaciji, genetski modifikovan miš je soj C57BL, u posebnoj realizaciji odabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57åBL/10Cr, C57BL/Ola. U posebnoj realizaciji, genetski modifiikovan miš je kombinacija prethodno navedenog soja 129 i prethodno navedenog soja C57BL/6. U sledećoj specifičnoj realizaciji, miš je kombinacija prethodno navedenih sojeva 129 ili kombinacija prethodno navedenih sojeva BL/6. U posebnoj realizaciji, soj 129 kombinacije je soj129S6 (129/SvEvTac).
[0032] U jednoj realizaciji, miš eksprimira reverzno himerno antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži mišji κ CL i somatski mutiran VL domen čoveka izveden iz segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmenta Vκ3-20Jκ1 gena čoveka i teški lanac koji sadrži mišji CH i somatski mutiran VH domen čoveka izveden iz segmenta VH gena čoveka odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1 segmenta VH gena čoveka, pri čemu miš ne eksprimira puno mišje antitelo i ne eksprimira puno antitelo čoveka. U jednoj realiaciji, miš sadrži κ laki lanac lokusa koji obuhvata zamenu svih endogenih mišjih κ VL genskih segmenata segmentima Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmentima Vκ3-20Jκ1 gena čoveka i obuhvata zamenu endogenog genskog lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca celokupnim ili suštinski celokupnim repertoarom segemnata VH gena čoveka.
[0033] Takođe je obezbeđena i ćelija miša koja je izolovana iz miša kao što je ovde opisano. Ćelija je obezbeđena u slučaju gde je ćelija izolovana iz genetski modifikovanog miša prema jednom od prethodnih zahteva, pri čemu ćelija obuhvata:
(a) zamenu lokusa gena endogenog varijabilnog regiona κ lakog lanca svih segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša jednim segmentom gena Vκ1-39/Jκ čoveka ili jednim segmentom gena Vκ3-20/Jκ čoveka, pri čemu je segment gena čoveka operativno vezan za konstantan endogeni mišji κ gen i pri čemu ćelija ne sadrži lokus endogenog varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji je sposoban da rearanžira i obrazuje gen koji kodira varijabilni region κ miša; i
(b) zamenu lokusa gena endogenoog varijabilnog regiona teškog lanca brojnim segmenatima gena varijabilnog regiona teškog lanca, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka operativno vezani za gen endogenog konstantnog teškog lanca i segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka su u stanju da rearanžiraju i obrazuju preuređen gen himernog teškog lanca čoveka/miša. U jednoj realizaciji, ćelija je ES ćelija. U jednoj realizaciji, ćelija je limfocit. Takođe se navodi i ćelija miša izolovana iz miša kao što je ovde opisano described,a koja je B ćelija. U jednom slučaju, B ćelija eksprimira himeran težak lanac koji sadrži varijabilan domen izveden iz segmenta gena čoveka; i lak lanac izveden iz preuređenog segmenta Vκ1-39/J čoveka ili preuređenog Vκ3-20/J segmenta čoveka; pri čemu je varijabilni domen teškog lanca spojen za konstantni region miša i varijabilni domen lakog lanca je spojen za konstantni region miša ili čoveka.
[0034] Takođe naveden i hibridom, pri čemu je hibridom dobijen sa B ćelijom miša kao što je ovde opisano. U posebnom slučaju, B ćelija je iz miša kao što je ovde opisano, a koji je imunizovan imunogenom koji sadrži epitop od interesa, a B ćelija eksprimira vezujući protein koji vezuje epitop od interesa, vezujući protein ima somatski mutiran domen VH čoveka i CH miša, i ima humani VL domen izveden iz segmenta gena Vκ1-39Jκ5 čoveka ili gena Vκ3-20Jκ1 čoveka i CL miša.
[0035] Takođe je naveden i embrion miša koji sadrži donorsku ES ćeliju koja je izvedena iz miša kao što je ovde opisano.
[0036] U jednom aspektu, dati vektor za ciljanje (engl. targeting vectors), sadrži počev od 5' ka 3' smeru transkripcije u odnosu na sekvence 5' i 3' vektorskih krakova homologije sa mišem (engl.mouse homology arms), 5' krak homologije sa mišem, promotor imunoglobulina čoveka ili miša, čeonu sekvencu čoveka ili miša, i segment LCVR gena čoveka odabran od segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmenta Vκ3-20Jκ1 gena čoveka, i 3' krak homologije miša. U jednom slučaju, 5' i 3' krakovi homologije upućuju vektor na sekvencu 5' u odnosu na pojačivačku sekvencu koja se nalazi 5' blizu gena za κ konstantnan region mipa. U jednom slučaju, promotor je promotor segmenta gena humanog varijabilnog regiona imunoglobulina. U posebnom slučaju, promotor je promotor Vκ3-15 čoveka. U jednom slučaju, čeona sekvenca je čeona sekvenca miša. U posebnoj realizaciji, čeona sekvenca miša je čeona sekvenca Vκ3-7 miša.
[0037] U jednom slučaju, dat je vektor kao što je prethodno opisano, ali umesto 5' kraka homologije miša uz humani ili mišji promotor sa 5' strane nalazi mesto prepoznavanja za specifičnu rekombinazu (engl. site-specific recombinase recognition site, (SRRS)), a umesto 3' kraka homologije miša uz humani segment LCVR gena sa 3' strane je SRRS.
1
[0038] Takođe je dato i reversno himerno antitelo dobijeno od miša kao što je ovde opisan, pri čemu reversno himerno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži CL miša i VL čoveka i težak lanac koji sadrži VH čoveka i CH miša.
[0039] Data je metoda za dobijanje antitela koje vezuje antigen od interesa, a koja obuvhata imunizaciju miša sa antigenom interesa, pri čemi nastaje varijabilna sekvenca gena imunoglobulinaod miša i koristi se sekvenca varijabilnog regiona gena imunoglobulinaza dobijanje antitela koje vezuje antigen.
[0040] Takođe je data i metoda za dobijanje antitela, koja obuhvata eksprimiranje u jendoj ćeliji (a) prve sekvence VH gena immunizovanog miša kao što je ovde opisano koja je spojena sa sekvencom CH gena čoveka; (b) sekvenca VL gena imunizovanog miša kao što je ovde opisano koja je spojena sa sekvencom CL gena; i (c) održavanje ćelije pod uslovima povoljnim za ekprimiranje celog antitela čoveka, i izolovanje antitela. U jednom slučaju, ćelija sadrži drugu sekvencu VH gena drugog imunizovanog miša kao što je ovde opisano spojenu sa sekvecom CH gena čoveka, prva sekvenca VH gena kodira VH domen koji prepoznaje prvi epitop i druga sekvenca VH gena kodira VH domen koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.
[0041] Takođe je opisan postupak dobijanja epitop-vezujućeg proteina, koji obuhvata izlaganje miša, kao što je ovde opisano, imunogenu koji sadrži epitop od interesa, održavajući miša pod uslovima dovoljnim da miš proizvede moleku imunoglobulina koji specifično veže epitop od interesa i izolovanje molekula imunoglobulina koji specifično vezuje epitop od interesa; pri čemu epitop-vezujući protein sadrži teški lanac koji obuhvata somatski mutiran VH čoveka i CH miša, povezan sa lakim lancem koji sadrži CL miša VL čoveka izvedenim iz Vκ1-39 Jκ5 čoveka ili segmenta gena Vκ3-20 Jκ1 čoveka.
[0042] Takođe je opisana i ćelija koja eksprimira epitop-vezujući protein, pri čemu ćelija sadrži: (a) nukleotidnu sekvencu VL čoveka koja kodira domen VL čoveka izveden iz Vκ1-39Jκ5 čoveka ili segmenta gena Vκ3-20Jκ1 čoveka, pri čemu je nukleotidna sekvenca VL čoveka fuzionisana (direktno ili preko linkera) za konstantan domen cDNK sekvence lakog lanca imunoglobulina čoveka (npr., sekvenca konstantnog domena κ DNK čoveka); i (b) prvu nukleotidnu sekvencu VH čoveka koja kodira domen VH čoveka izveden iz prve nukleotidne sekvence VH čoveka, pri čemu je prva nukleotidna sekvenca VH čoveka spojen (direktno ili preko linkera) za konstantan domen cDNK sekvence teškog lanca imunoglobulina čoveka; pri čemu epitop-vezujući protein propoznaje prvi epitop. U jednom slučaju, epitop-vezujući protein vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije manjom od 10<-6>M, manjom od 10<-8>M, manjom od 10<-9>M, manjom od 10<-10>M, manjom od 10<-11>M ili manjom od 10<-12>M.
[0043] U jednom slučaju, ćelija sadrži drugu nukleotidnu sekvencu VH čoveka koja kodira drugi domen VH čoveka, pri čemu je druga sekvenca VH čoveka spojena (direktno ili preko linkera) za konstantan domen cDNK sekvence teškog lanca imunoglobulina čoveka, i pri čemu drugi domen VH čoveka specifično ne prepoznaje prvi epitop (npr., ima konstantnu disocijacije od npr., 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, ili veću), i pri čemu epitop-vezujući protein prepoznaje prvi epitop i drugi epitop, i pri čemu se svaki od teških lanaca odnosno i prvi i drugi teški lanac imunoglobulina povezuje sa identičnim lakim lancem (a).
[0044] U jednom slučaju, drugi domen VH vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije koja ja manja od 10<-6>M, manja od 10<-7>M, manja od 10<-8>M, manja od 10<-9>M, manja od 10<-10>M, manja od 10<-11>M ili manja od 10<-12>M.
[0045] U jednom slučaju, epitop-vezujući protein sadrži prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina, svaki povezan sa identičnim lakim lancem izvedenim iz segmenta gena VL čoveka odabran od Vκ1-39Jκ5 čoveka ili segmenta gena Vκ3-20Jκ1 čoveka, pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnog opsega, drugi teški lanac imunoglobulina vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, prvi epitop i drugi epitop nisu identični, prvi teški lanac imunoglobulina ne vezuje drugi epitop ili vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr., milimolarni opseg), drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje prvi epitop ili vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr., milimolarni opseg), i jedan ili više VL, VH prvog teškog lanca imunoglobulina i VH drugog teškog lanca imunoglobulina, su somatski mutirani.
[0046] U jednom slučaju, prvi teški lanac imunoglobulina sadrži protein A-vezujući ostatak i drugi teški lanac imunoglobulina nema protein A-vezujući ostatak.
[0047] I jednom slučaju, ćelija je odabrana od CHO, COS, 293, HeLa i retinalne ćelije koja eksprimira sekvencu nukleinske kiseline virusa (npr., ćelija PERC.6™).
[0048] Reverzno himerno antitelo je takođe obezbeđeno, koje sadrži konstantan domen VH čoveka i konstantan domen teškog lanca miša, VL čoveka i konstantan domen lakog lanca miša, pri čemu je antitelo dobijeno procesom koji obuhvata imunizaciju miša kao što je ovde opisnao imunogenom koji sadrži epitop, i antitelo specifično vezuje epitop imunogena kojim je miš imunizovan. U jednom slučaju, domen VL je somatski mutiran. U narednom slučaju, domen VH je somatski mutiran.
U jednom slučaju, i VL domen i VH domen su somatski mutirani. U narednom slučaju, VL je vezan za konstantni domen κ miša.
[0049] Obezbeđeni miš sadrži segmente gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka koji zamenjuju endogeni genski lokus varjabilnog regiona mišjeg teškog lanca; ne više od jednog segmenta gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka odabranog od preuređenog Vκ1-39/Jk i preuređenog Vκ3-20/Jk segmenta, zamenjivanjem svih segmenta gena varijabilnog lakog lanca miša; pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka vezani za gen endogenog konstantnog regiona teškog lanca miša i segment gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka je vezan za gen endogenog konstantnog regiona Cκ miša.
[0050] Takođe je obezbeđena i ćelija ES miša koja sadrži zamenu endogenih mišjih genskih lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca sa segmentima gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka i ne više od jednog preuređenog segmenta V/J lakog lanca čoveka, izabranog preuređivanjem Vk1-39/Jk5 i preuređivanjem Vk3-20/Jk5 segmenta pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka vezani za gen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša, a segment V/J lakog lanca čoveka je vezan za segment gena konstantnog regiona lakog lanca k imunoglobulina miša.
[0051] Takođe je obezbeđen i antigen-vezujući protein koji je proizveo miš, kao što je ovde opisan. U posebnom slučaju, antigen-vezujući protein sadrži varijabilan region teškog lanca imunoglobulina čoveka koji vezan sa konstantnim regionom miša i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka je izveden iz segmenta Vκ1-39 gena ili segmenta Vκ3-20 gena, pri čemu konsatntan region lakog lanca je konstantan region miša.
[0052] Takođe je obezbeđen i potpuni antigen-vezujući protein čoveka dobijen od sekvence gena varijabilnog regiona imunoglobulina miša kao što je ovde opisano, pri čemu antigen-vezujući protein sadrži teški lanac čoveka pune dužine koji sadrži varijablni region izveden iz sekvence miša kao što je ovde opisano i laki lanac čoveka pune dužine koji sadrži Vκ1-39 ili Vκ3-20 varijablni region. U jednom slučaju, varijabilni region lakog lanca sadrži jedan do pet somatskih mutacija. U narednom slučaju varijabilni region lakog lanca je srodan varijabilnom regionu lakog lanca koji se sparuje u B ćeliji miša sa varijabilnim regionom teškog lanca.
[0053] U narednom slučaju, humani antigen-vezujući protein pune dužine sadrži prvi težak lanac i drugi težak lanac, pri čemu, prvi tažak lanac i drugi težak lanac sadrže ne-identične varijabilne regione koji su nezavisno izvedeni od miša kao što je ovde opisano i pri čemu se svaki od prvih i drugih teških lanaca eksprimovanih u ćeliji vezuje sa lakim lancem čoveka, izvedenim iz segmenta Vκ1-39 gena ili segmenta Vκ3-20
1
gena. U jednom slučaju, prvi teški lanac sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje prvi epitop prvog antigena, a drugi teški lanac sadrži drugi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje drugi peitop drugog antigena. U posebnom slučaju, prvi antigen i drugi antigen su različit. U posebnom slučaju, prvi antigen i drugi antigen su isti, i prvi epitop i drugi epitop nisu identični; u posebnom slučaju, vezivanje prvog epitopa prvim molekulom vezujućeg proteina ne blokira vezivanje drugog epitopa drugim molekulom vezujućeg proteina.
[0054] U narednom slučaju, vezujući protein čoveka pune dužine izveden iz humane imunoglobulinske sekvence miša kao što je ovde opisano sadrži prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina, pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina sadrži prvi varijabilni region koji nije identičan varijabilnom regionu drugog teškog lanca imunoglobulina i pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina sadrži determinantu vezivanja prirodnog proteina A prirodnog tipa (engl. wild type), i drugi teški lanac nema determinantu vezivanja prirodnog proteina A. U jednom slučaju, prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A pod uslovima izolovanja, i drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje protein A ili vezuje protein A barem 10 puta, sto puta ili hiljadu puta slabije nego što prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A pod uslovima izolovanja. U posebnoj realizaciji, prvi i drugi teški lanac su IgG1 izotipovi, pri čemu drugi teški lanac sadrži modifikaciju odabranu od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), i njihove kombinacije i pri čemu prvi teški lanac ne sadrži ovu modifikaciju.
[0055] Obezbeđena je metoda za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, pri čemu postupak obuhvata imunizaciju miša prema jednom od zahteva 1 do 5 i dobijanje bispecifičnog antitela koristeći sekvence varijabilnog regiona gena čoveka iz B ćelije miša.
[0056] U jednom aspektu, metoda dobijanja bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina obuhvata izlaganje prvog miša prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop, izlaganje drugog miša kao što je ovde dato drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop, omogućavajući prvom i drugom mišu da svaki podigne imunski odgovor na antigene od interesa, identifikujući u prvom mišu prvi varijabilan region teškog lanca čoveka koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikovanje u drugom mišu drugi varijabilni region teškog lanca čoveka koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, stvarajući tako prvi teški lanac gena čoveka pune dužine koji kodira prvi teški lanac koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, stvarajući tako drugi teški lanac gena čoveka pune dužine koji kodira drugi teški lanac koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, eksprimirajući prvi teški lanac i drugi teški lanac u ćeliji koja eksprimira jedan laki lanac čoveka pune dužine koji je izveden iz Vκ1-39 čoveka ili segmenta Vκ3-20 gena čoveka da formira bispecifičan antigenvezujući protein i izolovanje bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina.
[0057] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen nisu identični.
[0058] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su identični, a prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednoj realizaciji, vezivanje varijabilnog regiona prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje varijabilnog regiona drugog teškog lanca za drugi epitop.
