KR20200108113A - 인간화 경쇄 마우스 - Google Patents
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Abstract
마우스 내의 ADAM6 활성 기능성을 포함하고 또한 내인성 비-인간 중쇄 면역글로불린 서열의 변형을 포함하는 비-인간 동물, 조직, 세포, 및 유전적 물질이 제공되되, 여기서 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 동족 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 발현한다.
Description
유전자 변형된 비-인간 가임 동물은 인간 중쇄 가변 서열과 동족인 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 서열을 발현한다. 마우스ADAM6 자리 내의 ADAM6기능성을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 마우스, 세포, 배아 및 조직이 기재되어 있으며, 여기서 마우스, 세포, 배아 및 조직은, 기능 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 형성하기 위하여 재배열될 수 있는 인간 면역글로불린 람다 경쇄 유전자 분절을 포함한다. 변형은 인간 및/또는 인간화 면역글로불린 자리를 포함한다. ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성(ectopic, 異所性) 핵산 서열을 포함하는 마우스를 비롯하여, ADAM6 기능을 포함하는 마우스가 기재되어 있다. 수컷 마우스에 대해서 가임성을 회복시키는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스를 비롯하여, 내인성 마우스 면역글로불린 VH 영역 자리의 유전자리의 유전자 변형을 포함하고 또한 ADAM6 활성을 더 포함하는 유전자 변형된 수컷 마우스가 기재되어 있다.
내인성 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체(homolog) 혹은 오솔로그(ortholog)의 결실(deletion) 또는 변형(modification)을 포함하고, 그리고 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그)를 회복시키는 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 가임 동물은, 전체로서 혹은 일부로서 기능하며, 여기서 해당 비-인간 동물은 λ 또는 κ 경쇄 불변 서열의 맥락에서 인간 면역글로불린 λ 가변 서열을 발현한다.
지난 20년 동안 항체에 대한 약제학적 적용은 인간 치료제로서 이용하기에 적합한 항체의 제작에 많은 연구를 기울여 왔다. 마우스 항체에 기반한 초기의 항체 치료제는, 인간에 대한 마우스 항체를 반복적으로 투여하는 것이 장기 치료 요법이 틀렸음을 입증할 수 있는 면역원성 문제를 초래하기 때문에 인간 치료제로서 이상적이지 않았다. 더욱 인간과 유사하거나 덜 마우스와 유사하게 보이게 하기 위한 마우스 항체의 인간화에 기반한 해결책이 개발되었다. 항체에 이용하기 위한 인간 면역글로불린 서열을 발현하는 방법은, 결과적으로 파지(phage), 박테리아 혹은 효모에서의 인간 면역글로불린 라이브러리의 시험관내 발현에 대부분 기초하고 있었다. 최종적으로, 내인성 면역글로불린 자리(locus)가 불능화된 트랜스염색체(transchromosomal) 혹은 형질전환 마우스 내에서 그리고 인간 조혈 세포가 주입된 마우스 내에서, 인간 림프구로부터 유용한 인간 항체를 시험관 내에서 제작하는 것이 시도되었다. 이 형질전환 마우스에 있어서, 무작위로 합체된 완전한 인간 전이유전자(transgene)가 마우스에서 발현된 면역글로불린 서열의 소스로서 기능하도록, 내인성 마우스 면역글로불린 유전자를 불능화시키는 것이 필요하였다. 이러한 마우스는 인간 항체를 인간 치료제로서 이용하기에 적합하게 만들 수 있지만, 이들 마우스는 그들의 면역체계에 의한 실질적인 문제를 나타낸다. 이들 문제는, (1) 마우스가 충분히 다양한 항체 레퍼토리를 생성하는 것을 불가능하게 만들고, (2) 광범위한 재조작 해결책의 사용을 요구하며, (3) 인간 요소와 마우스 요소 간의 부적합성으로 인해 아마도 차선책의 클론 선택 과정을 제공할 공산이 있고, 그리고 (4) 이들 마우스에 인간 치료제를 만드는데 진정으로 유용하게 되도록 요구되는 인간 가변 서열의 방대하고 다양한 집단의 신뢰성없는 소스를 부여한다.
완전한 인간 항체 전이유전자를 함유하는 형질전환 마우스는 인간 중쇄 불변 서열에 연결된 재배열되지 않은(unrearranged) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 서열(V, D 및 J 서열) 및 인간 경쇄 불변 서열에 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 서열(V 및 J)을 포함하는 무작위로 삽입된 전이유전자를 포함한다. 따라서, 해당 마우스는 내인성 마우스 자리 이외의 자리로부터 재배열된 항체 유전자를 생성하며, 이때 재배열된 항체 유전자는 완전한 인간이다. 일반적으로, 적어도 몇몇 인간 λ 서열을 갖는 마우스가 또한 보고되어 있지만, 마우스는, 인간 중쇄 서열과 인간 κ 경쇄 서열을 포함한다. 형질전환 마우스는 일반적으로 손상된 및 비기능적 내인성 면역글로불린 자리, 또는 내인성 면역글로불린 자리의 넉아웃을 지니므로, 이 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 자리에서 인간 항체 서열의 재배열을 불가능하게 한다. 이러한 형질전환 마우스의 예상 밖의 변화는, 아마도 내인성 마우스 선택 시스템 내에서 완전한 인간 항체 분자와 접속되는 차선책의 클론 선택 과정에 적어도 부분적으로 연유하여, 이들을 마우스 내의 충분히 다양한 인간 항체 레퍼토리를 생성하기에 보다 덜 최적으로 되게 한다.
인간 항체 서열을 비롯환, 면역글로불린 서열을 생성하는데 유용하고 또한 충분히 다양한 인간 항체 레퍼토리를 생성하는데 유용한 개선된 유전자 변형된 비-인간 동물을 제작하기 위한 요구가 당업계에 남아 있다. 또한, 인간 λ 및/또는 인간 κ 경쇄 가변 서열의 충분한 다양한 선택을 포함하는 자리를 비롯한 변화된 면역글로불린 자리로부터 단백질을 제작할 수 있거나, 또는 인간 λ 혹은 인간 κ 가변 도메인과 동족인 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 유용한 재배열된 면역글로불린 유전자를 형성하도록 면역글로불린 유전자 분절을 재배열시킬 수 있는 마우스에 대한 요구가 남아 있다. 인간 κ 분절과 인간 λ 분절의 둘 모두로부터 항체 가변 영역을 생성할 수 있는 비-인간 동물에 대한 요구도 있되, 여기서 인간 κ 분절과 인간 λ 분절은 인간 중쇄 가변 도메인과 동족이다. 또한 인간 λ 서열의 유전자 변형된 동물에서 증가된 사용에 대한 요구도 있다.
ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그의 활성을 저감시키거나 제거하는 변형을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 기재되어 있되, 여기서 변형은 가임성의 손실을 초래하며, 해당 동물은 손실된 혹은 저감된 ADAM6 활성(또는 상동체 혹은 오솔로그 활성)을 보완하거나 회복시키는 활성을 암호화하는 서열을 더 포함하고, 비-인간 동물은 그들로 하여금 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역과 동족인 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 발현시킬 수 있게 하는 변형을 더 포함한다. 각종 양상에 있어서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 λ 또는 κ 불변 영역에 융합되어 발현된다.
각종 양상에 있어서, ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 인간 면역글로불린 서열과 연속적이다. 각종 양상에 있어서, ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 비-인간 면역글로불린 서열과 연속적이다. 각종 양상에 있어서, 서열은 비-인간 동물의 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 자리와 동일한 염색체 상에 존재한다. 각종 양상에 있어서, 서열은 비-인간 동물의 면역글로불린 중쇄 자리와는 상이한 염색체 상에 존재한다.
ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그의 활성을 유지하는 변형을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 기재되어 있되, 여기서 변형은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림에 있는 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입체를 포함하고, 비-인간 동물은 이들로 하여금 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 동족인 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 발현시키게 할 수 있는 변형을 더 포함한다. 각종 양상에 있어서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 λ 또는 κ 불변 영역에 융합되어 발현된다.
각종 양상에 있어서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입은 비-인간 동물의 ADAM6 유전자의 다운 스트림 혹은 3'에서 수행된다. 각종 양상에 있어서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입은, 비-인간 동물의 ADAM6 활성이 이러한 삽입을 포함하지 않는 비-인간 동물과 동일하거나 견줄만한 수준에 있도록 비-인간 동물의 ADAM6 유전자(들)이 파괴, 결실 및/또는 기능적으로 침묵하지 않도록 하는 방식으로 수행된다. 예시적인 파괴, 결실 및/또는 기능적 침묵 변형은 비-인간 동물의 ADAM6 유전자(들)에 의해 암호화된 ADAM6 단백질(들)의 활성의 저감, 제거 및/또는 손실을 초래하는 임의의 변형을 포함한다.
일 양상에 있어서, 비기능적 내인성 마우스 ADAM6 단백질 또는 ADAM6 유전자를 초래하는 변형(예컨대, 내인성 ADAM6 유전자의 넉아웃 또는 결실)을 포함하는 마우스를 제작하기 위한, 핵산 작제물, 세포, 배아, 마우스 및 방법이 제공되되, 여기서 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는 마우스를 제작하기 위한, 핵산 작제물, 세포, 배아, 마우스 및 방법이 제공되되, 여기서 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 면역글로불린 자리는 면역글로불린 중쇄 자리이고, 변형은 수컷 마우스의 세포 또는 조직의 ADAM6 활성을 저감시키거나 제거한다.
일 양상에 있어서, 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 암호화하는 이소성(異所性) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되며; 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 그리고 중쇄 면역글로불린 자리의 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 마우스가 또한 제공된다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는 마우스를 제작하기 위한 방법이 제공되되, 여기서 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 포함한다.
일 양상에 있어서, 중쇄 면역글로불린 자리의 유전자 변형을 포함하는 마우스를 제작하기 위한 방법이 제공되되, 여기서 이 방법의 적용은 변형된 중쇄 면역글로불린 자리(또는 그의 결실)을 포함하는 수컷 마우스를 유발하며, 해당 수컷 마우스는 교미에 의해 자손을 생산할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 마우스 난자를 수정시키기 위하여 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해서 이동할 수 있는 정자를 생산할 수 있다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 중쇄 자리 및 면역글로불린 경쇄 자리의 유전자 변형을 포함하는 마우스를 제작하기 위한 방법이 제공되되, 여기서, 중쇄 자리를 변형시키기 위한 이 방법의 적용은 가임성의 저감을 나타내는 수컷 마우스에서 일어나며, 마우스는 가임성의 저감을 전체적으로 혹은 부분적으로 회복시키는 유전자 변형을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 가임성의 저감은 마우스 난자를 수정시키기 위하여 수컷 마우스의 정자가 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해서 이동하는 것을 불능으로 하는 것으로 특징으로 한다. 각종 실시형태에 있어서, 가임성의 저감은 생체내 이동 결함을 나타내는 정자를 특징으로 한다. 각종 실시형태에 있어서, 가임성을 저감을 전체적으로 혹은 부분적으로 회복시키는 유전자 변형은 수컷 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 유전자 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 핵산 서열이다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 다른 종(예컨대, 비-마우스 종)의 면역글로불린 중쇄 가변 자리로 교체하는 것을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 오솔로그성(즉, 이종상동성) 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리 내 삽입하는 것을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 종은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 전체적 혹은 부분적이 결실을 포함하되, 이때 결실은 내인성 ADAM6 기능의 손실을 초래한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 ADAM6 기능의 손실은 수컷 마우스에서의 가임성의 저감과 연관된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 전체적인 혹은 부분적인 비활성화(inactivation)를 포함하되, 여기서 비활성화는 내인성 ADAM6 기능의 손실을 초래하지 않는다. 비활성화는 내인성 비-인간 유전자 분절을 포함하는 항체의 중쇄를 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 실질적으로 불가능하게 하는 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 자리를 초래하는 1개 이상의 내인성 비-인간 유전자 분절의 교체 혹은 결실을 포함할 수 있다. 비활성화는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 대해서 항체의 중쇄를 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 하는 기타 변형을 포함할 수 있으며, 이때 변형은 내인성 유전자 분절의 교체 혹은 결실을 포함하지 않는다. 예시적인 변형은, 분자 기법, 예컨대, 부위-특이적 재조합 부위의 정밀한 배치를 사용하는 분자 기법(예컨대, Cre-lox 기법)에 의해 매개된 염색체 역위 및/또는 전자우좌를 포함한다. 기타 예시적인 변형은 비-인간 면역글로불린 가변 유전자 분절과 비-인간 면역글로불린 불변 영역 사이의 작동가능한 연결을 불능으로 하는 것을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 하나 이상의 불변 영역 서열(예컨대, IgM 및/또는 IgG 유전자)에 작동가능하게 연결된 다른 종(예컨대, 비-마우스 종)의 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절, 1개 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 DNA 단편을 비-인간 동물의 게놈 내로 삽입하는 것을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, DNA 단편은 항체의 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 형성하기 위하여 비-인간 동물의 게놈에서 재배열을 수행할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 종은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 ADAM6 활성(예컨대 암호화된 단백질의 발현 및/또는 기능)이 삽입체를 포함하지 않는 비-인간 동물과 동일하거나 견줄만하게 되도록 비-인간 동물의 내인성 ADAM6 유전자의 다운스트림 혹은 3'에서의 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입체를 포함한다.
일 양상에 있어서, 내인성 ADAM6 기능의 저감 혹은 제거로 인해, 변형을 지니는 수컷 마우스가 저감된 가임성(예컨대, 교미에 의해 자손을 생산하는 고도로 저감된 능력)을 지니거나, 본질적으로 불임이 되도록 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터의 마우스 ADAM6 발현을 저감시키거나 제거하는 변형을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 이소성 ADAM6 서열 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 더 포함한다. 일 양상에 있어서, 마우스 ADAM6 발현을 저감시키거나 제거하는 변형은 마우스 면역글로불린 자리의 변형(예컨대, 삽입, 결실, 교체 등)이다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능의 저감 또는 손실은 마우스 난자를 수정시키기 위하여 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해서 이동할 수 있는 정자를 생산하는 마우스의 불능 또는 실질적으로 불능을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 사정 용적에서 생성된 정자 세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 혹은 99%는 교접 후 생체내에서 난관을 통해서 이동하여 마우스 난자를 수정시키는 것을 불가능하게 한다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능의 저감 또는 손실은 마우스의 정자 세포의 표면 상에 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성하는 불능 또는 해당 복합체를 형성하는 실질적인 불능을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능의 손실은 암컷 마우스와이 교접에 의해 마우스 난자를 수정시키는 실질적인 불능을 포함한다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 마우스에 ADAM6 기능성을 부여하는 단백질(또는 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 수컷 마우스이고, 기능성은 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하는 마우스에 비해서 증대된 가임성을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 단백질은 마우스의 생식선에서 면역글로불린 자리 내에 위치된 게놈 서열에 의해 암호화된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 중쇄 자리는 적어도 1개의 인간 VH, 적어도 1개의 인간 DH 및 적어도 1개의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 단백질은 마우스의 생신선에서 비-면역글로불린 자리 내에 위치된 게놈 서열에 의해 암호화된다. 일 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 자리는 전사 활성 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 전사 활성 자리는 ROSA26 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 전사 활성 자리는 조직-특이적 발현과 관련된다. 일 실시형태에 있어서, 조직-특이적 발현은 재생 조직에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 단백질은 마우스의 생식선 내로 무작위로 삽입된 게놈 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 혹은 키메라 인간/마우스 또는 키메라 인간/래트 경쇄(예컨대, 인간 가변, 마우스 혹은 래트 불변) 및 키메라 인간 가변/마우스 또는 래트 불변 중쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 전사 활성 프로모터, 예컨대, ROSA26 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 인간 가변/래트 혹은 마우스 불변 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 키메라 인간/마우스 또는 래트 경쇄 전이유전자는 마우스의 생식선 내의 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 생식선 내의 면역글로불린 자리 내에 위치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 자리는 적어도 1개의 인간 VH, 적어도 1개의 인간 DH 및 적어도 1개의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 생식선 내의 비-면역글로불린 자리 내에 위치된다. 일 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 자리는 전사 활성 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 전사 활성 자리는 ROSA26 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 생식선 내로 무작위로 삽입되어 위치된다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 마우스 ADAM6 기능의 소실을 보완하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 포함하는 대응하는 야생형 마우스와 견줄만한 자손을 생산하는 능력을 마우스에게 부여한다. 일 실시형태에 있어서, 이러한 서열은 마우스의 정자 세포의 표면에 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성하는 능력을 마우스에게 부여한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 서열은 난자를 수정시키기 위하여 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해서 이동하는 능력을 마우스에게 부여한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 동일한 나이의 야생형 마우스의 한배 새끼의 수의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 혹은 90%를 생산하고, 변종(strain)은 6개월의 시간 기간에 생산한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 결여하는 실질적으로 동일한 시간 기간에 걸쳐서 그리고 실질적으로 동일한 조건 하에 교미된 동일한 나이의 마우스 및 동일 혹은 유사한 변종보다 6-개월 시간 기간에 걸쳐서 교미된 경우 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 4배, 약 6배, 약 7배, 약 8배 혹은 약 10배 혹은 그 이상의 후손(progeny)을 생산한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 결여하며, 동일한 시간 기간에 교미된 마우스보다 4- 혹은 6-개월 교배 기간에서 한배 새끼당 평균 적어도 약 2배, 3배 혹은 4배 이상의 새끼를 생산한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 수컷 마우스이고, 수컷 마우스는, 교접 후 약 5 내지 6시간에 난관으로부터 회수될 때 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 결여하는 마우스보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 100배, 110배 혹은 120배 또는 그 이상인 난관 이동을 반영하는 정자를 생산한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 암컷 마우스와 교접할 경우 야생형 마우스로부터의 정자와 대략 동일한 효율에서 약 6시간 이내에 자궁을 횡단하여 난관으로 들어가 이동할 수 있는 정자를 생산한다.
일 실시형태에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 결여하고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 결여하는 마우스보다 견줄만한 시간 기간에 약 1.5배, 약 2배, 약 3배 혹은 약 4배 또는 그 이상의 한배 새끼를 생산한다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 단백질을 암호화하는 비-마우스 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 비-마우스 면역글로불린 서열은 마우스 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편의 삽입체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 인간 면역글로불린 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 서열은 인간 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 서열은 1개 이상의 V 유전자 분절, 1개 이상의 D 유전자 분절 및 1개 이상의 J 유전자 분절을 포함하고; 일 실시형태에 있어서, 서열은 1개 이상의 V 유전자 분절 및 1개 이상의 J 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 1개 이상의 V, D 및 J 유전자 분절, 또는 1개 이상의 V 및 J 유전자 분절은 재배열되지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 1개 이상의 V, D 및 J 유전자 분절, 또는 1개 이상의 V 및 J 유전자 분절은 재배열된다. 일 실시형태에 있어서, 1개 이상의 V, D 및 J 유전자 분절, 또는 1개 이상의 V 및 J 유전자 분절의 재배열 후, 마우스는 그의 게놈에 마우스 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열 후에 마우스는 마우스 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 암호화하는 적어도 2개의 핵산 서열을 그의 게놈에 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열 후 마우스는 마우스 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 그의 게놈에 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 B 세포의 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 비-B 세포의 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 그의 기능성 단편을 발현하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 내인성 ADAM6 자리에서 단일의 비변형 내인성 ADAM6 대립 유전자 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 ADAM6 기능을 부여하는 단백질을 암호화하는 이소성 마우스 ADAM6 서열 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다.
실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 내인성 마우스 ADAM6 대립 유전자의 위치와 근사한 마우스 게놈 내의 위치, 예컨대, V 유전자 분절 서열의 3' 및 초기의 D 유전자 분절의 5'에 ADAM6 서열 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 면역글로불린 가변 유전자 분절을 암호화하는 핵산 서열의 (ADAM6 서열의 전사 방향에 관하여) 측면 업스트림, 다운스트림, 또는 업스트림 및 다운스트림에 ADAM6 서열 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 가변 유전자 분절은 인간 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, 면역글로불린 가변 유전자 분절은 인간 유전자 분절이고, 마우스 내의 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편 기능성을 암호화하는 서열은 인간 V 유전자 분절들 사이의 위치에 있으며; 일 실시형태에 있어서, 마우스는 2개 이상의 인간 V 유전자 분절을 포함하고, 상기 서열은 마지막 V 유전자 분절과 끝에서 두 번째 V 유전자 분절 사이의 위치에 있으며; 일 실시형태에 있어서, 상기 서열은 마지막 V 유전자 분절과 처음 D 유전자 분절 이후의 위치에 있다.
일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 야생형 수컷 마우스와 동일하거나 실질적으로 동일한 내인성 면역글로불린 자리 내의 위치에 위치된 ADAM6 서열 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 자리는 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화할 수 없으며, 여기서 가변 영역은 내인성 비-인간 유전자 분절을 포함하거나 이로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 자리는 항체의 암호화 중쇄 가변 영역을 불능으로 하는 수컷 마우스의 게놈 내의 위치에 위치된다. 각종 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 인간 면역글로불린 유전자 분절과 동일한 염색체 상에 위치된 ADAM6 서열을 포함하며, ADAM6 서열은 기능성 ADAM6 단백질을 암호화한다.
일 양상에 있어서, 생식선 내에 내인성 ADAM6 유전자의 결실 또는 비기능적 내인성 ADAM6 유전자를 포함하는 수컷 마우스가 제공되되; 여기서 마우스의 정자 세포는 암컷 마우스의 난관을 이동하여 마우스의 난자를 수정시킬 수 있다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자 및 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 대한 변형을 포함하는 수컷 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 ADAM6 유전자의 다운스트림 혹은 3'에서 이루어진다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 1개 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절로의 교체이다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 업스트림에서 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입이다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 ADAM6 기능을 저감시키는 유전자 변형을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 전체적으로 혹은 부분적으로 기능적인 내인성 비변형 대립 유전자(예컨대, 이형접합체)에 의해, 또는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 암호화하는 이소성 서열로부터의 발현에 의해 적어도 일부의 ADAM6 기능성을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는, 기능성 ADAM6을 결여하는 수컷 마우스와 비교해서, 교미에 의해 자손을 생산하는 능력을 수컷 마우스에게 부여하기에 충분한 ADAM6 기능을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능은 마우스 ADAM6 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열의 존재에 의해 부여된다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능은 내인성 면역글로불린 자리에 존재하는 내인성 ADAM6 유전자에 의해 부여되되, 여기서 내인성 면역글로불린 자리는 항체의 암호화 중쇄 가변 영역을 불느응로 한다. 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 상동체 혹은 오솔로그 혹은 그의 단편은 충분한 내인성 마우스 ADAM6 활성을 결여하는 수컷 마우스에서 관측된 자손을 생산하는 능력의 손실, 예컨대, ADAM6 넉아웃 마우스에서 관측된 손실을 전체적으로 혹은 부분적으로 회복시키는 것을 포함한다. 이 의미에서 ADAM6 넉아웃 마우스는 내인성 자리 혹은 그의 단편을 포함하지만 기능적은 아니며, 즉, ADAM6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 전혀 발현하지 않거나 또는 야생형 수컷 마우스의 자손을 생산하는 본질적으로 정상의 능력을 뒷받침하기에 불충분한 수준으로 ADAM6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 발현하는 마우스를 포함한다. 기능의 손실은, 예컨대, 상기 자리의 구조적 유전자에(즉, ADAM6a 혹은 ADAM6b 암호화 영역에) 또는 상기 자리의 조절 영역에(예컨대, ADAM6유전자에 대한 5' 또는 ADAM6a 혹은 ADAM6b 암호화 영역의 3'의 서열, 여기서 서열이 ADAM6 유전자의 전사, ADAM6 RNA의 발현, 또는 ADAM6 단백질의 발현을 전체적으로 혹은 부분적으로 제어함) 기인될 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 수컷 마우스에서 기능적인 오솔로그 혹은 상동체 혹은 그의 단편은 수컷 마우스의 정자(또는 수컷 마우스의 사정된 정액 내 정자 세포의 대부분)이 마우스 난관을 이동하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있게 하는 것들이다.
일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 가변 영역 또는 그의 기능성 단편을 발현하는 수컷 마우스는 암컷 마우스와의 교미에 의해 자손을 생산하는 능력을 수컷 마우스에게 부여하는 충분한 ADAM6 활성을 포함하고, 일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 일 실시형태에 있어서 적어도 25%, 일 실시형태에 있어서, 적어도 30%, 일 실시형태에 있어서 적어도 40%, 일 실시형태에 있어서 적어도 50%, 일 실시형태에 있어서 적어도 60%, 일 실시형태에 있어서 적어도 70%, 일 실시형태에 있어서 적어도 80%, 일 실시형태에 있어서 적어도 90%, 그리고 일 실시형태에 있어서 1개 혹은 2개의 내인성 비변형 ADAM6 대립 유전자를 지니는 마우스의 것과 대략 동일한 암컷 마우스와의 교미 시 자손을 생산하는 능력을 발휘한다.
일 실시형태에 있어서 수컷 마우스는 수컷 마우스로부터의 정자 세포가 암컷 마우스 난관을 횡단하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있도록 충분한 ADAM6(또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편)을 발현한다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 기능성은 마우스 염색체 서열과 연속적인 핵산 서열에 의해 부여된다(예컨대, 핵산은 마우스 염색체 내로 무작위로 통합되거나; 또는 예컨대, 특정 위치에 핵산을 표적화함으로써, 예컨대, 부위-특이적 재조합효소-매개(예컨대, Cre-매개) 삽입 혹은 상동성 재조합에 의해 특정 위치에 배치된다). 일 실시형태에 있어서, ADAM6 서열은 마우스의 염색체와는 별개의 핵산 상에 존재한다(예컨대, ADAM6 서열은 에피솜(episome) 상에, 즉, 염색체 외로, 예컨대, 발현 작제물, 벡터, YAC, 트랜스염색체 등 내에 존재한다).
일 양상에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 유전자 변형된 마우스 및 세포가 제공되되, 여기서 마우스는 면역글로불린 중쇄 서열의 적어도 일부, 예컨대, 인간 서열의 적어도 일부를 발현하며, 이때 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 마우스의 ADAM6 활성을 저감시키거나 근절시킨다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 ADAM6 활성을 암호화하는 두 대립 유전자가 수컷 마우스에서의 정상적인 교미를 뒷받침하도록 실질적으로 기능하지 못하는 ADAM6를 발현하거나 없게 되도록 변형된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 암호화 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 것을 불가능하게 하는 마우스의 ADAM6 활성을 유지한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절에 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 배열시키는 것을 불가능하게 하는 염색체 역위 및 또는 전좌를 포함한다.
일 양상에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 유전자 변형된 마우스 및 세포가 제공되되, 여기서 변형은 상기 자리의 ADAM6 서열로부터 발현된 ADAM6 활성을 저감시키거나 제거하고, 마우스는 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 단편은 이소성 ADAM6 서열에 의해 암호화된다. 각종 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 단편은 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 발현된다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스는 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자로부터 기능성 ADAM6의 발현을 저감시키거나 제거하는 제1 변형을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자를 포함하고, 마우스는 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자로부터 기능성 ADAM6의 발현을 실질적으로 저감시키지 않거나 또는 제거하지 않는 제2 변형을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자를 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 업스트림 혹은 5'에서의 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 삽입이다. 각종 실시형태에 있어서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 위치된 내인성 ADAM6 유전자를 유지한다.
일 실시형태에 있어서, 제2 변형은 마지막 마우스 V 유전자 분절의 3'에 (마우스 V 유전자 분절의 전사 방향에 관하여) 위치되고 또한 마우스(또는 키메라 인간/마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 유전자 혹은 그의 단편(예컨대, 암호화 인간 및/또는 마우스를 암호화하는 핵산 서열: CH1 및/또는 힌지 및/또는 CH2 및/또는 CH3)의 5'(불변 서열의 전사 방향에 관하여)에 위치된다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 제1 ADAM6 대립 유전자를 암호화하는 제1 자리에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있고, ADAM6 기능은 기능성 ADAM6을 암호화하는 제2 자리에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있는 내인성 ADAM6의 발현에 기인되되, 여기서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자는 V, D 및/또는 J 유전자 분절의 적어도 하나의 변형을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, V, D 및 또는 J 유전자 분절의 적어도 하나의 변형은 결실, 인간 V, D, 및/또는 J 유전자 분절로의 교체, 카멜리드 V, D, 및/또는 J 유전자 분절로의 교체, 인간화 혹은 카멜화 V, D, 및/또는 J 유전자 분절로의 교체, 중쇄 서열의 경쇄 서열로의 교체, 및 이들의 조합이다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 변형은 중쇄 자리에서의 1개 이상의 중쇄 V, D, 및/또는 J 유전자 분절의 결실 및 하나 이상의 경쇄 V 및/또는 J 유전자 분절(예컨대, 인간 경쇄 V 및/또는 J 유전자 분절)로의 교체이다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 제1 자리에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있고, ADAM6 기능은 마우스의 생식선 내의 비-면역글로불린 자리에서 이소성 ADAM6의 발현으로부터 기인된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 자리는 ROSA26 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 자리는 재생 조직에서 전사적으로 활성이다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 제1 자리에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있고, ADAM6 기능은 마우스의 생식선 내의 내인성 ADAM6 유전자로부터 기인된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 ADAM6 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자 분절과 병치된다(juxtaposed).
일 실시형태에 있어서, 변형은 제1 자리에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있고, ADAM6 기능은 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서의 이소성 ADAM6 서열의 발현에 기인된다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 제1 자리에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에 있고, ADAM6 기능 혹은 활성은 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서의 이소성 ADAM6의 발현에 기인된다.
일 양상에 있어서, ADAM6의 이형접합체 혹은 동종접합체 넉아웃을 포함하는 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 혹은 인간화 면역글로불린 서열, 또는 카멜리드 혹은 카멜화 인간 또는 마우스 면역글로불린 서열인 변형된 면역글로불린 서열을 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 중쇄 면역글로불린 자리에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 중쇄 면역글로불린 자리에서의 인간 중쇄 가변 유전자 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 중쇄 가변 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 내인성 중쇄 가변 서열을 교체한다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 ADAM6 자리로부터 기능적 내인성 마우스 ADAM6을 발현시키는 것을 불가능하게 하는 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스에서 기능적인, ADAM6, 혹은 그의 기능성 단편을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이소성 핵산 서열은 ADAM6 넉아웃에 대해서 동종접합체인 수컷 마우스에 의해 나타나는 자손을 생산하는 능력의 손실을 구제하는 단백질을 암호화한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이소성 핵산 서열은 마우스 ADAM6 단백질을 암호화한다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 ADAM6 자리를 결여하고 또한 마우스 ADAM6 기능을 부여하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 내인성 마우스 ADAM6 서열 또는 그의 기능성 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 ADAM6 서열은 3'-대부분의 마우스 면역글로불린 중쇄 V 유전자 분절(VH)과 5'-대부분의 마우스 면역글로불린 중쇄 D 유전자 분절(DH) 사이의 야생형 마우스에 위치된 ADAM6a- 및 ADAM6b-암호화 서열을 포함한다,
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 마우스 ADAM6a 혹은 그의 기능성 단편을 암호화하는 서열 및/또는 마우스 ADAM6b 혹은 그의 기능성 단편을 암호화하는 서열을 포함하되, 여기서 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 혹은 그의 기능성 단편(들)은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 인간 프로모터이다. 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다. 구체적인 실시형태에 있어서, ADAM6 프로모터는 마우스 5'-대부분의 DH 유전자 분절에 가장 가까운 첫 번째 ADAM6 유전자의 제1 코돈과 5'-대부분의 DH 유전자 분절의 재조합 신호 서열 사이에 위치된 서열을 포함하되, 여기서 5'는 마우스 면역글로불린 유전자의 전사 방향에 관하여 표시된다. 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 바이러스 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터이다. 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 유비퀴틴 프로모터이다.
