BR112012019887B1

BR112012019887B1 - método para fabricação de anticorpo e método para selecionar uma sequência de ácido nucleico da região variável da cadeia pesada humana para produzir um anticorpo

Info

Publication number: BR112012019887B1
Application number: BR112012019887-4A
Authority: BR
Inventors: Lynn MacDonald; Sean Stevens; Samuel Davis; Andrew J. Murphy; David R. Buckler; John McWhirter
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2011-02-08
Publication date: 2021-06-08
Also published as: SG10201610294RA; MY166529A; JP6470789B2; JP5955781B2; KR20190077630A; LT2505654T; PT2501817E; JP6960005B2; DK2501817T4; US10143186B2; SI2501817T1; CN102791866B; EP2501817B1; US10986820B2; AU2011213585B2; PL2505654T5; SI3095871T1; MX350983B; CN105010238A; ZA201205944B

Abstract

MÉTODOS DE PRODUZIR UM CAMUNDONGO E DE SELECIONAR UMA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA HUMANA PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, BEM COMO USO DE UM CAMUNDONGO GENETICAMENTE MODIFICADO NA PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO QUIMÉRICA HUMANA E HIBRIDOMA. A presente invenção refere-se a um camundongo geneticamente modificado, em que o camundongo é incapaz de rearranjo e expressão de uma sequência variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena, em que o camundongo expressa somente um ou dois domínios variáveis da cadeia leve humana codificados por sequências de imunoglobulina humana operacionalmente ligadas ao gene constante de camundongo kappa (?) no locus de camundongo endógeno ?, em que o camundongo expressa um anticorpo quimérico reverso tendo um domínio variável da cadeia leve derivado de um de somente dois segmentos gênicos de região variável da cadeia leve humana e um domínio constante ? de camundongo, e um domínio variável de cadeia pesada humana e um domínio constante da cadeia pesada de camundongo, de um locus da cadeia pesada de camundongo endógeno. Proteínas de ligação ao epítopo biespecíficas que são totalmente humanas são fornecidas, compreendendo duas cadeias pesadas diferentes que se associam com uma cadeia leve idêntica (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um camundongogeneticamente modificado é fornecido que expressa anticorpos tendo uma cadeia leve variável humana/constante de camundongo comum associada a diversas cadeias pesadas variáveis humanas/constantes de camundongo. Um método para produção de um anticorpo biespecífico humano de sequências gênicas de região variável humana de células B do camundongo é fornecido.

ANTECEDENTES

[0002] Anticorpos tipicamente compreendem um componente dacadeia pesada homodimérica, em que cada monômero de cadeia pesada está associado a uma cadeia leve idêntica. Os anticorpos tendo um componente de cadeia pesada heterodimérica (por exemplo, anticorpos biespecíficos) são desejáveis como anticorpos terapêuticos. Mas produção anticorpos biespecíficos tendo um componente da cadeia leve adequado que pode associar-se satisfatoriamente com cada uma das cadeias pesadas de um anticorpo biespecífico resultou problemático.

[0003] Em uma abordagem, uma cadeia leve poderia serselecionada por levantamento estatístico de uso de todos os domínios variáveis da cadeia leve, identificando a cadeia leve ainda mais frequentemente empregada em anticorpos humanos, e pareando aquela cadeia leve in vitro com duas cadeias pesadas de especificidade diferente.

[0004] Em outra abordagem, uma cadeia leve poderia ser selecionada observando sequências da cadeia leve em uma biblioteca de exposição de fago (por exemplo, uma biblioteca de exposição de fago compreendendo sequências de região variável da cadeia leve humana, por exemplo, uma biblioteca ScFv humana) e selecionando a região variável da cadeia leve ainda mais comumente usada da biblioteca. A cadeia leve então pode ser testada em duas cadeias pesadas diferentes de interesse.

[0005] Em outra abordagem, uma cadeia leve poderia serselecionada analisando uma biblioteca de exposição de fago de sequências variáveis da cadeia leve usando as sequências variáveis da cadeia pesada de ambas as cadeias pesadas de interesse como sondas. Uma cadeia leve que se associa com ambas as sequências variáveis da cadeia pesada poderia ser selecionada como uma cadeia leve das cadeias pesadas.

[0006] Em outra abordagem, uma cadeia leve candidata poderiaser alinhada com as cadeias leves cognatas das cadeias pesadas, e as modificações são feitas na cadeia leve para corresponder mais estritamente com características de sequência comuns às cadeias leves cognatas de ambas as cadeias pesadas. Se as possibilidades da imunogenicidade tiverem que ser minimizadas, as modificações preferencialmente resultam em sequências que estão presentes em sequências conhecidas da cadeia leve humana, tais que o processamento proteolítico provavelmente não gerará um epítopo de célula T baseado em parâmetros e métodos conhecidos na técnica por avaliar a probabilidade de imunogenicidade (isto é, in silico bem como ensaios úmidos).

[0007] Todas as abordagens acima dependem de métodos in vitroque agrupam diversas restrições a priori, por exemplo, identidade de sequência, capacidade de associação com cadeias pesadas pré- selecionadas específicas, etc. Há uma necessidade na técnica de composições e métodos que não dependem de manipulação das condições in vitro, mas que em vez disso empregam abordagens mais biologicamente razoáveis para produção de proteínas de ligação a epítopo humanas que incluem uma cadeia leve comum.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0008] A figura 1 ilustra uma estratégia de direcionamento parasubstituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógenos com uma região gênica VK1-39JK5 humana.

[0009] A figura 2 ilustra uma estratégia de direcionamento parasubstituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógenos com uma região gênica VK3-20JK1 humana.

[00010] A figura 3 ilustra uma estratégia de direcionamento para substituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógenos com uma região gênica VpreB/JÀ5 humana.

SUMÁRIO

[00011] Camundongos geneticamente modificados que expressam domínios variáveis da cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que os camundongos têm um repertório variável da cadeia leve limitado, são fornecidos. Um sistema biológico para gerar um domínio variável da cadeia leve humana que associa e expressa com um repertório diverso de domínios variáveis da cadeia pesada humana amadurecidos por afinidade é fornecido. Os métodos para produção de proteínas de ligação compreendendo domínios variáveis de imunoglobulina são fornecidos, compreendendo imunização de camundongos que têm um repertório da cadeia leve de imunoglobulina limitado com um antígeno de interesse, e emprego de uma sequência gênica de região variável de imunoglobulina do camundongo em uma proteína de ligação que especificamente se liga ao antígeno de interesse. Os métodos incluem métodos para produção de domínios variáveis da cadeia pesada adequados de imunoglobulina humana para o uso na criação de proteínas de ligação ao antígeno multiespecíficas.

[00012] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos para domínios variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana amadurecida por afinidade adequados derivados de um repertório de segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana não rearranjados, em que domínios variáveis de cadeia pesada humana amadurecidos por afinidade associados e expressos com um domínio variável da cadeia leve humana único derivado de um segmento gênico de região variável da cadeia leve humana. Camundongos geneticamente engendrados que apresentam uma escolha de dois segmentos gênicos de região variável da cadeia leve humana também são fornecidos.

[00013] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos para expressar um repertório limitado de domínios variáveis da cadeia leve humana, ou domínio variável da cadeia leve humana único, de um repertório limitado de segmentos do gene de região variável da cadeia leve humana. Os camundongos são geneticamente engendrados para incluir um segmento gênico de região variável da cadeia leve humana não rearranjado único (ou dois segmentos gênicos de região variável da cadeia leve humana) que rearranja para formar um gene de região variável da cadeia leve humana rearranjado (ou dois genes de região variável da cadeia leve rearranjados) que expressam uma cadeia leve única (ou que expressam uma ou ambas de duas cadeias leves). Os domínios variáveis da cadeia leve humana rearranjados são capazes de pareamento com uma pluralidade de cadeias pesadas humanas amadurecidas por afinidade selecionadas pelos camundongos, em que as regiões variáveis da cadeia pesada especificamente se ligam a epítopos diferentes.

[00014] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido para que compreenda um segmento gênico de região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana única (VL) que é capaz de rearranjo e codificação de um domínio VL humano de uma cadeia leve de imunoglobulina. Em outro aspecto, o camundongo compreende não mais do que dois segmentos gênicos VL humanos que são capazes de rearranjo e codificação de um domínio VL humano de uma cadeia leve de imunoglobulina.

[00015] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido para que compreenda um segmento de região variável (VL) único rearranjado (V/J) da cadeia leve de imunoglobulina humana (isto é, um segmento V/J) que codifica um domínio VL humano de uma cadeia leve de imunoglobulina. Em outro aspecto, o camundongo compreende não mais do que dois segmentos gênicos VL humanos rearranjados que são capazes de codificar um domínio VL humano de uma cadeia leve de imunoglobulina.

[00016] Em uma modalidade, o segmento gênico VL é um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um segmento gênico VK3- 20JK1 humano. Em uma modalidade, o camundongo tem tanto um segmento gênico VK1-39JK5 humano como um segmento gênico VK3- 20JK1 humano.

[00017] Em uma modalidade, o segmento gênico VL humano é operacionalmente ligado a uma sequência líder humana ou de camundongo. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência líder de camundongo é uma sequência líder de camundongo VK3-7.

[00018] Em uma modalidade, o segmento gênico VL é operacionalmente ligado a uma sequência de promotor de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de promotor é uma sequência de promotor humana. Em uma modalidade específica, o promotor de imunoglobulina humana é um promotor VK3-15.

[00019] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado compreende um locus VL que não compreende um segmento gênico de VL de camundongo endógeno que é capaz de rearranjo para formar um gene da cadeia leve de imunoglobulina, em que o locus VL compreende um segmento gênico VL humano único que é capaz de rearranjo para codificar uma região VL de um gene da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o segmento gênico VL humano é um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um segmento gênico VK3-20JK1 humano.

[00020] Em uma modalidade, o locus VL compreende uma sequência líder flanqueada 5’ (com respeito à direção transcricional do segmento gênico VL) com um promotor de imunoglobulina humana e flanqueada 3’ com um segmento gênico VL humano que rearranja e codifica o domínio VL de uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo uma região constante da cadeia leve (CL) de camundongo endógena. Em uma modalidade específica, o segmento gênico VL está no locus kappa (K) VL de camundongo, e CL de camundongo é uma K CL de camundongo.

[00021] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina lambda (À) não funcional. Em uma modalidade específica, o locus À compreende uma deleção de uma ou mais sequências do locus, em que uma ou mais deleções fornecem o locus À incapaz de rearranjo para formar um gene da cadeia leve. Em outra modalidade todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VL do locus À são deletados.

[00022] Em uma modalidade, o locus VL do camundongo modificado é um locus k, e o locus k compreende um potencializador intrônico K de camundongo, um potencializador 3’ K de camundongo, ou tanto um potencializador intrônico como um potencializador 3’.

[00023] Em uma modalidade, o camundongo produz uma cadeia leve que compreende um domínio VL somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VL humano. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende um domínio VL somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VL humano, e um região k CL de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo não expressa uma cadeia leve À.

[00024] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado é capaz de somaticamente hipermutar a sequência de região VL humana. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma célula que compreende um gene da cadeia leve de imunoglobulina rearranjado derivado do segmento gênico VL humano que é capaz de rearranjo e codificação de um domínio VL, e o gene da cadeia leve de imunoglobulina rearranjado compreende um domínio VL somaticamente mutado.

[00025] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula que expressa uma cadeia leve compreendendo um domínio VL humano somaticamente mutado ligado a uma k CL camundongo, em que a cadeia leve se associa com uma cadeia pesada compreendendo um domínio VH somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VH humano e em que a cadeia pesada compreende uma região constante da cadeia pesada (CH) de camundongo.

[00026] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de segmentos gênicos de VH de camundongo endógenos com um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que os segmentos gênicos VH humanos são operacionalmente ligados a um gene de região de CH de camundongo, tal que o camundongo rearranja os segmentos gênicos VH humanos e expressa uma cadeia pesada de imunoglobulina quimérica reversa que compreende um domínio VH humano e um CH de camundongo. Em uma modalidade, 90-100% dos segmentos gênicos de VH de camundongo não rearranjados são substituídos por pelo menos um segmento gênico VH humano não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos de VH de camundongo endógeno são substituídos por pelo menos um segmento gênico VH humano não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 19, pelo menos 39, ou pelo menos 80 ou 81 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 12 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, pelo menos 25 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, ou pelo menos 43 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos D e J de camundongo com pelo menos um segmento D humano não rearranjado e pelo menos um segmento J humano não rearranjado. Em uma modalidade, pelo menos um segmento D humano não rearranjado é selecionado a partir de D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27, e umacombinação dos mesmos. Em uma modalidade, pelo menos um segmento J humano não rearranjado é selecionado a partir de J1, J3, J4, J5, J6, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, um ou mais o segmento gênico VH humano é selecionado a partir de um 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, um segmento gênico 6-1 VH humano, e uma combinação dos mesmos.

[00027] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula B que expressa uma proteína de ligação que especificamente se liga a um antígeno de interesse, em que a proteína de ligação compreende uma cadeia leve derivada de um rearranjo VK1-39/JK5 humano ou um rearranjo humano VK3-20/JK1, e em que a célula compreende um gene de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjado derivado de um rearranjo de segmentos gênicos humanos selecionados a partir de um segmento gênico VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH 4-39, VH4-59 e VH5-51. Em uma modalidade, um ou maissegmentos gênicos VH humanos são rearranjados com um segmento gênico J da cadeia pesada humana selecionado a partir de J1, J3, J4, J5 e J6. Em uma modalidade, um ou mais segmentos gênicos VH e J humanos são rearranjados com um segmento gênico D humano selecionado a partir de D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13 e D7-27. Em uma modalidade específica, o gene da cadeia leve tem 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais hipermutações somáticas.