[0059] U jednoj realizaciji, prvi antigen je odabran od rastvornog antigena i antigena na površini ćelije (npr., tumorski antigen), i drugi antigen sadrži transmembranske receptore. U posebnoj realizaciji, transmembranski receptor je imunoglobulinski receptor. U posebnoj realizaciji, imunoglobulinski receptor je Fc receptor. U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su isti transmembranski receptori, i vezivanje prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje drugog teškog lanca za drugi epitop.
[0060] U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U narednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca je somatski mutiran srodni laki lanac koji se eksprimira u B ćeliji prvog ili drugo imunizovanog miša bilo sa prvim ili drugim varijabilnim domenom teškog lanca.
[0061] U jednoj realizaciji, prvi humani teški lanac pune dužine nosi amino kiselinsku modifikaciju koja umanjuje afinitet za protein A, i drugi humani teški lanac pune dužine ne sadrži modifikaciju koja umanjuje njegov afinitet za protein A.
[0062] Takođe je obezbeđeno antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca čoveka dobijen u skladu sa pronalaskom. U narednom aspektu, opisana je upotreba ovde obezbeđenog miša za dobijanje humanog antitela pune dužine ili humanog bispecifičnog antitela pune dužine.
[0063] Bilo koja od ovde opisanih realizacija ili aspekata može se upotrebiti u kombinaciji jedna sa drugom, osim ako je drugačije naznačeno ili je očigledno iz konteksta. Ostale realizacije će biti jasne prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike pregledom dostupnog opisa.
1
Detaljan opis
[0064] Predmetni pronalazak nije ograničen na ovde opisane postupke i eksperimentalne uslove, tako da metode i uslovi mogu da variraju. Takođe treba napomenuti da je ovde korišćena terminologija data za potrebe opisivanja određenih realizacija i ne treba je smatrati kao ograničavajuću, budući da je predmet pronalaska definisan zahtevima.
[0065] Osim ako je drugačije naznačeno, svi izrazi i fraze koje su ovde upotrebljene uključujući značenja koji ovi izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je drugačije jasno naznačeno ili je očigledno iz konteksta u kojem je izraz ili fraza upoterbeljena. Iako se druge metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, mogu upotrebiti u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska, ovde se opisuju date metode i materijali.
[0066] Izraz "antitelo", kao što je ovde upotrebljen, obuhvata molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška lanca (H) lanca i dva laka (L) lanaca koja su međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca i konstantan region (CH) teškog lanca. Konstantan region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijablni (VL) region lakog lanca i konstantna region (CL) lakog lanca. Regioni VH i VL mogu se dalje podeliti u hipervarijabilne regione nazvane regioni određivanja komplementarnosti ( engl. complementary determining regions, CDR), sa razbacanim regionima koji su više očuvani, nazvani okvirni regioni (engl. framework regions, FR). Svaki VH i VL sadrži tri CDR i četiri FR, poređanih od amino-kraja ka karboksilnom -kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (teški lanac CDR može se skraćeno označiti kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; laki lanac CDR može se skraćeno označiti kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Izraz antitelo "visokog afiniteta" odnosi se na antitelo koje ima KDu odnosu na svoj ciljani epitop od oko 10<-9>M ili niži (npr., odnosno oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednoj realizaciji, KDje meren površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™; u narednoj realizaciji, KDje meren sa ELISA.
[0067] Fraza "bispecifično antitelo" obuhvata antitelo koje može selektivno da veže dva ili više epitopa. Bispecifična antitela obično sadrže dva neidentična teška lanca, gde svaki teški lanac specifično vezuje različit epitop bilo na dva različita molekula (npr., različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na istom molekulu (npr., različiti epitopi na istom imunogenu). Ako je bispecifično antitelo sposobno da selektivno veže dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet prvog teškog lanca za prvi epitop će obično biti barem jednom do dva ili tri ili četiti ili više puta niži od afiniteta prvog teškog lanca za drugi epitop, i vice versa. Epitopi specifično vezani bispecifičnim
1
antitelom mogu da budu na istom ili različitom cilju (npr., na istom ili različitom proteinu). Bispecifična antitela mogu se dobiti, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog imunogena, mogu se spojiti sa nukelotidnim sekvencama koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, i ove sekvence se mogu eksprimirati u ćeliji koja eksprimira laki lanac imunoglobulina. Tipično bispecifično antitelo ima dva teška lanca gde svaki ima tri teška lanca CDR, zatim (N-kraj do C-kraja) CH1 domen, pregib, CH2 domen, i CH3 domen, i laki lanac imunoglobulina koji ili ne prenosi epitope-vezujuću specifičnost ali može da se veže sa svakim teškim lancem, ili može da se veže za svaki teški lanac i može da veže jedan ili više epitopa koji su vezani eptiop-vezujućim regionima teškog lanca, ili mogu da se vežu za svaki teški lanac i omoguće vezivanje ili jednog ili oba teškalanca za jedan ili oba epitopa.
[0068] Termin "ćelija" obuhvata svaku ćelija koja je pogodna za ekspresiju rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina. Ćelije obuhvataju ćelije prokariota i eukariota (jednoćelelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr., sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), mikobakterijske ćelije, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), ćelije biljaka, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije, humane ćelije, ili fuzionisane ćelije kao što su, na primer, hibridoma ili kvadroma ćelije. U nekim realizacijama, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili miša. U nekim realizacijama, ćelija je eukariotska i odabrana je od sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), retinalne ćelije, Vero, CV1, kidney (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalne), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz prethodno navedenih ćelija. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više viralnih gena, npr. retinalna ćelija koja eksprimira viralni gen (npr., a PER.C6™ cell).
[0069] Fraza "hipervarijabilne sekvence," ili izraz "CDR," obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinskih kiselina gena imunoglobulina organizma koji se normalno (tj. kod životinje divljeg tipa) pojavljuje između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina (npr., anttelo ili receptor T ćelija). CDR može da kodira, na primer, germinativna sekvenca ili preuređena ili nearanžirana sekvenca i na primer, intaktna ili zrela B ćelija ili T ćelija. CDR može da bude somatski mutirana (npr. razlikuje se od sekvence koja je kodirana
1
u životinjskoj gemitivnoj liniji), humanizovana, i/ili modifikovana supstitucijama, adicijama ili delecijom aminokiselina. U nekim slučajevima (npr. za CDR3), CDR mogu da se kodiraju sa dve ili više sekvenci (npr., sekvence germinativnih linija ćelija) koje nisu susedne (npr., u nearanžiranoj sekvenci nukleinskih kiselina) ali su susedne u sekvenci nukelinskih kiselina B ćelije, npr., kao rezultat isecanja ili povezivanja sekvenci (npr., V-D-J rekombinacija za formiranje teškog lanca CDR3).
[0070] Izraz "konzervativna", kada se koristi da opiše konzervativnu supstituciju amino kiselina, obuhvata supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sličnih hemijskih osobina (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalne osobine od interesa proteina, na primer, sposobnost varijabilnog regiona da specifično veže ciljani epitop sa željenim afinitetom. Primeri grupa aminokiselina koji imaju bočne lance sličnih hemijskih osobina su alifatični bočni lanci kao što su glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; alifatični-hidroksil bočni lanac kao što su serin i treonin; bočni lanci sa amidom kao što su asparagin i glutamin; aromatični sporeni lanci poput fenilalanina, tirozina i triptofana; bazni bolčni lanci kao poput lizina, arginina i histidina; kiseli bočni lanci poput asparaginske kiseline i glutaminske kiseline; i bočni lanci koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativna supstitucija amino kiselinskih grupa obuhvata, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat, i asparagin/glutamin. U nekim realizacijama, konzervatvna supstitucija aminokiselina može da bude supstitucija bilo kog intaktnog ostatka u proteinu, alaninom, kako se koristi u, na primer, alaninskoj mutagenezi (engl.alanine scanning mutagenesis). U nekim realizacijama, konzervativma supstitucija je izvedena tako da ima pozitivnu vrednost u matriksu PAM250 log-likelihood opisanom u Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, ovde uključena kao referenca. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija, pri čemu supstitucija ima ne negativnu vrednost u matriksu PAM250 log-likelihood.
[0071] U nekim realizacijama, položaji ostataka u lakom ili teškom lancu imunoglobulina razlikuju se po jednoj ili više konzervativnih supstitucija aminokiselina. U nekim realizacijama, položaji ostataka u lakom lancu ili njegovom fragmentu imunoglobulina (npr., fragment koji dozvoljava ekspresiju i sekreciju iz, npr. B ćelija) nisu identični onim u lakom lancu čija je aminokiselinska sekvenca ovde navedena, ali se razlikuje po jednoj ili više konzervativnih supstitucija amino kiselina.
[0072] Fraza "epitop-vezujući protein" obuhvata protein koji ima najmanje jedna CDR i koji je sposoban da selektivno prepozna epitop, npr., sposoban je da veže epitop sa
1
KDkoja iznosi oko jednog mikromola ili manje (npr. KDkoja je oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M ili oko 1 x 10<-12>M). Terapeutski epitopvezujući proteini (npr. terapeutska antitela) često zahtevaju KDkoja je u nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu.
[0073] Fraza "funkcionalni fragment" obuhvata fragmente epitop-veujućih proteina koji se mogu eksprimirati, seretovati i specifično vezati za epitope sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje obuhvata KDkoja je najmanje u mikromolarnom opsegu, nanomolarnom opsegu ili pikomolarnom opsegu.
[0074] Izaz "germinativne (klicine) linije ćelija" obuhvata reference na imunoglobulinsku sekvencu nukleinske kiseline u ćeliji koja nije somatski mutirana, npr., ne-somatski mutirana B ćelija ili pre-B ćelija ili hematopoezna ćelija.
[0075] Fraza "teški lanac," ili "teški lanac imunoglobulina " obuhvata sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz bilo kog organzima. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri teška lanca CDRs i četiri regiona FR, osim ako je drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca sadrže CDR, CDR i FR i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac sadrži, poslevarijabilnog domena (od N-kraja ka C-kraju), CH1 domen, pregib, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment kojije sposoban da specifično prepozna epitop (npr. prepoznaje epitope sa KDu mikromolarnom, nanomolarom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban za eksprimiranje i sekreciju iz ćelije i koji sadrži najmanje jedan CDR.
[0076] Izraz "identitet" kada je upotrebljen u vezi sekvence, obuhvata identitet kao što je određeno brojnim različitim algoritmima koji su poznati u tehnici, a koji se mogu upotrebiti za merenje identiteta nukelotida i/ili aminokiselinske sekvence. U nekim realizacijama koje su ovde opisane, identiteti su određeni pomoću tehnike ClustalW v.
1.83 (spor) ravnomernom primenom metoda gap penalty od 10.0, extend gap penalty od 0.1, i korišćenjem matriksa Gonnet similarity (MaeVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u odnosu na identičnost sekvenci zavisiće od datih sekvenci, ali u slučaju konstantnog domena lakog lanca, dužina sekvence treda da obuhvati sekvencu dovoljne dužine da se preklopi u konstantan domen lakog lanca koji je sposoban da ostvari auto-asocijaciju, tako da se formira kanonski konstantan domen lakog lanca, npr. sposoban da formira beta slojeve koji sadrže beta lance i koji su u stanju da ostvare interakciju sa barem jednim CH1 domenom čoveka ili miša. U slučaju domena CH1, sekvenca treba da sadrži sekvencu dovoljne dužine da se preklopi u CH1 domen koji je sposoban da formira dve beta ravni koje sadrže beta lance i sposoban da ostvari interakciju sa najmanje jednim konstantnim domenom lakog lanca čoveka ili miša.
1
[0077] Fraza "molekul imunoglobulina" obuhvata dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. Teški lanci mogu da budu identični ili različiti i laki lanci mogu da budu identični ili različiti.
[0078] Fraza "laki lanac" obuhvata sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, osim ako je drugačije naznačeno, uključujući κ i λ lake lance čoveka i VpreB, kao i surogate lakih lanaca. Varijabilni (VL) domeni lakih lanaca obično sadrže tri laka lanca CDR i četiri regiona okvira čitanja (FR), osim ako je drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine sadrži, od amino kraja ka karboksilno kraju, VL domen koji obuhvata FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i konstantan domen lakog lanca. Laki lanci obuhvataju one, npr. koji neselektivno vezuju bilo prvi ili drugi epitop koji je selektivno vezan epitop-vezujućim proteinom u kojem se pojavljuju. Laki lanci takođe obuhvataju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškim lancima u veivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa koji su selektivno vezani epitopevezujućim proteinom u kojem se pojavljuju. Zajednički laki lanci su oni koji su izvedeni iz segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmenta Vκ3-20Jκ1 gena čoveka i obuhvataju somatski mutirane (npr. afinitetno zrele) verzije istih.
[0079] Fraza "mikromolarni opseg " odnosi se na 1-999 mikromola; fraza "nanomolarni opseg" označava 1-999 nanomola; fraza "pikomolarni opseg " odnosi se na 1-999 pikomol.
[0080] Fraza "somatski mutiran" obuhvata reference na sekvencu nukelinskih kiselina B ćelija koje su podvrgnute izotipskom prekopčavanju (engl.class-switching), pri čemu sekvenca nukleinskih kiselina varijabilnog regiona imunoglobulina (npr., varijabilni region teškog lanca ili sadrže sekvence teškog lanca CDR ili FR) u B-ćelijama koje su izotpiski prekopčane, a koje nisu identične sekvenci nukleinskih kiselina u B ćeliji pre podvrgavanja izotipskom prekopčavanju, kao što su, na primer, razlike u CDR ili sekvenci okvira čitanja nukleinskih kiselina između B ćelije koja nije podvrgnuta izotipskom prekopčavanju i B ćelije koja je podvrgnuta izotipskom prekopčavanju. "Somatski mutiran" obuhvata referencu na sekvence nukleinskih kiselina iz afinitetnozrelih B ćelija koje nisu identične odgovarajućim sekvencama varijabilnih regiona imunoglobulinau B ćelijama koji nisu afinitetno-zrele (tj., sekvence u genomu germinativnih ćelija). Fraza "somatski mutirane" takođe obuhvata reference na sekvencu nukleinskih kiselina varijabilnog regiona imunoglobulina iz B ćelija nakon izlaganja B ćelija epitopu od interesa, pri čemu se sekvenca nukleinskih kiselina razlikuje od odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina pre izlaganja B ćelija epitopu od interesa. Fraza "somatski mutirane" odnosi se na sekvence iz antitela koje su stvorene u životinji, npr. miš koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina varijabilnog
2
regiona imunoglobulina čoveka, u odgovoru na izazov imunogena i koji rezultuje iz procesa selekcije koji je po sebi operativan u datoj životinji.
[0081] Izraz "nearanžiran", koji se odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina, obuhvata sekvence nukleinskih kiselina koje postoje u germinativnoj ćelijskoj liniji životinjskih ćelija.
[0082] Fraza "varijablni domen" obuhvata aminokiselinsku sekvencu lakog ili teškog lanca imunoglobulina (modifikovana po želji) koja sadrži sledeće aminokiselinske regione, u sekvenci od N-kraja ka C-kraju (osim ako je drugačije naznačeno): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Zajednički laki lanac
[0083] Raniji napori da se multispecifični epitop-vezujući proteini, npr. bispecifična antitela, učine korisnim su ometana različitim problemima koji često dele zajedničku karakteristiku: in vitro selekciju ili manipulaciju sekvenci za racionalni inženjering, ili za inženjering putem metode probe-i-greške, odgovarajući format za sparivanje heterodimerinog bispecifičnog imunoglobulina čoveka. Nažalost, većina, ako ne i svi pristupi in vitro inženjeringa obezbeđuju većinom ad hoc popravke koje su odgovarajuće, ako su uopšte moguće, za pojedinačne molekule. Sa druge strane, nisu realizovane in vivo metode za primenu složenih organizama za izbor odgovarajućeg sparivanja, a koje mogu da dovedu do terapeutika za ljude.
[0084] Generalno, nativne mišje sekvence su često dobar izvor humanih terapeutskih sekvenci. Osim toga, stvaranje varijabilnih regiona teškog lanca imunoglobulina miša koji se sparuje sa zajedničkim lakim lancem čoveka ima ograničenu praktičnu primenu. Više napora in vitro inženjeringa bi se proširilo u proces probe-i-greške za pokušaj humanizacije varijabilnih sekvenci teškog lanca miša nadajući se da će biti zadržana specifičnost i afinitet epitopa uz održavanje sposobnosti vezivanja sa zajedničkim lakim lancem čoveka, sa neizvesnim ishodom. Na kraju ovakvih procesa, konačni krajnji proizvod može da održi nešto od specifičnosti i afiniteta i da se poveže sa zajedničkim lakim lancem, ali konačna imunogenost kod ljudi po svoj prilici ostaje i dalje ozbiljan rizik.
