KR20210142659A - Egfr×cd28 다중특이성 항체 - Google Patents

Egfr×cd28 다중특이성 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20210142659A
KR20210142659A KR1020217032287A KR20217032287A KR20210142659A KR 20210142659 A KR20210142659 A KR 20210142659A KR 1020217032287 A KR1020217032287 A KR 1020217032287A KR 20217032287 A KR20217032287 A KR 20217032287A KR 20210142659 A KR20210142659 A KR 20210142659A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
antigen
binding
Prior art date
Application number
KR1020217032287A
Other languages
English (en)
Inventor
디미트리스 스코코스
앤드류 제이. 머피
조지 디. 얀코파울로스
로릭 하버
치아-양 린
Original Assignee
리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. filed Critical 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Publication of KR20210142659A publication Critical patent/KR20210142659A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성 항체(EGFR×CD28)뿐만 아니라 항-EGFR 항체를 제공한다. 이러한 항체는 항-PD1 항체와 같은 추가의 치료제와 조합될 수 있다. 항체(예를 들어, 및 항-PD1과의 이들의 조합)를 투여함으로써 암(예를 들어, EGFR-발현 암)을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 EGFR×CD28 항체는 PD-1 저해와 조합된 종양-표적화된 면역치료적 양식을 구현한다. 이러한 이중특이성 항체는 하나의 암과는 종양-특이적 항원(TSA)(EGFR)에 결합하고, 다른 암과는 T-세포의 공동-자극 수용체인 CD28에 결합한다. PD-1 저해제와의 병용 요법은 종양내 T 세포 활성화를 특이적으로 강화하여, 다양한 동계 및 인간 종양 이종이식편 모델에서 전신 사이토카인 분비 없이 효과기 메모리-유사 T 세포 표현형을 촉진한다. 이러한 클래스의 CD28-공동-자극 이중특이성 항체와 임상적으로 검증된 항-PD-1 치료를 조합하면 현저하게 향상된 항-종양 효능과 함께 내약성이 좋은 항체 요법을 제공한다.

Description

EGFR×CD28 다중특이성 항체
관련 출원
본 출원은 2019년 3월 22일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/822,124호에 관한 것이며, 이 기초출원의 우선권을 주장한다. 전술한 기초출원의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 명시적으로 원용된다.
기술 분야
본 발명은 EGF 수용체 및 CD28에 결합하는 항체, 및, 예를 들어, 암을 치료 또는 예방하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 2020년 3월 19일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 118003-10620_SL.txt이며, 크기는 63,481 바이트이다.
세포 표적(예컨대, 바이러스에 감염된 세포 또는 종양 세포)을 인식하고 죽이는 T-세포의 능력은 조직화된 상호작용의 세트에 의존한다. 이들 중 가장 중요한 것은 T-세포 수용체(T-cell Receptor: TCR) 복합체(관련 CD3γ, δ, ε 및 ζ 사슬 포함)에 의한 표적 세포의 인식 및 결합이며, 이러한 상호작용은 T-세포 활성화에 대한 "신호 1"로 지칭된다. TCR은 표적 세포의 표면에 발현된 MHC 단백질의 홈에 존재하는 바이러스 또는 종양 펩타이드를 인식한다. 이러한 결합은 일반적으로 친화도가 낮기 때문에, "신호 1"을 성공적으로 촉발하기 위해서는 T-세포와 이의 표적 세포 사이의 경계면을 따라 많은 TCR 복합체를 클러스터링 할 필요가 있으며; 이러한 계면은 "면역 시냅스"로 지칭된다. T-세포 활성화는 추가적인 상호작용에 의해 더 촉진될 수 있다. 예를 들어, T-세포는 그 표면에 CD28로 지칭되는 분자를 가지고 있으며, 이는 TCR 복합체를 통한 활성화를 증가시키는 공동-자극 "신호 2"를 제공할 수 있다. T-세포가 TCR 복합체를 통해 표적 세포를 인식하고 CD28이 표적 세포 상의 동족 리간드(들)에 결합하여 "신호 2"에 관여하면 T-세포 활성화가 향상되고; "신호 1"과 마찬가지로, CD28-매개성 "신호 2"는 면역 시냅스에서 공동-클러스터링을 통해 발생하는 것으로 생각된다.
효능적(agonistic) 항-CD28 mAb는 배양된 T-세포의 지속적인 생체외 증식에 적용될 수 있지만; 초효능제(super agonist) 항-CD28 mAb가 전신적으로 테스트된 I상 임상 시험에서 일련의 급성 및 심각한 부작용의 결과로 인해 CD28에 대한 항체의 사용이 권장되지 않았다(문헌[Hunig, Nature Reviews Immunology. 2012;12:317-318]). 항-CD28 mAb의 국부화된 또는 표적화된 사용은 항종양 면역 촉진에 대한 위험을 낮추면서 사용될 수 있다. 문헌[Jung et al., Int J Cancer. 2001 Jan 15;91(2):225-30].
상이한 패밀리의 성장 인자 및 성장 인자 수용체는 암 세포의 자율적 성장에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들 중, 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 및 펩타이드 성장 인자의 EGF-패밀리는 상이한 암종 유형의 발병 및 진행에 중심적인 역할을 한다. EGFR은 세 가지의 추가적인 단백질, ErbB-2, ErbB-3 및 ErbB-4를 포함하는 수용체 패밀리에 속한다. 이러한 단백질 및 EGF 패밀리의 성장 인자는 개별 수용체 유형에 도달하는 신호가 종종 동일한 패밀리의 다른 수용체로 전달되는 통합된 시스템을 형성한다.
T-세포 활성화를 향상시키는 것을 목적으로 하는 단일클론 항체(Monoclonal antibody: mAb)는 항-종양 치료제로서 임상 개발 중에 있다. 그러나, 대부분의 현재의 치료제는 종양 미세환경의 저해 특성을 극복하는데 어려움이 있기 때문에, 효율적인 종양-특이적 T-세포 활성화 및 후속 종양 세포 살해를 일으키지 못한다. CTLA-4(세포독성 T 림프구-관련 단백질) 및 세포 예정사 1(programmed cell death 1: PD-1)/세포 예정사 리간드 1(programmed cell death ligand 1: PD-L1)과 같은 관문 저해제(checkpoint inhibitor)에 대한 여러 차단 mAb가 흑색종(melanoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 및 진행성 전이성 피부 편평 세포 암종(advanced metastatic cutaneous squamous cell carcinoma)에 대해 임상적으로 승인되었다. PD-1을 차단하면, T-세포 활성화에 대한 중단이 해제되지만, 단일 작용제로서의 효능은 종종 종양 제거 및 오래 지속되는 항-종양 반응을 얻기에 충분하지 않다.
본 발명은 PD-1 차단 항체와 조합될 때, 동계(syngeneic) 및 인간 종양 이종이식편 모델 모두에서 장기간 지속되는 항-종양 면역을 유도하며 전신 사이토카인 분비의 징후 없이 강력한 종양내 T-세포 활성화를 촉진하는, 분화 클러스터 28(Cluster of Differentiation 28: CD28)과 상피 성장 인자 수용체(EGFR×CD28 또는 CD28×EGFR)에 대해 표적화되는 이중-특이성 항체를 사용하는 면역치료 양식을 제공한다. 유전적으로-인간화된 면역적격 마우스 및 사이노몰구스 원숭이에서의 독성 연구는 이러한 이중-특이성 물질이 단독으로 또는 항-PD-1 항체와 조합하여 일부 단일 작용제 활성을 나타내며 독성이 없음을 보여준다. 총괄적으로, 이러한 데이터는 이러한 클래스의 CD28-기반 이중-특이성과 PD-1 저해를 조합하면 현저하게 향상된, 특이적이고 상승적인 항-종양 활성을 갖는 안전한 생물학적 해결책을 제공할 수 있음을 시사한다.
일 양태에서, 본 발명은 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 10-6 M 미만의 KD로 인간 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 도메인; 및 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 10-9 M 미만의 KD로 표적 종양 세포 상의 인간 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양태에서, 단리된 이중특이성 항원 결합 분자는 항-뮤신 16(anti-Mucine 16: MUC16)×CD3 이중특이성 항체와 함께 사용되고, EGFR을 발현하는 표적 세포에 대해 테스트될 때 공동자극 효과를 보여준다. 일 실시형태에서, 공동자극 효과는 다음 중 하나 이상으로 나타난다: (a) 인간 T 세포를 활성화하며 EGFR을 발현하는 표적 세포를 죽이도록 지시하는 능력; (b) T 세포에서 PD-1을 상향조절하는 능력; (c) PBMC로부터 사이토카인 IFN 감마 및 TNF의 방출을 증가시키는 능력; (d) 종양 세포를 고갈시키는 능력; 또는 (f) 종양 제거를 향상시키는 능력. 다른 실시형태에서, 공동자극 효과는 다음 중 하나 이상에 의해 추가로 나타난다: (g) T 세포/APC 루시퍼레이스-기반 리포터 검정에서 NFkB 활성의 활성화; 또는 (h) 1차 CD4+ T 세포/APC 기능 검정을 사용한 IL-2 사이토카인 생산의 측정.
본 발명은 다음을 포함하는 EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 제공한다: (1) (a) 서열번호 2, 30, 40 및 50 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬; 및/또는 (b) 서열번호 16 또는 이의 변이체에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬을 포함하는, EGFR 결합 암(arm); 및 CD28 결합 암; 또는 (2) (c) 서열번호 10, 59 및 63 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬; 및/또는 (d) 서열번호 16 및 67 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬을 포함하는, CD28 결합 암; 및 EGFR 결합 암.
예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 2, 24, 30, 40 및 50 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 16 및 28 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, EGFR 결합 암; 및 CD28 결합 암; 또는 (2) (c) 서열번호 10, 26, 59 및 63 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 (d) 서열번호 16, 28 및 67 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, CD28 결합 암; 및 EGFR 결합 암.
본 발명의 실시형태에서, EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 2, 30, 40 또는 50에 제시된 아미노산 서열 및 각각 서열번호 2, 30, 40 또는 50에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 및 각각 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, EGFR 결합 암; 및 CD28 결합 암; 또는 (2) (c) 서열번호 10, 59 또는 63에 제시된 아미노산 서열 및 각각 서열번호 10, 59 또는 63에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 (d) 서열번호 16 또는 67에 제시된 아미노산 서열 및 각각 서열번호 16 또는 67에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, CD28 결합 암; 및 EGFR 결합 암.
본 발명의 실시형태에서, EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함한다:
(1)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 아미노산 서열: GDSIITFY(서열번호 4; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: ARVSEDSYFHYGMDV(서열번호 8; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
(2)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 아미노산 서열: GFTFSTFI(서열번호 32; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: ISSNGGTI(서열번호 34; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: TRGGDFWSGYYPFDY(서열번호 36; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
(3)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 아미노산 서열: GFSFRDAW(서열번호 42; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IRNKIDGGTT(서열번호 44; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: TTDIWNYVLFYYYGLDV(서열번호 46; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
(4)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 아미노산 서열: DDSIISYY(서열번호 52; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGRT(서열번호 54; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: ARVSEDSYYHYGMDV(서열번호 56; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1; 아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및 아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3; 및 아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1; 아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및 아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3.
본 발명의 실시형태에서, EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함한다:
(1)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 2(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(2)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 30(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(3)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 40(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(4)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 50(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 실시형태에서, EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함한다:
(1)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 24(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(2)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 38(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(3)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 48(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(4)
다음을 포함하는 EGFR 결합 암: 서열번호 58(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
다음을 포함하는 CD28 결합 암: 서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
본 발명의 실시형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 REGN7075(본 명세서에서 bsAb7075로도 지칭됨); REGN6321(본 명세서에서 bsAb6321로도 지칭됨); REGN6322(본 명세서에서 bsAb6322로도 지칭됨); REGN6323(본 명세서에서 bsAb6323로도 지칭됨)이다. 다른 이중특이성 항체는 본 명세서의 표 9A, 표 9B 및 표 9C에서 기재된 모(parental) EGFR 항체를 사용하여 생성될 수 있으며, 여기서 EGFR 모 항체의 HCVR 암의 서열은 WO2014/004427에서 찾을 수 있고, 모 CD28 항체의 HCVR 아미노산 서열은 본 명세서의 표 3에서 찾을 수 있다. 임의의 EGFR HCVR 암은 본 명세서에 기재된 임의의 CD28 HCVR 암과 쌍을 이룰 수 있다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 상피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 제공한다: (i) 서열번호 2, 24, 30, 38, 40, 48, 50 또는 58; 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 (ii) 서열번호 16 또는 28; 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역. 본 발명의 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다.
본 발명은 또한 EGFR 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, 종양 세포의 표면) 및 CD28 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, T-세포와 같은 면역 세포의 표면)에 결합하는 본 명세서에 제시된 다중특이성 항원-결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 본 명세서에 제시된 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 상기 항원-결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에 도입하는 단계; (b) 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 선택적으로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장한 배지로부터 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬을 단리하는 단계. 이러한 방법의 생성물인 임의의 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬은 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이성(예를 들어, 이중-특이성) 항원-결합 단백질의 면역글로불린 사슬 중 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 항원-결합 단백질을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO)뿐만 아니라 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 다른 물질 또는 물품과 함께, 선택적으로, 추가의 치료제(예를 들어, PD-1 저해제, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, PD-L1 저해제, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 백금 항암 화학치료제, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴(vincristine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 항암 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(bevacizumab) 및/또는 세미플리맙(cemiplimab))와 함께 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다. 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단백질을 포함하는 약제학적 제형 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 선택적으로, 추가의 치료제가 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단백질, 조성물 및/또는 제형을 포함하는 용기 및 주사 장치(예를 들어, 주사기, 미리-충전된 주사기 또는 자기주사기(autoinjector))를 제공한다.
본 발명은 또한 항원-결합 단백질, 조성물 또는 제형을 대상체의 신체에, 예를 들어, 주사기, 미리-충전된 주사기 또는 자기주사기로 주사하는 것을 포함하는, 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단백질, 이의 조성물 또는 제형을 대상체(예를 들어, 인간)에 투여하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 추가의 치료제(예를 들어, 세미플리맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)가 또한 대상체에 투여된다.
본 발명은 또한 유효량의 다중특이성 항원-결합 단백질 또는 조성물 또는 제형을 선택적으로 추가의 치료제(예를 들어, 세미플리맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)와 함께 (예를 들어, 피하로, 정맥내로 또는 근육내로) 투여하는 단계를 포함하는, 과증식성 질환(hyperproliferative disease)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에서 과증식성 질환(예를 들어, EGFR-발현 암)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시형태에서, EGFR-발현 암은 식도 암종(esophageal carcinoma), 폐 편평 세포 암종(lung squamous cell carcinoma), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 경부 편평 세포 암종(cervical squamous cell carcinoma), 자궁내막 선암종(endometrial adenocarcinoma), 방광 요로상피 암종(bladder urothelial carcinoma), 폐암(lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 직장결장암(colorectal cancer), 직장암(rectal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 피부암(skin cancer), 두경부 편평세포 암종(head & neck squamous cell carcinoma), 뇌암(brain cancer), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 유방암(breast cancer), 위식도암(gastroesophageal cancer), 위식도 선암종(gastroesophageal cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 난소암(ovarian cancer)이다.
도 1a 내지 도 1e는 내인성 TSA가 있는 암 세포주에서, EGFR×CD28 이중특이성 항체(REGN7075)가 TSA×CD3(MUC16×CD3)에 의한 TCR 자극의 존재하에 T-세포 활성화를 강화함을 보여준다. 도 1a 및 도 1b에서, 유세포 분석은 EGFR×CD28 이중특이성 항체가 CD28+ 및 EGFR+ 세포에 결합함을 보여준다. (도 1a) 주캇 세포(Jurkat cell)(CD28+ 세포). (도 1b) PEO1 세포(EGFR+ 세포). 도 1c 내지 도 1e에서, 인간 T-세포는 내인성 MUC16과 EGFR(난소암 세포주 PEO1) 및 표시된 이중특이성 항체를 발현하는 암 표적 세포와 함께 96시간 동안 배양되었다. (도 1c) 종양 세포 살해, 생존 세포 %. (도 1d) CD25+ T 세포의 빈도(CD2의 %). (도 1e) 세포독성 검정으로부터의 상청액은 혈구계산 비드 어레이(Cytometric Bead Array: CBA) 키트를 사용하여 분석되었다. 방출된 IFN은 pg/㎖로 플로팅된다.
도 2a 내지 도 2d는 종양 세포 상의 CD28 리간드(CD86)의 발현이 항-PD1 처리와 상승작용하여 CD8 의존적 항-종양 면역을 유도함을 보여준다. MC38 종양 세포는 CD28, CD86(MC38/CD86) 또는 빈 벡터 대조군(MC38/EV)에 대한 리간드로 형질도입되었다. WT C57BL6 마우스는 초기에 마우스당 1×106개의 종양 세포가 이식되었고, 종양 이식 후 제0일, 제3일, 제7일, 제10일 및 제14일에 5 ㎎/㎏의 PD-1 mAb 또는 rIgG2a 아이소타입 대조군으로 처리되었다. 도 2a. 시간 경과에 따른 평균 종양 부피. 오차 바는 +/- SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 테스트(Tukey's multiple comparisons test)로 결정되었다. 도 2b. 시간 경과에 따른 생존(2000㎣ 미만의 종양을 갖는 마우스의 백분율). 이식 후 제60일의 통계적 유의성은 로그-순위(Log-rank)(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트로 결정되었다. 도 2c. 마우스는 CD8 고갈 항체(CD8 고갈됨) 또는 아이소타입 대조군(고갈 없음)으로 처리되었다. CD8 고갈(점선)과 고갈 없음(실선)의 시간 경과에 따른 평균 종양 부피는 +/- SEM으로 나타나 있다. 통계적 유의성은 이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 테스트로 결정되었다. 도 2d. MC38/CD86이 이식되고 PD1 mAb로 처리된 종양이 없는 마우스의 2차 종양 이식(재-이식(re-challenge)). 도 2a 내지 도 2d의 경우, 데이터는 그룹당 10 마리의 마우스를 사용한 1회 실험으로부터 표시된다. 데이터는 적어도 4개의 개별 실험을 나타낸다. 통계적 유의성이 표시된다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001).
도 3a 및 도 3b는 A431 인간 이종이식편 종양 모델을 보여준다. 데이터는 도 4 및 도 5에 해당한다. 도 3a는 전-처리된 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 생착(engraftment)을 보여준다. 도 3b는 A431 FACS 분석을 보여준다. 관심 있는 마커는 각 플롯에 대해 표시된다.
도 4 및 도 5는 EGFR×CD28(REGN7075)이 항-PD1(세미플리맙) 처리와 상승작용하여 인간 태아 간 CD34+ 세포가 생착된 VH 마우스에서 항-종양 면역을 유도함을 보여준다. 구체적으로, 도 4 및 도 5에서, A431 표피모양 암종 종양 세포(ATCC로부터 입수됨)는 태아 간 CD34+ 세포가 생착된 SIRPAh/h　TPOh/m　Rag2 -/- 　Il2rg -/- 마우스에 피하로 이식되었다. 마우스는 태아 간 공여체, 인간 면역 세포 생착 빈도 및 성별에 기초하여 표시된 처리 그룹으로 분리되었다. 마우스는 종양 이식(tumor challenge) 당일에 복강내로(intra-peritoneally: IP) 처리되고, 실험을 통해 2일 내지 3일마다 투여되었다. 항-PD-1의 용량은 10 ㎎/㎏이고, EGFR×CD28 또는 PSMA×CD28은 5 ㎎/㎏이다. 데이터는 종양 시험 후 일수에 대해 플로팅된 각 처리 그룹에 대한 평균 A431 종양 부피(㎣±SEM)를 보여준다. 이원 ANONA, 터키 비교: ** P<0.01, **** P<0.001. (n = 그룹당 10마리 내지 12마리의 마우스).
도 4는 인간 CD34+ 세포가 생착된 VH 마우스에서 종양 후 일수에 대해 플로팅된 각 처리 그룹(아이소타입, 항-PD1 단일요법(세미플리맙), EGFR×CD28(REGN7075) 단일요법 또는 EGFR×CD28(REGN7075) + 항-PD1 병용 요법)에 대한 평균 A431 종양 부피(㎣±SEM)를 구체적으로 보여준다. 이원 ANONA, 터키 비교: ** P<0.01, **** P<0.0001.
도 5는 인간 CD34+ 세포가 생착된 VH 마우스에서 종양 후 일수에 대해 플로팅된 대조군 그룹(아이소타입, 항-PD1 단일요법(세미플리맙), PSMA×CD28 단일요법 또는 PSMA×CD28 + 항-PD1 병용 요법)에 대한 평균 A431 종양 부피(㎣±SEM)를 보여준다. 이원 ANONA, 터키 비교: ** P<0.01, **** P<0.0001.
도 6은 A431 종양 세포에 대한 PSMA 발현의 결여의 검증을 보여준다. 인간 PSMA를 발현하도록 조작된 MC38 마우스 종양 세포주가 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 7a 및 도 7b. 예방적으로(도 7a) 또는 치료적으로(도 7b) 처리된 NSG 마우스에서 종양 시험 후 일수에 대해 플로팅된 EGFR×CD28(REGN7075)이 투여된 각 처리 그룹에 대한 평균 A431 종양 부피(㎣±SEM). 이원 ANONA, 터키 비교: **** P<0.0001.
도 8. NSG 마우스에서 종양 시험 후 일수에 대해 플로팅된 각 처리 그룹(아이소타입 또는 EGFR×CD28(REGN7075) @ 1 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏)에 대한 평균 A549 종양 부피(㎣±SEM). 이원 ANONA, 터키 비교: * 아이소타입 대 EGFR×CD28 1 ㎎/㎏(P<0.05), ****: P<0.0001; $ 아이소타입 대 EGFR×CD28 10 ㎎/㎏(P<0.05), $$$: P<0.001, $$$$: P<0.0001; @ EGFR×CD28 1 ㎎/㎏의 대 10 ㎎/㎏(P<0.05).
도 9a 내지 도 9d. EGFR×CD28(REGN7075)은 인간 태아 간 CD34+ 세포가 생착된 VH 마우스에서 항-종양 면역을 유도하기 위해 항-PD1(세미플리맙) 처리와 상승작용한다. (도 9a) CITRUS(클러스터 확인, 특성화 및 퇴행) 분석에 의해 확인된 선택된 종양 CD8+ T-세포 클러스터의 MFI; (도 9b) 표시된 처리 그룹으로부터의 각각의 클러스터에서 세포의 빈도; (도 9c) CITRUS 분석에 의해 확인된 선택된 종양 CD4+ T-세포 클러스터의 MFI; (도 9d) 표시된 처리 그룹으로부터의 각각의 클러스터에서 세포의 빈도. 도 9b 및 도 9d는 EGFR×CD28이 인간 태아 간 CD34+ 세포가 생착된 VH 마우스에서 항-종양 면역을 유도하기 위해 항-PD1 처리와 상승작용함을 보여준다.
도 10a 내지 도 10c. EGFR×CD28(REGN7075) 단독 또는 항-PD1(세미플리맙) 요법과의 조합은 사이노몰구스 원숭이에서 CD28 초효능제와 비교하여 전신 T-세포 활성화를 유도하지 않았다. 사이노몰구스 원숭이는 표시된 용량(㎎/㎏)의 이중-특이성 항체의 단일 용량으로 처리되었다. 시간은 투여 후(시간)로 나타낸다. (도 10a) 혈청 사이토카인(IFN감마, IL-2, IL-6, IL-8 및 IL-10) (도 10b) 상대적 말초 혈액 T-세포 수 (도 10c) Ki67+ 및 ICOS+ T-세포의 빈도(CD3의 %). 값은 평균 +/- SEM을 나타낸다. N = 그룹당 3마리의 동물. P 값은 아이소타입 대조군과 비교하여 이원 ANOVA로 계산되었다. (**, p<0.01; ***, p<0.001 및 ****, p<0.0001).
도 11은 PD-1 항체(REGN2810, US20150203579에 H2M7798N 또는 H4H7798N으로 기재됨)와 조합될 때 항-EGFR×항-CD28 항체(REGN7075)에 의해 매개되는 시간 경과에 따른 용량 의존적 항-종양 반응을 보여준다.
도 12는 PD-1 항체(REGN2810)와 조합될 때 항-EGFR×항-CD28 항체(REGN7075)에 의해 매개되는 용량 의존적 항-종양 반응을 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 주캇 세포(CD28 + 효과기 세포)(도 13a); A375 흑색종 세포, 22RV1 전립선 세포, PEO1 난소 세포, CAPAN 췌장 세포, SW1990 췌장 세포 및 H292 폐 세포를 포함하는 다양한 다른 종양 표적 세포(도 13b 및 도 13c)를 포함한 다양한 세포에 대한 다양한 항-EGFR×항-CD28 항체의 결합을 설명한다. 아이소타입 대조군(Isotype Control) I 및 II는 각각 Mer 및 EGFRvIII에 결합하는 항체이다.
도 14a 및 도 14b는 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체가 항-종양 특이적 항원(tumor specific antigen: TSA)×항-CD3 이중특이성 항체의 세포독성 효력을 향상시킴을 보여준다. 연구에는 항-STEAP2×항-CD3 이중특이성 항체(도 14a) 또는 항-PSMA×항-CD3 이중특이성 항체(도 14b)와 조합된 항-EGFR×항-CD28 항체가 포함되었다. 항-STEAP2×항-CD3 항체는 WO2018/058001A에 기술되어 있다. 항-PSMA×항-CD3 항체는 WO2017/053856A1에 기술되어 있다.