[00028] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula B que compreende uma sequência gênica de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada que compreende um segmento gênico VH, JH e DH selecionado a partir de VH 2-5 + JH1 + D6-6, VH3-23 + JH4 + D3, VH3-23 + JH4 + D3-10, VH3-30 + JH1 + D6-6, VH3-30 +JH3 + D6-6, VH3-30 + JH4 + D1-7, VH3-30 + JH4 + D5-12, VH3-30 + JH4 + D6-13, VH3-30 + JH4 + D6-6, VH3-30 + JH4 +D7-27, VH3-30 + JH5 + D3-22, VH3-30 + JH5 + D6-6, VH3-30 + JH5 +D7-27, VH4-39 + JH3 + D1-26, VH4-59 + JH3 + D3-16, VH4-59 + JH3+ D3-22, VH4-59 + JH4 + D3-16, VH5-51 + JH3 + D5-5, VH5-51 + JH5+ D6-13, e VH5-51 + JH6 + D3-16. Em uma modalidade específica, a célula B expressa uma proteína de ligação compreendendo uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana fusionada com uma região constante da cadeia pesada de camundongo, e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana fusionada com uma região constante da cadeia leve de camundongo.

[00029] Em uma modalidade, o segmento gênico VL humano é um segmento gênico VK1-39JK5 humano, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio VL derivado do segmento gênico VL humano e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo e (ii) um domínio VH humano somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VH humano selecionado a partir de um segmento gênico VH humano 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 e 6-1, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade CL é um K CL de camundongo.

[00030] Em uma modalidade, o segmento gênico VL humano é um segmento gênico VK3-20JK1 humano, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio VL derivado do segmento gênico VL humano, e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo, e (ii) um VH humano somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VH humano selecionado a partir de um segmento gênico VH humano 1-2, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 4-59 e 5-51, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade, o CL é um K CL de camundongo.

[00031] Em uma modalidade, o camundongo compreende tanto um segmento gênico VK1-39JK5 humano como um segmento gênico VK3- 20JK1 humano, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio VL derivado de um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um segmento gênico VK3-20JK1 humano, e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo, e (ii) um VH humano somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VH humano selecionado a partir de um segmento gênico VH humano 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 61, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade, o CL é um K CL de camundongo.

[00032] Em uma modalidade, 90 a 100% dos segmentos gênicos de VH de camundongo não rearranjados endógenos são substituídos por pelo menos um segmento gênico VH humano não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos de VH de camundongo não rearranjados endógenos são substituídos por pelo menos um segmento gênico VH humano não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 18, pelo menos 39, pelo menos 80 ou 81 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 12 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, pelo menos 25 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, ou pelo menos 43 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados.

[00033] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado é uma linhagem C57BL, em uma modalidade específica selecionada a partir de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ,C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola. Em uma modalidade específica, o camundongo geneticamente modificado é uma mistura de uma linhagem 129 acima mencionada e uma linhagem C57BL/6 acima mencionada. Em outra modalidade específica, o camundongo é uma mistura de linhagens 129 acima mencionada, ou mistura de linhagens BL/6 acima mencionada. Em uma modalidade específica, a linhagem 129 da mistura é uma linhagem 129S6 (129/SvEvTac).

[00034] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo quimérico reverso compreendendo uma cadeia leve que compreende um domínio K CL de camundongo e um VL humano somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um segmento gênico Vk3-20Jk1 humano, e uma cadeia pesada que compreende um domínio CH de camundongo e um VH humano somaticamente mutado derivado de um segmento gênico VH humano selecionado a partir de um segmento gênico VH humano 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, e 6-1, em que o camundongo não expressa um totalmente anticorpo de camundongo e não expressa um anticorpo totalmente humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus da cadeia leve k que compreende uma substituição de segmentos gênicos k VL de camundongo endógenos com o segmento gênico Vk1-39Jk5 humano ou o segmento gênico Vk3-20Jk1 humano, e compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos de VH de camundongo endógenos com um repertório completo ou substancialmente completo de segmentos gênicos VH humanos.

[00035] Em um aspecto, uma célula de camundongo é fornecida que é isolada de um camundongo como descrito neste pedido. Em uma modalidade, a célula é uma célula ES. Em uma modalidade, a célula é um linfócito. Em uma modalidade, o linfócito é uma célula B. Em uma modalidade, a célula B expressa uma cadeia pesada quimérica que compreende um domínio variável derivado de um segmento gênico humano; e uma cadeia leve derivada de um segmento humano rearranjado Vk1-39/J, segmento humano rearranjado Vk3-20/J, ou uma combinação dos mesmos; em que o domínio variável de cadeia pesada é fusionado a uma região constante de camundongo e o domínio variável da cadeia leve são fusionados a uma região constante de camundongo ou uma humana.

[00036] Em um aspecto, um hibridoma é fornecido, em que o hibridoma é produzido com uma célula B de um camundongo como descrito neste pedido. Em uma modalidade específica, a célula B é de um camundongo, como descrito neste pedido, que foi imunizado com um imunógeno que compreende um epítopo de interesse, e a célula B expressa uma proteína de ligação que se liga ao epítopo de interesse, a proteína de ligação tem um domínio VH humano somaticamente mutado e um CH de camundongo, e tem um domínio VL humano derivado de um VK1-39JK5 humano ou um segmento gênico VK3- 20JK1 humano e um camundongo CL.

[00037] Em um aspecto, um embrião de camundongo é fornecido, em que o embrião compreende uma célula doadora ES que é derivada de um camundongo como descrito neste pedido.

[00038] Em um aspecto, um vetor de direcionamento é fornecido, compreendendo, de 5’ a 3’ em direção transcricional com referência às sequências dos braços 5’ e 3’ de homologia de camundongo do vetor, um braço 5’ de homologia de camundongo, um promotor de imunoglobulina humana ou de camundongo, uma sequência líder humana ou de camundongo, e um segmento gênico LCVR humano selecionado a partir de um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um VK3-20JK1 humano, e um braço 3’ de homologia de camundongo. Em uma modalidade, os braços 5’ e 3’ de homologia direcionam o vetor a uma sequência 5’ com respeito a uma sequência potencializadora que é 5’ presente e proximal ao gene de região constante K de camundongo. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de segmento gênico de região variável de imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, o promotor é um promotor VK3-15 humano. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência líder de camundongo é uma sequência líder de camundongo VK3-7.

[00039] Em um aspecto, um vetor de direcionamento é fornecido como descrito acima, mas no lugar do braço de homologia 5’ de camundongo, o promotor humano ou de camundongo é flanqueado 5’ com um sítio de reconhecimento de recombinase sítio-específico (SRRS), e no lugar do braço de homologia 3’ de camundongo, o segmento gênico LCVR humano é flanqueado 3’ com um SRRS.

[00040] Em um aspecto, um anticorpo quimérico reverso produzido por um camundongo como descrito neste pedido, em que o anticorpo quimérico reverso compreende uma cadeia leve compreendendo um CL de camundongo e um VL humano, e uma cadeia pesada compreendendo um VH humano e um CH de camundongo.

[00041] Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo é fornecido, compreendendo expressão em uma célula única (a) uma primeira sequência gênica VH de um camundongo imunizado como descrito neste pedido fusionado com uma sequência gênica CH humana; (b) uma sequência gênica VL de um camundongo imunizado como descrito neste pedido fusionado com uma sequência gênica CL humana; e, (c) manutenção da célula sob condições suficientes para expressar um anticorpo totalmente humano, e isolamento do anticorpo. Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência gênica de VH de um segundo camundongo imunizado como descrito neste pedido fusionado com uma sequência gênica CH humana, a primeira sequência gênica VH codifica um domínio VH que reconhece um primeiro epítopo, e a segunda sequência gênica VH codifica um domínio VH que reconhece um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos.

[00042] Em um aspecto, um método para produção de uma proteína de ligação ao epítopo é fornecido, compreendendo exposição de um camundongo como descrito neste pedido com um imunógeno que compreende um epítopo de interesse, mantendo o camundongo sob condições suficientes para o camundongo para gerar uma molécula de imunoglobulina que especificamente se liga ao epítopo de interesse, e isolamento da molécula de imunoglobulina que especificamente se liga ao epítopo de interesse; em que a proteína de ligação ao epítopo compreende uma cadeia pesada que compreende um VH humano somaticamente mutado e um CH de camundongo, associado com uma cadeia leve que compreende um CL de camundongo e um VL humano derivado de um segmento gênico VK1- 39 JK5 humano ou um VK3-20 JK1 humano.

[00043] Em um aspecto, uma célula que expressa uma proteína de ligação ao epítopo é fornecida, em que a célula compreende: (a) uma sequência nucleotídica VL humana que codifica um domínio VL humano derivado de um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um VK3-20JK1 humano, em que a sequência nucleotídica VL humana é fusionada (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina humana (por exemplo, uma sequência de DNA de domínio constante K humana); e, (b) uma primeira sequência nucleotídica VH humana que codifica um domínio VH humano derivado de uma primeira sequência nucleotídica VH humana, em que a primeira sequência nucleotídica VH humana é fusionada (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana; em que a proteína de ligação ao epítopo reconhece um primeiro epítopo. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao epítopo liga-se ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação mais baixa que 10-6 M, mais baixa que 10-8 M, mais baixa que 10-9 M, mais baixa que 10-10 M, mais baixa que 10-11 M, ou mais baixa que 10-12 M.

[00044] Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência nucleotídica VH humana que codifica um segundo domínio VH humano, em que a segunda sequência VH humana é fusionada (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana, e em que o segundo domínio VH humano não reconhece especificamente o primeiro epítopo (por exemplo, exibe uma constante de dissociação, por exemplo, de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, ou mais alta), e em que a proteína de ligação ao epítopo reconhece o primeiro epítopo e o segundo epítopo, e em que o primeiro e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina cada uma associa-se com uma cadeia leve idêntica de (a).

[00045] Em uma modalidade, o segundo domínio VH liga-se ao segundo epítopo com uma constante de dissociação que é mais baixa que 10-6 M, mais baixa que 10-7 M, mais baixa que 10-8 M, mais baixa que 10-9 M, mais baixa que 10-10 M, mais baixa que 10-11 M, ou mais baixa que 10-12 M.

[00046] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao epítopo compreende uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, cada uma associada com uma cadeia leve idêntica derivada de um segmento gênico VL humano selecionado a partir de um segmento gênico VK1-39JK5 humano ou um VK3-20JK1 humano, em que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se a um primeiro epítopo com uma constante de dissociação na faixa de nanomolar a picomolar, a segunda cadeia pesada de imunoglobulina se liga a um segundo epítopo com uma constante de dissociação na faixa de nanomolar a picomolar, o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos, a primeira cadeia pesada de imunoglobulina não se liga ao segundo epítopo ou liga-se ao segundo epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa de micromolar (por exemplo, faixa de milimolar), a segunda cadeia pesada de imunoglobulina não se liga ao primeiro epítopo ou liga-se ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa de micromolar (por exemplo, faixa de milimolar), e um ou mais de VL, de VH da primeira cadeia pesada de imunoglobulina, e de VH da segunda cadeia pesada de imunoglobulina, são somaticamente mutados.

[00047] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada da imunoglobulina compreende um resíduo de ligação à proteína A, e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina sem o resíduo de ligação à proteína A.

[00048] Em uma modalidade, a célula é selecionada a partir de uma célula CHO, COS, 293, HeLa, e retiniana que expressa uma sequência de ácidos nucleicos virais (por exemplo, uma célula PERC.6™).

[00049] Em um aspecto, um anticorpo quimérico reverso é fornecido, compreendendo um domínio constante da cadeia pesada de VH humano e um de camundongo, um domínio constante da cadeia leve de VL humano e um de camundongo, em que o anticorpo é produzido por um processo compreendendo imunização de um camundongo como descrito neste pedido com um imunógeno compreendendo um epítopo, e o anticorpo especificamente liga-se ao epítopo do imunógeno com o qual o camundongo foi imunizado. Em uma modalidade, o domínio VL é somaticamente mutado. Em uma modalidade, o domínio VH é somaticamente mutado. Em umamodalidade, tanto o domínio VL como o domínio VH sãosomaticamente mutados. Em uma modalidade, o VL é ligado a um domínio constante K de camundongo.

[00050] Em um aspecto, um camundongo é fornecido, compreendendo segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana que substituem todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada de camundongo no locus de camundongo endógeno; não mais do que um ou dois segmentos gênicos variáveis da cadeia leve humana selecionados a partir de um segmento VK1-39/J rearranjado e um VK3-20/J rearranjado ou uma combinação dos mesmos, substituindo todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia leve de camundongo; em que os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana são ligados a um gene constante de camundongo, e o segmento(s) gênico de variável da cadeia leve humana é ligado a um gene constante humano ou de camundongo.

[00051] Em um aspecto, uma célula ES de camundongo compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada de camundongo com segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana, e não mais do que um ou dois segmentos V/J da cadeia leve humana rearranjados, em que os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana são ligados a um gene constante da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, e os segmentos V/J da cadeia leve humana são ligados a um gene constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo ou humana. Em uma modalidade específica, o gene constante da cadeia leve é um gene constante de camundongo.

[00052] Em um aspecto, uma proteína de ligação ao antígeno feita por um camundongo como descrito neste pedido é fornecida. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana fusionada com uma região constante de camundongo, e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana derivada de um segmento gênico VK1-39 ou um segmento gênico VK3-20, em que a região constante da cadeia leve é uma região constante de camundongo.