[0085] Shodno ovom, odgovarajući miš za dobijanje terapeutika za ljude obuhvatao bi veliki repertoar segemanta gena varijabilnih regiona teških lanaca čoveka umesto segmenata gena engodenih varijabilnih regiona teških lanaca miša. Segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka bi trebalo da mogu da se rearanžiraju
i rekombinuju sa konstantnim endogenim domenom teškog lanca miša tako da obrazuju reverzni himerni teški lanac (tj. teški lanac koji sadrži humani varijablni domen mišji konstantni region). Teški lanac bi trebalo da bude sposoban da izvede izotipsko prekopčavanje i somatsku hipermutaciju tako da je za miša dostupan relativno veliki repertoar varijabilnih domena teških lanaca kako bi se odrabrao jedan koji može da se poveže sa varijabilnim regionima lakog lanca čoveka ograničenog repertoara.
[0086] Miš koji selektuje zajednički lanac za veći broj teških lanaca nalazi praktičnu primenu. U različitim realizacijama, antitela koja se eksprimiraju u mišu koji može da eksprimira samo zajednički laki lanac imaće teške lance koji mogu da se povežu i eksprmiraju sa identičnim ili suštinski identičnim lakim lancem. Ovo je posebno korisno za dobijanje bispecifičnih antitela. Na primer, ovakav miš može da se imunizuje privim imunogenom da bi se dobila B ćelija koja eksprmira antitelo koje specifično vezuje prvi epitop. Miš (ili genetski isti miš) može da se imunizuje drugim imunogenom pri čemu se dobija B ćelija koja eksprimira antitelo koje specifično vezuje drugi epitop. Varijabilni regioni teškog laca mogu se klonirati od B ćelija i eksprimiraju se sa istim konstantnim regionom teškog lanca i istim lakim lancem i eksprimiraju se u ćeliji tako da se dobija bispecifično antitelo, pri čemu je komponenta lakog lanca bispecifičnog antitela odabrana od strane miša da bi se povezala i eksprimirala sa komponentom lakog lanca.
[0087] Pronalazači su genetskom modifikacijom proizveli miša za dobijanje lakih lanaca imunoglobulina koji će se pogodno upariti sa teškim lancima iz sasvim različite familije, uključujući teške lance čiji varijablni regioni odstupaju od sekvenci germitivnih ćelijskih linija, npr. afinitetno sazreli ili somatski mutirani varijabilni regioni. U različitim realizacijama, miš je osmišljen kao par varijabilnih domena lakog lanca čoveka sa varijabilnim domenima teškog lanca čoveka koji sadrže somatske mutacije, omogućavajući tako put do proteina sa visokim afinitetom vezivanja koji su pogodni za upotrebu kao lekovi za ljude.
[0088] Miš dobijen genetskom modifikacijom, kroz dugačak i složen proces selekcije antitela u organizmu, predstavlja biološki odgovarajući izbor za sparivanje različitih kolekcija varijabilnih domena teških lanaca čoveka sa ograničenim brojem opcija lakog lanca čoveka. Da bi se ovo postiglo, miš je genetskom modifikacijom dobijen tako da predstavlja ograničen broj opcija varijabilnih domena lakog lanca čoveka u kombinaciji sa opcijama varijabilnih domena teškog lanca čoveka, velike raznolikosti. Nakon izazivanja imunogenom, miš maksimizuje broj rešenja u svom repertoaru za ravoj antitela za imunogen, ograničen uglavnom ili isključivo brojem opcija lakog lanca u svom repertoaru. U različitim realizacijama, ovo obuhvata miša kako bi se postigle pogodne i kompatibilne somatske mutacije varijabilnog domena lakog lanca koji bi pored toga uglavnom bili kompatibilni sa relativno velikim brojem različitih varijabilnih domena teškog lanca čoveka, uključujući posebno somatski mutirane varijabilne domene teškog lanca čoveka.
[0089] Da bi se postigao ograničen repertoar opcija lakog lanca, miš dobijen genetskom modifikacijom je takav da čini nefunkcionalnom svoju sposobnost da napravi ili preuredi, nativni varijabilni domen lakog lanca k miša. Ovo se može postići, npr. delecijom segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca k miša. Endogeni lokus miša može se modifikovati pojedinačnim preuređenim humanim Vk1-39/Jk genskim segmentom ili jednim preuređenim humanim Vk3-20/Jk genskim segmentom, operativno vezanim za konstantan domen endogenoog lakog lanca miša, na takav način, da segmenti gena egzogenog varijabilnog regiona lakog lanca čoveka mogu da se rekombinuju sa konstantnim regionom gena k lakog lanca miša i formira preuređen gen reverznog himernog lakog lanca (humani varijablni, mišji konstantni). U različitim realizacijama, varijabilni region lakog lanca je sposoban za somatsku mutaciju. U različitm realizacijama, za povećanje sposobnosti varijabilnog regiona lakog lanca, do maksimuma, da somatski mutira, u mišu su zadržani odgovarajući pojačivači. Na primer, za modifikaciju mišjeg κ lokusa da zameni segmente gena endogenous varijabilnog regiona κ miša segmentima gena varijabilnog regiona κ čoveka, mišji κ intronski pojačivači i mišji κ 3' pojačivači su funkcionalno održavani ili nesmetani.
[0090] Miš dobijen genetskom modifikacijom eksprimira reversne himerne (humani varijablni, mišji konstantni) lake lanace ograničenog repertoara koji su povezanih sa različitim reverznim himernim (humani variablni, mišji konstantni) teškim lancima. U različitim realizacijama, segmenti gena endogenih variajbilnih regiona mišjeg κ lakog lanca su izostavljeni i zamenjeni segmentima gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka, koji je operativno vezan za segment gena endogenog konstantnog regiona κ miša. U realizacijama za postizanje somatske hipermutacije segemnata gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka, do maksimuma, sačuvani su mišji κ intronski pojačivač i mišji κ 3' pojačivač. U različitim realizacijama, miš takođe sadrži nefunkcionalan λ lokus lakog lanca ili njegovu deleciju li deleciju koja čini lokus nemoćnim da pravi λ laki lanac.
[0091] Tako ovde dati miš je miš koji sadrži:
(a) zamenu na lokusu endogenog varijabilnog regiona κ imunoglobulina miša svih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša jednim preuređenim segmentom Vκ1-39/Jκ gena čoveka ili jednim preuređenim segmentom gena Vκ3-20/Jκ čoveka, pri čemu je segment gena čoveka operativno vezan za gen konstantanog endogenog regiona κ miša i i pri čemu miš nema lokus endogenog varijabilnog regiona κ imunoglobulina miša koji ima sposobnost preuređenja i formrianja gena koji kodira varijabilni region κ miša; i,
2
(b) zamenu lokusa gena endogenog varijabilnog regiona teškog lanca većim brojem segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka operativno vezani za konstantan gen endogenoog teškog lanca miša i segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka imaju sposobnost preuređenja i formiranja preuređenih gena himernog teškog lanca čoveka/miša.
[0092] Miš dobijen genetskim inženjeringom, u različitim realizacijama, sadrži lokus varijabilnog regiona lakog lanca koji je bez svih segmenta gena endogenog varijabilnog regiona k lakog lanca miša i sadrži jedan preuređeni humani V/J segment izabran iz preuređenog Vk1-39/Jk genskog segmenta i preuređenog Vk3-20/Jk genskog segmenta , operativno vezana za konstantan region miša, pri čemu lokus može da podlegne somatskoj hipermutaciji i pri čemu lokus eksprimira laki lanac koji sadržu sekvencu V/J čoveka povezanu za konstantan region miša. Tako, u različitim realizacijama, lokus sadrži mišji κ 3' pojačivač koji je povezan sa somatskom hipermutacijom normalnog ili divljeg tipa.
[0093] Miš dobijen genetskom modifikacijom u različitim realizacijama, kada je imunizovan antigenom od interesa stvara B ćelije koje ispoljavaju različite rearanžmane varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka kojei eksprimira i funkcioniše sa jednim preuređenim lakim lancem, uključujući i realizacije u kojima jedan laki lanac sadrži varijabilne regione lakog lanca čoveka koji sadrži npr.
1 do 5 somatskih mutacija. U različitim realizacijama, ovako eksprimirani laki lanci čoveka mogu da se povezuju i eksprimiraju sa bilo kojim varijabilnim regionima teškog lanca imunoglobulina čoveka koji su eksprimirani u mišu.
Epitop-vezujući proteini koji vezuju više od jednog epitopa
[0094] Ovde opisane kompozicije i metode mogu se upotrebiti za dobijanje vezujućih proteina koji vezuju više od jednog epitopa sa visokim afinitetom, npr. bispecifična antitela. Prednosti pronalaska uključuju sposobnost za selekciju pogodno visoko vezujućih (npr. afinitetno zrelih) teških lanaca imunoglobulina od kojih će se svaki povezati sa jednim lakim lancem.
[0095] Sinteza i ekspresija bispecifičnih vezujućih proteina je bila problematična, delom zbog problema povezanih sa identifikovanjem odgovarajućeg lakog lanca koji može da se poveže i eksprimira sa dva različita teška lanca i delom usled problema za postupkom izolovanja. Metode i kompozicije koje su ovde opisane omogućavaju genetički modifikovanom mišu da selektuje, kroz inače prirodne procese, odgovarajući laki lanac koji može da se poveže i eksprimira sa više nego jednim lancem, uključujući teške lance koji su somatski mutirani (npr., afinitetno sazreli). Humane VL i VH sekvence od odgovarajućih B ćelija imunizovanog miša kao što je ovde opisano koje eksprimiraju afinitetno sazrela antitela sa reverznim himernim teškim lancima (tj., humani varijablni i mišji konstantni) se mogu identifikovati i klonirati u okviru u ekpresionom vektoru sa a pogodnom sekvencom sekvencom gena konstantnog regiona čoveka (npr., humani IgG1). Dva ovakva konstrukta mogu se pripremiti, gde svaki konstrukt kodira varijabilan domen teškog lanca čoveka koji vezuje različite epitope. Jedan od humanih VL (npr., humani Vκ1-39Jκ5 ili humani Vκ3-20Jκ1), u embrionalnoj sekvenci ili od B ćelije gde je sekvenca somatski mutirana, može se fuzionisati u okviru za odgovarajući konstantan region gena čoveka (npr. humani κ konstantni gen). Ove tri potpuno humana teška i laka konstrukta mogu se postaviti u odgovarajuću ćeliju za ekspresiju. Ćelija će eksprimirati dve glavne vrste: homodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem i heterodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem. Da bi se izvelo lako razdvajanje ovih glavnih vrsta, jedan teški lanac je modifikovan tako da izostavi protein A-vezujuću determinantnu, što dovodi do različitog afiniteta homodimernih vezujućih proteina od heterodimernog vezujućeg proteina. Kompozicije i metode koje upućuju na ovaj problem opisane su u USSN 12/832,838,podnetoj 25 June 20010, pod nazivom "Readily Isolated Bispecific Antitela with Native Immunoglobulin Format," obajvljenog kao US 2010/0331527A1.
[0096] U jednom slučaju, naveden je epitop-vezujući protein kao što je ovde opisan, u kojem su humane VL i VH sekvence izvedene od ovde opisanih miševa koji su imunizovani antigenom koji sadrži epitop od interesa.
[0097] Takođe je naveveden i an epitope-vezujući protein koji sadrži prvi i drugi polipeptid, gde prvi polipeptid sadrži, od N-kraja do C-kraja, prvi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje prvi epitop, nakon čega sledi konstantan region koji sadrži prvi CH3 region humanog IgG odabranog od IgG1, IgG2, IgG4, i njihove kombinacije; i drugi polipeptid koji sadrži od N-kraja do C-kraja i drugi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje drugi epitop, nakon čega sled konstantan region koji sadrži drugi CH3 region humanog IgG odabrabog od IgG1, IgG2, IgG4, i njihove kombinacije, pri čemu drugi CH3 region sadrži modifikaciju koja umanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena za protein A.
[0098] U jednom slučaju, drugi CH3 region sadrži H95R modifikaciju (prema IMGT egzon numeraciji; H435R prema EU numeraciji). U sledećoj realizaciji, drugi CH3 region dalje sadrži modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F prema EU).
[0099] U narednomslučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humanog IgG1, i dalje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I prema EU).
2
[0100] U jednom slučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humanog IgG2, i dalje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I prema EU).
[0101] U narednom slučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humaog IgG4, i dalje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I prema EU).
[0102] Jedan postupak dobijanja epitop-vezujućeg proteina koji vezuje više od jednog epitopa je imunizovati prvog miša, u skladu sa pronalaskom, antigenom koji sadrži prvi epitop od interesa, tako da su teški lanci imunoglobulina dobijeni od miša u celosti teški lanci koji sadrže varijabilne domene čoveka i konstantne domene miša. Kada je imunizovan, ovakav miš će napraviti reverzno himerno antitelo, koje sadrži samo jedan od dva varijabilna domena lakog lanca čoveka (npr. jedan od humanog Vκ1-39Jκ5 ili od humanog Vκ3-20Jκ1). Kada se identifikuje B ćelija koja kodira VH koji vezuje epitop od interesa, nukleotidna sekvenca VH (i po izobru, VL) može biti ponovo vraćena (npr. pomoću PCR) i klonirana u ekspresioni konstrukt u okviru sa odgovarajućim konstantnim domenom imunoglobulina čoveka. Ovaj proces može se ponoviti tako da se identifikuje drugi VH domen koji vezuje drugi epitop a druga sekvenca VH gena se može povratiti i klonirati u ekspresioni vektor u okvir za drugi odgovarajući konstantan domen imunoglobulina. Prvi i drugi konstantni domeni imunoglobulina mogu biti istog ili različitog izotipa, i jedan od konstantnih domena imunoglobulina (ali ne i drugi) može se modifikovati kao što je opisano ovde ili u US 2010/0331527A1, i epitop-vezujući protein se može eksprimirati u odgovarajućoj ćeliji i izolovati na osnovu diferencijanog afiniteta za protein A u odnosu na homodimerni epitop-vezujući protein, npr., kao što je opisano u US 2010/0331527A1.
[0103] Takođe je dat i postupak za dobijanje bispecifičnog epitop-vezujućeg proteina, koji obuhvata prvu afinitetno-sazrelu (npr. sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) humanu VH nukleotidnu sekvencu (VH1) miša kao što je ovde opisano, identifikujući drugu afinitetno-sazrelu (npr. sadrži jedanu ili više somatskih hipermutacija) humanu VH nukleotidnu sekvencu (VH2) miša kao što je ovde opisano, klonirajući VH1 u okviru sa humanim teškim lancem koji nema modifikaciju protein A-determinante kao što je opisano u US 2010/0331527A1 za formiranje teškog lanca 1 (HC1), kloniranje VH2 u okviru sa humanim teškim lancem koji sadrži protein A-determinantu kao što je opisano u US 2010/0331527A1 za formiranje teškog lanca 2 (HC2), uvođenje ekspresionog vektora koji sadrži HC1 i isti ili različiti ekspresioni vektor koji sadrži HC2 , u ćeliju, pri čemu ćelija takođe eksprimira laki lanac imunoglobulina čovekakoji sadrži humani Vκ1-39/humani Jκ5 ili humani Vκ3-20/humani Jκ1 vezan za konstantan domen
2
lakog lanca čoveka, omogućavajući tako ćeliji da eskprimira bispecifični epitopvezujući protein koji sadrži VH domen koji je kodiran sa VH1 i VH domen kordiran sa VH2 i izolovanje bispecifičnog epitop-vezujućeg proteina na osnovu njegove diferencijalne sposobnosti da veže protein A u odnosu na monospecifičan homodimerni epitop-vezujući protein. U specifičnom slučaju, HC1 je IgG1, i HC2 je IgG1 koji sadrži modifikaciju H95R (IMGT; H435R prema EU) i sadrži još i modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F prema EU). U jednom slučaju, VH domen kodiran sa VH1, VH domen kodiran sa VH2, ili oba, somatski su mutirani.
Humani VH geni koji se eksprimiraju sa zajedničkim humanim VL
[0104] Različiti humani varijablni regioni od afinitetno-sazrelih antitela na četiri različita antigena eksprimiraju se bilo sa svojim srodnim lakim lancem ili barem jednim humanim lakim lancem odabranim od humanog Vκ1-39Jκ5, humanog Vκ3-20Jκ1, ili humanog VpreBJλ5 (videti Primer 1). Za antitela na svaki od ovih antigena, somatski mutirani teški lanci visokog afiniteta iz različitih familija gena uspešno su se sparivali sa preuređenom humanim embrionalnim Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 regionima i izlučivali iz ćelija koje su eksprimirale teške i lake lance. Za Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1, VH domeni izvedeni od sledećih humanih VH familija su se eksprimovale: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1. Tako, miš dobijen da eksprimira ograničen reportoar humanih VL domena sa jednog od Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 generisaće različitu populaciju somatski mutiranih VH domena čoveka sa VH lokusa modifikovanog tako da su mišji segmenti VH gena zamenjeni segmentima VH gena čoveka.