도 15a, 도 15b, 도 15c 및 도 15d는 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체가 PEO1 세포(도 15a), CAPAN2 세포(도 15b), SW1990 세포(도 15c) 및 H292 세포(도 15d)를 포함하는 다양한 세포주에 걸쳐 항-종양 특이적 항원(anti-tumor specific antigen: TSA)×항-CD3 이중특이성 항체(항-MUC16×항-CD3)의 세포독성 효력을 향상시킴을 보여준다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명에 기재된 특정 방법 및 실험 조건은 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 인용된 특정 수치 값과 관련하여 사용될 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 그 값이 인용된 값으로부터 1% 이하만큼 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비특허 간행물은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
PD-1 차단 mAb에 의한 관문 저해는 T 세포 활성화에 대한 중단을 해제하는 것으로 알려져 있지만, 단일 작용제로서 이들의 효능은 종종 많은 암에서 종양 제거 및 오래 지속되는 항-종양 반응을 얻기에 항상 충분하지 않다. PD-1 저해에 대한 반응률을 개선하기 위한 몇 가지 접근법이 현재 평가되고 있다. 실제로, PD-1 mAb에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커의 확인, T 세포 활성화를 개선하기 위해 공동자극 수용체를 촉발하는 효능적 항체와 함께 PD-1 저해를 사용하는 비-종양 표적화 병용 요법, 또는 화학요법 또는 방사선요법이 모두 현재 전임상 및 임상 시험 진행 중이다. 그러나, 문제는 이러한 조합 중 다수가 종종 진정한 가설-중심 접근법(hypothesis-driven approach)보다는 일부 경우에 환자에게 더 나쁜 결과를 초래하는 기존 약물의 이용 가능성과 요법을 조합하기 위한 사후 논리(post-hoc rationale)에 기반을 두고 있다는 것이다. 면역계의 관문 저해 및 재활성화는 많은 환자에게 장기적인 관해(remission)의 가능성을 제공하므로, T 세포 활성을 더 개선 또는 향상시켜 보다 오래 지속되는 반응을 촉진하는 방법이 필요함이 분명하다. 여기에서, PD-1 mAb의 항-종양 효능을 개선하기 위해, EGFR×CD28 이중특이성 항체를 사용하여 T-세포 신호전달 및 활성화를 향상시킨다는 개념이 도입되었다. 실제로, 이러한 신규한 병용 면역요법은 CD28 공동자극 이중특이성 항체가 PD-1 mAb와 상승작용을 일으켜 강력한 T-세포 활성화를 생성할 뿐만 아니라 전신 독성 없이 오래 지속되는 항-종양 반응을 제공함을 보여주었다. 결과적으로, 이러한 종양-표적화된 병용 요법은 이전에 기술된 비-표적화된 접근법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 종양 세포 표면에 클러스터링되지 않는 CD28을 직접적으로 활성화하지 않는 CD28-이중특이성 항체를 사용하면, 종양 부위에만 공동-자극을 촉진할 가능성을 제공하여 CLTA-4 및 PD-1 차단 또는 기타 공동자극 효능제 2가 항체의 조합에서 종종 관찰되는 독성인 종래의 CD28-활성화 항체의 전신 독성을 피할 수 있었다. 유전적으로-인간화된 면역적격 마우스뿐만 아니라 사이노몰구스 원숭이에서의 독성 연구는 이러한 이중특이성 항체가 단일 작용제로서 또는 PD-1 mAb와 조합하여 독성을 나타내지 않았음을 보여주었다. 동계 및 이종 모델에 걸쳐 항-PD-1 mAb와 함께 EGFR×CD28에 의한 항-종양 효능의 유사한 향상과 함께 안전성 프로파일은 이러한 치료적 양식이 특정 종양 모델에 제한되지 않고 강력하며, 면역요법을 위한 신규한 조합 클래스로서 더 폭넓은 유용성을 가질 수 있음을 시사하였다.
종양 세포의 T-세포-매개성 살해를 향상시키기 위해, 종양-표적화된 접근법이 개발되고 있다. 실제로, CD3-기반 이중특이성 항체는 T 세포를 종양 세포에 연결하고 TCR/CD3을 활성화하여, 정상적인 "신호 1"을 모방함으로써 T-세포 활성화를 효율적으로 촉발할 수 있는 새로운 클래스의 항체를 나타낸다. 그러나, 이들의 유망한 임상적 효능에도 불구하고, CD3-이중특이성 항체는 직접적인 T-세포 활성화 및 종양만의 특이성의 부족으로 인해 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome: CRS)과 관련될 수 있다. 또한, 공동-자극("신호 2")의 부재하에 TCR/CD3 활성화는 무반응(anergy) 또는 활성화 유도성 세포 사멸(activation induced cell death: AICD)을 유발할 수 있으며, 이는 이러한 시약의 잠재적인 항-종양 효과를 제한하거나 또는 감소시킬 수 있다. 여기에서 EGFR×CD28 이중특이성 항체 및 항-PD-1 mAb 병용 요법이 종양 특이적 T-세포 활성화를 유도한다는 것이 처음으로 입증되었다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, EGFR×CD28 이중특이성 항체는 "신호 1"의 부재하에 활성이 제한되거나 또는 전혀 없으며, PD-1 차단은 종양 펩타이드에 대한 내인성 항원 특이적 T-세포 반응에 의존한다. 따라서, PD-1 차단과 함께 CD28-이중특이성 항체는 내인성 TCR/CD3-의존성 T 세포 반응을 증가시켜 오래 지속되는 항-종양 반응을 유도할 수 있다.
PD-1 mAb의 항-종양 활성은 CD28-의존적이며, T-세포 활성화의 PD-1 저해는 이러한 분자의 공간적 국재화에 영향을 미칠 수 있는 TCR/CD3 및/또는 CD28을 통한 신호전달을 감소시킨다. 본 명세서의 데이터는 PD-1이 표적 세포에 의해 발현될 때 면역 시냅스에 축적되며, 그 축적이 시냅스에서 CD28의 감소와 관련이 있음을 보여주었으며, PD-1이 시냅스로의 CD28 국재화를 방지함으로써 T-세포 저해를 실행할 수 있다는 것을 시사하였다. 게다가, PD-1 차단이 PD-1 시냅스 국재화를 방지하는 반면 시냅스에서의 CD28 축적이 증가하여 EGFR×CD28 이중특이성 항체가 T-세포 활성화를 촉진하는 PD-1 mAb의 능력을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 PD-1 차단 항체가 T-세포 활성화를 촉진하는 메커니즘 중 하나일 수 있다. 종합적으로, PD-1-PD-L1 상호작용 및/또는 PD-1 저해 후 면역학적 시냅스에서 PD-1 및 CD28 국재화의 시각화는 T-세포 활성화에 대한 PD-1 차단의 효과뿐만 아니라 면역 시냅스의 수준에서 EGFR×CD28과 PD-1 mAb 사이의 상승효과를 더 잘 이해할 수 있게 하였다.
PD-1 mAb는 면역요법의 중요한 새로운 클래스이지만, 많은 경우에 항-종양 활성의 추가의 최적화가 확실히 필요할 것이다. CAR-T 접근법이 항-종양 활성을 개선하기 위해 "신호 1" 및 "신호 2" 둘 다를 인위적으로 활성화하는 키메라 수용체를 사용하는 것처럼, 이제 항-종양 활성을 향상시키기 위한 PD-1 저해와 CD28-이중특이성 항체 조합("신호 2"를 제공함)의 잠재적인 이점이 나타나 있다. 이러한 접근법은 각각의 환자에 대해 개별적으로 맞춤화되어야 하는 힘든 세포 요법 준비가 필요하지 않으며, 환자가 종종 부작용과 관련이 있는 독성 화학용법을 통해 선제적으로(pre-emptively) "림프고갈(lymphodepleted)"을 일으켜 세포 요법을 받아들일 수 없게 될 필요가 없다는 점에서 CAR-T 요법에 비해 몇 가지 실용적인 이점이 있다. 이러한 이중특이성 항체 접근법은 작용의 특이성을 통해 증가된 효능뿐만 아니라 증가된 안전성에 대한 가능성을 제공한다. 총괄적으로, 본 명세서의 데이터는 CD28-기반 이중특이성 항체를 세미플리맙과 같은 임상적으로 검증된 PD-1 mAb와 조합하는 것이 현저하게 향상되고 상승적인 항-종양 활성을 갖는 내약성이 좋은(well-tolerated) 생물학적 해결책을 제공할 수 있음을 시사한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "EGFR" 및 "EGFR 단편"은 비-인간 종(예를 들어, "마우스 EGFR", "마우스 EGFR 단편", "원숭이 EGFR", "원숭이 EGFR 단편" 등)으로부터 유래되는 것으로 특정되지 않는 한, 잘 알려진 인간 EGFR 단백질 또는 이의 단편을 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서, 인간 EGFR은 NCBI 등록 번호 NP_005219.2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간 EGFR(등록 번호 005228.4의 아미노산 L25-A647)은 C-말단 CPGG.myc 에피토프(E1-L10).GlyGly.myc 에피토프(E1-L10).SerGly.6XHis.SSG 태그(서열번호 69)로 표시된다.
본 명세서에서 사용되는 "CD28"은 비-인간 종으로부터 유래되는 것으로 특정되지 않는 한, 공동자극 수용체로서 T 세포 상에서 발현되는 잘 알려진 인간 CD28 단백질을 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서, 인간 CD28은 NCBI 등록 번호 NP_006130.1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
"단리된" 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 벡터에는 이들이 생산되는 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 다른 항체 또는 항원-결합 단편, 지질, 탄수화물 또는 세포 찌꺼기 및 성장 배지와 같은 다른 물질을 포함한다. 단리된 항원-결합 단백질에는 숙주 세포 또는 이의 성장 배지로부터의 생물학적 분자와 같은 발현 시스템 성분이 추가로 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충액 또는 염의 부재 또는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함하는 약제학적 제형의 성분을 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
다음의 참조는 서열 분석에 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: BLAST 알고리즘: 문헌[Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J. C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J. M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff, M. O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O.Dayhoff(ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3.'' M. O.Dayhoff(ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D. J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; 및 Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y].
본 발명은 서열번호 6; 8; 10; 12; 14; 24; 34; 36; 38; 44; 46; 48; 54; 56 및/또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄(heavy chain: HC) 및 2개의 경쇄(light chain: LC)를 포함하는 면역글로불린 분자이다. 각각의 중쇄(HC)는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(예를 들어, IgG, IgG1 또는 IgG4)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄(LC)는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(예를 들어, 람다 또는 카파)을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework region: FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함하며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 CDR은 HCDR로 지칭될 수 있고, 경쇄 CDR은 LCDR로 지칭될 수 있다. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열세포 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다.
Y-형 IgG 항체의 항원-결합 암(예를 들어, CD28 또는 EGFR 결합 암)은 항원에 결합 특이성을 부여하는 항체의 구조적 부분을 지칭한다. 예를 들어, IgG 항체의 항원-결합 암은 경쇄(LC)와 관련된 중쇄(HC)를 가지고 있다.
예를 들어, 이중특이성인 항체는 제1 항원에 결합하는 암 및 제2 항원에 결합하는 또 다른 암을 포함한다. 예를 들어, EGFR×CD28 이중특이성 항체는 EGFR에 결합하는 1개의 암 및 CD28에 결합하는 다른 암을 포함한다.
이중특이성 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이성 항체)는 제1 항원에 결합하는 효과기 암(effector arm) 및 제2 항원에 결합하는 표적화 암(targeting arm)을 가질 수 있다. 효과기 암은 효과기 세포(예를 들어, T 세포) 상의 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-CD28)일 수 있다. 표적화 암은 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-EGFR 항체)일 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 효과기 암은 CD28에 결합하고, 표적화 암은 EGFR에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생적으로, 효소적으로 수득 가능한, 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 다중특이성 항원-결합 단편은 다중 항원에 결합한다(예를 들어, 단편이 이중특이성 항체인 경우 2개의 상이한 항원). 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 단백질 가수분해 소화 또는 재조합 유전 공학 기법과 같은 임의의 적합한 표준 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 단편의 비제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자; 및 (vi) dAb 단편을 포함한다.
항체의 항원-결합 단편은 본 발명의 실시형태에서 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성물일 수 있거나, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 또는 이의 프레임내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 관련된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치될 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있으며, VH - VH, VH - VL 또는 VL - VL 이량체를 함유한다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 도메인 및 불변 도메인의 비제한적이고 예시적인 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 위에 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 도메인 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나, 또는 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개(예를 들어, 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이의 가요성 또는 반-가요성 연결을 초래한다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해)과 비공유 회합으로 위에 열거된 임의의 가변 도메인 및 불변 도메인 구성의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 용어 "재조합" 항원-결합 단백질은 예를 들어, DNA 스플라이싱 및 형질전환 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술로서 당업계에 공지된 기술 또는 방법에 의해 생성, 발현, 단리 또는 수득된 이러한 분자를 지칭한다. 용어는 비-인간 포유동물(형질전환 비-인간 포유동물, 예를 들어, 형질전환 마우스를 포함) 또는 숙주 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 또는 세포 발현 시스템에서 발현되거나 또는 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 바와 같은 재조합 항원-결합 단백질을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하다(specifically binds)" 또는 "특이적으로 결합하다(binds specifically)"는 예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서 실시간, 무표지 생물-층 간섭 측정 검정(real time, label-free bio-layer interferometry assay), 예를 들어, Octet® HTX 바이오센서에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해, 또는 용액-친화도 ELISA에 의해 측정되는 바와 같은, 약 10-6 M(예를 들어, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M) 미만의 KD로 표현되는 EGFR 또는 CD28 단백질과 같은 항원에 대한 결합 친화도를 갖는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 지칭한다. "항-EGFR"은 항원-결합 단백질(또는 항원-결합 암과 같은 다른 분자), 예를 들어, EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하고, "항-CD28"은 항원-결합 단백질(또는 항원-결합 암과 같은 다른 분자), 예를 들어, CD28에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. "EGFR×CD28"은 항원-결합 단백질(또는 다른 분자), 예를 들어, EGFR 및 CD28(및 선택적으로 하나 이상의 다른 항원)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단을 지칭한다.
본 발명은 본 발명의 항원-결합 단백질과 동일한 EGFR 및 CD28 에피토프에 결합하는 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어 REGN7075(본 명세서에서 bsAb7075로도 지칭됨); REGN6321(본 명세서에서 bsAb6321로도 지칭됨); REGN6322(본 명세서에서 bsAb6322로도 지칭됨); REGN6323(본 명세서에서 bsAb6323로도 지칭됨)을 포함한다. 다른 항-EGFR×항-CD28 항원-결합 단백질은 표 9A, 표 9B 및 표 9C에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체의 EGFR HCVR 암의 아미노산 서열은 표 1에서 발견될 수 있는 반면, 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체의 CD28 HCVR 암의 아미노산 서열은 표 3에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 EGFR 모 항체는 WO2014/004427에 기술되어 있다. REGN7075, REGN6321, REGN6322 및 REGN6323의 EGFR HCVR 암과 CD28 HCVR 암의 아미노산 서열은 표 6에서 찾을 수 있다. 또한, 본 발명에 기재된 공통 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 표 6에서 찾을 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원-결합 단백질의 특정 항원-결합 부위, 예를 들어, 파라토프(paratope)로서 공지된 항체 분자의 가변 영역과 상호작용하는 항원 결정기(antigenic determinant)(예를 들어, EGFR 또는 CD28 상에서)를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원의 다른 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위 및/또는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역을 지칭할 수 있다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이며, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 선형 또는 입체형태, 즉, 비-선형 아미노산으로 구성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹인 결정기를 포함할 수 있으며, 소정의 실시형태에서, 특정 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 단편 또는 폴리펩타이드의 에피토프를 결정하는 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(문헌[Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63]), 펩타이드 절단 분석, 결정학적 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 게다가, 항원의 에피토프 제거(epitope excision), 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(문헌[Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496]). 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 단편 또는 폴리펩타이드)가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 질량 분광계에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 예를 들어, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemmistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A] 참조.
본 발명은 CD28 및 EGFR에 대한 결합에 대해 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, (예를 들어 REGN7075(본 명세서에서 bsAb7075로도 지칭됨); REGN6321(본 명세서에서 bsAb6321로도 지칭됨); REGN6322(본 명세서에서 bsAb6322로도 지칭됨); REGN6323(본 명세서에서 bsAb6323로도 지칭됨)뿐만 아니라 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 기재된 것들과 경쟁하는 항원-결합 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "경쟁하다"는 항원에 결합하고, 다른 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 항원에 대한 결합을 저해 또는 차단하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 또한 두 배향 모두에서 2개의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체, 즉, 항원에 결합하고 제2 항체에 의한 결합을 차단하는 제1 항체 간의 경쟁 및 그 반대의 경우를 포함한다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 경쟁은 하나의 이러한 배향에서 발생한다. 소정의 실시형태에서, 제1 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체) 및 제2 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 상이하지만, 예를 들어, 중첩 또는 비-중첩되는 에피토프에 결합할 수 있되, 하나의 결합은 예를 들어, 입체 장애를 통해 제2 항체의 결합을 저해 또는 차단한다. 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체) 간의 경쟁은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 실시간, 무표지 생물-층 간섭 측정 검정에 의해 측정될 수 있다. 또한, 항원-결합 단백질(예를 들어, 단일클론 항체(mAb)) 간의 결합 경쟁은 Octet RED384 바이오센서(폴 포르테바이오 코포레이션(Pall ForteBio Corp.))에서 실시간, 무표지 생물-층 간섭 측정 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
전형적으로, 어떤 식으로든 변형된 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 EGFR 및 CD28에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하며, 예를 들어, 활성이 몰 기준으로 표현될 때 EGFR 및 CD28 결합 활성(모 항체와 비교될 때)의 적어도 10%를 유지한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 항체로서 EGFR 및 CD28 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 보유한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환(항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존된 변이체"로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.
면역글로불린 사슬(예를 들어, REGN7075(본 명세서에서 bsAb7075로도 지칭됨); REGN6321(본 명세서에서 bsAb6321로도 지칭됨); REGN6322(본 명세서에서 bsAb6322로도 지칭됨); REGN6323(본 명세서에서 bsAb6323로도 지칭됨) VH, VL, HC 또는 LC 또는 본 명세서에 구체적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 이들의 CDR)과 같은 폴리펩타이드의 "변이체"는 본 명세서에 제시된(예를 들어, 임의의 서열번호 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22; 24; 26; 28; 30; 32; 34; 36; 38; 40; 42; 44; 46; 48; 50; 52; 54; 56; 또는 58 내지 67) 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 내지 99.9%(예를 들어, 적어도 70%, 72%, 74%, 75%, 76%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%) 동일하거나 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하며; 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때, 알고리즘의 매개변수는 각 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 선택된다(예를 들어, 예상 역치(expect threshold): 10; 단어 크기(word size): 3; 쿼리 범위(query range)에서 최대 매치(max match): 0; BLOSUM 62 매트릭스(matrix); 갭 코스트(gap cost): 기존(existence) 11, 연장(extension) 1; 조건부 조합 점수 매트릭스 조정(conditional compositional score matrix adjustment).
또한, 폴리펩타이드의 변이체는 아미노산 서열이 하나 이상의(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개) 돌연변이, 예를 들어, 하나 이상의 미스센스 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환), 넌-센스 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제외하고는 본 명세서에 구체적으로 제시된 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함할 수 있는 면역글로불린 사슬(예를 들어, REGN7075(본 명세서에서 bsAb7075로도 지칭됨); REGN6321(본 명세서에서 bsAb6321로도 지칭됨); REGN6322(본 명세서에서 bsAb6322로도 지칭됨); REGN6323(본 명세서에서 bsAb6323로도 지칭됨) VH, VL, HC 또는 LC 또는 이들의 CDR)과 같은 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 EGFR 결합 암 면역글로불린 경쇄(또는 VL) 변이체 및/또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 면역글로불린 중쇄(또는 VH) 변이체를 포함하는 CD28×EGFR 항원-결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, CD28×EGFR 항원-결합 단백질은 하나 이상의(예를 들어, 1개 또는 2개 또는 3개) 이러한 CDR이 이러한 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환) 중 하나 이상을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 변이체 및/또는 하나 이상의(예를 들어, 1개 또는 2개 또는 3개) 이러한 CDR이 이러한 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환) 중 하나 이상을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 변이체를 포함한다.
예를 들어, 본 명세서에 제시된 면역글로불린 사슬의 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 폴리펩타이드의 아미노산이 유사한 특성(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 하나 이상의 치환된 변이체를 지칭한다. 이러한 변화는 항체 또는 단편의 생물학적 활성을 현저하게 방해하지 않고 자주 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비필수적 영역에서 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 게다가, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 현저하게 방해할 가능성이 적다. 본 발명은 EGFR×CD28 및 항-EGFR 항원-결합 단백질 및/또는 이러한 보존적으로 변형된 변이체 면역글로불린 사슬을 포함하는 결합 암을 포함한다.
유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아마이드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다.
항원-결합 분자
본 발명의 항체는 단일특이성, 이중-특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tutt et aI., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244] 참조. 본 발명의 항-CD28 항체는 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 또는 이와 동시 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 제2 결합 특이성을 갖는 이중-특이성 또는 다중특이성 항체를 생성하기 위해 하나 이상의 다른 분자 독립체(entity), 예컨대 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의해)될 수 있다.
본 명세서에서 표현 "항-CD28 항체"의 사용은 단일특이성 항-CD28 항체뿐만 아니라 CD28-결합 암 및 표적 항원에 결합하는 제2 암을 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 면역글로불린의 한 암이 인간 CD28에 결합하고 면역글로불린의 다른 암이 표적 항원에 특이적인 이중특이성 항체를 포함한다. CD28 이중특이성 항체의 다른 암이 결합하는 표적 항원은 표적화된 면역 반응이 요구되는 세포, 조직, 기관, 미생물 또는 바이러스 상에서 또는 그 부근에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. CD28-결합 암은 본 명세서의 표 3 및 표 8에 제시된 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CD28-결합 암은 인간 CD28에 결합하고, 인간 T-세포 증식을 유도한다.
항체의 한 암이 CD28에 결합하고 다른 암이 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이성 항체의 맥락에서, 표적 항원은 EGFR과 같은 종양-관련 항원일 수 있다.
소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명은 CD28 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 분자는 예를 들어, "항-CD28/항-EGFR", 또는 "항-CD28×EGFR", 또는 "CD28×EGFR", 또는 "EGFR×CD28", 또는 "항-EGFR/항-CD28", 또는 "항-EGFR×CD28", 또는 "EGFR×CD28" 이중특이성 분자, 또는 "항-EGFR×항-CD28", 또는 "항-CD28×항-EGFR", 또는 다른 유사한 용어로 본 명세서에서 지칭될 수 있다.
소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 이중특이성 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이성 항체)는 효과기 암 및 표적화 암을 가질 수 있다. 효과기 암은 효과기 세포(예를 들어, T 세포) 상의 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 항체)일 수 있다. 표적화 암은 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-/EGFR 항체)일 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 효과기 암은 CD28에 결합하고, 표적화 암은 EGFR에 결합한다. 이중특이성 항-CD28/EGFR은 효과기 세포(예를 들어, T-세포)에 공동-자극 신호를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "항원-결합 분자"는 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 CDR 및/또는 프레임워크 영역(FR)과 조합하여, 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 항원-결합 분자는 항체 또는 항체의 단편이며, 이러한 용어는 본 명세서의 다른 곳에서 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "이중특이성 항원-결합 분자"는 적어도 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 의미한다. 이중특이성 항원-결합 분자 내의 각각의 항원-결합 도메인은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 CDR 및/또는 FR과 조합하여, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인은 제1 항원(예를 들어, CD28)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 제2의 별개의 항원(예를 들어, EGFR)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 소정의 예시적인 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체의 각각의 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인(HCVR) 및 경쇄 가변 도메인(LCVR)을 포함한다.
제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 형성하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 서로 연결될 수 있다. 대안적으로, 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 별도의 다량체화 도메인에 연결될 수 있다. 하나의 다량체화 도메인과 다른 다량체화 도메인의 회합은 2개의 항원-결합 도메인 사이의 회합을 촉진하여, 이중특이성 항원-결합 분자를 형성한다. 본 명세서에서 사용되는 "다량체화 도메인"은 동일하거나 유사한 구조 또는 구성의 제2 다량체화 도메인과 회합하는 능력을 갖는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 아미노산이다. 예를 들어, 다량체화 도메인은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 다량체화 성분의 비제한적인 예는 면역글로불린(CH2-CH3 도메인 포함)의 Fc 부분, 예를 들어, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 IgG뿐만 아니라 각 아이소타입 그룹 내의 임의의 알로타입(allotype)의 Fc 도메인이다.
본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 전형적으로 2개의 다량체화 도메인, 예를 들어, 별개의 항체 중쇄의 각각 개별적인 부분인 2개의 Fc 도메인을 포함할 것이다. 제1 및 제2 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4와 같은 동일한 IgG 아이소타입일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 등과 같은 상이한 IgG 아이소타입일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 다량체화 도메인은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 1개 내지 약 200개의 아미노산 길이의 Fc 단편 또는 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, 다량체화 도메인은 시스테인 잔기 또는 짧은 시스테인 함유 펩타이드이다. 다른 다량체화 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper), 헬릭스-루프 모티프(helix-loop motif) 또는 코일-코일 모티프(coiled-coil motif)를 포함하거나 또는 이로 구성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
임의의 이중특이성 항체 형식 또는 기술이 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 항원 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이중특이성 항원-결합 분자를 생성하기 위해 제2 항원-결합 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 독립체에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의해)될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 특정의 예시적인 이중특이성 형식은 제한 없이, 예를 들어, scFv-기반 또는 다이어바디 이중특이성 형식, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(dual variable domain: OVO)-Ig, 쿼드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knob-into-hole), 공통 경쇄(예를 들어, 놉-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), 크로스Mab, 크로스Fab, (SEEO)바디, 류신 지퍼, 오우오바디(Ouobody), IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab(OAF)-IgG 및 Mab2 이중특이성 형식을 포함한다(예를 들어, 문헌[Klein et al. 2012, mAb 4:6, 1-11] 및 전술한 형식의 검토를 위해 본 명세서에 인용된 참고 문헌 참조).
본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자의 맥락에서, 다량체화 도메인, 예를 들어, Fc 도메인은 야생형과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환), Fc 도메인의 자연 발생적 버전을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 Fc와 FcRn 사이에 변형된(예를 들어, 향상되거나 또는 감소된) 결합 상호작용을 갖는 변형된 Fc 도메인을 생성하는 Fc 도메인 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역에 변형을 포함하되, 변형은 산성 환경에서(예를 들어, 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는 예를 들어, 250의 위치(예를 들어, E 또는 Q); 250의 위치 및 428의 위치(예를 들어, L 또는 F); 252의 위치(예를 들어, LN/FIW 또는 T), 254의 위치(예를 들어, S 또는 T) 및 256의 위치(예를 들어, S/R/Q/EID 또는 T)에서의 변형; 또는 428의 위치 및/또는 433의 위치(예를 들어, UR/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434의 위치(예를 들어, H/F 또는 V)에서의 변형; 또는 250의 위치 및/또는 428의 위치에서의 변형; 또는 307의 위치 또는 308의 위치(예를 들어, 308F, V308F) 및 434의 위치에서의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591(예를 들어, V2591) 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다.