일 실시형태에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일 실시형태에 있어서, 유도성 프로모터는 비재생 조직 내의 발현을 조절한다. 일 실시형태에 있어서, 유도성 프로모터는 재생 조직 내의 발현을 조절한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 서열 혹은 그의 기능성 단편(들)의 발현은 재생 조직 내에서 유도성 프로모터에 의해 발전적으로 조절된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b는 서열번호 1의 ADAM6a 및/또는 서열번호 2의 DAM6b로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 프로모터는 서열번호 3의 프로모터이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 제1 코돈의 바로 업스트림에(ADAM6a의 잔사 방향에 관하여 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하고 이는 ADAM6 암호화 영역의 업스트림에 서열 번호 3의 말단까지 연장된다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 개시 코돈의 업스트림에 약 5 내지 약 20개 이내의 뉴클레오타이드로부터 ADAM6a의 개시 코돈의 업스트림에 약 0.5kb, 1kb, 2kb 혹은 3kb 이상까지 연장되는 단편이다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 불임이거나 또는 ADAM6의 결여로 인해 낮은 가임성을 지니는 마우스 내에 배치될 경우 가임성을 개선시키거나 가임성을 대략 야생형 가임성으로 회복시키는 서열번호 3 혹은 그의 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 서열번호 3 혹은 그의 단편은 마우스 난자를 수정시키기 위하여 암컷 마우스 난관을 횡단할 수 있는 정자 세포를 생산하는 능력을 수컷 마우스에 부여한다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은, 마우스 내에 배치되거나 유지될 경우 야생형 마우스와 동일하거나 견줄만한 수준의 가임성을 산출하는 서열 암호화 ADAM6 유전자 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편을 암호화하는 임의의 서열이다. 가임성의 예시적인 수준은 마우스 난자를 수정시키기 위하여 암컷 마우스 난관을 횡단할 수 있는 정자 세포를 생산하는 수컷 마우스의 능력에 의해 입증될 수 있다.
일 양상에 있어서, ADAM6 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열의 결실, 내인성 마우스 VH 유전자 분절의 인간 VH 유전자 분절로의 교체, 및 수컷 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 ADAM6 유전자를 포함하는 내인성 면역글로불린 자리 뉴클레오타이드 서열의 결실을 포함하는 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하고, 암호화 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 여기서 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 혹은 바로 인접해 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 VH 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 교체를 포함하며, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 혹은 바로 인접해 있다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개 이상의 내인성 DH 유전자 분절의 내인성 DH 유전자 자리에서의 1개 이상의 인간 DH 유전자 분절로의 교체를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개 이상의 내인성 JH 유전자 분절의 내인성 JH 유전자 자리에서의 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절로의 교체를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 교체 및 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 자리에서의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절로의 교체를 포함하되, 여기서 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서의 인간 VH, DH 및 JH 유전자의 삽입체를 포함하되, 여기서 마우스는 마우스에서 기능적인 ADAM6 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열은 존재하는 인간 VH 유전자 분절의 끝에서 두 번째의 3'-대부분의 VH 유전자 분절과 존재하는 인간 VH 유전자 분절의 최후의 3' VH 유전자 분절 사이에 배치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 VH 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 결실, 및 인간 VH 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부로의 교체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 인간 유전자 분절 VH1-2의 다운스트림과 인간 유전자 분절 VH6-1의 업스트림에 존재한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 VH 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 교체를 포함하고, 및 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에, 혹은 바로 인접해 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 게놈 내의 전이유전자 상에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스 내의 염색체 외에 존재한다.
일 양상에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 면역글로불린 서열을 포함하는 B 세포를 발현하고, B 세포는 수컷 마우스에서 기능적인 유전자 암호화 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 그의 게놈 내에(예컨대, B 세포 염색체 상에) 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 면역글로불린 서열은 인간 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열; 마우스 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열; 인간 혹은 마우스 경쇄 V 및/또는 J 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 또는 마우스 중쇄 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 기능적으로 침묵하는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리를 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 ADAM6 기능은 마우스 내에 유지되고, 하나 이상의 마우스 중쇄 불변 영역의 업스트림 혹은 5'에 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절의 삽입체를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절은 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절, 1개 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 기능적으로 침묵하는 내인성 경쇄 자리를 더 포함하되, 여기서 마우스는 야생형 마우스와 동일하거나 견줄만한 ADAM6 활성을 포함하고, 또한 마우스 경쇄 불변 영역의 업스트림 혹은 5'에 1개 이상의 인간 λ 경쇄 유전자 분절의 삽입체를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 12개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 12개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 28개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 28개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 40개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 40개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 4개의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 또는 마우스 Cλ이다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 기능적으로 침묵하는 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하고, 1개 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절로의 교체를 더 포함하며, 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 자리를 결여하고, 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 마우스 ADAM6 자리 혹은 서열을 결여하고 마우스 ADAM6 자리를 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열 또는 마우스 ADAM6 자리 혹은 서열의 기능성 단편을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 이소성 ADAM6 자리 혹은 서열을 포함하는 후손을 생산하기 위하여 반대쪽 성의 마우스와의 교미를 가능하게 한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 수컷이다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 암컷이다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리에 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하고, 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리에서 내인성 기능성 ADAM6 서열을 결여하며, 그리고 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 염색체 외에 있다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 게놈 내의 하나 이상의 자리에서 표적화된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 자리는 면역글로불린 자리를 포함한다.
일 양상에 있어서, 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리로부터 면역글로불린 중쇄 서열을 발현하는 마우스가 제공되되, 여기서 중쇄는 인간 V 유전자 분절, D 유전자 분절, 및 J 유전자 분절로부터 유래되고, 이때 마우스는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 복수의 인간 V 유전자 분절, 복수의 D 유전자 분절 및 복수의 J 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, D 유전자 분절은 인간 D 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, J 유전자 분절은 인간 J 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간화 중쇄 불변 영역 서열을 더 포함하되, 여기서 인간화는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열의 교체를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 중쇄는 인간 V 유전자 분절, 인간 D 유전자 분절, 인간 J 유전자 분절, 인간 CH1 서열, 인간 또는 마우스 힌지 서열, 마우스 CH2 서열, 및 마우스 CH3 서열로부터 유래된다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 경쇄 불변 서열을 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 측면의 5' 및 3'에 있는 ADAM6 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절은 항체의 중쇄의 암호화를 불가능하게 한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 ADAM6 유전자는 야생형 마우스 내의 것과 동일한 위치에 있고, 마우스의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리는 항체의 중쇄를 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 한다.
일 실시형태에 있어서, V 유전자 분절은 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열 측면의 5'(V 유전자 분절의 전사에 관하여)에 있다.
일 실시형태에 있어서, V 유전자 분절은 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열 측면의 3'(V 유전자 분절의 전사에 관하여)에 있다.
일 실시형태에 있어서, D 유전자 분절은 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열의 측면의 5'(D 유전자 분절의 전사에 관하여)에 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 자리의 5'-대부분의 D 유전자 분절의 5' 및 3'-대부분의 V 유전자 분절의 3'(V 유전자 분절의 전사 방향에 관하여)에 위치된 뉴클레오타이드 서열의 발현에 기인한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 자리에서의 2개의 인간 V 유전자 분절 사이에 위치된 뉴클레오타이드 서열의 발현에 기인된다. 일 실시형태에 있어서, 2개의 인간 V 유전자 분절은 인간 VH1-2 유전자 분절과 VH6-1 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6b 서열 또는 그의 기능성 단편, 마우스 ADAM6a 서열 또는 그의 기능성 단편, 및 이들의 조합로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 2개의 인간 V 유전자 분절 사이에 있는 뉴클레오타이드 서열은 인간 V 유전자 분절에 관하여 반대쪽 전사 배향으로 배치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 ADAM6 유전자의 전사 방향에 관하여 5'에서 3'로 암호화되고 ADAM6a 서열에 이어서 ADAM6b 서열이 온다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 V 유전자 분절인 VH1-2와 VH6-1 사이에 있는 인간 ADAM6 위유전자(pseudogene) 서열의 마우스 ADAM6 서열 혹은 그의 기능성 단편으로의 교체를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 마우스 ADAM6 서열 또는 그의 기능성 단편이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는, 내인성 마우스 DFL16.1 유전자 분절(예컨대, 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에 대해서 이형접합체인 마우스 내에서), 또는 인간 DH1-1 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스에 의해 발현된 면역글로불린 중쇄의 D 유전자 분절은 내인성 마우스 DFL16.1 유전자 분절 또는 인간 DH1-1 유전자 분절로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 비-재배열(non-arranged) B 세포 계통(lineage)의 DNA-보유 세포 내의 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 재배열된 면역글로불린 자리를 포함하는 B 세포 내의 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 마우스 ADAM6 유전자가 야생형 마우스에서 나타나는 위치와는 상이한 위치에서 게놈 내에서 발견된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 B 세포 계통가 아닌 DNA-보유 세포의 전부 혹은 실질적으로 전부에 존재하며; 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 재배열된 B 세포의 염색체가 아니라, 마우스의 생식선 세포에 존재한다.
일 양상에 있어서, 재배열된 면역글로불린 자리를 포함하는 B 세포를 비롯하여, DNA-보유 세포의 전부 혹은 실질적으로 전부에 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)를 암호화하는 핵산 서열은 마우스 ADAM6 유전자가 야생형 마우스에서 나타나는 위치와는 상이한 위치에서 게놈 내에 발생한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 자리와 연속적인 핵산 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 재배열된 면역글로불린 자리와 연속적인 핵산은 염색체이다. 일 실시형태에 있어서, 염색체는 야생형 마우스 내에서 발견되는 염색체이고, 이 염색체는 마우스 면역글로불린 자리의 변형을 포함한다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 마우스는 그의 게놈에 ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 포함하는 B 세포를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체는 면역글로불린 중쇄 자리에 있다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체는 면역글로불린 자리가 아닌 자리에 있다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 서열은 비상동성 프로모터(heterologous promoter)에의해 구동되는 전이유전자 상에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비상동성 프로모터는 비-면역글로불린 프로모터이다. 구체적인 실시형태에 있어서, B 세포는 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 B 세포의 90% 이상은 마우스에서 기능적인 유전자 암호화 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 그의 상동체 혹은 그의 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 수컷 마우스이다.
일 실시형태에 있어서, B 세포 게놈은 ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 포함하는 제1 대립 유전자 및 제2 대립 유전자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, B 세포 게놈은 ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 포함하는 제2 대립 유전자가 아니라 제1 대립 유전자를 포함한다.
일 양상에 있어서, 마우스는 1개 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 변형을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 변형은 1개 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자를 유지하고, 마우스는 마우스 경쇄 불변 영역의 업스트림에서의 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절의 삽입체를 더 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 또는 마우스 Cλ이다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 마우스가 적어도 하나의 중쇄 대립 유전자로부터 재배열된 내인성 중쇄 유전자 분절을 포함하는 기능성 중쇄를 발현시키는 것을 불가능하게 하고, 또한 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 내에 위치된 내인성 ADAM6 대립 유전자를 유지한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자들 중 적어도 하나로부터 재배열된 내인성 중쇄 유전자 분절을 포함하는 기능성 중쇄를 발현키는 것을 불가능하게 하고, 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 ADAM6 단백질을 발현한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 2개의 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자로부터 재배열된 내인성 중쇄 유전자 분절을 포함하는 기능성 중쇄를 발현키는 것을 불가능하게 하고, 마우스는 1개 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 ADAM6 단백질을 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 각각의 내인성 중쇄 대립 유전자로부터 기능성 중쇄를 발현키는 것을 불가능하게 하고, 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 (마우스 중쇄 자리의 전사 방향에 관하여) 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 혹은 120 이상 Mbp 업스트림 내에 위치된 기능성 ADAM6 대립 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 기능성 ADAM6 대립 유전자는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에(예컨대, 유전자간 V-D 영역에, 두 V 유전자 분절 사이에, V 유전자 분절과 D 유전자 분절 사이에, D 유전자 분절과 J 유전자 분절 사이에 등) 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 기능성 ADAM6 대립 유전자는 마지막 마우스 V 유전자 분절과 첫 번째 마우스 D 유전자 분절 사이의 90 내지 100 kb 유전자간 서열 내에 위치된다.
일 양상에 있어서, 1개 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자에 변형을 포함하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 변형은 마우스가 1개 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자 중 적어도 하나로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시키는 것을 불가능하게 한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자의 각각으로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시키는 것을 불가능하게 한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 각각의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시키는 것을 불가능하게 한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 각각의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시키는 것을 불가능하게 하고, 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 (마우스 중쇄 자리의 전사 방향에 관하여) 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120 이상 kb 업스트림 내에 위치된 이소성 ADAM6 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이소성 ADAM6 서열은 내인성 중쇄 자리에(예컨대, 유전자간 V-D 영역에, 두 V 유전자 분절 사이에, V 유전자 분절과 D 유전자 분절 사이에, D 유전자 분절과 J 유전자 분절 사이에 등) 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이소성 ADAM6 서열은 마지막 마우스 V 유전자 분절과 첫 번째 D 유전자 분절 사이의 90 내지 100 kb 유전자간 서열 내에 위치된다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 90 내지 100 kb 유전자간 V-D 서열이 제거되고, 이소성 ADAM6 서열이 마지막 유전자 분절과 첫 번째 D 유전자 분절 사이에 배치된다.
일 양상에 있어서, 불임 수컷 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 2개 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자의 결실을 포함한다. 일 양상에 있어서, 수컷 불임 특성의 매개체(carrier)인 암체 마우스가 제공되되, 여기서 암컷 마우스는 그의 생식선에 비기능성 ADAM6 대립 유전자 또는 내인성 ADAM6 대립 유전자의 넉아웃을 포함한다.
일 양상에 있어서, 항체의 중쇄를 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 하는 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 또는 J 유전자 분절을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스의 B 세포의 대부분은 기능성 ADAM6 유전자를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스의 B 세포의 대부분은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림에 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 및 마우스 Cλ로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 항체의 기능성 중쇄를 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 하는 온전한 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 적어도 1개 내지 89개까지의 V 유전자 분절, 적어도 1개 내지 13개까지의 D 유전자 분절, 적어도 1개 내지 4개의 J 유전자 분절, 및 이들의 조합을 포함하고; 적어도 1개 내지 89개까지의 V 유전자 분절, 적어도 1개 내지 13개까지의 D 유전자 분절, 적어도 1개 내지 4개까지의 J 유전자 분절은 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 온전한 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절 내에 위치된 기능성 ADAM6 유전자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 ADAM6 자리를 포함하는 내인성 중쇄 자리를 포함하되, 여기서 내인성 중쇄 자리는 89개의 V 유전자 분절, 13개의 D 유전자 분절 및 4개의 J 유전자 분절을 포함하며, 내인성 중쇄 유전자 분절은 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하기 위하여 재배열시키는 것을 불가능하게 하고, ADAM6 자리는 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질을 암호화한다.
일 양상에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 결여하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스의 B 세포의 대부분은 ADAM6 서열 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 B 세포의 대부분은 인간 람다 가변 도메인 및 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 2개 이상의 V 유전자 분절, 2개 이상의 D 유전자 분절, 2개 이상의 J 유전자 분절로부터 선택된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절, 및 이들의 조합을 결여한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 적어도 1개 내지 89개까지의 V 유전자 분절, 적어도 1개 내지 13개의 D 유전자 분절, 적어도 1개 내지 4개까지의 J 유전자 분절, 및 이들의 조합으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 유전자 분절을 결여한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 약 3 메가베이스(megabase)의 내인성 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 염색체 12로부터 게놈 DNA 단편을 결여한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 모든 기능적 내인성 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절을 결여한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 9개의 VH 유전자 분절, 13개의 DH 유전자 분절 및 4개의 JH 유전자 분절을 결여한다.
일 양상에 있어서, 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 생식선 내에 게놈을 가지며, 여기서 면역글로불린 중쇄 자리에 대한 변형은 하나 이상의 마우스 면역글로불린 가변 영역 서열의 하나 이상의 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열로의 교체를 포함하고, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 면역글로불린 중쇄 자리의 DH 및 JH 서열 그리고 적어도 3, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 40, 적어도 60 또는 적어도 80개의 VH 서열이 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 교체된다. 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 면역글로불린 중쇄 자리의 DH, JH 및 모든 VH 서열이 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 교체된다. 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 비-재배열일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 비-마우스종의 완전 비-재배열 DH 및 JH 영역 그리고 적어도 3, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 40, 적어도 60 혹은 적어도 80개의 비-재배열 VH 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 비-마우스종의 모든 VH, DH 및 JH 영역을 포함하는 완전 가변 영역을 포함한다. 비-마우스종은 호모 사피엔스일 수 있고, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 인간 서열일 수 있다.
일 양상에 있어서, 적어도 1개의 인간 가변 도메인/비-인간 불변 도메인 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 면역글로불린 자리 이외의 자리로부터 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체는 마우스의 B 세포에서 발현되되, 여기서 B 세포는 인간 가변 서열 및 비-인간 불변 서열을 포함하는 재배열된 면역글로불린 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 불변 서열은 설치류 서열이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 불임 수컷 마우스를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 공여자 ES 세포의 내인성 ADAM6 대립 유전자에 비기능성을 부여하는(또는 상기 대립 유전자를 넉아웃시키는) 단계, 공여자 ES 세포를 숙주 배아를 도입시키는 단계, 숙주 배아를 대리모에 수정시키는 단계 및 대리모에게 공여자 ES 세포로부터 전체적으로 혹은 부분적으로 유래된 후손이 태어나게 하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 불임 수컷 마우스를 얻기 위하여 후손을 교배하는 단계를 더 포함한다.
일 양상에 있어서, 관심 대상 유전자 변형을 가진 마우스를 제작하는 방법이 제공되되, 여기서 마우스는 불임이며, 상기 방법은 (a) 게놈 내 관심 대상 유전자 변형을 만드는 단계; (b) 게놈을 내인성 ADAM6 대립 유전자의 넉아웃으로 변형시키거나, 또는 내인성 ADAM6 대립 유전자에게 비기능성을 부여하는 단계; 및 (c) 마우스의 제작 시 게놈을 이용하는 단계를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 게놈은 ES 세포로부터 유래되거나, 또는 핵 이식 실험에 이용된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화 벡터, 뉴클레오타이드 작제물 또는 세포를 이용해서 제작된 마우스가 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 야생형 마우스이거나 혹은 유전자 변형된 제2 마우스와의 교미에 의한 후손이 제공된다.
일 양상에 있어서, 마우스 변종을 유지시키는 방법이 제공되되, 여기서 마우스 변종은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열의 하나 이상의 비상동성 면역글로불린 중쇄 서열로의 교체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 비상동성 면역글로불린 중쇄 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 서열이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 변종은 1개 이상의 마우스 VH, DH, 및/또는 JH 유전자 분절의 결실을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절, 1개 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및/또는 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절을 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 어도 3, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 40, 적어도 60, 혹은 적어도 80개의 인간 VH 분절, 적어도 27개의 인간 DH 유전자 분절, 및 적어도 6개의 JH 유전자 분절을 포함한다
. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 적어도 3, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 40, 적어도 60, 또는 적어도 80 인간 VH 분절을 포함하고, 적어도 27 인간 DH 유전자 분절, 및 적어도 6개의 JH 유전자 분절은 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 또는 이들의 조합으로부터 선태된 마우스 불변 영역 유전자 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열의 교체를 위하여 이형접합체인 수컷 마우스를 생성하는 단계, 및 이형접합체 수컷 마우스를 인간 중쇄 서열에 대해서 동종접합체가거나 이형접합체인 야생형 암컷 마우스 혹은 암컷 마우스와 교배시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 이형접합체 수컷을 인간 중쇄 서열에 대해서 동종접합체 혹은 이형접합체가거나 야생형인 암컷과 반복해서 교배시킴으로써 변종을 유지시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 인간 중쇄 서열에 대해서 동종접합체 또는 이형접합체인 수컷 혹은 암컷 마우스로부터 세포를 얻는 단계, 및 이들 세포를 공여자 세포로서 혹은 그로부터의 핵을 공여자 핵으로서 이용하고, 해당 세포 혹은 핵을 이용해서 숙주 세포를 이용한 유전자 변형된 동물을 제작하고/하거나 대리모 내에 세포 및/또는 핵을 수정시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 중쇄 자리에서의 교체에 대해서 이형접합체인 수컷 마우스만을 암컷 마우스와 교배시킨다. 구체적인 실시형태에 있어서, 암컷 마우스는 교체된 중쇄 자리에 관하여 동종접합체, 이형접합체, 또는 야생형이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열의 비상동성 면역글로불린 경쇄 서열로의 교체를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비상동성 면역글로불린 경쇄 서열은 인간 면역글로불린 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 면역글로불린 자리 이외의 자리에 전이유전자를 더 포함하되, 여기서 전이유전자는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 (재배열되지 않은 것에 대하여) 작동가능하게 연결되거나 또는 (재배열된 것에 대하여) 융합된 재배열된 혹은 재배열되지 않은 비상동성 λ 또는 κ 경쇄 서열(예컨대, 재배열되지 않은 VL 및 재배열되지 않은 JL, 또는 재배열된 VJ)을 암호화하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비상동성 λ 또는 κ 경쇄 서열은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 서열은 설치류, 인간 및 비-인간 영장류로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 서열은 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 전이유전자는 경쇄 서열의 발현을 구동하는 비-면역글로불린 프로모터를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 프로모터는 전사 활성 프로모터이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 프로모터는 ROSA26 프로모터이다.
일 양상에 있어서, 업스트림 상동성 부문 및 다운스트림 상동성 부문을 포함하는 핵산 작제물이 제공되되, 여기서 업스트림 상동성 부문은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 다운스트림 상동성 부문은 인간 또는 마우스 면역글로불린 가변 영역 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하고 다운스트림 상동성 부문사이에 배치되며, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 서열은 마우스 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이에 따라서 마우스 ADAM6은 야생형 마우스에 연결된다.
일 양상에 있어서, (a) 인간 가변 영역 유전자 분절 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적을 동일한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 표적화 벡터는 마우스 ADAM6을 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다.
일 양상에 있어서, 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 변형시키기 위한 뉴클레오타이드 작제물이 제공되되, 여기서 작제물은 적어도 하나의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위 및 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는, ES 세포, 다능성 세포 및 유도된 다능성 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 마우스 세포 및 마우스 배아가 제공된다. XX인 세포 및 XY인 세포가 제공도니다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형, 예컨대, 전핵 주입(pronuclear injection)에 의해 세포 내로 도입된 변형을 함유하는 핵을 포함하는 세포가 또한 제공된다. 바이러스에 의해 도입된 ADAM6 유전자를 포함하는 세포, 배아 및 마우스, 예컨대, 마우스에서 기능적인 ADAM6 유전자를 포함하는 형질도입 작제물을 포함하는 세포, 배아 및 마우스가 또한 제공된다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스 세포가 제공되되, 여기서 세포는 기능적 내인성 마우스 ADAM6 자리를 결여하고, 세포는 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열의 변형을 더 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열의 변형은 마우스 VH 유전자 분절의 결실, 마우스 DH 유전자 분절의 결실, 마우스 JH 유전자 분절의 결실, 및 이들의 조합으로부터 선택된 결실을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 하나 이상의 마우스 면역글로불린 VH, DH, 및/또는 JH 서열의 인간 면역글로불린 서열로의 교체를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 인간 VH, 인간 Vλ, 인간 DH, 인간 JH, 인간 JL, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 전능 세포, 다능성 세포 또는 유도된 다능성 세포이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
일 양상에 있어서, 마우스 B 세포가 제공되되, 여기서 마우스 B 세포는 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함하고, B 세포는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 핵산 서열을 B 세포의 염색체 상에 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 B 세포 핵산 서열의 2개의 대립 유전자를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리와 연속적인 핵산 분자(예컨대, B 세포 염색체) 상에 있다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 핵산 분자와는 별개의 핵산 분자(예컨대, B 세포 염색체) 상에 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 B 세포는 마우스 혹은 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열된 비-마우스 면역글로불린 가변 유전자 서열을 포함하되, 여기서 B 세포는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 염색체, 그리고 수컷 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 신체 마우스 세포가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 변형된 면역글로불린 중쇄 자리와 동일한 염색체 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산은 변형된 면역글로불린 중쇄 자리와는 상이한 염색체 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 신체 세포는 단일 복체의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 신체 세포는 적어도 2 복제의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 신체 세포는 B 세포이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 세포는 생식 세포이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 세포는 줄기 세포이다.
일 양상에 있어서, 생식 세포의 염색체 상에 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 생식 세포가 제공되되, 마우스 ADAM6(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그 혹은 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스 생식 세포의 염색체 내의 위치와는 상이한 염색체 내의 위치에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리와 동일한 생식 세포의 염색체 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리와는 상이한 생식 세포의 염색체 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 면역글로불린 자리는 적어도 하나의 마우스 면역글로불린 서열의 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열로의 교체를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열은 인간 면역글로불린 서열이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 다능성, 유도된 다능성 혹은 전능 세포가 제공된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 세포 는 마우스 배아줄기(ES) 세포이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 또는 조직이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 세포 또는 조직은 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 B 세포이다. 일 실시형태에 있어서 세포는 배아줄기 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 생식 세포이다.
일 실시형태에 있어서, 조직은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 조직은 재생 조직이다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 및/또는 조직은 하나 이상의 체외 검정에 이용하기 위하여 단리된다. 각종 실시형태에 있어서, 하나 이상의 체외 검정은 물리적, 열, 전기, 기계 혹은 광학 특성, 외과수술적 시술, 상이한 조직 유형의 상호작용의 측정, 영상화 기술의 발달 또는 이들의 조합을 포함한다.
양상에 있어서, 항체를 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 또는 조직의 용도가 제공된다. 일 양상에 있어서, 하이브리도마 혹은 쿼드로마(quadroma)를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 또는 조직의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 비-인간 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 염색체 혹은 그의 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 핵을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 세포는 핵 이식의 결과로서 염색체 혹은 그의 단편을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터 유래된 핵이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 핵은 B 세포가 아니라 2배체 세포로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스에서 제작된 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스에서 제작된 항체의 면역글로불린 중쇄 혹은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스에서 제작된 항체의 가변 영역을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 혹은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스에서 제작된 그의 항체 혹은 항원-결합 단편(예컨대, Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 업스트림에서 (면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 전사에 관하여) 1개 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 분절을 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절로 교체하는 단계, 및 마우스의 ADAM6 자리의 다운스트림에서 (면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 전사에 관하여) 하나 이상의 면역글로불린 유전자 분절을 1개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 혹은 경쇄 유전자 분절로 교체하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 업스트림에서 1개 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 분절을 교체하는 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절은 V 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 업스트림에서 1개 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 분절 업스트림을 교체하는 인간 면역글로불린 유전자 분절은 V 및 D 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 1개 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 분절을 교체하는 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절은 J 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 1개 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 분절을 교체하는 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절은 D 및 J 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 1개 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 분절을 교체하는 1개 이상의 인간 면역글로불린 유전자 분절은 V, D 및 J 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 유전자의 업스트림 및/또는 다운스트림에서의 1개 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 분절은 유전자 변형된 전구 세포를 형성하기 위하여 다능성, 유도된 다능성, 혹은 전능 세포로 교체되고; 유전자 변형된 전구 세포는 숙주 내로 도입되고; 유전자 변형된 전구 세포를 포함하는 숙주는 유전자 변형된 전구 세포로부터 유래된 게놈을 포함하는 마우스를 형성하기 위하여 임신된다. 일 실시형태에 있어서, 숙주는 배아이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 숙주는 마우스 프레-상실배(pre-morula)(예컨대, 8- 혹은 4-세포기), 4배체 배아, 배아 세포의 응집제, 또는 배반포로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스를 제작하는 방법이 제공되되, 해당방법은 마우스 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 마우스 뉴클레오타이드 서열 및 마우스 ADAM6(또는 수컷 마우스에서의 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편 기능성) 뉴클레오타이드 서열을 인간 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 서열로 교체하여 제1 키메라 자리를 형성하는 단계, 이어서 마우스 ADAM6-암호화 서열(또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 기능성 단편을 암호화하는 서열)을 포함하는 서열을 인간 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 서열 내로 삽입하여 제2 키메라 자리를 형성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 제2 키메라 자리는 인간 면역글로불린 중쇄 가변(VH) 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 제2 키메라 자리는 인간 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 제2 키메라 자리는 인간 DH 유전자 분절 및 인간 JH 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 인간 VH 유전자 분절 또는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 제2 키메라 자리는, 마우스 CH2 + CH3 서열와 융합된, 인간 CH1 서열, 또는 인간 CH1 및 인간 힌지 서열을 포함하는 제3 키메라 자리에 작동가능하게 연결된다.
일 양상에 있어서, 가임 수컷 마우스를 제작하기 위한 마우스 ADAM6 자리 혹은 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스의 용도가 제공되되, 여기서 상기 용도는 마우스 ADAM6 자리 혹은 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스를 기능적 내인성 마우스 ADAM6 자리 혹은 서열을 결여하는 마우스와 교미시키는 단계, 및 이소성 ADAM6 자리 혹은 서열을 지니는 후손을 생산할 수 있는 암컷이거나 또는 이소성 ADAM6 자리 혹은 서열을 포함하는 수컷인 후손을 얻는 단계를 포함하며, 상기 수컷은 야생형 수컷 마우스가 나타내는 가임성과 대략 동일한 가임성을 나타낸다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 완전한 인간 Fab 또는 완전한 인간 F(ab)2를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 불멸화된 세포주를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 하이브리도마 또는 쿼드로마를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 가변 영역을 함유하는 파지 라이브러리를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 인간 항체를 제작하기 위한 가변 영역 서열을 생성하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 해당 용도는 (a) 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 관심 대상 항원으로 면역화하는 단계, (b)(a)의 면역화된 마우스로부터 림프구를 단리시키는 단계, (c) 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 관심 대상 항원에 결합될 수 있는 림프구를 동정하는 단계, 및 (e) 프구로부터 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열을 증폭시킴으로써 가변 영역 서열을 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 림프구는 마우스의 비장으로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 림프구는마우스의 림프절로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 림프구는 마우스의 골수로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 표지된 항체는 형광단-컨쥬게이팅된 항체이다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 형광단-컨쥬게이팅된 항체는 IgM, IgG, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 림프구는 B 세포이다.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 서열이다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간 항체를 제조하기 위하여 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 이 용도는 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 관심 대상 항원으로 면역화시키는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 비장을 단리시키는 단계, (c) 비장으로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 관심 대상 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프구를 동정하는 단계, 및 (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시킴으로써 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간 항체를 제조하기 위하여 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 이 용도는 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 관심 대상 항원으로 면역화시키는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 하나 이상의 림프절을 단리시키는 단계, (c) 하나 이상의 림프절로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 관심 대상 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프구를 동정하는 단계, 및 (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시킴으로써 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간 항체를 제조하기 위하여 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 이 용도는 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 관심 대상 항원으로 면역화시키는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 골수를 단리시키는 단계, (c) 골수로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 관심 대상 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프구를 동정하는 단계, 및 (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시킴으로써 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 하나 이상의 표지된 항체는 IgM, IgG, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
각종 실시형태에 있어서, 인간 항체를 제조하기 위하여 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 이 용도는 증폭된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열에 융합시키는 단계, 세포 내에 융합된 중쇄 및 경쇄 서열을 발휘시키니는 단계 및 발현된 중쇄 및 경쇄 서열을 회수함으로써 인간 항체를 생성하는 단계를 더 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 인간 중쇄 불변 영역은 IgM, IgD, IgA, IgE 및 IgG로부터 선택된다. 각종 구체적인 실시형태에 있어서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, 인간 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4, 또는 이들의 조합을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 경쇄 불변 영역은 면역글로불린 κ 불변 영역이다. 각종 실시형태에 있어서, 세포는 HeLa 세포, DU145 세포, Lncap 세포, MCF-7 세포, MDA-MB-438 세포, PC3 세포, T47D 세포, THP-1 세포, U87 세포, SHSY5Y(인간 신경모세포종) 세포, Saos-2 세포, Vero 세포, CHO 세포, GH3 세포, PC12 세포, 인간 망막 세포(예컨대, PER.C6(상표명) 세포), 및 MC3T3 세포로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 세포는 CHO 세포이다.
일 양상에 있어서, 관심 대상 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 설치류-인간 항체를 생성하는 방법에 제공되되, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 마우스-인간 항체를 생산하는 마우스로부터 적어도 하나의 세포를 단리시키는 단계, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 마우스-인간 항체를 생산하는 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체를 얻는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 역-키메라 마우스-인간 항체는 마우스 또는 래트 중쇄 불변 유전자에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인 및 마우스 또는 래트 또는 인간 경쇄 불변 유전자에 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 설치류-인간 항체를 생산하는 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계는 마우스로부터 단리된 적어도 하나의 세포로부터 생성된 적어도 하나의 하이브리도마 세포 상에서 수행된다.
일 양상에 있어서, 관심 대상 항원에 대해서 특이적인 완전한 인간 항체를 생성하는 방법이 제공되되, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 설치류-인간 항체를 생산하는 마우스로부터 적어도 하나의 세포를 단리시키는 단계, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 설치류-인간 항체로부터 유래된 완전한 인간 항체를 생산하는 적어도 하나의 세포를 생성하는 단계, 완전한 인간 항체를 생산하는 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계, 상기 완전한 인간 항체를 얻는 단계를 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 항원에 대해서 특이적인 역-키메라 설치류-인간 항체를 생산하는 마우스로부터 단리된 적어도 하나의 세포는 비장세포 또는 B 세포이다.
각종 실시형태에 있어서, 항체는 단클론성 항체이다.