[0105] Miševi dobijeni tako da eksprimiraju reverzne himerne teške lance (humani varijablni, mišji konstantni) imunoglobulina povezane sa jednim preuređenim lakim lancem (Vκ1-39/J ili Vκ3-20/J), kada su imuniziovani antigenom od interesa, dobijene B su ćelije koje sadrže različite preuređene segmente V čoveka i eksprimirane visokoafinitetna antigen-specifična antitela sa različitim osobinama po pitanju njihove sposobnosti da blokiraju vezivanje antigena za svoj ligand i po pitanju njihove sposobnosti da vežu varijante antigena (videti Primere 5 do 10).
[0106] Tako, ovde opisani miševi i postupci su korisni za dobijanje i odabir varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina čoveka, uključujući somatski mutirane varijabilne domene teškog lanca čoveka, koji nastaju kao razultat različitih preuređenja, koji ispoljavaju širok spektar afiniteta (uključujući i KDreda veličine od oko nanomolarne ili manje), širok spektar specifičnosti (uključujući vezivanje za različite epitope istih antigena), i koji se povezuju i eksprimiraju sa istim ili suštinski istim varijabilnim lakim lancima imunoglobulina čoveka.
2
[0107] Sledeći primeri su dati tako da opišu prosečnom stručnjaku kako da napravi i primeni metode i kompozicije pronalaska, i ni na koji način ne ograničavaju ono što pronalazačismatraju obimom pronalaska. Uloženi su napori da se osigura preciznost datih brojeva (npr. količine, temperatura, itd.) međutim neke eksperimentalne greške i devijacije treba uzeti u obzir. Osim ako je drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je data u stepenima Celzijusa, i pritisak je na ili oko atmosferskog.
PRIMERI
Primer 1. Identifikacija humanih varijabilnih regiona teškog lanca koji su povezani sa odabranim humanim varijabilnim regionima lakog lanca
[0108] Konstruisan je in vitro sistem ekspresije da bi se odredilo da li jedan preuređeni laki lanac embriona čoveka može biti ko-eksprimiran zajedno sa humanim teškim lancima iz antigen specifičnih humanih antitela.
[0109] Metode za stvaranje humanih antitela kod genetski modifikovanih miševa su poznate (videti npr., US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). VELOCIMMUNE® tehnologija uključuje stvranje genetski modifikovanog miša koji ima genom koji sadrži humane varijabilne regione lakog i teškog lanca koji su operativno vezani za lokuse endogeg mišjieg konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitelo koji sadrži humani varijabilni region i mišji konstantni region kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koje kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela koje je proizveo VELOCIMMUNE® miš su potpuno humane. U početku, izolovana su himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je opisano u tekstu koji sledi, antitela su okarakterisana i izabrana sa željenim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim himanim konstantnim regionom da bi se stvorilo potpuno humano antitelo koje sadrži izotip koji nije IgM (engl. non-IgM isotype), na primer prirodnog tipa ili modifikovani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od upotrebe, vezivanje antigena sa visokim afinitetom i ciljane specifičnosti karakteristika se nalaze u varijabilnom regionu.
[0110] VELOCIMMUNE® miš je imunizovan faktorom rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i antigen-specifična humana antitela su izolovana i sekvencirana za upotrebu V gena primenom poznatih standardnih tehnika. Izabrana antitela su klonirana na humane konstante regione teškog i lakog lanca i 69 teških lanaca je izabrano za sparivanje sa jednim ili tri humana laka lanca: (1) srodni κ laki
2
lanac vezan za humani κonstantni region k, (2) preuređena humana embrionska linija Vκ1-39Jκ5 vezana za humani konstantni region κ ili (3) preuređena humana embrionska linija Vκ3-20Jκ1 vezana za humani konstantni region κ. Svaki par teškog i lakog lanca je zajednički transfektovan u CHO-K1 ćelije korišćenjem standardnih tehnika. Prisustvo antitela u supernatantu je detektovano anti-humanim IgG metodom ELISA. Titar antitela (ng/ml) je određen za svaki par teškog i lakog lanca i titri sa različitim preuređenim embrionskim lakim lancima su upoređeni sa titrima dobijenim od roditeljskog molekula antitela (tj., teškog lanca sparenog sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat nativnog titra (Tabela 1). VH: varijabilni teški lanac gena. ND: pod tekućim eksperimentalnim uslovima ekspresija nije primećena.
2
Tabela 1
[0111] U sličnom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su imunizovani sa nekoliko različitih antigena i izabrani teški lanci antigen specifičnih humanih antitela su testirani na njihovu sposobnost da se sparuju sa različitim preuređenim humanim lakim lancima embrionalnih linija (kako je prethodno opisano). Antigeni upotrebljeni u ovom eksperimentu obuhvatali su enzim koji je uključen u homeostazu holesterola (antigen A), serum hormona uključenog u regulaciju homeostaze glukoze (anigen B), faktor
1
rasta koji promoviše angiogenezu (Aantigen C) i receptor na površini ćelija (antigen D). Antigen specifična antitela su izolovana od miševa iz svake imunizacione grupe i varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca su klonirani i sekvencirani. Iz sekvence teških i lakih lanaca, određena je upotreba V gena i izabrani teški lanci su spareni ili sa njihovim srodnim lakim lancem ili preuređenim regionom humane embrionske linije Vκ1-39Jκ5. Svaki par teški/laki lanac je kotransfektovan u ćelije CHO-K1 i prisustvo antitela u supernatantu je detektovano sa anti-humanim IgG metodom ELISA. Titar antitela (µg/ml) je određen za svako sparivanje teškog lanca i lakog lanca i titri sa različtitim preuređenim lakim lancima humane embrionalne linije su upoređeni sa titrima dobijenim sa roditeljskim molekulom antitela (tj. teški lanac sparen sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat nativnog titra (Tabela 2). VH: varijabilni teški lanac gena. Vκ: varijabilni κ laki lanac gena. ND: pod tekućim eksperimentalnim uslovima ekspresija nije detektovana.
2
Tabela 2
[0112] Rezultati dobijeni u ovim eksperimentima prikazuju da su somatski mutirani, teški lanci visokog afiniteta iz različitih familija gena sposobni da se sparuju sa preuređenim humanim embrionalnim linijama Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 regiona i budu izlučeni iz ćelija kao normalni molekul antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 1, titar antitela je porastao za oko 61% (42 od 69) teških lanaca kada su spareni sa preuređenim humanim Vκ1-39Jκ5 lakim lancem i oko 29% (20 od 69) teških lanaca kad su spareni sa preuređenim humanim Vκ3-20Jκ1 lakim lancem u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Za oko 20% (14 od 69) teških lanaca, oba preuređena laka lanca humane embrionalne linije su prikazala povećanje u ekspresiji u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 2, preuređena humana embrionalna linija Vκ1-39Jκ5 regiona pokazala je povećanje ekspresije nekoliko teških lanaca specifičnih za raspon različitih klasa antigena u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Titar antitela je
4
povećan više od dva puta za oko 35% (15/43) teških lanaca u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Za dva teška lanca (315 i 316), povećanje je bilo veće od deset puta u poređenju sa roditeljskim antitelom. Među svim teškim lancima koji su pokazali povećanje ekspresije u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela, familija tri (VH3) teška lanca je najviše zastupljena u poređenju sa drugim varijabilnim regionima teških lanaca familija gena. Ovo pokazuje povoljan odnos humanih VH3 teških lanaca prema sparivanju sa preuređenim lakim lancima humanih germinativnih linija Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1.
Primer 2. Generisanje lokusa lakog lanca preuređeno embriona čoveka
[0113] Dobijeni su različiti vektori za ciljanje, preuređenog lakog lanca humane embrionalne linije upotrebom VELOCIGENE® tehnologije (videt, npr. US Pat. No.
6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis), Nature Biotech.21(6):652-659) da bi se modifikovali klonovi mišjeg genomskog veštačkog bakterijskog hromozoma (BAC) 302g12 i 254m04 (Invitrogen). Upotrebom ova dva BAC klona, genomski konstrukti su dizajnirani tako da sadrže jedan preuređeni region lakog lanca humane embrionalne linije i ubačeni u lokus andogenog κ lakog lanca koji je prethodno modifikovan da deletira endogeni κ varijabilni deo i poveže segmenate gena.
A. Konstrukcija vektora za ciljanje preuređenog lakog lanca embriona čoveka
[0114] Napravljena su tri različita preuređena regiona lakog lanca embriona čoveka korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije koje su poznate u tehnici. Humani varijabilni segmenti gena upotrebljeni za konstrukciju ova tri regiona obuhvatali su preuređenu humanu Vκ1-39Jκ5 sekvencu, preuređenu humanu Vκ3-20Jκ1 sekvencu i preuređenu humanu VpreBJλ5 sekvencu.
[0115] Fragment DNK koji sadrži ekson 1 (koji enkodira vodeći peptid) i intron 1 mišjeg Vκ3-7 gena su napravljeni pomoću de novo DNK sinteze (Integrated DNA Technologies). Uključen je deo od 5' neprevedenog regiona do mesta prirodno nastalog Blpl restrikcionog enzima. Eksoni humanih Vκ1-39 i Vκ3-20 gena su pomoću PCR pojačani iz biblioteke humanih genomskih BAC. Čeone sekvence forward imale su 5' ekstenziju koja sadrži mesto splajsovanja akceptora introna 1 mišjeg Vκ3-7 gena. Desni (reverzni) prajmer (graničnik) upotrebljen za PCR humane Vκ1-39 sekvence uključivao je humani Jκ5 koji enkodira ekstenziju, dok je desni prajmer upotrebljen za PCR humane Vκ3-20 sekvence uključivao humani Jκ1 koji enkodira ekstenziju. Humana VpreBJλ5 sekvenca je načinjena de novo DNK sintezom (Integrated DNA Technologies). Deo humanog Jκ-Cκ introna koji uključuje mesto splajsovanja donora je PCR pojačan od plazmida pBS-296-HA18-PIScel. Levi (forward) PCR prajmer je uključivao deo koji enkodira ekstenziju ili humane Jκ5, Jκ1 ili Jλ5 sekvence. Desni prajmer je uključivao PI-Scel lokaciju, koja je prethodno ugrađeno u intron.
[0116] Mišji Vκ3-7 ekson1/intron 1, humani varijabilni laki lanac eksona i fragmenti humanog Jκ-Cκ introna su su spojeni zajedno primenom lančane reakcije polimeraze (engl. overlap extension PCR), digestirani sa Blpl i PI-Scel, i ligatirani u plazmid pBS-296-HA18-PIScel, koji je sadržao promoter iz segmenta varijabilnog Vκ3-15 gena. Kaseta higromicina unutar plazmida pBS-296-HA18-PIScel u tečnom kiseoniku, zamenjena je sa kasetom FRTed higromicina okruženom sa NotI i AscI mestima. NotI/PI-SceI fragment ovog plazmida je ligiran u modifikovani mišji BAC 254m04, koji je sadržao deo mišjeg Jκ-Cκ introna, mišji Cκ ekson, i oko 75 kb genomske sekvence nizvodono od mišjeg κ lokusa što je obezbedilo krak homologije 3' za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama. The Notl/Ascl fragment ovog BAC je podvrgnut ligaciji u modifikovani mišji BAC 302g12, koji je sadržao FRTed neomicin kasetu i oko 23 kb genomske sekvence uzvodno od endogenog κ lokusa za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama.
B. Vektor za ciljanje preuređene humane embrionalne linije Vκ1-39Jκ5 (Slika 1)
[0117] Mesta restrikcionog enzima su uvedena na 5' i 3' krajevima genetski modifikovanog inserta lakog lanca za kloniranje u vektor za ciljanje: na Ascl mesto na 5' kraju i PI-Scel mesto na 3' kraju. Unutar 5' Ascl mesta i 3' PI-Scel mesta ciljanog konstrukta od 5' do 3' uključivao je krak homologije 5' koji sadrži sekvencu 5' do lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantnog gena, genomske sekvence koja uključuje humani Vκ3-15 promoter, čeone sekvence segmenta gena mišjeg varijabilnog Vκ3-7, intronske sekvence segmenta gena mišjeg varijabilnog Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog regiona humane embrionalne linije Vκ1-39Jκ5, genomske sekvence koje sadrže deo humanog Jκ-Cκ introna, i krak homologije 3' koji sadrži sekvencu 3' segmenta gena endogenog mišjeg Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 1, sredina). Geni i/ili sekvence uzvodno od lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca i nizvodno od većine segmenata 3' Jκ gena (npr., endogeni 3' pojačivač) bile su nemodifikovane od ciljanog konstrukta (videti Sliku 1). Sekvenca dizajniranog humanog Vκ1-39Jκ5 lokusa je prikazana u SEQ ID NO:1.
[0118] Ciljano umetanje preuređenog regiona humane embrionalne linije Vκ1-39Jκ5 u BAC DNA je potvrđeno polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvencama unutar preuređenog regiona lakog lanca humane embrionalne linije. Ukratko, intron sekvenca 3' do čeone mišje sekvence Vκ3-7 potvrđena je prajmerima ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:2) i ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog regiona humanog embriona Vκ1-39Jκ5 potvrđena je prajmerima 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO:4) i 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO:5). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO:6) i neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena da bi se elektroprirale mišje ES ćelije do kreiranih modifikovanih ES ćelija za stvaranje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni humani embrionalni Vκ1-39Jκ5 region.
[0119] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom upotrebom analiza koje su specifične za genteski modifikovan region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 koji je insertovan u endogeni lokus. Ukratko, ispitivanje neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje čeone sekvence Vκ3-7, i ispitivanje 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO:10) koji se vezuje unutar preuređenog okvira čitanja Vκ1-39Jκ5 embiriona čoveka. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 embriona čoveka.
[0120] Alternativno, ES ćelije koje nose region lakog lanca humane embrionalne linije Vκ1-39Jκ5 transfektovane su u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila kaseta FRTed neomicina uvedena ciljanim konstruktom. Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Po izboru, neomicin kaseta je zadržana u miševima
C. Vektor za ciljanje preuređenog embriona Vk3-20Jk1 čoveka (Slika 2)
[0121] Na sličan način, genetski modifikovan lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region humane embrionalne linije Vκ3-20Jκ1 načinjen je upotrebom ciljanog konstrukta koji uključuje od 5' do 3', 5' krak homologije koji sadrži sekvencu 5' do lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantni gen, genomsku sekvencu koja uključuje humani Vκ3-15 promoter, čeonu sekvencu segmenta mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7. intronsku sekvencu mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog regiona humane embrionalne linije Vκ3-20Jκ10, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ intron i krak homologije 3' koji sadrži sekvence 3' endogenog mišjeg genskog segmenta Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 2, sredina). Sekvenca genetski modifikovanog humanog Vκ3-20Jκ1 lokusa je prikazana u SEQ ID NO:11.
[0122] Ciljano umetanje preuređenog regiona humane embrionalne linije Vκ3-20Jκ1 u BAC DNA je potvrđeno polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvencama unutar regiona lakog lanca preuređene humane embrionalne linijaline Vκ3-20Jκ1. Ukratko, intron sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence je potvrđena prajmerima ULC-m1 F (SEQ ID NO:2) i ULC-m1 R (SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog embrionalnog regiona Vκ3-20Jκ1 čoveka, potvrđen je prajmerima 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO:12) i 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO:13). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (SEQ ID NO:6) i neoR (SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena za elektroporaciju mišjih ES ćelija da bi se kreirale modifikovane ES ćelije za stvaranje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni laki lanac humanih embrionalnih Vκ3-20Jκ1 regiona.
[0123] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom upotrebom analiza koje su specifične za genetski modifikovan laki lanac Vκ3-20Jκ1 regiona koji je insertovan u endogeni lokus κ lakog lanca Ukratko, ispitivanje neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i ispitivanje 16353h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO:14) koji se vezuje unutar otvorenog okvira čitanja preuređenog humanog embrionalnog Vκ3-20Jκ1 regiona. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa. Leglo mladunaca eksprimira laki lanac humanog embrionalnog Vκ3-20Jκ1 regiona.
[0124] Alternativno, ES ćelije koje nose laki lanac humanog embrionalnog Vκ3-20Jκ1 regiona, mogu biti transfektovane u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila kaseta FRTed neomicina uvedena konstruktom za ciljanje. Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicin kaseta je zadržana u miševima.
D. Vektor za ciljanje preuređenog humanog embrionalnog VpreBJλ regiona (Slika 3)
[0125] Na sličan način, genetski modifikovan lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni humani embrionalni VpreBJλ5 region dobijen je upotrebom konstrukta za ciljanje koji obuhvata krak homologije od 5' do 3', gde krak homologije 5' sadrži sekvencu 5' do lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantni gen, genomsku sekvencu koja uključuje humani Vκ3-15 promotor, vodeću sekvencu segmenta mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, intronsku sekvencu mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i krak homologije 3' koji sadrži sekvence 3' endogenog mišjeg genskog segmenta Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04.