본 발명은 또한 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하되, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중-특이성 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이성 항체의 결합을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같은 단백질 결합을 감소 또는 폐지시키는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Y436F)을 더 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우에는 D16E, L 18M, N44S, K52N, V57M 및 V821(IMGT에 의함; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V4221); IgG2 항체의 경우에는 N44S, K52N 및 V821(IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N 및 V4221); 및 IgG4 항체의 경우에는 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V821(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V4221).
소정의 실시형태에서, Fc 도메인은 하나 이상의 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래되는 Fc 서열을 조합하는 키메라일 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 CH2 영역으로부터 유래되는 CH2 서열의 일부 또는 전부, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4로부터 유래되는 CH3 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 키메라 Fc 도메인은 또한 키메라 힌지 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "하부 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "상부 힌지" 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제시된 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 특정 예는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: [IgG4 CH1] - [IgG4 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. 본 명세서에 제시된 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 다른 실시예는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: [IgG1 CH1] - [IgG1 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. 본 발명의 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 이러한 및 다른 예는 WO2014/022540 A1에 기술되어 있고, 이러한 일반 구조적 배열 및 이의 변이체를 갖는 키메라 Fc 도메인은 변경된 Fc 수용체 결합을 가질 수 있으며, 이는 결국 Fc 효과기 기능에 영향을 미친다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 본 명세서에 구체적으로 제시된 아미노산 서열(및 이의 변이체)뿐만 아니라 항체 또는 단편에 대한 세포 및 시험관내 번역후 변형을 포함하는 면역글로불린 사슬을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 제시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 EGFR 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편뿐만 아니라, 하나 이상의 아스파라긴, 세린 및/또는 트레오닌 잔기가 글리코실화되고, 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 탈아미드화되고, 하나 이상의 잔기(예를 들어, Met, Trp 및/또는 His)가 산화되고, N-말단 글루타민이 피로글루타메이트(pyroE)이고/이거나 C-말단 라이신 또는 다른 아미노산이 없는 항체 및 단편을 포함한다.
상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 분자 및 항-EGFR 항원-결합 암
본 발명은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 EGFR 결합 암뿐만 아니라 하나 이상의 CD28 결합 암을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
EGFR 결합 암은 단백질에 EGFR 결합을 부여하는 다중특이성 항원-결합 단백질의 부분이다. 본 발명의 실시형태에서, 이중특이성 항체 REGN7075, REGN6321, REGN6322 또는 REGN6323의 EGFR 결합 암은 EGFR에 대한 EGF 결합을 차단하며, 본 발명의 다른 실시형태에서, EGFR 결합 암은 EGFR에 대한 EGF 결합을 차단하지 않는다. 예를 들어, Y-형 IgG 항체의 EGFR-결합 암은 EGFR에 결합 특이성을 부여하는 항체의 구조적 부분을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, EGFR 결합 암은 HCDR1, LCDR1, HCDR2, LCDR2, HCDR3 및 LCDR3; HCVR(VH) 및 LCVR(VL) 및/또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 HC 및 LC를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, EGFR 결합 암은 본 명세서 또는 국제 공개 WO2014/004427에 제시된, 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)의 조합을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 면역글로불린 및 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 조합을 포함하는 VL을 포함하는 상응하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다.
"085N"; "086N"; "089N"; "102N"; "103N"; "116N"; "134P"; "136P"; "141P"; "142P"; "143P"; "144P"; "145P"; "147P"; "151P"; "153P"; "155P"; "157P"; "158P"; "159P"; "161P"; "163P"; "169P" 및 "171P"은 WO2014/004427에 기재된 여러 항-EGFR 단일특이성 항체의 식별 번호를 지칭한다. 이러한 항체의 HCVR 암은 EGFR을 발현하는 종양 세포 및 CD28을 발현하는 T 세포를 표적으로 하는 이중특이성 항체를 제조하기 위해 표 3에 기재된 바와 같은 HCVR 아미노산 서열을 갖는 항-CD28 암 및 표 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 공통 경쇄와 조합하여 사용될 수 있다. 각각 "bsAb7075", "bsAb6321", "bsAb6322" 또는 "bsAb6323"으로도 지칭되는 "REGN7075", "REGN6321", "REGN6322" 또는 "REGN6323"은 본 명세서의 표 1, 표 6 및 표 8에 제시된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 또는 전장 중쇄(또는 이의 변이체) 및 본 명세서의 표 1, 표 6 및 표 8에 제시된 상응하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 또는 전장 경쇄(또는 이의 변이체)를 포함하거나, 또는 이의 CDR(HCDR1(또는 이의 변이체), HCDR2(또는 이의 변이체) 및 HCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 VH 및 이의 CDR(LCDR1(또는 이의 변이체), LCDR2(또는 이의 변이체) 및 LCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 상응하는 VL을 포함하는 EGFR 결합 암을 포함하는 이중특이성 항체를 지칭하되, 예를 들어, 가변 영역 및/또는 CDR은 본 명세서에 기재된 특정 아미노산 서열을 포함하고, 변이체가 아니다. 이러한 VH는 CDR-H가 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있고/있거나 이러한 VL은 CDR-L은 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 EGFR 결합 암은 EGFR×CD28 다중특이성 항원-결합 단백질의 맥락에서, 예를 들어, 085N×14226P2로 지칭될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, VH는 IgG 불변 중쇄 도메인(예를 들어, IgG1 또는 IgG4(예를 들어, S228P 돌연변이 포함))에 연결되고/되거나 VL은 람다 또는 카파 불변 경쇄 도메인에 연결된다.
본 발명은 또한 EGFR 단백질 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, EGFR의 세포외 도메인)에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 인간 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체) 및 이의 항원-결합 단편과 같은 항원-결합 단백질을 제공한다. EGFR 상의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 본 명세서에 제시된 임의의 항원-결합 단백질과 EGFR에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질은 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 항-EGFR 항체 및 이의 항원-결합 단편은 085N; 086N; 089N; 102N; 103N; 116N; 134P; 136P; 141P; 142P; 143P; 144P; 145P; 147P; 151P; 153P; 155P; 157P; 158P; 159P; 161P; 163P; 169P; 171P의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), VH 또는 전장 면역글로불린 서열; 본 명세서 또는 WO2014/004427(또는 이의 변이체)에 제시된 바와 같은 mAb12999P2, mAb13008P2, mAb35193P2, mAb13006P2, REGN7075, REGN6321, REGN6322 또는 REGN6323 EGFR 결합 암; 및/또는 085N; 086N; 089N; 102N; 103N; 116N; 134P; 136P; 141P; 142P; 143P; 144P; 145P; 147P; 151P; 153P; 155P; 157P; 158P; 159P; 161P; 163P; 169P; 171P의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3), VL 또는 전장 면역글로불린 서열; 본 명세서 또는 WO2014/004427(또는 이의 변이체)에 제시된 바와 같은 mAb12999P2, mAb13008P2, mAb35193P2, mAb13006P2, REGN7075, REGN6321, REGN6322 또는 REGN6323 EGFR 결합 암을 포함하는 것들을 포함한다.
"REGN7075", "REGN6321", "REGN6322" 또는 "REGN6323"은 또한 본 명세서에 제시된 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 또는 전장 중쇄(또는 이의 변이체); 및 본 명세서에 제시된 상응하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 또는 전장 경쇄(또는 이의 변이체)를 포함하는 항-EGFR 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일특이성 항체 및 단편); 또는 이의 CDR(HCDR1(또는 이의 변이체), HCDR2(또는 이의 변이체) 및 HCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 VH 및 이의 CDR(LCDR1(또는 이의 변이체), LCDR2(또는 이의 변이체) 및 LCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 상응하는 VL을 포함하는 것을 지칭할 수 있되, 예를 들어, 가변 영역 및/또는 CDR은 본 명세서에 기재된 특정 아미노산 서열을 포함하고, 변이체가 아니다. 이러한 VH는 CDR-H가 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있고/있거나 이러한 VL은 CDR-L이 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, VH는 IgG 불변 중쇄 도메인(예를 들어, IgG1 또는 IgG4)에 연결하고/하거나 VL 람다 또는 카파 불변 경쇄 도메인에 연결된다.
항원-결합 단백질 REGN7075, REGN6321, REGN6322 및 REGN6323은 EGFR(및/또는 하나 이상의 상이한 항원 또는 상이한 EGFR 에피토프)에 결합하는 하나의 HCVR 암을 갖고, T 세포 상의 CD28에 결합하는 하나의 HCVR 암을 갖는 이중특이성 항-EGFR 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)이다.
REGN7075, REGN6321, REGN6322 및 REGN6323의 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열은 아래에 제시된다:
REGN7075의 EGFR 성분
모 EGFR mAb12999P2로부터의 EGFR 암의 HCVR:
Figure pct00001
(서열번호 2; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-H1: G D S I I T F Y(서열번호 4)
CDR-H2: I Y Y S G I T(서열번호 6)
CDR-H3: A R V S E D S Y F H Y G M D V(서열번호 8)
이중특이성 항체 REGN7075의 EGFR 암의 전장 중쇄
Figure pct00002
(서열번호 24)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 REGN7075의 LCVR
Figure pct00003
(서열번호 16; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 둘 다의 전장 경쇄
Figure pct00004
(서열번호 28)
REGN6321의 EGFR 성분
모 EGFR mAb13008P2로부터의 EGFR 암의 HCVR
Figure pct00005
(서열번호 30; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-H1: G F T F S T F I(서열번호 32)
CDR-H2: I S S N G G T I(서열번호 34)
CDR-H3: T R G G D F W S G Y Y P F D Y(서열번호 36)
이중특이성 항체 REGN6321의 EGFR 암의 전장 중쇄
Figure pct00006
(서열번호 38)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 REGN6321의 LCVR
Figure pct00007
(서열번호 16; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 둘 다의 전장 경쇄
Figure pct00008
(서열번호 28)
REGN6322의 EGFR 성분
모 EGFR mAb35193P2로부터의 EGFR 암의 HCVR:
Figure pct00009
(서열번호 40; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-H1: G F S F R D A W(서열번호 42)
CDR-H2: I R N K I D G G T T(서열번호 44)
CDR-H3: T T D I W N Y V L F Y Y Y G L D V(서열번호 46)
이중특이성 항체 REGN6322의 EGFR 암의 전장 중쇄
Figure pct00010
(서열번호 48)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 REGN6322의 LCVR
Figure pct00011
(서열번호 16; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 둘 다의 전장 경쇄
Figure pct00012
(서열번호 28)
REGN6323의 EGFR 성분
모 EGFR mAb13006P2로부터의 EGFR 암의 HCVR:
Figure pct00013
(서열번호 50; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-H1: D D S I I S Y Y(서열번호 52)
CDR-H2: I Y Y S G R T(서열번호 54)
CDR-H3: A R V S E D S Y Y H Y G M D V(서열번호 56)
이중특이성 항체 REGN6323의 EGFR 암의 전장 중쇄
Figure pct00014
(서열번호 58)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 REGN6323의 LCVR
Figure pct00015
(서열번호 16; CDR 밑줄 표시됨)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
EGFR 및 CD28 모 항체 및 이중특이성 항체 둘 다의 전장 경쇄
Figure pct00016
(서열번호 28)
본 발명의 실시형태에서, mAb12999P2, mAb13008P2, mAb35193P2 또는 mAb13006P2 중쇄는 다음으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 쌍을 이룬다:
Figure pct00017
(서열번호 16);
및
Figure pct00018
(서열번호 67).
CD28(분화 클러스터 28) 결합 암
본 발명은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 CD28 결합 암뿐만 아니라 하나 이상의 EGFR 결합 암을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
CD28 결합 암은 단백질에 CD28 결합을 부여하는 다중특이성 항원-결합 단백질의 부분이다. 예를 들어, Y-형 IgG 항체의 CD28-결합 암은 CD28에 결합 특이성을 부여하는 항체의 구조적 부분을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, CD28 결합 암은 HCDR1, LCDR1, HCDR2, LCDR2, HCDR3 및 LCDR3; HVCR(VH) 및 LCVR(VL) 및/또는 CD28에 특이적으로 결합하는 HC 및 LC를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CD28 결합 암은 본 명세서에 제시된 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)의 조합을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 면역글로불린 및 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 조합을 포함하는 VL을 포함하는 상응하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, CD28 결합 암은 본 명세서에 제시된 중쇄 가변 영역(VH) 및 상응하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
모 항-CD28 항체 14226P2, 14193P2 및 14216P2의 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열이 아래에 제시된다:
이중특이성 항체를 제조하는데 사용되는 모 CD28 mAb
mAb14226P2
mAb14226P2의 HCVR
Figure pct00019
(서열번호 10)
CDR-H1: GGSISSYY(서열번호 12)
CDR-H2: IYYSGIT(서열번호 6)
CDR-H3: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14)
mAb14226P2의 전장 중쇄
Figure pct00020
(서열번호 26)
mAb14226P2의 LCVR
Figure pct00021
(서열번호 16)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
mAb14226P2의 전장 경쇄
Figure pct00022
(서열번호 28)
mAb14193P2
mAb14193P2의 HCVR
Figure pct00023
(서열번호 59)
CDR-H1: GFTFSSYG(서열번호 60)
CDR-H2: ISYAGNNK(서열번호 61)
CDR-H3: AKDSYYDFLTDPDVLDI(서열번호 62)
mAb14193P2의 LCVR
Figure pct00024
(서열번호 16)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
mAb14216P2
mAb14216P2의 HCVR
Figure pct00025
(서열번호 63)
CDR-H1: GFTFSRNN(서열번호 64)
CDR-H2: ISSNGGRT(서열번호 65)
CDR-H3: TRDDELLSFDY(서열번호 66)
mAb14216P2의 LCVR
Figure pct00026
(서열번호 16)
CDR-L1: QSVSSSY(서열번호 18)
CDR-L2: GAS(서열번호 20)
CDR-L3: QQYGSSPWT(서열번호 22)
본 발명의 실시형태에서, 14226P2, 14193P2 또는 14216P2 중쇄는 다음으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 쌍을 이룬다:
Figure pct00027
(서열번호 16);
및
Figure pct00028
(서열번호 67).
"14226P2", "14193P2" 또는 "14216P2" 또는 "mAb14226P2", "mAb14193P2" 또는 "mAb14216P2"는 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체의 CD28 암이 얻어지는 모 단일특이성 항체를 지칭한다. 본 명세서에 제시된 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 또는 전장 중쇄(또는 이의 변이체); 및 본 명세서에 제시된 상응하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 또는 전장 경쇄(또는 이의 변이체)를 포함하는 CD28 결합 암; 또는 이의 CDR(HCDR1(또는 이의 변이체), HCDR2(또는 이의 변이체) 및 HCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 VH 및 이의 CDR(LCDR1(또는 이의 변이체), LCDR2(또는 이의 변이체) 및 LCDR3(또는 이의 변이체))을 포함하는 상응하는 VL을 포함하는 것, 예를 들어, 가변 영역 및/또는 CDR은 본 명세서에 기재된 변이체가 아닌 특정 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 VH는 CDR-H가 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있고/있거나 이러한 VL은 CDR-L이 변이체가 아닌 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 CD28 결합 암은 EGFR×CD28 다중특이성 항원-결합 단백질의 맥락에서, 예를 들어, 085N×14226P2로 지칭될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, VH는 IgG 불변 중쇄 도메인(예를 들어, IgG1 또는 IgG4)에 연결되고/되거나 VL은 람다 또는 카파 불변 경쇄 도메인에 연결된다.
본 발명은 또한 CD28 단백질 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, CD28의 세포외 도메인)에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 인간 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체) 및 이의 항원-결합 단편과 같은 항원-결합 단백질을 제공한다. CD28 상의 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 본 명세서에 제시된 임의의 항원-결합 단백질과 CD28에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질이 또한 본 발명의 일부이다.
T-세포의 표면의 CD28에 결합하고, T-세포의 활성화 및/또는 증식을 향상시키는 CD28 신호전달을 작동시키는 본 발명의 다중특이성 EGFR×CD28 항원-결합 단백질은 본 명세서에서, "공동-자극" 또는 "공동자극"으로 지칭될 수 있다. T-세포 활성화는 T-세포 수용체(TCR)/CD3 복합체가 펩타이드-MHC 복합체("신호 1")에 결합할 때 시작되고; 그 다음, 활성화는 표적 세포("신호 2") 상의 동족 리간드(들)에 결합하는 T-세포 상의 CD28 수용체와 같은 제2 "공동-자극" 수용체의 결합에 의해 향상된다. 예를 들어, CD28 이중-특이성 항체에 의한 T-세포의 활성화는 TCR/CD3 복합체에 의한 내인성 종양 항원 인식에 대한 반응으로, 또는 CD3-이중특이성을 통한 "신호 1" 활성화에 대한 반응으로 신호의 증폭에 의해 야기될 수 있다.
다중특이성 항원-결합 단백질
본 발명은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이고, 적어도 EGFR 및 CD28에 결합하는 항원-결합 단백질을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 이러한 항체는 A×B 형식으로 지칭되되, A는 EGFR에 결합하는 다중특이성 분자의 결합 암을 지칭하고, B는 CD28에 결합하는 다중특이성 분자의 결합 암을 지칭하며, 또는 그 반대도 마찬가지이다. EGFR×CD28 또는 CD28×EGFR은 EGFR 및 CD28에 결합하는 다중특이성 항원 결합 단백질을 지칭한다. 다중특이성 항원-결합 단백질에서 특정 EGFR 및 CD28 결합 암은 또한 A×B 형식으로 지정될 수 있되, A는 특정 암을 지칭하고, B는 다른 특정 암을 지칭한다. 예를 들어, 085N×14226P2는 본 명세서에 제시된 바와 같은 085N의 항-EGFR 결합 암 및 본 명세서에 제시된 바와 같은 14426P2의 항-CD28 결합 암을 갖는 다중특이성 항원-결합 단백질이다. 예를 들어, 085N은 085N 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 또는 이의 가변 영역 또는 서열이 본 명세서에 구체적으로 제시되거나 또는 이의 변이체인 이의 CDR을 포함하는 결합 암이다.
소정의 실시형태에서, 다중특이성 항원-결합 단백질은 이중특이성 항원-결합 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 표현 "이중특이성 항원-결합 단백질"은 적어도 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 의미한다. 이중특이성 항원-결합 분자 내의 각각의 항원-결합 도메인은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 CDR 및/또는 FR과 조합하여 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인은 제1 항원(예를 들어, CD28)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 제2의 별개의 항원(예를 들어, EGFR)에 특이적으로 결합한다.
다중특이성 결합은 동일하거나 또는 상이한 항원 상에 있을 수 있는 2개 이상의 상이한 에피토프(EGFR 및 CD28 이상)에 대한 결합을 지칭한다. 다중특이성은 이중특이성, 삼중특이성 및 사중특이성을 포함한다.
본 발명은 임의의 다음의 다중특이성 항원-결합 단백질(예를 들어, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 포함한다: REGN7075, REGN6321, REGN6322, REGN6323뿐만 아니라 표 1의 임의의 EGFR HCVR 암(예를 들어, 모 단일클론 항체 mAb12999P2, mAb13008P2, mAb35193P2 및 mAb13006P2의 HCVR 암)과 표 3의 임의의 CD28 HCVR 암(예를 들어, 모 mAb14226, mAb14193 및 mAb14216의 HCVR 암)을 조합하여 제조된 이중특이성 항체 및 본 명세서에 제시된 바와 같은 이의 사용 방법.
폴리뉴클레오타이드 및 제조 방법
본 명세서에 제시된 임의의 EGFR×CD28 다중특이성 항원-결합 단백질 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및/또는 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 항원-결합 단백질을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)와 마찬가지로 본 발명의 일부를 형성한다.
폴리뉴클레오타이드 DNA 및 RNA를 포함한다. 본 발명은 예를 들어, 선택적으로, 프로모터 또는 다른 발현 대조군 서열에 작동 가능하게 연결된 EGFR 결합 암 및/또는 CD28 결합 암의 면역글로불린 VH, VL, CDR-H, CDR-L, HC 또는 LC를 암호화하는 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 표 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 및 표 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA)를 제공한다.
본 발명은 선택적으로 프로모터 또는 다른 발현 대조군 서열 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 15, 17, 19, 21, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 43, 45, 49, 51, 53 및/또는 55에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일반적으로, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서(예를 들어, 직접적으로 또는 다른 프로모터-결합 단백질 또는 물질을 통해) RNA 폴리머레이스에 결합할 수 있고, 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 인핸서 및 억제자 서열을 포함하는 다른 발현 대조군 서열 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터(미국 특허 제5,385,839호 및 제5,168,062호), SV40 조기 프로모터 영역(문헌[Benoist, et al., (1981) Nature 290:304-310]), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 포함되는 프로모터(문헌[Yamamoto, et al., (1980) Cell 22:787-797]), 헤르페스 티미딘 카이네이스 프로모터(문헌[Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(문헌[Brinster, et al., (1982) Nature 296:39-42]); 베타-락타메이스 프로모터와 같은 원핵생물 발현 벡터(문헌[VIIIa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731]) 또는 tac 프로모터(문헌[DeBoer, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25]); 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American (1980) 242:74-94]도 참조; 및 효모 또는 다른 진균류로부터의 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, ADC(alcohol dehydrogenase: 알코올 데하이드로게네이스) 프로모터, PGK(phosphoglycerol kinase: 포스포글리세롤 카이네이스) 프로모터 또는 알칼라인 포스파테이스 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 또는 다른 발현 시스템에서, 서열이 코딩 서열의 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 RNA 폴리머레이스 매개 전사를 지시할 때 프로모터 또는 다른 발현 대조군 서열에 "작동 가능하게 연결"되어 있으며, 이는 이후 RNA 스플라이싱(인트론을 포함하는 경우)되고, 선택적으로, 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 수 있다.
본 발명은 뉴클레오타이드 서열이 본 명세서에 구체적으로 제시된 것의 변이체인 면역글로불린 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 "변이체"는 본 명세서에 제시된 참조된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 약 70% 내지 99.9%(예를 들어, 70%, 72%, 74%, 75%, 76%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며; 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때, 알고리즘의 매개변수가 각 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 선택된다(예를 들어, 예상 역치: 10; 단어 크기: 28; 쿼리 범위의 최대 매치: 0; 매치/미스매치 점수: 1, -2; 갭 코스트: 선형). 본 발명의 실시형태에서, 본 명세서에 구체적으로 제시된 뉴클레오타이드 서열의 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 하나 이상의(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개) 점 돌연변이, 삽입(예를 들어, 프레임내 삽입) 또는 결실(예를 들어, 프레임내 결실)을 포함한다. 이러한 돌연변이는 본 발명의 실시형태에서, 미스센스 또는 넌센스 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 EGFR 결합 암 및/또는 CD28 결합 암에 통합될 수 있는, 즉, 단백질이 EGFR 및/또는 CD28에 대한 특이적 결합을 유지하도록 하는 면역글로불린 폴리펩타이드 사슬을 암호화한다.
포유동물 세포를 포함하는 진핵생물 및 원핵생물 숙주 세포는 항-EGFR 및 EGFR×CD28 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 또는 이의 항원 결합 암의 발현을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 것이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 입수 가능하다. 이러한 숙주 세포는 특히 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(monkey kidney cell: COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)), 양서류 세포, 세균 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 예를 들어, 피키아(Pichia), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta)(오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 테르모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 안세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질루스 니두란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질루스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 룩크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함하는 효모 및 사상균 세포를 포함한다. 본 발명은 항-EGFR 항체(예를 들어, WO2014/004427에서 발견되는 EGFR 항체) 또는 본 발명의 항-EGFR×항-CD28 항원-결합 단백질, 예컨대 REGN7075; REGN6321; REGN6322; REGN6323 및 표 9A, 표 9B 또는 표 9C에 나타나 있는 항-EGFR×항-CD28 항원-결합 단백질 또는 이의 면역글로불린(Ig) 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단백질의 EGFR 결합 암 및 CD28 결합 암을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 위에 제시된 임의의 유형의 숙주 세포)를 포함한다.
본 발명은 또한 EGFR 및/또는 CD28 또는 EGFR×CD28에 의해 결합되는 이의 항원성 단편 또는 융합체(예를 들어, His6(서열번호 68), Fc 및/또는 myc)를 발현하는 세포 및/또는 본 발명의 항-EGFR 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 예를 들어, REGN7075, REGN6321, REGN6322, REGN6323뿐만 아니라 표 1(예를 들어, 모 단일클론 항체 mAb12999P2, mAb13008P2, mAb35193P2 및 mAb13006P2의 HCVR 암)의 임의의 EGFR HCVR 암과 표 3(예를 들어, 모 mAb14226, mAb14193 및 mAb14216의 HCVR 암)의 임의의 CD28 HCVR 암을 조합하여 제조되는 이중특이성 항체 또는 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 나타나 있는 임의의 이중특이성 항체를 포함하되, 예를 들어, 세포는 대상체 체내에 있거나 또는 시험관내에 있다.
게다가, 본 발명은 또한 EGFR×CD28을 포함하는 복합체, 및/또는 EGFR 및/또는 CD28 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편 또는 이의 융합체 및/또는 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 검출 가능하게 표지된 2차 항체)과 복합체화된 본 명세서에 논의된 바와 같은 본 발명의 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 실시형태에서, 복합체는 시험관내(예를 들어, 고체 기질에 고정됨)에 있거나 또는 대상체의 체내에 있다. 본 발명의 실시형태에서, EGFR은 종양 세포의 표면 상에 있고, CD28은 면역 세포, 예를 들어, T-세포의 표면 상에 있다. 본 발명의 실시형태에서, T-세포는 활성화된다.
당업계에 공지된 재조합 항체를 생산하는 몇 가지 방법이 있다. 항체의 재조합 생산 방법의 한 예는 US4816567에 개시되어 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개성 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개성 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공법, 리포솜으로의 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 생물학적 주사 및 DNA의 핵으로의 직접 미세주사를 포함한다. 게다가, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4399216호; 제4912040호; 제4740461호 및 제4959455호 참조.