각종 실시형태에 있어서, 관심 대상 항원으로의 면역화는 단백질, DNA, DNA와 단백질의 조합, 또는 항원을 발현하는 세포로 수행된다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 가변 영역 혹은 그의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제작하는데 이용된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 항체, 다중-특이적 항체(예컨대, 이중-특이적 항체), scFv, 이중-특이적 scFv, 다이아바디, 트라이바디, 테트라바디, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD(즉, 이중 가변 도메인 항원-결합 단백질), SVD(즉, 단일 가변 도메인 항원-결합 단백질), 또는 이중 특이적 T-세포 인게이저(bispecific T-cell engager: BiTE)로부터 선택된 항원-결합 단백질을 제작하는데 이용된다.
일 양상에 있어서, 기능적 내인성 마우스 ADAM6 서열을 결여하는 마우스 내에 이소성 ADAM6 서열을 도입하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되되, 여기서 상기 용도는 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 기능적 내인성 마우스 ADAM6 서열을 결여하는 마우스와 교미시키는 단계를 포함한다.
일 양상에 있어서, 이소성 ADAM6 서열을 지니는 마우스를 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스로부터의 유전자 재료의 이용이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 용도는 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 세포의 핵을 이용한 핵 이식을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 용도는 세포로부터 유래된 동물을 생산하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 세포를 클로닝하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 용도는 이소성 ADAM6 서열을 포함하는 마우스를 제작하는 과정에서본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 정자 혹은 난자를 이용하는 것을 포함한다.
일 양상에 있어서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 가임 수컷 마우스를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 제1 마우스 생식 세포를 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 유전자 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 포함하는 제2 마우스 생식 세포로 수정시키는 단계; 수정된 세포를 형성하는 단계; 수정된 세포를 배아로 발달시키는 단계; 및 대리체 내에 배아를 수정시켜서 마우스를 얻는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 수정은 수컷 마우스와 암컷 마우스를 교미시킴으로써 달성된다. 일 실시형태에 있어서, 암컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편을 포함한다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 게놈을 지니는 마우스의 가임성을 회복시키거나 증대시키기 위한, 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 대응하는 ADAM6 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열의 용도가 제공되되, 변형은 내인성 ADAM6 기능을 저감시키거나 제거한다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 이소성 위치에서 마우스의 게놈 내로 통합된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 자리에서 마우스의 게놈 내로 통합된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 자리 이외의 위치에서 마우스의 게놈 내로 통합된다.
일 양상에 있어서, 약제(예컨대, 항원-결합 단백질)의 제조를 위하여, 또는 약제(예컨대, 항원-결합 단백질)의 가변 서열을 암호화하는 서열의 제조를 위하여, 인간 질환 혹은 장애의 치료를 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스 세포가 제공되되, 여기서 세포는 재배열된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절을 포함하는 중쇄를 발현시키는 것을 불가능하게 하고, 세포는 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 기능성 ADAM6 유전자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 면역글로불린 유전자 분절의 삽입체를 더 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 유전자 분절은, 재배열 시, 인간 가변 영역을 포함하는 항체의 기능성 중쇄를 암호화하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 중쇄 유전자 분절이다.
비-인간 동물을 변형시키기 위한 핵산 작제물뿐만 아니라 유전자 변형된 비-인간 동물, 배아, 세포, 조직, 그리고, 이들을 제작하고 이용하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 카파(κ) 경쇄의 맥락에서 람다(λ) 가변 영역(인간 혹은 비-인간)을 생성하는 동물 및 세포가 제공되되, 여기서 동물 및 세포는, ADAM6 단백질 또는 그의 상동체 혹은 오솔로그의 활성을 제거하거나 저감시키는 중쇄 면역글로불린 자리의 변형을 포함하되, 동물은 ADAM6 활성(또는 그의 상동체 혹은 오솔로그의 활성)을 전체적으로 혹은 부분적으로 회복시키는 유전자 변형을 더 포함한다. 가임성이고 인간 중쇄 가변 도메인과 동족인 인간 λ 가변 도메인을 발현하는 마우스가 제공되되, 여기서 λ 또는 κ 불변 영역과 연속적인 인간 λ 가변 도메인이 마우스에서 발현되고, 각종 실시형태에 있어서 λ 또는 κ 가변 영역은 내인성(예컨대, 마우스 또는 래트) 불변 영역이다. κ 혹은 λ 경쇄의 맥락에서, 예컨대, 내인성 마우스 경쇄 자리로부터 인간 λ 가변 영역을 생성하는 마우스 및 세포가 또한 제공된다. 또 람다 가변 영역을 포함하는 항체를 제조하기 위한 방법이 제공된다. 동족 람다 가변 영역으로 발현되는 중쇄를 선택하는 방법이 제공된다.
마우스 경쇄 불변 도메인에 융합된 인간 Vλ 및 인간 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 지니는 항체를 비롯한, 체세포 돌연변이된 가변 영역을 포함하는, 키메라 및 인간 항원-결합 단백질(예컨대, 항체), 그리고 이들을 암호화하는 핵산이 제공된다.
일 양상에 있어서, 마우스 불변 영역을 포함하는 경쇄 상에 인간 λ 가변 영역 서열을 발현하는 마우스가 제공된다. 일 양상에 있어서, κ 불변 영역을 포함하는 경쇄 상에 인간 λ 가변 영역 서열을 발현시키는 마우스가 제공된다. 일 양상에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리로부터 인간 λ 가변 영역 서열을 포함하는 경쇄를 발현하는 마우스가 제공된다. 일 양상에 있어서, 마우스 불변 영역 서열에 연결된 인간 λ 가변 서열을 포함하는 재배열된 경쇄 유전자를 포함하는 마우스가 제공되고; 일 실시형태에 있어서, 마우스 불변 영역 서열은 λ 불변 서열이고; 일 실시형태에 있어서, 마우스 불변 영역 서열은 κ 불변 서열이다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 가변 유전자 분절(hVλ) 및 인간 λ 접합 유전자 분절(hJλ)을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ는 마우스 경쇄 자리에 있다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 hVλ 및 재배열되지 않은 hJλ는 전이유전자 상에 있고 또한 인간 혹은 마우스 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 hVλ 및 재배열되지 않은 hJλ는 에피솜 상에 있다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는, 마우스 경쇄 불변 영역(CL) 핵산 서열과 재배열되지 않은 hVλ 서열 및 hJλ 서열로부터 유래된 경쇄를 포함하는 면역글로불린을 제작할 수 있다. 유전자 변형된 마우스를 제작하고 이용하는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 항체가 제공되되, 해당 항체는 (a) 마우스 중쇄 불변 영역에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인(hVH) 및 (b) 마우스 CL 도메인에 융합된 인간 VL을 포함하고; 이때 가변 도메인의 하나 이상이, 본 발명의 마우스에서, 예컨대, 항체 혹은 면역 세포 선택 동안, 가변 도메인의 하나 이상이 체세포 돌연변이되는 것을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 hVλ 및 재배열되지 않은 hJλ는 인간 또는 마우스 κ 불변 영역 (Cκ)과 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 hVλ와 재배열되지 않은 hJλ는 인간 또는 마우스 λ 불변 영역 (Cλ)과 작동가능하게 연결된다.
일 양상에 있어서, 생식선에 내인성 마우스 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 마우스가 제공되되, 여기서 인간 람다 가변 영역 서열은 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열을 포함하는 경쇄에 발현된다.
일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 λ 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 κ 자리이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 경쇄 자리에서 내인성 경쇄 가변 서열을 결여한다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부는 1개 이상의 인간 λ 가변 영역 유전자 분절로 교체되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 인간 Jλ 서열을 포함한 다. 일 실시형태에 있어서, 인간 Jλ 서열은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 인간 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편은 Vλ3-27에서부터 hVλ3-1을 통해 연장된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 인간 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52에서부터 hVλ1-40를 통해 연장된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 게놈 클러스터 A의 단편 및 게놈 클러스터 B의 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 적어도 하나의 유전자 분절 및 클러스터 B의 적어도 하나의 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 경쇄 나이브 레포토리의 10% 이상이 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 및 9-49로부터 선택된 적어도 2개의 hVλ 유전자 분절로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 경쇄 나이브 레퍼토리의 20% 이상이 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 및 9-49로부터 선택된 적어도 3개의 hVλ 유전자 분절로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스의 경쇄 나이브 레퍼토리의 30% 이상이 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 및 9-49로부터 선택된 적어도 4개의 hVλ 유전자 분절로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 마우스 불변 영역과 융합된 인간 λ 가변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 약 1:1의 κ 사용 대 λ 사용비를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 면역글로불린 경쇄는 내인성 마우스 경쇄 자리로부터 발현된다.
일 양상에 있어서, 마우스 κ 경쇄 불변 영역 서열과 연속적인, λ 경쇄 가변 영역 서열(Vλ) 및 적어도 1개의 J 서열(J)을 포함하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 기능성 마우스 Vκ 및/또는 마우스 Jκ 유전자 분절을 결여한다.
일 실시형태에 있어서, Vλ는 인간 Vλ(hVλ)이고, J는 인간 Jλ (hJλ)이다. 일 실시형태에 있어서, hVλ 및 hJλ는 재배열되지 않은 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 복수의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 hJλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 복수의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절은 적어도 12개의 유전자 분절, 적어도 28개의 유전자 분절 또는 적어도 40개의 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 1개의 hJλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 전체적으로 혹은 부분적으로 삭제된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 마우스 경쇄 자리에 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 B 세포의 약 10% 내지 약 45%는 인간 λ 경쇄 가변(Vλ) 도메인 및 마우스 κ 경쇄 불변(Cκ) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 인간 λ 가변 도메인은 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 및 1-51/1로 이루어진 군으로부터 선택된 재배열된 hVλ/hJλ 서열로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 κ 경쇄 자리로부터 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역을 더 포함하되, 여기서 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 Vλ 서열 및 J 서열과 연속적이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 Vλ 서열과 J 서열 사이에 배치된다.
일 양상에 있어서, (a) 내인성 마우스 경쇄 자리에서 적어도 12 내지 적어도 40개의 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절; (b) 적어도 12 내지 적어도 40개의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절과 적어도 1개의 인간 Jλ 서열 사이에 위치된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 서열을 포함하는 마우스가 제공되되; 여기서 마우스는 인간 Vλ 도메인 및 마우스 Cκ 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
일 양상에 있어서, λ 가변 서열 및 κ 불변 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 약 1:1의 κ 사용 대 λ 사용비를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 골수로부터 얻어진 미성숙 B 세포의 집단은 약 1:1의 κ 사용 대 λ 사용비를 나타낸다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 마우스 CL 유전자를 포함하는 마우스 경쇄 자리에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, Vλ 및/또는 Jλ 유전자 분절은 인간 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, Vλ 및/또는 Jλ 유전자 분절은 마우스 유전자 분절이며, CL은 마우스 Cκ이다.
일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 κ 경쇄 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 λ 경쇄 자리이다.
일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 내인성 마우스 경쇄 자리에 있다.
일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 전이유전자 상에 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개 이상의 중쇄 V, D, 및/또는 J 유전자 분절의 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 자리에서의 1개 이상의 인간 V, D, 및/또는 J 유전자 분절로의 교체를 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 유전자 분절(Vλ) 및 λ 접합 유전자 분절(Jλ)을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 유전자 자리("VL 자리")는 적어도 1개의 인간 Vλ(hVλ) 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 1개의 인간 Jλ(hJλ) 유전자 분절을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, VL 자리는 4개까지의 hJλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 인간 λ 및 인간 κ 게놈 서열을 포함하는 연속 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, κ 경쇄 가변 유전자 자리("κ 자리")는 적어도 1개의 인간 Vλ(hVλ) 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, κ 자리는 적어도 1개의 인간 Jλ(hJλ) 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, κ 자리는 4개까지의 hJλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, κ 자리는 적어도 1개의 hVλ 및 적어도 1개의 hJλ를 포함하고, 기능성 Vκ 영역 유전자 분절을 결여하거나 실질적으로 결여하며, 기능성 Jκ 영역 유전자 분절을 결여하거나 실질적으로 결여한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 기능성 Vκ 영역 유전자 분절을 포함하지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 기능성 Jκ 영역 유전자 분절을 포함하지 않는다.
일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 가변 유전자 자리("λ 자리")는 적어도 1개의 hVλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, λ 자리는 적어도 1개의 인간 Jλ (hJλ) 유전자 분절을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, λ 자리는 4개까지의 hJλ 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, VL 자리는 복수의 hVλ를 을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 복수의 hVλ는 인간에서 관측된 Vλ 사용의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 이상을 반영하는 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 발현을 초래하도록 선택된다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 유전자 분절 hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, 및 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, hVλ는 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 Vλ3-12에서 Vλ3-1에 걸친 인간 λ 경쇄 자리의 연속 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 hVλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, hVλ는 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 Vλ3-12에서 Vλ3-1에 걸친 인간 λ 자리의 연속 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있고 내인성 λ 경쇄 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있고, 내인성 κ 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다.
일 실시형태에 있어서, VL 자리는 13 내지 28 이상 hVλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, hVλ는 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 및 3-27을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, κ 자리는 Vλ3-27에서 Vλ3-1에 걸친 인간 λ 자리의 연속 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있고, 내인성 λ 경쇄 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있고, 내인성 κ 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다.
일 실시형태에 있어서, VL 자리는 29 내지 40개의 hVλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, κ 자리는 Vλ3-29에서 Vλ3-1에 걸친 인간 λ 자리의 연속 서열 및 Vλ5-52에서 Vλ1-40에 걸친 인간 λ 자리의 연속 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스 내 hVλ1-40과 hVλ3-29 사이에 있는 서열의 전부 혹은 실질적으로 전부는 hVλ1-40 유전자 분절의 다운스트림(3' 비번역 부분의 다운스트림)에 자연에서(예컨대, 인간 모집단에서) 발견되는 대략 959 bp의 인간 λ 서열, 제한 효소 부위(예컨대, PI-SceI), 이어서 자연에서 발견되는 hVλ3-29 유전자 분절의 업스트림에 대략 3,431 bp의 인간 λ 서열로 본질적으로 구성된다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 마우스 κ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 마우스 κ 자리에 있고, 내인성 마우스 λ 경쇄 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 마우스 λ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 마우스 λ 자리에 있고, 내인성 마우스 κ 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다.
일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 1개의 hJλ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 복수의 hJλ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 hJλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 4개의 hJλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 4개의 hJλ는 hJλ1, hJλ2, hJλ3 및 hJλ7이다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 κ 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있고, 내인성 λ 경쇄 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 1개의 hJλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 1개의 hJλ는 hJλ1이다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 κ 자리에 있고, 내인성 λ 경쇄 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 자리는 내인성 λ 자리에 있고, 내인성 κ 자리는 부분적으로 혹은 완전히 결실되어 있다.
일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 1개의 hVλ, 적어도 1개의 hJλ, 및 마우스 Cκ 유전자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, VL 자리는 적어도 1개의 hVλ, 적어도 1개의 hJλ, 및 마우스 Cλ 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 κ 자리에서 내인성 마우스 Vκ 유전자 분절의 하나 이상의 hVλ 유전자 분절로의 교체를 포함하되, 여기서 hVλ 유전자 분절은 내인성 마우스 Cκ 영역 유전자에 작동가능하게 연결되므로, 마우스는 인간 Vλ 유전자 분절을 재배열하고, 인간 Vλ 도메인 및 마우스 Cκ를 포함하는 역 키메라 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 마우스 Vκ 유전자 분절의 90 내지 100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 교체된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 Vκ 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부는 적어도 하나의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 교체되어 있다. 일 실시형태에 있어서, 교체는 적어도 12개, 적어도 28개 또는 적어도 40개의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 행해진다.. 일 실시형태에 있어서, 교체는 적어도 7개의 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절, 적어도 16개의 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절, 또는 적어도 27개의 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 행해진다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 모든 마우스 Jκ 유전자 분절의 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절로의 교체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 hVλ 유전자 분절은 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVλ 유전자 분절, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 λ 자리에서의 내인성 마우스 Vλ 유전자 분절의 내인성 마우스 λ 자리에서의 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절로의 교체를 포함하되, hVλ 유전자 분절은 마우스 Cλ 영역 유전자에 작동가능하게 연결되므로, 마우스는 hVλ 유전자 분절을 재배열하고, 또한 hVλ 도메인 및 마우스 Cλ를 포함하는 역 키메라 역글로불린 경쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 마우스 Vλ 유전자 분절의 90 내지 100%가 적어도 하나의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 교체된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 Vλ 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부는 적어도 1개의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 교체되어 있다. 일 실시형태에 있어서, 교체는 적어도 12개, 적어도 28개, 또는 적어도 40개의 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 행해진다. 일 실시형태에 있어서, 교체는 적어도 7 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절. 적어도 16 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절 또는 적어도 27 기능성 재배열되지 않은 hVλ 유전자 분절로 행해진다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 모든 마우스 Jλ 유전자 분절의 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절로의 교체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, 및 이들의 조합로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 hVλ 유전자 분절은 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVλ 유전자 분절, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 hJλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로붜 선택된다.
일 양상에 있어서, 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 위치된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열은 hVλ 및 hJλ 유전자 분절을 포함하는 마우스의 내인성 κ 경쇄 자리에 있고, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열은 hVλ 유전자 분절과 hJλ 유전자 분절 사이에 배치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, hVλ 및 hJλ 유전자 분절은 마우스 내의 기능성 인간 λ 경쇄 가변 도메인에 재조합될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 복수의 hVλ 및 하나 이상의 hJλ를 포함하는 마우스가 제공되고, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열은, 전사에 관하여, 근위 혹은 3' 대부분의 hVλ 서열의 다운스트림에 그리고 첫 번째hJλ 서열의 업스트림 혹은 5'에 배치된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 인간 Vκ4-1 유전자 분절의 다운스트림 또는 3'에 약 130 bp, 인간 Vκ4-1 유전자 분절의 3'비번역 영역의 다운스트림에 약 130 bp 배치된 영역이고, 인간 Jκ1 유전자 분절의 업스트림 혹은 5'에 약 600 bp에 걸쳐 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 크기가 약 22.8 kb이다. 일 실시형태에 있어서, Vκ-Jκ 유전자간 영역은 인간 Vκ4-1 유전자 분절의 3'비번역 영역의 말단에서부터 인간 Jκ1 유전자 분절의 업스트림의 약 600 bp까지 연장되는 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역과 약 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상 또는 약 95% 이상 동일하다. 일 실시형태에 있어서, Vκ-Jκ 유전자간 영역은 서열번호 158을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, Vκ-Jκ 유전자간 영역은 서열번호 158의 기능성 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, Vκ-Jκ 유전자간 영역은 서열번호 158이다.
일 양상에 있어서, 언급된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열을 포함하는 비-인간 동물, 비-인간 세포(예컨대, ES 세포 또는 다능성 세포), 비-인간 배아 또는 비-인간 조직이 제공되되, 여기서 유전자간 영역 서열은 이소성이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 이소성 서열은 인간화 내인성 비-인간 면역글로불린 자리에 배치된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 염소, 소, 양 및 비-인간 영장류로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 언급된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열을 포함하는 단리된 핵산 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 작제물은 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역 서열을 마우스 경쇄 자리에 대해서 표적화하는 표적화 부문(targeting arm)을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 경쇄 자리는 κ 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 표적화 부문은 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역을 변형된 내인성 마우스 κ 자리에 대해서 표적화하되, 여기서 표적화는 Vλ 서열과 hJλ 서열 사이의 위치에 대한 것이다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스는 2개 이하의 경쇄 대립 유전자를 포함하고, 경쇄 대립 유전자는, (a) 마우스 CL 유전자를 포함하는 내인성 마우스 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절; 및 (b) 마우스 CL 유전자를 포함하는 내인성 마우스 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 κ 자리이다. 다른 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 경쇄 자리는 λ 자리이다.
일 실시형태에 있어서, 2개 이하의 경쇄 대립 유전자는 κ 대립 유전자와 λ 대립 유전자, 2개의 κ 대립 유전자, 및 2개의 λ 대립 유전자로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 2개의 경쇄 대립 유전자 중 하나는 Cλ2 유전자를 포함하는 λ 대립 유전자이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개의 기능성 면역글로불린 경쇄 자리와 1개의 비기능성 경쇄 자리를 포함하되, 여기서 기능성 경쇄 자리는 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 1개의 기능성 면역글로불린 경쇄 자리와 1개의 비기능성 경쇄 자리를 포함하되, 여기서 기능성 경쇄 자리는 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 동일한 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 적어도 1개의 면역글로불린 중쇄 대립 유전자를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 1개의 면역글로불린 중쇄 대립 유전자는 인간/마우스 중쇄를 발현하는 인간 중쇄 유전자를 포함하는 인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절, 및 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 2개의 면역글로불린 중쇄 대립 유전자를 포함하고, 마우스는 인간/마우스 중쇄를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 자리에 재배열되지 않은 hVκ 및 재배열되지 않은 hJκ를 포함하는 제1 경쇄 대립 유전자; 및 내인성 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 자리에 재배열되지 않은 hVλ 및 재배열되지 않은 hJλ를 포함하는 제2 경쇄 대립 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 경쇄 대립 유전자는 유전자 변형된 마우스의 유일한 기능성 경쇄 대립 유전자이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 비기능성 λ 자리를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 λ 불변 영역을 포함하는 경쇄를 발현하지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 자리에 재배열되지 않은 hVκ및 재배열되지 않은 hJκ를 포함하는 제1 경쇄 대립 유전자; 및 내인성 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 자리에 재배열되지 않은 hVλ 및 재배열되지 않은 hJλ를 포함하는 제2 경쇄 대립 유전자를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 경쇄 대립 유전자는 유전자 변형된 마우스의 유일한 기능성 경쇄 대립 유전자이다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 6개의 면역글로불린 대립 유전자를 포함하되, 여기서 첫 번째 대립 유전자는 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 두 번째 대립 유전자는 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하며, 세 번째 대립 유전자는 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 네 번째와 다섯 번째 대립 유전자는 각각 독립적으로 마우스 중쇄 유전자를 포함하는 내인성 마우스 중쇄 자리에 재배열되지 않은 VH 및 DH 및 JH 유전자 분절을 포함하며, 여섯 번째 대립 유전자는 (a) 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절, (b) 비기능성인 λ 자리, 또는 (c) λ 자리의 전체적 혹은 부분적인 결실을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 첫 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 두 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVκ 및 hJκ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 네 번째와 다섯 번째 대립 유전자는 각각 독립적으로 재배열되지 않은 hVH 및 hDH 및 hJH를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 여섯 번째 대립 유전자는 전체적으로 혹은 부분적으로 결실된 내인성 마우스 λ 자리를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 6개의 면역글로불린 대립 유전자를 포함하되, 여기서 첫 번째 대립 유전자는 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 두 번째 대립 유전자는 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글루불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하며, 세 번째 대립 유전자는 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하고, 네 번째와 다섯 번째 대립 유전자는 각각 독립적으로 마우스 중쇄 유전자를 포함하는 내인성 마우스 중쇄 자리에 재배열되지 않은 VH 및 DH 및 JH 유전자 분절을 포함하며, 여섯 번째 대립 유전자는 (a) 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 재배열되지 않은 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분, (b) 비기능적인 κ 자리, 또는 (c) κ 자리의 하나 이상의 요소의 결실을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 첫 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 두 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세 번째 대립 유전자는 재배열되지 않은 hVκ 및 hJκ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 네 번째와 다섯 번째 대립 유전자는 각각 독립적으로 재배열되지 않은 hVH 및 hDH 및 hJH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 여섯 번째 대립 유전자는 기능적으로 침묵하는 내인성 마우스 κ 자리를 포함한다
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 마우스 CL 도메인에 작동가능하게 연결된 재배열된 hVλ 도메인을 포함하는 재배열된 항체 유전자를 포함하는 B 세포를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 CL 도메인은 마우스 Cκ 및 마우스 Cλ 도메인으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 도메인은 Cλ2 유전자로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 도메인은 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 도메인으로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, Cκ인 CL 상에 Vλ 영역을 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 일 양상에 있어서, 인간 Cκ, 인간 Cλ 또는 마우스 Cκ로부터 선택된 CL 상에 hVλ 영역을 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 일 양상에 있어서, 마우스 Cκ 상에 hVλ 영역을 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 비장세포의 약 10 내지 50%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 그 중 약 9 내지 28%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장세포의 약 23 내지 34%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 9 내지 11%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장 세포의 약 19 내지 31%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 9 내지 17%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장 세포의 약 21 내지 38%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 24 내지 27%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장 세포의 약 10 내지 14%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 9 내지 13%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장 세포의 약 31 내지 48%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 15 내지 21%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스의 비장 세포의 약 30 내지 38%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 약 33 내지 48%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 골수의 약 52 내지 70%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 미성숙 B 세포(즉, CD19-양성/B220-중간체 양성/IgM-양성)의 약 31 내지 47%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스의 골수의 약 60%는 B 세포(즉, CD19-양성)이거나, 또는 그 중 미성숙 B 세포(즉, CD19-양성/B220-중간체 양성/IgM-양성)의 약 38.3%는 마우스 Cκ 도메인에 융합된 hVλ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 V 및 인간 J 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 마우스 불변 영역 유전자로부터 유래된 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 불변 영역 유전자는 Cκ 유전자이다. 다른 실시형태에 있어서, 마우스 불변 영역 유전자는 Cλ 유전자이다. 구체적인 실시형태에 있어서, Cλ 영역은 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 항체는 인간 V, 인간 D 및 인간 J 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 도메인의 힌지-CH2-CH3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 도메인의 CH1-힌지-CH2-CH3 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 도메인의 CH1-CH2-CH3-CH4 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 도메인의 CH2-CH3-CH4 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 재배열된 인간 Vλ-Jλ 서열 및 마우스 Cκ 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다. 일 실시형태에 있어서, 재배열된 인간 Vλ-Jλ 서열은 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-14, 3-19, 2-23, 3-25, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 9-49 및 1-51 유전자 분절로부터 선택된 hVλ 유전자 분절의 재배열로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 재배열된 인간 Vλ-Jλ 서열은 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7 유전자 분절로부터 선택된 hJλ 유전자 분절의 재배열로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 및 1-51/1로부터 선택된 인간 Vλ/Jλ 서열을 포함하는 재배열된 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다. 구체적인 실시형태에 있어서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 마우스 κ 경쇄 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다.
일 양상에 있어서, (a) 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄(여기서 중쇄 가변 도메인은 마우스 중쇄 불변(CH) 영역에 융합됨); 및 (b) 재배열되지 않은 hVλ 및 hJλ로부터 유래된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄(여기서 경쇄 가변 도메인은 마우스 CL 영역에 융합됨)를 포함하는 항체를 발현하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 (i) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 V, D 및 J 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능성 인간 V, D 및 J 유전자 분절로의 교체, 및 마우스 CH 유전자를 포함하는 중쇄 자리, (ii) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 전부, 실질적으로 전부 또는 복수의, 기능성 hVλ 및 hJλ 유전자 분절로의 교체, 및 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 제1 κ 경쇄 자리, (iii) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 전부, 실질적으로 전부 또는 복수의, 기능성 hVκ 및 hJκ 유전자 분절로의 교체, 및 마우스 Cκ 유전자를 포함하는 제2 κ 경쇄 자리를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 Cλ 영역을 포함하는 항체를 발현하지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 Cλ 유전자 및/또는 Vλ 및/또는 Jλ 유전자 분절의 결실을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 비기능성 λ 경쇄 자리를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, λ 경쇄 자리는 전체적으로 혹은 부분적으로 결실되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 (i) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 V, D 및 J 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능성 인간 V, D 및 J 유전자 분절로의 교체, 마우스 CH 유전자를 포함하는 중쇄 자리, (ii) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 전부, 실질적으로 전부 또는 복수의, 기능성 hVλ 및 hJλ 유전자 분절로의 교체, 및 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 제1 λ 경쇄 자리, (iii) 전부 혹은 실질적으로 전부의 기능적 내인성 마우스 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 전부, 실질적으로 전부 또는 복수의, 기능성 hVλ 및 hJλ 유전자 분절로의 교체, 및 마우스 Cλ 유전자를 포함하는 제2 λ 경쇄 자리를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 Cκ 유전자 및/또는 Vκ 및/또는 Jκ 유전자 분절의 결실을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 비기능성 κ 경쇄 자리를 포함한다.
일 양상에 있어서, 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 마우스에 의해 생산된 총 IgG 항체의 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상이 λ-유래 가변 도메인을 포함하고, 마우스는 마우스 Cκ 영역에 융합된 κ-유래 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스에 의해 생산된 총 IgG 항체의 약 15 내지 40%, 20 내지 40%, 25 내지 40%, 30 내지 40% 또는 35 내지 40%가 λ-유래 가변 도메인을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, λ-유래 가변 도메인은 hVλ 및 hJλ로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, λ-유래 가변 도메인은 마우스 Cκ 영역을 포함하는 경쇄 내에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, λ-유래 가변 영역은 마우스 Cλ 영역을 포함하는 경쇄 내에 있다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, Cλ 영역은 Cλ2 영역이다. 일 실시형태에 있어서, κ-유래 가변 도메인은 hVκ 및 hJκ로부터 유래되고, 구체적인 실시형태에 있어서는 마우스 Cκ 영역을 포함하는 경쇄 내에 있다.
일 양상에 있어서, 업스트림 상동성 부문 및 다운스트림 상동성 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공되되, 여기서 업스트림 및 다운스트림 상동성 부문은 작제물을 마우스 κ 자리에 대해서 표적화시키고, 작제물은 기능성 재배열되지 않은 hVλ 분절과 기능성 재배열되지 않은 hJλ 분절, 그리고 선택 혹은 마커 서열을 포함한다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, 마우스 Vλ2의 업스트림에 마우스 λ 서열을 표적화하기 위한 표적화 부문, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면에 선택 카세트 및 마우스 Jλ2의 3'에서의 마우스 λ 서열을 표적화하기 위한 표적화 부분을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 Frt부착(Frt'ed) Hyg-TK 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 마우스 Cλ2, Jλ4, Cλ4, 및 마우스 인핸서 2.4를 포함한다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, Vλ1에 관하여 5'에서의 마우스 λ 자리를 표적화하는 표적화 부분, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면의 선택 카세트, 그리고 마우스 Cλ1에 관하여 3'에서의 마우스 λ 서열을 표적화하는 3' 표적화 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 록스트(loxed) 네오마이신 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 마우스 λ 3' 인핸서 및 마우스 λ 3' 인핸서 3.1을 포함한다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, Vλ2에 관하여 5'에서의 마우스 λ 자리를 표적화하기 위한 표적화 부문, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면의 선택 카세트, 그리고 마우스 Jλ2에 관하여 3' 및 마우스 Cλ2에 관하여 5'에서의 마우스 λ 서열을 표적화하기 위한 3' 표적화 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물에 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 Frt부착 하이드로마이신-TK 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 마우스 Cλ2-Jλ4-Cλ4 유전자 분절 및 마우스 λ 인핸서 2.4를 포함한다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, Vλ2에 관하여 5'에서의 마우스 λ 자리를 표적화하는 표적화 부분, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면의 선택 카세트, hVλ3-12로부터 hJλ1의 말단으로의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 인간 게놈 단편, 그리고 마우스 Jλ2에 관하여 3'에서의 마우스 λ 서열을 표적화하는 3' 표적화 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 Frt부착 네오마이신 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 마우스 Cλ2-Jλ4-Cλ4 유전자 분절 및 마우스 λ 인핸서 2.4를 포함한다.
일 양상에 있어서, hVλ3-12로부터 hJλ1로의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, Vλ2에 관하여 5'에서의 마우스 λ 자리를 표적화하는 표적화 부분, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면의 선택 카세트 그리고 hVλ3-27로부터 hVλ2-8의 말단까지의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 인간 게놈 단편을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 Frt부착 하이그로마이신 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 게놈 단편은 3' 표적화 부문을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 hVλ3-12로부터 hVλ2-8의 말단까지의 다운스트림에 약 53 kb의 인간 λ 경쇄 자리를 포함한다.
일 양상에 있어서, hVλ3-27로부터 hVλ3-12의 말단까지의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, Vλ2에 관하여 5'에서의 마우스 λ 자리를 표적화하는 표적화 부분, 재조합효소 인식 부위의 5' 및 3' 측면의 선택 카세트, hVλ5-52로부터 hVλ1-40의 말단까지의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 제1 인간 게놈 단편, 제한 효소 부위, 그리고 hVλ3-29로부터 hVλ82K의 말단까지의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 제2 인간 게놈 단편을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 Frt부착 네오마이신 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 제한 효소 부위는 귀소 엔도뉴클레아제용의 부위이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 귀소 엔도뉴클레아제는 PI-SceI이다. 일 실시형태에 있어서, 제2 인간 게놈 단편은 3' 표적화 부문이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 3' 표적화 부문은 hVλ3-29로부터 hVλ82K의 말단까지의 다운스트림에 약 27 kb의 인간 λ 경쇄 자리를 포함한다.