[0126] (Slika 3, sredina). Sekvenca genetski modifikovanog humanog VpreBJλ5 lokusa je prikazana u SEQ ID NO:15.
[0127] ] Ciljana insercija preuređenog humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona u BAC DNK je potvrđena polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvencama unutar lakog lanca preuređeng humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona. Ukratko, intronska sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence potvrđena je prajmerima ULC-m1 F (SEQ ID NO:2) i ULC-m1 R (SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona, potvrđen je prajmerima 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO:16) i1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO:17). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (SEQ ID NO:6) i neoR (SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena za elektroporaciju mišjih ES ćelija da bi se kreirale modifikovane ES ćelije za kreiranje humernih miševa koji eksprimiraju preuređeni laki lanac humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona.
[0128] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom primenom analiza koje su specifične za genetski modifikovan laki lanac VpreBJλ5 regiona koji je insertovan u endogeni lokus κ lakog lanca, Ukratko, ispitivanje neoP (SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i ispitivanje 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:18) koji se vezuje unutar okvira čitanja humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju laki lanac embrionalnog regiona.
[0129] Alternativno, ES ćelije koje nose laki lanac humanog embrionalnog VpreBJλ5 regiona, mogu biti transfektovane u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila FRTed neomicin kaseta uvedena ciljanim konstruktom. Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicin kaseta je zadržana u miševima
Primer 3. Stvaranje miševa koji eksprimiraju jedan preuređeni laki lanac embrionalnog regiona čoveka
[0130] Prethodno opisane ciljane ES ćelije su upotrebljene kao donorske ES ćelije i uvedene u mišji embrion faze 8 ćelija metodom VELOCIMOUSE® (videti, npr., US Pat. No. 7,294,754 i Poueymirouet al. (2007) F0 generacija miševa koji su u skoro potpuno izvedeni od donorskih ES ćelija sa ciljanim genima (engl.gene-targeted) koje omogućavaju neposrednu fenotipsku analizu Nature Biotech. 25(1):91-99. VELOCIMICE® koji nezavisno nosi genetski modifikovan laki lanac humanog embrionalnog Vκ1-39Jκ5 regiona, laki lanac Vκ3-20Jκ1 regiona ili laki lanac VpreBJλ5 regiona se identifikuje genotipizacijom korišćenjem modifikacije analize alela (Valenzuela et al., supra) koja detektuje prisustvo jedinstvenog preuređenog lakog lanca humanog embrionalnog regiona.
[0131] Mladunci su genotipizovani i mladunče koje je heterozigot za jedinstveni preuređeni region lakog lanca humane embrionalne linije je izabrano za karakterizaciju ekspresije preuređenog lakog lanca humanog embrionalnog regiona.
Primer 4. Uzgoj miševa koji eksprimiraju jedan preuređeni laki lanac humane germinativne linije
A. Knokaut (KO) endogenog Igλ
[0132] Da bi se optimizovala upotreba genetski modifikovanog lokusa lakog lanca, miševi koji nose jedan od preuređenih lakih lanaca humanog embrionalnog regiona, su pareni sa drugim mišem koji sadrži deleciju u lokusu endogenog λ lakog lanca. Na taj način, dobijeni potomci će eksprimirati, kao njihov jedini laki lanac, preuređeni laki lanac humanog embrionalnog regiona kao što je opisano u Primeru 2. Uzgoj je izveden standardnim tehnikama koje su poznate u tehnici i, alternativno komercijalnim odgavijačem (npr., The Jackson Laboratory). Mišji soj koji nosi genetski modifikovan lokus lakog lanca i deleciju lokusa endogenog λ lakog lanca je kontrolisan na prisutvo jedinstvenog regiona lakog lanca i odsustvo endogenog lakog lanca λ miša.
B. Humanizovani lokus endogenog teškog lanca
[0133] Miševi koji nose genetski modifikovan lokus lakog lanca humanog embriona su pareni sa miševima koji sadrže zamenu lokusa varijabilnog teškog lanca endogenog mišjeg gena sa lokusom varijabilnog teškog lanca humanog gena (videti US 6,596,541; VELOCIMMUNE® miš, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® miš sadrži genome koji sadrže varijabilne regione humanog teškog lanca operativno povezane za endogene mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja sadrže humani varijabilni region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja
4
nkodira varijabilne regione teških lanaca antitela je izolovana i operativno povezana za DNK koja enkodira konstantne regione humanih teških lanaca. DNK je tada eksprimirana u ćelije koje su sposobne za ekspresiju potpuno humanog teškog lanca antitela.
[0134] Dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg VH lokusa sa humanim VH lokusom i jedan preuređeni VL region humane embrionalne linije na lokusu endogenog κ lakog lanca. Reverzna himerna antitela koja sadrže somatski mutirane teške lance (humane VH i mišje CH) sa jedinstvenim humanim lakim lancem (humani VL i mišji CL) dobijena su posle imunizacije sa antigenom od interesa. Identifikovane su VH i VL sekvence nukleotida B ćelija koje eksprimiraju antitela i potpuno humana antitela su dobijena fuzijom VH i VL nukleotidnih sekvenci sa humanim CH i CL nukleotidnim sekvencama u pogodnom sistemu eksprimiranja.
Primer 5. Stvaranje antitela od miševa koji eksprimiraju humane teške lance i preuređene lake lance humanih embrionalnih regiona
[0135] Posle uzgoja miševa koji sadrže genetski modifikovan region humanog lakog lanca i različitih željenih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kao što je opisano u Primeru 4), izabrani miševi se mogu imunizovati antigenom od interesa.
[0136] Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od jedinstvenih preuređenih lakih lanaca humanog embrionalnog regiona je izazvan antigenom, i limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su izdvojene iz seruma životinja. Limfatične ćelije su fuzionisane sa linijom mijelomskih ćelija da bi se pripremile linije besmrtnih hibridoma ćelija, i takve linije hibridoma ćelija su podvrgnute skriningu i izabrane za identifikaciju linija hibridoma ćelija koje proizvode antitela koja sadrže varijable humanog teškog lanca i preuređene lake lance humane embrionalne linije koji su specifični za antigen upotrebljen za imunizaciju. Izolovane su DNK koje kodiraju variabilne regione teških lanaca i lakih lanaca i povezane sa željenim izotipnim konstantim regionima teških lanaca i lakih lanaca. Usled prisustva endogenih mišjih sekvenci i bilo kog dodatnih cis-delujućih elemenata prisutnih u endogenom lokusu, jedinstveni laki lanac svakog antitela može biti somatski mutiran. Ovo doprinosi dodatnoj raznolikosti antigen-specifičnog repertoara koji sadrži jedinstveni laki lanac i razne sekvence teškog lanca. Dobijene sekvence kloniranog antitela su zatim eksprimovane u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koje kodiraju antigenspecifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca su identifikovane direktno iz antigen-specifičnih limfocita.
[0137] U početku, izolovana su himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani variabilni region i mišji konstantni region. Kako je prethodno opisano, antitela su okarakterisana i izabrana prema željenim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom da bi se stvorilo potpuno humano antitelo koje sadrži somatski mutirani humani teški lanac i jedinstveni laki lanac izveden od preuređenog regionalakog lanca humane embrionalne linije pronalaska. Pogodni humani konstantni regioni uključuju, na primer divljeg tipa ili modofikovane IgG1 ili IgG4.
[0138] Izdvojene kohorte VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže zamenu lokusa endogenog mišjeg teškog lanca sa humanim V, D, i J segmentima gena i zamenu lokusa endogenog mišjeg lakog lanca sa ili genetsk modifikovanim regionom Vκ1-39Jκ5 lakog lanca humane embrionalnog regiona (opisano ranije) su imunizovane sa proteinom receptora na površii ćelije čoveka (antigen E). Antigen E je dat direktno u stražnje stopalo miša sa šest uzastopnih injekcija svaka 3-4 dana. Dva do tri mikrograma antigena E je pomešano sa 10 µg CpG oligonukleotida (Cat # tlrl-modn -ODN1826 oligonukleotid ; InVivogen, San Diego, CA) i 25 µg Adju-Phos (Aluminijum fosfat gel adjuvant, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Danska) pre injekcije. Ukupno šest injekcija je dato pre krajnjeg povlačenja antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Uzorsci krvi posle četvrte i šeste injekcije su sakupljeni i imunski odgovor antitela je posmatran pomoću standardne antigen-specifične imunoanalize.
[0139] Kada je postignut željeni imunski odgovor, sakupljeni su splenociti i spojeni sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se sačuvala njihova održivost i oblik linija hibridoma ćelija. Linije hibridoma ćelija su podvrgnute skriningu i izabrane da identifikuju ćelijske linije koje proizvode antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca antitela. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko anti-antigen E-specifičnih antitela zajednčkog lakog lanca (tj., antitela koja poseduju varijabilne domene humanih teških lanaca, isti varijabilni domen humanog lakog lanca, i mišje konstantne domene).
[0140] Alternativno, anti-Antigen E antitela zajednčkog lakog lanca su izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez spajanja sa mijelomskim ćelijama, kao što je opisano u U.S. 2007/0280945A1. Upotrebom ove metode, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-Antigen E antitela zajdničkog lakog lanca ( tj., antitela koja poseduju varijabilne domene humanog teškog lanca, ili dizajnirani humani Vκ1-39Jκ5 laki lanac ili dizajnirani region humanog Vκ3-20Jκ1 lakog lanca i humane konstantne domene).
[0141] Biološke osobine ekzemplarnih anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca generisanih prema metodama ovog Primera detaljno su opisane u sekcijama koje slede.
Primer 6. Upotreba genskog segmenta teškog lanca u antigen specifičnim antitelima zajedničkog lakog lanca
[0142] Da bi se analizirala struktura proizvedenih anti-antigen E antitela humanog zajedničkog lakog lanca, nukleniske kiseline koje enkodiraju varijabilne regione teškog lanca antitela su klonirane i sekvencirane. Iz sekvenci nukleinske kiseline i predviđenih aminokiselinskih sekvenci antitela, upotreba gena je identifikovana za varijabilni region teškog lanca (HCVR) izabranog od zajedničkog lakog lanca antitela dobijenog od imunizovanih VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže ili dizajnirani humani Vκ1-39Jκ5 laki lanac ili dizajnirani region humanog Vκ3-20Jκ1 lakog lanca. Rezultati su prikazani u Tabelama 3 i 4, i pokazuju da miševi prema pronalasku stvaraju antigen-specifična antitela zajedničkog lakog lanca od raznih genskih segmenata humanog teškog lanca, usled raznih preuređivanja, kad se koriste ili miševi koji eksprimira laki lanac i samo jednog Vκ1-39- ili humani Vκ3-20-izvedeni laki lanac. Humani VHgenski segmenti 2, 3, 4, i 5 familija preuređeni sa raznim humanim DHsegmentima i humanim JHsegmentima da bi se dobila antigen-specifična antitela.
4
Tabela 3
antitela Vκ1-39Jκ5 zajedničkog lakog lanca
Primer 7. Određivanje sposobnosti blokiranja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca Luminex™ metodom (engl.Luminex™ Assay)
[0143] Testirana je sposobnost devedeset osam humanih antitela sa zajedničkim lakim lancem koja su odgajena na antigenu E, za blokiranje vezivanja prirodnog liganda antigena E (Ligand Y) za antigen E u testu baziranom na kuglicama (engl. bead-based assay).
[0144] Ekstracekularni domen (ECD) antigena E je konjugovan za dva taga myc epitopa i tagom 6X histidina (antigen E-mmH) i amino-fuzionisan za karboksilovane mikrosfere sa koncentracijom od 20 µg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi pa je zatim izvršena deaktivacija kuglica sa 1M Tris pH 8.0 što je praćeno ispiranjem u PBS sa 0.05% (v/v) Tween-20. Kuglice su zatim blokirane sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)koji sadrži 2% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 ležišta, supernatanti koji sadrže zajedničke lake lance antigen E-specifičnih antitela razblaženi su u puferu 1:15.
4
Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži lažni supernatant sa istim kompenentama medijuma kao za supernatant antitela. Antigenom E-označene kuglice su dodate supernatantu i inkubirane preko noći na 4°C. Biotinilizirani ligand Y protein je dodat krajnjoj koncentraciji od 0.06 nM i inkubiran tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotiniliziranog-liganda Y vezanog za antigen E-myc-myc-6His označene kuglice izvršena je sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) pa zatim merenjem u analizatoru baziranom na Luminex™ tečnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije fona (MFI) uzorka bez liganda Y je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0145] U sličnom eksperimentu, testirana je sposobnost ista 98 humana antitela zajedničkog lakog lanca humanog antitela gajena na antigen E da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-obeležene kuglice.
[0146] Ukratko, ligand Y je amino-fuzionisan za karboksilovane mikrosfere sa koncentracijom od 20 µg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi pa je zatim izvršena deaktivacija kuglica sa 1 M Tris pH 8.0 što je praćeno ispiranjem u PBS sa 0.05% (v/v) Tween-20. Kuglice su zatim blokirane dodatkom PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 2% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 ležišta, supernatanti koji sadrže zajedničke lake lance antigen E-specifičifičnih antitela su razblaženi 1:15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži lažni supernatant sa istim kompenantama medijuma kao za supernatant antitela. Antigenom E-označene kuglice su dodate supernatantu i inkubirane preko noći na 4°C. Biotinilizirani antigen E-mmH je dodat krajnjoj koncentraciji od 0.42 nM i inkubiran preko noći na 4°C. Ligandom Y obeležene kuglice su tada dodate smeši antitelo/antigenE i inkubirane tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotiniliziranog Antigen E-mmH vezanog za ligand Y-beads izvršena je sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) pa zatim merenjem u analizatoru zasnovanom na Luminex™ tečnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije fona (MFI) uzorka bez liganda Y je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0147] Tabele 5 i 6 prikazuju procenat blokiranja za sva 98 antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem koja su testirana Luminex™ metodom. ND: nije određeno pod tekućim eksperimentalnim uslovima.
4
[0148] U prvom opisanom Luminex™ eksperimentu, testirana je sposobnost 80 antitela sa zajednilkim lakim lancem koji sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac da blokiraju vezivanje liganda Y za antigenom E-označene kuglice. Od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, 68 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 12 pokazalo <50% blokiranja (6 sa 25-50% blokiranja i 6 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koja sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 12 je pokazalo više od >50% blokiranja, dok je 6 pokazalo <50% blokiranje (3 sa 25-50% blokiranja i 3 sa <25% blokiranja) vezivanja liganda Y za antigenom E-označene kuglice.
[0149] U drugom opisanom Luminex™ eksperimentu, testirana je sposobnost istih 80 antitela antitela sa zajedničkim lakim lancem, koja sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-označene kuglice. Od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, 36 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 44 pokazalo <50% blokiranja (27 sa 25-50% blokiranja i 17 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koja sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 1 je pokazao >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 sa 25-50% blokiranja i 12 sa <25% blokiranja) vezivanja antigena E za ligandom Y-obeležene kuglice.
[0150] Podaci u Tabelama 5 i 6 dokazuju da su preuređenja opisana u Tabelama 3 i 4 generisala anti-antigen E-specifična antitela lakog lanca koja blokiraju vezivanje liganda Y za njegov srodni receptor antigen E sa različitim stepenom efikasnosti, što je konzistentno sa anti-antigen E antitelima zajedničkog lanca iz Tabela 3 i 4 koje sadrže antitela sa epitopima preklapajuće i nepreklapajuće specifičnsti, u odnosu na antigen E.
4
Tabela 5
Antitela Vκ1-39Jκ5 sa zajedničkim lakim lancem
4
Tabela 5
Antitela Vκ1-39Jκ5 sa zajedničkim lakim lancem
4
Tabela 5
Antitela Vκ1-39Jκ5 sa zajedničkim lakim lancem
Tabela 5
Antitela Vκ1-39Jκ5 sa zajedničkim lakim lancem
Primer 8. Određivanje sposobnosti blokiranja antigen specifičnog antitela zajedničkog lanca ELISA metodom
1
[0151] Testirana je sposobnost humanih antitela sa zajedničkim lakim lancem gajena na antigen E da blokiraju vezivanje antigena E za ligand Y-obložene površine ELISA testom.
[0152] Ligand Y je obložen po ploči sa 96 ležišta sa koncentracijom od 2 µg/mL razblažen u PBS i inkubiran preko noći, pa potom ispran četiri puta u PBS sa 0.05% Tween-20. Ploča je tada blokirana sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 0.5% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. U posebnoj ploči, supernatanti koji sadrže anti-antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem su razblaženi1:10 u puferu. Lažni supernatant sa istim komponentama antitela upotrebljen je kao negativna kontrola. Antigen E-mmH (prethodno opisan) dodat je u krajnjoj koncentraciji od 0.150 nM i inkubiran tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Smeša antitelo/antigen E-mmH je tada dodata u ploču koja sadrži ligand Y i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Detekcija antigen E-mmH vezanog za ligand Y određena je sa Horse-Radish peroksidazom (HRP) konjugovanom sa anti-penta-His antitelom (Qiagen, Valencia, CA) i razvijena standardnim kolorimetrijskim odgovorom upotrebom tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizovanog sumpornom kiselinom. Apsorbancija je čitana na OD450 tokom 0.1 sec. Apsorbancija fona uzorka bez antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0153] Tabele 7 i 8 prikazuju procenat blokiranja za sva 98 anti-Antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem koja su testirani sa ELISA. ND: ND: nije određeno pod tekućim eksperimentalnim uslovima.