본 발명은 다음을 포함하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 면역글로불린 사슬과 같은 본 발명의 항-EGFR×항-CD28(예를 들어, REGN7075, REGN6321, REGN6322 또는 REGN6323) 항원-결합 단백질을 제조하기 위한 재조합 방법을 포함한다:
(i) 예를 들어, EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질의 항원 결합 암을 암호화하는 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 있고/있거나 숙주 세포 염색체에 통합되고/되거나 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계;
(ii) 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건하에서 숙주 세포(예를 들어, CHO 또는 피키아 또는 피키아 파스토리스)를 배양하는 단계; 및
(iii) 선택적으로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장한 배지로부터 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편) 또는 사슬을 단리하는 단계. 본 발명은 또한 본 명세서에 제시된 생산 방법 및 선택적으로, 본 명세서에 제시된 정제 방법의 생성물인 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같은 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항원-결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, EGFR×CD28(예를 들어, REGN7075, REGN6321, REGN6322 또는 REGN6323) 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법은 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 침전 및/또는 여과에 의해 항원-결합 단백질을 정제하는 방법을 포함한다. 논의된 바와 같이, 이러한 방법의 생성물은 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
서열 변이체
항체 및 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 개별 항원-결합 도메인이 유래되는 상응하는 생식계열세포 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본 명세서에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공개 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식세포주 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 본 명세서에 개시된 임의의 예시적인 아미노산 서열로부터 유래되는 항원-결합 단편을 포함할 수 있되, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래되는 생식계열세포 서열의 상응하는 잔기(들) 또는 다른 인간 생식계열세포 서열의 상응하는 잔기(들) 또는 상응하는 생식계열세포 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본 명세서에서 집합적으로 "생식계열세포 돌연변이"로 지칭됨). 당업자는 본 명세서에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여 하나 이상의 개별 생식계열세포 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 소정의 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항원-결합 도메인이 원래 유래되는 원래의 생식계열세포 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 소정의 잔기만, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식계열세포 서열로 다시 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상이 상이한 생식계열세포 서열(즉, 항원-결합 도메인이 원래 유래되는 생식세포주 서열과 상이한 생식계열세포 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 항원-결합 도메인은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개의 이상 생식계열세포 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있되, 예를 들어, 소정의 개별 잔기는 특정 생식세포주 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면, 원래의 생식세포주 서열과 상이한 소정의 다른 잔기는 유지되거나 또는 상이한 생식계열세포 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식계열세포 돌연변이를 함유하는 항원-결합 도메인은 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선된 또는 향상된 길항적 또는 효능적 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 목적하는 특성에 대해 쉽게 테스트될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 얻어진 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자는 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본 명세서에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 바꾸지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 다음을 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아마이드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당히 보존적"인 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. 아미노산 서열을 지칭할 때 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬될 때, 2개의 아미노산 서열이 적어도 95% 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. BioI. 24: 307-331] 참조.
서열 동일성이라고도 지칭되는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정을 사용하여 유사한 서열을 매칭한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 종의 유기체로부터의 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 간의 상동성 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 매개변수와 함께 사용될 수 있는 GAP 및 Bestfit와 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인 디폴트 또는 권장 매개변수를 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 서열과 검색 서열 사이에서 가장 잘 중첩되는 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(상기 문헌[Pearson (2000)]). 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. BioI. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402] 참조.
Fc 변이체를 포함하는 항체
본 발명의 소정의 실시형태에 따르면, 예를 들어, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 향상 또는 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항원 결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 분자를 포함하되, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는 예를 들어, 다음을 포함한다:
Figure pct00029
250번 위치(예를 들어, E 또는 Q);
Figure pct00030
250번 위치 및 428번 위치(예를 들어, L 또는 F);
Figure pct00031
252번 위치(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T),
Figure pct00032
254번 위치(예를 들어, S 또는 T) 및/또는
Figure pct00033
256번 위치(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)
에서의 변형; 또는
Figure pct00034
428번 위치 및/또는 433번 위치(예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는
Figure pct00035
434번 위치(예를 들어, H/F 또는 Y)
에서의 변형; 또는
Figure pct00036
250번 위치 및/또는 428번 위치
에서의 변형; 또는
Figure pct00037
307번 위치 또는 308번 위치(예를 들어, 308F, V308F) 및/또는
Figure pct00038
434번 위치
에서의 변형.
일 실시형태에서, 변형은 다음을 포함한다:
Figure pct00039
428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형;
Figure pct00040
428L, 259I(예를 들어, V259I) 및 308F(예를 들어, V308F) 변형;
Figure pct00041
433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형;
Figure pct00042
252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T 및 256E) 변형;
Figure pct00043
250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및/또는
Figure pct00044
307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P).
예를 들어, 본 발명은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 EGFR×CD28 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다:
Figure pct00045
250Q 및 248L(예를 들어, T250Q 및 M248L);
Figure pct00046
252Y, 254T 및 256E(예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E);
Figure pct00047
428L 및 434S(예를 들어, M428L 및 N434S); 및
Figure pct00048
433K 및 434F(예를 들어, H433K 및 N434F).
전술한 Fc 도메인 돌연변이의 모든 가능한 조합 및 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이는 본 발명의 범위 내에 상정된다.
항체 및 항원-결합 분자의 생물학적 특성
본 발명은 높은 친화도로 인간 CD28 및 EGFR에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 목적하는 치료 내용 및 특정 표적화 특성에 따라 중간 또는 낮은 친화도로 인간 CD28 및/또는 EGFR에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 이중특이성 항원-결합 분자의 맥락에서, 하나의 암은 CD28에 결합하고, 다른 암은 표적 항원(예를 들어, EGFR)에 결합하며, 표적 항원-결합 암은 높은 친화도로 표적 항원에 결합하는 반면 항-CD28 암은 중간 또는 낮은 친화도로만 CD28에 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 항원-결합 분자의 우선적인 표적화는 일반적인/비표적화된 CD28 결합 및 이와 관련된 결과적인 유해한 부작용을 피하면서 달성될 수 있다.
소정의 실시형태에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1 및 실시예 13에 정의된 바와 같은 검정 형식을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 200nM 미만의 KD로 인간 CD28(예를 들어, 25℃에서)에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1 및 실시예 13에 정의된 바와 같은 검정 형식 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 100nM 미만, 약 90nM 미만, 약 80nM 미만, 약 60nM 미만, 약 40nM 미만, 약 30nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만 또는 5nM 미만의 KD 로 CD28에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 약 5nM 내지 약 20nM의 KD로 CD28에 결합한다.
본 발명은 또한 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1 및 실시예 13에 정의된 바와 같은 검정 형식 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 3분 초과의 해리 반감기(dissociative half-life)(t½)로 CD28에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1 및 실시예 13에 정의된 바와 같은 검정 형식 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 200분 초과, 약 300분 초과, 약 400분 초과, 약 500분 초과, 약 600분 초과, 약 700분 초과, 약 800분 초과, 약 900분 초과, 약 1000분 초과 또는 약 1200분 초과의 t½로 CD28에 결합한다.
본 발명은 인간 CD28 및 인간 EGFR에 동시에 결합할 수 있는 이중특이성 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이성 항체)를 포함한다. 소정의 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 CD28 및/또는 EGFR을 발현하는 세포와 특이적으로 상호작용한다. 이중특이성 항원-결합 분자가 CD28 및/또는 EGFR을 발현하는 세포에 결합하는 정도는 본 명세서의 실시예 10A 및 실시예 10B에 예시된 바와 같이 형광 활성화된 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS)에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 CD28은 발현하지만 EGFR은 발현하지 않는 인간 세포주(예를 들어, 주캇 세포) 및 EGFR은 발현하지만 CD28은 발현하지 않는 인간 난소암 세포주(예를 들어, PEO1)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 1×10-5 M 미만의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포 또는 사이노몰구스 T-세포에 결합한다. 일부 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 1×10-12 M 내지 1×10-5 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포 또는 사이노몰구스 T-세포에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 1×10-9 M 내지 1×10-5 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포 또는 사이노몰구스 T-세포에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 약 2.5×10-8 M 미만의 EC50으로 EGFR을 발현하는 세포주의 표면에 결합한다. 세포 또는 세포주의 표면에 대한 이중특이성 항원 결합 분자의 결합은 실시예 10A 및 실시예 10B에 기재된 바와 같은 시험관내 FACS 결합 검정에 의해 측정될 수 있다.
예를 들어, 변이체 면역글로불린 사슬을 포함하는 본 명세서에 제시된 EGFR×CD28 항원-결합 단백질은 다음 중 하나 이상의 특성을 나타낼 수 있다:
- CD34+ 세포(예를 들어, 태아 간 CD34+ 세포)가 생착된 마우스(예를 들어, VH 마우스(Rag2널(null)/γc 널/huSirp-a/huTPO))에서 인간 종양 세포(예를 들어, A431 종양 세포)의 성장 및/또는 생존의 감소; 선택적으로, EGFR×CD28은 PD1 길항제(예를 들어, 세미플리맙과 같은 항-PD1)와 함께 투여됨;
- 인간 PBMC(예를 들어, 종양 세포와 혼합된 인간 PBMC는 피하로 마우스에 이식됨)를 포함하는 마우스(예를 들어, (NOD/SCID/γc 널))에서 인간 종양 세포(예를 들어, A431 종양 세포)의 성장 및/또는 생존의 감소; 선택적으로 EGFR×CD28은 PD1 길항제(예를 들어, 세미플리맙과 같은 항-PD1)와 함께 투여됨;
- 인간 PBMC(예를 들어, 인간 PBMC는 복강내로 이식되고, 종양 세포는 피하로 마우스에 이식됨)를 포함하는 마우스(예를 들어, NOD/SCID/γc 널)에서 인간 종양 세포(예를 들어, A549 종양 세포)의 성장 및/또는 생존의 감소; 선택적으로 EGFR×CD28은 PD1 길항제(예를 들어, 세미플리맙과 같은 항-PD1)와 함께 투여됨;
- 주캇 CD28+ 세포에 결합함;
- PE01 EGFR+ 세포에 결합함; 및/또는
- 사이노몰구스 원숭이에게, 예를 들어, 10 ㎎/㎏으로 투여될 때, 상당한 사이토카인 방출(예를 들어, 인터페론-감마, IL-2, IL-6, IL-8 및/또는 IL-10)을 일으키지 않음.
본 발명은 대상체에서 종양 세포를 고갈시킬 수 있는 항-EGFR 및 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다(예를 들어, 실시예 3 내지 실시예 5 참조). 예를 들어, 소정의 실시형태에 따르면, 항-EGFR 및 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자가 제공되되, 치료적 유효 용량으로 대상체에 대한 항원-결합 분자의 단일 투여는 대상체에서 종양 세포의 수를 감소시킨다.
본 발명은 A375 흑색종 세포, 22RV1 전립선 세포, PEO1 난소 세포, CAPAN2 췌장 세포, SW1990 췌장 세포 및 H292 폐 세포를 포함하는 다양한 종양 세포에 결합할 수 있는 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다(실시예 10A 및 실시예 10B 참조). 이와 같이, 본 발명의 이중특이성 항체는 다수의 암 적응증을 치료하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명은 다양한 세포주에 걸쳐 항-종양 특이적 항원(TSA)×항-CD3 이중특이성 항체의 세포독성 효력을 향상시킬 수 있는 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다(실시예 11 참조). 이러한 접근법을 사용하여, TSA×CD3 이중특이성 항체는 항-STEAP2×항-CD3, 항-PSMA×항-CD3 또는 항-MUC16×항-CD3 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 항-EGFR×항-CD28 항체는 또한 관문 저해제, 예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 항체 또는 임의의 다른 관문 저해제와 조합될 때 유용한 것으로 입증될 수 있다(실시예 9 참조). 소정의 실시형태에서, 항-EGFR×항-CD28을 항-TSA×항-CD3 이중특이성 항체와 관문 저해제 모두와 조합하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 수소-중수소 교환을 사용하여 인간 EGFR 상의 소정의 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다(실시예 12 참조). 특히, 본 발명의 소정의 항체는 인간 EGFR(서열번호 70)의 345번 내지 368번 아미노산 잔기, 인간 EGFR(서열번호 71)의 399번 내지 416번 아미노산 잔기 및 인간 EGFR(서열번호 72)의 133번 내지 154번 아미노산 잔기에 결합하거나/이와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
에피토프 매핑 및 관련 기술
본 발명의 항원-결합 분자가 결합하는 CD28 또는 EGFR 상의 에피토프는 CD28 단백질 또는 EGFR 단백질의 3개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상)의 아미노산의 단일 인접 서열로 구성될 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 CD28 또는 EGFR의 복수의 비-인접 아미노산(또는 아미노산 서열)로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체는 CD28 단량체 내에 포함되는 아미노산과 상호작용할 수 있거나, 또는 CD28 이량체의 2개의 상이한 CD28 사슬 상의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 파라토프로 공지된 항체 분자의 가변 영역에서 특정 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원의 다른 영역에 결합할 수 있으며, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 형태적 또는 선형일 수 있다. 형태적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 세그먼트로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성되는 것이다. 소정의 환경에서, 에피토프는 항원 상의 사카라이드기, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인이 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지 여부를 결정하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 기법이 사용될 수 있다. 특정 항체 또는 항원-결합 도메인의 에피토프 또는 결합 도메인을 결정하는데 사용될 수 있는 예시적인 기법은 예를 들어, 문헌[Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기술되어 있는 것과 같은 일상적인 교차 차단 검정, 점 돌연변이유발(예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 아르기닌 스캐닝 돌연변이유발 등), 펩타이드 블롯 분석(문헌[Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463]), 프로테이스 보호 및 펩타이드 절단 분석을 포함한다. 게다가, 항원의 에피토프 제거, 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(문헌[Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496]). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광계에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 대체적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심 있는 단백질을 중수소-표지한 후, 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 것을 포함한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체는 항체에 의해 보호되는 잔기(중수소-표지된 상태로 남아 있음)를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 일어나도록 하기 위해 물로 옮겨진다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테이스 절단 및 질량 분광계 분석을 거쳐, 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A] 참조. 대안적으로, 소정의 실시형태에서, 관심 있는 단백질이 항체에 결합한 후, 수소-중수소 교환이 이어진다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테이스 절단 및 질량 분광계 분석을 거쳐, 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 비-중수소-표지된 잔기를 나타낸다. X-선 결정 구조 분석은 또한 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 항체(예를 들어, 표 1, 표 3, 표 6, 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 제시된 바와 같은 임의의 아미노산 서열을 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD28 및 항-EGFR 항체를 더 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 CD28 및/또는 EGFR에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 항체(예를 들어, 본 명세서의 표 1, 표 3, 표 6, 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 제시된 바와 같은 임의의 아미노산 서열을 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-CD28 및/또는 항-EGFR 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하되, 제1 항원-결합 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 CD28-특이적 항원-결합 도메인과 같이 CD28 상의 동일한 에피토프에 결합하고/하거나, 제2 항원-결합 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 EGFR-특이적 항원-결합 도메인과 같은 EGFR 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 72에 제시된 것과 같은 EGFR의 133번 내지 154번 아미노산 잔기, 또는 서열번호 70에 제시된 바와 같은 EGFR의 345번 내지 368번 아미노산 잔기, 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 EGFR의 399번 내지 416번 아미노산 잔기 중 하나 이상과 상호작용하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하되, 제1 항원-결합 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 CD28-특이적 항원 결합 도메인과 CD28에 대한 결합에 대해 경쟁하고/하거나 제2 항원-결합 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 특정의 예시적인 EGFR-특이적 항원-결합 도메인과 EGFR에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
특정 항원-결합 분자(예를 들어, 항체) 또는 이의 항원-결합 도메인이 본 발명의 참조 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 이와 결합을 위해 경쟁하는지 여부를 당업계에 공지된 일상적인 방법에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 본 발명의 참조 이중특이성 항원-결합 분자와 동일한 CD28(또는 EGFR) 상의 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 이중특이성 분자가 먼저 CD28 단백질(또는 EGFR 단백질)에 결합된다. 다음으로, CD28(또는 EGFR) 분자에 결합하는 테스트 항체의 능력이 평가된다. 테스트 항체가 참조 이중특이성 항원-결합 분자와의 포화 결합 후 CD28(또는 EGFR)에 결합할 수 있는 경우, 테스트 항체는 CD28(또는 EGFR)에 대한 결합에 대해 참조 이중특이성 항원-결합 분자와 경쟁하지 않고/않거나 항원 상의 상이한 부위에 결합하는 항체 사이에 입체 간섭이 존재한다는 결론을 내릴 수 있다. 반면에, 테스트 항체가 참조 이중특이성 항원-결합 분자와의 포화 결합 후 CD28(또는 EGFR) 분자에 결합할 수 없다면, 테스트 항체는 CD28(또는 EGFR)에 대한 결합에 대해 본 발명의 참조 이중특이성 항원-결합 분자와 경쟁한다. 그런 다음, 관찰된 테스트 항체의 결합의 결여가 실제로 참조 이중특이성 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 또는 입체 차단(steric blocking)(또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여에 대한 원인인지 여부를 확인하기 위해 추가적인 일상적인 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에 따라, 2개의 항원-결합 단백질은 예를 들어, 1-배, 5-배, 10-배, 20-배 또는 100-배 초과의 하나의 항원-결합 단백질이 경쟁적 결합 검정에서 측정되는 바와 같이 다른 항원 결합 단백질의 결합을 적어도 50% 저해하지만, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 저해하는 경우 항원에 대한 결합에 대해 경쟁한다(예를 들어, 문헌[Junghans et aI., Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 본질적으로 한 항원-결합 단백질의 결합을 감소 또는 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항원-결합 단백질은 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 한 항원-결합 단백질의 결합을 감소 또는 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항원-결합 단백질은 "중첩 에피토프"를 가질 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 도메인이 참조 항원-결합 분자와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 위에 기재된 결합 방법은 2가지 배향으로 수행된다: 제1 배향에서, 참조 항원-결합 분자를 포화 조건하에 CD28 단백질(또는 EGFR 단백질)에 결합시킨 후 CD28(또는 EGFR) 분자에 대한 테스트 항체의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 테스트 항체를 포화 조건하에 CD28(또는 EGFR) 분자에 결합시킨 후 CD28(또는 EGFR) 분자에 대한 참조 항원-결합 분자의 결합을 평가한다. 두 배향 모두에서, 제1(포화) 항원-결합 분자만 CD28(또는 EGFR) 분자에 결합할 수 있다면, 테스트 항체와 참조 항원-결합 분자가 CD28(또는 EGFR)에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론지었다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항원-결합 분자와의 결합에 대해 경쟁하는 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
항원-결합 도메인의 제조 및 이중특이성 분자의 구축
특정 항원에 특이적인 항원-결합 도메인은 당업계에 공지된 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조될 수 있다. 일단 수득되면, 2개의 상이한 항원(예를 들어, CD28 및 EGFR)에 특이적인 2개의 상이한 항원-결합 도메인은 일상적인 방법을 사용하여 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 생성하기 위해 서로에 대해 적절하게 배열될 수 있다. (본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 구축하는데 사용될 수 있는 예시적인 이중특이성 항체 형식의 논의는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다). 소정의 실시형태에서, 본 발명의 다중특이성 항원-결합 분자의 개별 성분(예를 들어, 중쇄 및 경쇄) 중 하나 이상은 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체로부터 유래된다. 이러한 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상은 VELOCIMMUNE™ 기술을 사용하여 제조될 수 있다. VELOCIMMUNE™ 기술(또는 임의의 다른 인간 항체 생성 기술)을 사용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 특정 항원(예를 들어, CD28 또는 EGFR)에 대한 고친화도 키메라 항체가 초기에 단리된다. 항체는 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 대해 특성화되고 선택된다. 마우스 불변 영역은 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자에 통합될 수 있는 완전한 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 생성하기 위해 목적하는 인간 불변 영역으로 대체된다.
유전적으로 조작된 동물은 인간 이중특이성 항원 결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 재배열하고 발현할 수 없는 유전적으로 변형된 마우스가 사용될 수 있되, 마우스는 내인성 마우스 카파 유전자좌에서 마우스 카파 불변 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 1개 또는 2개의 인간 경쇄 가변 도메인만을 발현한다. 이러한 유전적으로 변형된 마우스는 2개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 중 하나로부터 유래되는 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 회합하는 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 완전한 인간 이중특이성 항원-결합 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. (예를 들어, 이러한 조작된 마우스 및 이중특이성 항원-결합 분자를 생성하기 위한 이의 용도에 대한 상세한 논의에 대해서는 US 2011/0195454 참조).
생물학적 동등성(Bioequivalent)
본 발명은 기재된 항체의 아미노산 서열과 다르지만 CD28 및 EGFR에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 변이체 분자는 모 서열과 비교할 때 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항원-결합 분자의 것과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항원 결합 분자-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기재된 본 발명의 항원-결합 분자에 대해 본질적으로 생물학적으로 동등한 항원 결합 분자를 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 위에 논의되어 있다.
본 발명은 본 명세서에 제시된 임의의 예시적인 항원-결합 분자에 대해 생물학적으로 동등한 항원-결합 분자를 포함한다. 2개의 항원-결합 단백질 또는 항체는 예를 들어, 이들이 단일 용량 또는 다중 용량의 유사한 실험 조건에서 동일한 몰 용량으로 투여될 때 흡수 속도 및 정도가 유의한 차이를 나타내지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대체물인 경우, 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체는 흡수 정도는 동일하지만 흡수 속도는 동일하지 않은 경우 등가물 또는 약제학적 대체물로 간주될 것이지만, 흡수 속도의 이러한 차이는 의도적이고 라벨에 반영되며, 예를 들어, 장기 사용에 대한 효과적인 신체 약물 농도의 달성에 필수적이지 않으며 특정 연구 의약품에 대해 의학적으로 중요하지 않은 것으로 간주되기 때문에 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 것이다.
일 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질은 이들의 안전성, 순도 및 효력에 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 경우, 생물학적으로 동등하다.
일 실시형태에서, 면역원성의 임상적으로 유의한 변화 또는 효과의 감소를 포함하여 부작용 위험의 예상되는 증가 없이 참조 약품과 생물학적 약품 간에 1회 이상 전환될 수 있는 경우, 2개의 항원-결합 단백질은 환자가 그러한 전환 없이 요법을 계속하는 것과 비교하여 생물학적으로 동등하다.
일 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질은 이러한 메커니즘이 알려진 범위 내에서 조건 또는 사용 조건에 대한 공통 메커니즘 또는 작용 메커니즘에 의해 둘 다 작용하는 경우, 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정은 예를 들어, (a) 항체 또는 이의 대사산물의 농도가 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 생물학적 유체에서 시간의 함수로 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트; (b) 인간 생체내 생물학적 이용 가능성 데이터와 상관관계가 있고 합리적으로 예측할 수 있는 시험관내 테스트; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능 또는 생물학적 이용 가능성 또는 생물학적 동등성을 확립하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.
본 명세서에 제시된 예시적인 이중특이성 항원-결합 분자의 생물학적으로 동등한 변이체는 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 수행하거나 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구축될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 복원(renaturation)시 불필요하거나 잘못된 분자내 이황화 브리지의 형성을 방지하기 위해 결실되거나 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 동등한 항체는 항체의 글리코실화 특성, 예를 들어, 글리코실화를 제거(eliminate) 또는 제거(remove)하는 돌연변이를 변형시키는 아미노산 변화를 포함하는 본 명세서에 제시된 예시적인 이중특이성 항원-결합 분자를 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
소정의 실시형태에 따르면, 본 발명은 인간 CD28에는 결합하지만 다른 종으로부터의 CD28에는 결합하지 않는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 EGFR에는 결합하지만 다른 종으로부터의 EGFR에는 결합하지 않는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 CD28 및 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 CD28에 결합하는 항원-결합 분자; 및/또는 인간 EGFR 및 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 EGFR에 결합하는 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명의 소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 인간 CD28 및/또는 인간 EGFR에 결합하고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 저빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 젖소, 말, 낙타, 사이노몰구스, 마모셋, 레서스 또는 침팬지 CD28 및 또는 EGFR 중 하나 이상에 결합하거나 또는 결합하지 않을 수 있는 항원-결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 특정의 예시적인 실시형태에서, 인간 CD28 및 사이노몰구스 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자가 제공된다.
면역접합체
본 발명은 EGFR×CD28 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 예컨대 REGN7075, REGN6321, REGN6322, REGN6323 또는 다른 모이어티, 예를 들어, 치료적 모이어티("면역접합체")에 접합된 본 명세서에 기재된 임의의 CD28 항체로부터의 HCVR과 쌍을 이루는 항-EGFR HCVR의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 본 명세서에 제시된 임의의 추가의 치료제에 접합된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역접합체"는 다른 항원-결합 단백질, 약물, 방사능제, 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드, 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결되는 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다.
소정의 실시형태에서, 치료적 모이어티는 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다. 면역접합체를 형성하기 위한 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, WO 05/103081 참조).
투여 및 치료
본 발명은 항원-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 대상체(예를 들어, 인간)의 신체에, 예를 들어, 비경구적으로 도입하는 것을 포함하는, 본 발명의 EGFR×CD28 다중특이성 항원-결합 단백질, 예를 들어, REGN7075; REGN6321; REGN6322; REGN6323; 또는 본 명세서에 기재된 임의의 CD28 항체로부터의 HCVR과 쌍을 이루는 항-EGFR HCVR의 임의의 조합 또는 이의 약제학적 조성물을 대상체(예를 들어, 인간, 예를 들어, 과증식성 장애를 앓고 있는 인간)에 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 주사기의 바늘로 대상체의 신체를 관통하고, 항원-결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 대상체의 신체에, 예를 들어, 대상체의 정맥, 동맥, 종양, 근육 조직 또는 피하조직 내로 주사하는 것을 포함한다.
EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물의 투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 비경구(parenteral), 비경구외(non-parenteral), 경구(oral), 직장(rectal), 점막경유(transmucosal), 장(intestinal), 비경구; 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 골수내(intramedullary), 경막내(intrathecal), 직접 뇌실내(direct intraventricular), 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal), 안내(intraocular), 흡입(inhalation), 취입(insufflation), 국소(topical), 피부(cutaneous), 안구내(intraocular), 유리체내(intravitreal), 경피(transdermal) 또는 동맥내(intra-arterial)를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 포함하는 용기(예를 들어, 예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 칼럼, 중공 보어 바늘(hollow bore needle) 또는 주사기 실린더가 있는 플라스틱 또는 유리 바이알 또는 앰풀)를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR 또는 EGFR 및 CD28(EGFR×CD28)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편) 또는 이의 약제학적 제형을 포함하는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 키트로 패키징될 수 있다. 주사 장치는 비경구적 경로, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내를 통해 대상체의 신체에 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는 예를 들어, 주사될 유체(예를 들어, 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 제형 포함)를 담기 위한 실린더 또는 배럴, 유체를 주사하기 위해 피부, 혈관 또는 다른 조직을 뚫기 위한 바늘; 및 유체를 실린더 밖으로 밀어 니들 보어를 통해 대상체의 신체로 밀어 넣는 플런저를 포함하는 주사기 또는 자기 주사기(예를 들어, 약제학적 제형으로 미리 충전됨)일 수 있다.
미리-충전된 주사기는 최종 사용자, 예를 들어, 환자/대상체에게 조성물을 투여할 의사 또는 간병인에게 판매 또는 전달되기 전에 조성물(예를 들어, 다중특이성 항원-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물)로 충전된 주사기이다.
항원-결합 분자의 치료적 용도
본 발명은 치료적 유효 용량의 EGFR×CD28 항원-결합 단백질(예를 들어, REGN7075; REGN6321; REGN6322; REGN6323; 또는 본 명세서에 기재된 임의의 CD28 항체로부터의 HCVR과 쌍을 이루는 항-EGFR HCVR의 임의의 조합을 선택적으로 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및/또는 세미플리맙) 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 PD-1 및/또는 PD-L1 저해제와 함께 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 과증식성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시형태에서, 방법은 대상체의 암이 EGFR을 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 발현이 관찰된다면, EGFR×CD28 및/또는 항-EGFR 항원-결합 단백질이 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, 방법은 암의 생검(예를 들어, 치료하는 의사에 의해 수행됨)을 수행하고, 암의 세포가 EGFR을 발현하는지 여부를 결정하거나 또는 다른 개체 또는 독립체(예를 들어, 환자 또는 대상체를 대신하여)에게 이러한 결정 및 EGFR 발현이 존재한다면, 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항원-결합 단백질을 대상체에 투여하도록 지시하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 의사는 일부 다른 개체 또는 독립체, 예를 들어, 병리학자(예를 들어, 환자 또는 대상체를 대신하여)에게 생검을 수행하도록 지시한다. 본 발명의 실시형태에서, EGFR 발현은 면역조직화학적으로(immunohistochemically: IHC) 또는 ELISA(효소 연결 면역흡착 검정)에 의해 테스트된다.
본 발명은 EGFR 또는 CD28 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 치료적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 항체 또는 이중특이성 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 이중특이성 항원-결합 분자(및 이를 포함하는 치료적 조성물)는 특히 면역 반응의 자극, 활성화 및/또는 표적화가 유익할 임의의 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자는 EGFR 발현 또는 활성 또는 EGFR+ 세포의 증식과 관련되거나 또는 이에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 방법이 달성되는 작용 메커니즘은 효과기 세포, 예를 들어, T-세포의 존재하에 EGFR을 발현하는 세포의 살해를 포함한다. 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 사용하여 저해 또는 살해될 수 있는 EGFR을 발현하는 세포는 예를 들어, 폐암 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 예를 들어, EGFR-발현 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 고양이, 개, 젖소, 양, 말, 염소, 토끼), 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체는 EGFR-발현 암을 가질 수 있고, 이러한 병태가 발생하는 경향이 있고/있거나 EGFR 활성의 저해 또는 감소, 또는 EGFR+ 세포의 고갈로부터 이익을 얻을 것이다. 일 실시형태에서, 대상체는 과증식성 질환이 있거나 또는 이의 발병 위험이 있을 수 있다.
본 명세서의 목적을 위해 과증식성 질환은 비정상적이고, 과도하고/하거나 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭하되, 예를 들어, 세포는 EGFR을 발현한다. 예를 들어, 과증식성 질환은 EGFR-발현 암을 포함한다. 광범위한 암이 EGFR을 발현한다. 예시적인 EGFR-발현 암은 식도 암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 경부 편평 세포 암종, 신경교종, 갑상선암, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암), 직장결장암, 결장암, 방광암, 직장암, 두경부암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 요로상피암, 전립선암, 고환암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 위식도암, (예를 들어, 위식도 선암종) 및 흑색종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 항체 및 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 광범위한 암의 치료에 사용될 수 있다.
암은 예를 들어, 치료될 특정 대상체의 세포에서 EGFR 발현이 확인되었으며, 식도 암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 경부 편평 세포 암종, 자궁내막 선암종, 방광 요로상피 암종, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암), 직장결장암, 직장암, 자궁내막암, 피부암(예를 들어, 두경부 편평세포 암종), 뇌암(예를 들어, 다형성 교모세포종), 유방암, 위식도암, (예를 들어, 위식도 선암종), 전립선암 및/또는 난소암을 포함하는, EGFR-발현 암일 수 있는 고형 종양 세포 또는 암성 혈액 세포를 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 분자는 또한 예를 들어, 결장, 폐, 유방, 신장 암, 및 방광에서 발생하는(또는 본 명세서에 논의된 임의의 암으로부터의) 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 난소암을 치료하는데 사용된다.
본 발명은 또한 대상체에서 잔존 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "잔존 암"은 항암 요법으로 치료한 후 대상체에서 하나 이상의 암성 세포의 존재 또는 지속을 의미한다.
소정의 양태에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 대상체가 다른 유형의 항암 요법에 반응하지 않는 것으로 나타난 후, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자 중 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어, EGFR 발현(예를 들어, 폐암)과 관련된 과증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 대상체가 암, 예를 들어, 폐암을 앓고 있는 환자에 대한 표준 치료를 받은 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 1년 이상에 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자를 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폐암과 같은 과증식성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 다른 양태에서, IgG4 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 이중특이성 항원-결합 분자는 처음에 하나 이상의 시점에서 대상체에 투여되고(예를 들어, 난소암 세포의 강력한 초기 고갈을 제공하기 위해), 이어서 후속 시점에서 IgG1 Fc 도메인과 같은 상이한 IgG 도메인을 포함하는 동등한 이중특이성 항원-결합 분자가 투여된다. 본 발명의 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항체는 항-EGFR/항-CD3 이중특이성 항체와 같은 다른 이중특이성 항원 결합 분자와 함께 사용될 수 있는 것으로 구상된다. 본 발명의 이중특이성 항체는 PD-1 및 다른 표적을 표적으로 하는 것들과 함께 사용될 것으로 또한 구상된다. 동일한 종양 항원(예를 들어, EGFR)을 표적으로 하는 2개의 이중특이성 항체를 조합하는 것이 유리할 수 있지만, T-세포 상의 CD3을 표적으로 하는 이중특이성 항체 중 하나와 CD28과 같은 공동-자극 분자를 표적으로 하는 다른 이중특이성 항체를 조합하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 조합은 종양 세포 살해를 향상시키기 위해 단독으로 사용될 수 있거나 또는 관문 저해제와 조합하여 사용될 수 있다.
EGFR-발현 암과 같은 과증식성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편의 "유효한" 또는 "치료적으로 유효한" 용량은 이러한 징후 및/또는 증상의 퇴행 또는 제거를 유도하거나 또는 이러한 징후 및/또는 증상의 진행을 저해함으로써 치료될 대상체에서 질환의 하나 이상의 징후 및/또는 증상을 완화하기에 충분한 항원-결합 단백질의 양이다. 본 발명의 실시형태에서, 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항원-결합 단백질의 치료적 유효 용량은 0.1㎎ 내지 2000㎎, 예를 들어, 0.1㎎ IV(정맥내) Q2W(2주마다) 내지 2000㎎ IV Q2W이다. 투여량은 투여될 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 초기 용량 후에 초기 용량과 대략 동일하거나 또는 그보다 더 적거나 더 많을 수 있는 양으로 제2의 또는 복수의 후속 용량의 항원-결합 단백질이 투여될 수 있되, 후속 용량은 2주로 분리된다.
환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량은 환자의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체 표면적에 따라 계산된다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간은 조정될 수 있다. 이중특이성 항원-결합 분자를 투여하기에 효과적인 투여량 및 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있고; 예를 들어, 환자의 진행 상황은 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있으며, 그에 따라 용량이 조정된다. 또한, 투여량의 종간 스케일링(scaling)은 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, 문헌[Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351])을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따르면, 다중 용량의 항원-결합 분자(예를 들어, EGFR 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항-CD28 항체 또는 이중특이성 항원-결합 분자)는 정의된 시간 경과에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 다중 용량의 본 발명의 항원-결합 분자를 대상체에 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "순차적으로 투여하는"은 항원-결합 분자의 각 용량이 상이한 시점에, 예를 들어, 미리 결정된 간격(예를 들어, 시간, 일, 주 또는 개월)으로 분리된 상이한 날에 대상체에 투여되는 것을 의미한다. 본 발명은 단일 초기 용량의 항원-결합 분자를 환자에게 순차적으로 투여하고, 이어서 1회 이상의 2차 용량의 항원-결합 분자를 투여하고, 선택적으로 이어서 1회 이상의 3차 용량의 항원-결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "초기 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 본 발명의 항원-결합 분자의 투여의 경시적인 순서를 지칭한다. 따라서, "초기 용량"은 치료 양생법("기준선 용량(baseline dose)"으로도 지칭됨)의 시작 시에 투여되는 용량이고; "2차 용량"은 초기 용량 후에 투여되는 용량이며; "3차 용량"은 2차 용량 후에 투여되는 용량이다. 초기, 2차 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항원-결합 분자를 함유할 수 있으나, 투여 빈도의 면에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 이 소정의 실시형태에서, 초기, 2차 및/또는 3차 용량에 함유되는 항원-결합 분자의 양은 치료의 과정 동안 서로 달라진다(예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조정됨). 소정의 실시형태에서, 2회 이상의 용량이 치료 양생법의 시작 시에 "부하 용량(loading dose)"으로서 투여된 후, 덜 빈번하게 투여되는 후속 용량(예를 들어, "유지 용량(maintenance dose)")으로 투여된다.
본 발명의 하나의 예시적인 실시형태에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 직전 용량 후 1주 내지 몇 주 사이에 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 문구 "직전 용량(immediately preceding dose)"은 다중 투여의 순서에서, 개입 용량(intervening dose) 없이 순차에서 바로 다음의 용량 투여 전에 환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량을 의미한다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 환자 임의의 수의 2차 및/또는 3차 용량의 항원-결합 분자(예를 들어, EGFR 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항-CD28 항체 또는 이중특이성 항원-결합 분자)를 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 단일 2차 용량만이 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상의 2차 용량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 소정의 실시형태에서, 단일 3차 용량만이 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상의 3차 용량이 환자에게 투여된다.
다중 2차 용량을 포함하는 실시형태에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 유사하게는, 다중 3차 용량을 포함하는 실시형태에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 대안적으로, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 양생법의 과정에 따라 변할 수 있다. 투여 빈도는 또한 임상 검사 후 개별 환자의 필요에 따라 의사에 의해 치료 과정에서 조정될 수 있다.
진단적 용도
본 발명의 이중특이성 항체는 또한 예를 들어, 진단 목적을 위해 샘플에서 CD28 또는 EGFR, 또는 CD28-발현 또는 EGFR-발현을 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-EGFR 또는 EGFR×CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD28 또는 EGFR의 비정상적인 발현(예를 들어, 과발현(over-expression), 저발현(under-expression), 발현의 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. CD28 또는 EGFR에 대한 예시적인 진단적 검정은 예를 들어, 환자로부터 얻은 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있되, 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 비표지된 항체는 자체적으로 검출 가능하게 표지된 2차 항체와 조합하여 진단 용도로 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32p, 35S 또는 125I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레세인 아이소티오사이아네이트 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파테이스, 베타갈락토시데이스, 서양고추냉이 퍼옥시데이스 또는 루시퍼레이스일 수 있다. 샘플에서 CD28 또는 EGFR을 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 특정의 예시적인 검정은 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역검정(RIA) 및 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다. 본 발명에 따른 CD28 또는 EGFR 진단적 검정에 사용될 수 있는 샘플은 정상적인 또는 병리학적 병태하에서 검출 가능한 양의 CD28 또는 EGFR 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 환자로부터 수득될 수 있는 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(예를 들어, 비정상적인 CD28 또는 EGFR 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태에 걸리지 않은 환자)로부터 수득된 특정 샘플에서 CD28 또는 EGFR의 수준은 기준선 또는 표준 수준의 CD28 또는 EGFR을 초기에 확립하기 위해 측정될 것이다. 그런 다음, CD28 또는 EGFR의 이러한 기준선 수준은 CD28 또는 EGFR 관련 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 샘플에서 측정된 CD28 또는 EGFR의 수준에 대해 비교될 수 있다
조합 및 약제학적 제형
본 발명은 EGFR×CD28 및/또는 항-EGFR 항원-결합 단백질 및 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물; 뿐만 아니라 이의 사용 방법 및 이러한 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질을 포함하는 약제학적 제형(예를 들어, 물을 포함하는 수성 약제학적 제형) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 본 발명의 일부이다.
본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하는 기타 작용제와 함께 제형화될 수 있다. 모든 제약 화학자에게 공지된 처방집에서 다수의 적절한 제형을 찾을 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]. 이러한 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예컨대, LIPOFECTIN™, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼즈배드 소재), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔 및 반-고체 혼합물 함유 카보왁스를 포함한다. 또한, 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311] 참조.
EGFR×CD28 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, REGN7075; REGN6321; REGN6322; REGN6323; 또는 본 명세서에 기재된 임의의 CD28 항체로부터의 HCVR과 쌍을 이루는 항-EGFR HCVR의 임의의 조합)의 약제학적 제형을 제조하기 위해, 항원-결합 단백질은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y] 참조. 본 발명의 실시형태에서, 약제학적 제형은 멸균이다. 이러한 조성물은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 약제학적 제형은 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질 및, 예를 들어, 물, 완충제, 보존제 및/또는 세제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 범위는 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 건조된(desiccated), 예를 들어, 동결-건조된(freeze-dried) 조성물 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하지만 실질적으로 물이 없는 이의 약제학적 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있는 다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜 내로의 봉입, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 세포내섭취(receptor mediated endocytosis)가 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Wu et aI., 1987, J. BioI. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 또는 국부적일 수 있다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 본 명세서의 EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제형을 포함하는 용기(예를 들어, 플라스틱 또는 유리 바이알) 또는 주사 장치(예를 들어, 주사기, 미리-충전된 주사기 또는 자기주사기)를 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기로 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 게다가, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 또는 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 이용한다. 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기되고 약제학적 조성물을 포함하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 그런 다음, 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체 가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장소에 수용되는 약제학적 조성물이 미리 충전되어 제공된다. 저장소의 약제학적 조성물이 비워지면, 전체 장치는 폐기된다.
수많은 재사용 가능한 및 일회용 펜 및 자기주사기 전달 장치가 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 예를 들어, AUTOPEN™(오웬 멈포드 인코포레이션(Owen Mumford, Inc.), 영국 우드스톡 소재) 또는 HUMIRA™ 펜(애보트 랩스(Abbott Labs), 일리노이주 애보트 소재) 참조.
소정의 상황에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201] 참조). 다른 실시형태에서, 중합체 재료가 사용될 수 있다; 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida] 참조. 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 배치될 수 있으므로 전신 용량의 일부만이 필요하다(예를 들어, 문헌[Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 제어 방출 시스템은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 리뷰에 논의되어 있다.
주사용 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 투여 형태를 포함할 수 있다. 이러한 주사용 제제는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는 예를 들어, 주사를 위해 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 위에 기재된 항체 또는 이의 염을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들어, 생리 식염수 및 적절한 가용화제와 함께 사용될 수 있는 기타 등장성 용액이 있다. 주사용 유성 매질도 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 유성 매질은 가용화제와 조합될 수 있다.
유리하게는, 위에 기재된 경구 또는 비경구적 사용을 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 적합한 단위 용량의 투여 형태로 제조된다. 단위 용량의 이러한 투여 형태는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사(앰풀), 좌약 등을 포함한다. 함유되는 상기 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투여 형태당 약 0.1㎎ 내지 약 2000㎎이고; 특히 주사의 형태로 함유된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 항체 및 이중특이성 항원-결합 분자를 하나 이상의 추가적인 치료적으로 활성 성분과 조합하여 포함하는 조성물 및 치료적 제형, 및 이러한 조합을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자와 조합되거나 또는 함께 투여될 수 있는 예시적인 추가적인 치료제는 예를 들어, 화학요법(예를 들어, 항암 화학요법, 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 시스플라틴, 카보플라틴 또는 옥살리플라틴), 방사선 요법, 표적 PD-1을 표적으로 하는 관문 저해제(예를 들어, 항-PD-1 항체, 예컨대 펨브롤리주맙, 니볼루맙 또는 세미플리맙(US9,987,500 참조)), CTLA-4, LAG3, TIM3 등, GITR, OX40, 4-1BB 등과 같은 분자를 표적으로 하는 공동자극 효능제 2가 항체, 다른 공동자극 CD28 이중특이성 항체, 및 종양 관련 항원(예를 들어, MUC16(뮤신 16), PSMA 또는 STEAP2) 및, 예를 들어, CD3(MUC16×CD3, PSMA×CD3 또는 STEAP2×CD3)에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. CD3에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 예시적인 이중특이성 항체는 예를 들어, WO2017/053856A1, WO2014/047231A1, WO2018/067331A1 및 WO2018/058001A1에 기술된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. EGFR은 광범위한 암에서 발현된다. 따라서, 본 발명의 이중특이성 항-EGFR×CD28 항체는 다양한 암의 치료에서 CD3에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 광범위한 이중특이성 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, EGFR×CD28 및/또는 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 대상체에 투여되는 추가의 치료제는 문헌[Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare; 57th edition(Nov. 1, 2002))] 또는 일반적으로 특정 작용제와 함께 제공되는 승인된 처방 정보에 따라 대상체에 투여된다.
추가의 치료제와 함께 치료적 유효 용량의 EGFR×CD28 및/또는 항-EGFR 항원-결합 단백질을 투여함으로써 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 EGFR을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 일부이다.
용어 "함께"는 성분, EGFR×CD28 또는 항-EGFR 항원-결합 단백질, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세미플리맙과 같은 추가의 치료제와 함께, 예를 들어, 동시 전달을 위해 단일 조성물로 제형화되거나 또는 2개의 이상 조성물(예를 들어, 각 성분을 포함하는 키트)로 개별적으로 제형화될 수 있음을 나타낸다. 서로 함께 투여되는 성분은 다른 성분이 투여될 때와 상이한 시간에 대상체에 투여될 수 있으며; 예를 들어, 각각의 투여는 치료 양생법의 일부로서 주어진 기간에 걸쳐 간격을 두고 비-동시적으로(예를 들어, 개별적으로 또는 순차적으로) 주어질 수 있다. 서로 함께 투여되는 별개의 성분은 또한 동일한 투여 세션 동안 본질적으로 동시에 순차적으로 투여될 수 있다. 또한, 서로 함께 투여되는 별개의 성분은 동일하거나 상이한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항-EGFR×CD28 항체의 구축
항-EGFR 항체의 생성
항-EGFR 항체를 인간 면역글로불린 중쇄 및 보편적 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에 면역 반응을 자극하는 보조제와 함께 EGFR-발현 세포주(A431)를 직접 투여하여 얻었다. 즉, 이러한 마우스에서 생성된 항체는 상이한 중쇄 가변 영역을 갖지만, 본질적으로 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
항체 면역 반응을 EGFR-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 목적하는 면역 반응이 달성되었을 때, 항-EGFR 항체를 US 7,582,298에 기술된 바와 같이 골수종 세포에 대한 융합 없이 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다.
표 1은 본 발명의 선택된 항-EGFR 항체의 중쇄와 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 제시되어 있다.
Figure pct00049
Figure pct00050
항-CD28 항체의 생성
항-CD28 항체를 VELOCIMMUNE® 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 보편적 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 마우스 IgG2a의 Fc 부분에 융합된 인간 CD28 단백질, 또는 CD28을 발현하는 세포, 또는 CD28을 암호화하는 DNA로 면역화함으로써 수득하였다.
항체 면역 반응을 CD28-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 목적하는 면역 반응이 달성될 때, 항-CD28 항체를 US7,582,298에 기술된 바와 같은 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다.
표 3은 본 발명의 선택된 항-CD28 항체의 중쇄와 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 4에 제시되어 있다.
이러한 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-CD28 항체의 소정의 생물학적 특성은 아래 제시되는 실시예에 상세히 설명된다.
Figure pct00051
Figure pct00052
CD28 및 EGFR에 결합하는 이중특이성 항체(bsAb)의 생성
항-EGFR-특이적 결합 도메인 및 항-CD28-특이적 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 표준 방법을 사용하여 구축하였으며, 여기서 항-EGFR 항원 결합 도메인 및 항-CD28 항원 결합 도메인은 각각 공통 LCVR과 쌍을 이루는 상이한, 별개의 HCVR을 포함한다. 일부 예에서, 이중특이성 항체는 항-CD28 항체로부터의 중쇄, 항-EGFR 항체로부터의 중쇄 및 아래 표 5, 표 6, 표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같은 항체를 암호화하는 성분, 아미노산 및 핵산 서열을 포함하는 공통 경쇄를 이용하여 구축하였다. EGFR 및 CD28에 결합하는 추가적인 이중특이성 항체는 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 나타낸 명칭을 갖는 모 단일클론 항체를 사용하여 제조할 수 있다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
모 EGFR 항체로부터의 하나의 HCVR과 모 CD28 항체로부터의 다른 HCVR 암을 포함하는 추가적인 이중특이성 항체는 본 명세서에 기재된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 추가적인 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체를 생성하는데 사용되는 모 EGFR 항체는 WO2014/004427에 기재된 HCVR 서열을 갖는다. 이러한 추가적인 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체를 생성하는데 사용되는 CD28 모 항체는 위의 표 3에 기재된 아미노산을 갖는다. 이러한 항-EGFR 및 항-CD28 결합 도메인(페어링)은 아래의 표 9A, 표 9B 및 표 9C에 나타나 있다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
하기 실시예에 기재된 이중특이성 항체는 인간 가용성 이종이량체 hCD28 단백질에 결합하는 것으로 알려진 결합 암; 및 인간 EGFR로 구성된다(하기 Biacore 결합 데이터 참조). 2014년 8월 28일자로 공개된 미국 공개 US20140243504A1에 제시된 바와 같이 변형된(키메라) IgG4 Fc 도메인을 갖는 예시된 이중특이성 항체를 제조하였다.
본 실시예에 따라 생성된 이중특이성 항체는 2개의 별개의 항원-결합 도메인(즉, 결합 암)을 포함한다. 제1 항원-결합 도메인은 항-CD28 항체("CD28-VH")로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 항-EGFR 항체("EGFR-VH")로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항-EGFR 및 항-CD28 둘 다는 공통 경쇄를 공유한다. CD28-VH/EGFR-VH 페어링은 T 세포 상의 CD28 및 종양 세포 상의 EGFR을 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인을 생성한다.
CD28 및 EGFR에 결합하는 이중특이성 항체의 특성화
SPR 동역학 방법: T-200 기구 및 CM5 센서(지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 동역학 결합 매개변수를 결정하였다. 이중-참조된 센서그램을 Scrubber(바이오로직스 소프트웨어(BioLogics Software))를 사용하여 1:1 결합 모델에 전체적으로 피팅하였다. 해리 속도 상수(kd)는 해리 단계 동안 결합 반응의 변화를 피팅함으로써 결정하였고, 결합 속도 상수(ka)는 상이한 농도에서 결합하는 분석물을 피팅함으로써 결정하였다. KD를 kd와 ka의 비로부터 계산하였다. 해리 반감기(t1/2)는 ln2/kd로 계산하였으며, 분으로 변환하였다.
EGFR 세부적 방법: 항-hFc 단일클론 Ab(REGN2567)를 전통적인 EDC/NHS 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 표면에 커플링하였다. 200RU 내지 250RU의 EGFR×CD28 Ab를 이러한 표면에서 포획하였다. 30nM에서 시작하는 hEGFR.mmH의 6-포인트, 3배 희석 시리즈를 50 ㎕/분의 유속으로 5분 동안 이 표면에 주입하였다. 표면은 20mM H3PO4의 10초 펄스로 재생하였다. 해리를 10분 동안 측정하였다. 센서그램을 위에 기재된 바와 같이 처리하고 피팅하였다.
CD28 포획 방법 세부사항: 항-mFc 다중클론 Ab(GE)를 전통적인 EDC/NHS 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 표면에 커플링하였다. 대략 30RU의 hCD28.mFc를 이 표면에서 포획하였다. 90nM에서 시작하는 EGFR×CD28 Ab의 6 포인트, 3-배 희석 시리즈를 50 ㎕/분의 유속으로 4분 동안 이 표면에 주입하였다. 해리를 5분 동안 측정하였다. 표면은 10mM 글리신(pH 1.5)을 40초 주입하여 재생하였다. 센서그램을 위에 기재된 바와 같이 처리하고 피팅하였다.
Biacore 분석은 EGFR×CD28이 대략 9.3E-10의 KD로 hEGFR에 결합하고, 대략 5.2E-08의 KD로 hCD28에 결합함을 보여주었다(표 10 및 표 11).
Figure pct00060
Figure pct00061
다음으로, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 및 PEO-1을 함유하는 인간 T-세포의 공-배양물을 사용하여, EGFR×CD28이 세포 세포독성 및 T-세포 활성화를 유도하는 능력을 테스트하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여체 백혈구 팩으로부터 단리하였다. PBMC 단리는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 50㎖의 SepMate™ 튜브를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 수행하였다. 간략하게는, 15㎖의 FicollPaque PLUS를 50㎖의 SepMate 튜브에 넣은 다음, D-PBS로 1:2로 희석된 30㎖의 백혈구를 첨가하였다. SepMate 제조업체의 프로토콜에 따라 후속 단계를 수행하였다. CD3+ T-세포를 이후에 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)의 EasySep 인간 T-세포 단리 키트를 사용하여 제조업체의 권장 지침에 따라 PBMC로부터 단리하였다. 단리된 CD3+ T-세포를 바이알당 50×106개 세포의 농도로 10% DMSO를 함유하는 FBS에 동결시켰다.