[00053] Em um aspecto, uma proteína de ligação ao antígeno totalmente humana feita de uma sequência gênica de uma região variável de imunoglobulina de camundongo como descrito neste pedido é fornecida, em que a proteína de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada totalmente humana que compreende uma região variável humana derivada de uma sequência de um camundongo como descrito neste pedido, e uma cadeia leve totalmente humana que compreende uma região variável VK1-39 ou uma VK3-20. Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma a cinco mutações somáticas. Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve é uma região variável da cadeia leve cognata que é pareada em uma célula B de camundongo com a região variável da cadeia pesada.

[00054] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno totalmente humana compreende uma primeira cadeia pesada e uma segunda cadeia pesada, em que a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada compreendem regiões variáveis não idênticas independentemente derivadas de um camundongo como descrito neste pedido, e em que cada uma das primeiras e segundas cadeias pesadas expressam de uma célula hospedeira associada com uma cadeia leve humana derivada de um segmento gênico VK1-39 ou um segmento gênico VK3-20. Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada compreende uma primeira região variável da cadeia pesada que especificamente se liga a um primeiro epítopo de um primeiro antígeno, e a segunda cadeia pesada compreende uma segunda região variável da cadeia pesada que especificamente se liga a um segundo epítopo de um segundo antígeno. Em uma modalidade específica, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são diferentes. Em uma modalidade específica, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são os mesmos, e o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos; em uma modalidade específica, a ligação do primeiro epítopo por uma primeira molécula da proteína de ligação não bloqueia a ligação do segundo epítopo por uma segunda molécula da proteína de ligação.

[00055] Em um aspecto, uma proteína de ligação totalmente humana derivada de uma sequência de imunoglobulina humana de um camundongo como descrito neste pedido compreende uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, em que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma primeira região variável que não é idêntica a uma região variável da segunda cadeia pesada de imunoglobulina, e em que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende um determinante de ligação à proteína A selvagem, e a segunda cadeia pesada sem um determinante de ligação à proteína A selvagem. Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se a proteína A sob condições de isolamento, e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina não se liga à proteína A ou liga-se à proteína A pelo menos de 10 vezes, cem vezes, ou mil vezes mais fraca do que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se à proteína A sob condições de isolamento. Em uma modalidade específica, as primeiras e segundas cadeias pesadas são isotipos IgG1, em que a segunda cadeia pesada compreende uma modificação selecionada a partir de 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), e uma combinação dos mesmos, e em que a primeira cadeia pesada não necessita de tal modificação.

[00056] Em um aspecto, um método para produção de umaproteína de ligação ao antígeno biespecífica é fornecido, compreendendo exposição de um primeiro camundongo como descrito neste pedido a um primeiro antígeno de interesse que compreende um primeiro epítopo, exposição de um segundo camundongo como descrito neste pedido a um segundo antígeno de interesse que compreende um segundo epítopo, permitindo o primeiro e o segundo camundongo cada um montar respostas imunes aos antígenos de interesse, identificação no primeiro camundongo de uma primeira região variável da cadeia pesada humana que se liga ao primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, identificação no segundo camundongo de uma segunda região variável da cadeia pesada humana que se liga ao segundo epítopo do segundo antígeno de interesse, produção de um primeiro gene de cadeia pesada totalmente humano que codifica uma primeira cadeia pesada que se liga ao primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, produção de um segundo gene de cadeia pesada totalmente humano que codifica uma segunda cadeia pesada que se liga o segundo epítopo do segundo antígeno de interesse, expressar a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada em uma célula que expressa uma cadeia leve totalmente humana única derivada de um segmento gênico VK1-39 humano ou um VK3-20 humano para formar uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica, e isolamento da proteína de ligação ao antígeno biespecífica.

[00057] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundoantígeno não são idênticos.

[00058] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundoantígeno são idênticos, e o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos. Em uma modalidade, a ligação da primeira região variável da cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a ligação da segunda região variável da cadeia pesada ao segundo epítopo.

[00059] Em uma modalidade, o primeiro antígeno é selecionado a partir de um antígeno solúvel e um antígeno de superfície celular (por exemplo, um antígeno tumoral), e o segundo antígeno compreende um receptor de superfície celular. Em uma modalidade específica, o receptor de superfície celular é um receptor de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o receptor de imunoglobulina é um receptor Fc. Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo receptor de superfície celular, e a ligação da primeira cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a ligação da segunda cadeia pesada ao segundo epítopo.

[00060] Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia leve da cadeia leve compreende 2 a 5 mutações somáticas. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia leve é uma cadeia leve cognata somaticamente mutada expressa em uma célula B do primeiro ou segundo camundongo imunizado com o primeiro ou com o segundo domínio variável de cadeia pesada.

[00061] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada totalmente humana carrega uma modificação de aminoácido que reduz sua afinidade à proteína A, e a segunda cadeia pesada totalmente humana não compreende uma modificação que reduz sua afinidade à proteína A.

[00062] Em um aspecto, um anticorpo ou um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio variável de cadeia pesada humana produzido conforme a invenção é fornecido. Em outro aspecto, o uso de um camundongo como descrito neste pedido para produção de um anticorpo totalmente humano ou um anticorpo biespecífico totalmente humano é fornecido.

[00063] Qualquer uma das modalidades e aspectos descritos neste pedido pode ser usada em conjunto com outra, a menos que de outra maneira indicado ou evidente do contexto. Outras modalidades ficarão evidentes para os versados na técnica a partir de uma revisão da seguinte descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00064] Esta invenção não é limitada a métodos particulares, e condições experimentais descritas, como tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste pedido é com o objetivo de descrever modalidades particulares somente, e não é destinada a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.

[00065] A menos que definido de outra maneira, todos os termos e frases usadas neste pedido incluem os significados que os termos e as frases alcançaram na técnica, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidente do contexto no qual o termo ou a frase são usados. Embora qualquer método e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste pedido possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais particulares são descritos agora. Todas as publicações mencionadas são por meio deste incorporadas por referência.

[00066] O termo "anticorpo", como usado neste pedido, inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, regiões de determinação de complementaridade denominadas (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominou regiões conservadas (FR). Cada VH e VL compreendem três CDRs e quatro FRs, arranjadas do amino-terminal ao carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (as CDRs da cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; as CDRs da cadeia leve podem ser abreviadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3). O termo anticorpo de "alta afinidade" refere-se a um anticorpo que tem uma KD com respeito ao seu epítopo alvo aproximadamente de 10-9 M ou mais baixo (por exemplo,aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M ouaproximadamente 1 x 10-12 M). Em uma modalidade, KD é medida pela ressonância de plásmons de superfície, por exemplo, BIACORE™; em outra modalidade, KD é medido por ELISA.

[00067] A frase "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de seletivamente ligar-se a dois ou mais epítopos. Anticorpos biespecíficos geralmente compreendem duas cadeias pesadas não idênticas, com cada cadeia pesada que especificamente se liga a um epítopo diferente - um em duas moléculas diferentes (por exemplo, epítopos diferentes em dois imunógenos diferentes) ou na mesma molécula (por exemplo, epítopos diferentes no mesmo imunógeno). Se um anticorpo biespecífico for capaz de seletivamente ligar-se a dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada do primeiro epítopo será geralmente pelo menos uma a duas ou três ou quatro ou mais ordens de magnitude mais baixa do que a afinidade da primeira cadeia pesada do segundo epítopo, e vice-versa. Os epítopos especificamente ligados ao anticorpo biespecífico podem estar no mesmo alvo ou um diferente (por exemplo, na mesma proteína ou uma diferente). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos, por exemplo, combinando cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências variáveis da cadeia pesada que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno podem ser fusionadas a sequências de ácidos nucleicos que codificam a mesma cadeia pesada ou diferentes regiões constantes, e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas cada uma tendo três CDRs da cadeia pesada, seguidas (N- terminal ao C-terminal) por um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3, e uma cadeia leve de imunoglobulina que não confere especificidade de ligação ao epítopo mas que pode associar-se com cada cadeia pesada, ou que pode associar-se com cada cadeia pesada e que pode ligar-se um ou mais epítopos ligados pelas regiões de ligação ao epítopo da cadeia pesada, ou que pode associar-se com cada cadeia pesada e capaz de ligar-se a um ou ambas as cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos.

[00068] O termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para expressão de uma sequência de ácidos nucleicos recombinante. As células incluem aqueles de procariotos e eucariotos (célula única ou célula múltipla), células bacterianas (por exemplo, linhagens de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactéria, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, células SF-9, SF-21, de inseto infectadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.). Células animais não humanas, células humanas, ou fusões celulares tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, célula é uma célula de ser humano, macaco, grande macaco, hamster, rato ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionada a partir das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS 7), célula retiniana, Vero, CV1, renal (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmico), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, e uma linhagem celular derivada de uma célula acima mencionada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retiniana que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™).

[00069] A frase "região de determinação de complementaridade" ou termo "CDR", inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos de genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal selvagem) aparece entre duas regiões conservadas em uma região variável de uma cadeia leve ou uma pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por um naive ou uma célula B madura ou uma célula T. Uma CDR pode ser somaticamente mutada (por exemplo, variar de uma sequência codificada na linhagem germinativa de um animal), humanizada, e/ou modificada com substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácidos nucleicos não rearranjada) mas são contíguas em uma sequência de ácidos nucleicos de célula B, por exemplo, como o resultado de splicing ou união das sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma cadeia pesada CDR3).

[00070] O termo "conservador", quando usado para descrever uma substituição de aminoácido conservativa, inclui a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido que tem um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não modificará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de uma região variável de ligar-se especificamente a um epítopo alvo com uma afinidade desejada. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem cadeias laterais alifáticas, tais como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadeias laterais alifáticas e hidroxilas, tais como serina e treonina; cadeias laterais contendo amida, tais como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas, tais como fenilalanina, tirosina e triptofano; cadeias laterais básicas, tais como lisina, arginina, e histidina; cadeias laterais acídicas, tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; e, cadeias laterais contendo enxofre, tais como cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativos incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato e asparagina/glutamina. Em algumas modalidades, uma substituição de aminoácido conservativa pode ser substituição de qualquer resíduo nativo em uma proteína por alanina, como usado, por exemplo, em mutagênese de varredura de alanina. Em algumas modalidades, uma substituição conservativa é feita a que tem um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, por meio deste incorporado por referência. Em algumas modalidades, a substituição é uma substituição moderadamente conservativa em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.

[00071] Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina diferenciam-se por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve de imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma (por exemplo, um fragmento que permite expressão e secreção, por exemplo, de uma célula B) não são idênticas a uma cadeia leve cuja sequência de aminoácidos é listada neste pedido, mas se diferencia por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas.

[00072] A frase "proteína de ligação ao epítopo" inclui uma proteína tendo pelo menos uma CDR e é capaz de seletivamente reconhecer que um epítopo, por exemplo, é capaz de ligar-se a um epítopo com um KD que está em aproximadamente um micromolar ou mais baixo (por exemplo, um KD que é aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, ou aproximadamente 1 x 10-12 M). As proteínas de ligação ao epítopo terapêuticas (porexemplo, anticorpos terapêuticos) frequentemente requerem uma KD que está na faixa nanomolar ou picomolar.

[00073] A frase "fragmento funcional" inclui fragmentos de proteínas de ligação ao epítopo que podem ser expressos, secretados, e especificamente ligam-se a um epítopo com um KD na faixa micromolar, nanomolar ou picomolar. O reconhecimento específico inclui ter um KD que está pelo menos na faixa micromolar, faixa nanomolar ou faixa picomolar.

[00074] O termo "linhagem germinativa" inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos de imunoglobulina em uma célula não somaticamente mutada, por exemplo, uma célula B não somaticamente mutada ou célula pré-B ou célula hematopoiética.

[00075] A frase "cadeia pesada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo. Os domínios variáveis da cadeia pesada incluem três CDRs da cadeia pesada e quatro regiões FRs, a menos que de outra maneira especificado. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações das mesmas. Uma cadeia pesada típica tem, após domínio variável (do N-terminal ao C-terminal), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de especificamente reconhecer um epítopo (por exemplo, reconhecendo o epítopo com um KD na faixa micromolar, nanomolar ou picomolar), que é capaz de expressão e secreção de uma célula, e que compreende pelo menos uma CDR.

[00076] O termo "identidade" quando usado com relação à sequência, inclui a identidade como determinado por diversos algoritmos diferentes conhecidos na técnica que pode ser usada para medir a identidade de sequência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos. Em algumas modalidades descritas neste pedido, a identidade é determinada usando um alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) que emprega uma penalidade de lacuna aberta de 10,0, uma penalidade de lacuna de extensão de 0,1, e usa uma matriz de similaridade Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc, 2008). O comprimento das sequências comparadas com respeito à identidade de sequências dependerá das sequências particulares, mas em caso de um domínio constante da cadeia leve, o comprimento deve conter a sequência de comprimento suficiente para dobrar em um domínio constante da cadeia leve que é capaz de autoassociação para formar um domínio constante canônico da cadeia leve, por exemplo, capaz de formar duas folhas beta compreendendo fitas beta e capaz de interação com pelo menos um domínio CH1 de um ser humano ou um camundongo. Em caso de um domínio CH1, o comprimento da sequência deve conter a sequência de comprimento suficiente para dobrar-se em um domínio CH1 que é capaz de formar duas folhas beta compreendendo fitas beta e capaz de interação com pelo menos um domínio constante da cadeia leve de um camundongo ou um ser humano.