[0154] Kao što je opisano u ovom Primeru, od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, koji sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac i testirani su na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-obloženu površinu, 22 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 58 pokazalo <50% blokiranja (20 sa 25-50% blokiranja i 38 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koji sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 1 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 sa 25-50% blokitanja i 12 sa <25% blokiranja) vezivanja antigena E za ligandom Y-obeleženu površinu.
[0155] Ovi rezultati su takođe konzistentni sa skupom antigen E-specifičnih antitela sa zajednčkim lakim lancrm koji sadrži antitela sa preklapajućom i nepreklapajućom epitopskom specifičnosti u odnosu na antigen E.
2
4
Primer 9. Određivanje afiniteta za antigen E-specifična antitela sa zajedničkim lakim lancem pomoću BIAcore™
[0156] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za izabrane supernatante antitela određene su sa SPR (površinska plazmonska rezonanca) upotrebom BIAcore™ T100 instrumenta (GE Healthcare). Svu podaci su dobijeni korišćenjem HBS-EP (10mM Hepes, 150mM NaCl, 0.3mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) kako kao nosećeg pufera, tako i kao pufera uzorka na 25°C. Antitela su sakupljena iz sirovih uzoraka supernatanta na površinu CM5 senzorskog čipa koji je prethodno derivatizovan sa anti-humanim Fc antitelim velike gustine korišćenjem standardne tehnike fuzionisanja amina. Tokom faze sakupljanja, supernatanti su injektirani kroz anti-humanu Fc površinu sa brzinom toka od 3 µL/min, za ukupno 3 minuta. Sakupljanje je praćeno injekcijom ili nosećeg pufera ili analita sa koncentracijom od 100 nM tokom 2 minuta sa brzinom toka od 35 µL/min. Disocijacija antigena iz antitela je kontrolisana tokom 6 minuta. Sakupljena antitela su uklonjena kratkom injekcijom 10 mM glicina, pH 1.5. Svi senzogrami su dvostgruko referentni, oduzimanjem senzograma injekcija pufera od senzograma injekcija analita, uklanjajući na taj način artifakte uzrokovane disocijacijom antitela sa površine sakupljanja. Podaci o vezivanju za svako antitelo su fitovani sa 1:1 modelom vezivanja sa transportom mase korišćenjem BIAcore T100 programa v2.1. Rezultati su prikazani u Tabelama 9 i 10.
[0157] Afiniteti vezivanja antitela sa zajedničkim lakim lancem koji sadrže preuređivanja prikazana u Tabelama 3 i 4 variraju, pri čemu svi pokazuju KDnanomolarskom opsegu. Podaci o afinitetu su konzistenzni sa antitelima zajedničkog lakog lanca nastalih iz kombinovanog spajanja preuređenih varijabilnih domena opisanih u Tabelama 3 i 4 budući da su visokog afiniteta, izabranih klonova, i somatski mutirani. Zajedno sa ranije prikazanim podacima, antitela zajednčkog lakog lanca opisana u Tabelama 3 i 4 čine skup različitih antitela, visokog afiniteta koja pokazuju specifičnost za jedan ili više epitopa na antigenu E.
1
2 Primer 10. Određivanje specifićnosti vezivanja antigen specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca Luminex™ metodom [0158] Testirana je sposobnost izabranih anti-antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem da se vezuju za ECD antigen E i ECD varijanti antigena E, uključujući ortolog cynomolgous majmuna (Mf antigen E), koji se razlikuje od humanog proteina u približno 10% ostataka njegovih amino kiselina; delecijski mutant antigena E kome nedostaje poslednjih 10 amino kiselina od C-terminalnog kraja ECD (antigen E-ΔCT); i dva mutantakoja sadrže supstituciju alanina na pretpostavljenoj lokaciji interakcije sa ligandomY (antigen E-Ala1 i antigenE-Ala2). Antigen E proteini su proizvedeni u CHO ćelijama i svaki je sadržao myc-myc-His C-terminalni tag.
[0159] Za ispitivanje vezivanja, antigen E ECD protein ili varijant proteina (prethodno opisan) sakupljeni su iz 1 mL medijuma kulture inkubacijom tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa 1 x 10<6>mikrosfernim (Luminex™) kuglicama koje su kovalentno obložene sa anti-myc monoklonalnim antitelom (MAb 9E10, hibridoma ćelijska linija CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). Kuglice su tada pre upotrebe isprane sa PBS. Supernatanti, koji sadrže anti-antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem, razblaženi su u puferu u odnosu 1:4 i dodati u filter ploče sa 96 ležišta. Lažni supernatant bez antitela je upotrebljen kao negativna kontrola. Kuglice koje sadrže sakupljene antigen E proteine su dodate u uzorke antitela (3000 kuglica po ležištu) i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, kuglice se uzorkom su isprane i vezano antitelo zajednčkog lakog lanca je detektovano sa R-fikoeritrin-konjugovanim antihumanim IgG antitelom. Intenzitet fluorescencije kuglica (približno 100 kuglica je brojano za svaki uzorak antitela vezanog za svaki antigen E protein) meren je sa Luminex™ analizatorom baziranim na protočnoj citometriji, i srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) za najmanje 100 brojanih kuglica po interakciji kuglica/antitelo je zabeležena. Rezultati su prikazani u Tabelama 11 i 12.
4
[0160] Supernatanti anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca ispoljili su visoko specifično vezivanje za čestice vezane za antigen E-ECD. za ove čestice, lažni supernatant negativne kontrole doveo je do zanemarljivog signala (<10 MFI) kad je kombinovan sa kuglicama uzorka antigen E-ECD, dok su supernatanti koji sadrže antiantigen E antitela zajedničkog lakog lanca ispoljili jaki signal vezivanja (srednja MFI od 2627 za 98 supernatanata antitela; MFI > 500 za 91/98.uzoraka antitela)
[0161] Kao mera sposobnosti izabranih anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca da identifikuju različite epitope na ECD antigena E, određeno je relativno vezivanje antitela za varijante. Sve četiri varijante antigena E su sakupljene na anti-myc Luminex™ kuglicama kao što je ranije opisano za ispitivanje vezivanja nativnog antigen E-ECD, i određeni su odnosi relativnog vezivanja (MFIvarijanta/MFIAntigen E-ECD). Za 98 testiranih antitela zajedničkog lakog lanca supernatanti prikazani u Tabelama 11 i 12, prosečni odnosi (MFIvariant/MFIAntigen E-ECD) razlikuju se za svaku varijantu, verovatno odražavajući različite količine sakupljenog proteina na kuglicama (prosečni odnosi od 0.61, 2.9, 2.0, i 1.0 za antigen E-ΔCT, antigen E-Ala1, antigen E-Ala2, odnosno Mf Antigen E). Za svaku varijantu proteina, vezivanje za podgrupu od 98 testiranih antitela zajedničkog lakog lanca pokazalo je znatno smanjenje vezivanja, ukazujući na osetljivost na mutaciju koja karakteriše datu varijanru. Na primer, 19 od uzoraka antitela zajedničkog lakog lanca vezanih za Mf antigen E sa MFIvariant/MFIAntigen
E-ECDod <8%. Pošto mnoge u ovoj grupi uključuju antitela visokog ili srednje visokog afiniteta (5 sa KD< 5nM, 15 sa KD< 50 nM), verovatno je da je niži signal za ovu grupu rezultat osetlivosti na razlike (epitop) sekvenci između nativnog antigena E-ECD, pre nego zbog manjeg afiniteta.
[0162] Ovi podaci potvrđuju da antitela zajedničkogn lakog lanca opisana u Tabelama 3 i 4 zaista predstavljaju različitu grupu anti-antigen E antitela zajedničkoglakog lanca koja specifičo raspoznaju više od jednog epitopa na antigenu E.
1
2
4

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Miš koji sadrži:
(a) zamenu u endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih endogenih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša jednim preuređenim humanim segmentom Vκ1-39/Jκ gena ili jednim preuređenim humanim segmentom Vκ3-20/Jκ gena, gde je segment gena čoveka operativno vezan za endogeni konstantan κ gen miša i pri čemu miš nema endogeni lokus varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji može da se preuredi i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša; i
(b) zamenu endogenog genskog lokusa miša varijabilnog regiona teškog lanca različitim segmenatima gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni gen konstantnog teškog lanca miša i gde su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.
2. Miš prema zahtevu 1, naznačen time, što:
(a) sadrži i mišji κ intronski pojačivač 5' u odnosu na konstantan region lakog lanca miša; ili
(b) sadrži još i mišji κpojačivač na 3'.
3. Miš prema zahtevu 2, naznačen time, što:
(a) više segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadrže segmente odabrane iz grupe koju čine 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1 segmenta gena varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka i njihove kombinacije;
(b) više segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadrže segment odabran iz grupe koju čine D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, i D7-27 segmenta gena i njihove kombinacije;
(c) sadrži B ćeliju koja sadrži preuređenu sekvencu gena varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koja ima varijabilni region teškog lanca gena čoveka izveden od segmenta VH gena koji je odabran iz grupe koju čine VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-39, VH4-59, i VH5-51, i izveden od segmenta D gena koji odabran iz grupe koju čineD1-7, D1-26, D3-3, D3-16, D3-10, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, i D7-27; ili
(d) sadrži B ćeliju koja sadrži preuređeni sekvencu gena varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži segment VH, JH, i DH gena odabran od VH 2-5 JH 1 D6-6, VH3-23 JH4 D3, VH3-23 JH4 D3-10, VH3-30 JH 1 D6-6, VH3-30 JH3 D6-6, VH3-30 JH4 D1 -7, VH3-30 JH4 D5-12, VH3-30 JH4 D6-13, VH3-30 JH4 D6-6, VH3-30 JH4 D7-27, VH3-30 JH5 D3-22, VH3-30 JH5 D6-6, VH3-30 JH5 D7-27, VH4-39 JH3 D1 -26, VH4- 59 JH3 D3-16, VH4-59 JH3 D3-22, VH4-59 JH4 D3-16, VH5-51 JH3 D5-5, VH5-51 JH5 D6-13 i VH5-51 JH6 D3-16.
4. Miš prema zahtevu 1, naznačen time, što:
(a) segment Vκ1-39 gena čoveka je prisutan kao preuređen sa segmentom Jκ5 gena čoveka; ili
(b) segment Vκ3-20 gena čoveka je prisutan kao preuređen sa segmentom Jκ1 gena čoveka.
5. Ćelija izolovana iz genetski modifikovanog miša prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što sadrži:
(a) zamenu u endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih endogenih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulinska miša jednim segmentom Vκ1-39/Jκ gena čoveka ili jednim segmentom Vκ3-20/Jκ gena čoveka, pri čemu je segment gena čoveka operativno vezan za endogeni gen za konstantan deo κ miša i pri čemu ćelija nema endogeni lokus varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji je u stanju da se preuredi i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša; i,
(b) zamenu endogenog genskog lokusa miša varijabilnog regiona teškog lanca različitim segmenatima gena varijabilnog regiona humanog teškog lancapri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca operativno vezani za endogeni gen konstantnog teškog lanca miša i gde su segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.
6. Ne terapeutski postupak dobijanja antitela koje vezuje antigen od interesa, a koji obuhvata imunizaciju miša prema jednom od zahteva 1 do 4 sa antigenom od interesa, pri čemu se dobija sekvenca gena za varijabilni region imunoglobulina miša i upotreba sekvence gena varijabilnog regiona imunoglobulina za dobijanje antitela koje vezuje antigen.
7. Postupak prema zahtevu 6 koji dalje obuhvata:
- ekspresiju u jednoj ćeliji: (a) prvu sekvencu gena varijabilnog regiona (VH) teškog lanca miša prema jednom od zahteva 1 do 4 koji je imunizovan, pri čemu je sekvenca VHgena fuzionisana sa sekvencom gena konstantnog regiona (CH) teškog lanca čoveka; i (b) sekvencu gena varijabilnog regiona (VL) lakog lanca miša prema jednom od zahteva 1 do 4 koji je imunizovan, pri čemu je sekvenca VLgena fuzionisana sa sekvencom gena konstantnog regiona(CL) lakog lanca čoveka;
- održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim za ekspresiju potpuno humanog antitela; i
- izolovanje antitela.
8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što ćelija sadrži drugu sekvencu VHgena miša prema jednom od zahteva 1 do 4 koji je imunizovan, pri čemu je sekvenca VHgena fuzionisana sa sekvencom CHgena čoveka, pri čemu prva sekvenca VHgena kodira VHdomen koji prepoznaje prvi epitop, a druga sekvenca VHgena kodira VHdomen koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi i drugi epitop nisu identični.
9. Ne terapeutski postupak za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, koji obuhvata imunizaciju miša prema jednom od zahteva 1 do 4 i dobijanje bispecifičnog antitela korišćenjem sekvenci gena humanog varijabilnog regiona B ćelija iz miša
1
10. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time, što obuhvata:
(a) identifikovanje klonalno odabranog limfocita miša prema jednom od zahteva 1 do 4, pri čemu je miš imunizovan i omogućeno mu je da razvije imunski odgovor na antigen od interesa, pri čemu limfocit eksprimira antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa;
(b) dobijanje iz limfocita ili antitela nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni region humanog teškog lanca antitela koje specifično vezuje antigen od interesa; i
(c) primenu nukleotidne sekvence (b) za dobijanje bispecifičnog antitela.
11. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što su koraci (a) do (c) izvedeni prvi put za prvi antigen od interesa za dobijanje prve sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca i koraci (a) do (c) su izvedeni drugi put za drugi antigen od interesa za dobijanje druge sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca gde se prva sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca eksprimira fuzionisana sa prvim konstantnim regionom humanog teškog lanca pri čemu se formira prvi humani teški lanac, a druga sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca se eskprimira fuzionisana sa drugim konstantnim regionom humanog teškog lanca, čime formira drugi teški lanac čoveka, gde se prvi i drugi teški lanac eksprimuju u prisustvu jednog lakog lanca čoveka eksprimiranog iz segmenta Vκ1-39 ili Vκ3-20 gena.
12. Postupak prema zahtevu 10, koji obuhvata:
(a) kloniranje sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca čoveka iz B ćelija
- miša prema jednom od zahteva 1 do 4 koji je imunizovan prvim antigenom od interesa; i
- istog miša ili različitog miša koji je genetski isti, a koji je imunizovan drugim antigenom od interesa,
(b) ekspresiju u ćeliji sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca čoveka iz (a) sa istim konstantnim regionom teškog lanca i istim lakim lancem za dobijanje bispecifičnog antitela.
13. Postupak prema zahtevu 11 ili 12, naznačen time, što prvi teški lanac čoveka sadrži modifikaciju koja uklanja ili bitno smanjuje afinitet prvog teškog lanca čoveka za protein
2
A, a drugi teški lanac čoveka zadržava sposobnost da veže protein A, gde se modifikacija koja uklanja ili bitno afinitet prvog teškog lanca čoveka za protein A bira od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), i njihove kombinacije.
14.Upotreba miša prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za izbor varijabilnog domena ili segmenta gena teškog lanca imunoglobulina čoveka.