일 양상에 있어서, hVλ5-52로부터 hVλ1-40의 말단까지의 다운스트림에 인간 λ 경쇄 자리의 연속 영역을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, 내인성 Vκ 유전자 분절에 관하여 5'에서의 마우스 κ 자리를 표적화하는 표적화 부분, 2개의 병치된 재조합효소 인식 부위, 3'에서 병치된 재조합효소 인식 부위로의 선택 카세트, 그리고 κ 경쇄 가변 유전자 분절에 관하여 5'에 마우스 κ 서열을 표적화하는 3' 표적화 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 병치된 재조합효소 인식 부위는 서로에 관하여 반대쪽 배향에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 재조합효소 인식 부위는 상이하다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 재조합효소 인식 부위는 loxP 부위 및 lox511 부위이다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 네오마이신 카세트이다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, 마우스 Jκ 유전자 분절에 관하여 5'에서 마우스 κ 자리를 표적화하는 표적화 부문, 선택 카세트, 3'에서 선택 카세트로의 재조합효소 인식 부위, 및 마우스 Jκ 유전자 분절에 관하여 3'에 그리고 5'에서 마우스 κ 인트론성 인핸서로의 마우스 κ 서열을 표적화하는 3' 표적화 부문을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 선택 카세트는 하이그로마이신-TK 카세트이다. 일 실시형태에 있어서, 재조합효소 인식 부위는 선택 카세트와 전사에 관하여 동일한 방향에 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 재조합효소 인식 부위는 loxP 부위이다.
일 양상에 있어서, 5'에서 3'로의 전사 방향에 관하여, 내인성 마우스 Vκ 유전자 분절의 5'에 서열을 포함하는 제1 마우스 게놈 단편, 제1 재조합효소 인식 부위, 제2 재조합효소 인식 부위, 및 내인성 마우스 Jκ 유전자 분절의 3'에 그리고 마우스 κ 인트론성 인핸서의 5'에 서열을 포함하는 제2 마우스 게놈 단편을 포함하는 단리된 DNA 작제물이 제공된다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 마우스가 제공되되, 여기서 유전자 변형은 위에서 혹은 본 명세서에 기재된 DNA 작제물 중 하나 이상을 지니는 변형을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 제작하기 위한 단리된 DNA 작제물의 용도가 제공된다. 일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에서의 단리된 DNA 작제물의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 위에서 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA 작제물을 포함하는 표적화 벡터를 포함하는 비-인간 줄기 세포가 제공된다. 일 양상에 있어서, 비-인간 줄기 세포가 제공되되, 여기서 비-인간 줄기 세포는 본 명세서에 기재된 마우스로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 줄기 세포는 배아줄기(ES) 세포이다. 구체적인 실시형태에 있어서, ES 세포는 마우스 ES 세포이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 줄기 세포의 용도가 제공된다. 일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 줄기 세포의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 마우스 배아가 제공되되, 마우스 배아는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 유전자 변형을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 공여자 ES 세포를 포함하는 숙주 마우스 배아가 제공되되, 여기서 공여자 ES 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 배아는 프레-상실배기 배아. 구체적인 실시형태에 있어서, 프레-상실배기 배아는 4-세포기 배아 혹은 8-세포기 배아이다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 배아는 배반포이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스를 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스 배아의 용도가 제공된다. 일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스 배아의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 비-인간 세포가 제공되되, 비-인간 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 B 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 하이브리도마이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 체세포 돌연변이된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화한다.
일 양상에 있어서, 비-인간 세포가 제공되되, 여기서 비-인간 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 B 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 하이브리도마이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 체세포 돌연변이된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 세포의 용도가 제공된다. 일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 세포의 용도가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 양, 염소, 소 및 비-인간 영장류로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, (a) hVλ 유전자 분절 및 hJλ 유전자 분절로부터 유래된 가변 영역; 및 (b) 마우스 CL 유전자를 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스 B 세포가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 CL 유전자는 Cκ 및 Cλ 유전자로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, Cλ 유전자는 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 B 세포는 (c) hVH, hDH로부터 유래된 가변 영역 및 (d) hJH 분절을 포함하는 동족 중쇄를 더 발현한다. 일 실시형태에 있어서, B 세포는 재배열된 λ 유전자를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, B 세포는 재배열된 κ 유전자를 포함하지 않는다.
일 양상에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물 내에 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 유전자 변형된 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 동물은 내인성 경쇄 자리에 적어도 1개의 hVλ 및 적어도 1개의 hJλ를 포함하는 게놈을 지니고, 내인성 경쇄 자리는 비-인간 CL 유전자를 포함함); (b) 유전자 변형된 동물에 항원에 대한 면역 반응을 전개시키는 단계; 및, (c) 동물로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 단리시키거나 동물로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포를 단리시키는 단계를 포함하며, 여기서 항체는 hVλ, hJλ 및 동물 CL 유전자로부터 유래된 경쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 CL 유전자는 마우스 Cκ 유전자이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 양, 염소, 소, 및 비-인간 영장류로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물 내에 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 유전자 변형된 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 동물은 내인성 κ 자리에 적어도 1개의 hVλ 그리고 κ 자리에 적어도 1개의 hJλ를 포함하는 게놈을 지니고, κ 자리는 비-인간 Cκ 유전자를 포함함); (b) 유전자 변형된 동물에게 항원에 대한 면역 반응을 전개시키는 단계; 및 (c) 동물로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 단리시키거나 또는 마우스로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포를 단리시키는 단계를 포함하며, 여기서 항체는 hVλ, hJλ 및 비-인간 Cκ 유전자로부터 유래된 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, κ 경쇄 불변 유전자는 인간 Cκ 유전자 및 마우스 Cκ 유전자로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물에서 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 유전자 변형된 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 동물은 λ 경쇄 자리에 적어도 1개의 hVλ 및 λ 경쇄 자리에 적어도 1개의 Jλ를 포함하는 게놈을 지니고, λ 경쇄 자리는 비-인간 Cλ유전자를 포함함); (b) 유전자 변형된 동물에게 항원에 대한 면역 반응을 전개시키는 단계; 및, (c) 동물로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 단리시키거나 또는 동물로부터 (b) 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포를 단리시키거나, 또는 동물에서 항원에 결합하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 B 핵산 서열을 동정하는 단계를 포함하며, 여기서 항체는 hVλ, hJλ 및 비-인간 Cλ 유전자로부터 유래된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 양, 염소, 소 및 비-인간 영장류로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 불변 유전자는 인간 Cλ 유전자 및 비-인간 Cλ 유전자로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 불변 유전자는 인간 Cλ 유전자이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Cλ 유전자는 Cλ1, Cλ2, Cλ3 및 Cλ7로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 불변 유전자는 마우스 또는 래트 Cλ 유전자이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 Cλ1, Cλ2 및 Cλ3으로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 Cλ2이다. 다른 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, (a) 유전자 변형된 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 유전자 변형은 내인성 경쇄 자리에서 hVλ 및 hJλ를 포함하고, 내인성 경쇄 자리는 비-인간 CL 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함함); 및 (b) 상기 비-인간 동물 내의 재배열된 면역글로불린 유전자를 동정하는 단계를 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물 내 재배열된 항체 유전자를 제작하는 방법이 제공되되, 재배열된 면역글로불린 유전자는 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 CL 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 동물로부터 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 더 포함하되, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 및 마우스 CL을 포함하는 항체로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 CL 유전자 혹은 그의 기능성 단편은 인간 CL 유전자 및 마우스 CL 유전자, 혹은 그의 기능성 단편으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물 내에 재배열된 항체 유전자를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a)유전자 변형된 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 유전자 변형은 κ 경쇄 자리에서 hVλ 및 hJλ를 포함하고, κ 경쇄 자리는 비-인간 Cκ 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함함); 및 (b) 상기 동물 내의 재배열된 면역글로불린 유전자를 동정하는 단계를 포함하며, 여기서 재배열된 면역글로불린 유전자는 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 Cκ 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, κ 경쇄 불변 유전자 혹은 그의 기능성 단편은 인간 Cκ 유전자 및 비-인간(예컨대, 마우스 또는 래트) Cκ 유전자, 혹은 그의 기능성 단편으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 동물로부터 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 더 포함하되, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 및 비-인간(예컨대, 마우스 또는 래트) Cκ를 포함하는 항체로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물에서 재배열된 항체 유전자를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은, (a) 유전자 변형된 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계(여기서 유전자 변형은 비-인간 λ 경쇄 자리에 hVλ 및 hJλ를 포함하고, λ 경쇄 자리는 비-인간 Cλ 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함함); 및 (b) 상기 동물 내의 재배열된 면역글로불린 유전자를 동정하는 단계를 포함하며, 여기서 재배열된 면역글로불린 유전자는 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 Cλ 유전자 혹은 그의 기능성 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 불변 유전자 혹은 그의 기능성 단편은 인간 Cλ 유전자 및 마우스 또는 래트 Cλ 유전자, 혹은 그의 기능성 단편으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, λ 경쇄 불변 유전자는 마우스 또는 래트 Cλ 유전자, 혹은 그의 기능성 단편이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 동물로부터 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계를 더 포함하되, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 및 비-인간(예컨대, 마우스 또는 래트) Cλ를 포함하는 항체로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하는 것을 포함하는 면역 반응을 동물에게 전개시키는 단계, 중쇄를 암호화하는 동물 내 재배열된 핵산 서열 및 항체의 동족 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 동물 내 재배열된 핵산 서열을 동정하는 단계(여기서 항체는 항원에 특이적으로 결합됨), 및 인간 불변 도메인에 융합된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 핵산 서열을 이용해서 목적으로 하는 항체를 제작하는 단계를 포함하며, 여기서 목적으로 하는 항체는 CL 도메인에 융합된 Vλ 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, Vλ 도메인은 인간이고, CL 도메인은 인간 또는 마우스 또는 래트 Cλ 도메인이다. 일 실시형태에 있어서, Vλ 도메인은 마우스 또는 래트이고, CL 도메인은 인간 또는 마우스 Cκ 도메인이다.
일 실시형태에 있어서, 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하는 것을 포함하는 면역 반응을 동물에게 전개시키는 단계, 중쇄를 암호화하는 동물 내 재배열된 핵산 서열 및 항체의 동족 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 동물 내 재배열된 핵산 서열을 동정하는 단계(여기서 항체는 항원에 특이적으로 결합됨), 및 인간 불변 도메인의 핵산 서열에 융합된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 핵산 서열을 이용해서 목적으로 하는 항체를 제작하는 단계를 포함하며, 여기서 목적으로 하는 항체는 Cκ 도메인에 융합된 Vλ 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항체를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하는 것을 포함하는 면역 반응을 동물에게 전개시키는 단계, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 동물 내 재배열된 핵산 서열 및 항체의 동족 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 재배열된 핵산 서열을 동정하는 단계(여기서 항체는 항원에 특이적으로 결합됨), 및 인간 불변 도메인 및 인간 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 융합된 핵산 서열을 이용해서 인간 서열로부터 유래된 항체를 제작하는 단계를 포함하며, 여기서 항원에 특이적으로 결합되는 항체는 비-인간(예컨대, 마우스 또는 래트) Cλ 영역에 융합된 인간 Vλ 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, Cλ 영역은 마우스이고, 일 실시형태에 있어서 Cλ1, Cλ2 및 Cλ3으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 영역은 Cλ2이다.
일 양상에 있어서, 재배열된 항체 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은, (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 동물에게 면역 반응을 전개시키는 단계; (c) 비-인간 CL 도메인에 융합된 재배열된 인간 Vλ 도메인 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 동물 내 세포를 동정하는 단계(여기서 세포는 또한 인간 VH 도메인 및 비-인간 CH 도메인을 포함하는 동족 중쇄를 암호화하고, 세포는 항원에 결합되는 항체를 발현함); (d) 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 핵산 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열로부터 클로닝하는 단계; 및, (e) 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열을 이용해서 완전한 인간 항체를 제작하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물 및 비-인간 도메인은 마우스 및 래트로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 재배열된 항체 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 본 개시내용에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 동물에게 면역 반응을 전개시키는 단계; (c) 비-인간 동물의 Cκ 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 지니는 동일한 핵산 분자 상에 연속적인 재배열된 인간 Vλ 도메인 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 동물에서 세포를 동정하는 단계(여기서 세포는 또한 비-인간 동물의 인간 VH 도메인 및 CH 도메인을 포함하는 동족 중쇄를 암호화하고, 그리고 세포는 항원에 결합된 항체를 발현함); (d) 세포 핵산으로부터 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계; 및 (e) 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열을 이용해서 완전한 인간 항체를 제작하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 재배열된 항체 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 동물에게 항원에 대한 면역 반응을 전개시키는 단계;; (c) 동물의 비-인간 Cλ 도메인에 융합된 재배열된 인간 Vλ 도메인 서열을 암호화하는 DNA를 포함하는 동물 내 세포를 동정하는 단계(여기서 세포는 또한 동물의 인간 VH 도메인 및 비-인간 CH 도메인을 포함하는 동족 중쇄를 암호화하고 그리고 세포는 항원에 결합하는 항체를 발현함); (d) 세포 핵산으로부터 재배열된 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 단계; 및 (e) 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열 및 동족 인간 VH 도메인을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열을 이용해서 완전한 인간 항체를 제작하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이고, Cλ 도메인은 마우스 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 도메인은 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 내인성 경쇄 불변 영역(CL)에 융합된 인간 λ-유래 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되되, 여기서 동물은, 항원에 의한 면역화 시, 동물의 비-인간 CL 도메인에 융합된 인간 Vλ 도메인을 포함하는 항체를 제작한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 CL 도메인은 Cκ 도메인 및 Cλ 도메인으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, CL 도메인은 Cκ 도메인이다. 일 실시형태에 있어서, 동물은 마우스이다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 CL 도메인은 Cλ 도메인이다. 구체적인 실시형태에 있어서, Cλ 도메인은 Cλ2이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 도메인은 마우스 Cλ2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 Cλ 유전자로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 복수의 면역글로불린 중쇄와 관련된 복수의 면역글로불린 λ 경쇄를 발현하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 내인성 κ 혹은 λ 경쇄 자리를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄는 인간 서열을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 인간 서열은 가변 서열, CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 복수의 면역글로불린 λ 경쇄는 인간 서열을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 인간 서열은 가변 서열, 불변 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 동물은 불능인 내인성 면역글로불린 자리를 포함하고 전이유전자 혹은 염색체 외 에피솜으로부터 중쇄 및/또는 λ 경쇄를 발현한다. 일 실시형태에 있어서, 동물은 내인성 (비-인간) 자리에서 부 혹은 전부의 내인성 비-인간 중쇄 유전자 분절(즉, V, D, J) 및/또는 일부 혹은 전부의 내인성 비-인간 중쇄 불변 서열(예컨대, CH1, 힌지, CH2, CH3, 또는 이들의 조합), 및/또는 일부 혹은 전부의 내인성 비-인간 경쇄 서열(예컨대, V, J, 불변, 또는 이들의 조합)의, 1개 이상의 인간 면역글로불린 서열로의 교체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이다.
일 양상에 있어서, 인간 λ-유래 경쇄를 지니는 항체를 제작하는데 적합한 비-인간 동물이 제공되되, 비-인간 동물에서 제작된 전부 혹은 실질적으로 전부의 항체는 인간 λ-유래 경쇄로 발현된다. 일 실시형태에 있어서, 인간 λ-유래 경쇄는 내인성 경쇄 자리로부터 발현된다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 경쇄 자리는 κ 경쇄 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 동물은 마우스이고 κ 경쇄 자리는 마우스 κ 경쇄 자리이다.
일 양상에 있어서, 인간 항체에 대한 λ-유래 경쇄를 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 얻는 단계, 및 인간 항체를 제조함에 있어서 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 이용하는 단계를 포함한다.
일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 비-인간 동물에게 면역 반응을 전개시키는 단계; 및 비-인간 동물로부터 항원에 결합된 항원-결합 단백질을 얻거나, 비-인간 동물로부터 항원에 결합하는 항원-결합 단백질을 제조함에 있어서 이용될 서열을 얻는 단계를 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예컨대, 마우스 또는 래트)로부터 유래된 세포가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 배아줄기 세포, 다능성 세포, 유도된 다능성 세포, B 세포 및 하이브리도마로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 세포가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 마우스 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 하이브리도마 및 쿼드로마로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 마우스 불변 서열에 융합된 인간 λ 가변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 불변 서열은 마우스 κ 불변 서열이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 조직이 제공된다.
일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 제작하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 또는 세포의 용도가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단백질은 인간 단백질이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 단백질은 인간 항체이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 세포, 조직 또는 방법에 의해 제작된 항원-결합 단백질이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단백질은 인간 단백질이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 단백질은 인간 항체이다.
본 명세서에 기재된 실시형태들 및 양상들의 어느 것이라도, 달리 언급되지 않거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 서로 연계하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태들은 이어지는 설명의 검토로부터 당업자에게 자명하게 될 것이다.
도 1a는 약 3 메가베이스(Mb)의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리(흑색 기호)의 약 1 메가베이스(Mb)의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리(백색 기호)로의 직접 게놈 교체의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다..
도 1b는 약 3 메가베이스(Mb)의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리(흑색 기호)의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 두 근사하게 동일한 반복부 중 약 0.5 메가베이스(Mb)의 첫 번째 혹은 근위부(백색 기호)로의 직접 게놈 교체의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 2a는 모든 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 결실 및 3개의 인간 VH, 모든 인간 DH 및 JH 유전자 분절로의 교체를 초래하는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 3개의 초기 단계(A 내지 C)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 λ 삽입체에 대한 표적화 벡터는 67 kb 5' 마우스 상동성 부문, 선택 카세트(백색 사각형), 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형), 145 kb 인간 게놈 단편 및 8 kb 3' 마우스 상동성 부문과 함께 표시되어 있다(3hVH BACvec). 후속의 표적화 벡터로부터 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절, 부가적인 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 2b는 77개의 부가적인 인간 VH 유전자 분절의 삽입 및 마지막 선택 카세트의 제거를 초래하는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 6개의 부가적인 단계(D 내지 I)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 부가적인 인간 VH 유전자 분절의 삽입체(18hVH BACvec) 내지 인간 중쇄 유전자 분절의 초기의 삽입체(3hVH-CRE 혼성 대립 유전자)에 대한 표적화 벡터는 20 kb 5' 마우스 상동성 부문, 선택 카세트(백색 사각형), 196 kb 인간 게놈 단편 및 인간 유전자 분절에 대해서 5'에 위치된 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)로 도시된 인간 중쇄 유전자 분절의 초기의 삽입체의 5' 말단과 중첩되는 62 kb 인간 상동성 부문으로 도시되어 있다. 후속의 표적화 벡터에 의해 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절 및 부가적인 선택 카세트(백색 사각형)가 도시되어 있다.
도 2c는 모든 마우스 Vκ, 및 Jκ 유전자 분절(Igκ-CRE 혼성 대립 유전자)의 결실을 초래하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 3개의 초기 단계(A 내지 C)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 표적화 벡터로부터 삽입된 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 2d는 근위 반복부에서의 모든 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 삽입과 마지막 선택 카세트(40hVκdHyg 혼성 대립 유전자)의 결실을 초래하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 4개의 부가적인 단계(D 내지 H)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 후속의 표적화 벡터에 의해 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절 및 부가적인 선택 카세트(백색 사각형)이 도시되어 있다.
도 3a는 표적화된 배아줄기(ES) 세포 내의 인간 중쇄 유전자 서열의 직접 삽입 및 마우스 중쇄 유전자 서열의 소실에 대한 정량적 PCR(qPCR) 프라이머/프로브의 위치를 포함하는 선별 전략(screening strategy)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 첫 번째 인간 중쇄 유전자 삽입에 대한 ES 세포 및 마우스의 선별 전략은 비변형 마우스 염색체(상부) 및 정확하게 표적화된 염색체(하부) 상의 결실된 영역("손실" 프로브 C 및 D), 삽입 영역("하이H" 프로브 G 및 H) 및 측면 영역("보유" 프로브 A, B, E 및 F)에 대한 qPCR 프라이머/프로브 세트로 도시되어 있다.
도 3b는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 부모 및 변형된 ES 세포에서의 관측된 프로브 복제수의 대표적인 계산을 나타낸다. 프로브 A 내지 F에 대한 관측된 프로브 복제수는 2/2ΔΔCt로서 산출되었다. ΔΔCt는 ave[ΔCt(샘플) - medΔCt(대조군)]로서 산출되되, 여기서 ΔCt는 테스트 프로브와 기준 프로브 간(검정에 따라 4개와 6개의 기준 프로브 간)의 차이이다. medΔCt(대조군)란 용어는 부모 ES 세포로부터의 다중의 (>60) 비표적화 DNA 샘플의 중앙 ΔCt이다. 각각의 변형된 ES 세포 클론은 6벌로 검정되었다. 부모 ES 세포 내 IgH 프로브 G 및 H의 복제수를 산출하기 위하여, 이들 프로브는 어떠한 증폭도 관측되지 않더라도 변형된 ES 세포에서 1의 복제수 및 35의 최대 Ct를 갖는 것으로 가정하였다.
도 3c는 프로브 D 및 H만을 이용해서 계산된 각 유전자형의 4마리의 마우스에 대한 복제수의 대표적인 계산을 나타낸다. 야생형 마우스:WT 마우스; 인간 면역글로불린 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 마우스 이형접합체:HET 마우스;인간 면역글로불린 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 마우스 동종접합체:호모 마우스.
도 4a는 박테리아 상동성 재조합(BHR)에 의한 3hVH BACvec의 작제에 이용된 3 단계의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 표적화 벡터로부터 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절, 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 4b는 NotI 소화 후의 3개의 BAC 클론(B1, B2 및 B3)의 펄스장 겔 전기영동(pulse-field gel electrophoresis: PFGE)을 나타낸다. 마커 M1, M2 및 M3은 각각 낮은 범위, 중간 범위 및 람다 래더 PEG 마커이다(매사추세츠주의 입시치시에 소재한 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)).
도 5a는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 양을 증가시키면서 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 순차적인 변형의, 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 동종접합성 마우스는 중쇄 인간화의 3개의 상이한 단계의 각각으로부터 제작되었다. 백색 기호는 인간 서열을 나타내고; 흑색 기호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 5b는 인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자 분절의 양을 증가시키면서 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 순차적인 변형의, 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 동종접합성 마우스는 κ 경쇄 인간화의 3개의 상이한 단계의 각각으로부터 제작되었다. 백색 기호는 인간 서열을 나타내고; 흑색 기호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 6은 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 인간화 마우스에서의 B 세포 집단의 FACS 도트 플롯을 나타낸다. 비장(첫줄, 위에서부터 세 번째줄 및 마지막 줄) 또는 야생형(wt), 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1(V1), 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2(V2) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 3(V3) 마우스의 서혜부 림프절(위에서부터 두 번째줄)로부터의 세포는 표면 IgM 발현 B 세포(첫줄, 및 위에서부터 두번째줄), κ 혹은 λ 경쇄를 함유하는 표면 면역글로불린(위에서부터 세번째줄) 또는 특정단상형의 표면 IgM(마지막줄), 및 FACS에 의해 분리된 모집단에 대해서 염색되었다.
도 7a는 VH-DH-JH(CDR3) 접합부 둘레의 무작위로 선택된 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 대표적인 중쇄 CDR3 서열을 나타내며, 이것은 접합 다양성 및 뉴클레오타이드 부가를 입증한다. 중쇄 CDR3 서열은 DH 유전자 분절 사용에 따라서 그룹화되며, 그의 생식선은 각 그룹 위쪽에 볼드체로 제공된다. 각 중쇄 CDR3 서열에 대한 VH 유전자 분절은 각 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 3-72은 인간 VH3-72이다). 각 중쇄 CDR3에 대한 JH 유전자 분절은 각 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 3은 인간 JH3이다). 도시된 각 서열에 대한 서열번호는 위에서부터 아래쪽으로 다음과 같다: 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39.
도 7b는 Vκ-Jκ(CDR3) 접합부 둘레의 무작위로 선택된 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 대표적인 경쇄 CDR3 서열을 나타내며, 이것은 접합 다양성 및 뉴클레오타이드 부가를 입증한다. 각 경쇄 CDR3 서열에 대한 Vκ 유전자 분절은 각 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 1-6은 인간 Vκ1-6이다). 각 경쇄 CDR3 서열에 대한 Jκ 유전자 분절은 각 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 1은 인간 Jκ1이다). 도시된 각 서열에 대한 서열번호는 위에서부터 아래쪽으로 다음과 같다: 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 서열번호 46; 서열번호 47; 서열번호 48; 서열번호 49; 서열번호 50; 서열번호 51; 서열번호 52; 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58.
도 8은 38(비면역화 IgM), 28(비면역화 IgG), 32(IgG로부터의 비면역화 Igκ), 36(면역화된 IgG) 또는 36(IgG로부터의 비면역화된 Igκ) 서열의 세트 중 각각의 뉴클레오타이드(NT; 좌측 열) 또는 아미노산(AA; 우측 열) 위치에서 변화된 서열의 퍼센트로서 점수매긴(교미 생식선 서열에 대한 정렬 후) 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 중쇄 및 경쇄의 체세포 과돌연변이 빈도(somatic hypermutation frequency)를 나타낸다. 음영으로 표시된 바는 CDR의 위치를 나타낸다.
도 9a는 야생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgM 및 IgG 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 9b는 생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgA 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 9c는 야생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgE 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 10a는 IL-6R의 엑토도메인에 의한 면역화의 2회(교배 1) 또는 3회(교배 2) 후의 7가지 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 5마리 야생형(WT) 마우스로부터의 혈청의 인터류킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 항원-특이적 IgG 역가를 나타낸다.
도 10b는 7가지 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 5마리의 야생형(WT) 마우스로부터의 IL-6R-특이적 IgG 아이소형-특이적 역가를 나타낸다.
도 11a는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 단클론성 항체의 친화도 분포를 나타낸다.
도 11b는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 야생형(WT) 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 단클론성 항체의 항원-특이적 차단을 나타낸다.
도 12는 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 인간화 내인성 중쇄 자리 내로의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b의 삽입에 이용되는 표적화 벡터(mADAM6 표적화 벡터)는 5' 및 3' 말단 상의 공학적으로 조작된 제한 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(Frt)를 양 측면에 지닌 선택 카세트(HYG: 하이그로마이신)로 도시되어 있다.
도 13은 인간 중쇄 가변 유전자 분절 1-2(VH1-2)와 6-1(VH6-1) 사이에 위치된 인간 ADAM6 위유전자(hADAM6Y)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 인간 ADAM6 위유전자를 삭제하고 특유의 제한 부위를 인간 중쇄 자리 내로 삽입하기 위한 박테리아 상동성 재조합(hADAM6Y 표적화 벡터)을 위한 표적화 벡터는 5' 및 3' 말단 상의 공학적으로 조작된 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(loxP)를 양 측면에 가진 선택 카세트(NEO: 네오마이신)로 도시되어 있다. 부위-특이적 재조합 부위를 양 측면에 가진 선택 카세트를 포함하는 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 게놈 단편을 함유하는 얻어지는 표적화된 인간화 중쇄 자리의 일정한 축척이 아닌 도해가 도시되어 있다.
도 14a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리(H+/+κ+/+)에 대한 마우스 동종접합체 및 마우스 ADAM6 유전자(H+/+A6resκ+/+)를 포함하는 삽입된 마우스 게놈 단편을 지닌 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체에 대한 골수 내의 IgM 및 B220의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 14b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 15a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수에서의 c-키트 및 CD43의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 프로-B(CD19+CD43+c키트+) 및 프레-B(CD19+CD43-c키트-) 세포의 백분율은 각 등고선 선도의 각각의 상부 우측 및 하부 좌측 사분면에 표기되어 있다.
도 15b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 ㄷ대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 프로-B 세포(CD19+CD43+c키트+) 및 프레-B 세포(CD19+CD43-c키트-)의 총 수를 나타낸다.
도 16a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수 내의 CD19 및 CD43의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙 B(CD19+CD43-), 프레-B (CD19+CD43int) 및 프로-B(CD19+CD43+)의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 16b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수 내의 미성숙 B(CD19+CD43-) 및 프레-B(CD19+CD43int) 세포의 막대그래프를 나타낸다.
도 17a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)에 대한 비장세포 내의 CD19 및 CD3의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. B(CD19+CD3-) 및 T(CD19-CD3+) 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 17b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 Igλ 및 Igκ 경쇄의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포에 대한 FACs 등고선 선도를 나타낸다. Igλ+(상부 좌측 사분면) 및 Igκ+(하부 우측 사분면) B 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 17c는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 CD19+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 18a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 IgD 및 IgM의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACs 등고선 선도를 나타낸다. 성숙 B 세포(CD19+IgDhighIgMint)의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다. 우측 등고선 선도 상의 화살표는 IgM 및 IgD 표면 발현과 관련한 B 세포의 성숙 과정을 예시한다.
도 18b는 CD19+IgM하이IgDint로부터 CD19+IgMintIgD하이로의 성숙화 동안 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 19는 Vλ 유전자 분절(A, B 및 C) 그리고 Jλ 및 Cλ 영역쌍(J-C 쌍)의 클로스터를 포함하는 인간 λ 경쇄 자리의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다.
도 20은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 비활성화시키는데 이용되는 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 21은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리를 비활성화시키는데 이용되는 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 22a는 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절(12/1-λ 표적화 벡터)을 포함하는 인간 λ 경쇄 서열로 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 표적화하기 위한 초기의 표적화 벡터의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 22b는 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절(12/1-κ 표적화 벡터), 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절(12/4-κ 표적화 벡터), 12 hVλ 유전자 분절, 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열 및 hJλ1 유전자 분절 (12(κ)1-κ 표적화 벡터) 및 12 hVλ 유전자 분절, 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절(12(κ)4-κ 표적화 벡터)을 포함하는 인간 λ 경쇄 서열로 내인성 마우스 κ 경쇄 자리를 표적화하는 4개의 초기 표적화 벡터의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 23a는 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 into 마우스 λ 경쇄 자리 내로 점진적으로 삽입하기 위한 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 23b는 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 마우스 κ 자리로 점진적으로 삽입하기 위한 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 24는 인간 κ 유전자간 서열, 다중hJλ 유전자 분절 또는 둘 모두를 함유하는 혼성 경쇄 자리의 작제를 위한 특유의 인간 λ-κ 혼성 표적화 벡터를 제작하는데 이용되는 표적화 및 분자 조작 단계의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 25a는 내인성 Cλ2 유전자에 작동가능하게 연결된 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 함유하는 변형된 마우스 λ 경쇄 자리용의 자리 구조의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 25b는 내인성 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 연속 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열의 존재 혹은 부재 하에 1 내지 4개의 Jλ 유전자 분절 및 40개의 hVλ 유전자 분절을 함유하는 4개의 독립적인 변형된 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 자리 구조의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 26a는 야생형 마우스(WT), 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 12개의 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(12hVλ-VκJκ-4hJλ) 그리고 40개의 hVλ 및 1개의 hJλ 유전자 분절에 대한 .마우스 동종접합체(40hVλ-1hJλ)로부터의 CD19+에 대해 게이팅된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다.
도 26b는 야생형(WT), 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 12개의 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(12hVλ-VκJκ-4hJλ) 및 40개의 hVλ 및 1개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체 (40hVλ-1hJλ)로부터의 수거된 비장에서의 CD19+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 27a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 B 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대한 단일선 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 Igλ+ 및 Igκ+ 발현에 대해서 CD19+ 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다.
도 27b는 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터 수거한 비장에서의 CD19+, CD19+Igκ+ 및 CD19+Igλ+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 27c는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해서 CD19+ 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다. 성숙(WT에 대해서 72개, 40hVλ-VκJκ-4hJλ에 대해서 51개) 및 과도적(WT에 대해서 13개, 40hVλ-VκJκ-4hJλ에 대해서 22개) B 세포는 등고선 선도의 각각 상에 표기된다.
도 27d는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터 수거된 비장 내의 CD19+ B 세포, 과도적 B 세포(CD19+IgMhiIgDlo) 및 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi)의 총 수를 나타낸다.
도 28a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 B 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해서 염색된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 CD19+ 상에 게이팅되고 c키트+ 및 CD43+ 에 대해서 염색된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 프로 및 프레 B 세포는 하부 패널의 등고선 선도에 대해 표기되어 있다.
도 28b는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 수거한 골수 내의 프로(CD19+CD43+c키트+) 및 프레(CD19+CD43-C키트-) B 세포의 수를 나타낸다.
도 28c는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해서 염색된 단일선 상에 게이팅된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프레 B 세포는 등고선 선도의 각각 상에 표기되어 있다.