[00077] A frase "molécula de imunoglobulina" inclui duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina. As cadeias pesadas podem ser idênticas ou diferentes, e as cadeias leves podem ser idênticas ou diferentes.

[00078] A frase "cadeia leve" inclui uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que de outra maneira especificado inclui cadeias leves K e À humanas e um VpreB, bem como cadeias leves substitutas. Domínios variáveis da cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs da cadeia leve e quatro regiões conservadas (FR), a menos que de outra maneira especificado. Geralmente, uma cadeia leve inteira inclui, do terminal amino ao terminal carboxila, um domínio VL que inclui FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, e um domínio constante da cadeia leve. As cadeias leves incluem aquelas, por exemplo, que não se ligam seletivamente a um primeiro ou um segundo epítopo seletivamente ligado pela proteína de ligação ao epítopo na qual aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que se ligam e reconhecem, ou assistem a cadeia pesada com ligação e reconhecimento, de um ou mais epítopos seletivamente ligados pela proteína de ligação ao epítopo na qual aparecem. As cadeias leves comuns são as derivadas de um segmento gênico Vk1-39Jk5 humano ou um segmento gênico Vk3-20Jk1 humano, e incluem versões somaticamente mutadas (por exemplo, amadurecida por afinidade) do mesmo.

[00079] A frase "faixa micromolar" é destinada a significar 1-999 micromolar; a frase "faixa nanomolar" é destinada a significar 1-999 nanomolar; a frase "faixa picomolar" é destinada a significar 1-999 picomolar.

[00080] A frase "somaticamente mutada" inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos de uma célula B que sofreu troca de classe, em que a sequência de ácidos nucleicos de uma região variável de imunoglobulina (por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada ou incluindo uma CDR da cadeia pesada ou sequência de FR) na célula B trocada de classe não é idêntica à sequência de ácidos nucleicos na célula B antes da troca de classe, tal como, por exemplo, uma diferença em uma CDR ou sequência de ácidos nucleicos de região conservada entre uma célula B que não sofreu troca de classe e uma célula B que sofreu troca de classe." Somaticamente mutado" inclui referência a sequências de ácidos nucleicos de células B amadurecidas por afinidade que não são idênticas a sequências de região variável de imunoglobulina correspondentes em células B que não são amadurecidas por afinidade (isto é, sequências no genoma de células de linhagem germinativa). A frase "somaticamente mutada" também inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos da região variável de imunoglobulina de uma célula B após exposição da célula B a um epítopo de interesse, em que a sequência de ácidos nucleicos se diferencia da sequência de ácidos nucleicos correspondentes antes da exposição da célula B ao epítopo de interesse. A frase "somaticamente mutada" refere-se a sequências de anticorpos que foram gerados em um animal, por exemplo, um camundongo tendo sequências de ácidos nucleicos da região variável de imunoglobulina humana, em resposta a um desafio de imunógeno, e aquele resultado a partir dos processos de seleção inerentemente operacionais em tal animal.

[00081] O termo "não rearranjado", com referência a umasequência de ácidos nucleicos, inclui sequências de ácidos nucleicos que existem na linhagem germinativa de uma célula animal.

[00082] A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (modificada como desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácido, na sequência do N-terminal ao C-terminal (a menos que de outra maneira indicado): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Cadeia Leve Comum

[00083] Esforços prévios para produção de proteínas de ligação ao epítopo multiespecíficas úteis, por exemplo, anticorpos biespecíficos, foram impedidos pela variedade de problemas que frequentemente compartilham um paradigma comum: seleção in vitro ou manipulação de sequências para engendrar racionalmente, ou para engendrar por tentativa e erro, um formato adequado para parear um heterodimérico biespecífico de imunoglobulina humana. Infelizmente, a maioria se não todas as abordagens de engenharia in vitro fornecem basicamente correções ad hoc que são adequadas, se em todas, para moléculas individuais. Por outro lado, métodos in vivo para empregar organismos complexos para selecionar pareamentos apropriados que são capazes de levar a produtos terapêuticos humanos não foram realizados.

[00084] Geralmente, sequências de camundongo nativas frequentemente não são uma boa fonte para sequências terapêuticas humanas. Por pelo menos esta razão, geração de regiões variáveis de imunoglobulina da cadeia pesada de camundongo que pareiam com uma cadeia leve humana comum é de utilidade prática limitada. Mais esforços de engenharia in vitro seriam expendidos em um processo de tentativa e erro para tentar humanizar sequências variáveis da cadeia pesada de camundongo esperando conservar especificidade de epítopo e afinidade mantendo a capacidade de ligação com a cadeia leve humana comum, com o resultado incerto. No fim de tal processo, o produto final pode manter alguma especificidade e afinidade, e associar-se com a cadeia leve comum, mas enfim, a imunogenicidade em um ser humano permaneceria provavelmente um risco profundo.

[00085] Por isso, um camundongo adequado para produção de produtos terapêuticos humanos incluiria um repertório apropriadamente grande de segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana no lugar dos segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada de camundongo endógeno. Os segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana devem ser capazes de rearranjar e recombinar com um domínio constante da cadeia pesada de camundongo endógeno para formar uma cadeia pesada quimérica reversa (isto é, uma cadeia pesada compreendendo um domínio variável humano e uma região constante de camundongo). A cadeia pesada deve ser capaz de troca de classe e hipermutação somática para que um repertório apropriadamente grande de domínios variáveis da cadeia pesada esteja disponível para o camundongo para selecionar aquele que pode associar-se com o repertório limitado de regiões variáveis da cadeia leve humana.

[00086] Um camundongo que seleciona uma cadeia leve comum de uma pluralidade de cadeias pesadas tem uma utilidade prática. Em várias modalidades, anticorpos que expressam em um camundongo que somente pode expressar uma cadeia leve comum terão cadeias pesadas que podem associar e expressar com uma cadeia leve idêntica ou substancialmente idêntica. Isto é particularmente útil na criação de anticorpos biespecíficos. Por exemplo, tal camundongo pode ser imunizado com um primeiro imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente se liga a um primeiro epítopo. O camundongo (ou um camundongo geneticamente igual) pode ser imunizado com um segundo imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente se liga ao segundo epítopo. As regiões pesadas variáveis podem ser clonadas das células B e expressas com a mesma região constante da cadeia pesada, e a mesma cadeia leve, e expressas em uma célula para produzir um anticorpo biespecífico, em que o componente da cadeia leve do anticorpo biespecífico foi selecionado por um camundongo para associar e expressar com o componente da cadeia leve.

[00087] Os inventores engendraram um camundongo para gerar cadeias leves de imunoglobulina que se juntarão apropriadamente com uma família bastante diversa de cadeias pesadas, incluindo cadeias pesadas cujas regiões variáveis partem de sequências de linhagem germinativa, por exemplo, amadurecida por afinidade ou regiões variáveis somaticamente mutadas. Em várias modalidades, o camundongo é inventado para parear domínios variáveis da cadeia leve humana com domínios variáveis da cadeia pesada humana que compreendem mutações somáticas, dessa forma permitindo uma via para proteínas de ligação de alta afinidade adequadas para o uso como produtos terapêuticos humanos.

[00088] O camundongo geneticamente engendrado, através do processo longo e complexo de seleção de anticorpo dentro de um organismo, faz escolhas biologicamente apropriadas no pareamento de uma coleta diversa de domínios variáveis da cadeia pesada humana com um número limitado de opções da cadeia leve humana. A fim de alcançar isto, o camundongo é engendrado para apresentar um número limitado de opções de domínio variável da cadeia leve humana em conjunto com uma ampla diversidade de opções de domínio variável da cadeia pesada humana. No desafio com um imunógeno, o camundongo maximiza o número de soluções em seu repertório para desenvolver um anticorpo para o imunógeno, limitado em grande parte ou somente pelo número ou opções da cadeia leve no seu repertório. Em várias modalidades, que incluem permitir o camundongo alcançar mutações somáticas adequadas e compatíveis do domínio variável da cadeia leve que será todavia compatível com uma variedade relativamente grande de domínios variáveis da cadeia pesada humana, incluindo em particular domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutados.

[00089] Para alcançar um repertório limitado de opções da cadeia leve, o camundongo é engendrado para tornar não funcional ou substancialmente não funcional sua capacidade de fazer, ou rearranjar, um domínio variável da cadeia leve de camundongo nativo. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela deleção dos segmentos gênicos de região variável da cadeia leve do camundongo. O locus de camundongo endógeno então pode ser modificado por um segmento gênico de região variável da cadeia leve humana adequado exógeno de escolha, operacionalmente ligado ao domínio constante da cadeia leve de camundongo endógeno, de uma maneira tal que os segmentos gênicos de região variável humana exógenos possam rearranjar e recombinar com a cadeia leve do gene da região constante de camundongo endógeno e formar um gene da cadeia leve quimérica reverso rearranjado (variável humana, constante de camundongo). Em várias modalidades, a região variável da cadeia leve é capaz de ser somaticamente mutada. Em várias modalidades, para maximizar a capacidade da região variável da cadeia leve de adquirir mutações somáticas, o potencializador(es) apropriado é conservado no camundongo. Por exemplo, na modificação de um locus K de camundongo para substituir os segmentos gênicos K de camundongo endógeno de região variáveis por segmentos gênicos de região variável k humana, o potencializador intrônico k de camundongo e potencializador k de camundongo 3’ são funcionalmente mantidos, ou não interrompidos.

[00090] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido que expressa um repertório limitado de cadeias leves reversas quiméricas (variável humana, constante de camundongo) associadas com uma diversidade de cadeias pesadas reversas quiméricas (variável humana, constante de camundongo). Em várias modalidades, segmentos gênicos de região variável da cadeia leve K de camundongo endógenos são deletados e substituídos por segmentos gênicos de região variável da cadeia leve humana única (ou duas), operacionalmente ligados ao gene de região constante de camundongo endógeno. Em modalidades para maximizar hipermutação somática dos segmentos gênicos de região variável da cadeia leve humana, o potencializador intrônico k de camundongo e o potencializador k de camundongo 3’ são mantidos. Em várias modalidades, o camundongo também compreende um locus da cadeia leve À não funcional, ou deleção desta ou uma deleção que torna o locus incapaz de produzir uma cadeia leve À.

[00091] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido que, em várias modalidades, compreende um locus de região variável da cadeia leve que não tem um segmento gênico variável da cadeia leve de camundongo endógeno e compreende um segmento gênico variável humano, em uma modalidade, uma sequência V/J humana rearranjada, operacionalmente ligada a uma região constante de camundongo, em que o locus é capaz de sofrer hipermutação somática, e em que o locus expressa uma cadeia leve compreendendo a sequência V/J humana ligada a uma região constante de camundongo. Dessa forma, em várias modalidades, o locus compreende um potencializador k de camundongo 3’, que é correlacionado com um nível de hipermutação somática normal ou selvagem.

[00092] O camundongo geneticamente engendrado em várias modalidades quando imunizado com um antígeno de interesse gera células B que exibem uma diversidade de rearranjos das regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humana que expressam e funcionam com um ou com duas cadeias leves rearranjadas, incluindo modalidades onde uma ou duas cadeias leves compreendem regiões variáveis da cadeia leve humana que compreendem, por exemplo, 1 a 5 mutações somáticas. Em várias modalidades, ascadeias leves humanas assim expressas são capazes de associação e expressão com qualquer imunoglobulina humana da região variável da cadeia pesada expressa no camundongo.Proteínas de Ligação ao Epítopo que Se Ligam a Mais de Um Epítopo

[00093] As composições e métodos dos descritos neste pedido podem ser usados para produção de proteínas de ligação que se ligam a mais de um epítopo com alta afinidade, por exemplo, anticorpos biespecíficos. As vantagens da invenção incluem a capacidade de selecionar ligação da cadeia pesada apropriadamente alta (por exemplo, amadurecido por afinidade) de cadeias de imunoglobulina de cada uma das quais se associará com uma cadeia leve única.

[00094] A síntese e a expressão de proteínas de ligação biespecíficas foram problemáticas, em parte devido a questões associadas com a identificação de uma cadeia leve adequada que pode se associar e expressar com duas cadeias pesadas diferentes, e em parte devido a questões de isolamento. Os métodos e composições descritas neste pedido permitem um camundongo geneticamente modificado selecionar, por processos naturais de outra maneira, uma cadeia leve adequada que pode se associar e expressar com mais de uma cadeia pesada, incluindo cadeias pesadas que são somaticamente mutadas (por exemplo, amadurecida por afinidade). Sequências humanas VL e VH de células B adequadas de camundongos imunizados como descrito neste pedido que anticorpos expressos amadurecidos por afinidade tendo cadeias pesadas quiméricas reversas (isto é, variáveis humana e constantes de camundongo) podem ser identificadas e clonadas na estrutura em um vetor de expressão com uma sequência gênica de região constante humana adequada (por exemplo, uma IgG1 humana). Tais dois construtos podem ser preparados, em que cada construto codifica um domínio variável de cadeia pesada humana que se liga a um epítopo diferente. Um dos VLs humanos (por exemplo, VK1-39JK5 humano ou VK3-20JK1 humano), na sequência de linhagem germinativa ou de uma célula B em que a sequência foi somaticamente mutada, pode ser fusionado na estrutura a um gene de região constante humana adequado (por exemplo, um gene constante K humano). Estes três construtos pesados e leves totalmente humanos podem ser colocados em uma célula adequada da expressão. A célula expressará duas espécies principais: uma cadeia pesada homodimérica com a cadeia leve idêntica, e uma cadeia pesada heterodimérica com a cadeia leve idêntica. Para permitir uma separação fácil destas espécies principais, uma das cadeias pesadas é modificada para omitir um determinante de ligação à proteína A, resultando em uma afinidade diferencial de uma proteína de ligação homodimérica de uma proteína de ligação heterodimérica. As composições e métodos que dirigem esta questão são descritos em USSN 12/832.838, depositado em 25 de junho de 2010, intitulado "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format" publicado como US 2010/0331527A1, por meio deste incorporado por referência.