EGFR×CD28은 종양 세포의 T-세포 살해를 유도하는 MUC16×CD3(데이터 미도시)의 능력을 18.8%에서 71.5%로 현저하게 증가시켰다(도 1). T-세포 세포독성의 이러한 향상과 일치하게, EGFR×CD28은 또한 CD25-발현 및 IFNγ 사이토카인 방출에 의해 평가된 바와 같이 T-세포 활성화를 증가시켰다(도 1d 및 도 1e). 특히, 비-표적화된 CD3 결합 대조군("신호 1"의 부재)의 존재하에 EGFR×CD28은 T-세포 세포독성 또는 활성화에 영향을 미치지 않았다(도 1c 내지 도 1e).
실시예 2: 종양 세포에 대한 천연 CD28 리간드의 과발현은 PD-1 mAb 처리와 상승작용을 일으켜 생체내에서 CD8 T 세포-의존성 오래 지속되는 항-종양 면역을 유도한다
천연 리간드(들)에 의한 CD28의 관여(engagement)가 생체내 PD-1 mAb의 항-종양 효능을 강화할 수 있는지를 결정하기 위해, MC38 종양 세포를 CD28에 대한 공동-자극 리간드 중 하나인 CD86을 과발현하도록 조작하였다. 구체적으로, 공동-자극 리간드를 발현하도록 조작된 종양 세포주를 생성하기 위해, 마우스 CD86 또는 빈 벡터를 암호화하는 EF1a 프로모터 및 퓨로마이신 저항성 유전자가 있는 pLVX 렌티바이러스 플라스미드(각각 pLVX.EF1a.CD86-puro 및 pLVX.EF1a.EV-puro)를 사용하여 HEK293T 세포를 형질감염시켜, 바이러스 입자의 생성을 촉진하고, 이를 이후에 MC38(국립 암 연구소, 종양 면역학 및 생물학 연구소(National Cancer Institute, Laboratory of Tumor Immunology & Biology))을 감염시키는데 사용하였다. CD86을 발현하는 조작된 세포주를 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 단리하였다. 세포를 0.5 ㎍/㎖의 퓨로마이신의 존재하에 ATCC에서 권장하는 조건하에 유지하였다. 생성된 세포주를 MC38/CD86 및 MC38/EV로 명명하였다.
MC38/CD86 세포와 항-PD-1 mAb 처리의 조합은 종양 성장을 현저하게 저해하여(도 2a), 빈 벡터 대조군(MC38/EV)으로 형질감염된 음성 대조군 MC38 세포와 비교할 때 강력한 생존 이점과 관련된 완전한 종양 퇴행을 초래하였다(도 2b). 처리 과정 동안 CD8+ T-세포의 고갈은 CD8+ T-세포에 대한 의존성을 보여주는 항-PD-1 mAb 요법과 MC38/CD86 세포를 조합하여 유도된 항-종양 효능을 완전히 폐지하였다(도 2c). 참고로, 처음에 MC38/CD86 세포를 이식하고 항-PD-1 mAb로 처리한 종양이 없는 마우스는 원발성 종양 이식 후 60일 이상에 이식된 두 번째 MC38 모 종양을 거부하였으며, 이는 T-세포 기억 반응의 존재를 나타낸다(도 2d). 결과적으로, 이러한 데이터는 CD28 리간드의 구성적 발현과 항-PD-1 요법의 상승적 효과가 생체내에서 오래 지속되는 CD8-의존적 항-종양 면역을 초래할 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 항-PD-1 항체와 조합한 EGFR×CD28 항체의 투여는 인간 CD34 + 줄기 세포가 생착된 V H 마우스 인간 종양 이종이식편을 상승적으로 제어하고 근절시킨다.
PD-1 차단 Ab(REGN2810(세미플리맙), 문헌[E. Burova et al., Characterization of Anti-PD-1 Antibody REGN2810 and Its Antitumor Activity in Human PD-1 Knock-In Mice. Mol Cancer Ther 16, 861-870 (2017)])와 조합한 EGFR×CD28 이중특이성 항체의 효과를 인간 종양 이종이식편 모델을 사용하여 테스트하였다. 인간 면역 세포 집단의 생착을 FACS에 의해 검증하였다(도 3a). A431 표피모양 암종 종양 세포(ATCC에서 입수)를 태아 간 CD34+ 세포가 생착된 SIRPAh/h TPOh/m Rag2-/- Il2rg-/-에 피하로 이식하였다. 마우스를 태아 간 공여체, 인간 면역 세포 생착 빈도 및 성별에 기초하여 4개 그룹으로 분리하였다. 마우스에 이식 당일(제0일)부터 주당 2회 복강내 주사에 의해 아이소타입 대조군, 5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28, 10 ㎎/㎏의 PD-1 또는 조합을 투여하였다. 그런 다음, 항체 주사(들)를 실험을 통해 2일 내지 3일마다 투여하였다. 종양을 2차원적으로 측정하고(길이×폭), 종양 부피를 계산하였다(길이×폭2×0.5). 종양이 지정된 종양 종점에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다(종양 부피 > 2000㎣ 또는 종양 궤양).
A431 종양 세포에 대한 EGFR 및 PD-L1의 발현을 FACS에 의해 검증하였다(도 3b). 각 그룹을 다음과 같이 종양 시험 당일부터 복강내로(IP) 처리하였다:
(1) 10 ㎎/㎏의 인간 아이소타입 대조군 번호 1 + 5 ㎎/㎏의 인간 아이소타입 대조군 번호 2
(2) 10 ㎎/㎏의 항-인간 PD-1(REGN2810; 세미플리맙) + 5 ㎎/㎏의 인간 아이소타입 대조군 번호 2
(3) 5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075) + 10 ㎎/㎏의 인간 아이소타입 대조군 번호 1 또는
(4) 5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075) + 10 ㎎/㎏의 항-인간 PD-1(REGN2810).
그런 다음, 항체 주사(들)를 실험을 통해 주당 2회 투여하였다. 종양을 2차원적으로 측정하고(길이×폭), 종양 부피를 계산하였다(길이×폭2×0.5). 종양이 지정된 종양 종점에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다(종양 부피 > 2000㎣ 또는 종양 궤양).
아이소타입 대조군 번호 1 및 아이소타입 대조군 번호 2는 Fel d1에 결합하는 음성 대조군 항체이다.
각 처리 그룹에서 시간 경과에 따른 A431 종양 크기의 크기는 도 4에 제시되어 있다. 항-PD-1과 조합한 EGFR×CD28은 인간화 마우스에서 상승적으로 제어되고 근절된 인간 종양 이종이식편이다. EGFR×CD28 단일요법은 종양 성장을 현저하게 지연시킬 수 있었고, 항-PD-1 Ab와의 조합은 종양 진행을 추가로 저해하였다. 대조군 PSMA×CD28 Ab를 동일한 처리 환경에서 사용하였을 때, 항-PD1 처리 유무에 관계 없이 종양 성장 저해는 관찰되지 않았다(도 5). A431 종양 세포에 대한 PSMA 발현의 결여는 FACS에 의해 검증하였다(도 6).
이러한 데이터는 항-PD1 단일요법이 제한된 항-종양 반응을 일으키고 항-EGFR 단일요법이 부분적인 항-종양 반응을 일으킨 반면, 병용 요법은 강하고, 강력한 항-종양 면역 반응을 나타내었음을 보여주었다.
실시예 4: 단일요법으로서 EGFR×CD28 항체의 투여는 인간 PBMC 세포가 생착된 NSG 마우스에서 인간 A431 종양 이종이식편을 제어하고 근절한다.
A431 표피모양 암종 종양 세포(ATCC에서 입수)를 인간 PBMC와 혼합하고, NSG 마우스(NOD/SCID/γc 널)에 피하로 이식하였다. 마우스를 예방적(제0일, 제3일, 제7일 처리) 또는 치료적(제3일, 제7일, 제10일) 프로토콜로 처리하였다.
예방적 프로토콜을 위해, 마우스를 4개의 처리 그룹으로 분리하였다. 각 그룹은 다음으로 복강내로(IP) 처리하였다:
(1) 5 ㎎/㎏의 대조군 Ab EGRvIII×CD3(bs17664D)
(2) 5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075)
(3) 0.5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075)
(4) 0.05 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075).
치료적 프로토콜을 위해, 마우스를 3개의 처리 그룹으로 분리하였다. 각 그룹을 다음으로 처리하였다:
(1) 5 ㎎/㎏의 대조군 Ab EGRvIII×CD3(bs17664D)
(2) 5 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075)
(3) 0.05 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075).
종양을 2차원적으로 측정하고(길이×폭), 종양 부피를 계산하였다(길이×폭2×0.5). 종양이 지정된 종양 종점에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다(종양 부피 > 2000㎣ 또는 종양 궤양).
각 처리 그룹에서 처리된 마우스에서의 평균 종양 크기는 도 7a 및 도 7b에 요약되어 있다. 이러한 데이터는 예방적 환경에서는 강한 항-종양 반응이 테스트된 모든 3가지 용량에서 관찰되는 반면, 치료적 환경에서는 반응이 완전하지 않다는 것을 보여주었다.
실시예 5: 단일요법으로서 EGFR×CD28 항체의 투여는 인간 PBMC 세포가 생착된 NSG 마우스에서 인간 A549 종양 이종이식편을 제어하고 근절시킨다.
A549 폐 선암종 종양 세포(ATCC에서 입수)를 제0일에 NSG 마우스(NOD/SCID/γc 널)에 피하로 이식하였다. 인간 PBMC를 제3일에 복강내로 생착시켰다. 마우스를 4개의 처리 그룹으로 분리하였다. 각 그룹을 다음으로 복강내로(IP) 처리하였다:
(1) 10 ㎎/㎏의 대조군 Ab EGRvIII×CD3(bs17664D)
(2) 1 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075)
(3) 10 ㎎/㎏의 EGFR×CD28(REGN7075).
Ab 치료제를 제15일, 제22일 및 제29일에 투여하였다. 종양을 2차원적으로 측정하고(길이×폭), 종양 부피를 계산하였다(길이×폭2×0.5). 종양이 지정된 종양 종점에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다(종양 부피 > 2000㎣ 또는 종양 궤양).
각 처리 그룹에서 처리된 마우스에서의 평균 종양 크기는 도 8에 요약되어 있다. 종양이 확립된 치료적 환경에서 상당한 용량-의존적 항-종양 반응이 관찰되었다.
실시예 6: EGFR×CD28 공동-자극 이중특이성 항체는 CD28+ 및 EGFR+ 세포에 결합한다.
유세포 분석을 이용하여 주캇 세포(CD28+ 세포) 및 PEO1 세포(EGFR+ 세포)에 대한 EGFR×CD28(REGN6323)의 결합을 결정하였다. 각 세포 유형에 대한 항체의 결합이 관찰되었다. 도 1a 및 도 1b 참조.
EGFR을 내인성으로 발현하는 세포주(PEO1, EGFR+)를 1μM의 Violet Cell Tracker로 표지하고 37℃에서 밤새 평판배양하였다. 별도로, 인간 PBMC(뉴욕 혈액 센터(New York Blood Center)) 또는 사이노몰구스 원숭이 PBMC(코반스(Covance), 뉴저지주 크랜포드 소재)를 1×106개 세포/㎖가 보충된 RPMI 배지에 평판배양하고, 부착성 대식세포, 수지상 세포 및 일부 단핵구를 고갈시켜 림프구를 풍부하게 하기 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 표적 세포를 부착성 세포-고갈된 미경험(naive) 인간 PBMC(효과기/표적 세포 4:1 비) 및 TSA×CD3 또는 비-표적화 CD3-기반 이중특이성 항체의 연속 희석액을, 단독으로 또는 고정된 농도(2.5 ㎍/㎖)의 TSA×CD28 이중특이성 항체와 조합하여 37℃에서 96시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 무효소 세포 해리 완충액을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 세포를 제거하고, 유세포 분석(FACS)에 의해 분석하였다.
FACS 분석을 위해, 세포를 생존력 far red cell tracker(인비트로젠(Invitrogen))로 염색하고, 직접적으로 CD2, CD4, CD8 및 CD25(BD)에 대한 항체를 직접 접합하였다. 보정 비드를 사용하여 샘플의 세포 계수를 실행하였다. 살해의 특이성을 평가하기 위해, 표적 세포를 Violet Cell Tracker 양성 집단으로 게이팅하였다. 살아 있는 표적 세포의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: 생존 세포 % = (R1/R2)*100, 여기서 R1 = 항체의 존재하에 살아 있는 표적 세포의 % 및 R2 = 테스트 항체의 부재하에 살아 있는 표적 세포의 %. T 세포 활성화는 CD2+/CD4+ 또는 CD2+/CD8+ T 세포 중 활성화된(CD25+) T 세포의 퍼센트로 측정하였다. 보정 비드당 살아 있는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 수를 계산하여 T 세포 수를 측정하였다.
배지에 축적된 사이토카인의 수준을 BD 혈구계산 비드 어레이(cytometric Bead Array: CBA) 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 분석하였다.
실시예 7: 종양내 T-세포 클러스터 분석.
처리가 A431 종양 이종이식편 모델에서 인간 T-세포의 활성화에 현저한 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 종양내 T-세포를 프로파일링하였다. 통계적으로 유의한 상이한 T 세포 클러스터를 독립적으로 계층화하는 방법인 CITRUS(클러스터 확인, 특성화 및 퇴행)를 사용하여 단일 및 조합 처리시 반응하는 인간 CD8+/CD4+ T-세포 클러스터를 확인하였다.
생체내 실험의 유세포 분석을 위해, 종양을 수확하고, 단일 세포 현탁액을 제조하고, ACK 용해 완충액(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 살아 있는/죽은 세포 식별(discrimination)을 Live/dead fixable blue 죽은 세포 염색 키트(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 Symphony(비디 바이오사이언스(BD Bioscience))에서 획득하고, Cytobank 소프트웨어(사이토뱅크(Cytobank), 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 분석하였다. 샘플당 동일한 수의 분석을 수행하였다. 이벤트의 범위는 획득된 이벤트가 가장 적은 샘플에 의해 결정하였다. 특정 마커를 기반으로 T 세포를 자동으로 클러스터링하기 위해, 사이토뱅크의 CITRUS 분석을 사용하였다.
EGFR×CD28(REGN7075) 및 항-PD-1 Ab(세미플리맙) 단일 작용제 처리는 모두 높은 수준의 PD-L1 및 ICOS를 발현하는 CD8+ T-세포 클러스터 C1을 감소시켰다(도 9a 및 도 9b 참조). PD-1 차단만으로도 고도로 활성화된 표현형(높은 수준의 CD2, CD86, GITR, TIGIT 및 ICOS)으로 CD8+ T-세포 클러스터 C2의 증식을 강력하게 유도하였다. 흥미롭게도, 단일 또는 조합 처리에 반응하는 더 다양한 CD4+ T 세포 클러스터가 관찰되었다(도 9c 및 도 9d). 조합 처리만이 표현형(높은 Ki67, 낮은 CD45RA 및 CCR7)과 같은 증식 효과기 메모리와 클러스터 C3(낮은 CD38, CD45RA 및 CCR7)과 같은 덜 소모된 효과기 메모리로 클러스터 C2를 상당히 증식시켰다. CD8+ T-세포와 유사하게, 조합 처리는 더 높은 PDL1 발현 수준으로 클러스터 C1을 현저하게 감소시켰다. PD-1 차단 단일요법은 보다 활성화된 표현형과 유사한 더 높은 CD38 발현 수준(C4)으로 효과기 메모리 세포의 증식을 유도하였다. EGFR×CD28 단일요법은 종양(C5)에서 미경험 유사 CD4+ T-세포의 작은 풀을 유지하였으며, 이는 항-PD1 Ab 처리시 추가로 프라이밍/활성화될 수 있다.
이러한 데이터는 인간화 마우스에서 인간 이종이식편 종양 모델이 PD-1 차단 시약과 조합하여 단일요법으로서 EGFR×CD28 이중특이성 항체를 테스트하기 위한 강력한 플랫폼을 제공함을 보여주었다. 고차원 FACS 분석과 완전 자동화된 클러스터링 확인 방법을 사용하여 인간 면역계가 재구성된 마우스에서 기본 면역 메커니즘을 더 해부할 수 있었다. PD1 차단만으로 표현형이 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T-세포의 강력한 증식을 유도할 수 있었지만, 기억 발달을 촉진하고 현저한 종양 저해를 유도하는데 충분하지 않았다. EGFR×CD28 처리와 조합될 때, 균형 잡힌 T-세포 활성화 상태가 달성될 수 있고, 강력한 항-종양 반응을 유도할 수 있다.
실시예 8: EGFR×CD28 단독 또는 항-PD1 요법과의 조합은 사이노몰구스 원숭이에서 CD28 초효능제와 비교하여 전신 T-세포 활성화를 유도하지 않는다
EGFR×CD28 이중특이성 항체(REGN7075) 단독의 내약성 또는 항-PD1 항체와의 조합에서 상승적 약리학에 대한 가능성을 평가하기 위해, 사이노몰구스 원숭이에서 연구를 수행하였다. 처리 그룹당 3마리의 원숭이에 정맥내 주입을 통해 단일 용량(10 ㎎/㎏)의 EGFR×CD28을 단독으로 또는 REGN2810(세미플리맙)(10 ㎎/㎏)과 조합하여 제공하였다(조합 그룹은 순차적 주입을 받았음).
사이노몰구스 원숭이 연구를 IACUC 지침에 따라 수행하였다. EGFR×CD28을 이용한 연구를 위해, 암컷 사이노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis) 연구를 SNBL USA(실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(the Association for Assessment and Accredation of Laboratory Animal Care: AAALAC)에 의해 승인됨; 실험 동물 복지국(Office of Laboratory Animal Welfare: OLAW)에서 발행된 동물 복지 보증(Animal Welfare Assurance); 미국 농무부(United States Department of Agriculture: USDA) 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(institutional Animal care and use committee: IACUC)에 등록됨)에서 수행하였다. 유세포 분석을 위해, 의식이 있는 억제된 동물의 말초 정맥에서 혈액을 포타슘 EDTA 튜브로 수집하였다. 100㎕의 전혈을 명시된 항체로 염색하였다. FACS Canto II를 사용하여 유세포 분석 데이터 수집을 수행하였다. 개별 집단의 절대 수(absolute count)를 모/조모 집단 게이트로부터 파생된 상대적 백분율과 및 다음 공식에 따라 검증된 혈액학 분석기(hematology analyzer)로부터의 총 모/조모 집단 수로부터 계산하였다: 절대 집단 수(×103/㎕) =(집단 상대 % × 총 모/조모 집단 수)/100. 혈청 사이토카인의 경우, 혈액을 항응고제가 포함된 혈청 분리기 튜브에 수집하였다. 혈청을 4℃로 설정된 원심분리기에서 원심분리를 통해 분리하였다. MSD U-Plex 플랫폼(IL-2, 4, 6, 8, 10, TNFα 및 IFNγ)을 사용하여 분석하였다.
독성의 평가는 임상 관찰, 정성적 음식 소비, 체중 및 활력 징후(신체 온도, 심박수, 맥박 산소 측정 및 호흡률) 및 실험 완료시 임상 및 해부학적 병리를 기반으로 하였다. 사이토카인 및 FACS 면역표현형 분석을 위해 혈액 샘플을 수집하였다. EGFR×CD28 단독 또는 세미플리맙과의 조합은 내약성이 우수하였으며, 모든 동물은 예정된 부검 시간까지 살아있었다. 관찰된 임상-관찰과 관련된 테스트 항목은 없었다(데이터 미도시). 장기 무게의 변화는 발견되지 않았으며, 말기 부검에서 어떠한 거시적 변화도 관찰되지 않았다(데이터 미도시). 또한, 현저한 사이토카인 방출, T-세포 주변화(marginalization) 또는 활성화도 관찰되지 않았다(도 10a 내지 도 10c). 대조적으로, 현저한 사이토카인 방출, 림프구 주변화 및 T-세포 활성화가 CD28 "초효능제"가 투여된 원숭이에서 관찰되었다(데이터 미도시). EGFR×CD28을 단독으로 또는 세미플리맙과 조합하여 투여한 동물에서 현저한 처리-관련 조직학적 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 9: EGFR×CD28 이중특이성 항체(REGN7075) 및 항-PD-1 항체(REGN2810) 병용 요법에 의해 매개되는 용량 의존적 항-종양 반응
재료 및 방법
NCI-H292
NCI-H292 세포주는 32세 여성 환자로부터 단리된 인간 점막표피모양 폐 암종 세포주(ATCC CRL-1848)이다. 세포주는 PSG(페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민)가 보충된 10% FBS와 함께 RPMI-1640에서 유지하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
인간 PBMC는 리치바이오(ReachBio)로부터 입수하였으며, Cat. # 0500-401, 공여체 # 0190205를 이 연구에 사용하였다.
종양 연구에 사용된 절차:
암컷 NSG 마우스(대략 10주령)를 실험에 사용하였다. 마우스에 2×106개의 PBMC와 혼합된 4×106개의 종양 세포를 피하로 이식하였다. 연구 기간 동안 1주일에 2회 캘리퍼로 종양 성장을 모니터링하였다. 표 12에 나타낸 항체를 종양 이식 후 명시된 날짜에 언급된 투여량으로 단일요법으로 또는 조합으로 복강내 주사에 의해 투여하였다. IACUC 표준에 따라 마우스가 궤양성 종양 또는 종양 부피가 1500㎤를 초과하는 경우 실험을 종료하였다. 통계적 분석은 표 13에 나타나 있다. 데이터는 도 11 및 도 12에 요약되어 있다.
Figure pct00062
Figure pct00063
요약
도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같은 데이터는 이러한 모델에서 테스트될 때, 항체가 단독으로 사용될 때 얻어진 결과와 비교하여 REGN7075(항-EGFR×항-CD28)가 항-PD-1 항체(REGN2810)와 조합될 때 가장 강력한 항-종양 반응이 관찰된다는 것을 보여주었다.
실시예 10A: REGN6323을 사용한 유세포 분석 결합 적정
유세포 세포측정 분석을 사용하여 여러 암 세포주(A375, 22RV1, PEO1, CAPAN2, SW1990, H292), 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 주캇 세포에 대한 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체의 결합을 결정한 다음, 표지된 항-인간 2차 IgG 항체로 검출하였다. 간략하게는, 1×105개 세포/웰을 인간 및 사이노몰구스 T 세포의 경우 100nM 내지 1.5pM 범위 그리고 EGFR 발현 세포의 경우 133nM 내지 2pM 범위의 EGFR×CD28 이중특이성 항체 또는 대조군 항체(인간 또는 사이노몰구스 CD28에 대한 교차-반응성 없이 인간 항원에 결합하는 인간 IgG4 항체)의 연속 희석액과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 1%의 여과된 FBS를 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하고, 형광단-접합된 항-인간 2차 항체를 세포에 첨가하고, 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. Live/dead 염료를 인간 및 사이노몰구스 T 세포 인큐베이션에 첨가하였다. 항체 또는 2차만을 함유하는 웰을 대조군으로 사용하였다.
EGFR 발현 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 1%의 여과된 FBS를 함유하는 200㎕의 차가운 PBS에 재현탁하고, BD FACS Canto II에서 유세포 분석에 의해 분석하였다.
인간 또는 사이노몰구스 T 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 브릴리언트 염색 완충액 중 항-CD2, 항-CD16, 항-CD4 및 항-CD8 항체의 칵테일로 4℃에서 추가 20분 동안 인큐베이션하여 염색하였다. 세척 후, 세포를 1%의 여과된 FBS를 함유하는 200㎕의 차가운 PBS에 재현탁하고, Live/CD2+/CD4+/CD16-게이트 또는 Live/CD2+/CD8+/CD16-게이트에 게이팅하고, BD FACS LSR-Fortessa-X20에서 유세포 분석에 의해 분석하였다.
유세포 분석 결합 적정의 결과(표 14A 및 표 14B 및 도 13a, 도 3b 및 도 13c 참조)
인간 T 세포 및 사이노몰구스 T 세포의 표면에 대한 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체(REGN6323)의 결합을 유세포 분석에 의해 위에 기재된 바와 같이 테스트하였다. 결과는 선택된 농도 범위 내에서 포화에 도달하지 않고, 인간 및 사이노몰구스 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에 결합함을 보여주었다(도 13a).
EGFR을 발현하는 다른 세포주의 표면에 대한 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체(REGN6323)의 결합을 또한 유세포 분석에 의해 테스트하였다. 사용된 세포주는 인간　T 림프구　세포의 불멸화 세포주인 주캇 세포(도 13c 참조); 상피 흑색종 세포주인 A375 세포; 상피 전립선암종인 22RV1 세포; 복수로부터 유래되는 난소암종 세포주인 PEO1 세포; 췌장 선암종 세포주인 CAPAN2; 전이성 부위(비장)로부터 유래되는 췌장 선암종인 SW1990; 및 폐 상피 암종 세포주인 H292였다. 결과는 REGN6323이 1.48E-09M의 EC50으로 A375 세포에 결합하였음을 보여준다. REGN6323은 5.54E-10M의 EC50으로 22RV1 세포에 결합하였다. REGN6323은 6.67E-10의 EC50으로 PEO1 세포에 결합하였다. REGN6323 1.29E-09M의 EC50으로 CAPAN2 세포에 결합하였다. REGN6323은 2.96E-09M의 EC50으로 SW1990 세포에 결합하였고, REGN6323은 6.74E-10의 EC50으로 H292 세포에 결합하였다(도 13b 참조).
아이소타입 대조군 항체는 인간 또는 사이노몰구스 T 세포에 어떠한 결합도 나타내지 않았고, EGFR을 발현하는 세포주에도 결합하지 않았다.
이러한 데이터는 REGN6323이 EGFR을 발현하는 다양한 암 세포주에 결합할 수 있고, 이와 같이 다중 암 적응증을 치료하는데 효과적일 수 있음을 시사한다.