도 28d는 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 28e는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 단리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙 (B220hiIgM+) B 세포에 대해 게이팅된 골수의 등고선 선도를 나타낸다.
도 29는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 8개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. A6 = 서열번호 115; B6 = 서열번호 116; F6 = 서열번호 117; B7 = 서열번호 118; E7 = 서열번호 119; F7 = 서열번호 120; C8 = 서열번호 121; E12 = 서열번호 122; 1-4 = 서열번호 123; 1-20 = 서열번호 124; 3B43 = 서열번호 125; 5-8 = 서열번호 126; 5-19 = 서열번호 127; 1010 = 서열번호 128; 11A1 = 서열번호 129; 7A8 = 서열번호 130; 3A3 = 서열번호 131; 2-7 = 서열번호 132. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. hJλ1 및 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격(Framework) 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산(consensus amino acid)은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
도 30은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 연속 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 12개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. 5-2 = 서열번호 145; 2-5 = 서열번호 146; 1-3 = 서열번호 147; 4B-1 = 서열번호 148; 3B-5 = 서열번호 149; 7A-1 = 서열번호 150; 5-1 = 서열번호 151; 4A-1 = 서열번호 152; 11A-1 = 서열번호 153; 5-7 = 서열번호 154; 5-4 = 서열번호 155; 2-3 = 서열번호 156. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. 각각의 인간 Jλ 및 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
도 31은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 3개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cλ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. 2D1 = 서열번호 159; 2D9 = 서열번호 160; 3E15 = 서열번호 161. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. hJλ1 및 마우스 Cλ2의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
도 1b는 약 3 메가베이스(Mb)의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리(흑색 기호)의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 두 근사하게 동일한 반복부 중 약 0.5 메가베이스(Mb)의 첫 번째 혹은 근위부(백색 기호)로의 직접 게놈 교체의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 2a는 모든 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 결실 및 3개의 인간 VH, 모든 인간 DH 및 JH 유전자 분절로의 교체를 초래하는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 3개의 초기 단계(A 내지 C)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 λ 삽입체에 대한 표적화 벡터는 67 kb 5' 마우스 상동성 부문, 선택 카세트(백색 사각형), 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형), 145 kb 인간 게놈 단편 및 8 kb 3' 마우스 상동성 부문과 함께 표시되어 있다(3hVH BACvec). 후속의 표적화 벡터로부터 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절, 부가적인 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 2b는 77개의 부가적인 인간 VH 유전자 분절의 삽입 및 마지막 선택 카세트의 제거를 초래하는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 6개의 부가적인 단계(D 내지 I)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 부가적인 인간 VH 유전자 분절의 삽입체(18hVH BACvec) 내지 인간 중쇄 유전자 분절의 초기의 삽입체(3hVH-CRE 혼성 대립 유전자)에 대한 표적화 벡터는 20 kb 5' 마우스 상동성 부문, 선택 카세트(백색 사각형), 196 kb 인간 게놈 단편 및 인간 유전자 분절에 대해서 5'에 위치된 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)로 도시된 인간 중쇄 유전자 분절의 초기의 삽입체의 5' 말단과 중첩되는 62 kb 인간 상동성 부문으로 도시되어 있다. 후속의 표적화 벡터에 의해 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절 및 부가적인 선택 카세트(백색 사각형)가 도시되어 있다.
도 2c는 모든 마우스 Vκ, 및 Jκ 유전자 분절(Igκ-CRE 혼성 대립 유전자)의 결실을 초래하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 3개의 초기 단계(A 내지 C)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 표적화 벡터로부터 삽입된 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 2d는 근위 반복부에서의 모든 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 삽입과 마지막 선택 카세트(40hVκdHyg 혼성 대립 유전자)의 결실을 초래하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 직접 게놈 교체에 대한 4개의 부가적인 단계(D 내지 H)의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 후속의 표적화 벡터에 의해 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절 및 부가적인 선택 카세트(백색 사각형)이 도시되어 있다.
도 3a는 표적화된 배아줄기(ES) 세포 내의 인간 중쇄 유전자 서열의 직접 삽입 및 마우스 중쇄 유전자 서열의 소실에 대한 정량적 PCR(qPCR) 프라이머/프로브의 위치를 포함하는 선별 전략(screening strategy)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 첫 번째 인간 중쇄 유전자 삽입에 대한 ES 세포 및 마우스의 선별 전략은 비변형 마우스 염색체(상부) 및 정확하게 표적화된 염색체(하부) 상의 결실된 영역("손실" 프로브 C 및 D), 삽입 영역("하이H" 프로브 G 및 H) 및 측면 영역("보유" 프로브 A, B, E 및 F)에 대한 qPCR 프라이머/프로브 세트로 도시되어 있다.
도 3b는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 부모 및 변형된 ES 세포에서의 관측된 프로브 복제수의 대표적인 계산을 나타낸다. 프로브 A 내지 F에 대한 관측된 프로브 복제수는 2/2ΔΔCt로서 산출되었다. ΔΔCt는 ave[ΔCt(샘플) - medΔCt(대조군)]로서 산출되되, 여기서 ΔCt는 테스트 프로브와 기준 프로브 간(검정에 따라 4개와 6개의 기준 프로브 간)의 차이이다. medΔCt(대조군)란 용어는 부모 ES 세포로부터의 다중의 (>60) 비표적화 DNA 샘플의 중앙 ΔCt이다. 각각의 변형된 ES 세포 클론은 6벌로 검정되었다. 부모 ES 세포 내 IgH 프로브 G 및 H의 복제수를 산출하기 위하여, 이들 프로브는 어떠한 증폭도 관측되지 않더라도 변형된 ES 세포에서 1의 복제수 및 35의 최대 Ct를 갖는 것으로 가정하였다.
도 3c는 프로브 D 및 H만을 이용해서 계산된 각 유전자형의 4마리의 마우스에 대한 복제수의 대표적인 계산을 나타낸다. 야생형 마우스:WT 마우스; 인간 면역글로불린 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 마우스 이형접합체:HET 마우스;인간 면역글로불린 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 마우스 동종접합체:호모 마우스.
도 4a는 박테리아 상동성 재조합(BHR)에 의한 3hVH BACvec의 작제에 이용된 3 단계의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다. 표적화 벡터로부터 삽입된 인간(백색 기호) 및 마우스(흑색 기호) 면역글로불린 유전자 분절, 선택 카세트(백색 사각형) 및 부위-특이적 재조합 부위(백색 삼각형)가 도시되어 있다.
도 4b는 NotI 소화 후의 3개의 BAC 클론(B1, B2 및 B3)의 펄스장 겔 전기영동(pulse-field gel electrophoresis: PFGE)을 나타낸다. 마커 M1, M2 및 M3은 각각 낮은 범위, 중간 범위 및 람다 래더 PEG 마커이다(매사추세츠주의 입시치시에 소재한 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)).
도 5a는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 양을 증가시키면서 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 순차적인 변형의, 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 동종접합성 마우스는 중쇄 인간화의 3개의 상이한 단계의 각각으로부터 제작되었다. 백색 기호는 인간 서열을 나타내고; 흑색 기호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 5b는 인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자 분절의 양을 증가시키면서 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 순차적인 변형의, 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 동종접합성 마우스는 κ 경쇄 인간화의 3개의 상이한 단계의 각각으로부터 제작되었다. 백색 기호는 인간 서열을 나타내고; 흑색 기호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 6은 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 인간화 마우스에서의 B 세포 집단의 FACS 도트 플롯을 나타낸다. 비장(첫줄, 위에서부터 세 번째줄 및 마지막 줄) 또는 야생형(wt), 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1(V1), 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2(V2) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 3(V3) 마우스의 서혜부 림프절(위에서부터 두 번째줄)로부터의 세포는 표면 IgM 발현 B 세포(첫줄, 및 위에서부터 두번째줄), κ 혹은 λ 경쇄를 함유하는 표면 면역글로불린(위에서부터 세번째줄) 또는 특정단상형의 표면 IgM(마지막줄), 및 FACS에 의해 분리된 모집단에 대해서 염색되었다.
도 7a는 VH-DH-JH(CDR3) 접합부 둘레의 무작위로 선택된 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 대표적인 중쇄 CDR3 서열을 나타내며, 이것은 접합 다양성 및 뉴클레오타이드 부가를 입증한다. 중쇄 CDR3 서열은 DH 유전자 분절 사용에 따라서 그룹화되며, 그의 생식선은 각 그룹 위쪽에 볼드체로 제공된다. 각 중쇄 CDR3 서열에 대한 VH 유전자 분절은 각 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 3-72은 인간 VH3-72이다). 각 중쇄 CDR3에 대한 JH 유전자 분절은 각 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 3은 인간 JH3이다). 도시된 각 서열에 대한 서열번호는 위에서부터 아래쪽으로 다음과 같다: 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39.
도 7b는 Vκ-Jκ(CDR3) 접합부 둘레의 무작위로 선택된 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 대표적인 경쇄 CDR3 서열을 나타내며, 이것은 접합 다양성 및 뉴클레오타이드 부가를 입증한다. 각 경쇄 CDR3 서열에 대한 Vκ 유전자 분절은 각 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 1-6은 인간 Vκ1-6이다). 각 경쇄 CDR3 서열에 대한 Jκ 유전자 분절은 각 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 표기되어 있다(예컨대, 1은 인간 Jκ1이다). 도시된 각 서열에 대한 서열번호는 위에서부터 아래쪽으로 다음과 같다: 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 서열번호 46; 서열번호 47; 서열번호 48; 서열번호 49; 서열번호 50; 서열번호 51; 서열번호 52; 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58.
도 8은 38(비면역화 IgM), 28(비면역화 IgG), 32(IgG로부터의 비면역화 Igκ), 36(면역화된 IgG) 또는 36(IgG로부터의 비면역화된 Igκ) 서열의 세트 중 각각의 뉴클레오타이드(NT; 좌측 열) 또는 아미노산(AA; 우측 열) 위치에서 변화된 서열의 퍼센트로서 점수매긴(교미 생식선 서열에 대한 정렬 후) 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체의 중쇄 및 경쇄의 체세포 과돌연변이 빈도(somatic hypermutation frequency)를 나타낸다. 음영으로 표시된 바는 CDR의 위치를 나타낸다.
도 9a는 야생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgM 및 IgG 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 9b는 생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgA 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 9c는 야생형(백색 막대) 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(흑색 막대)의 IgE 아이소형에 대한 혈청 면역글로불린의 수준을 나타낸다.
도 10a는 IL-6R의 엑토도메인에 의한 면역화의 2회(교배 1) 또는 3회(교배 2) 후의 7가지 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 5마리 야생형(WT) 마우스로부터의 혈청의 인터류킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 항원-특이적 IgG 역가를 나타낸다.
도 10b는 7가지 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 5마리의 야생형(WT) 마우스로부터의 IL-6R-특이적 IgG 아이소형-특이적 역가를 나타낸다.
도 11a는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 단클론성 항체의 친화도 분포를 나타낸다.
도 11b는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(VI) 및 야생형(WT) 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 단클론성 항체의 항원-특이적 차단을 나타낸다.
도 12는 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 일정한 축척이 아니라 개략적인 도해를 나타낸다. 인간화 내인성 중쇄 자리 내로의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b의 삽입에 이용되는 표적화 벡터(mADAM6 표적화 벡터)는 5' 및 3' 말단 상의 공학적으로 조작된 제한 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(Frt)를 양 측면에 지닌 선택 카세트(HYG: 하이그로마이신)로 도시되어 있다.
도 13은 인간 중쇄 가변 유전자 분절 1-2(VH1-2)와 6-1(VH6-1) 사이에 위치된 인간 ADAM6 위유전자(hADAM6Y)의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다. 인간 ADAM6 위유전자를 삭제하고 특유의 제한 부위를 인간 중쇄 자리 내로 삽입하기 위한 박테리아 상동성 재조합(hADAM6Y 표적화 벡터)을 위한 표적화 벡터는 5' 및 3' 말단 상의 공학적으로 조작된 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(loxP)를 양 측면에 가진 선택 카세트(NEO: 네오마이신)로 도시되어 있다. 부위-특이적 재조합 부위를 양 측면에 가진 선택 카세트를 포함하는 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 게놈 단편을 함유하는 얻어지는 표적화된 인간화 중쇄 자리의 일정한 축척이 아닌 도해가 도시되어 있다.
도 14a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리(H+/+κ+/+)에 대한 마우스 동종접합체 및 마우스 ADAM6 유전자(H+/+A6resκ+/+)를 포함하는 삽입된 마우스 게놈 단편을 지닌 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체에 대한 골수 내의 IgM 및 B220의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 14b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 15a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수에서의 c-키트 및 CD43의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 프로-B(CD19+CD43+c키트+) 및 프레-B(CD19+CD43-c키트-) 세포의 백분율은 각 등고선 선도의 각각의 상부 우측 및 하부 좌측 사분면에 표기되어 있다.
도 15b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 ㄷ대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 프로-B 세포(CD19+CD43+c키트+) 및 프레-B 세포(CD19+CD43-c키트-)의 총 수를 나타낸다.
도 16a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수 내의 CD19 및 CD43의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙 B(CD19+CD43-), 프레-B (CD19+CD43int) 및 프로-B(CD19+CD43+)의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 16b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 골수 내의 미성숙 B(CD19+CD43-) 및 프레-B(CD19+CD43int) 세포의 막대그래프를 나타낸다.
도 17a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)에 대한 비장세포 내의 CD19 및 CD3의 표면 발현에 대한 단일선 상에 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. B(CD19+CD3-) 및 T(CD19-CD3+) 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 17b는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 Igλ 및 Igκ 경쇄의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포에 대한 FACs 등고선 선도를 나타낸다. Igλ+(상부 좌측 사분면) 및 Igκ+(하부 우측 사분면) B 세포의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다.
도 17c는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 CD19+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 18a는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 IgD 및 IgM의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACs 등고선 선도를 나타낸다. 성숙 B 세포(CD19+IgDhighIgMint)의 백분율은 각 등고선 선도에 표기되어 있다. 우측 등고선 선도 상의 화살표는 IgM 및 IgD 표면 발현과 관련한 B 세포의 성숙 과정을 예시한다.
도 18b는 CD19+IgM하이IgDint로부터 CD19+IgMintIgD하이로의 성숙화 동안 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동종접합체(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 지니는 마우스 동종접합체(H+/+A6resκ+/+)의 비장에서의 B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 19는 Vλ 유전자 분절(A, B 및 C) 그리고 Jλ 및 Cλ 영역쌍(J-C 쌍)의 클로스터를 포함하는 인간 λ 경쇄 자리의, 일정한 축척이 아니라 상세한 도해를 나타낸다.
도 20은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 비활성화시키는데 이용되는 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 21은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리를 비활성화시키는데 이용되는 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 22a는 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절(12/1-λ 표적화 벡터)을 포함하는 인간 λ 경쇄 서열로 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 표적화하기 위한 초기의 표적화 벡터의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 22b는 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절(12/1-κ 표적화 벡터), 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절(12/4-κ 표적화 벡터), 12 hVλ 유전자 분절, 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열 및 hJλ1 유전자 분절 (12(κ)1-κ 표적화 벡터) 및 12 hVλ 유전자 분절, 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절(12(κ)4-κ 표적화 벡터)을 포함하는 인간 λ 경쇄 서열로 내인성 마우스 κ 경쇄 자리를 표적화하는 4개의 초기 표적화 벡터의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 23a는 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 into 마우스 λ 경쇄 자리 내로 점진적으로 삽입하기 위한 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 23b는 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 마우스 κ 자리로 점진적으로 삽입하기 위한 표적화 전략의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 24는 인간 κ 유전자간 서열, 다중hJλ 유전자 분절 또는 둘 모두를 함유하는 혼성 경쇄 자리의 작제를 위한 특유의 인간 λ-κ 혼성 표적화 벡터를 제작하는데 이용되는 표적화 및 분자 조작 단계의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 25a는 내인성 Cλ2 유전자에 작동가능하게 연결된 40개의 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 함유하는 변형된 마우스 λ 경쇄 자리용의 자리 구조의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 25b는 내인성 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 연속 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열의 존재 혹은 부재 하에 1 내지 4개의 Jλ 유전자 분절 및 40개의 hVλ 유전자 분절을 함유하는 4개의 독립적인 변형된 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 자리 구조의, 일정한 축척이 아니라 대략적인 도해를 나타낸다.
도 26a는 야생형 마우스(WT), 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 12개의 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(12hVλ-VκJκ-4hJλ) 그리고 40개의 hVλ 및 1개의 hJλ 유전자 분절에 대한 .마우스 동종접합체(40hVλ-1hJλ)로부터의 CD19+에 대해 게이팅된 Igλ+ 및 Igκ+ 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다.
도 26b는 야생형(WT), 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 12개의 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(12hVλ-VκJκ-4hJλ) 및 40개의 hVλ 및 1개의 hJλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체 (40hVλ-1hJλ)로부터의 수거된 비장에서의 CD19+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 27a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 B 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대한 단일선 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 Igλ+ 및 Igκ+ 발현에 대해서 CD19+ 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다.
도 27b는 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터 수거한 비장에서의 CD19+, CD19+Igκ+ 및 CD19+Igλ+ B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 27c는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해서 CD19+ 상에 게이팅되고 염색된 비장세포의 등고선 선도를 나타낸다. 성숙(WT에 대해서 72개, 40hVλ-VκJκ-4hJλ에 대해서 51개) 및 과도적(WT에 대해서 13개, 40hVλ-VκJκ-4hJλ에 대해서 22개) B 세포는 등고선 선도의 각각 상에 표기된다.
도 27d는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터 수거된 비장 내의 CD19+ B 세포, 과도적 B 세포(CD19+IgMhiIgDlo) 및 성숙 B 세포(CD19+IgMloIgDhi)의 총 수를 나타낸다.
도 28a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 B 및 T 세포(각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해서 염색된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 하부 패널은 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)로부터의 CD19+ 상에 게이팅되고 c키트+ 및 CD43+ 에 대해서 염색된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 프로 및 프레 B 세포는 하부 패널의 등고선 선도에 대해 표기되어 있다.
도 28b는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 수거한 골수 내의 프로(CD19+CD43+c키트+) 및 프레(CD19+CD43-C키트-) B 세포의 수를 나타낸다.
도 28c는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해서 염색된 단일선 상에 게이팅된 골수의 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙, 성숙 및 프로/프레 B 세포는 등고선 선도의 각각 상에 표기되어 있다.
도 28d는 야생형 마우스(WT) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 단리된 골수 내의 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220hiIgM+) B 세포의 총 수를 나타낸다.
도 28e는 야생형 마우스(WT) 그리고 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40개의 hVλ 및 4개의 Jλ 유전자 분절에 대한 마우스 동종접합체(40hVλ-VκJκ-4hJλ)의 대퇴골로부터 단리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙 (B220hiIgM+) B 세포에 대해 게이팅된 골수의 등고선 선도를 나타낸다.
도 29는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 8개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. A6 = 서열번호 115; B6 = 서열번호 116; F6 = 서열번호 117; B7 = 서열번호 118; E7 = 서열번호 119; F7 = 서열번호 120; C8 = 서열번호 121; E12 = 서열번호 122; 1-4 = 서열번호 123; 1-20 = 서열번호 124; 3B43 = 서열번호 125; 5-8 = 서열번호 126; 5-19 = 서열번호 127; 1010 = 서열번호 128; 11A1 = 서열번호 129; 7A8 = 서열번호 130; 3A3 = 서열번호 131; 2-7 = 서열번호 132. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. hJλ1 및 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격(Framework) 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산(consensus amino acid)은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
도 30은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 연속 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 12개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. 5-2 = 서열번호 145; 2-5 = 서열번호 146; 1-3 = 서열번호 147; 4B-1 = 서열번호 148; 3B-5 = 서열번호 149; 7A-1 = 서열번호 150; 5-1 = 서열번호 151; 4A-1 = 서열번호 152; 11A-1 = 서열번호 153; 5-7 = 서열번호 154; 5-4 = 서열번호 155; 2-3 = 서열번호 156. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. 각각의 인간 Jλ 및 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
도 31은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 서열을 보유하는 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 3개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vλ-Jλ-Cλ 접합부의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 도시한다. 2D1 = 서열번호 159; 2D9 = 서열번호 160; 3E15 = 서열번호 161. 소문자 염기는 재조합 동안 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 기인하는 비-생식선 염기를 나타낸다. hJλ1 및 마우스 Cλ2의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 골격 4 영역(FWR4) 내의 공통 아미노산은 서열 정렬의 아래쪽에 표기되어 있다.
본 발명은 기재된 특정 방법 및 실험조건으로 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건을 다를 수 있다. 본 명세서에 기재된 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목절을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 특허청구범위에 의해서 정해지기 때문이다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 용어 및 어구는, 정반대로 명확하게 표시되거나 또는 용어 또는 어구가 사용된 문맥으로부터 명확하게 분명하지 않다면, 용어 및 어구가 당업계에서 이룬 의미를 포함한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 이제 기재된다. 모든 언급된 간행물은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
어구 "실질적인" 또는 "실질적으로"는 유전자 분절의 양을 지칭하기 위해 사용될 때(예를 들어, "실질적으로 모든" V 유전자 분절) 기능성과 비기능성 유전자 분절을 둘다 포함하며, 각종 실시형태에 있어서, 예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 모든 유전자 분절을 포함하고; 각종 실시형태에 있어서, "실질적으로 모든" 유전자 분절은, 예컨대, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 기능성(즉, 비-위유전자(non-pseudogene)) 유전자 분절을 포함한다.
용어 "교체"는 DNA 서열이 세포의 게놈 내에 위치되어 게놈 내의 서열을 게놈 서열의 자리에서 이종성 서열(예컨대, 마우스 내 인간 서열)로 교체하는 것을 포함한다. 이렇게 위치된 DNA 서열은 이렇게 위치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 DNA의 부분인 하나 이상의 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서, 5' 또는 3' 비번역 영역, 적절한 재조합 신호 서열 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각종 실시형태에 있어서, 교체는 이렇게 위치된 DNA 서열(이종성 서열을 포함)로부터 유전자 산물의 생성을 초래하는 이종성 서열에 대한 내인성 서열의 치환이지만, 내인성 서열의 발현은 아니며; 교체는 내인성 게놈 서열에 의해 암호화된 단백질로서 유사한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 지니는 내인성 게놈 서열을 가진다(예컨대, 내인성 게놈 서열은 면역글로불린 유전자 또는 도메인을 암호화하고, DNA 단편은 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자 또는 도메인을 암호화함). 각종 실시형태에 있어서, 내인성 유전자 또는 이의 단편은 대응되는 인간 유전자 또는 이의 단편으로 교체된다. 대응되는 인간 유전자 또는 이의 단편은 교체된 내인성 유전자 또는 이의 단편의 오솔로그, 상동체인 인간 유전자 또는 단편이거나, 또는 교체된 내인성 유전자 또는 이의 단편과 구제 및/또는 기능이 실질적으로 동일하거나 또는 동일하다.
용어 "연속"(인접한)은 동일한 핵산 분자 상에서 생기는 것에 대한 언급을 포함하며, 예컨대, 2개의 핵산 서열은 그것들이 동일한 핵산 분자 상에서 생기지만, 다른 핵산 서열에 의해 막히지 않는다면, 연속적이다. 예를 들어, V(D)J 서열의 최종 코돈 바로 뒤가 불변 영역 서열의 제1 코돈이 아니더라도, 재배열된 V(D)J 서열은 불변 영역 유전자 서열을 지닌다. 다른 예에서, 2개의 V 유전자 분절 서열은, 그것들이 동일 게놈 단편 상에서 생긴다면, 그것들이 V 영역의 코돈을 암호화하지 않는 서열에 의해 분리될 수 있다고해도, 예컨대, 그것들이 프로모터 또는 다른 비암호화 서열과 같은 조절 서열에 의해 분리될 수 있다고 해도, "연속적"이다. 일 실시형태에 있어서, 연속 서열은 야생형 게놈에서 발견되는 바와 같이 배열되는 게놈 서열을 함유하는 게놈 단편을 포함한다.
어구 "로부터 유래된"은 인용된 유전자 또는 유전자 분절로부터 "유래된" 가변 영역에 대해 사용될 때, 가변 도메인을 발현시키는 유전자를 형성하기 위해 원래의 특정 재배열되지 않은 유전자 분절 또는 재배열된 유전자 분절에 서열을 추적하기 위한 능력을 포함한다(적용가능하다면, 스플라이스 차이 및 체세포 돌연변이를 설명함).
어구 "기능성"은 가변 영역 유전자 분절 또는 결합된 유전자 분절에 관해 사용될 때 발현된 항체 레퍼토리에서 사용을 지칭하며; 예컨대, 인간 Vλ 유전자 분절 3-1, 4-3, 2-8 등에서 기능성인 반면, Vλ 유전자 분절 3-2, 3-4, 2-5 등은 비기능성이다.
"중쇄 자리"는 염색체, 예컨대 마우스 염색체 상의, 야생형 마우스에서 중쇄 가변 (VH), 중쇄 다양성(DH), 중쇄 결합(JH) 및 중쇄 불변(CH) 영역 DNA 서열이 발견되는 위치를 포함한다.
"κ 자리"는 염색체, 예컨대, 마우스 염색체 상의, 야생형 마우스에서 κ가변(Vκ), κ결합(Jκ), 및 κ 불변(Cκ) 영역 DNA 서열이 발견되는 위치를 포함한다.
"λ 자리"는 염색체, 예컨대, 마우스 염색체 상의, 야생형 마우스에서 λ 가변 (Vλ), λ결합(Jλ), 및 λ불변(Cλ) 영역 DNA 서열이 발현되는 위치를 포함한다.
용어 "세포"는 서열을 발현시키는 것과 관련되어 사용될 때, 재조합 핵산 서열을 발현시키는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵세포 및 진핵세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예컨대, 이콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예컨대, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe), 피키아 파스토리스(P. pastoris), 피키아 멘타놀리카(P. methanolica) 등의 균주), 식물 세포, 곤충 세포(예컨대, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염 곤충 세포, 트리코프루시아니(Trichoplusia ni) 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, B 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어, 하이브리도마 또는 쿼드로마의 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 소정의 실시형태에 있어서, 세포는 진핵세포이며, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예컨대, CHO K1, DXB-11 CHO, 베기(Veggie)-CHO), COS(예컨대, COS-7), 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 신장(예컨대, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예컨대, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 앞서 언급한 세포로부터 유래된 세포주. 소정의 실시형태에 있어서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현시키는 망막 세포(예컨대, PER.C6(상표명) 세포)를 포함한다.
어구 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자(예컨대, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 내 두 골격 영역 사이에서 정상적으로 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의(즉, 야생형 동물에서) 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식선 서열 또는 재배열되거나 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 그리고, 예를 들어, 나이브 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 상황에서(예컨대, CDR3에 대해), CDR은 서열을 스플라이싱 또는 연결하는 결과로서(예컨대, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합), 연속이 아닌(예컨대 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 그러나 B 세포 핵산 서열에서는 연속인 2 이상의 서열(예컨대, 생식선 서열)에 의해 암호화될 수 있다
어구 "유전자 분절" 또는 "분절"은 V(경 또는 중) 또는 D 또는 J (경 또는 중) 면역글로불린 유전자 분절에 대한 언급을 포함하는데, 이는 재배열된 V/J 또는 V/D/J 서열을 형성하기 위해 재배열에 참여할 수 있는(예컨대, 내인성 재조합에 의해 매개됨) 면역글로불린 자리(예컨대, 인간 및 마우스에서)에서 재배열되지 않은 서열을 포함한다. 달리 표시되지 않는다면, V, D 및 J 분절은 12/23 규칙에 따라 V/J 재조합 또는 V/D/J 재조합을 허용하는 재조합 신호 서열(RSS)을 포함한다. 달리 표시되지 않는다면, 분절은 그것들이 천연에서 결합된 서열 또는 이의 기능성 동등물(예를 들어 V 분절 프로모터(들) 및 리더(들)에 대해)을 추가로 포함한다.
용어 "재배열되지 않은"은 면역글로불린 자리의 상태를 포함하되, V 유전자 분절 및 J 유전자 분절(중쇄에 대해, D 유전자 분절도)은 별개로 유지되지만, V(D)J 레퍼토리의 단일 V, (D), J를 포함하는 재배열된 V(D)J 유전자를 형성하도록 결합될 수 있다.
어구 "마이크로몰 범위"는 1 내지 999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되며; 어구 "나노몰 범위"는 1 내지 999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되고; 어구 "피코몰 범위"는 1 내지 999 피코몰을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "비-인간 동물"은 원구류, 경골어류, 상어 및 가오리와 같은 연골어류, 양서류, 파충류, 포유류 및 조류와 같은 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 비-인간 동물은 포유류를 포함한다. 적합한 포유류는 비-인간 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 및 설치류를 포함한다. 적합한 비-인간 동물은 래트 및 마우스를 포함하는 설치류과로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이다.
유전자 모델로서 마우스는 형질전환 및 넉아웃 기법에 의해 크게 향상되었는데, 이는 특이적 유전자의 지시된 과발현 또는 결실의 효과를 연구하게 한다. 모든 그것의 이점에도 불구하고, 마우스는 여전히 유전적 장애가 존재하는데, 이는 그것들을 인간 질병에 대한 불완전한 모델로 만들며, 인간 치료제를 시험하고 그것들을 만드는데 불완전한 플랫폼으로 만든다. 우선, 인간 유전자의 약 99%는 마우스 상동체를 가지지만(Waterston, R.H. et al. (2002) Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562.), 잠재적 치료제는 종종 의도된 인간 표적의 마우스 오솔로그와 교차반응하지 못하거나 또는 부적절하게 교차반응한다. 이 문제를 제거하기 위해, 선택된 표적 유전자는 "인간화될" 수 있고, 즉, 마우스 유전자는 대응되는 인간 오솔로그 유전자 서열에 의해 제거되고 교체될 수 있다(예컨대, 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국특허 제6,586,251호, 미국특허 제6,596,541호 및 미국특허 제7,105,348호). 처음에, "넉아웃-플러스-형질전환 인간화" 전략에 의해 마우스 유전자를 인간화하기 위한 노력은 내인성 유전자의 결실(즉, 넉아웃)을 옮기는 마우스와 무작위로 통합된 인간 전이유전자를 옮기는 마우스의 교차를 수반한다(예컨대, 문헌[Bril, W.S. et al. (2006) Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics, G.E. et al. (2006) Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D. et al. (2006) A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia. Genomics 88(3):309-15; Pan, Q. et al. (2006) Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice. Mol Immunol 43, 1741-1750] 참조). 그러나 이런 노력은 크기 제한에 의해 방해되었고; 통상적인 넉아웃 기법은 거대 마우스 유전자를 그것의 거대 인간 게놈 상대로 직접 교체하는데 충분하지 않았다. 직접 상동성 교체의 간단한 접근은 기술적 어려움 때문에 거의 시도되지 않는데, 이때 내인성 마우스 유전자는 마우스 유전자의 동일한 정확한 유전적 위치에서(즉, 내인성 마우스 자리에서) 인간 상대 유전자에 의해 직접 교체된다. 지금까지, 직접 교체에서 노력은 정교하고 힘든 절차를 수반하였으며, 따라서 처리될 수 있는 유전적 재료의 길이 및 그것이 조작될 수 있는 정확성을 제한한다.