RS20150772A 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem RS54367B2 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30228210P 2010-02-08 2010-02-08
PCT/US2011/023971 WO2011097603A1 (en) 2010-02-08 2011-02-08 Common light chain mouse
EP11703799.4A EP2501817B2 (en) 2010-02-08 2011-02-08 Common light chain mouse

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS54367B1 RS54367B1 (sr) 2016-04-28
RS54367B2 true RS54367B2 (sr) 2021-08-31

Family

ID=43663643

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150772A RS54367B2 (sr) 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem
RS20190849A RS59001B1 (sr) 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem
RS20161014A RS55315B2 (sr) 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190849A RS59001B1 (sr) 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem
RS20161014A RS55315B2 (sr) 2010-02-08 2011-02-08 Miš sa zajedničkim lakim lancem

Country Status (29)

Country Link
US (5) US10143186B2 (sr)
EP (4) EP2501817B2 (sr)
JP (9) JP5955781B2 (sr)
KR (5) KR101995735B1 (sr)
CN (2) CN105010238B (sr)
AU (1) AU2011213585B2 (sr)
BR (1) BR112012019887B1 (sr)
CA (1) CA2789154C (sr)
CY (2) CY1118241T1 (sr)
DK (3) DK2501817T4 (sr)
ES (3) ES2603559T5 (sr)
HR (3) HRP20151188T4 (sr)
HU (3) HUE029785T2 (sr)
IL (4) IL321266A (sr)
LT (2) LT3095871T (sr)
ME (2) ME02646B (sr)
MX (4) MX2012009168A (sr)
MY (1) MY166529A (sr)
NZ (4) NZ719253A (sr)
PL (3) PL2501817T5 (sr)
PT (3) PT2505654T (sr)
RS (3) RS54367B2 (sr)
RU (2) RU2724663C2 (sr)
SG (4) SG183149A1 (sr)
SI (3) SI3095871T1 (sr)
SM (3) SMT201900372T1 (sr)
TR (1) TR201906650T4 (sr)
WO (1) WO2011097603A1 (sr)
ZA (1) ZA201205944B (sr)

Families Citing this family (226)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2008027986A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
PL3456190T3 (pl) * 2008-06-27 2022-06-06 Merus N.V. Wytwarzające przeciwciała transgeniczne zwierzę z gatunku myszy
AU2009329365B2 (en) 2008-12-18 2016-01-14 Roger Kingdon Craig Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use thereof
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20120021409A1 (en) * 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
CN104404050B (zh) * 2010-06-22 2018-06-08 瑞泽恩制药公司 杂交轻链小鼠
CA2807282A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
US10765093B2 (en) * 2010-11-27 2020-09-08 James Zhu Humanized transgenic animal
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
BR112013020338A2 (pt) 2011-02-28 2016-10-18 Hoffmann La Roche proteína de ligação de antígeno monovalente, composição farmacêutica, uso da proteína de ligação de antígeno monovalente, método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno monovalente, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
FI3865581T3 (fi) * 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
EP2758534B1 (en) * 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
GB2495083A (en) * 2011-09-26 2013-04-03 Kymab Ltd Human VpreB and chimaeric surrogate light chains in transgenic non-human vertebrates
MX355877B (es) * 2011-09-30 2018-05-03 Dana Farber Cancer Inst Inc Peptidos terapeuticos.
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
US20140283153A1 (en) 2011-10-28 2014-09-18 Trianni, Inc. Transgenic animals and methods of use
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9706759B2 (en) 2011-12-20 2017-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
NZ714516A (en) 2012-03-02 2017-06-30 Regeneron Pharma Human antibodies to clostridium difficile toxins
HK1205873A1 (en) * 2012-03-06 2015-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
AU2015227453B2 (en) * 2012-03-16 2017-05-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
NZ730271A (en) 2012-03-16 2022-09-30 Regeneron Pharma Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
RS57118B1 (sr) 2012-03-16 2018-06-29 Regeneron Pharma Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
CN104302170B (zh) * 2012-03-16 2016-09-28 瑞泽恩制药公司 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PT2838917T (pt) * 2012-04-20 2019-09-12 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas
US9969813B2 (en) * 2012-05-10 2018-05-15 Bioatla, Llc Multi-specific monoclonal antibodies
AU2013271737A1 (en) * 2012-06-05 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for making fully human bispecific antibodies using a common light chain
KR102266274B1 (ko) 2012-06-12 2021-06-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
PL2900694T3 (pl) 2012-09-27 2018-12-31 Merus N.V. Dwuswoiste przeciwciała igg jako aktywatory komórek t
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
TR201810255T4 (tr) * 2013-02-20 2018-08-27 Regeneron Pharma Modifiye edilmiş immunoglobulin ağır zincir sekanslarına sahip olan insan olmayan hayvanlar.
EP3543253B1 (en) * 2013-02-20 2024-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized t-cell co-receptors
HRP20181866T1 (hr) * 2013-02-22 2019-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi koji izražavaju humanizirane komplekse glavne histokompatibilnosti
CA2903025C (en) * 2013-03-11 2025-10-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. TRANSGENIC MICE EXPRESSING CHIMERIC MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS II MOLECULES
LT3501272T (lt) * 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
CN105189545A (zh) * 2013-03-13 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 常见轻链小鼠
EP2967012B1 (en) 2013-03-14 2020-09-16 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgenic non-human mammal for antibody production
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
JP2016528167A (ja) 2013-04-29 2016-09-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及び使用方法
US20150033372A1 (en) * 2013-05-01 2015-01-29 Kymab Limited Human VpreB & Chimaeric Surrogate Light Chains in Transgenic Non-Human Vertebrates
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
SG11201601272YA (en) 2013-09-18 2016-03-30 Regeneron Pharma Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same
CN105765063B (zh) 2013-09-30 2021-05-07 中外制药株式会社 应用改变的辅助噬菌体制备抗原结合分子的方法
AU2014330922A1 (en) * 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
EP3835318B1 (en) 2014-01-15 2025-10-29 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
WO2015107015A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with improved protein a-binding
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
RS66392B1 (sr) 2014-02-28 2025-02-28 Merus Nv Antitelo koje vezuje erbb-2 i erbb-3
ES2816624T3 (es) 2014-02-28 2021-04-05 Merus Nv Anticuerpos que se unen a EGFR y ERBB3
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
CA3124228C (en) * 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
PT3142750T (pt) 2014-05-13 2020-09-22 Univ Pennsylvania Composições que compreendem aav expressando construções de anticorpos duplos e suas utilizações
CA2951234C (en) 2014-06-06 2022-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
AU2015317370A1 (en) 2014-09-19 2017-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
CA2963470A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
KR20170076697A (ko) 2014-11-06 2017-07-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 개질된 FCRN-결합 특성 및 단백질 A-결합 특성을 가진 Fc-영역 변이체
PT3221359T (pt) 2014-11-17 2020-06-23 Regeneron Pharma Métodos para o tratamento de tumores usando anticorpos biespecíficos cd3xcd20
KR20230125855A (ko) 2014-11-21 2023-08-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd73에 대항한 항체 및 그의 용도
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
EP3233912B1 (en) 2014-12-19 2021-05-19 Regenesance B.V. Antibodies that bind human c6 and uses thereof
CN110256558B (zh) 2014-12-23 2023-07-04 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体
WO2016149678A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
UY36687A (es) 2015-05-29 2016-11-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos contra ox40 y sus usos
EA201890162A1 (ru) 2015-06-29 2018-07-31 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к cd40 с повышенной агонистической активностью
CN107849131A (zh) 2015-07-06 2018-03-27 瑞泽恩制药公司 多特异性抗原结合分子及其用途
LT3115376T (lt) 2015-07-10 2018-11-12 Merus N.V. Antikūnai, kurie jungiasi su žmogaus cd3
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
DK3353212T3 (da) 2015-09-23 2021-12-20 Regeneron Pharma Optimerede bispecifikke anti-CD3-antistoffer og anvendelser deraf
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
TWI752920B (zh) 2015-10-12 2022-01-21 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
US11939394B2 (en) 2015-10-23 2024-03-26 Merus N.V. Binding molecules that inhibit cancer growth
AU2016356780A1 (en) 2015-11-19 2018-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) and uses thereof
BR112018012801B1 (pt) 2015-12-22 2024-03-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Usos de uma combinação de anticorpos anti-pd-1 e anticorpos biespecíficos anti-cd20/anti-cd3 e de uma composição farmacêutica
CN108777951B (zh) 2016-01-13 2021-11-05 瑞泽恩制药公司 具有包括改造的多样性簇的免疫球蛋白重链可变区的非人动物及其用途
KR20220033522A (ko) 2016-03-04 2022-03-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
EP4406550A3 (en) 2016-03-04 2024-10-16 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
CA3023678A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Tl1a antibodies and uses thereof
TWI786044B (zh) 2016-05-13 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予ｐｄ-１抑制劑治療皮膚癌之方法
EP4368637A3 (en) 2016-05-20 2024-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
KR102784608B1 (ko) 2016-06-03 2025-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물
LT3468990T (lt) 2016-06-14 2024-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antikūnai ir jų panaudojimas
CA3029209A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
SG10201911972QA (en) 2016-07-14 2020-02-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against tim3 and uses thereof
CN109641949B (zh) 2016-08-26 2023-09-15 赛诺菲 促进选择性轻链配对的多特异性抗体
US10981976B2 (en) 2016-08-31 2021-04-20 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus K envelope (HERV-K) and use thereof
UA126384C2 (uk) 2016-09-14 2022-09-28 Тенеобіо, Інк. Антитіло, яке зв'язує cd3
EP4273172A3 (en) 2016-09-23 2024-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
MX2019003325A (es) 2016-09-23 2019-08-05 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-steap2, conjugados anticuerpo-farmaco, y moleculas de fijacion al antigeno biespecificas que se fijan a steap2 y cd3, y usos de estos.
CR20190193A (es) 2016-10-13 2019-08-21 Massachusetts Inst Technology Anticuerpos que se unen a la proteína de envoltura del virus zika y usos de los mismos
NZ795790A (en) 2016-12-21 2025-11-28 Teneobio Inc Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
IL268667B2 (en) 2017-02-10 2024-12-01 Regeneron Pharma Radiolabeled antibodies against LAG3 for immuno-PET imaging
EP3583124A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
JP7116736B2 (ja) 2017-03-02 2022-08-10 ノバルティス アーゲー 操作されたヘテロ二量体タンパク質
IL269656B2 (en) 2017-03-31 2024-06-01 Merus Nv Bispecific antibodies that bind ERBB-2 and ERBB3 for use in the treatment of cells with NRG1 fusion gene
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
EP3625264B9 (en) 2017-05-17 2023-10-25 Merus N.V. Combination of an erbb-2/erbb-3 bispecific antibody with endocrine therapy for breast cancer
EP3635009A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
US11970540B2 (en) 2017-06-20 2024-04-30 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
CA3065951A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneoone, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
GB201710984D0 (en) * 2017-07-07 2017-08-23 Kymab Ltd Cells, vertebrates, populations & methods
TWI865430B (zh) 2017-07-24 2024-12-11 美商再生元醫藥公司 穩定化之抗體組合物及其製法
PL3665198T3 (pl) 2017-08-09 2025-06-09 Merus N.V. Przeciwciała wiążące egfr i cmet
CA3076632A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind a staphylococcus target antigen and a complement component and uses thereof
AU2018366199A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
MX2020006113A (es) 2017-12-13 2020-08-24 Regeneron Pharma Combinaciones de anticuerpos anti-c5 y usos de las mismas.
MX2020006494A (es) 2017-12-22 2020-11-24 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada que se unen a cd22.
CN111886255B (zh) 2018-01-12 2025-04-04 百时美施贵宝公司 抗tim3抗体及其用途
US11780907B2 (en) 2018-01-26 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to influenza hemagglutinin
JP7351845B2 (ja) 2018-03-23 2023-09-27 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｍｉｃａおよび／またはｍｉｃｂに対する抗体ならびにそれらの使用
SMT202500038T1 (it) 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
SI3773713T1 (sl) 2018-04-06 2025-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protitelo, agonist leptinskega receptorja, za uporabo pri povečanju kostne mase pri osebi, ki trpi zaradi presnovne disfunkcije ali hipoleptinemije
MX2020011487A (es) 2018-04-30 2020-12-07 Regeneron Pharma Anticuerpos y moleculas biespecificas de union al antigeno que se unen a her2 y/o aplp2, conjugados y usos de estos.
EP3793591A1 (en) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
CN112513081A (zh) 2018-06-14 2021-03-16 生物蛋白有限公司 多重特异性抗体构建体
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
US11548947B2 (en) 2018-06-21 2023-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-PSMA X anti-CD28 antibodies and uses thereof
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
EA202190601A1 (ru) 2018-08-23 2021-07-14 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. АНТИТЕЛА АНТИ-Fc ЭПСИЛОН-R1 АЛЬФА (FCER1A), БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ FCΕR1Α И CD3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
IL280875B2 (en) 2018-08-31 2024-12-01 Regeneron Pharma Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
KR20210082207A (ko) 2018-10-23 2021-07-02 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-npr1 항체 및 이의 용도
JP7520003B2 (ja) 2018-11-16 2024-07-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｎｋｇ２ａ抗体およびその使用
EP3883961A1 (en) 2018-11-20 2021-09-29 Takeda Vaccines, Inc. Novel anti-zika virus antibodies and uses thereof
JP2022512904A (ja) 2018-11-21 2022-02-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ抗体およびその使用
CN113166268B (zh) 2018-12-19 2024-07-30 瑞泽恩制药公司 双特异性抗muc16 x抗cd28抗体以及其用途
EP3897715A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-cd28 x anti-cd22 antibodies and uses thereof
US12467062B2 (en) 2018-12-21 2025-11-11 Compass Therapeutics Llc Transgenic mouse expressing common human light chain
CN113396162B (zh) 2019-01-22 2024-08-16 百时美施贵宝公司 抗IL-7Rα亚基的抗体及其用途
EP3923978A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for using bispecific antibodies to bind complement and a target antigen
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
CN113661177B (zh) 2019-03-22 2024-04-16 里珍纳龙药品有限公司 EGFR x CD28多特异性抗体
KR20210149076A (ko) 2019-04-05 2021-12-08 테네오바이오, 인코포레이티드 Psma에 결합하는 중쇄 항체
TW202110323A (zh) 2019-06-05 2021-03-16 美商再生元醫藥公司 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途
CN113966343A (zh) 2019-06-11 2022-01-21 瑞泽恩制药公司 结合PcrV的抗PcrV抗体、包含抗PcrV抗体的组合物及其使用方法
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
US12091460B2 (en) 2019-06-21 2024-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind MUC16 and CD3 in combination with 4-1BB co-stimulation
KR20220024594A (ko) 2019-06-21 2022-03-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Psma 및 cd3에 결합하는 이중 특이적 항원 결합 분자와 4-1bb 공동 자극의 병용
US12215148B2 (en) 2019-08-08 2025-02-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antigen binding molecule formats
MX2022001942A (es) 2019-08-15 2022-07-27 Regeneron Pharma Moléculas de union a antígeno multiespecíficas para el direcciónamiento célular y usos de las mismas.
GB201912008D0 (en) 2019-08-21 2019-10-02 Cambridge Entpr Ltd Antibody
PH12022550963A1 (en) 2019-10-28 2023-09-25 Regeneron Pharma Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use thereof
CA3163549A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
JP7693672B2 (ja) 2019-12-06 2025-06-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性抗ｂｃｍａ×抗ｃｄ３抗体により多発性骨髄腫を治療する方法
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
EP4103617A1 (en) 2020-02-11 2022-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-acvr1 antibodies and uses thereof
JP7625007B2 (ja) 2020-04-29 2025-01-31 テネオバイオ， インコーポレイテッド 重鎖定常領域が修飾された多重特異性重鎖抗体
IL298099A (en) 2020-05-12 2023-01-01 Regeneron Pharma Anti-glp1r antagonist antibodies and methods of use thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
CA3182925A1 (en) * 2020-06-02 2021-12-09 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
AU2021329378A1 (en) * 2020-08-19 2023-03-23 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
KR20230066386A (ko) 2020-09-11 2023-05-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항원 특이적 항체의 확인 및 제조
US11905332B2 (en) 2020-09-18 2024-02-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antigen-binding molecules that bind CD38 and/or CD28, and uses thereof
CA3190569A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Christopher Daly Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
CN118878693A (zh) 2020-11-23 2024-11-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种双特异性抗体及其用途
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
IL303542A (en) 2020-12-18 2023-08-01 Regeneron Pharma Immunoglobulin proteins that bind to NPR1 agonists
US12371487B2 (en) 2020-12-23 2025-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce the same
CA3165366A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
SI4284512T1 (sl) 2021-01-28 2025-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za zdravljenje sindroma sproščanja citokinov
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
CN118511853A (zh) 2021-03-31 2024-08-20 瑞泽恩制药公司 包含具有改善的tcrb组库多样性的人源化细胞免疫系统组分的基因修饰的小鼠
MX2024006812A (es) 2021-12-06 2024-08-19 Regeneron Pharma Anticuerpos antagonistas anti-npr1 y metodos de uso de los mismos.