[00095] Em um aspecto, uma proteína de ligação ao epítopo como descrito neste pedido é fornecida, em que sequências humanas VL e VH são derivadas de camundongos descritos neste pedido que foram imunizados com um antígeno compreendendo um epítopo de interesse.

[00096] Em uma modalidade, uma proteína de ligação ao epítopo é fornecida compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, a primeira compreendendo polipeptídeo, do N-terminal ao C-terminal, de uma primeira região de ligação ao epítopo que seletivamente se liga a um primeiro epítopo, seguido por uma região constante que compreende uma primeira região CH3 de uma IgG humana selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG4, e uma combinação das mesmas; e, uma segunda compreendendo polipeptídeo, do N-terminal ao C-terminal, uma segunda região de ligação ao epítopo que seletivamente se liga a um segundo epítopo, seguido por uma região constante que compreende uma segunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG4, e uma combinação das mesmas, em que a segunda região CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segundo domínio CH3 à proteína A.

[00097] Em uma modalidade, a segunda região CH3 compreende uma modificação de H95R (pela numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). Em outra modalidade, a segunda região CH3compreende ainda uma modificação de Y96F (IMGT; Y436F pela EU).

[00098] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG1humana modificada, e compreende ainda uma modificaçãoselecionada a partir do grupo consistindo de D16E, L18M, N44S,K52N, V57M, e V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I pela EU).

[00099] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG2humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo de N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I pela EU).

[000100] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG4 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo de Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I pela EU).

[000101] Um método para produção de uma proteína de ligação ao epítopo que se liga a mais de um epítopo é imunizar um primeiro camundongo conforme a invenção com um antígeno que compreende um primeiro epítopo de interesse, em que o camundongo compreende um locus de região variável da cadeia leve de imunoglobulina endógeno que não contém um VL de camundongo endógeno que é capaz de rearranjo e formação de uma cadeia leve, em que na região variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena o locus é um segmento gênico VL humano único operacionalmente ligado ao gene de região constante da cadeia leve de camundongo endógeno, e o segmento gênico VL humano é selecionado a partir de um VK1-39JK5 humano e um VK3-20JK1 humano, e os segmentos gênicos de VH de camundongo endógenos foram substituídos em inteiro ou em parte com segmentos gênicos VH humanos, tais que as cadeias pesadas de imunoglobulina feitas pelo camundongo são exclusiva ou substancialmente cadeias pesadas que compreendem domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo. Quando imunizado, tal camundongo produzirá um anticorpo quimérico reverso, compreendendo somente um dos dois domínios variáveis da cadeia leve humana (por exemplo, um de VK1-39JK5 humano ou VK3- 20JK1 humano). Uma vez que uma célula B é identificada que codifica um VH que se liga ao epítopo de interesse, a sequência nucleotídica de VH (e, opcionalmente, VL) pode ser recuperada (por exemplo, por PCR) e clonada em um construto de expressão na estrutura com um domínio constante de imunoglobulina humana adequado. Este processo pode ser repetido para identificar um segundo domínio de VH que se liga a um segundo epítopo, e uma segunda sequência gênica de VH pode ser recuperada e clonada em um vetor de expressão na estrutura a um segundo domínio constante de imunoglobulina adequado. Os primeiros e segundos domínios constantes de imunoglobulina podem ser o mesmo isotipo ou diferente, e um dos domínios constantes de imunoglobulina (mas não o outro) pode ser modificado como descrito neste pedido ou em US 2010/0331527A1, e a proteína de ligação ao epítopo pode ser expressa em uma célula adequada e isolada baseada na sua afinidade diferencial para a proteína A comparando com uma proteína de ligação ao epítopo homodimérica, por exemplo, como descrito em US 2010/0331527A1.

[000102] Em uma modalidade, um método para produção de uma proteína de ligação ao epítopo biespecífica é fornecido, compreendendo identificação de uma primeira sequência nucleotídica VH humana (VH1) amadurecida por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como descrito neste pedido, identificando uma segunda sequência nucleotídica VH humana (VH2) amadurecida por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como descrito neste pedido, clonando VH1 na estrutura com uma cadeia pesada humana sem uma modificação de determinante de proteína A como descrito em US 2010/0331527A1 para a forma cadeia pesada 1 (HC1), clonando VH2 na estrutura com uma cadeia pesada humana que compreende um determinante de proteína A como descrito em US 2010/0331527A1 para formar a cadeia pesada 2 (HC2), introduzindo um vetor de expressão que compreende HC1 e o mesmo vetor de expressão ou um diferente que compreende HC2 em uma célula, em que a célula também expressa uma cadeia leve de imunoglobulina humana que compreende um VK1- 39 humano/jK5 humano ou um VK3-20 humano/jKl humano fusionado a um domínio constante da cadeia leve humana, permitindo a célula expressar uma proteína de ligação ao epítopo biespecífica que compreende um domínio VH codificado por VH1 e um domínio VH codificado por VH2, e isolar a proteína de ligação ao epítopo biespecífica baseada na sua capacidade diferencial de ligar-se à proteína A comparando com uma proteína de ligação ao epítopo homodimérica monoespecífica. Em uma modalidade específica, HC1 é uma IgG1, e HC2 é uma IgG1 que compreende a modificação de H95R (IMGT; H435R pela EU) e compreende ainda a modificação de Y96F (IMGT; Y436F pela EU). Em uma modalidade, o domínio VH codificado por VH1, o domínio VH codificado por VH2, ou ambos, é somaticamente mutado.Genes VH Humanos Que Expressam com um VL Humano Comum

[000103] Uma variedade de regiões variáveis humanas de anticorpos amadurecidos por afinidade originados contra quatro antígenos diferentes foi expressa com sua cadeia leve cognata, ou com pelo menos uma de uma cadeia leve humana selecionada a partir de VK1- 39JK5 humano, VK3-20JK1 humano, ou VpreBJÀ5 humano (ver o Exemplo 1). Para anticorpos para cada um dos antígenos, cadeias pesadas de famílias gênicas diferentes de alta afinidade somaticamente mutadas parearam com sucesso com regiões de VK1- 39JK5 e VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada e foram secretadas de células que expressam cadeias pesadas e leves. Para VK1-39JK5 e VK3-20JK1, domínios VH derivados das seguintes famílias VH humanas expressaram favoravelmente: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 459, 5-51 e 6-1. Dessa forma, um camundongo que é engendrado para expressar um repertório limitado de domínios VL humanos de um ou ambos de VK1-39JK5 e VK3-20JK1 gerará uma população diversa de domínios VH humanos somaticamente mutados de um locus VH modificado para substituir segmentos gênicos de VH de camundongo com segmentos gênicos VH humanos.

[000104] Camundongos geneticamente engendrados para expressar as cadeias pesadas reversas quiméricas (variáveis humana, constantes de camundongo) de imunoglobulina associadas com uma cadeia leve rearranjada única (por exemplo, VK1-39/J ou VK3-20/J), quando imunizados com um antígeno de interesse, geraram células B que compreenderam uma diversidade de rearranjos de segmento V humano e expressaram uma diversidade de anticorpos específicos de alta afinidade para o antígeno com propriedades diversas com respeito à sua capacidade de bloquear a ligação do antígeno ao seu ligante, e com respeito à sua capacidade de ligar-se a variantes do antígeno (ver Exemplos 5 a 10).

[000105] Dessa forma, os camundongos e métodos descritos neste pedido são úteis em criação e seleção de domínios variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana, incluindo domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutados, que resultam de uma diversidade de rearranjos, que exibem uma larga variedade de afinidades (incluindo exibição de um KD de aproximadamente um nanomolar ou menos), uma ampla variedade de especificidades (incluindo ligação a epítopos diferentes do mesmo antígeno), e que se associam e expressam com a mesma ou substancialmente a mesma região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana.

[000106] Os seguintes exemplos são fornecidos para descrever para aqueles versados ordinários na técnica como fazer e usar métodos e composições da invenção, e não são destinados a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar a exatidão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser contabilizados. A menos que indicado de outra maneira, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é indicada em Centígrados, e a pressão é atmosférica ou próxima.EXEMPLOSExemplo 1. Identificação de regiões variáveis da cadeia pesada humana que se associam com regiões variáveis da cadeia leve humana selecionadas

[000107] Um sistema de expressão in vitro foi construído para determinar se uma cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única pode ser coexpressa com cadeias pesadas humanas de anticorpos humanos específicos para o antígeno.

[000108] Métodos para geração de anticorpos humanos em camundongos geneticamente modificados são conhecidos (ver por exemplo, US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals,VELOCIMMUNE®). A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo geneticamente modificado tendo um genoma que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve humanas operacionalmente ligadas ao loci de região constante de camundongo endógeno tal que o camundongo produza um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos produzidos de um camundongo VELOCIMMUNE® é totalmente humano. Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar um anticorpo totalmente humano contendo um isotipo não IgM, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 selvagem ou modificado. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, ligação do antígeno de alta afinidade e características de especificidade ao alvo residem na região variável.

[000109] Um camundongo VELOCIMMUNE® foi imunizado com um fator de crescimento que promove angiogênese (Antígeno C) e os anticorpos humanos específicos para o antígeno foram isolados e sequenciados para uso do gene V usando técnicas padrão reconhecidas na técnica. Os anticorpos selecionados foram clonados para cadeia pesada e leve humana que regiões constantes e 69 cadeias pesadas foram selecionadas para parear com uma das três cadeias leves humanas: (1) a cadeia leve K cognata ligada a uma região constante K humana, (2) uma linhagem germinativa humana rearranjada Vk1-39Jk5 ligada a uma região constante k humana, ou (3) uma linhagem germinativa humana rearranjada Vk3-20Jk1 ligada a uma região constante k humana. Cada cadeia pesada e o par de cadeia leve foram cotransfectados em células CHO-K1 usando técnicas padrão. A presença do anticorpo no sobrenadante foi detectada por IgG anti-humana em um ensaio ELISA. O título de anticorpo (ng/ml) foi determinado para cada par de cadeia pesada/cadeia leve e os títulos com as cadeias leves de linhagem germinativa rearranjadas diferentes foram comparados com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo parental (isto é, cadeia pesada pareada com a cadeia leve cognata) e porcentagem do título nativo foram calculados (Tabela 1). VH: gene variável da cadeia pesada. ND: nenhuma expressão detectada sob condições experimentais atuais.

[000110] Em um experimento similar, camundongosVELOCIMMUNE® foram imunizados com vários antígenos diferentes e cadeias pesadas selecionadas do antígeno que os anticorpos humanos específicos foram testados para sua capacidade de parear com cadeias leves de linhagem germinativa humana rearranjadas diferentes (como descrito acima). Os antígenos usados neste experimento incluíram uma enzima envolvida na homeostase de colesterol (Antígeno A), um hormônio de soro envolvido na regulação da homeostase de glicose (Antígeno B), um fator de crescimento que promove a angiogênese (Antígeno C) e um receptor de superfície celular (Antígeno D). Anticorpos específicos para o antígeno foram isolados de camundongos de cada grupo de imunização e regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve foram clonadas e sequenciadas. Da sequência de cadeias pesadas e leves, uso do gene V foi determinado e cadeias pesadas selecionadas foram pareados com sua cadeia leve cognata ou com uma região de VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada. Cada par de cadeia pesada/leve foi cotransfectado em células CHO-K1 e a presença do anticorpo no sobrenadante foi detectada por IgG anti-humana em um ensaio ELISA. Título de anticorpo (μg/ml) foi determinado para cada pareamento de cadeia pesada/cadeia leve e os títulos com as cadeias leves de linhagem germinativa humanas rearranjadas diferentes foram comparadas com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo parental (isto é, cadeia pesada pareada com a cadeia leve cognata) e porcentagem do título nativo foi calculada. (Tabela 2). VH: gene de variável de cadeia pesada. VK: gene de variável da cadeia leve K. ND: nenhuma expressão detectada sob condições experimentais atuais.