외인성으로 도입된 인간 면역글로불린 전이유전자는 마우스에서 전구체 B-세포를 재배열한다(Alt, F.W., Blackwell, T.K., and Yancopoulos, G.D. (1985). Immunoglobulin genes in transgenic mice. Trends Genet 1, 231-236). 이 발견점은 인간 항체를 발현시키기 위해 넉아웃-플러스-형질전환 접근을 사용하여 유전자 조작 마우스에 의해 이용되었다(Green, L.L. et al. (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 13-21; Lonberg, N. (2005). Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23, 1117-1125; Lonberg, N. et al. (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856-859; Jakobovits, A. et al. (2007) From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol 25, 1134-1143). 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리는 각각의 내인성 자리의 작지만 중요한 부분의 표적화된 결실에 의해 이들 마우스에서 불활성화된 다음 상기 기재한 바와 같이 무작위로 통합된 거대 전이유전자로서, 또는 미니염색체로서 인간 면역글로불린 유전자 자리를 도입하였다(Tomizuka, K. et al. (2000) Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 722-727). 이러한 마우스는 유전적 조작에서 중요한 진보를 나타내었고; 그것들로부터 단리된 완전한 인간 단클론성 항체는 다양한 인간 질병을 표적화하기 위한 유망한 치료적 가능성을 얻었다(Gibson, T.B. et al. (2006) Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 6, 29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim, Y.H. et al. (2007) Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma. Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker, A.V. et al. (2005) Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study. Ann Surg Oncol 12, 1005-1016; McClung, M.R., Lewiecki, E.M. et al. (2006) Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821-831). 그러나, 상기 논의한 바와 같이, 이들 마우스는 야생형 마우스와 비교할 때, 약화된(compromised) B 세포 발생 및 면역 결핍을 나타낸다. 이러한 문제는 격렬한 체액성 반응을 지지하고, 결과적으로 일부 항원에 대해 완전한 인간 항체를 만들기 위한 마우스의 능력을 잠재적으로 제한한다. 결핍은 하기에 기인할 수 있다: (1) 인간 면역글로불린 전이유전자의 무작위 도입에 기인하는 불충분한 기능성 및 업스트림 및 다운스트림 제어 요소의 결여에 기인하는 얻어진 부정확한 발현(Garrett, F.E. et al. (2005) Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, 1511-1525; Manis, J.P. et al. (2003) Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region. Mol Immunol 39, 753-760; Pawlitzky, I. et al. (2006) Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A. J Immunol 176, 6839-6851); (2) 세포 표면 상의 B-세포 수용체 신호처리 복합체의 인간 불변 도메인과 마우스 성분 사이의 불출분한 종간 상호작용, 이는 정상 성숙, 증식 및 B 세포의 생존에 필요한 신호처리 과정을 부여할 수 있다(Hombach, J. et al. (1990) Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class. Nature 343, 760-762); 및 (3) 친화도 선택을 감소시킬 수 있는 가용성 인간 면역글로불린과 마우스 Fc 수용체 간의 불충분한 종간 상호작용(Rao, S.P. et al. (2002) Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells. J Immunol 169, 1859-1868) 및 면역글로불린 혈청 농도(Brambell, F.W. et al. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P., and Anderson, C.L. (1996). The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm, F. et al. (2006) Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. (2007). Fc-receptors as regulators of immunity. Adv Immunol 96, 179-204). 이들 결핍은 내인성 중쇄 및 경쇄 자리에서 그것의 천연 위치 내에서 마우스 면역글로불린 자리의 가변 영역만의 인시추 인간화에 의해 보정될 수 있다. 이는 보유하는 마우스 불변 영역에 기반한 마우스 환경과 함께 정상 상호작용 및 선택될 수 있는 "역 키메라"(즉, 인간 V: 마우스 C) 항체를 만드는 마우스를 효과적으로 초래한다. 추가로, 이러한 역 키메라 항체는 치료적 목적을 위해 완전한 인간 항체로 용이하게 재설정될 수 있다.
이종성(예컨대, 다른 종으로부터의) 면역글로불린 서열을 지니는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 교체를 포함하는 유전자 변형된 동물은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리 에서 교체와 함께 또는 면역글로불린 경쇄 전이유전자(예컨대, 키메라 면역글로불린 경쇄 전이유전자 또는 완전한 인간 완전한 마우스 등)와 함께 만들어질 수 있다. 이종성 면역글로불린 중쇄 서열이 유래된 종은 면역글로불린 경쇄 서열 교체 또는 면역글로불린 경쇄 전이유전자에서 사용된 면역글로불린 경쇄 서열과 마찬가지로 크게 다를 수 있다.
면역글로불린 가변 영역 핵산 서열, 예컨대, V, D, 및/또는 J 분절은 각종 실시형태에 있어서 인간 또는 비-인간 동물로부터 얻어진다. V, D, 및/또는 J 분절을 제공하는데 적합한 비-인간 동물은, 예를 들어 경골어류, 상어 및 가오리와 같은 연골어류, 양서류, 파충류, 포유류 및 조류(예컨대, 닭)와 같은 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은, 예를 들어, 포유류를 포함한다. 포유류는, 예를 들어, 비-인간 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소(예컨대, 젖소, 황소, 버팔로), 사슴, 낙타, 페럿 및 설치류 및 비-인간 영장류(예컨대, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 마모셋, 레서스 원숭이 비비)를 포함한다. 적합한 비-인간 동물은 래트, 마우스, 및 햄스터를 포함하는 설치류과로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이다. 내용으로부터 명확한 바와 같이, 다양한 비-인간 동물은 가변 도메인 또는 가변 영역 유전자 분절의 공급원(예컨대, 상어, 가오리, 포유류(예컨대, 낙타, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트)으로서 사용될 수 있다.
내용에 따르면, 비-인간 동물은 또한 가변 서열 또는 분절과 관련하여 사용되는 불변 영역 서열의 공급원으로서 사용되며, 예를 들어, 설치류 불변 서열은 인간 또는 비-인간 가변 서열(예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터에 작동가능하게 연결된 인간 또는 비-인간 영장류 가변 서열, 불변 서열)에 작동가능하게 연결된 전이유전자에서 사용될 수 있다. 따라서, 각종 실시형태에 있어서, 인간 V, D, 및/또는 J 분절은 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터) 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에 있어서, 인간 V, D, 및/또는 J 분절(또는 하나 이상의 재배열된 VDJ 또는 VJ 유전자)는 예컨대 내인성 면역글로불린 자리가 아닌 자리에서 통합된 전이유전자 내 마우스, 래트, 또는 햄스터 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 융합된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 VH, DH, 및 JH 분절을 지니는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 VH, DH, 및 JH 유전자 분절의 교체를 포함하는 마우스가 제공되되, 하나 이상의 인간 VH, DH, 및 JH 분절은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 작동가능하게 연결되고; 마우스는 내인성 면역글로불린 자리가 아닌 자리에서 전이유전자를 포함하며, 전이유전자는 마우스 또는 래트 또는 인간 불변 영역에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않거나 또는 재배열된 인간 VL 및 인간 JL 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 하나 이상의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 마우스가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 삽입은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 유전자의 업스트림이며; 일 실시형태에 있어서, 삽입은 내인성 가변(V) 유전자 분절의 다운스트림이고; 일 실시형태에 있어서, 삽입은 내인성 다양성(D) 유전자 분절의 다운스트림이며; 일 실시형태에 있어서, 삽입은 내인성 결합(J) 유전자 분절의 다운스트림이다. 각종 실시형태에 있어서, 삽입은 하나 이상의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 중쇄 불변 유전자에 작동가능한 연결로 위치되도록 된다.
인간 생식선 면역글로불린 가변 유전자 자리를 지니는 마우스 생식선 면역글로불린 가변 유전자 자리의 거대 인시츄 유전적 교체를 하는 한편 새끼를 만들기 위한 마우스의 능력을 유지하는 방법이 기재된다. 구체적으로, 인간 상대부분을 지니는 마우스 중쇄와 κ 경쇄 면역글로불린 가변 유전자 자리 둘다의 6개 메가베이스의 정확한 교체를 하는 한편 무결함인 마우스 불변 영역을 이탈하는 것이 기재된다. 결과로서, 마우스는 인간 생식선 면역글로불린 가변 서열과 동등한 마우스의 전체 생식선 면역글로불린 가변 레퍼토리의 정확한 교체를 만든 한편, 마우스 불변 영역을 유지하였다. 인간 가변 영역은 마우스 불변 영역에 연결되어 생리적으로 적절한 수준에서 재배열되고 발현되는 키메라 인간-마우스 면역글로불린 자리를 형성한다. 발현된 항체는 "역 키메라"이며, 즉, 그것들은 인간 가변 영역 서열 및 마우스 불변 영역 서열을 포함한다. 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 항체를 발현시키는 인간화 면역글로불린 가변 영역을 갖는 이들 마우스는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로 불린다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 인간화 마우스는 야생형 마우스로부터 본질적으로 구별될 수 없는 완전히 기능성인 체액성 면역체계를 나타낸다. 그것들은 모든 B 세포 발생 단계에서 정상 세포 집단을 나타낸다. 그것들은 정상 림프 기관 형태를 나타낸다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스의 항체 서열은 정상 V(D)J 재배열 및 정상 체세포 과돌연변이 빈도를 나타낸다. 이들 마우스에서 항체 집단은 정상 분류 전환(예컨대, 정상 아이소타입 시스-전환)으로부터 초래되는 아이소타입 분포를 반영한다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 면역화하는 것은 치료적 후보로서 적합한 인간 면역글로불린 가변 도메인을 갖는 거대하고, 다양한 항체 레퍼토리를 만드는 강한 체액성 면역 반응을 초래한다. 이 플랫폼은 약제학적으로 허용가능한 항체 및 다른 항원-결합 단백질을 만들기 위해 자연적으로 친화도-성숙된 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 풍부한 공급원을 제공한다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 만들게 하는 인간 면역글로불린 가변 서열로 마우스 면역글로불린 가변 서열의 정확한 교체가 있다. 또한 인간 면역글로불린 서열의 매우 거대한 범위의 순차적 재조합에 의해 동등한 면역글로불린 서열을 지니는 중쇄 및 경쇄 자리에서 내인성 마우스 면역글로불린 서열의 정확한 교체조차, 마우스와 인간 사이의 면역글로불린 자리의 다양한 진화에 기인하는 특정 도전으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 자리 내에서 산재된 유전자간 서열은 마우스와 인간 간에 동일하지 않지만, 일부 경우에, 기능적으로 동일할 수 없다. 마우스와 인간 간의 그것의 면역글로불린 자리에서 차이는 인간화 마우스에서, 특히 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 특정 부분이 인간화 또는 조작될 때, 여전히 비정상을 초래할 수 있다. 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 일부 변형은 해롭다. 해로운 변형은, 예를 들어 짝짓기 하거나 새끼를 생산하는 변형된 마우스의 능력 손실을 포함할 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스의 게놈 내 인간 면역글로불린 서열을 조작하는 것은 변형된 마우스 균주에서 없을 때 해로운 내인성 서열을 유지하는 방법을 포함한다. 예시적인 해로운 효과는 변형된 균주의 증식 불능, 필수적 유전자의 기능 손실, 폴리펩타이드를 발현하는 것의 불능 등을 포함할 수 있다. 이러한 해로운 효과는 마우스의 게놈 내로 유전자조작된 변형과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.
대응되는 1.4 메가베이스 인간 게놈 서열을 지니는 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 자리의 가변 영역(VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ)의 6메가베이스의 정확하고, 거대한 규모의 인시츄 교체가 수행된 한편, 모든 마우스 불변 쇄 유전자 및 자리 전사 제어 영역을 포함하는, 무결함이고 기능성인 혼성 자리 내에서 측접 마우스 서열을 이탈한다(도 1a 및 도 1b). 구체적으로, 인간 VH, DH, JH, Vκ 및 Jκ 유전자 서열은 VELOCKGENE(등록상표) 유전자 조작 기술을 사용하여 마우스 ES 세포 내로 인간 생식선 가변 자리의 중첩 단편을 함유하는 13 키메라 BAC 표적화 벡터의 단계적 삽입을 통해 도입되었다(예컨대, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela, D.M. et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659] 참조).
마우스 면역글로불린 유전자의 인간화는 지금까지 마우스 게놈에 대해 가장 큰 유전자 변형을 나타낸다. 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 전이유전자에 의한 이전의 노력은 일부 성공을 충족하였지만(상기 논의), 마우스 면역글로불린 유전자의 그것의 인간 상대부분으로 직접적 교체는 완전-인간 항체가 다른 정상 마우스에서 효율적으로 발생될 수 있는 효율을 극적으로 증가시킨다. 추가로, 이러한 마우스는 장애가 있는 내인성 자리 및 완전한 인간 항체 전이유전자를 함유하는 마우스에 비해, 사실상 임의의 항원에 의한 면역화 후 얻을 수 있는 완전-인간 항체의 극적으로 증가된 다양성을 나타낸다. 다양한 형태의 교체된, 인간화 자리는 무작위로 통합된 인간 전이유전자를 지니는 마우스와 대조적으로, 성숙 및 미성숙 B 세포의 완전히 정상인 수준을 나타내는데, 이는 다양한 분화 단계에서 유의하게 감소된 B 세포를 나타낸다. 인간 형질 전환 마우스에서 인간 유전자 분절의 수를 증가시키기 위한 노력은 이러한 결함을 감소시켰지만, 확장된 면역글로불린 레퍼토리는 야생형 마우스에 비해 B 세포 집단에서 전적으로 보정된 감소를 가지지 않는다.
근처의 야생형 체액성 면역 기능이 교체된 면역글로불린 자리를 지니는 마우스(즉, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스)에서 관측되었지만, 무작위로 통합된 전이유전자를 사용하는 일부 접근에서 마주치지 않는 면역글로불린의 직접적 교체를 사용할 때 마주친 다른 도전이 있다. 마우스와 인간 사이의 면역글로불린 자리의 유전적 조성의 차이는 교체된 면역글로불린 유전자 분절을 지니는 마우스의 증식에 유리한 서열의 발견을 야기하였다. 구체적으로, 내인성 면역글로불린 자리 내에 위치된 마우스 ADAM 유전자는 가임성에서 그것의 역할 때문에, 교체된 면역글로불린 자리를 지니는 마우스에서 최적으로 존재한다.
마우스 ADAM6의 게놈 위치 및 기능
임의의 기능성 ADAM6 단백질에 대한 능력을 결여하는 수컷 마우스는 놀랍게도 짝짓기 하고 새끼를 만드는 마우스 능력에서 결함을 나타낸다. 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절의 인간 가변 영역 유전자 분절로 교체 때문에 마우스는 기능성 ADAM6 단백질을 발현시키는 능력을 결여한다. ADAM6 기능의 손실은 DH 유전자 분절의 업스트림인 VH 유전자 분절 자리의 3' 단부에 근위인 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리의 영역 내에 위치되기 때문에 초래된다. 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 분절의 인간 중쇄 가변 유전자 분절로 교체에 대해 동형접합적인 마우스를 교배하기 위해, 교체에 대해 각각 동형접합적이고 생산적 짝짓기를 기다리는 수컷과 암컷을 마련하는 번거로운 접근이 일반적이다. 성공적인 한 배 새끼는 빈도 및 규모가 낮다. 대신, 교체에 대해 이형접합적인 수컷을 교체에 대해 동형접합적인 암컷과 짝짓기를 위해 사용하여 교체에 대해 이형접합적인 후손을 만들었고, 그 다음에 그것으로부터 동형접합적 마우스를 교배한다. 본 발명자는 수컷 마우스에서 가임성의 가능성 있는 손실 원인이 기능성 ADAM6 단백질의 동형접합적 수컷 마우스의 부재라는 것을 결정하였다.
각종 양상에 있어서, 손상된(즉, 비기능성 또는 미미하게 기능성인) ADAM6 유전자를 포함하는 수컷 마우스는 가임성의 감소 또는 제거를 나타낸다. 마우스(및 다른 설치류)에서 ADAM6 유전자는 면역글로불린 중쇄 자리 내에 위치되기 때문에, 본 발명자들은 마우스를 증식시키거나, 또는 교체된 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 마우스의 균주를 만들고 유지하기 위해, 다양한 변형된 교배 또는 증식 계획이 사용된다는 것을 결정하였다. 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 교체에 대해 동형접합적인 수컷 마우스의 낮은 가임성, 또는 비가임성은 마우스 균주에서 이러한 변형을 유지하는 것을 어렵게 만든다. 각종 실시형태에 있어서, 균주를 유지하는 것은 교체에 대해 동형접합적인 수컷 마우스에 의해 나타난 비가임성 문제를 회피하는 것을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스의 균주를 유지하기 위한 방법이 제공된다. 마우스의 균주는 이소성 ADAM6 서열을 포함할 필요가 없으며, 각종 실시형태에 있어서 마우스의 균주는 ADAM6의 넉아웃(예컨대, 기능성 넉아웃)을 위해 동형접합적이거나 또는 이형접합적이다.
마우스 균주는 수컷 마우스에서 가임성의 감소 또는 손실을 초래하는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 변형은 ADAM6 유전자의 조절 영역 및/또는 암호 영역의 결실을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 변형은 변형을 포함하는 수컷 마우스의 가임성을 감소시키거나 또는 제거하는 내인성 ADAM6 유전자(조절 및/또는 암호 영역)의 변형을 포함하고; 구체적인 실시형태에 있어서, 변형은 변형에 동형접합적인 수컷 마우스의 가임성을 감소시키거나 또는 제거한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 ADAM6 유전자의 넉아웃(예컨대, 기능성 넉아웃) 또는 결실에 대해 동형접합적 또는 이형접합적이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 변형에 대해 동형접합적 또는 이형접합적인 마우스로부터 세포를 단리시키는 것, 숙주 배아 내 공여체 세포를 사용하는 것, 대리모 내 숙주 배아 및 공여체 세포를 잉태시키는 것 및 유전자 변형을 포함하는 수손을 대리모로부터 얻는 것에 의해 유지된다. 일 실시형태에 있어서, 공여체 세포는 ES 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 공여체 세포는 다능성 세포, 예컨대, 유도된 다능성 세포이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 변형을 포함하는 핵산 서열을 변형에 대해 동형접합적 또는 이형접합적인 마우스로부터 단리시키는 것, 및 숙주 핵 내로 핵산 서열을 도입하는 것, 및 적합한 동물에서 핵산 서열 및 숙주 핵을 포함하는 세포를 잉태하는 것에 의해 유지된다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 숙주 난모세포 배아 내로 도입된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 변형에 대해 동형접합적 또는 이형접합적인 마우스로부터 핵을 단리시키는 것, 및 핵을 숙주 세포 내로 도입하는 것, 및 적합한 동물에서 핵 및 숙주 세포를 잉태하여 변형에 대해 동형접합적 또는 이형접합적인 후손을 얻는 것에 의해 유지된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 유전자 변형을 포함하는 수컷 마우스로부터의 정자를 사용하는 수컷 마우스(야생형, 변형에 대해 동형접합적, 또는 변형에 대해 이형접합적)의 시험관내 수정(in vitro fertilization: IVF)을 사용함으로써 유지된다. 일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 유전자 변형에 대해 이형접합적이다. 일 실시형태에 있어서, 수컷 마우스는 유전자 변형에 대해 동형접합적이다.
일 실시형태에 있어서, 마우스 균주는 유전자 변형에 대해 이형접합적인 수컷 마우스를 암컷 마우스와 교배시켜 유전자 변형을 포함하는 후손을 얻는 것, 유전자 변형을 포함하는 수컷 및 암컷 후손을 확인하는 것, 및 교배에서 유전자 변형에 대해 이형접합적인 수컷을 유전자 변형에 대해 야생형, 동형접합적, 또는 이형접합적인 암컷과 함께 사용하여 유전자 변형을 포함하는 후손을 얻는 것에 의해 유지된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형에 대해 이형접합적인 수컷을 야생형 암컷, 유전자 변형에 대해 이형접합적인 암컷, 또는 유전자 변형에 대해 동형접합적인 암컷과 교배시키는 단계는 마우스 균주에서 유전자 변형을 유지하기 위해 반복된다.
일 양상에 있어서, 이형접합적 수컷 마우스를 만들기 위해 마우스 균주를 교배시키는 단계를 포함하는, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 서열로 교체를 포함하는 마우스 균주를 유지하기 위한 방법이 제공되되, 이형접합적 수컷 마우스는 균주에서 유전적 변형을 유지하도록 교배된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 균주는 동형접합적 수컷의 야생형 암컷, 유전자 변형에 대해 동형접합적 또는 이형접합적인 암컷과 임의의 교배에 의해 유지되지 않는다.
ADAM6 단백질은 단백질의 ADAM 패밀리의 구성원이며, 여기서 ADAM은 A 디스인테그린(Disintegrin) 및 메탈로프로테아제에 대한 두문자어이다. 단백질의 ADAM 패밀리는 거대하고 다양하며, 세포 접착을 포함하는 다양한 기능을 지닌다. ADAM 패밀리의 일부 구성원은 정자형성 및 수정에 연루된다. 예를 들어, ADAM2는 정자-난자 상호작용에 연루되는 단백질 퍼틸린(fertilin)의 서브유닛을 암호화한다. ADAM3, 또는 크리테스틴(cyritestin)은 투명대에 결합되는 정자를 위해 필요한 것으로 나타난다. ADAM2 또는 ADAM3 중 하나의 부재는 비가임성을 초래한다. ADAM2, ADAM3 및 ADAM6은 마우스 정자 세포 표면 상에서 복합체를 형성하는 것으로 가정되었다.
간 VH 유전자 분절 VH1-2와 VH6-1 사이에서 정상적으로 발견된 인간 ADAM6 유전자는 위유전자가 되는 것으로 나타난다(도 12). 마우스에서, 마우스 VH와 DH 유전자 분절 사이의 유전자간 영역에서 발견된 2개의 유전자-ADAM6a 및 ADAM6b-가 있으며, 마우스에서 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자는 주위의 면역글로불린 유전자 분절의 유전자에 대해 마주보는 전사 배향으로 배향된다(도 12). 마우스에서, 기능성 ADAM6 자리는 정상 수정을 위해 명백하게 필요하다. 그 다음에 기능성 ADAM6 자리 또는 서열은 상보적이거나 또는 구제할 수 있는 ADAM6 자리 또는 서열을 지칭하며, 손실 또는 비기능성 내인성 ADAM6 자리를 지니는 수컷 마우스에서 극적으로 감소된 수정이 나타났다.
ADAM6a 및 ADAM6b를 암호화하는 마우스에서 유전자간 서열의 위치는 내인성 마우스 중쇄를 변형시킬 때 변형에 민감한 유전자간 서열을 제공한다. VH 유전자 분절이 결실되거나 또는 교체될 때, 또는 DH 유전자 분절이 결실되거나 또는 교체될 때, 얻어진 마우스가 가임성에서 심각한 결손을 나타낼 높은 가능성이 있다. 결손을 보완하기 위해, 마우스는 내인성 마우스 ADAM6 자리의 변형에 기인하는 ADAM6 활성의 손실을 보완할 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 변형된다. 각종 실시형태에 있어서, 상보적 뉴클레오타이드 서열은 가임성 결손을 구제하는 마우스 ADAM6a, 마우스 ADAM6b, 또는 상동체 혹은 오솔로그 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 것이다. 대안적으로, 내인성 ADAM6 자리를 보존하기 위한 적합한 방법이 사용될 수 있는 한편, 기능성 내인성 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 재배열될 수 없는 마우스 ADAM6 자리에 측접하는 내인성 면역글로불린 중쇄 서열을 제공한다. 예시적인 대안의 방법은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 자리를 위치시키는 마우스 염색체의 거대 부분의 조작을 포함하는데, 이러한 방법에서 그것들은 내인성 중쇄 불변 유전자에 작동가능하게 연결된 기능성 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 재배열될 수 없다. 각종 실시형태에 있어서, 상기 방법은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 분절을 함유하는 마우스 염색체 단편의 역위 및/또는 전좌를 포함한다.
가임성을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은 임의의 적합한 위치에 위치될 수 있다. 유전자간 영역에서, 또는 게놈 내 임의의 적합한 위치에서(즉, 이소성으로) 위치될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 게놈 내로 무작위로 통합되는 전이유전자 내로 도입될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 서열은 에피솜으로, 즉, 마우스 염색체보다 별개의 핵산 상에서 유지될 수 있다. 적합한 위치는 전사적으로 관대하거나 또는 활성인 위치, 예컨대 ROSA26 자리(Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), BT-5 자리(Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), 또는 Oct4 자리(Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464)를 포함한다. 전사적으로 활성인 자리에 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 것은, 예컨대 본 명세서에 참조로서 포함된 미국특허 제7,473,557호에서 기재된다.
대안적으로, 가임성을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은 유도성 프로모터와 결합되어 적절한 세포 및/또는 조직, 예컨대 재생 조직에서 최적의 발현을 가능하게 할 수 있다. 예시적인 유도성 프로모터는 물리적(예컨대, 열 충격 프로모터) 및/또는 화학적 수단(예컨대, IPTG 또는 테트라사이클린)에 의해 활성화된 프로모터를 포함한다.
추가로, 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구체적 발생 단계에서 또는 구체적 조직 내에서 발현을 달성하기 위해 다른 유전자에 연결될 수 있다. 이러한 발현은 구체적 발생 단계에서 발현된 유전자의 프로모터와 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열을 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 종의 게놈 내로 조작된 하나의 종으로부터의 면역글로불린 서열은 숙주 종으로부터 CD19 유전자(B 세포 특이적 유전자)의 프로모터 서열과 작동가능한 연결에 놓인다. 면역글로불린이 발현될 때 정확한 발생 단계에서 B 세포-특이적 발현이 달성된다.
삽입된 뉴클레오타이드 서열의 강한 발현을 달성하는 또 다른 방법은 구성적 프로모터를 사용하는 것이다. 예시적인 구성적 프로모터는 SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK 및 CAGG를 포함한다. 유사한 방식에서, 원하는 뉴클레오타이드 서열은 선택된 구성적 프로모터와 작동가능한 연결에 놓이는데, 이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질(들)의 높은 발현 수준을 제공한다.
용어 "이소성"는 천연에서 정상적으로 발생하지 않는 위치에서 이동 또는 배치를 포함하는 것으로 의도된다(예컨대, 핵산 서열이 야생형 마우스에서 발견된 것과 동일한 위치가 아닌 위치에서 핵산 서열의 배치). 상기 용어는 각종 실시형태에 있어서 그것의 정상 또는 적절한 위치 밖에서 그것의 목적의 의미로 사용된다. 예를 들어, 어구 "이소성 뉴클레오타이드 서열 암호화"는 그것이 마우스에서 정상적으로 생기지 않는 위치에서 나타나는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열의 경우에(또는 수컷 마우스에서 동일 또는 유사한 가임성 이점을 제공하는 그의 오솔로그 혹은 상동체 혹은 단편), 서열은 야생형 마우스에서 정상적으로 발견되는 것보다 마우스 게놈 내 상이한 위치에 위치될 수 있다. 이러한 경우에, 마우스 서열의 신규한 서열 접합부는 야생형 마우스에서보다 마우스의 게놈 내 상이한 위치에 서열을 위치시킴으로써 만들어질 것이다. 마우스 ADAM6의 기능성 상동체 혹은 오솔로그는 ADAM6-/- 마우스에서 관측된 가임성 손실(예컨대 짝짓기에 의해 새끼를 만드는 수컷 마우스 능력의 손실)을 부여하는 서열이다. 기능성 상동체 또는 오솔로그는 ADAM6a의 아미노산 서열에 대해 및/또는 ADAM6b의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 89% 상동성 이상, 예컨대 99% 상동성을 가지거나, 또는 ADAM6a 및/또는 ADAM6b의 결실 또는 넉아웃을 포함하는 유전자형을 갖는 마우스의 성공적으로 짝짓는 능력을 구제하는 단백질을 포함한다.
이소성 위치는 어디든지 있을 수 있거나(예컨대, 마우스 ADAM6 서열을 함유하는 전이유전자의 무작위 삽입과 같음), 또는, 예컨대, 야생형 마우스 내 그것의 위치에 가까운 위치에(예컨대, 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 자리지만, 그것의 천연 위치의 업스트림 또는 다운스트림 중 하나, 예컨대 변형된 면역글로불린 자리 내이지만, 상이한 유전자 분절 간이거나 또는 마우스 V-D 유전자간 서열 내 상이한 위치에서) 있을 수 있다. 이소성 위치의 일 예는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리 내의 야생형 마우스에서 정상적으로 발견되는 위치를 유지하는 한편 내인성 중쇄 불변 영역을 함유하는 기능성 중쇄를 암호화하도록 재배열될 수 있는 주위의 내인성 중쇄 유전자 분절을 제공하는 것이다. 이 예에서, 이는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 함유하는 염색체 단편의 역위에 의해, 예컨대 가변 영역 자리에 측접하는 위치에 위치된 유전자조작된 부위 특이적 재조합 부위를 사용함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 재조합 시, 내인성 중쇄 가변 영역 자리는 내인성 중쇄 불변 영역 유전자로부터 크게 떨어진 거리에 위치되고, 이에 의해 재배열을 방지하여 내인성 중쇄 불변 영역을 함유하는 기능성 중쇄를 암호화한다. 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 기능성 침묵을 달성하는 한편 기능성 ADAM6 자리를 유지하는 다른 예시적인 방법은 본 개시내용을 읽고/읽거나 당업계에 공지된 방법과 조합하여 당업자에게 명백할 것이다. 내인성 중쇄 자리의 이러한 배치에 의해, 내인성 ADAM6 유전자는 유지되며, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리는 기능적으로 침묵된다.
이소성 배치의 다른 예는 인간화 면역글로불린 중쇄 자리 내의 배치이다. 예를 들어, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절의 인간 VH 유전자 분절로 교체를 포함하는 마우스는 인간 VH 유전자 분절을 함유하는 서열 내에 위치된 마우스 ADAM6 서열을 갖도록 유전자 조작될 수 있되, 교체는 내인성 ADAM6 서열을 제거한다. 얻어진 변형은 인간 유전자 서열 내에서 (이소성) 마우스 ADAM6 서열을 만들며, 인간 유전자 서열 내에서 마우스 ADAM6 서열의 (이소성) 배치는 인간 ADAM6 위유전자(즉, 2개의 V 분절간)의 위치에 가까울 수 있거나 또는 마우스 ADAM6 서열의 위치(즉, V-D 유전자간 영역 내)에 가까울 수 있다. 마우스의 생식선 내에서 인간 유전자 서열(예컨대, 면역글로불린 유전자 서열) 내이거나 또는 인접한 (이소성) 마우스 ADAM6 서열의 결합에 의해 만들어지는 얻어진 서열 접합부는 야생형 마우스의 게놈에서 동일하거나 또는 유사한 위치에 비해 새롭다.
각종 실시형태에 있어서, ADAM6 또는 이의 오솔로그 또는 상동체가 없는 비-인간 동물이 제공되되, 결여는 비가임인 비-인간 동물을 제공하거나, 또는 비-인간 동물의 가임성을 실질적으로 감소시킨다. 각종 실시형태에 있어서, ADAM6 또는 이의 오솔로그 또는 상동체의 결여는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형에 기인한다. 가임성의 실질적인 감소는, 예컨대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 가임성(예컨대 교배 빈도, 한배 새끼, 1년 당 새끼 등)의 감소이다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 비-인간 동물의 수컷에서 기능성인 마우스 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편으로 보충되되, 보충된 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 전체 또는 실질적인 부분에서 가임성의 감소를 구제한다. 실질적인 부분에서 가임성의 구제는, 예컨대 가임성의 회복이므로, 비-인간 동물은 비변형(즉, ADAM6 유전자 또는 이의 오솔로그 또는 상동체에 대해 변형이 없는 동물) 중쇄 자리에 비해 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상인 가임성을 나타낸다.
유전자 변형된 동물(즉, 예컨대 면역글로불린 중쇄 자리의 변형에 기인하여 기능성 ADAM6 또는 이의 오솔로그 또는 상동체가 없는 동물)에 부여된 서열은, 각종 실시형태에 있어서, ADAM6 유전자 또는 이의 오솔로그 또는 상동체로부터 선택된다. 예를 들어, 마우스에서, ADAM6 기능의 손실은, 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 유전자를 첨가함으로써 구제된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스에서 ADAM6 기능의 손실은 마우스, 예컨대,설치류, 예컨대, 상이한 균주 또는 종의 마우스, 임의의 종의 래트, 설치류에 대해 밀접하게 관련된 종의 오솔로그 또는 상동체를 첨가함으로써 구제되되; 마우스에 오솔로그 또는 상동체의 부가는 ADAM6 기능의 손실 또는 ADAM6 유전자의 손실에 기인하여 가임성의 손실을 구제한다. 다른 종으로부터의 오솔로그 및 상동체는, 각종 실시형태에 있어서, 계통발생적으로 관련된 종으로부터 선택되고, 각종 실시형태에 있어서, 약 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상 또는 97% 이상이며 내인성 ADAM6(또는 오솔로그)와의 동일성 백분율을 나타내며; ADAM6-관련 또는 (비-마우스에서) 가임성의 ADAM6 오솔로그-관련 손실을 구제한다. 예를 들어, ADAM6 기능(예컨대, 래트 면역글로불린 중쇄 영역에서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 넉아웃으로 교체된 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 지니는 래트)이 없는 유전자 변형된 수컷 래트에서, 래트에서 가임성의 손실은 래트 ADAM6 또는, 소정의 실시형태에 있어서, 래트 ADAM6의 오솔로그(예컨대, 다른 균주 또는 종으로부터의 또는, 일 실시형태에 있어서, 마우스로부터의 ADAM6 오솔로그)의 부가에 의해 구제된다.