CA3252619A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-CD28 and anti-PSMA antibodies
TW202400228A (zh) 2022-02-25 2024-01-01 美商再生元醫藥公司 減輕細胞激素釋放症候群的給藥方案
WO2023196903A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind and cd3 and tumor associated antigens (taas) and uses thereof
EP4507790A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
JP2025519057A (ja) 2022-05-18 2025-06-24 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃｄ３８及び４－１ｂｂに結合する多重特異性抗原結合分子、並びにその使用
EP4554977A1 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ciliary neurotrophic factor receptor (cntfr) and methods of use thereof
WO2024092133A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-acvr1 antibodies and their use in the treatment of trauma-induced heterotopic ossification
GB202217978D0 (en) * 2022-11-30 2023-01-11 Petmedix Ltd Rodents expressing a common light chain
TW202430641A (zh) 2023-01-18 2024-08-01 美商基利科學股份有限公司 人類免疫球蛋白二元輕鏈轉殖基因構築體及其用途
WO2024163477A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 University Of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
IL322397A (en) 2023-02-13 2025-09-01 Regeneron Pharma Treating muscle-related disorders with anti-human CACNG1 antibodies
CN120857940A (zh) 2023-02-17 2025-10-28 瑞泽恩制药公司 对cd3/taa双特异性抗体有反应的诱导型nk细胞
WO2024229105A1 (en) 2023-05-02 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
WO2024259206A1 (en) 2023-06-16 2024-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd40 x cd40 bispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2025014913A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific pd-l1xcd28 antibodies and methods of use thereof
WO2025014533A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human cacng1 antibody-drug conjugates and uses thereof
TW202519547A (zh) 2023-07-10 2025-05-16 美商再生元醫藥公司 雙特異性PD-L1x4-1BB抗體及其使用方法
EP4630457A1 (en) 2023-08-18 2025-10-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2025064761A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kras10-18 g12d off-target peptides and uses thereof
WO2025064738A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dntt 250-258 off-target peptides and uses thereof
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025160324A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250277048A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
US20250297006A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Masked Multispecific Antigen-Binding Molecules with Cleavable Linkers

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341351C (en) 1988-09-06 2002-03-26 Marc D. Better Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) † 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US5574205A (en) 1989-07-25 1996-11-12 Cell Genesys Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0502976B1 (en) 1989-12-01 1996-07-03 Pharming B.V. Production of recombinant polypeptides by bovine species and transgenic methods
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) * 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7084260B1 (en) 1996-10-10 2006-08-01 Genpharm International, Inc. High affinity human antibodies and human antibodies against human antigens
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5667988A (en) * 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US7067284B1 (en) * 1992-01-27 2006-06-27 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
SG48760A1 (en) 1992-07-24 2003-03-18 Abgenix Inc Generation of xenogenetic antibodies
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
EP0739412B1 (en) 1993-12-23 2002-02-27 Infigen, Inc. ungulate EMBRYONIC STEM CELLS AS NUCLEAR DONORS AND NUCLEAR TRANSFER TECHNIQUES TO PRODUCE CHIMERIC AND TRANSGENIC ANIMALS
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US7119248B1 (en) 1994-04-12 2006-10-10 Miltenyi Biotec Gmbh Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0826696T3 (da) 1996-09-03 2002-09-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Anvendelse af bi- og trispecifikke antistoffer til inducering af en tumorimmunitet
ES2301183T3 (es) 1996-12-03 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpo completamente humano que se une al receptor del egfr.
BR9808192A (pt) 1997-03-06 2000-10-24 Infigen Inc Processo de clonagem de animais
CN100387621C (zh) 1997-04-14 2008-05-14 麦可麦脱股份公司 抗人抗原受体的新的生产方法及其用途
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
ATE373712T1 (de) * 1997-10-03 2007-10-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Natürlicher menschlicher antikörper
ES2245487T3 (es) 1997-11-18 2006-01-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CA2370477C (en) 1999-04-15 2010-06-29 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein
AU2001245358A1 (en) 2000-02-29 2001-09-12 Auburn University Production of antibodies in transgenic plastids
CN101498731A (zh) 2000-05-18 2009-08-05 日本烟草产业株式会社 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途
MXPA03000634A (es) 2000-07-21 2004-12-03 Us Agriculture Metodos para el reemplazo, el desplazamiento y acumulacion de adn en genomas eucarioticos.
CA2422155A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Wim Van Schooten Production of humanized antibodies in transgenic animals
EP1184458A1 (en) 2000-08-28 2002-03-06 U-BISys B.V. Differentially expressed CD46 epitopes, proteinaceous molecules capable of binding thereto, and uses thereof
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) * 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
MA26040A1 (fr) 2001-01-05 2004-04-01 Pfizer Des anticorps pour recepteur i de facteur de croissance insulinique
US6961875B2 (en) 2001-03-22 2005-11-01 International Business Machines Corporation Method and apparatus for capturing event traces for debug and analysis
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
JP2005538706A (ja) 2001-07-12 2005-12-22 ジェファーソン フーテ， スーパーヒト化抗体
EP1578917A4 (en) 2001-07-19 2008-01-23 Perlan Therapeutics Inc MULTIMEDIA PROTEINS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
ES2350248T3 (es) 2001-10-01 2011-01-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Procedimiento de producción de bibliotecas de proteínas y de selección de proteínas a partir de las mismas.
US20060199204A1 (en) * 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20030108925A1 (en) * 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
GB0130267D0 (en) 2001-12-19 2002-02-06 Neutec Pharma Plc Focussed antibody technology
US20050095712A1 (en) 2002-01-17 2005-05-05 Alberto Martin Mutations caused by activation-induced cytidine deaminase
JP2005527490A (ja) 2002-01-18 2005-09-15 イノヴィオ アーエス 筋肉内投与のための二重特異性抗体ｄｎａ構築物
DE60327199D1 (de) 2002-04-26 2009-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening auf agonistische antikörper
CN1675245B (zh) 2002-06-14 2011-01-12 免疫医疗公司 人源化单克隆抗体hPAM4
CN101962408A (zh) 2002-07-12 2011-02-02 杰斐逊·富特 超人源化抗体
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
EP1439234A1 (en) 2003-01-08 2004-07-21 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Targeted transgenesis using the rosa26 locus
DE602004021095D1 (de) 2003-01-21 2009-06-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening der leichten kette eines antikörpers
JP2006518372A (ja) 2003-01-28 2006-08-10 セレクティス 脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびその応用
US20070009957A1 (en) 2003-03-04 2007-01-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Vectors used to create hybrid constant regions
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) * 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CN1852925A (zh) 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
US20050153392A1 (en) 2003-08-11 2005-07-14 Roland Buelow Transgenesis with humanized immunoglobulin loci
WO2005038001A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
JP4906094B2 (ja) 2004-01-16 2012-03-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド レセプターを活性化し得る融合ポリペプチド
CN1560081A (zh) 2004-02-17 2005-01-05 大连帝恩生物工程有限公司 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
US7625549B2 (en) 2004-03-19 2009-12-01 Amgen Fremont Inc. Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice
DK1802193T3 (da) 2004-10-19 2014-06-10 Regeneron Pharma Fremgangsmåde til frembringelse af en homozygot mus til genetisk modifikation
US20080184380A1 (en) 2004-10-22 2008-07-31 Therapeutic Human Polyclonals Inc. Suppression of Endogenous Immunoglobulin Expression in Non-Human Transgenic Animals
WO2007001422A2 (en) * 2004-10-22 2007-01-04 Medimmune, Inc. High affinity antibodies against hmgb1 and methods of use thereof
WO2006117699A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Innate Pharma Transgenic animals and methods of making recombinant antibodies
CN101297031B (zh) 2005-05-14 2013-06-05 复旦大学 在脊椎动物中作为遗传操作和分析工具的piggyBac
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP2314619A1 (en) * 2005-12-05 2011-04-27 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
US20090307787A1 (en) 2006-01-25 2009-12-10 Franklin Gerardus Grosveld Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
US7462759B2 (en) 2006-02-03 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brittle stalk 2 gene family and related methods and uses
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
PL2374818T3 (pl) 2006-06-02 2013-05-31 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
US8084024B2 (en) 2006-08-22 2011-12-27 G2 Inflammation Pty Ltd Method for producing antibodies
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
PL2069403T3 (pl) 2006-10-02 2015-08-31 Regeneron Pharma Przeciwciała ludzkie o wysokim powinowactwie wobec receptora ludzkiej IL-4
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
GB0700194D0 (en) 2007-01-05 2007-02-14 Univ Edinburgh Humanisation of animals
CN101688228B (zh) 2007-03-13 2014-12-24 国家犾太健康中心 抗体产生的方法
EP2336329B8 (en) 2007-06-01 2012-11-21 Omt, Inc. Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenis human idiotype antibodies
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
ITMI20071522A1 (it) * 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
US9693539B2 (en) 2007-08-10 2017-07-04 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HCO32 and HCO27 and related examples
BRPI0815416A2 (pt) 2007-08-15 2014-10-21 Amunix Inc Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos
CN101855242B (zh) 2007-09-14 2014-07-30 阿迪马布有限责任公司 合理设计的合成抗体文库及其用途
US8536310B2 (en) 2007-10-17 2013-09-17 Arca Biopharma, Inc. Antibodies to CLL-1
KR101615935B1 (ko) 2007-12-14 2016-04-28 노보 노르디스크 에이/에스 인간 ｎｋｇ2ｄ에 대한 항체 및 그것의 용도
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CA2721231C (en) 2008-04-14 2015-10-06 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
KR20110020860A (ko) 2008-05-23 2011-03-03 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. 유전자 삽입동물에서 단일 ｖｌ 도메인 항체를 생산하는 방법
PL3456190T3 (pl) * 2008-06-27 2022-06-06 Merus N.V. Wytwarzające przeciwciała transgeniczne zwierzę z gatunku myszy
LT2346994T (lt) 2008-09-30 2022-03-10 Ablexis, Llc Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai
CA2742969A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
AU2009329365B2 (en) 2008-12-18 2016-01-14 Roger Kingdon Craig Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use thereof
EP2401298A1 (en) 2009-02-24 2012-01-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
KR20140056401A (ko) 2009-05-07 2014-05-12 볼보 컨스트럭션 이큅먼트 에이비 작업 기계 및 작업 기계를 작동하기 위한 방법
SG175407A1 (en) 2009-05-29 2011-11-28 Morphosys Ag A collection and methods for its use
ES2865648T3 (es) 2009-06-26 2021-10-15 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecíficos fácilmente aislados con formato de inmunoglobulina nativa
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102803488A (zh) 2009-11-17 2012-11-28 协和发酵麒麟株式会社 人类人工染色体载体
SMT201900251T1 (it) 2009-12-10 2019-07-11 Regeneron Pharma Topi che producono anticorpi della catena pesante
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20130045492A1 (en) * 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130185821A1 (en) * 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA2802591A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN104404050B (zh) 2010-06-22 2018-06-08 瑞泽恩制药公司 杂交轻链小鼠
CA2807282A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
FI3865581T3 (fi) 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
HK1205873A1 (en) 2012-03-06 2015-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
PT2838917T (pt) 2012-04-20 2019-09-12 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas
AU2013271737A1 (en) 2012-06-05 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for making fully human bispecific antibodies using a common light chain
CN105189545A (zh) 2013-03-13 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 常见轻链小鼠
LT3501272T (lt) 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką

Also Published As

Publication number Publication date
JP7233504B2 (ja) 2023-03-06
HUE045591T2 (hu) 2019-12-30
KR102283195B1 (ko) 2021-07-29
IL290085A (en) 2022-03-01
PL2505654T5 (pl) 2020-11-30
JP2019076108A (ja) 2019-05-23
RS54367B1 (sr) 2016-04-28
US10986820B2 (en) 2021-04-27
ME02288B (me) 2016-02-20
RU2724663C2 (ru) 2020-06-25
ES2603559T5 (es) 2021-02-22
US20120192300A1 (en) 2012-07-26
BR122014002928A2 (pt) 2015-12-29
JP2017140050A (ja) 2017-08-17
SG10201913463QA (en) 2020-03-30
PL2501817T5 (pl) 2021-08-16
NZ719253A (en) 2022-08-26
IL321266A (en) 2025-08-01
MY166529A (en) 2018-07-10
SI2505654T2 (sl) 2020-08-31
US20190040123A1 (en) 2019-02-07
MX2012009168A (es) 2012-08-31
HRP20151188T4 (hr) 2021-10-01
SMT201600432B (it) 2017-01-10
BR112012019887A2 (pt) 2015-09-15
TR201906650T4 (tr) 2019-05-21
CA2789154A1 (en) 2011-08-11
PL3095871T3 (pl) 2019-10-31
IL290085B2 (en) 2025-11-01
DK2501817T4 (da) 2021-07-26
PL2501817T3 (pl) 2016-02-29
JP2020096633A (ja) 2020-06-25
US20210204531A1 (en) 2021-07-08
HK1174358A1 (zh) 2013-06-07
EP2505654B1 (en) 2016-08-24
ES2547142T3 (es) 2015-10-02
KR20210095730A (ko) 2021-08-02
CA2789154C (en) 2024-06-11
JP2023062142A (ja) 2023-05-02
KR101995735B1 (ko) 2019-07-03
AU2011213585B2 (en) 2014-02-06
DK3095871T3 (da) 2019-06-11
RU2015147726A (ru) 2019-01-15
EP3540066A1 (en) 2019-09-18
RS59001B1 (sr) 2019-08-30
SI2501817T1 (sl) 2015-12-31
LT2505654T (lt) 2016-12-12
CN105010238A (zh) 2015-11-04
HUE029785T2 (en) 2017-04-28
RU2571205C2 (ru) 2015-12-20
EP2501817B1 (en) 2015-08-26
DK2505654T4 (da) 2020-07-27
JP2013518597A (ja) 2013-05-23
SMT201900372T1 (it) 2019-09-09
HRP20161551T4 (hr) 2020-10-02
CY1121794T1 (el) 2020-07-31
JP5955781B2 (ja) 2016-07-20
JP2022001066A (ja) 2022-01-06
JP2024156973A (ja) 2024-11-06
NZ619512A (en) 2014-10-31
ES2547142T5 (es) 2021-12-09
IL267362B (en) 2022-02-01
JP2015171386A (ja) 2015-10-01
CY1118241T1 (el) 2017-06-28
ME02646B (me) 2017-06-20
RS55315B2 (sr) 2020-08-31
CN105010238B (zh) 2018-07-20
EP2505654A1 (en) 2012-10-03
JP6215264B2 (ja) 2017-10-18
SI3095871T1 (sl) 2019-06-28
ES2728942T3 (es) 2019-10-29
SI2501817T2 (sl) 2021-09-30
RU2012138431A (ru) 2014-03-20
HUE026229T2 (en) 2016-06-28
ZA201205944B (en) 2013-06-26
KR20190077630A (ko) 2019-07-03
HRP20151188T1 (hr) 2015-12-04
US20130302836A1 (en) 2013-11-14
KR102116296B1 (ko) 2020-05-28
US20110195454A1 (en) 2011-08-11
SG183149A1 (en) 2012-09-27
WO2011097603A1 (en) 2011-08-11
MX378870B (es) 2025-03-11
RS55315B1 (sr) 2017-03-31
HRP20161551T1 (hr) 2016-12-30
PT3095871T (pt) 2019-06-12
EP2501817B2 (en) 2021-04-21
CN102791866B (zh) 2015-07-29
JP2018138047A (ja) 2018-09-06
IL221265B (en) 2020-04-30
MX2021000286A (es) 2022-06-08
IL290085B1 (en) 2025-07-01
PT2505654T (pt) 2016-11-18
RU2015147726A3 (sr) 2019-06-25
EP3540066B1 (en) 2025-12-24
EP3095871A1 (en) 2016-11-23
KR20130010110A (ko) 2013-01-25
AU2011213585A1 (en) 2012-08-30
SG10201500821UA (en) 2015-04-29
NZ631363A (en) 2016-05-27
PL2505654T3 (pl) 2017-02-28
US10143186B2 (en) 2018-12-04
KR20180018838A (ko) 2018-02-21
MX350983B (es) 2017-09-27
EP2501817A1 (en) 2012-09-26
EP2505654B2 (en) 2020-05-13
SG10201610294RA (en) 2017-02-27
KR101829691B1 (ko) 2018-02-19
SI2505654T1 (sl) 2016-12-30
SMT201500283B (it) 2016-01-08
KR102432611B1 (ko) 2022-08-16
BR112012019887B1 (pt) 2021-06-08
HRP20191191T1 (hr) 2019-10-04
PT2501817E (pt) 2015-11-04
ES2603559T3 (es) 2017-02-28
NZ601679A (en) 2014-01-31
IL267362A (en) 2019-08-29
DK2501817T3 (en) 2015-12-07
CN102791866A (zh) 2012-11-21
JP7538907B2 (ja) 2024-08-22
IL221265A0 (en) 2012-10-31
HK1231505A1 (en) 2017-12-22
KR20200060534A (ko) 2020-05-29
JP6666483B2 (ja) 2020-03-13
JP6960005B2 (ja) 2021-11-05
EP3095871B1 (en) 2019-04-10
LT3095871T (lt) 2019-05-27
JP6470789B2 (ja) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7538907B2 (ja) 共通の軽鎖のマウス
US20190090462A1 (en) Common light chain mouse
RS59331B1 (sr) Čovekolike životinje koje ispoljavaju antitela koja imaju zajednički laki lanac
WO2014160179A1 (en) Common light chain mouse
AU2014200245B2 (en) Common light chain mouse
HK40013893A (en) Common light chain mouse
AU2016203148A1 (en) Common light chain mouse
HK1174358B (en) Common light chain mouse
HK1170763A (en) Common light chain mouse
HK1231505B (en) Common light chain mouse
HK1170763B (en) Common light chain mouse