[000111] Os resultados obtidos destes experimentos demonstram que as cadeias pesadas de alta afinidade somaticamente mutadas, de famílias gênicas diferentes, são capazes de parear com regiões VK1- 39JK5 e VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada e ser secretadas da célula como uma molécula de anticorpo normal. Como mostrado na Tabela 1, o título de anticorpo foi aumentado para aproximadamente 61% (42 de 69) de cadeias pesadas quandopareadas com a cadeia leve de VK1-39JK5 humana rearranjada e aproximadamente 29% (20 de 69) de cadeias pesadas quandopareadas com a cadeia leve de VK3-20JK1 humana rearranjada comparando com a cadeia leve cognata do anticorpo parental. Para aproximadamente 20% (14 de 69) das cadeias pesadas, ambas as cadeias leves de linhagem germinativa humana rearranjadas conferiram um aumento na expressão comparando com a cadeia leve cognata do anticorpo parental. Como mostrado na Tabela 2, a região VK1-39JK5 da linhagem germinativa humana rearranjada conferiu um aumento na expressão de várias cadeias pesadas específicas para uma faixa de classes diferentes de antígenos quando comparada com a cadeia leve cognata dos anticorpos parentais. O título de anticorpo foi aumentado por mais do que duas vezes para aproximadamente 35% (15/43) das cadeias pesadas quando comparada com a cadeia leve cognata dos anticorpos parentais. Para duas cadeias pesadas (315 e 316), o aumento foi maior do que dez vezes quando comparado com o anticorpo parental. Dentro de todas as cadeias pesadas que mostraram expressão de aumento quanto à cadeia leve cognata do anticorpo parental, família de três cadeias pesadas (VH3) são super representadas em comparação com outras famílias gênicas de região variável da cadeia pesada. Isto demonstra uma relação favorável de cadeias pesadas VH3 humanas para parear com cadeias leves de VK1- 39JK5 e VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada.Exemplo 2. Geração de um Locus da Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humano Rearranjado

[000112] Vários vetores de direcionamento da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjados foram feitos usando a tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar os clones de Cromossomo Artificial Bacteriano (BAC) genômico de camundongo 302g12 e 254m04 (Invitrogen). Usando estes dois clones de BAC, os construtos genômicos foram engendrados para conter uma região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única e inseridos em um locus da cadeia leve K endógeno que foi anteriormente modificado para deletar a variável K endógena e juntar segmentos gênicos.A. Construção de Vetores de Direcionamento da Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humana Rearranjados

[000113] Três regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjadas diferentes foram feitas usando técnicas de biologia molecular padrão reconhecidas na técnica. Os segmentos gênicos variáveis humanos usados para construir estas três regiões incluíram a sequência VK1-39JK5 humana rearranjada, uma sequência VK3-20JK1 humana rearranjada e uma sequência VpreBJÀ5 humana rearranjada.

[000114] Um segmento de DNA contendo o éxon 1 (que codifica o peptídeo líder) e o íntron 1 do gene VK3-7 de camundongo foi feito por síntese de novo de DNA (Integrated DNA Technologies). Parte da região 5’ não traduzida até um sítio de enzima de restrição BlpI de ocorrência natural foi incluída. Os éxons de genes humanos VK1-39 e VK3-20 foram amplificados por PCR de bibliotecas de BAC genômico humana. Os iniciadores de sentido direto tinham uma extensão 5’ contendo o sítio de aceptor de junção do íntron 1 do gene VK3-7 de camundongo. O iniciador de sentido reverso usado para PCR da sequência VK1-39 humana incluiu uma extensão que codifica JK5 humano, ao passo que o iniciador de sentido reverso usado para PCR da sequência VK3-20 humana incluiu uma extensão que codifica JK1 humano. A sequência VpreBJÀ5 humana foi feita por síntese de novo de DNA (Integrated DNA Technologies). Uma porção do íntron humano JK-CK incluindo o sítio doador de junção foi amplificada por PCR do plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI. O iniciador de PCR de sentido direto incluiu uma parte de codificação de extensão de uma sequência humana JK5, JK1 ou JÀ5. O iniciador de sentido reverso incluiu um sítio PI-SCEI, que foi anteriormente engendrado no íntron.

[000115] O éxon1/íntron 1 Vk3-7 de camundongo, éxons da cadeia leve variável humana, e fragmentos de íntron Jk-Ck humano foram unidos pela extensão de sobreposição por PCR, digeridos com BlpI e PI-SceI, e ligados no plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI, que continha o promotor do segmento gênico variável Vk3-15 humano. Um cassete de higromicina com lox dentro do plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI foi substituído com um cassete de higromicina com FRT flanqueado por sítios NotI e AscI. O fragmento NotI/PI-SceI deste plasmídeo foi ligado no BAC 254m04 de camundongo modificado, que continha a parte do íntron JK-CK de camundongo, o éxon CK de camundongo, e aproximadamente 75 kb da sequência genômica a jusante do locus K de camundongo que forneceu um braço 3’ de homologia da recombinação homóloga em células ES de camundongo. O fragmento NotI/AscI deste BAC então foi ligado no BAC de camundongo modificado 302g12, que continha um cassete de neomicina com FRT e aproximadamente 23 kb da sequência genômica a montante do locus k endógeno para recombinação homóloga em células ES de camundongo.B. Vetor de Direcionamento VK1-39JK5 de Linhagem Germinativa Humana Reajustado (Figura 1)

[000116] Os sítios de enzima de restrição foram introduzidos nas extremidades 5’ e 3’ de um inserto da cadeia leve engendrado para clonagem em um vetor de direcionamento: um sítio AscI na extremidade 5’ e um sítio PI-SCEI na extremidade 3’. Dentro do sítio 5’ AscI e o sítio 3’ PI-SCEI, o construto de direcionamento de 5’ a 3’ incluiu um braço 5’ de homologia contendo a sequência 5’ para o locus da cadeia leve k de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina com FRT, uma sequência genômica incluindo o promotor Vk3-15 humano, uma sequência líder do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma sequência de íntron do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma região de leitura aberta de uma região Vk1- 39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada, uma sequência genômica contendo uma porção do íntron humano Jk-Ck, e um braço 3’ de homologia contendo a sequência 3’ do segmento gênico de Jk5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 1, meio). Genes e/ou sequências a montante do locus da cadeia leve k de camundongo endógeno e a jusante da maior parte do segmento gênico 3’ JK (por exemplo, potencializador 3’ endógeno) não foram modificados pelo construto de direcionamento (ver Figura 1). A sequência do locus Vk1-39Jk5 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:1.

[000117] A inserção direcionada da região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada em DNA de BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de íntron 3’ para a sequência líder Vk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:2) e ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:3). A região de leitura aberta da região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1633-h2F (GGGCAAGTCAGAGCATTAGC A; SEQ ID NO:4) e 1633-h2R (TGCAAACTGGATGCAGCATA G; SEQ ID NO:5). O cassete de neomicina foiconfirmado com iniciadores neoF (ggtggagagg ctattcggc; SEQ ID NO:6) e neoR (gaacacggcg gcatcag; SEQ ID NO:7). DNA de BAC direcionado então foi usado para eletroporar as células ES de camundongo para células ES modificadas criadas para gerar camundongos quiméricos que expressam uma região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[000118] Os clones de células ES positivos foram confirmados por rastreamento com Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve Vk1-39Jk5 engendrada inserida no locus endógeno. Resumidamente, a sonda neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO:9) que se liga dentro da sequência de íntron 3’ para a sequência líder VK3-7 de camundongo, e sonda 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO:10) que se liga dentro da região de leitura aberta de VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada. Os clones de células ES positivos então foram usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes expressando a região da cadeia leve de VK1-39JK5 de linhagem germinativa.

[000119] Alternativamente, células ES que carregam a região da cadeia leve de VK1-39JK5 da linhagem germinativa humana rearranjada é transfectada com um construto expressando FLP a fim de remover o cassete de neomicina com FRT introduzido pelo construto de direcionamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido pela reprodução a camundongos expressando FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.C. Vetor de Direcionamento VK3-20JK1 de Linhagem Germinativa Humana Reajustada (Figura 2)

[000120] De uma maneira similar, um locus da cadeia leve engendrado que expressa uma região VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada foi feito usando um construto de direcionamento incluindo, de 5’ a 3’, um braço 5’ de homologia contendo sequência 5’ para o locus endógeno K de camundongo da cadeia leve obtido do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina com FRT, uma sequência genômica incluindo o promotor Vk3-15 humano, uma sequência líder do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma sequência de íntron do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma região de leitura aberta de uma região Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada, uma sequência genômica contendo uma porção do íntron humano JK-CK, e um braço 3’ de homologia contendo sequência 3’ do segmento gênico JK5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 2, meio). A sequência do locus Vk3-20Jk1 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:11.

[000121] A inserção direcionada da região Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada em DNA de BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de íntron 3’ para sequência líder Vk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO:2) e ULC-m1R (SEQ ID NO:3). A região de leitura aberta da região Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO:12) e 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO:13). O cassete de neomicina foi confirmado com iniciadores neoF (SEQ ID NO:6) e neoR (SEQ ID NO:7). DNA de BAC direcionado então então foi usado para eletroporar as células ES de camundongo para células ES modificadas criadas para gerar camundongos quiméricos que expressam a cadeia leve Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[000122] Os clones de células ES positivos foram confirmados por rastreamento com Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve Vk3-20Jk1 engendrada inserida no locus da cadeia leve k endógeno. Resumidamente, sonda neoP (SEQ ID NO:8) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (SEQ ID NO:9) que se liga dentro da sequência líder Vk3-7 de camundongo, e a sonda 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO:14) que se liga dentro da região de leitura aberta VK3-20JK1 humana. Os clones de células ES positivos então foram usados para implantar camundongos fêmeas. Uma ninhada de filhotes que expressam a região da cadeia leve de VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana.

[000123] Alternativamente, células ES que carregam a região da cadeia leve VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana podem ser transfectadas com um construto que expressa FLP a fim de remover o cassete de neomicina com FRT introduzido pelo direcionamento do construto. Opcionalmente, o cassete de neomicina pode ser removido por reprodução a camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.D. Vetor de Direcionamento VpreBJÀ5 de Linhagem Germinativa Humana Reajustada (Figura 3)

[000124] De uma maneira similar, um locus da cadeia leve engendrado que expressa uma região VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi feito usando um construto de direcionamento incluindo, de 5’ a 3’, um braço 5’ de homologia contendo sequência 5’ para o locus endógeno K de camundongo da cadeia leve obtido do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina com FRT, uma sequência genômica incluindo o promotor Vk3-15 humano, uma sequência líder do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma sequência de íntron do segmento gênico variável de camundongo Vk3-7, uma região de leitura aberta de uma linhagem germinativa humana rearranjada região VpreBJÀ5, uma sequência genômica contendo uma porção do íntron humano Jk-Ck, e um braço 3’ de homologia contendo sequência 3’ do segmento gênico Jk5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 3, meio). A sequência do locus VpreBJÀ5 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:15.

[000125] A inserção direcionada da região VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada em DNA de BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve de região de VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de íntron 3’ para a sequência líder VK3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO:2) e ULC-m1R (SEQ ID NO:3). A região de leitura aberta da região VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO:16) e 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO:17). O cassete de neomicina foi confirmado com iniciadores neoF (SEQ ID NO:6) e neoR (SEQ ID NO:7). DNA de BAC direcionado então foi usado para eletroporar células ES de camundongo para células ES modificadas criadas para gerar camundongos quiméricos que expressam a cadeia leve VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[000126] Os clones de células ES positivos são confirmados por rastreamento Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve VpreBJÀ5 engendrada inserida no locus da cadeia leve K endógeno. Resumidamente, sonda neoP (SEQ ID NO:8) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, sonda ULC- m1P (SEQ ID NO:9) que se liga dentro da sequência líder IgVk3-7 de camundongo, e a sonda 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:18) que se liga dentro da região de leitura aberta VpreBJÀ5 humana. Os clones de células ES positivos então são usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes que expressa uma região da cadeia leve de linhagem germinativa.

[000127] Alternativamente, as células ES que carregam a região da cadeia leve VpreBJÀ5 da linhagem germinativa humana rearranjada é transfectada com um construto que expressa FLP a fim de remover o cassete de neomicina com FRT introduzido pelo direcionamento do construto. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido por reprodução a camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.Exemplo 3. Geração de Camundongos que Expressam Uma Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humana Rearranjada Única

[000128] As células ES direcionadas descritas acima foram usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo em estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 7.294.754 e Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1):91-99. VELOCIMICE® independentemente carregando uma região da cadeia leve VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana engendrada, uma região da cadeia leve VK3-20JK1 ou uma região da cadeia leve VpreBJÀ5 são identificadas por genotipagem usando uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detecta a presença da região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única.

[000129] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto para a região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única são selecionados para caracterização da expressão da região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada.Exemplo 4. Melhoramento de Camundongos que expressam uma cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única A. IgÀ Endógeno Nocaute (KO).

[000130] Para otimizar o uso do locus da cadeia leve engendrado, os camundongos carregando uma das regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humanas rearranjadas são criados para outro camundongo contendo uma deleção no locus da cadeia leve À endógeno. Desta maneira, a progênie obtida expressará, como sua única cadeia leve, a região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada como descrito no Exemplo 2. O melhoramento é realizado por técnicas padrão reconhecidas na técnica e, alternativamente, por um criador comercial (por exemplo, The Jackson Laboratory). As linhagens de camundongo que carregam um locus da cadeia leve engendrado e uma deleção do locus da cadeia leve À endógeno são rastreadas para presença da região da cadeia leve única e ausência das cadeias leves À de camundongo endógeno.B. Locus de Cadeia Pesada Endógeno Humanizado.

[000131] Camundongos carregando um locus da cadeia leve de linhagem germinativa humana engendrado são reproduzidos com camundongos contendo uma substituição do locus gênico variável da cadeia pesada de camundongo endógeno com o locus gênico variável de cadeia pesada humana (ver US 6.596.541; camundongo VELOCIMMUNE®, Regeneron Pharmaceuticals, Inc). O camundongo VELOCIMMUNE® compreende um genoma compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada humanas operacionalmente ligadas ao loci de região constante de camundongo endógeno tal que o camundongo produza anticorpos que compreendem uma região variável da cadeia pesada humana e uma região constante da cadeia pesada de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas dos anticorpos é isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada humana. O DNA então é expresso em uma célula capaz de expressar a cadeia pesada totalmente humana do anticorpo.