실시예 10B: REGN6321 및 REGN6322를 사용한 유세포 분석 결합 적정
다른 항-EGFR×항-CD28 이중특이성 항체가 또한 다중 세포 유형에 대한 결합을 나타낼 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 위에 기재된 프로토콜에 따라, REGN6321 및 REGN6322를 유사한 방식으로 테스트하였다. REGN6323도 또한 이 연구에 포함되었다.
도 13c에 나타낸 바와 같이, 결과는 REGN6321, REGN6322 및 REGN6323이 전립선 세포주인 22RV1뿐만 아니라 난소 세포주인 PEO1로 명명된 세포주에 대한 결합을 나타냄을 보여준다. 이러한 결과는 이러한 추가적인 항-EGFR×항-CD28 항체가 EGFR을 발현하는 다른 암 세포주에 걸쳐 결합할 수 있음을 보여주었다.
Figure pct00064
실시예 11: 유세포 분석에 의해 측정된 세포 독성
항-TSA×항-CD3 및 EGFR×CD28 항체의 존재하에 다양한 크기의 종양 특이적 항원(TSA)을 발현하는 세포의 살해를 모니터링하기 위해, 22RV1(PSMA+, STEAP2+) 또는 PEO1(MUC16+) 또는 CAPAN2(MUC16+) 또는 SW1990(MUC16+) 또는 H292(MUC16+) 세포를 1μM의 형광 추적 염료인 Violet Cell Tracker로 표지하였다. 표지 후, 세포를 37℃에서 밤새 평판배양하였다. 개별적으로, 인간 PBMC를 1×106개 세포/㎖로 보충된 RPMI 배지에 평판배양하고, 부착성 대식세포, 수지상 세포 및 일부 단핵구를 고갈시켜 림프구를 풍부하게 하기 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 표적 세포를 부착성 세포-고갈된 미경험 PBMC(효과기/표적 세포 4:1 비), 표적화 TSA×CD3 이중특이성 항체 또는 대조군 TSA×CD3 이중특이성 항체의 연속 희석액(농도 범위: 66.7nM 내지 0.2pM) 및 2.5 ㎍/㎖(16.7nM)의 고정된 농도의 EGFR×CD28 공동자극 분자 REGN6323과 37℃에서 96시간 동안 공동 인큐베이션하였다. 세포를 트립신-EDTA 해리 완충액을 사용하여 세포 배양물 플레이트로부터 제거하고, FACS BD LSRFortessa-X20에서 유세포 분석에 의해 분석하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 dead/live Near IR Reactive(인비트로젠) 염료로 염색하였다. 5E05 계수 비드를 유세포 분석 직전에 각 웰에 첨가하였다. 1E05 비드를 각 샘플에 대해 수집하였다. 살해의 특이성 평가를 위해, 세포를 live Violet 표지된 집단에 대해 게이팅하였다. 살아 있는 집단의 퍼센트를 기록하고, 생존의 계산에 사용하였다.
T 세포 활성화는 세포를 CD2, CD4, CD8, CD25에 직접적으로 접합된 항체를 인큐베이션하고, 총 T 세포(CD2+) 또는 CD8+ T 세포 중 후기 활성화된 T 세포의 퍼센트를 보고함으로써 평가하였다.
세포독성 검정에 기초한 유세포 분석의 결과(표 15 및 도 14 및 도 15)
공동자극 EGFR×CD28 이중특이성 항체 REGN6323을 다양한 크기의 세포 표면 항원을 표적으로 하는 TSA×CD3 항체의 세포독성 효력을 향상시키는 능력에 대해 그리고 여러 암 적응증에 대해 테스트하였다.
REGN6323은 자극되지 않은 인간 PBMC의 존재하에 PSMA 또는 MUC16 또는 STEAP2를 표적으로 하는 다양한 TSA×CD3 이중특이성 항체의 세포독성 효력을 성공적으로 향상시켰다. 표적 세포 살해는 TSA×CD3 단일 작용제 처리와 비교하여 EGFR×CD28 + TSA×CD3 이중특이성 항체 조합의 존재하에 향상되었고, 세포는 pM EC50으로 용량-의존적 방식으로 살해되었다.
관찰된 표적-세포 용해 증가는 다시 pM EC50으로 T 세포에서의 CD25+ 발현의 증가와 관련이 있었다.
Figure pct00065
실시예 12: HDX-MS에 의한 REGN7075, REGN6323 및 REGN6322를 사용한 EGFR의 에피토프 매핑
수소-중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS)을 수행하여 REGN7075(mAb12999P2×mAb14226P2), mAb13006P(모 REGN6323 EGFR 암) 및 mAb35193P(모 REGN6322 EGFR 암)와 상호작용하는 상피 성장 인자 수용체의 아미노산 잔기(재조합 인간 EGFR, 부록의 아미노산 서열)를 결정하였다. HDX-MS 방법의 일반적인 설명은 예를 들어, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemical 267(2):252-259; 및 Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]에 제시되어 있다. 결과는 표 16, 표 17 및 표 18에 나타나 있다.
HDX-MS 실험을 중수소 표지 및 반응 중지(quenching)를 위한 Leaptec HDX PAL 시스템, 샘플 분해 및 로딩을 위한 Waters Acquity M-Class(보조 용매 매니저), 분석적 구배를 위한 Waters Acquity M-Class(바이너리 용매 매니저) 및 펩타이드 질량 측정을 위한 Thermo Q Exactive HF 질량 분석기로 구성된 통합 HDX-MS 플랫폼에서 수행하였다.
표지 용액을 pD 7.0(10mM 포스페이트 완충액, 140mM NaCl 및 3mM KCl, 25℃에서 pH 7.4와 등가)에서 D2O 중 PBS 완충액으로 제조하였다. 중수소 표지의 경우, 1:1 몰비(Ag-Ab 복합체)로 REGN7075와 미리 혼합된 11㎕의 52.0μM hEGFR.mmh(리제네론(Regeneron) 사내 제작 단백질 REGN355) 또는 hEGFR.mmh, 1:0.6 몰비(Ag-Ab 복합체)로 mAb13006P2와 미리 혼합된 11㎕의 34.3μM hEGFR.mmH(리제네론 사내 제작 단백질 REGN355) 또는 hEGFR.mmH, 1:0.6 몰비(Ag-Ab 복합체)로 mAb35193P2와 미리 혼합된 11㎕의 31.4μM hEGFR.mmH(리제네론 사내 제작 단백질 REGN355) 또는 hEGFR.mmH를 20℃에서 44㎕의 D2O 표지 용액과 함께 다양한 시점에서 이중으로 인큐베이션하였다(예를 들어, 비-중수소화 대조군 = 0초; 5분 및 10분 동안 중수소-표지됨). 중수소화 반응을 55㎕의 미리 냉각된 반응 중지 완충액(0.5M TCEP-HCl, 8M 우레아 및 1% 폼산)을 20℃에서 5분 인큐베이션하는 동안 각 샘플에 첨가하여 반응 중지하였다. 그런 다음, 반응 중지된 샘플을 온라인 펩신/프로테이스 XIII 분해를 위해 Waters HDX Manager에 주입하였다. 분해된 펩타이드를 0% 내지 90% B(이동상 A: 0.5% 폼산 및 물 중 4.5% 아세토나이트릴, 이동상 B: 아세토나이트릴 중 0.5% 폼산)에서 22-분 구배로 -9.5℃에서 C8 칼럼(1.0㎜×50㎜, 노바바이오어세이(NovaBioassays))에 의해 분리하였다. 용리된 펩타이드를 LC-MS/MS 또는 LC-MS 모드에서 Thermo Q Exactive HF 질량 분광계에 의해 분석하였다.
중수소화되지 않은 EGFR 샘플의 LC-MS/MS 데이터를 Byonic 검색 엔진(프로테인 메트릭스(Protein Metrics))을 사용하여 hEGFR.mmH(REGN355) 서열 및 그 역 서열을 포함하는 데이터베이스에 대해 검색하였다. 검색 매개변수를 비-특이적 효소 분해 및 인간 글리코실화를 공통 변수 수정으로 사용하여 디폴트로 설정하였다. 그런 다음, 확인된 펩타이드의 목록을 HDX Workbench 소프트웨어(버전 3.3)로 가져와서 모든 중수소화된 샘플로부터 LC-MS에 의해 검출된 각 펩타이드의 중수소 흡수를 계산하였다. 주어진 펩타이드의 경우, 각 시점에서의 중심 질량(강도-가중 평균 질량(intensity-weighted average mass))을 사용하여 중수소 흡수(D) 및 중수소 흡수의 백분율(D%)을 계산하였다.
중수소 흡수(D-흡수) = 평균 질량(중수소화)- 평균 질량(비중수소화)
Figure pct00066
hEGFR.mmH(REGN355)로부터의 총 271개의 펩타이드가 hEGFR.mmH 단독 및 REGN7075 샘플과의 복합체의 hEGFR.mmH 둘 모두로부터 확인되었으며, 이는 hEGFR.mmH의 84.4%의 서열 적용 범위(coverage)를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 퍼센트 D-흡수 값을 나타내는 임의의 펩타이드는 상당히 보호되는 것으로 정의되었다. hEGFR.mmH 상의 아미노산 345-368(LHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQEL 서열번호 70) 및 399-416(LEIIRGRTKQHGQFSLAV 서열번호 71)에 상응하는 펩타이드는 REGN7075에 의해 상당히 보호되었다(hEGFR.mmH 잔기는 hEGFR.mmH 서열에 따라 넘버링되었음).
hEGFR.mmH(REGN355)로부터의 총 341개의 펩타이드가 hEGFR.mmH 단독 및 mAb13006P 샘플과의 복합체의 hEGFR.mmH 둘 모두로부터 확인되었으며, 이는 hEGFR.mmH의 85.8%의 서열 적용 범위를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 퍼센트 D-흡수 값을 나타내는 임의의 펩타이드는 상당히 보호되는 것으로 정의되었다. hEGFR.mmH 상의 아미노산 345-368(LHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQEL 서열번호 70) 및 399-416(LEIIRGRTKQHGQFSLAV 서열번호 71)에 상응하는 펩타이드는 mAb13006P에 의해 상당히 보호되었다(hEGFR.mmH 잔기는 부록의 hEGFR.mmH 서열에 따라 넘버링되었음).
hEGFR.mmH(REGN355)로부터의 총 335개의 펩타이드가 hEGFR.mmH 단독 및 mAb35193P 샘플과의 복합체의 hEGFR.mmH 둘 모두로부터 확인되었으며, 이는 hEGFR.mmH의 85.5%의 서열 적용 범위를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 퍼센트 D-흡수 값을 나타내는 임의의 펩타이드는 상당히 보호되는 것으로 정의되었다. hEGFR.mmH 상의 아미노산 133-154(CNVESIQWRDIVSSDFLSNMSM 서열번호 72)에 상응하는 펩타이드는 mAb35193P에 의해 상당히 보호되었다(hEGFR.mmH 잔기는 hEGFR.mmH 서열에 따라 넘버링되었음).
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
hEGFR.mmh의 아미노산 서열
hEGFR(ECD).CPGG.MMH6(REGN355): C-말단 CPGG.myc 에피토프(E1-L10).GlyGly.myc 에피토프(E1-L10).SerGly.6XHis.SSG 태그를 갖는 인간 EGFR(아미노산 L25-A647, 등록 번호 NM_005228.4)(mmh 태그는 밑줄 그어져 있음)
Figure pct00070
실시예 13: 표면 플라스몬 공명 유도 결합 친화도 및 EGFR×CD28 이중특이성 및 EGFR 및 CD28에 대한 관련 모 항체의 동역학 상수
EGFR 실험 절차
포획된 항-EGFR×CD28 이중특이성 Ab에 대한 hEGFR.mmH(REGN355) 결합에 대한 평형 해리 상수(K D 값)를 Biacore 4000 기구를 사용하는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용하여 결정하였다. CM5 Biacore 센서 표면을 정제된 항-EGFR×CD28 이중특이성 Ab를 포획하기 위해 단일클론 마우스 항-인간 Fc 항체(REGN2567, 로트 번호 REGN2567-L1)와의 아민 커플링에 의해 유도체화하였다. 이러한 Biacore 결합 연구는 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20(HBS-EP 전개 완충액)으로 구성된 완충액에서 수행하였다. HBS-EP 전개 완충액에 제조된 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(REGN355)를 갖는 다양한 농도의 hEGFR.mmH(30nM 내지 120pM의 범위, 3-배 연속 희석)를 30㎕/분의 유속으로 Ab 포획된 표면 위에 주입하였다. 해리를 5분 동안 모니터링하고, HBS-EP 전개 완충액에서 hEGFR.mmH의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 모든 결합 동역학 실험을 25℃에서 수행하였다. Scrubber 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 동역학 결합(k a) 및 해리(k d) 속도 상수를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K D) 및 해리 반감기(t½)를 다음과 같은 동역학 속도 상수로부터 계산하였다:
K D( M) = k d / k a , 및 t½(분) = 0.693/ k d /60
25℃에서 정제된 EGFR×CD28 Ab에 대한 hEGFR.mmH 결합에 대한 결합 동역학 매개변수는 하기 표 19에 나타나 있다.
CD28 실험 절차
포획된 hCD28.mFc(REGN2012)에 대한 정제된 이중특이성 Ab 결합에 대한 평형 해리 상수(K D 값)를 Biacore T-200 기구를 사용하는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용하여 결정하였다. CM5 Biacore 센서 표면을 C-말단 마우스 Fc 태그(hCD28.mFc, REGN2012)를 갖는 정제된 hCD28을 포획하기 위해 다중클론 토끼 항-마우스 Fc 항체(GE Healthcare, Cat # BR100838)와의 아민 커플링에 의해 유도체화하였다. 이러한 Biacore 결합 연구는 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20(HBS-EP 전개 완충액)으로 구성된 완충액에서 수행하였다. HBS-EP(90nM 내지 1.1nM의 범위, 3-배 연속 희석)에 제조된 다양한 농도의 이중특이성 Ab를 50㎕/분의 유속으로 hCD28.mFc 포획된 표면 위에 주입하였다. 해리를 4분 동안 모니터링하고, HBS-EP에서 이중특이성 Ab의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 모든 결합 동역학 실험을 25℃에서 수행하였다. Scrubber 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 동역학 결합(k a) 및 해리(k d) 속도 상수를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K D) 및 해리 반감기(t½)를 다음과 같은 동역학 속도 상수로부터 계산하였다:
K D( M) = k d / k a , 및 t½(분) = 0.693/ k d /60
25℃에서 hCD28.mFc에 결합하는 EGFR×CD28 Ab 결합에 대한 결합 동역학 매개변수는 아래 표 20에 나타나 있다.
표로 만든 데이터 요약:
Figure pct00071
Figure pct00072
실시예 14: 인간 EGFR을 과발현하는 조작된 BaF3 세포를 사용한 리간드-매개성 세포 성장 검정에서 EGFR×CD28 이중특이성 항체의 특성화
EGFR(ErbB1, HER1) 수용체는 다세포 유기체의 세포 증식, 생존, 분화 및 이동을 조절하는 수용체 타이로신 카이네이스(receptor tyrosine kinase: RTK) 패밀리의 구성원이다. 수용체의 활성화는 가용성 리간드, 예를 들어 EGF 또는 TGFβ의 결합을 통해 발생하며, 이는 EGFR의 동종-이량체화 및 자가인산화를 유도하여, 결국 Ras/MAPK, PLCγ/PKC, PI3-카이네이스/Akt 및 STAT 경로와 같은 과다한 세포내 신호전달 캐스케이드의 활성화를 유도한다(문헌[Wieduwilt et al. 2008; Cell Mol Life Sci. May; 65(10): 1566-1584]).
EGFR 신호전달에 대한 항-EGFR×CD28 항체의 차단 효과를 연구하기 위해, 인간 상피 성장 인자 수용체(EGFR - Genbank 등록 번호 NP_005219.2의 아미노산 M1 내지 A1210)를 안정적으로 과발현하도록 유전적으로 변형된 조작된 IL-3-의존적 Ba/F3 뮤린 조혈 세포주를 사용하여 증식 검정을 전개하였다(문헌[Kong et al. 2017; Oncotarget Vol. 8, (No. 22), pp: 35488-35489]). 조작된 BaF3/hEGFR 세포를 적정된 항체의 존재하에 리간드(인간 EGF 또는 TGFβ)로 자극하였고, 세포 성장을 증식 세포의 함수로서 삼중수소 혼입에 의해 측정하였다.
실험 절차:
조작된 BaF3/hEGFR 세포를 배양 배지(RPMI1640 + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 + 10 ㎍/mℓ 마우스 IL-3 + 0.5 ㎍/mℓ 퓨로마이신)에서 성장시키고, 세포-증식 검정에 사용하기 전에 24시간 동안 IL-3이 없는 배지(RPMI1640 + 1% FBS)에서 결핍(starved)시켰다. 간략하게는, 96-웰 둥근-바닥 조직 배양 플레이트에서, 12.5×10^5 세포/웰을 불변 리간드, hEGF(0.5nM) 또는 hTGFβ(0.5nM)의 존재하에 항체 함유 대조군을 포함하지 않는 15.2pM 내지 100nM 범위의 1:3 연속 희석 항체에 첨가하였다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 0.3 μCi/웰 적정된 티미딘을 세포에 첨가하고, 플레이트를 16시간 더 인큐베이션하였다. 티미딘, 및 따라서 삼중수소는 분열하는 세포의 새로 합성된 DNA에 더 많은 양으로 혼입될 것이다. 인큐베이션 후, 세포를 96-웰 UniFilter 플레이트 상에서 수확하고, 30㎕의 섬광 유체를 각 웰에 첨가하였다. 삼중수소 혼입을 마이크로플레이트 섬광계수 및 발광분석 장치(Microplate 섬광 & Luminescence Counter) TopCount NXT 기구를 사용하여 분당 계수(CPM: counts per minute)로 측정하였다. 세포, 항체 및 리간드를 검정 배지(Opti-MEM + 0.1% 소 혈청 알부민)에 제조하고, 모든 연속 희석액을 이중으로 테스트하였다.
항체의 IC50/EC50 값을 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용하여 10-포인트 용량-반응 곡선에 걸쳐 4-매개변수 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다. 증식의 최대 저해를 다음 방정식에 의해 결정하였다:
Figure pct00073
결과의 요약:
EGFR×CD28 이중특이성(REGN6322; REGN6323 및 REGN7075) 및 이들의 상응하는 모 EGFR 항체(mAb35193P2; mAb13006P2 및 mAb12999P2)를 0.5nM hEGF 또는 hTGFβ의 존재하에 사내 생성된 비교 항체(얼비툭스) 및 아이소타입 매치된 음성 대조군과 함께 테스트하였다(표 21 참조).
0.5nM EGF의 존재하에:
이중특이성 항체(REGN6322; REGN6323 및 REGN7075) 중 어느 것도 증식의 용량-의존적 저해를 나타내지 않았다. 이들의 최대 저해 값은 30.5% 내지 -6.8%의 범위였다(음성 값은 증식의 증가를 의미함). 반면에, mAb35193P2, mAb12999P2 및 사내 제조 얼비툭스는 각각 2.55nM/29.6%, 19.8nM/91.8% 및 6.69nM/97.6%의 IC50 및 최대 저해 값으로 BaF3/hEGFR 세포의 증식을 저해하였다. mAb13006P2는 93.2%의 최대 저해를 나타내었고, IC50 값은 계산할 수 없었다. 음성 아이소타입 대조군 항체는 예상대로 저해를 나타내지 않았다.
0.5nM hTGFβ의 존재하에:
REGN6322는 3.67nM의 EC50으로 증식에서 40.6% 증가를 나타낸 반면, REGN6323 및 REGN7075는 음성 아이소타입 대조군 항체와 유사한 반응을 나타내지 않는다. 대조적으로, mAb13006P2, mAb12999P2 및 사내 제조 얼비툭스는 각각 6.55nM/97.2%, 7.79nM/95.9% 및 1.38nM/99.8%의 IC50 및 최대 저해 값으로 증식을 저해하였다. mAb35193P2는 914pM의 EC50 값으로 32.7%의 증식 증가를 나타내었다.
Figure pct00074
실시예 15: NCI-H292 및 인간 1차 T-세포를 사용한 동종이계 T-세포 활성화 검정에서 EGFR×CD28 이중특이성 항체의 특성화
Figure pct00075
배경
적절한 T 세포 활성화를 위해서는 2개의 신호, "신호 1" 및 "신호 2"가 필요하다. "신호 1"은 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)가 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)의 펩타이드-결합 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC)에 결합함으로써 유도된다. 반면, "신호 2"는 T 세포의 공동-자극 CD28 수용체와 APC에 존재하는 분화 클러스터 80 또는 86(CD80/CD86)의 리간드를 결합함으로써 제공된다(문헌[Martin et al. 1986; June et al. 1987; Harding et al. 1992]). 따라서, CD28 신호전달의 활성화는 기존 TCR 신호전달을 향상시키는 표적화된 접근법을 제공한다.
EGFR×CD28 이중특이성 항체는 동종이계 T 세포 활성화 검정에서 기존 "신호 1"의 존재하에 T 세포의 활성화를 향상시키기 위해, "신호 2"를 제공하기 위해 EGFR+ 표적 세포를 CD28+ T 세포와 연결함으로써 CD28의 천연 리간드를 모방하도록 설계된다. 그러나, T 세포 활성화는 T 세포의 세포 예정사단백질 1 수용체(PD-1)를 APC의 리간드 PD-L1에 연결함으로써 저해될 수 있다. 결찰된 PD-1은 CD28 및 TCR 복합체에 대한 포스파테이스의 동원을 유도하고(문헌[Zou et al. 2008, Francisco et al. 2010, Hui et al. 2017]), 이는 차례로 TCR 신호전달 및 CD28 자극에 대응한다. 따라서, EGFR×CD28 이중특이성 항체와 조합된 세미플리맙과의 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 T 세포 기능을 강화하고, 암과 같은 표적 세포의 살해를 촉진할 수 있다.
실험 절차:
IL-2 방출 및 T-세포 증식에 의해 결정되는 바와 같이 "신호 2"를 전달하기 위해 EGFR 및 CD28을 결합함으로써 인간 1차 T-세포를 활성화하는 EGFR×CD28 이중특이성 항체의 능력을 "신호 1"의 역할을 하기에 충분한 동종이계 TCR 반응을 제공하는 EGFR+/PD-L1+ 인간 폐암 세포주(NCI-H292)의 존재하에 평가하였다.
인간 1차 CD3 + T 세포의 단리:
EasySepTM Direct 인간 PBMC 단리 키트를 사용하여 프리시즌 포 메디신(Precision for Medicine)의 건강한 공여체 백혈구 팩(공여체 555015)으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하고, 제조업체의 권장 프로토콜을 따라 동결하였다. 동결된 PBMC의 바이알을 해동하여 CD3+ T-세포를 단리하였다. 공여체 PBMC를 스템셀 테크놀로지스의 EasySepTM 인간 CD3+ T 세포 단리 키트를 사용하고 제조업체의 권장 지침에 따라 CD3+ T-세포를 농축시켰다.
IL-2 방출 검정:
자극 배지에 재현탁된 농축된 CD3+ T-세포를 1×105개 세포/웰의 농도로 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다. EGFR 및 PD-L1을 내생적으로 발현하는 성장-정지된 NCI-H292 세포를 5×104개 세포/웰의 최종 농도로 CD3+ T-세포에 첨가하였다. 후속적으로, REGN6322, REGN6323, REGN7075, 비-TAA×CD28 및 이들의 매치된 아이소타입 대조군(IsoC-2)을 1:4 희석으로 0.76pM에서 50nM로 적정하고 웰에 첨가하였다. 10-포인트 희석의 최종 포인트에는 적정된 항체가 포함되어 있지 않다. 적정된 항체의 첨가 후, 일정한 20nM의 세미플리맙 또는 이의 매치된 아이소타입 대조군(IsoC-1)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 인큐베이션하고, 50ℓ의 총 상청액을 제거하고, 수집된 상청액에서 5ℓ를 IL-2를 측정하는데 사용하였다. 검정 상청액에서 IL-2의 양을 제조업체의 프로토콜에 따라 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 AlphaLisa 키트를 사용하여 결정하였다. IL-2 측정값을 퍼킨엘머의 다중표지 플레이트 판독기 Envision에서 획득하고, 값을 pg/㎖로 보고하였다. 모든 연속 희석액을 삼중으로 테스트하였다.
항체의 EC50 값을 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용하여 10-포인트 용량-반응 곡선에 걸쳐 4-매개변수 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다. 최대 IL-2는 테스트된 용량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로 제공된다.
T-세포 증식 검정:
37℃, 5% CO2에서 96시간의 인큐베이션 및 상청액 제거 후(IL-2 방출 검정 참조), 0.25 mCi/웰의 삼중수소 티미딘을 세포에 첨가하고, 플레이트를 추가 6시간 내지 8시간 동안 인큐베이션하였다. 티미딘, 따라서 삼중수소는 분열하는 세포의 새로 합성된 DNA에 더 많은 양으로 혼입될 것이다. 인큐베이션 후, 세포를 96-웰 UniFilter 플레이트에서 수확하고, 30㎕의 섬광 유체를 각 웰에 첨가하였다. 삼중수소 혼입을 마이크로플레이트 섬광계수 및 발광분석 장치 TopCount NXT 기구를 사용하여 분당 계수(CPM)로 측정하였다. 모든 연속 희석액을 삼중으로 테스트하였다.
항체의 EC50 값을 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용하여 10-포인트 용량-반응 곡선에 걸쳐 4-매개변수 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다. 최대 CPM은 테스트된 용량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로 제공된다.
결과의 요약(표 23)
세미플리맙의 존재하에, EGFR×CD28 항체 처리(REGN6322, REGN6323, 및 REGN7075)는 비-TAA×CD28 및 IsoC-2와 비교하여 더 높은 IL-2 및 증식 반응을 유도하며, 이는 CD28 이중특이성에 대한 각각의 매치된 아이소타입 대조군이다. 반면에, 세미플리맙의 부재하에, EGFR×CD28 항체 처리는 비-TAA×CD28 및 IsoC-1과 비교하여 더 높은 IL-2 및 증식 반응을 유도하지만, 최대 값은 더 낮다.