따라서, 각종 실시형태에 있어서, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 ADAM6 단백질(또는 이의 오솔로그 또는 상동체) 또는 조절 영역을 암호화하는 핵산 서열의 변형에 기인하는 가임성의 감소 또는 가임성 없음을 나타내는 유전자 변형된 동물은 가임성의 손실을 보완하거나 또는 회복하는 핵산 서열이 동일한 종의 상이한 균주로부터 또는 계통 발생적으로 관련된 종으로부터 유래된 경우 가임성의 손실보완하거나 또는 회복하는 핵산 서열을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 보완하는 핵산 서열은 ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편이다. 각종 실시형태에 있어서, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편을 보완하는 것은 가임성 결합을 갖는 유전자 변형된 동물과 밀접하게 관련된 비-인간 동물로부터 유래된다. 예를 들어, 유전자 변형된 동물이 특정 균주의 마우스인 경우, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 다른 균주의 마우스 또는 관련된 종의 마우스로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 가임성 결함을 포함하는 유전자 변형된 동물이 설치류 목인 경우, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 설치류목의 다른 동물로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 가임성 결함을 포함하는 유전자 변형된 동물은 쥐 아목(예컨대, 날쥐, 날새앙쥐, 마우스-유사 햄스터, 햄스터, 뉴 월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐, 트루 마우스 및 래트, 게르빌루스 쥐, 가시주머니쥐, 갈기쥐, 클라이밍 마우스, 락 마우스, 흰꼬리 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스, 가시겨울잠쥐, 뒤지, 대나무쥐, 꼰두더지쥐)을 가지며, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 설치류목 또는 쥐아목의 동물로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 뛰는쥐상과로부터 유래되며, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 쥐상과로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 쥐상과로부터 유래되며, ADAM6 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편은 뛰는쥐상과로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물 설치류이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐상과로부터 선택되고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐상과 내의 상이한 종으로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(예컨대, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과(예컨대, 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 볼), 쥐목(트루 마우스 및 래트, 게르빌루스 쥐, 가시주머니쥐, 벼슬나무 쥐), 네소미이다에(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스, 흰꼬리 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(예컨대, 가시겨울잠쥐), 및 대나무쥐과(예컨대, 뒤쥐, 대나무쥐, 및 꼰두더쥐)로부터 선택되고; ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 동일한 과의 상이한 종으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(쥐과)로부터 선택되고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 또는 벼슬나무 쥐로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 쥐과의 구성원으로부터 유래되며, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐과의 상이한 종으로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 설치류는 쥐목과의 마우스이며, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐과의 래트, 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 또는 벼슬나무 쥐로부터 유래된다.
각종 실시형태에 있어서, 과에서 설치류의 하나 이상의 설치류 ADAM6 오솔로그 또는 이의 상동체 또는 기능성 단편은 ADAM6 오솔로그 또는 상동체가 없는 동일한 패밀리의 유전자 변형된 설치류(예컨대, 비단털쥐과 (예컨대, 햄스터, 뉴 월드 래트 및마우스, 볼); 쥐목 (예컨대, 트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 벼슬나무 쥐))에 대해 가임성을 회복한다.
각종 실시형태에 있어서, ADAM6 오솔로그, 이의 상동체, 및 단편은 오솔로그, 상동체, 또는 단편이 ADAM6 활성이 없는 유전자 변형된 수컷 비-인간 동물(예컨대, ADAM6의 넉아웃 또는 그것의 오솔로그를 포함하는 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트)에 대해 가임성을 회복하는지 여부를 확인함으로써 기능성에 대해 평가된다. 각종 실시형태에 있어서, 기능성은 난관을 이동시키거나 유전자 변형된 동물의 동일 종의 난자를수정하기 위한 내인성 ADAM6 또는 이의 오솔로그 또는 상동체가 없는 유전자 변형된 동물의 정자 능력으로서 정의된다.
각종 양상에 있어서, 마우스 ADAM6(예컨대, 수컷 마우스에서 기능성인 오솔로그 또는 상동체 또는 이의 단편)에 대해 유사한 가임성 이점을 부여하는 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 내인성 중쇄 가변 영역 자리 또는 이의 부분의 결실 또는 교체를 포함하는 마우스가 만들어질 수 있다. 이소성 뉴클레오타이드 서열은 상이한 마우스 균주 또는 상이한 종, 예컨대 상이한 설치류 종의 ADAM6 상동체 혹은 오솔로그(또는 이의 단편)인 단백질을 암호화하고, 가임성에서 이점, 예컨대 구체화된 시간 기간에 걸쳐 증가된 새끼의 수 및/또는 마우스 난소를 수정시키기 위해 마우스 난관을 통해 횡단하는 수컷 마우스의 정사 세포의 능력을 부여하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다
일 실시형태에 있어서, ADAM6는 마우스 ADAM6 단백질에 적어도 89% 내지 99% 동일한(예컨대, 마우스 ADAM6a 또는 마우스 ADAM6b에 대해 적어도 89% 내지 99% 동일한) 상동체 혹은 오솔로그이다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6a에 대해 적어도 89% 동일한 단백질, 마우스 ADAM6b에 대해 적어도 89% 동일한 단백질 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 일 실시형태에 있어서, 상동체 혹은 오솔로그는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b에 대해 약 89% 이상 동일하게 되거나 또는 변형된 래트, 햄스터, 마우스, 또는 기니아 피그 단백질이다. 일 실시형태에 있어서, 상동체 혹은 오솔로그는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b에 대해 동일하거나 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
일 양상에 있어서, 비-인간 동물이 제공되되, 비-인간 동물은 (a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림의 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 삽입, (b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림의 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입, 및 (c) ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역이다(예컨대, 마우스, 래트 또는 햄스터 불변 영역으로부터 선택됨). 일 실시형태에 있어서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 또는 래트 Cκ 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 경쇄 불변 영역은 마우스 Cλ 또는 래트 Cκ 영역이다. 적합한 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 적어도 12 내지 적어도 40 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 12 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 28 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 40 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 적어도 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 4개의 인간 Jλ 유전자 분절은 적어도 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-인간 동물에서 이소성이다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편(비-인간 동물에서 기능성)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비-인간 ADAM6 자리와 비교하여 동일한 위치에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이며, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하고, 비-인간 동물의 게놈 내 이소성 위치에서 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이며 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하고, 면역글로불린 유전자 분절 내에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 유전자 분절은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 중쇄 유전자 분절은 비-인간 동물의 내인성 중쇄 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 하나 이상의 내인성 재배열되지 않은 중쇄 유전자 분절을 포함하는 이소성 연속 서열을 포함하며, ADAM6 서열은 이소성 연속 서열 내에 있다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 내인성 면역글로불린 VL 및/또는JL 유전자 분절이 없다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 비-인간 동물에서 면역글로불린 VL 도메인을 형성하기 위해 재배열될 수 없는 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 비-인간 동물에서 무결함이며, 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 분절과 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 사이에 삽입된 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물에서 항체의 VL 도메인을 형성하기 위해 재배열될 수 없는 무결함 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절이 제공된다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리는 면역글로불린 κ 경쇄 자리이다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리는 면역글로불린 λ 경쇄 자리이다. 각종 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이다. 각종 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 Vλ 및 Jλ 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 인간 κ 경쇄 자리로부터 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역을 추가로 포함하되, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절과 연속적이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 인간 Vλ 유전자 분절과 인간 Jλ 유전자 분절 사이에 위치된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 세포 및/또는 조직이 제공되되, 세포s 및/또는 조직은 (a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림의 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 삽입, (b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림의 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입, 및 (c) ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 마우스 불변 영역이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 래트 불변 영역이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 햄스터 불변 영역이다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포 및/또는 조직에서 이소성이다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비-인간 ADAM6 자리와 비교하여 동일한 위치에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 세포 및/또는 조직은 마우스로부터 유래되고, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하며, 이소성 위치에서 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 세포 및/또는 조직은 마우스로부터 유래되며, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하고, 면역글로불린 유전자 분절 내에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 중쇄 유전자 분절의 연속 서열은 비-인간 동물에서 이소성으로 위치되되, 내인성 중쇄 유전자 분절에 이소성으로 위치된 연속 서열은 마우스에서(예컨대, 수컷 마우스에서) 기능성인 ADAM6 유전자를 포함한다.
일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 만들기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 사용이 제공되되, 비-인간 동물은 (a) (i) 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 인간 VH 도메인 및 비-인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체; 및 (b) ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 항원 결합 단백질은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 설치류이고 비-인간 불변 영역은 설치류 불변 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 비-인간 세포 또는 조직이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 세포 또는 조직은 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자와 연속적인 하나 이상의 인간 면역글로불린 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 면역글로불린 Jλ 유전자 분절 및 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 연속적인 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하되, 세포 또는 조직은 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 Cκ 또는 마우스 Cλ이다.
일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이소성이다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비-인간 세포와 동일한 위치에 위치된다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 세포는 마우스 B 세포이다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 세포는 배아줄기 세포이다.
일 실시형태에 있어서, 조직은 비-인간 동물의 비장, 골수 또는 림프절로부터 유래된다.
일 양상에 있어서, 하이브리도마 또는 쿼드로마를 만들기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용이 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 게놈을 포함하는 비-인간 세포가 제공되되, 비-인간 세포는 난모세포, 숙주 배아, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 세포 및 상이한 비-인간 동물로부터의 세포의 융합물이다.
일 양상에 있어서, 완전한 인간 항체를 만들기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 완전한 인간 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 단리된 인간 VH 도메인 및 인간 Vλ 도메인을 포함한다.
일 양상에 있어서, 관심 대상 항원에 결합된 항체를 만들기 위한 방법이 제공되되, 상기 방법은 (a) 관심 대상 항원에 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 노출시키는 단계, (b) 비-인간 동물의 하나 이상의 B 림프구를 단리시키되, 하나 이상의 B 림프구는 관심 대상 항원에 결합되는 항체를 발현시키는 단계, 및 (c) 관심 대상 항원에 결합된 항체의 면역글로뷸린 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 확인하되, 면역글로불린 경쇄는 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 도메인을 포함하는 단계, 및 (d) 관심 대상 항원에 인간 항체를 결합시키기 위해 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열을 지니는 (c)의 핵산 서열을 사용하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 경쇄 불변 도메인은 마우스 Cκ이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 경쇄 불변 도메인은 마우스 Cλ이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 중쇄 자리에서 변형을 포함하는 가임 수컷 마우스가 제공되되, 가임 수컷 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 이소성 ADAM6 서열을 포함한다.
인간화 중쇄 마우스에서 이소성 ADAM6
유전자 표적화에서의 발생, 예컨대, 박테리아 인공 염색체(BAC)의 발생은 이제 상대적으로 거대한 게놈 단편의 재조합을 가능하게 한다. BAC 유전자 조작은 거대 결실, 및 거대 삽입을 마우스 ES 세포로 만드는 능력을 허용하였다.
인간 항체를 만드는 마우스는 이제 약간의 시간 동안 이용가능하다. 그것들은 인간 치료 항체의 발생에서 중요한 진보를 나타내었지만, 이들 마우스는 그것의 유용성을 제한하는 다수의 유의한 이상을 나타낸다. 예를 들어, 그것들은 약화된 B 세포 발생을 나타낸다. 약화된 발생은 형질전환 마우스와 야생형 마우스 사이의 다양한 차이에 기인할 수 있다.
인간 항체는 클론 선택 동안 성숙, 증식 또는 생존을 위해 신호처리하는 마우스 세포의 표면 상의 마우스 pre B 세포 또는 B 세포와 최적으로 상호작용하지 않을 수도 있다. 완전한 인간 항체는 마우스 Fc 수용체 시스템과 최적으로 상호작용하지 않을 수도 있고; 마우스는 인간 Fc 수용체와의 1 대 1 대응을 나타내지 않는 Fc 수용체를 발현시킨다. 최종적으로, 완전한 인간 항체를 만드는 다양한 마우스는 예컨대, 다운스트림 인핸서 요소 및 야생형 B 세포 발생에 필요할 수 있는 다른 자리 제어 요소와 같은 모든 진짜 마우스 서열을 포함하지 않는다.
완전한 인간 항체를 만드는 마우스는 일반적으로 일부 방법에서 무능화된(disabled) 내인성 면역글로불린 자리를 포함하며, 가변 및 불변 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 인간 전이유전자는 마우스 게놈 내 무작위 위치 내로 도입된다. 내인성 자리가 기능성 면역글로불린 유전자를 형성하는 유전자 분절을 재배열하지 않도록 충분하게 무능화되지 않는다면, 약화된 B 세포 발생을 지니기는 하지만 이러한 마우스에서 완전한 인간 항체를 만드는 목표는 달성될 수 있다.
인간 전이 유전자 자리로부터 완전한 인간 항체를 만드는 것은 매력적이지만, 마우스 내 인간 항체를 만드는 것은 명백하게 호의적이지 않은 과정이다. 일부 마우스에서, 과정은 트랜스-전환의 메커니즘을 통해 키메라 인간 가변/마우스 불변 중쇄(그러나 경쇄는 아님)의 형성을 초래하는 것에 관하여 호의적이지 않다. 이 메커니즘에 의해, 완전한 인간 항체를 암호화하는 전사체는 인간 아이소타입으로부터 마우스 아이소타입로 으로 트랜스로 전환되는 이소형을 겪는다.
과정은 트랜스인데, 완전한 인간 전이유전자는 마우스 중쇄 불변 영역 유전자의 미손상 복제물을 보유하는 내인성 자리와 떨어져서 위치되기 때문이다. 이러한 마우스에서 트랜스 전환은 용이하게 명확하지만, 현상은 사실상 부여된채로 남아있는 B 세포 발생을 구제하는데 여전히 불충분하다. 임의의 사건에서, 이러한 마우스에서 만들어진 트랜스 전환된 항체는 완전한 인간 경쇄를 보유하는데, 트랜스-전환의 현상은 경쇄에 대해 일어나지 않으며; 트랜스-전환은 시스에서 정상 아이소타입 전환에서 사용된(상이하긴 하지만) 내인성 자리 내 전환 서열에 추정적으로 의존하기 때문이다. 따라서, 완전한 인간 항체를 만들기 위해 유전자 조작된 마우스가 마우스 불변 영역을 지니는 항체를 만들기 위해 트랜스 전환 메커니즘을 선택할 때 조차, 전략은 정상 B 세포 발생을 구제하는데 불충분하다. 항체-기반 인간 치료제를 만드는 것에서 주된 문제는 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 바람직한 친화도로 - 보통 -그러나 항상은 아님- 높은 친화도로 그것들과 결합되는 유용한 가변 도메인을 확인하기 위해 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 충분하게 큰 다양성을 만드는 것이다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스(본 명세서에서 기재함)의 발생 전, 마우스 불변 영역과 함께 인간 가변 영역을 발현시키는 마우스가 전이유전자로부터 인간 항체를 만든 마우스와 어떤 유의한 차이를 나타낸다는 징후는 없었다. 그러나, 추정은 정확하지 않다.
내인성 마우스 자리에서 인간 면역글로불린 가변 영역과 함께 마우스 면역글로불린 가변 영역의 정확한 교체를 함유하는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 B 세포 발생에 대해 야생형 마우스와 놀랍고, 현저한 유사성을 나타낸다. 놀랍고 뜻밖인 발생에서, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 면역화에 대해 만들어진 야생형 마우스로부터의 하나의 유의한 측면 - 가변 영역에서만 상이한 면역화에 대해 본질적으로 정상이고, 야생형인 반응을 나타내었다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄(IgH) 및 면역글로불린 경쇄 (예컨대, κ 경쇄, Igκ) 의 내인성 자리에서 대응되는 인간 면역글로불린 가변 영역으로 생식선 가변 영역의 정확한, 대규모 교체를 함유한다. 전체적으로, 마우스 자리의 약 6개의 메가베이스는 인간 게놈 서열의 약 1.5 메가메이스로 교체된다. 이 정확한 교체는 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역중쇄 및 경쇄를 만드는 혼성 면역글로불린 자리를 지니는 마우스를 초래한다. 마우스 VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ 분절의 정확한 교체는 혼성 면역글로불린 자리에서 측접 마우스 서열 무결함 및 기능성을 이탈한다. 마우스의 체액성 면역체계는 야생형 마우스의 면역체계처럼 기능한다. B 세포 발생은 어떤 유의한 대상에서 입체방해되지 않으며 인간 가변 영역의 풍부한 다양성은 항원 시험감염시 마우스에서 만들어진다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 중쇄 및 κ 경쇄에 대한 면역글로불린 유전자 분절이 그것이 동일 또는 심지어 거의 동일한 것은 아닌(명확하게 그런 것은 아님), 인간 및 마우스에서 유사하게 재배열되기 때문에 가능하다. 그러나, 자리는 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 분절을 함유하는 연속 마우스 서열의 약 3백만개의 염기쌍을 중쇄 가변 유전자 자리의 인간화가 인간 면역글로불린 자리로부터 동등한 서열을 근본적으로 포함하는 연속 인간 게놈 서열의 약 백만개의 염기로 교체함으로써 수행될 수 있다는 것과 충분히 유사하다.
소정의 실시형태에 있어서, 특정 마우스 불변 영역 유전자 서열의 인간 유전자 서열로 추가적인 교체(예컨대, 마우스 CH1 서열을 인간 CH1 서열로 교체, 및 체 마우스 CL 서열을 인간 CL 서열로 교체)는 예컨대, 완전한 인간 항체 단편, 예컨대, 완전한 인간 Fab를 만드는데 적합한 인간 가변 영역 및 부분적 인간 불변 영역을 가지는 항체를 만드는 혼성 면역글로불린 자리를 지니는 마우스를 초래한다. 혼성 면역글로불린 자리를 지니는 마우스는 정상 가변 유전자 분절 재배열, 정상 체세포 과돌연변이, 및 정상 분류 전환을 나타낸다. 이들 마우스는 야생형 마우스로부터 구별될 수 없는 체액성 면역체계를 나타내며, 마우스가 인간 가변 영역 유전자 분절의 전체 레퍼토리가 없는 경우조차 B 세포 발생의 모든 단계 및 정상 림프 기관 구제에서 정상 세포 집단을 나타낸다. 이들 마우스를 면역화시키는 것은 매우 다양한 가변 유전자 분절 사용을 나타내는 강한 체액성 반응을 초래한다.
마우스 생식선 가변 영역 유전자 분절의 정확한 교체는 마우스가 부분적으로 인간 면역글로불린 자리를 가지게 한다. 부분적으로 인간 면역글로불린 자리가 재배열되고, 초돌연변이되며, 정상적으로 클래스 전환되기 때문에, 부분적으로 인간 면역글로불린 자리는 인간 가변 영역을 포함하는 마우스 내 항체를 만든다. 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 확인되고, 클로닝될 수 있고, 그 다음에 임의의 선택 서열, 예컨대 특정 사용에 적합한 임의의 면역글로불린 아이소타입과 융합될 수 있는데(예컨대, 시험관내 시스템에서), 이는 인간 서열로부터 완전히 유래된 항체 또는 항원-결합 단백질을 초래한다.
재조합 방법에 의한 대규모 인간화는 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 분절의 모두를 포함한 마우스 중쇄 면역글로불린 자리의 3개까지의 메가베이스를 모든 인간 VH, DH, 및 JH 유전자 분절의 일부 또는 본질적으로 모두를 함유하는 1개의 메가베이스 인간 게놈 서열을 지니는 동등한 인간 유전자 분절로 정확하게 교체하기 위해 마우스 배아줄기 (ES) 세포를 변형시키는데 사용되었다. 본질적으로 모든 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 암호화하는 2개의 반복체 중 하나를 포함하는 인간 게놈의 메가베이스 분절의 1/2까지 본질적으로 모든 마우스 Vκ및 Jκ 유전자 분절을 함유하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 3개의 메가베이스 분절을 교체하기 위해 사용되었다.
이러한 교체된 면역글로불린 자리를 지니는 마우스는 내인성 마우스 ADAM6 자리의 파괴 또는 결실을 포함할 수 있는데, 이는 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 3' 대부분의 VH 유전자 분절과 5'대부분의 DH 유전자 분절 사이에서 정상적으로 발견된다. 이 영역 내 파괴는 내인성 마우스 ADAM6 자리의 기능성의 감소 또는 제거를 야기할 수 있다. 인간 중쇄 레퍼토리의 3' 대부분의 VH 유전자 분절이 교체에서 사용된다면, 인간 ADAM6 위유전자가 되는 것으로 나타난 위유전자를 함유하는 유전자간 영역은 이들 VH 유전자 분절 사이에, 즉 인간 VH1-2와 VH1-6 사이에 존재한다. 그러나, 이 인간 유전자간 서열을 포함하는 수컷 마우스는 가임성에서 감소를 나타낸다. 마우스는 상기 기재된 바와 같은 교체된 자리를 포함하고, 또한 ADAM6을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 또한 포함하는 마우스가 기재되며, 여기서 마우스는 본질적으로 정상의 가임성을 나타낸다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 핵산 서열은 변형된 내인성 중쇄 자리에서 인간 VH1-2 유전자 분절과 인간 VH6-1 유전자 분절 사이에 위치된 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이소성 핵산 서열은 변형된 내인성 중쇄 자리에서 인간 VH1-2와 VH1-6 사이에 위치된 서열번호 3이다. 서열번호 3의 ADAM6 유전자의 전사 방향은 주위의 인간 VH 유전자 분절의 전사 방향에 대해 반대이다. 본 명세서의 예는 표시된 인간 VH 유전자 분 사이에 이소성 서열을 위치시킴으로써 가임성의 구제를 나타내지만, 당업자는 마우스 게놈 내 임의의 적합한 전사적으로 허용되는 자리에서(또는 심지어 염색체밖으로) 이소성 서열의 배치는 수컷 마우스에서 가임성을 유사하게 구제시키는 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다.
마우스 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 이소성 서열을 지니는 기능성 ADAM6 자리가 없는 마우스를 보충하는 현상은 비기능성 또는 최소로 기능성인 내인성 ADAM6 자리를 지니는 임의의 마우스를 구제하기 위해 적용가능한 일반적 방법이다. 따라서, 면역글로불린 중쇄 자리의 ADAM6-파괴 변형을 포함하는 큰 다수의 마우스는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 구제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 내인성 ADAM6 기능을 약화시키는 매우 다양한 면역글로불린 중쇄 자리를 지니는 마우스를 포함한다. 일부(비제한적) 예는 본 설명에 제공된다. 추가로, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스가 기재되며, ADAM6과 관련된 조성물 및 방법은 매우 다수의 적용에서, 예컨대 매우 다양한 방법에서 중쇄 자리를 변형시킬 때 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 기능성 ADAM6 단백질(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편), 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절의 인간 DH 및 인간 JH 유전자 분절로 교체를 암호화하는 이소성 ADAM6 서열을 포함하는 마우스가 제공되되; 마우스는 CH1 및/또는 힌지 영역이 없다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는: (a) 인간 VH - 마우스 CH1 - 마우스 CH2 -마우스 CH3; (b) 인간 VH - 마우스 힌지 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3; 및, (c) 인간 VH - 마우스 CH2 - 마우스 CH3으로부터 선택된 면역글로불린 쇄의 다이머인 단일 가변 도메인 결합 단백질을 만든다.
일 양상에 있어서, 가임성을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절(mVH, mDH, 및/또는 mJH의 분절)의 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절(hVH, hDH, 및/또는 hJH의 분절)로 교체를 가지는 마우스에서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 (예컨대, 인간 VH1-2와 VH1-6 유전자 분절 사이) 내에 위치되며, 마우스는 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절(mVκ 및/또는 mJκ의 분절)의 하나 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절(hVκ 및/또는 hJκ의 분절)로 교체를 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 인간 VH1-2 유전자 분절과 인간 VH1-6 유전자 분절 사이에 위치된다(본 명세서에 참조로서 포함된 미국특허 제6,596,541호 및 미국특허 제7,105,348호). 일 실시형태에 있어서, 이렇게 변형된 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절(모든 hVH, hDH, 및 hJH의 분절) 및 모든 또는 실질적으로 모든 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절(hVκ 및 hJκ의 분절)로 쵸체를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절은 약 3 메가베이스의 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 적어도 89개 VH 유전자 분절, 적어도 13개 DH 유전자 분절, 적어도 4개 JH 유전자 분절 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절은 약 1 메가베이스의 인간 면역글로불린 중쇄 자리를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 중쇄 자리의 적어도 80개 VH 유전자 분절, 적어도 27개 DH 유전자 분절, 적어도 6개 JH 유전자 분절 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 약 3메가베이스의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 적어도 137 Vκ 유전자 분절, 적어도 5개 Jκ 유전자 분절 또는이들의 조합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 약 1/2 메가베이스의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 자리를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 근위 반복체(면역글로불린 κ 불변 영역에 대해)를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 분절은 인간 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 적어도 40Vκ 유전자 분절, 적어도 5개 Jκ 유전자 분절 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 2개의 인간 면역글로불린 유전자 분절 사이에 위치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 2개 인간 면역글로불린 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이다.
일 양상에 있어서, 기능성 마우스 ADAM6 자리(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편)는 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 자리에서 존재하는 마우스 유전자 분절의 가장 중간에 존재하며, 상기 자리는 내인성 중쇄 불변 영역을 함유하는 기능성 중쇄를 암호화하기 위해 재배열될 수 없다. 일 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 중쇄 자리는 적어도 1개 내지 89개까지의 VH 유전자 분절, 적어도 1개 내지 13개까지의 DH 유전자 분절, 적어도 1개 내지 4개까지의 JH 유전자 분절 및 이들의 조합을 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 기능성 마우스 ADAM6 자리(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편)는 마우스에서 기능성인 하나 이상의 ADAM6 단백질을 암호화하되, 하나 이상의 ADAM6 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
일 양상에 있어서, 기능성 마우스 ADAM6 자리(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편)는 내인성 마우스 VH 유전자 분절을 교체하는 인간 VH 유전자 분절의 가장 가운데에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 89 마우스 VH 유전자 분절은 제거되고, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체되며, 마우스 ADAM6 자리는 인간 VH 유전자 분절의 3' 단부에 바로 인접하거나 또는 2개의 인간 VH 유전자 분절 사이에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 삽입된 인간 VH 유전자 분절의 3' 말단의 약 20 킬로베이스(kb) 내지 약 40 킬로베이스(kb) 내에서 2개의 VH 유전자 분절 사이에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 삽입된 인간 VH 유전자 분절의 3' 말단의 약 29 kb 내지 약 31 kb 내에서 2개의 VH 유전자 분절 사이에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 삽입된 인간 VH 유전자 분절의 3' 말단의 약 30kb 내에서 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 삽입된 인간 VH 유전자 분절의 3' 말단의 약 30,184 bp 내에서 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 교체는 인간 VH 유전자 분절 VH1-2 및 VH6-1을 포함하며, 마우스 ADAM6 자리는 VH1-2 유전자 분절의 다운스트림 및 VH6-1 유전자 분절의 업스트림에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 인간 VH1-2 유전자 분절과 인간 VH6-1 유전자 분절 사이에 존재하되, 마우스 ADAM6 자리의 5' 단부는 인간 VH1-2 유전자 분절의 3' 말단으로부터 약 13,848 bp이며, ADAM6 자리의 3'단부는 인간 VH6-1 유전자 분절의 5' 말단으로부터 약 29,737 bp 이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리는 마우스의 세포 내에서 ADAM6 기능을 부여하는 서열번호 3 또는 이의 단편을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서,인간 VH 유전자 분절의 배열은 그 다름에 다음이 된다(인간 VH 유전자 분절의 전사 방향에 대해 업스트림으로부터 다운스트림으로): 인간 VH1-2 - 마우스 ADAM6 자리 - 인간 VH6-1. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 VH1-2와 인간 VH6-1 사이의 ADAM6 위유전자는 마우스 ADAM6 자리로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 배향은 인간 VH 유전자 분절의 배향과 비교하여 전사 방향에 대해 반대이다. 대안적으로, 마우스 ADAM6 자리는 3' 대부분의 인간 VH 유전자 분절과 5' 대부분의 DH 유전자 분절 사이의 유전자간 영역 내에 존재한다. 이는 5' 대부분의 DH 분절이 마우스이든 또는 인간이든 경우가 될 수 있다.
유사하게, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 분절을 교체하는 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절(예컨대, Vκ 또는 Vλ 분절)에 의해 변형된 마우스는, 예컨대 마우스 ADAM6 자리 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 다운스트림 상동성 부분을 갖는 표적화 벡터를 사용함으로써 상기 기재한 바와 같은 내인성 마우스 ADAM6 자리를 유지하거나, 또는 2개의 인간 Vλ 유전자 분절 사이 또는 인간 Vλ 유전자 분절과 DH 유전자 분절 사이(인간이든 마우스이든, 예컨대, Vλ + m/hDH), 또는 J 유전자 분절(인간이든 마우스이든, 예컨대, Vκ + JH)에 위치된 이소성 서열을 지니는 손상된 마우스 ADAM6 자리를 교체하기 위해 변형될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 교체는 2 이상의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하며, 마우스 ADAM6 자리 또는 그의 기능성 단편은 2개의 3' 대부분의 VL 유전자 분절 사이에 존재한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절의 배열은 그 다음에 다음과 같다(인간 유전자 분절의 전사 방향에 대해 업스트림으로부터 다운스트림으로): 인간 Vλ3' 1 - 마우스 ADAM6 자리- 인간 Vλ3'. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 배향은 인간 Vλ 유전자 분절의 배향과 비교하여 전사 방향에 대해 반대이다. 대안적으로, 마우스 ADAM6 자리는 3' 대부분의 인간 Vλ 유전자 분절과 5' 대부분의 DH 유전자 분절 사이의 유전자간 영역에 존재한다. 이는 5' 대부분의 DH 분절이 마우스이든 인간이든 경우가 될 수 있다.
일 양상에 있어서, 하나 이상의 내인성 마우스 VH 유전자 분절의 교체를 지니며, 적어도 하나의 내인성 마우스 DH 유전자 분절을 포함하는 마우스가 제공된다. 이러한 마우스에서, 내인성 마우스 VH 유전자 분절의 변형은 3' 대부분의 VH 유전자 분절의 하나 이상의 변형을 포함하지만, 5' 대부분의 DH 유전자 분절은 포함하지 않으며, 여기서 하나 이상의 3' 대부분의 VH 유전자 분절의 변형은 내인성 마우스 ADAM6 자리 비기능성을 파괴하거나 또는 만들지 않도록 처리된다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 분절을 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체를 포함하며, 마우스는 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절 및 기능성 내인성 마우스 ADAM6 자리를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 3' 대부분의 VH 유전자 분절의 변형, 및 하나 이상의 내인성 마우스 DH 유전자 분절의 변형을 포함하며, 변형은 내인성 ADAM6 자리가 기능성으로 남아있는 정도로 내인성 마우스 ADAM6 자리의 통합을 유지하도록 수행된다. 일 예에서, 이러한 변형은 2개의 단계로 행해진다: (1) 3' 대부분의 내인성 마우스 VH 유전자 분절을 업스트림 상동성 부문 및 다운스트림 상동성 부문을 지니는 표적화 벡터를 사용하여 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체하되, 다운스트림 상동성 부문은 기능성 마우스 ADAM6 자리의 모두 또는 일부를 포함하는 단계; (2) 그 다음에 내인성 마우스 DH 유전자 분절을 마우스 ADAM6 자리의 모두 또는 기능성 부분을 포함하는 업스트림 상동성 부문을 갖는 표적화 벡터로 교체하는 단계.
각종 양상에 있어서, 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능성 상동체를 암호화하는 이소성 서열을 함유하는 마우스를 사용하는 것은 변형이 내인성 마우스 ADAM6의 기능을 파괴하는 경우 유용하다. 내인성 마우스 ADAM6 기능을 파괴할 가능성은 마우스 면역글로불린 자리에 대해 변형이 만들어질 때, 특히 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 주위의 서열이 변형될 때 높다. 따라서, 이러한 마우스는 전체 또는 부분적으로 결실되거나, 전체 또는 부분적으로 인간화되거나, 또는 전체 또는 부분적으로 교체된(예컨대 Vκ 또는 Vλ 서열로) 면역글로불린 중쇄 자리를 지니는 마우스를 만들 때 특히 이점을 제공한다. 이하에 기재된 마우스에 대해 기재된 유전자 변형을 만들기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
마우스 ADAM6 단백질, 또는 마우스 ADAM6 단백의 가임성 이점을 부여하는 실질적으로 동일하거나 또는 유사한 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 함유하는 마우스는 내인성 마우스 ADAM6 서열을 파괴하거나 또는 결실시키는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리에 대한 변형과 함께 특히 유용하다. 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 지니는 항체를 발현시키는 마우스와 관련하여 주로 기재되었지만, 이러한 마우스는 내인성 마우스 ADAM6 유전자를 파괴하는 임의의 유전자 변형과 관련하여 유용하다. 당업자는 이것이 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 변형을 함유하는 매우 다양한 유전자 변형된 마우스를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 이들은, 다른 변형에도 불구하고, 예를 들어 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자 분절의 모두 또는 일부의 결실 또는 교체를 지니는 마우스를 포함한다.