[000132] Os camundongos carregando uma substituição do locus VH endógeno de camundongo com o locus VH humano e uma linhagem germinativa humana rearranjada única região de VL no locus da cadeia leve K endógeno são obtidos. Anticorpos quiméricos reversos contendo cadeias pesadas somaticamente mutadas (VH humano e CH de camundongo) com uma cadeia leve humana única (VL humano e CL de camundongo) são obtidos na imunização com um antígeno de interesse. As sequências nucleotídicas VH e VL de células B que expressam os anticorpos são identificadas e os anticorpos totalmente humanos são feitos por fusão, sequências nucleotídicas VH e VL para sequências nucleotídicas humanas CH e CL em um sistema de expressão adequado.Exemplo 5. Geração de Anticorpos de Camundongos que Expressam Cadeias Pesadas Humanas e uma Região da Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humana Reajustada

[000133] Após os camundongos de reprodução contendo a região da cadeia leve humana engendrada para várias linhagens desejadas contendo modificações e deleções de outros loci Ig endógenos (como descrito no Exemplo 4), camundongos selecionados podem ser imunizados com um antígeno de interesse.

[000134] Geralmente, um camundongo VELOCIMMUNE® contendo uma das regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humanas rearranjadas únicas é desafiado com um antígeno, e as células linfáticas (tais como células B) são recuperadas do soro dos animais. As células linfáticas são fusionadas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortais, e tais linhagens celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos que contêm variáveis da cadeia pesada humanas e cadeias leves de linhagem germinativa humanas rearranjadas que são específicas para o antígeno usado para a imunização. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e a cadeia leve é isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Devido à presença das sequências de camundongo endógenas e quaisquer elementos adicionais cis- atuantes presentes no locus endógeno, a cadeia leve única de cada anticorpo pode ser somaticamente mutada. Isto adiciona a diversidade adicional ao repertório específico para o antígeno que compreende uma cadeia leve única e sequências da cadeia pesada diversas. As sequências de anticorpo clonadas resultantes são posteriormente expressas em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos para o antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas é identificado diretamente de linfócitos específicos para o antígeno.

[000135] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito acima, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano contendo uma cadeia pesada humana somaticamente mutada e uma cadeia leve única derivada de uma região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada da invenção. As regiões constantes humanas adequadas incluem, por exemplo, IgG1 ou IgG4 selvagem ou modificada.

[000136] As coortes separadas de camundongos VELOCIMMUNE® contendo uma substituição do locus de cadeia pesada de camundongo endógeno com segmentos gênicos humanos V, D e J e uma substituição do locus endógeno K de camundongo da cadeia leve com a região da cadeia leve humana VK1-39JK5 de linhagem germinativa engendrada ou com região da cadeia leve humana Vk3-20Jk1 da linhagem germinativa engendrada (descrito acima) foram imunizadas com uma proteína de receptor de superfície celular humana (Antígeno E). O Antígeno E é administrado diretamente no coxim plantar traseiro de camundongos com seis injeções consecutivas a cada 3-4 dias. Dois a três microgramas do Antígeno E são misturados com 10 μg de oligonucleotídeo CpG (Cat # tlrl-modn - oligonucleotídeo ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) e 25 μg de Adju-Phos (adjuvante gel de fosfato de alumínio, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de injeção. Um total de seis injeções é dado antes da revocação de antígeno final, que é dada 3-5 dias antes do sacrifício. Hemorragias após a 4a e 6a injeção são coletadas e a resposta imune do anticorpo é monitorada por um imunoensaio específico para o antígeno padrão.

[000137] Quando uma resposta imune desejada é alcançada, esplenócitos são coletados e fusionados com células de mieloma de camundongo para conservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos da cadeia leve comuns de Antígeno E específicos. Usando esta técnica, vários anticorpos da cadeia leve comuns antiantígeno E específicos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da cadeia pesada humana, o mesmo domínio variável da cadeia leve humana, e domínios constantes de camundongo) são obtidos.

[000138] Alternativamente, anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E são isolados diretamente de células B positivas para o antígeno sem fusão a células de mieloma, como descrito em U.S. 2007/0280945A1, neste pedido especificamente incorporado por referência em sua totalidade. Usando este método, vários anticorpos totalmente humanos da cadeia leve comum antiantígeno E (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da cadeia pesada humana, uma cadeia leve VK1-39JK5 humana engendrada ou uma região da cadeia leve VK3-20JK1 humana engendrada, e domínios constantes humanos) foram obtidos.

[000139] As propriedades biológicas exemplares de anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E gerados conforme os métodos deste Exemplo são descritas detalhadamente nas seções apresentadas abaixo.Exemplo 6. Uso de Segmento Gênico de Cadeia Pesada em Anticorpos da Cadeia Leve Comum específicos para o Antígeno

[000140] Para analisar a estrutura de anticorpos humanos da cadeia leve comum antiantígeno E produzidos, ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de anticorpo da cadeia pesada foram clonados e sequenciados. Das sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácido preditas dos anticorpos, o uso gênico foi identificado para a região variável da cadeia pesada (HCVR) de anticorpos da cadeia leve comum selecionados obtidos de camundongos imunizados com VELOCIMMUNE® contendo a cadeia leve VK1-39JK5 humana engendrada ou região da cadeia leve VK3- 20JK1 humana engendrada. Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4, que demonstram que os camundongos de acordo com a invenção geram anticorpos da cadeia leve comum específicos para o antígeno de uma variedade de segmentos gênicos da cadeia pesada humana, devido a uma variedade de rearranjos, empregando um camundongo expressando uma cadeia leve de somente um VK1-39- humano ou uma cadeia leve VK3-20-derivada humana. Os segmentos gênicos VH humanos das famílias 2, 3, 4, e 5 rearranjadas com uma variedade de segmentos humanos de segmentos humanos DH e JH para produzir anticorpos específicos para o antígeno.

Exemplo 7. Determinação de Capacidade de Bloquear Anticorpos da Cadeia Leve Comum Específicos para o Antígeno por Ensaio Luminex™

[000141] Noventa e oito anticorpos da cadeia leve comuns humanos que reagiram contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do ligante natural de Antígeno E (Ligante Y) ao Antígeno E em um ensaio baseado em contas.

[000142] O domínio extracelular (ECD) do Antígeno E foi conjugado a dois marcadores de epítopo myc e um marcador de histidina 6X (Antígeno E-mmH) e acoplado com amina a microesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/mL em tampão MES. A mistura foi incubada durante duas horas à temperatura ambiente seguida pela desativação de conta com Tris 1M pH 8,0 seguida por lavagem em PBS com Tween-20 0,05% (v/v). As contas então foram bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 2% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de filtro de 96 poços, os sobrenadantes contendo anticorpos da cadeia leve comum Antígeno E-específicos, foram diluídos 1:15 em tampão. Um controle negativo contendo um sobrenadante falso com os mesmos componentes dos meios como para o sobrenadante de anticorpo foi preparado. As contas marcadas com Antígeno E foram adicionadas aos sobrenadantes e incubadas durante a noite a 4°C. Proteína de ligante Y biotinilado foi adicionado a uma concentração final de 0,06 nM e incubado por duas horas à temperatura ambiente. A detecção de ligante Y biotinilado ligado às contas marcadas com Antígeno E-myc- myc-6His foram determinadas com R-ficoeritrina conjugada à Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido pela medida em um fluxo analisador baseado em citometria Luminex™. Intensidade de Fluorescência Média de Fundo (MFI) de uma amostra sem Ligante Y foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[000143] Em um experimento similar, os mesmos 98 anticorpos da cadeia leve comum humanos originados contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do Antígeno E às contas marcadas com Ligante Y.

[000144] Resumidamente, o Ligante Y foi acoplado por amina a microesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/mL diluído no tampão MES. A mistura e incubado duas horas à temperatura ambiente seguido por desativação de contas com Tris 1M pH 8 então lavagem em PBS com Tween-20 0,05% (v/v). As contas então foram bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 2% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de filtro de 96 poços, sobrenadantes contendo anticorpos da cadeia leve comum Antígeno E-específicos foram diluídos 1:15 em tampão. Um controle negativo contendo um sobrenadante falso com os mesmos componentes de meios quanto ao sobrenadante de anticorpo foi preparado. Um antígeno E-mmH biotinilado foi adicionado a uma concentração final de 0,42 nM e incubado durante a noite a 4°C. As contas marcadas com Ligante Y então foram adicionadas à mistura Anticorpo/Antígeno E e incubadas por duas horas à temperatura ambiente. A detecção do antígeno E-mmH Biotinilado ligado a Ligante Y-contas foi determinada com R-ficoeritrina conjugada à Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido pela medida em um fluxo analisador baseado em citometria Luminex™. Intensidade de Fluorescência Média de Fundo (MFI) de uma amostra sem Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[000145] As tabelas 5 e 6 mostram o bloqueio de 98 por cento de anticorpos antiantígeno E da cadeia leve comum testados em ambos os ensaios Luminex™. ND: não determinado sob condições experimentais atuais.

[000146] No primeiro experimento Luminex™ descrito acima, 80 anticorpos da cadeia leve comum contendo a cadeia leve engendrada VK1-39JK5 foram testados para sua capacidade de bloquear o Ligante Y ligando-se a contas marcadas com Antígeno E. Destes 80 anticorpos da cadeia leve comum, 68 demonstraram bloqueio de >50%, enquanto 12 demonstraram bloqueio de <50% (6 em bloqueio de 25-50% e 6 em bloqueio de <25%). Já que 18 anticorpos da cadeia leve comum continham a cadeia leve VK3-20JK1 engendrada, 12demonstraram bloqueio de >50%, enquanto 6 demonstraram bloqueio de <50% (3 no bloqueio de 25-50% e 3 em bloqueio de <25%) do Ligante Y ligando-se a contas marcadas com Antígeno E.

[000147] No segundo experimento Luminex™ descrito acima, os mesmos 80 anticorpos da cadeia leve comum contendo a cadeia leve engendrada VK1-39JK5 foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do Antígeno E a contas marcadas com Ligante Y. Destes 80 anticorpos da cadeia leve comum, 36 demonstraram bloqueio de >50%, enquanto 44 demonstraram bloqueio de <50% (27 em bloqueio de 25-50% e 17 em bloqueio de <25%). Já que 18 anticorpos da cadeia leve comum contendo a cadeia leve VK3-20JK1 engendrada, 1 demonstrou bloqueio de >50%, enquanto 17 demonstraram bloqueio de <50% (5 no bloqueio de 25-50% e 12 em bloqueio de <25%) do Antígeno E ligando-se a contas marcados com Ligante Y.

[000148] Os dados das Tabelas 5 e 6 estabelecem que os rearranjos descritos nas Tabelas 3 e 4 geraram anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E-específicos que bloquearam a ligação do Ligante Y a seu Antígeno E de receptor cognato com graus variados de eficácia, que é compatível com anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E das Tabelas 3 e 4 que compreendem anticorpos com especificidade de epítopo de sobreposição e não sobreposição com respeito ao Antígeno E.

Exemplo 8. Determinação de Capacidade de Bloqueio de Anticorpos da Cadeia Leve Comum Específicos para o Antígeno por ELISA

[000149] Os anticorpos da cadeia leve comum humanos originados contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear o Antígeno E ligando-se a uma superfície recoberta com Ligante Y em um ensaio de ELISA.

[000150] O Ligante Y foi recoberto em placas de 96 poços em uma concentração de 2 μg/mL diluído em PBS e incubado durante a noite seguido por lavagem quatro vezes em PBS com Tween-20 0,05%. A placa então foi bloqueada com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 0,5% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) por uma hora à temperatura ambiente. Em uma placa separada, os sobrenadantes contendo anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E foram diluídos 1:10 em tampão. Um sobrenadante falso com os mesmos componentes dos anticorpos foi usado como um controle negativo. O Antígeno E-mmH (descrito acima) foi adicionado a uma concentração final de 0,150 nM e incubado por uma hora à temperatura ambiente. A mistura Anticorpo/Antígeno E-mmH então foi adicionada à placa contendo Ligante Y e incubada por uma hora à temperatura ambiente. A detecção do Antígeno E-mmH ligado ao Ligante Y foi determinada com Peroxidase de rábano silvestre (HRP) conjugada ao anticorpo anti-Penta-His (Qiagen, a Valência, CA) e desenvolvida pela resposta colorimétrica padrão usando substrato tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizado por ácido sulfúrico. A absorvância foi lida em OD450 por 0,1 segundo. A absorvância de fundo de uma amostra sem Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[000151] As tabelas 7 e 8 mostram o bloqueio de 98 por cento de anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E testados no ensaio ELISA. ND: não determinado sob condições experimentais atuais.

[000152] Como descrito neste Exemplo, de 80 anticorpos da cadeia leve comum contendo a cadeia leve VK1-39JK5 engendrada testada para sua capacidade de bloquear o Antígeno E ligando-se a uma superfície recoberta com Ligante Y, 22 demonstraram bloqueio de >50%, enquanto 58 demonstraram bloqueio de <50% (20 no bloqueio de 25-50% e 38 em bloqueio de <25%). Já que 18 anticorpos da cadeia leve comum contendo a cadeia leve engendrada VK3-20JK1 , 1 demonstraram bloqueio de >50%, enquanto 17 demonstraram bloqueio de <50% (5 no bloqueio de 25-50% e 12 em bloqueio de <25%) do Antígeno E ligando-se a uma superfície recoberta com Ligante Y.

[000153] Estes resultados são também compatíveis com o agrupamento de anticorpo da cadeia leve comum Antígeno E- específico compreendendo anticorpos com especificidade de epítopo com sobreposição e não sobreposição com respeito ao Antígeno E.