Figure pct00076
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. SKOKOS, DIMITIS Haber, Lauric Lin, Chia-Yang MURPHY, ANDREW J. YANCOPOULOS, GEORGE D. <120> EGFR X CD28 MULTISPECIFIC ANTIBODIES <130> WO 2020/198009 <140> 2020-10-01 <141> <150> 62/822,124 <151> 2019-03-22 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccatcatt actttctact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaggg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggatcac caactacaat 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca ggtctccctg 240 aaactgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agtgtccgag 300 gattcctact ttcactacgg gatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ile Thr Phe 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Phe His Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggtgactcca tcattacttt ctac 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Asp Ser Ile Ile Thr Phe Tyr 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 atctattaca gtgggatcac c 21 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr 1 5 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 gcgagagtgt ccgaggattc ctactttcac tacgggatgg acgtc 45 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Ala Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Phe His Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggatcac ccactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagatcca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag atggggggtt 300 cggagggact actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ile Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Trp Gly Val Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ggtggctcca tcagtagtta ctac 24 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 gcgagatggg gggttcggag ggactactac tactacggta tggacgtc 48 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Ala Arg Trp Gly Val Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 15 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 gaaatagttt tgacacagag tcccggcaca ctgtcactct ctcccgggga aagagccacc 60 ttgtcatgta gagcaagtca gtcagtctct agctcttatc tcgcctggta ccagcagaag 120 ccgggacagg cccctagact gctgatctac ggggcaagtt ccagggccac cggaatcccc 180 gaccggttca gtggaagcgg aagcggaacc gattttactt tgacgatttc tagactggag 240 ccagaggatt tcgccgttta ctattgtcaa cagtacggaa gcagcccgtg gacgtttggc 300 cagggcacga aggtagaaat caag 324 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 cagtcagtct ctagctctta t 21 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ggggcaagt 9 <210> 20 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Ala Ser 1 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 caacagtacg gaagcagccc gtggacg 27 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 23 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccatcatt actttctact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaggg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggatcac caactacaat 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca ggtctccctg 240 aaactgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agtgtccgag 300 gattcctact ttcactacgg gatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 tccaaatatg gtcccccatg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accatcagtc 720 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 1320 ctctccctgt ctctgggtaa atga 1344 <210> 24 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ile Thr Phe 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Phe His Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 25 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggatcac ccactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagatcca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag atggggggtt 300 cggagggact actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ctacaaaggg accttctgtg tttcctctgg ctccttgttc tagatctaca 420 tctgaatcta cagctgctct gggatgtctg gtgaaggatt attttcctga acctgtgaca 480 gtgtcttgga attctggagc tctgacatct ggagtgcata catttcctgc tgtgctgcag 540 tcttctggac tgtattctct gtcttctgtg gtgacagtgc cttcttcttc tctgggaaca 600 aagacatata catgtaatgt ggatcataag ccttctaata caaaggtgga taagagagtg 660 gaatctaagt atggacctcc ttgtcctcct tgtcctgctc ctcctgtggc tggaccttct 720 gtgtttctgt ttcctcctaa gcctaaggat acactgatga tctctagaac acctgaagtg 780 acatgtgtgg tggtggatgt gtctcaggaa gatcctgaag tgcagtttaa ttggtatgtg 840 gatggagtgg aagtgcataa tgctaagaca aagcctagag aagaacagtt taattctaca 900 tatagagtgg tgtctgtgct gacagtgctg catcaggatt ggctgaatgg aaaggaatat 960 aagtgtaagg tgtctaataa gggactgcct tcttctatcg aaaagacaat ctctaaggct 1020 aagggacagc ctagagaacc tcaggtgtat acactgcctc cttctcagga agaaatgaca 1080 aagaatcagg tgtctctgac atgtctggtg aagggatttt atccttctga tatcgctgtg 1140 gaatgggaat ctaatggaca gcctgaaaat aattataaga caacacctcc tgtgctggat 1200 tctgatggat ctttttttct gtattctaga ctgacagtgg ataagtctag atggcaggaa 1260 ggaaatgtgt tttcttgttc tgtgatgcat gaagctctgc ataatagatt tacacagaag 1320 tctctgtctc tgtctcctgg aaagtag 1347 <210> 26 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ile Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Trp Gly Val Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 27 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 gaaatagttt tgacacagag tcccggcaca ctgtcactct ctcccgggga aagagccacc 60 ttgtcatgta gagcaagtca gtcagtctct agctcttatc tcgcctggta ccagcagaag 120 ccgggacagg cccctagact gctgatctac ggggcaagtt ccagggccac cggaatcccc 180 gaccggttca gtggaagcgg aagcggaacc gattttactt tgacgatttc tagactggag 240 ccagaggatt tcgccgttta ctattgtcaa cagtacggaa gcagcccgtg gacgtttggc 300 cagggcacga aggtagaaat caagcgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 28 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 29 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt caccttcagt acctttatta tgttctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggaata tgtttcatcc attagtagta atgggggtac catatattat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cactctatat 240 cttcaaatgg gcagcctgag agctgaggac atggctgtat attattgtac gagagggggc 300 gatttttgga gtggttatta tccttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Ile Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ggattcacct tcagtacctt tatt 24 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Ile 1 5 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 attagtagta atgggggtac cata 24 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Ile Ser Ser Asn Gly Gly Thr Ile 1 5 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 acgagagggg gcgatttttg gagtggttat tatccttttg actac 45 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Thr Arg Gly Gly Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt caccttcagt acctttatta tgttctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggaata tgtttcatcc attagtagta atgggggtac catatattat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cactctatat 240 cttcaaatgg gcagcctgag agctgaggac atggctgtat attattgtac gagagggggc 300 gatttttgga gtggttatta tccttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccatca 720 gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840 gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctcaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260 gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320 tccctctccc tgtctctggg taaatga 1347 <210> 38 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Ile Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 39 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtacag cctccggatt ctccttcaga gacgcctgga tgacctgggt ccgccaggtt 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaggaaca aaattgatgg tgggacgaca 180 gactacaata cacccgtgaa agacagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ttgtaccaca 300 gatatttgga actacgttct cttctactac tacggtttgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378 <210> 40 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asp Ala 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Asn Lys Ile Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Thr 50 55 60 Pro Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Asp Ile Trp Asn Tyr Val Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ggattctcct tcagagacgc ctgg 24 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Phe Ser Phe Arg Asp Ala Trp 1 5 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 attaggaaca aaattgatgg tgggacgaca 30 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ile Arg Asn Lys Ile Asp Gly Gly Thr Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 accacagata tttggaacta cgttctcttc tactactacg gtttggacgt c 51 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Thr Thr Asp Ile Trp Asn Tyr Val Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp 1 5 10 15 Val <210> 47 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtacag cctccggatt ctccttcaga gacgcctgga tgacctgggt ccgccaggtt 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaggaaca aaattgatgg tgggacgaca 180 gactacaata cacccgtgaa agacagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ttgtaccaca 300 gatatttgga actacgttct cttctactac tacggtttgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc 420 tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc ccatgcccac cgtgcccagc accacctgtg 720 gcaggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 840 aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacacaga agtccctctc cctgtctctg ggtaaatga 1359 <210> 48 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asp Ala 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Asn Lys Ile Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Thr 50 55 60 Pro Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Asp Ile Trp Asn Tyr Val Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr 195 200 205 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 49 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgatga ctccatcatt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggcgcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca ggtctcactg 240 aagctgaact ctgtgattgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agtgtccgag 300 gattcctact accactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 50 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ile Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Ile Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Tyr His Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gatgactcca tcattagtta ctac 24 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Asp Asp Ser Ile Ile Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 atctattaca gtgggcgcac c 21 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr 1 5 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgagagtgt ccgaggattc ctactaccac tacggtatgg acgtc 45 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Ala Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Tyr His Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 57 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctgatga ctccatcatt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggcgcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca ggtctcactg 240 aagctgaact ctgtgattgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agtgtccgag 300 gattcctact accactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 tccaaatatg gtcccccatg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accatcagtc 720 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 1320 ctctccctgt ctctgggtaa atga 1344 <210> 58 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ile Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Ile Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ser Glu Asp Ser Tyr Tyr His Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 59 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Tyr Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Pro Asp Val Leu Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ile Ser Tyr Ala Gly Asn Asn Lys 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Ala Lys Asp Ser Tyr Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Pro Asp Val Leu Asp 1 5 10 15 Ile <210> 63 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Gly Leu Arg Ala Ala Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Asp Glu Leu Leu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn Asn 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Ile Ser Ser Asn Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Thr Arg Asp Asp Glu Leu Leu Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 68 His His His His His His 1 5 <210> 69 <211> 660 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn 20 25 30 Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg 35 40 45 Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60 Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95 Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro 100 105 110 Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn 115 120 125 Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val 130 135 140 Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175 Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala 180 185 190 Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys 195 200 205 His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220 Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255 Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro 260 265 270 Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly 275 280 285 Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300 Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys 325 330 335 Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe 340 345 350 Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu 355 360 365 Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln 370 375 380 Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415 Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile 420 425 430 Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala 435 440 445 Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460 Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495 Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val 500 505 510 Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn 515 520 525 Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn 530 535 540 Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His 545 550 555 560 Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met 565 570 575 Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val 580 585 590 Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly 595 600 605 Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Cys 610 615 620 Pro Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu 625 630 635 640 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Gly His His His His His 645 650 655 His Ser Ser Gly 660 <210> 70 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 1 5 10 15 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu 20 <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Ala Val <210> 72 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe 1 5 10 15 Leu Ser Asn Met Ser Met 20

Claims (50)

  1. 단리된 다중특이성 항원 결합 분자로서:
    a) 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 2×10-7 M 미만의 KD로 인간 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 도메인(D1); 및
    b) 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 10-8 M 미만의 KD로 표적 종양 세포 상의 인간 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인(D2)
    을 포함하는, 단리된 다중특이성 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 10-5 M 미만의 EC50으로 인간 T 세포의 표면에 결합하는, 단리된 다중특이성 항원 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 10-5 M 미만의 EC50으로 사이노몰구스 T 세포의 표면에 결합하는, 단리된 다중특이성 항원 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 2.5×10-8 M 미만의 EC50으로 EGFR을 발현하는 세포주의 표면에 결합하는, 단리된 다중특이성 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 D2 도메인은
    (a) 서열번호 2, 30, 40, 및 50 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬; 및/또는
    (b) 서열번호 16 또는 이의 변이체에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬
    을 포함하거나, 또는
    상기 D1 도메인은
    (c) 서열번호 10, 59 및 63 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬; 및/또는
    (d) 서열번호 16 및 67 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR을 포함하는 면역글로불린 사슬
    을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 D2 도메인은
    (a) 서열번호 2, 24, 30, 38, 40, 48, 50 및 58 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열번호 16 및 28에 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역
    을 포함하거나, 또는
    상기 D1 도메인은
    (c) 서열번호 10, 26, 59 및 63 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
    (d) 서열번호 16, 28 및 67 또는 이들의 변이체에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역
    을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 D2 도메인은
    (a) 서열번호 2, 30, 40 또는 50에 제시된 아미노산, 서열 및 각각 서열번호 2, 30, 40 또는 50에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역
    을 포함하거나, 또는
    상기 D1 도메인은
    (c) 서열번호 10, 59 또는 63에 제시된 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 10, 59 또는 63에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
    (d) 서열번호 16 또는 67에 제시된 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 16 또는 67에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역
    을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    아미노산 서열: GDSIITFY(서열번호 4; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: ARVSEDSYFHYGMDV(서열번호 8; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
    (2) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    아미노산 서열: GFTFSTFI(서열번호 32; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: ISSNGGTI(서열번호 34; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: TRGGDFWSGYYPFDY(서열번호 36; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2;
    아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
    (3) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    아미노산 서열: GFSFRDAW(서열번호 42; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IRNKIDGGTT(서열번호 44; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: TTDIWNYVLFYYYGLDV(서열번호 46; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (4) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    아미노산 서열: DDSIISYY(서열번호 52; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGRT(서열번호 54; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: ARVSEDSYYHYGMDV(서열번호 56; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    아미노산 서열: GGSISSYY(서열번호 12; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H1;
    아미노산 서열: IYYSGIT(서열번호 6; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H2; 및
    아미노산 서열: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 14; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-H3;
    및
    아미노산 서열: QSVSSSY(서열번호 18; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L1;
    아미노산 서열: GAS(서열번호 20; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L2; 및
    아미노산 서열: QQYGSSPWT(서열번호 22; 또는 이의 변이체)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 및 CD28에 결합하며,
    (1) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 2(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (2) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 30(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (3) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 40(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (4) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 50(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 10(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 및 CD28에 결합하며,
    (1) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 24(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (2) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 38(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (3) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 48(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (4) 다음을 포함하는 D2 도메인:
    서열번호 58(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    및
    다음을 포함하는 D1 도메인:
    서열번호 26(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 28(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단백질.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-특이성인, 항원-결합 단백질.
  12. 이중특이성 항원-결합 분자로서, 인간 EGFR과 인간 CD28에 특이적으로 결합하되, 제1 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 참조 항원 결합 단백질과 인간 CD28에 대한 결합에 대해 경쟁하고, 상기 HCDR1은 아미노산 서열 서열번호 12를 포함하고; 상기 HCDR2는 아미노산 서열 서열번호 6을 포함하며; 상기 HCDR3은 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하고, 상기 LCDR1은 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하며, 상기 LCDR2는 아미노산 서열 서열번호 20을 포함하고, 상기 LCDR3은 아미노산 서열 서열번호 22를 포함하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
  13. 이중특이성 항원-결합 분자로서, 인간 EGFR과 인간 CD28에 특이적으로 결합하되, 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 10, 59 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 참조 항원 결합 단백질과 인간 CD28에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
  14. 이중특이성 항원-결합 분자로서, 인간 EGFR과 인간 CD28에 특이적으로 결합하되, 제2 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 참조 항원 결합 단백질과 인간 EGFR에 대한 결합에 대해 경쟁하고, 상기 HCDR1은 서열번호 4, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 6, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 HCDR3은 서열번호 8, 36, 46 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR1은 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하며, 상기 LCDR2는 아미노산 서열 서열번호 20을 포함하고, 상기 LCDR3은 아미노산 서열 서열번호 22를 포함하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
  15. 이중특이성 항원-결합 분자로서, 인간 EGFR과 인간 CD28에 특이적으로 결합하되, 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 2, 30, 40 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 참조 항원 결합 단백질과 인간 EGFR에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
  16. 이중특이성 항원-결합 분자로서, 인간 EGFR과 인간 CD28에 특이적으로 결합하되, 제1 항원-결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 참조 항원 결합 단백질과 인간 CD28에 대한 결합에 대해 경쟁하고, 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 2, 30, 40 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 참조 항원-결합 단백질과 인간 EGFR에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질을 제조하는 방법으로서,
    (a) 상기 항원-결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 선택적으로, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 상기 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬을 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포인, 방법.
  19. 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬로서, 제17항 또는 제18항에 따른 방법의 생성물인, 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬.
  20. 폴리뉴클레오타이드로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  21. 벡터로서, 제20항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
  22. 숙주 세포로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  23. 조성물 또는 키트로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질 중 하나 이상을 선택적으로 추가의 치료제와 함께 포함하는, 조성물 또는 키트.
  24. 약제학적 제형으로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제, 및 선택적으로 추가의 치료제를 포함하는, 약제학적 제형.
  25. 제1항 내지 제16항, 제19항, 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 저해제, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, PD-L1 저해제, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 백금 항암 화학치료제, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴(vincristine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 항암 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(bevacizumab ) 및 세미플리맙(cemiplimab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 치료제와 함께인, 항원-결합 단백질, 조성물 또는 제형.
  26. 용기 또는 주사 장치로서, 제1항 내지 제16항, 제19항, 제23항 및 제24항 또는 제25항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질, 또는 조성물 또는 제형을 포함하는, 용기 또는 주사 장치.
  27. 제1항 내지 제16항, 제19항, 제23항 및 제24항 또는 제25항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질, 또는 조성물 또는 제형을 대상체에 투여하는 방법으로서, 상기 항원-결합 단백질, 조성물 또는 제형을 상기 대상체의 신체에 주사하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 과증식성 질환(hyperproliferative disease)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 과증식성 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항, 제19항, 제23항 및 제24항 또는 제25항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단백질, 또는 조성물 또는 제형을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 과증식성 질환은 암이고,
    상기 항원-결합 단백질을 투여하기 전에, 상기 암의 세포가 EGFR을 발현하는지 여부를 결정하거나 또는 다른 개체 또는 독립체(entity)가 그러한 결정을 수행하도록 지시하고, EGFR 발현이 존재한다면, 상기 EGFR×CD28 항원-결합 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 과증식성 질환은 EGFR-발현 암인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 과증식성 질환은 식도 암종(esophageal carcinoma), 폐 편평 세포 암종(lung squamous cell carcinoma), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 경부 편평 세포 암종(cervical squamous cell carcinoma), 자궁내막 선암종(endometrial adenocarcinoma), 방광 요로상피 암종(bladder urothelial carcinoma), 폐암(lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 직장결장암(colorectal cancer), 직장암(rectal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 피부암(skin cancer), 두경부 편평세포 암종(head & neck squamous cell carcinoma), 뇌암(brain cancer), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 유방암(breast cancer), 위식도암(gastroesophageal cancer), 위식도 선암종(gastroesophageal adenocarcinoma), 전립선암(prostate cancer) 또는 난소암(ovarian cancer)인 암인, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질은 상기 대상체의 신체에 피하로, 정맥내로 또는 근육내로 주사에 의해 투여되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 1×10-12 M 내지 1×10-5 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포에 결합하는, 다중특이성 항원-결합 분자.
  34. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 1×10-9 M to 1×10-5 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포에 결합하는, 다중특이성 항원-결합 분자.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 인간 CD28을 발현하는 인간 세포 및 사이노몰구스 CD28을 발현하는 사이노몰구스 원숭이 세포에 결합하는, 다중특이성 항원-결합 분자.
  36. 약제학적 조성물로서, 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원-결합 분자, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 핵산으로서, 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항원-결합 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  38. 발현 벡터로서, 제37항의 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  39. 숙주 세포로서, 제38항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  40. 대상체에서 암의 성장을 저해하는 방법으로서, 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 단리된 이중특이성 항체 또는 제36항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하여 상기 대상체에서 암의 성장을 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제28항 또는 제40항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항-종양제, 방사선요법, 항체 약물 접합체, 관문 저해제, 동일한 종양 표적 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다른 상이한 이중특이성 항체, 상이한 종양 표적 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다른 상이한 이중특이성 항체, 또는 이들의 조합인, 방법.
  43. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제24항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 암은 EGFR 발현 암인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 EGFR 발현 암은 식도 암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 경부 편평 세포 암종, 자궁내막 선암종, 방광 요로상피 암종, 폐암, 비-소세포 폐암, 직장결장암, 직장암, 자궁내막암, 피부암, 두경부 편평세포 암종, 뇌암, 다형성 교모세포종, 유방암, 위식도암, 위식도 선암종, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제2 치료제는 항-종양제, 방사선요법, 항체 약물 접합체, 관문 저해제, 동일한 종양 표적 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다른 상이한 이중특이성 항체, 상이한 종양 표적 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다른 상이한 이중특이성 항체, 또는 이들의 조합인, 방법.
  48. 제42항 또는 제47항에 있어서, 상기 관문 저해제는 세미플리맙(cemiplimab)인, 방법.
  49. 제42항 또는 제47항에 있어서, 상기 상이한 이중특이성 항체는 PSMA, MUC16 및 STEAP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  50. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항원-결합 분자는 서열번호 72에 제시된 바와 같은 EGFR의 133번 내지 154번 아미노산 잔기, 또는 서열번호 70에 제시된 바와 같은 EGFR의 345번 내지 368번 아미노산 잔기, 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 EGFR의 399번 내지 416번 아미노산 잔기 중 하나 이상과 상호작용하는, 이중특이성 항원-결합 분자.
KR1020217032287A 2019-03-22 2020-03-20 Egfr×cd28 다중특이성 항체 KR20210142659A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962822124P 2019-03-22 2019-03-22
US62/822,124 2019-03-22
PCT/US2020/023857 WO2020198009A1 (en) 2019-03-22 2020-03-20 EGFR x CD28 MULTISPECIFIC ANTIBODIES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210142659A true KR20210142659A (ko) 2021-11-25

Family

ID=70228885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217032287A KR20210142659A (ko) 2019-03-22 2020-03-20 Egfr×cd28 다중특이성 항체

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11912767B2 (ko)
EP (1) EP3941941A1 (ko)
JP (1) JP2022526764A (ko)
KR (1) KR20210142659A (ko)
CN (1) CN113661177B (ko)
AU (1) AU2020247803A1 (ko)
BR (1) BR112021018442A2 (ko)
CA (1) CA3134335A1 (ko)
CL (2) CL2021002446A1 (ko)
CO (1) CO2021014076A2 (ko)
EA (1) EA202192566A1 (ko)
IL (1) IL286536A (ko)
MA (1) MA55363A (ko)
MX (1) MX2021011500A (ko)
SG (1) SG11202110341WA (ko)
WO (1) WO2020198009A1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11548947B2 (en) * 2018-06-21 2023-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-PSMA X anti-CD28 antibodies and uses thereof
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
MX2023005081A (es) * 2020-10-30 2023-06-15 Janux Therapeutics Inc Anticuerpos multiespecificos para dirigirse a cd28 y pd-l1 y metodos de uso de los mismos.
JP2023547507A (ja) * 2020-11-03 2023-11-10 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ 標的細胞限定的で共刺激性の二重特異性かつ２価の抗ｃｄ２８抗体
CA3204161A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Jagesh Vijaykumar SHAH Use of cd8-targeted viral vectors
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
US20240344083A1 (en) 2021-08-04 2024-10-17 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd4-targeted viral vectors
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
IL314916A (en) 2022-03-07 2024-10-01 Novimmune Sa Bispecific CD28 antibodies for targeted T cell activation
WO2023174925A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Novimmune Sa Bispecific gpc3xcd28 and gpc3xcd3 antibodies and their combination for targeted killing of gpc3 positive malignant cells
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023198042A1 (zh) * 2022-04-11 2023-10-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合egfr和cd28的抗原结合分子及其医药用途
WO2023198015A1 (zh) * 2022-04-11 2023-10-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合psma和cd28的抗原结合分子及其医药用途
US20240027432A1 (en) 2022-07-13 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mild acid immunoassays for detection of analytes
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
US20240270849A1 (en) 2022-10-03 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cancer with bispecific egfr xcd28 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
US20240254234A1 (en) 2022-10-21 2024-08-01 Novimmune Sa PD-L1xCD28 BISPECIFIC ANTIBODIES FOR IMMUNE CHECKPOINT-DEPENDENT T CELL ACTIVATION

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US7235641B2 (en) * 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
EP3770174A1 (en) 2005-10-11 2021-01-27 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
PL2041177T3 (pl) 2006-06-02 2012-09-28 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
RU2724663C2 (ru) 2010-02-08 2020-06-25 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мышь с общей легкой цепью
TW201843172A (zh) 2012-06-25 2018-12-16 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CN104558190B (zh) * 2015-01-06 2018-08-10 中国药科大学 一种全人源靶向EGFR/KDR的IgG样双特异性抗体
ES2901133T3 (es) 2015-09-23 2022-03-21 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecíficos anti-CD3 optimizados y usos de los mismos
CA3037732A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
RS63660B1 (sr) 2016-09-23 2022-11-30 Regeneron Pharma Anti-muc16 (mucin 16) antitela
CN106632681B (zh) * 2016-10-11 2017-11-14 北京东方百泰生物科技有限公司 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用
WO2020132066A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-cd28 x anti-cd22 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN113661177A (zh) 2021-11-16
JP2022526764A (ja) 2022-05-26
US20200299388A1 (en) 2020-09-24
CL2023002805A1 (es) 2024-03-15
EP3941941A1 (en) 2022-01-26
SG11202110341WA (en) 2021-10-28
CL2021002446A1 (es) 2022-05-06
WO2020198009A1 (en) 2020-10-01
BR112021018442A2 (pt) 2022-01-11
MA55363A (fr) 2022-01-26
AU2020247803A1 (en) 2021-11-11
EA202192566A1 (ru) 2021-12-27
CA3134335A1 (en) 2020-10-01
CN113661177B (zh) 2024-04-16
IL286536A (en) 2021-10-31
US20230322927A1 (en) 2023-10-12
CO2021014076A2 (es) 2021-10-29
US11912767B2 (en) 2024-02-27
WO2020198009A8 (en) 2020-11-19
MX2021011500A (es) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210142659A (ko) Egfr×cd28 다중특이성 항체
JP7027401B2 (ja) Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
KR102587941B1 (ko) 향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자
DK3097120T3 (en) Human antibodies against PD-L1
US20180194862A1 (en) Bispecific binding proteins
NL1032132C2 (nl) Nieuwe MAdCAM-antilichamen.
WO2018191438A1 (en) Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
JP2020018298A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２及びｃｄ３に対する抗体コンストラクト
KR20200061402A (ko) 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합
US20210371537A1 (en) Anti-tnfr2 antibodies and uses thereof
KR20170065029A (ko) 증강된 면역 반응 및 암 요법을 위한 조성물 및 사용 방법
KR20170010863A (ko) 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 이의 용도
JP2017534267A (ja) イヌｐｄ−ｌ１と結合するｐｄ−ｌ１抗体
JP7194481B2 (ja) 免疫グロブリン様転写産物３（ｉｌｔ３）に特異的な抗体およびその使用
ES2833773T3 (es) Proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes y multiespecíficas
US20220403037A1 (en) Anti-ccr8 antibodies and uses thereof
US20240190989A1 (en) Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
US20220281990A1 (en) Anti-tnfr2 antibodies and uses thereof
CA3156983A1 (en) Antibodies against the poliovirus receptor (pvr) and uses thereof
KR20220042137A (ko) 항-뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (ny-eso-1) 항원-결합 단백질 및 이의 사용 방법
WO2022242679A1 (en) Anti-cd137 antibodies and methods of use
CN114641500B (zh) 使用抗ox40抗体与抗tim3抗体的组合治疗癌症的方法
US20240209113A1 (en) Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
RU2826084C2 (ru) МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ PD-L1 и CD137
KR20230135627A (ko) 항-PDGF-b 항체 및 폐동맥 고혈압 (PAH)을 치료하기 위한 사용 방법