Exemplo 9. Determinação de Afinidade com BIAcore™ de Anticorpos da Cadeia Leve Comum Antígeno-específicos

[000154] As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) de sobrenadantes de anticorpo selecionados foram determinadas por SPR (Ressonância de plásmons de superfície) usando um equipamento BIAcore™ T100 (GE Healthcare). Todos os dados foram obtidos usando HBS-EP (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,3 mM, Tensoativo P20 0,05%, pH 7,4) tanto como nos tampões de corrida como amostra, a 25°C. Os anticorpos foram capturados de amostras de sobrenadante brutas em uma superfície de chip sensor CM5 anteriormente derivada com uma alta densidade de anticorpos Fc anti- humanos usando química de acoplamento de amina padrão. Durante a etapa de captura, os sobrenadantes foram injetados através da superfície de Fc anti-humano em uma taxa de fluxo de 3 μL/min, por um total de 3 minutos. A etapa de captura foi seguida por uma injeção de tampão de corrida ou de analito em uma concentração de 100 nM por 2 minutos em uma taxa de fluxo de 35 μL/min. A dissociação de antígeno do anticorpo capturado foi monitorada por 6 minutos. O anticorpo capturado foi removido por uma breve injeção de glicina 10 mM, pH 1,5. Todos os sensorgramas foram duplamente referidos subtraindo sensorgramas de injeções de tampões de sensorgramas de analito, por meio disso removendo artefatos causados pela dissociação de anticorpo da superfície de captura. Os dados de ligação de cada anticorpo foram ajustados para um modelo 1:1 de ligação com o transporte de massa usando programa BIAcore T100 Evaluation v2.1. Os resultados são mostrados nas Tabelas 9 e 10.

[000155] As afinidades de ligação de anticorpos da cadeia leve comum que compreendem os rearranjos mostrados nas Tabelas 3 e 4 variam, com quase todos exibindo um KD na faixa de nanomolar. Os dados de afinidade são compatíveis com os anticorpos da cadeia leve comum que resultam da associação combinatória de domínios variáveis rearranjados descritos nas Tabelas 3 e 4 que são de alta afinidade, clonalmente selecionados e somaticamente mutados. Acoplados com dados anteriormente mostrados, os anticorpos da cadeia leve comum descritos nas Tabelas 3 e 4 compreendem uma coleta de diversos anticorpos de alta afinidade que exibem a especificidade a um ou mais epítopos no Antígeno E.

Exemplo 10. Determinação de Especificidades de Ligação de Anticorpos da Cadeia Leve Comum Antígeno-Específicos por Ensaio Luminex™

[000156] Os anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E selecionados foram testados para sua capacidade de ligação ao ECD de Antígeno E e variantes de Antígeno E ECD, incluindo o ortólogo de macaco cinomolgus (Antígeno E Mf), que se diferencia da proteína humana em aproximadamente 10% dos seus resíduos de aminoácidos; um mutante de deleção de Antígeno E sem os últimos 10 aminoácidos da extremidade C-terminal de ECD (Antígeno E-ΔCT); e dois mutantes contendo uma substituição de alanina em posições suspeitas de interação com Ligante Y (Antígeno E-Ala1 e Antígeno E- Ala2). As proteínas de Antígeno E foram produzidas em células CHO e cada um continha uma marcação C-terminal myc-myc-His.

[000157] Para os estudos de ligação, a proteína de Antígeno E ECD ou variante proteica (descrito acima) de 1 mL de meio de cultura foi capturada pela incubação por 2 horas à temperatura ambiente com 1 x 106 contas de microesferas (Luminex™) covalentemente recobertas com um anticorpo monoclonal anti-myc (MAb 9E10, linhagem celular de hibridoma CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). As contas então foram lavadas com PBS antes do uso. Os sobrenadantes contendo anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E foram diluídos 1:4 em tampão e adicionados a placas de filtro de 96 poços. Um sobrenadante falso sem anticorpo foi usado como controle negativo. As contas contendo proteínas de Antígeno E capturadas então foram adicionadas às amostras de anticorpo (3000 contas por poço) e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as contas de amostra foram lavadas e o anticorpo da cadeia leve comum ligado foi detectado com o anticorpo IgG anti-humano conjugado com uma R- ficoeritrina. A intensidade de fluorescência das contas (aproximadamente 100 contas contadas para cada amostra de anticorpo que se liga a cada proteína de Antígeno E) foi medida com um analisador baseado em citometria de fluxo Luminex™, e a intensidade de fluorescência mediana (MFI) de pelo menos 100 contas contadas por interação de conta/anticorpo foi registrada. Os resultados são mostrados nas Tabelas 11 e 12.

[000158] Os sobrenadantes de anticorpo an tiantígeno E da cadeialeve comum exibiram alta ligação específica às contas ligadas ao Antígeno E-ECD. Para estas contas, o sobrenadante falso de controle negativo resultou em sinal insignificante (<10 MFI) quando combinado com a amostra de conta de Antígeno E-ECD, ao passo que ossobrenadantes contendo anticorpos da cadeia leve comumantiantígeno E exibiram sinal de ligação forte (MFI médio de 2627 para 98 sobrenadantes de anticorpo; MFI> 500 para amostras de anticorpo 91/98).

[000159] Como uma medida da capacidade dos anticorpos da cadeia leve comum antiantígeno E selecionados para identificar epítopos diferentes no ECD do Antígeno E, a ligação relativa dos anticorpos às variantes foi determinada. Todas as quatro variantes de Antígeno E foram capturadas com contas anti-myc Luminex™ como descrito acima para os estudos de ligação Antígeno nativo E-ECD, e as proporções de ligação relativas (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD) foram determinadas. Para 98 sobrenadantes de anticorpo da cadeia leve comum testados mostrados nas Tabelas 11 e 12, as proporções médias (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD) diferenciaram-se para cada variante, provavelmente refletindo quantidades de captura diferentes de proteínas nas contas (proporções médias de 0,61, 2,9, 2,0, e 1,0 para o Antígeno E-ΔCT, Antígeno E-Ala1, Antígeno E-Ala2, e Antígeno Mf E, respectivamente). Para cada variante proteica, a ligação de um subconjunto de 98 anticorpos da cadeia leve comum testados mostrou ligação muito reduzida, indicando sensibilidade à mutação que caracterizou uma dada variante. Por exemplo, 19 das amostras de anticorpo da cadeia leve comum ligadas ao Antígeno Mf E com MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD de <8%. Uma vez que muitos neste grupo incluem anticorpos de alta afinidade ou moderadamente alta (5 com KD <5nM, 15 com KD <50 nM), é provável que o sinal mais baixo deste grupo resulte da sensibilidade a diferenças de sequência (epítopo) entre o Antígeno E nativo-ECD e uma dada variante em vez de afinidades mais baixas.

[000160] Estes dados estabelecem que os anticorpos da cadeia leve comum descritos nas Tabelas 3 e 4 de fato representam um grupo diverso de anticorpos da cadeia leve comum específicos para o Antígeno E que especificamente reconhecem mais de um epítopo no Antígeno E.

Claims

1. Método para selecionar uma sequência de ácido nucleico da região variável da cadeia pesada humana para produzir um anticorpo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma ou mais sequências de ácido nucleico da região variável da cadeia pesada humana a partir de uma célula B de um camundongo, em que a célula B produz um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse,em que o camundongo tem um genoma de linhagem germinativa compreendendo:(a) uma única região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana rearranjada no locus da região variável da cadeia leve da imunoglobulina Kendógena de camundongo, em que a única região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana rearranjada é uma sequência Vk1-39/Jk humana rearranjada, em que a sequência Vk1-39/Jk humana rearranjada compreende um único segmento Vk1-39 da linhagem germinativa e um único segmento Jk da linhagem germinativa, ou uma sequência Vk3-20/Jk humana rearranjada, em que a sequência VK3-20/JK humana rearranjada compreende um único segmento Vk3-20 da linhagem germinativa e um único segmento Jk da linhagem germinativa; e,(b) uma substituição ou inserção de segmentos gênicos variáveis de cadeia pesada endógenos com um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que os segmentos gênicos VH humanos estão operacionalmente ligados a um gene da região da cadeia pesada constante endógena, e os segmentos gênicos VH humanos são capazes de rearranjar e formar um gene de cadeia pesada quimérico humano/camundongo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B do camundongo expressam uma população de anticorpos que todos contêm a mesma cadeia leve ou variantes mutadas de forma somática do mesmo, pareados com uma população de diferentes cadeias pesadas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de obtenção compreende a obtenção de uma célula B selecionada clonalmente de um camundongo, tendo o camundongo:(a) sido imunizado com o antígeno de interesse; e(b) permitido desenvolver uma resposta imune ao antígeno de interesse; em que a célula B expressa um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno de interesse.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um locus da região variável da cadeia leve de imunoglobulina que não compreende um segmento do gene VK endógeno que é capaz de rearranjar e formar um gene da cadeia leve de imunoglobulina.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um potencializador intrônico k de camundongo e/ou um potencializador k 3' de camundongo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a única região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada está operacionalmente ligada a uma região constante de cadeia leve de camundongo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia leve de camundongo é uma região constante de cadeia leve kappa.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem entre 19 e 81 segmentos gênicos VHhumanos não rearranjados.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem entre 12 e 43 segmentos gênicos VH humanos funcionais.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos são selecionados dentre VH1-2, VH1- 8, VH1-18, VH1-24, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3- 20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-59, VH6-1, ou uma combinação destes.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de camundongo compreende ainda pelo menos um segmento gênico D humano não rearranjado e pelo menos um segmento gênico J humano não rearranjado.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um segmento gênico D humano não rearranjado é selecionado dentre D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27 ou uma combinação destes.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento gênico J humano não rearranjado é selecionado dentre J1, J3, J4, J5, J6, ou uma combinação dos mesmos.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada única compreende um rearranjo de um segmento gênico VK1-39 humano e um segmento gênico JK5 humano.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a única região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada compreende um rearranjo de um segmento gênico VK3-20 humano e um segmento gênico humano JK1.

17. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os domínios variáveis da cadeia pesada humana do anticorpo biespecífico se ligam a:(a) dois antígenos diferentes; ou(b) dois epítopos diferentes do mesmo antígeno.

18. Método para fabricar um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) cultivar uma célula contendo(i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, em que a primeira sequência de ácido nucleico compreende uma primeira sequência da região variável da cadeia pesada humana que codifica um primeiro domínio variável da cadeia pesada humana que reconhece um primeiro epítopo;(ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina em que a segunda sequência de ácido nucleico compreende uma segunda sequência da região variável da cadeia pesada humana que codifica um segundo domínio variável da cadeia pesada humana que reconhece um segundo epítopo;(iii) uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina em que a terceira sequência de ácido nucleico compreende uma sequência da região variável da cadeia leve humana que codifica um domínio variável da cadeia leve humana, em que a cadeia leve da imunoglobulina pareia com a primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina;sob condições que permitem que a célula expresse a primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina e a cadeia leve de imunoglobulina para gerar o anticorpo; e(b) isolar o anticorpo da célula;em que a primeira e segunda sequências da região variável da cadeia pesada são obtidas de um camundongo, cujo genoma de linhagem germinativa compreende:(iv) uma única região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada (VK/JK) que codifica um domínio VK humano de uma cadeia leve de imunoglobulina, em que a única região Vk/Jk humana rearranjada é selecionada dentre uma sequência Vk1-39/J humana ou uma sequência Vk3-20/J humana; e,(v) uma substituição de segmentos gênicos variáveis de cadeia pesada (VH) endógenos com um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que os segmentos gênicos VH humanos estão operacionalmente ligados a um gene da região constante endógena da cadeia pesada, e os segmentos gênicos VH humanos são capazes de rearranjar e formar um gene de cadeia pesada quimérico humano/camundongo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o camundongo não possui segmento(s) Vk e/ou Jk de imunoglobulina de camundongo.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o camundongo não expressa cadeias pesadas e leves k de imunoglobulina endógena funcionais.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um potencializador intrônico K de camundongo e/ou um potencializador K 3' de camundongo.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que a única região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada está operacionalmente ligada a uma região constante de cadeia leve de camundongo.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia leve de camundongo é uma região constante de cadeia leve kappa.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos de (v) compreendem entre 19 e 81 segmentos gênicos VH humanos não rearranjados.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos de (v) compreendem entre 12 e 43 segmentos gênicos VH humanos funcionais.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos de (v) são selecionados dentre VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4- 59, VH6-1 ou uma combinação destes.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa do camundongo compreende ainda pelo menos um segmento gênico D humano não rearranjado e pelo menos um segmento gênico J humano não rearranjado.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento gênico D humano não rearranjado é selecionado dentre D1-7, D1-26, D3-3, D310, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27 ou umacombinação destes.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento gênico J humano não rearranjado é selecionado dentre J1, J3, J4, J5, J6, ou uma combinação dos mesmos.

30. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a única região VK/JK rearranjada em (iv) compreende um rearranjo de um segmento gênico VK1-39 humano e um segmento gênico Jk5 humano.

31. Método de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a única região Vk/Jk humanarearranjada em (iv) compreende um rearranjo de um segmento gênico humano Vk3-20 e um segmento gênico Jk1 humano.

32. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de que o primeiro esegundo epítopos estão em antígenos diferentes.

33. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de que o primeiro esegundo epítopos estão no mesmo antígeno.

34. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de que o primeiro esegundo epítopos são os mesmos.

35. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 a 34, caracterizado pelo fato de quea primeira sequência de ácido nucleico compreende a primeira sequência da região variável da cadeia pesada humana fundida com uma sequência da região constante de cadeia pesada humana,a segunda sequência de ácido nucleico compreende a segunda sequência da região variável da cadeia pesada humana fundida com uma sequência da região constante de cadeia pesada humana, ea terceira sequência de ácido nucleico compreende a sequência da região variável da cadeia leve humana fundida com uma sequência da região constante de cadeia leve humana.

36. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.