소정의 양상에있어서, 이소성 마우스, 설치류, 또는 마우스에서 기능성인 다른 ADAM6 유전자(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 단편), 및 하나 이상의 인간 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 각종 실시형태에 있어서, 마우스에서 기능성인 다른 ADAM6 유전자 오솔로그 또는 상동체 또는 단편은 소, 개, 영장류, 토끼 또는 다른 비-인간 서열로부터의 서열을 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열을 암호화하는 마우스, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체; 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절로 교체; 및 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 JH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절로 교체가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 CH1 뉴클레오타이드 서열의 인간 CH1 뉴클레오타이드 서열로 교체를 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 힌지 뉴클레오타이드 서열의 인간 힌지 뉴클레오타이드 서열로 교체를 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 가변 자리(VL 및 JL)의 인간 면역글로불린 경쇄 가변 자리로 교체를 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오타이드 서열의 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오타이드 서열로 교체를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL, JL 및 CL은 면역글로불린 κ 경쇄 서열이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 힌지 및 인간 CH1 서열에 융합된 마우스 CH2 및 마우스 CH3 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함하므로, 마우스 면역글로불린 자리는 재배열되어 (a) 인간 가변 영역, 인간 CH1 영역, 인간 힌지 영역 및 마우스 CH2 및 마우스 CH3 영역을 갖는 중쇄; 및 (b) 인간 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 유전자를 포함하는 결합 단백질을 암호화하는 유전자를 형성한다.
일 양상에 있어서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절로 교체, 및 선택적으로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 분절s 및/또는 JH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및/또는 인간 JH 유전자 분절로 교체, 또는 선택적으로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절로 교체를 포함하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 분절의 with 하나 이상의 VL, 하나 이상의 DH, 및 하나 이상의 J 유전자 분절(예컨대, Jκ 또는 Jλ)로 교체를 포함하되, 유전자 분절은 내인성 마우스 힌지 영역에 작동가능하게 연결되며, 마우스는 인간 Vλ - 인간 또는 마우스 DH - 인간 또는 마우스 J - 마우스 힌지 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3을 전사 방향에서 5'으로부터 3'으로 함유하는 재배열된 면역글로불린 쇄 유전자를 형성한다. 일 실시형태에 있어서, J 영역은 인간 Jκ 영역이다. 일 실시형태에 있어서, J 영역은 인간 JH 영역이다. 일 실시형태에 있어서, J 영역은 인간 Jλ 영역이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 Vλ 영역은 인간 Vλ 영역 및 인간 Vκ 영역으로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 인간 Vκ, 인간 DH 및 인간 Jκ; 인간 Vκ, 인간 DH, 및 인간 JH; 인간 Vλ, 인간 DH, 및 인간 Jλ; 인간 Vλ, 인간 DH, 및 인간 JH; 인간 Vκ, 인간 DH, 및 인간 Jλ; 인간 Vλ, 인간 DH, 및 인간 Jκ로부터 유래된 마우스 또는 인간 불변 영역 및 가변 영역을 갖는 단일 가변 도메인 항체를 발현시킨다. 구체적인 실시형태에 있어서, 재조합 인식 서열은 인용된 V, D과 J 유전자 분절 사이에 또는 인용된 V와 J 유전자 분절 사이에 생산적 재배열이 생기도록 변형된다.
일 양상에 있어서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편), 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절로 교체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 분절 및 JH 유전자 분절의 인간 Jλ 유전자 분절로 교체를 포함하는 마우스가 제공되되; 마우스는 CH1 및/또는 힌지 영역이 없다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 서열 암호화 a CH1 도메인이 없다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 힌지 영역을 암호화하는 서열이 없다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 암호화하는 서열이 없다.
구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 마우스 CH3 도메인에 부착된 마우스 CH2 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (λ 또는 κ)를 포함하는 결합 단백질을 발현시킨다.
일 양상에 있어서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열(또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편), 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절로 교체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 및 JH 유전자 분절의 인간 Jλ 유전자 분절로 교체를 암호화하는 마우스가 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 CH1 영역, 힌지 영역, CH1 및 힌지 영역, 또는 CH1 영역 및 힌지 영역 및 CH2 영역을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열의 결실을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 다음으로부터 선택된 호모다이머를 포함하는 단일 가변 도메인 결합 단백질을 만든다: (a) 인간 Vλ -마우스 CH1 - 마우스 CH2 -마우스 CH3; (b) 인간 Vλ -마우스 힌지 -마우스 CH2 -마우스 CH3; (c) 인간 Vλ -마우스 CH2 - 마우스 CH3.
일 양상에 있어서, 무능화 되거나 또는 결실된 내인성 마우스 ADAM6 자리를 포함하는, 무능화된 내인성 중쇄 면역글로불린 자리를 지니는 마우스가 제공되되, 마우스는 인간 또는 마우스 또는 인간/마우스 또는 다른 키메라 항체를 발현시키는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 마우스 게놈 내로 무작위로 통합된 전이유전자 상에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 야생형 마우스에서 발견되지 않는 에피솜(예컨대, 염색체) 상에 있다.
일 실시형태에 있어서, 마우스는 무능화된 내인성 면역글로불린 경쇄 자리를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 내인성 면역글로불린 경쇄 자리는 카파(κ) 및 람다 (λ) 경쇄 자리로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 무능화된 내인성 κ 경쇄 자리 및 무능화된 λ 경쇄 자리를 포함하되, 마우스는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 인간 면역글로불린 경쇄 도메인을 포함하는 항체를 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 도메인은 인간 κ 경쇄 도메인 및 인간 λ 경쇄 도메인으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스는 무능화된 내인성 κ 경쇄 자리를 포함하되, 마우스는 인간 Vλ 도메인을 포함하는 인간/마우스 (즉, 인간 가변/마우스 불변) 면역글로불린 중쇄 및 인간/마우스 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 인간/마우스 면역글로불린 경쇄는 마우스 Cκ를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간/마우스 면역글로불린 경쇄는 마우스 Cλ를 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ는 Cλ2이다.
일 양상에 있어서, 키메라 항체를 발현시키며 유전자 변형된 동물에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 오솔로그 또는 상동체를 발현시키는 유전자 변형된 동물이 제공된다.
일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 마우스이고, ADAM6 단백질 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 유전자 변형된 동물보다 상이한 균주인 마우스 균주로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 비단털쥐과의 설치류(예컨대, 햄스터, 뉴 월드 래트 또는 마우스, 볼)이고, ADAM6 단백질 오솔로그 또는 상동체는 쥐과의 설치류(예컨대, 트루 마우스 또는 래트, 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 벼슬나무 쥐)로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 동물은 쥐과의 설치류이며, ADAM6 단백질 오솔로그 또는 상동체는 비단털쥐과의 설치류로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 인간 가변 도메인 및 설치류의 불변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 비단털쥐과의 설치류 및 쥐과의 설치류로부터 선택되며, 구체적인 실시형태에 있어서, 비단털쥐과 및 쥐과의 설치류는 마우스이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비단털쥐과 및 쥐과의 설치류는 래트이다. 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 마우스 또는 래트로부터 선택된 동물로부터의 인간 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하며; 구체적인 실시형태에 있어서, 마우스 또는 래트는 비단털쥐과 및 쥐과로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 마우스 및 래트로부터 선택된 설치류로부터 유래된 인간 중쇄 가변 도메인, 인간 경쇄 가변 도메인 및 불변 영역 서열을 포함하되, 인간 중쇄 가변 도메인 및 인간 경쇄는 동족이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 동족은 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 도메인이 개개의 B세포의 표면 상에서 함께 가변 도메인을 존재하면서 함께 인간 경쇄 가변 도메인 및 인간 중쇄 가변 도메인을 발현시키는 단일 B 세포로부터 유래된다는 것을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 면역글로불린 자리로부터 발현된다. 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체의 중쇄 가변 도메인은 재배열된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 발현된다. 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 내인성 면역글로불린 경쇄 자리로부터 발현된다. 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 전이유전자로부터 발현된다(예컨대, 재배열되지 않은 핵산 서열로부터 유래된 재배열된 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 자리 이외의 자리에서 동물의 게놈에 통합된다). 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 전이유전자로부터 발현된다(예컨대, 내인성 면역글로불린 자리 이외의 자리에서 동물의 게놈 내로 통합된 재배열되지 않은 핵산 서열로부터 유래된 재배열된 핵산 서열).
구체적인 실시형태에 있어서, 전이유전자는 전사적으로 활성인 자리, 예컨대, ROSA26 자리, 예컨대, 뮤린(예컨대, 마우스) ROSA26 자리로부터 발현된다.
일 양상에 있어서, 인간화 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 비-인간 동물이 제공되되, 인간화 면역글로불린 중쇄 자리는 비-인간 ADAM6 서열 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된 설치류이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 마우스 ADAM6 서열에 대해 오솔로그 및/또는 상동성인 서열이되, 오솔로그 또는 상동체는 비-인간 동물에서 기능성이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택되고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된 비-인간 동물로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 상이한 마우스 종, 래트, 및 햄스터로부터 선택된 동물로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 래트이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 상이한 래트 종, 마우스, 및 햄스터로부터 선택된 설치류로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 햄스터이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 상이한 햄스터 종, 마우스, 및 래트로부터 선택된 설치류를 형성한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 쥐아목으로부터 유래되고, ADAM6 서열은 뛰는쥐상과의 설치류 및 쥐상과의 설치류로부터 선택된 동물로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐상과의 마우스이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐상과의 마우스 또는 래트 또는 햄스터로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 인간화 중쇄 자리는 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절은 하나 이상의 인간, 키메라 및/또는 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트) 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 마우스이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 래트이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 햄스터이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 불변 영역 유전자는 힌지, a CH2, 및 CH3 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 서열과 연속적이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 서열 내에 위치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄 서열은 V, D 및/또는 J 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 서열은 V 유전자 분절과 병치된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 서열은 2개의 V 유전자 분절 사이에 위치된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 ADAM6 서열은 V와 D 유전자 분절 사이에 병치된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 서열은 V와 J 유전자 분절 사이에 위치된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 ADAM6 서열은 D와 J 유전자 분절 사이에 병치된다.
일 양상에 있어서, 면역글로불린 자리로부터의 인간 Vλ 도메인을 지니는 인간 VH 도메인 동족을 발현시키는 B 세포를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되되, 비-인간 동물은 면역글로불린 자리로부터의 비-면역글로불린 비-인간 단백질을 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 비-인간 단백질은 ADAM 단백질이다. 구체적인 실시형태에 있어서, ADAM 단백질은 ADAM6 단백질 또는 상동체 혹은 오솔로그 또는 그의 기능성 단편이다.
일 실시형태에 있어서 비-인간 동물은 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트)이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐과이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐아과이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 쥐아과의 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 비-인간 단백질은 설치류 단백질이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐과이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 쥐아과이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 VH 및 VL 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 불변 도메인 서열은 힌지, CH2 a CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 Vλ 도메인은 Vκ 또는 Vλ 도메인으로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 생식선 인간 면역글로불린 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되되, 수컷 비-인간 동물의 정자는 생체내 이동 결함을 특징으로 한다. 일 실시형태에 있어서, 생체내 이동 결함은 동일 종의 암컷 비-인간 동물의 난관을 통해 자궁으로부터 이동을 위한 수컷 비-인간 동물 정자의 불능을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 없다. 구체적인 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편은 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 단백질 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 설치류이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, ADAM6 단백질 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 비-인간 서열과 연속적인 인간 면역글로불린을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 설치류이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 면역글로불린 중쇄 서열이다. 일 실시형태에 있어서, 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 하나 이상의 DH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 하나 이상의 JH 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VH 유전자 분절, 하나 이상의 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 JH 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 면역글로불린 서열은 천연 인간 레퍼토리에서 높은 빈도로 하나 이상의 VH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 VH 유전자 분절은 2개 이하 VH 유전자 분절, 3개 이하 VH 유전자 분절, 4개이하의 VH 유전자 분절, 5개 이하의 VH 유전자 분절, 6개 이하 VH 유전자 분절, 7개 이하 VH 유전자 분절, 8개 이하 VH 유전자 분절, 9개 이하 VH 유전자 분절, 10개 이하 VH 유전자 분절, 11개 이하 VH 유전자 분절, 12개 이하 VH 유전자 분절, 13개 이하 VH 유전자 분절, 14개 이하 VH 유전자 분절, 15개 이하 VH 유전자 분절, 16개 이하 VH 유전자 분절, 17개 이하 VH 유전자 분절, 18개 이하 VH 유전자 분절, 19개 이하 VH 유전자 분절, 20개 이하 VH 유전자 분절, 21개 이하 VH 유전자 분절, 22개 이하 VH 유전자 분절 또는 23개 이하의 VH 유전자 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 VH 유전자 분절은 5개의 VH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 VH 유전자 분절은 10개의 VH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 VH 유전자 분절은 15개 VH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 VH 유전자 분절은 20개 VH 유전자 분절을 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 및 VH3-74로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 및 VH4-59로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 및 VH4-39로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH1-18, VH3-23 및 VH4-39로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH3-21, VH3-23 및 VH3-30으로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, VH 유전자 분절은 VH3-23, VH3-30 및 VH4-39로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 적어도 18 VH 유전자 분절, 27 DH 유전자 분절 및 6개 JH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 적어도 39 VH 유전자 분절, 27 DH 유전자 분절 및 6개 JH 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 적어도 80 VH 유전자 분절, 27 DH 유전자 분절 및 6개의 JH 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 마우스이고, 마우스는 내인성 마우스 VH 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로 교체를 포함하되, 인간 VH 유전자 분절은 마우스 CH 영역 유전자에 작동가능하게 연결되므로, 마우스는 인간 VH 유전자 분절을 재배열하며, 인간 VH 도메인 및 마우스 CH를 포함하는 역 키메라 면역글로불린 중쇄를 발현시킨다. 일 실시형태에 있어서, 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 분절의 90 내지 100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절로 교체된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 분절은 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 19, 적어도 39 또는 적어도 80 또는 81개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절로 교체된다. 일 실시형태에 있어서, 마우스는 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 분절로 모든 마우스 DH 및 JH 분절의 교체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 분절은 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 분절은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절은 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 인간 VH 유전자 분절, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
각종 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 서열은 비-인간 동물(예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스, 래트 또는 햄스터)의 생식선 내 불변 영역과 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역은 인간, 키메라 인간/마우스 또는 키메라 인간/래트 또는 키메라 인간/햄스터, 마우스, 래트, 또는 햄스터 불변 영역이다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역은 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터) 불변 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 각종 실시형태에 있어서, 불변 영역은 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄 서열은 비-인간 동물(예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터)의 생식선 내 면역글로불린 중쇄 자리에 위치된다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄 서열은 비-인간 동물의 생식선 내 비-면역글로불린 중쇄 자리에 위치되되, 비-중쇄 자리는 전사적으로 활성인 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-중쇄 자리는 ROSA26 자리이다.
각종 양상에 있어서, 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식선 내 인간 면역글로불린 경쇄 서열(예컨대, 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 서열, 또는 하나 이상의 재배열된 VJ 서열)을 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 면역글로불린 경쇄 서열은 면역글로불린 λ 경쇄 서열이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 12 Vλ 유전자 분절 및 하나의 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 12개의 Vλ 유전자 분절 및 4개의 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 28개 Vλ 유전자 분절 및 1개의 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 28개 Vλ 유전자 분절 및 4개의 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 40개의 Vλ 유전자 분절 및 1개 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 40개 Vλ 유전자 분절 및 4개 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 비-인간 동물(예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터)의 생식선 내 불변 영역과 작동가능하게 연결된다. 일 실시형태에 있어서, 불변 영역은 인간, 키메라 인간/설치류, 마우스, 래트 또는 햄스터 불변 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 불변 영역은 마우스 또는 래트 불변 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 불변 영역은 마우스 κ 불변(mCκ) 영역 또는 래트 κ 불변(rCκ) 영역이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 불변 영역은 마우스 λ 불변(mCλ) 영역 또는 래트 λ 불변(rCλ) 영역이다. 일 실시형태에 있어서, 마우스 Cλ 영역은 마우스 Cλ2 영역이다.
일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 비-인간 동물의 생식선 내 면역글로불린 경쇄 자리에 위치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 생식선 내 면역글로불린 경쇄 자리는 면역글로불린 κ 경쇄 자리이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 생식선 내 면역글로불린 경쇄 자리는 면역글로불린 λ 경쇄 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 인간 면역글로불린 경쇄 서열은 전사적으로 활성인 비-인간 동물의 생식선 내 비-면역글로불린 경쇄 자리에 위치된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-면역글로불린 자리는 ROSA26 자리이다.
일 양상에 있어서, 인간 항체의 제조방법이 제공되되, 인간 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 세포에서 암호화된 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유래된 가변 도메인을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 단리된 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유래된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 항체이다. 일 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 중쇄만의 항체이다. 일 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 단쇄 가변 단편(예컨대, scFv)이다.
일 양상에 있어서, 항체를 만들기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 사용이 제공된다. 각종 실시형태에 있어서, 항체는 비-인간 동물로부터 단리된 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 가변 영역 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 유전자 분절을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 가변 영역 핵산 서열은 면역글로불린 경쇄 유전자 분절을 포함한다.
인간 λ 가변 도메인을 발현시키는 마우스
ADAM 단백질 활성(예컨대, ADAM6-의존적)의 손실에 기인하여 가임성을 감소시키는 변형을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물(예컨대, 마우스, 래트 등)은 내인성 비-인간, 또는(예컨대, 유전자이식) 인간, 불변 경쇄 유전자에서 인간 λ 가변 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물과 교배될 수 있다. 예를 들어, 손상된 ADAM6 유전자(또는 결실된 ADAM6 유전자), 예컨대, 인간화 면역글로불린 중쇄 자리를 지니는 동물을 포함하는 비-인간 동물, 예컨대 마우스 또는 래트는 인간 또는 비-인간(예컨대, 내인성 마우스 또는 래트) 경쇄 불변 영역 유전자에 연결된 인간 λ 분절 및 Jλ 분절을 포함하는 경쇄 자리 (내인성 또는 유전자이식)를 포함하는 마우스와 조합되되, 비-인간 동물은 ADAM-의존적 가임성을 회수하는 활성을 포함한다. ADAM-의존적 가임성을 회복하는 유전자 변형은 비-인간 동물에서, 예컨대, 인간화 중쇄를 지니는 마우스에서, 또는 인간화 λ 가변 분절을 지니는 마우스에서 있을 수 있다. 후손은 인간화 중쇄(즉, 인간 중쇄 가변 도메인을 발현시키는 것을 초래) 및 인간화 경쇄 자리(즉, 인간 또는 비-인간 λ 또는 κ 영역에 융합된 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 발현시키는 것을 초래)를 형성하는 유전자를 포함하되, 동물은 ADAM6 활성 또는 ADAM6의 오솔로그 또는 상동체의 활성이 없는 마우스에 비해 증가된 가임성을 나타낸다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 유전자 조작된 마우스는 인간 V(D)J 유전자 분절을 지니는 내인성 마우스 자리에서 재배열되지 않은 V(D)J 유전자 분절의 교체를 포함한다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 갖는 키메라 항체를 발현시킨다(예컨대, 미국 특허 제7,605,237호 참조). 대부분의 다른 보고는 무능화된 내인성 면역글로불린 자리를 갖는 마우스 내 완전한 인간 전이유전자로부터의 완전한 인간 항체를 발현시키는 마우스에 관한 것이다.
항체 경쇄는 2개의 별개의 자리: 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나에 의해 암호화된다. 마우스 항체 경쇄는 주로 κ유형이다. 마우스 항체를 만드는 마우스, 및 완전한 인간 또는 키메라 인간-마우스 항체를 만드는 변형된 마우스는 경쇄 사용에서 바이어스를 나타낸다. 인간은 또한 경쇄 바이어스를 나타내지만, 마우스에서와 같이 두드러지지 않으며; 마우스에서 κ 경쇄 대 λ 경쇄의 비는 약 95:5인 반면, 인간에서 비는 약 60:40이다. 마우스에서 더 두드러진 바이어스는 항체 다양성에 심각하게 영향을 미치는 것으로 생각되지 않는데, 마우스에서 λ 가변 자리는 처음 예에서 그렇게 다양하지 않기 때문이다. 이는 인간에서는 그렇지 않다. 인간 λ 경쇄 자리는 풍부하게 다양하다.
인간 λ 경쇄 자리는 1,000 kb 이상으로 연장되며 가변 (V) 또는 결합 (J) 분절을 암호화하는 80개 이상의 유전자를 함유한다(도 19). 인간 λ 경쇄 자리 내에서, 모든 관측된 Vλ 도메인의 절반 이상은 유전자 분절 1-40, 1-44, 2-8, 2-14 및 3-21에 의해 암호화된다. 전반적으로, 인간 Vλ 유전자 분절의 약 30개 정도는 기능성이 되는 것으로 믿어진다. 7개의 Jλ 유전자 분절이 있으며, 이 중 4개만이 대체로 기능성 Jλ 유전자 분절 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7로서 고려된다.
인간에서 λ 경쇄 자리는 마우스와 인간 둘 다의 λ 자리에 대한 구조와 유사하며, 즉, 인간 λ 경쇄 자리는 기능성 경쇄 단백질을 형성하기 위해 재조합될 수 있는 몇몇 가변 영역 유전자 분절을 가진다. 인간 λ 경쇄 자리는 대략 70개 V 유전자 분절 및 7 Jλ-Cλ 유전자 분절쌍을 함유한다. 이들 Jλ-Cλ 유전자 분절쌍 중 단지 넷 만이 기능성인 것으로 나타난다. 일부 대립 유전자에서, 제5 Jλ-Cλ 유전자 분절쌍은 알려진 바에 따르면 위유전자(Cλ6)이다. 70 Vλ 유전자 분절은 38개의 기능성 유전자 분절을 함유하는 것을 나타난다. 70 Vλ 서열은 3개의 클러스터에서 배열되며, 이중 모두는 별개의 V 유전자 패밀리 그룹의 상이한 구성원을 함유한다(클러스터 A, B 및 C; 도 19). 이는 비-인간 동물에서 인간 V 영역을 지니는 항체를 만들기 위한 상대적으로 이용되지 않은 다양성의 잠재적으로 풍부한 공급원이다.
완전히 대조적으로, 마우스 λ 경쇄 자리는 단지 2 또는 3(균주에 따라서) 마우스 Vλ 영역 유전자 분절을 함유한다(도 20). 이 이유에 대해 적어도, 마우스에서 심각한 κ바이어스는 전체 항체 다양성에 대해 특히 해로운 것으로 생각되지 않는다.
마우스 λ 경쇄 자리의 공개된 맵에 따르면, 자리는 대략 200 kb의 범위 내에서 유전자 분절의 2개의 클러스터로 본질적으로 이루어진다(도 20). 2개의 클러스터는 독립적 재배열Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 및 Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1을 가능하게 하는 V, J 및 C 유전자의 2개 세트를 함유한다. Vλ2는 모든 Jλ 유전자 분절과 재조합되는 것으로 발견되었고, Vλ1은 Cλ1과 배타적으로 재조합되는 것으로 나타난다. Cλ4는 결함있는 스플라이스 부위를 지니는 위유전자가 되는 것으로 믿어진다.
마우스 κ 경쇄 자리는 현저하게 상이하다. 마우스 κ 자리로부터 기능성 경쇄 단백질을 야기하는 재조합 사건에 참여하는 유전자 분절의 구조 및 수는 훨씬 더 복잡하다(도 21). 따라서, 마우스 λ 경쇄는 전형적인 마우스에서 항체 집단의 다양성에 크게 기여하지 않는다.
마우스에서 인간 λ 경쇄 자리의 풍부한 다양성을 활용하는 것은 특히 경쇄 V 도메인인 더 완전한 인간 레퍼토리를 위한 공급원을 초래할 가능성이 있다. 이 다양성을 이용하기 위한 이전의 시도는 마우스 게놈 내로 무작위로 포함된 인간 λ 경쇄 자리의 청크(chunk)를 함유하는 인간 전이유전자를 사용하였다(예컨대, 미국특허 제6,998,514호 및 미국특허 제7,435,871호). 이들 무작위로 통합된 전이유전자를 함유하는 마우스는 알려진 바에 의하면 완전한 인간 λ 경쇄를 발현시키지만, 그러나, 일부 경우에, 내인성 경쇄 자리 중 하나 또는 둘 다는 무결함으로 남아있다. 이 상황은 마우스의 발현된 항체 레퍼토리에서 마우스 경쇄(κ 또는 λ)와 다투는 인간 λ 경쇄 서열로서 바람직하지 않다.
대조적으로, 본 발명자는 내인성 마우스 경쇄 자리에서 교체에 의해 포함되는 마우스 경쇄 자리로부터 직접적으로 하나 이상의 λ 경쇄 핵산 서열을 발현시킬 수 있는 유전자 변형된 마우스를 기재한다. 내인성 자리로부터 인간 λ 경쇄 서열을 발현시킬 수 있는 유전자 변형된 마우스는 인간 중쇄 자리를 포함하는 마우스에 대해 추가로 교배될 수 있고, 따라서 완전한 인간인 V 영역(중 및 경)을 포함하는 항체를 발현시키기 위해 사용된다. 각종 실시형태에 있어서. V 영역은 마우스 불변 영역과 함께 발현된다. 각종 실시형태에 있어서, 내인성 마우스 면역글로불린 유전자 분절은 존재하지 않으며, V 영역은 인간 불변 영역과 함께 발현된다. 이들 항체는 수많은 적용에서, 진단적뿐만 아니라 치료적으로 유용한 것으로 증명되었다.
마우스에서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 결합 단백질을 발현시키는 각종 실시형태에 대해 다수의 이점이 실현될 수 있다. 내인성 경쇄 자리, 예를 들어, 마우스 κ 또는 λ 자리에서 인간 λ 서열을 위치시킴으로써 이점이 실현될 수 있다. 이러한 마우스로부터 만들어진 항체는 마우스 CL 영역, 구체적으로는 마우스 Cκ 또는 Cλ 영역에 융합된 인간 Vλ 도메인을 포함하는 경쇄를 가질 수 있다. 마우스는 또한 인간 CL 영역, 구체적으로는 Cκ 및/또는 Cλ 영역과 함께 사용을 위한 확인 및 클로닝에 적합한 인간 Vλ 도메인을 발현시킬 것이다. 이러한 마우스에서 B 세포 발생은 다르게는 정상이기 때문에, Cλ 또는 Cκ 영역의 내용에서 양립가능한 Vλ 도메인(체세포 돌연변이된 Vλ 도메인을 포함) 을 만들 수 있다. 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 자리에서 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 기재된다. Cκ 및/또는 Cλ 영역에 융합된 인간 Vλ 도메인을 갖는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시키는 마우스가 기재된다.
일 양상에 있어서, (1) 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절, (2) 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 기재되되, 비-인간 동물은 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 발현시킬 수 있고, ADAM6 단백질은 비-인간 동물의 수컷에서 기능성이다. 일 양상에 있어서, 인간 VH 도메인 및 비-인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 함유하는 항체를 발현시키는 유전자 변형된 비-인간 동물이 기재되되, 비-인간 동물은 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 발현시킬 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일 실시형태에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 도메인이다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편은 마우스의 생식선 내 이소성 서열에 의해 암호화된다. 일 실시형태에 있어서, ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편은 비-인간 동물의 내인성 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 내인성 경쇄 자리는 면역글로불린 λ 경쇄 자리이다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 내인성 경쇄 자리는 면역글로불린 κ 경쇄 자리이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 내인성 경쇄 자리에서 내인성 VL 및/또는 Jλ 유전자 분절이 없다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 및/또는 Jλ 유전자 분절은 Vκ 및/또는 Jκ 유전자 분절이다. 구체적인 실시형태에 있어서, VL 및/또는 Jλ 유전자 분절은 Vλ 및/또는 Jλ 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 VL 및 Jλ 유전자 분절은 하나 이상의 인간 Vλ 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절에 의해 교체된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 VL 및 Jλ 유전자 분절은 κ 유전자 분절이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 비-인간 동물의 VL 및 Jλ 유전자 분절은 λ 유전자 분절이다.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편으로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 클러스터 A의 단편은 인간 Vλ3-27로부터 인간 Vλ3-1을 통해 연장된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 클러스터 A의 단편은 인간 Vλ3-12로부터 인간 Jλ1을 통해 연장된다. 일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편으로부터 유래된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 클러스터 B의 단편은 인간 Vλ5-52로부터 인간 Vλ1-40을 통해 연장된다. 구체적인 실시형태에 있어서, 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편으로부터 및 클러스터 B의 단편으로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 적어도 12개 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 적어도 28개 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 비-인간 동물은 적어도 40 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 가임 비-인간 수컷 동물이 제공되되, 가임 비-인간 동물은 (1) 인간 Vλ 도메인 또는 인간 Vκ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄, 및 (2) 인간 VH 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 수컷 비-인간 동물은 수컷 비-인간 동물에서 기능성인 변형된 중쇄 가변 영역 자리 및 이소성 ADAM6 유전자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 수컷 비-인간 동물은 마우스이다.
일 양상에 있어서, 항원-결합 단백질을 만들기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 사용이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단백질은 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단백질은 항체이다. 일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 인간 VH 도메인 및/또는 인간 Vλ 도메인을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 조직이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 조직은 비장, 골수 또는 림프절로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 B 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 배아줄기 (ES) 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 생식 세포이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 비-인간 동물의 이배체 게놈을 포함하는 난모세포가 제공된다.
면역글로불린 κ 경쇄 자리의 불임 전사체
마우스에서 인간 면역글로불린 λ서열을 발현시키는 주제에 대한 변형은 이러한 발현을 할 수 있는 유전자 변형된 마우스의 각종 실시형태에 있어서 반영된다. 따라서, 소정의 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 인간 자리로부터 특정 비암호 서열(들)을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 내인성 κ 경쇄 자리에서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 인간 κ 경쇄 게놈 단편을 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인간 κ 경쇄 게놈 단편은 인간 Vκ 유전자 분절과 인간 Jκ 유전자 분절 사이에서 자연적으로 발견되는 비암호 서열이다.
인간 및 마우스 κ 경쇄 자리는 출발 코돈 또는 오픈 리딩 프레임 중 하나가 없는 불임 전사체를 암호화하며, κ 경쇄 자리의 전사를 조절하는 구성요소로서 간주되는 서열을 함유한다. 이들 불임 전사체는 대부분의 근위 Vκ 유전자 분절의 다운스트림에 또는 3' 및 κ 경쇄 불변 영역 유전자(Cκ)의 업스트림인 κ 경쇄 인트론 인핸서(Eκi)의 업스트림 또는 5'에 위치된 유전자간 서열로부터 생긴다. 불임 전사체는 유전자간 서열의 재배열로부터 생겨서 Cκ에 융합된 VκJκ1 분절을 형성한다.
Cκ 유전자의 κ 경쇄 자리 업스트림의 교체는 불임 전사체를 암호화하는 유전자간 영역을 제거한다. 따라서, 각종 실시형태에 있어서, 마우스 Cκ 유전자의 마우스 κ 경쇄 서열 업스트림의 인간 λ 경쇄 유전자 분절로 교체는 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 함유하지만, 불임 전사체를 암호화하지 않는 κ 경쇄 유전자간 영역이 아닌 인간화 마우스 κ 경쇄 자리를 초래한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은, 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 지니는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 인간화는 λ 경쇄 사용에서 현저한 증가와 결부된 κ 경쇄 자리의 사용에서 현저한 하락을 초래하되, 여기서 인간화는 유전자간 영역을 제거한다. 따라서, 유전자간 영역이 없는 인간화 마우스는 인간 경쇄 가변 도메인(예컨대, 인간 λ또는 κ 도메인)을 지니는 항체를 만들 수 있다는 점에서 유용하며, 자리로부터의 사용은 감소된다.
또한 전사에 대해서, 최종 인간 Vλ 유전자 분절과 제1 인간 Jλ 유전자 분절, κ 유전자간 영역 사이에 함유되는 Vλ 자리를 만들기 위한 인간 κ 유전자간 영역의 삽입과 결부된 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 지니는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 인간화가 기재되는데; 이는 κ 유전자간 영역이 없는 자리보다 더 높은 발현을 지니는 B 세포 집단을 나타낸다. 이 관측은 유전자간 영역이 내인성 λ 경쇄 자리로부터 사용을 -불임 전사체를 통해 직접적으로 또는 간접적으로-억제한다는 가설과 일치된다. 이러한 가설 하에서, 유전자간 영역을 포함하는 것은 내인성 λ 경쇄 자리에서 사용의 감소를 초래하고, 항체를 만들기 위해 변형된 (λ에서 κ로 ) 자리를 사용하는 것을 제외하고 제한된 선택으로 마우스를 이탈한다.
각종 실시형태에 있어서, 마우스 Cκ 유전자의 업스트림의 마우스 κ 경쇄 서열의 인간 λ 경쇄 서열로 교체는 전사에 대해서, 3' 대부분의 Vλ 유전자 분절의 3'비번역 영역과 제1 인간 Jλ 유전자 분절에 대한 5' 사이에 배치된 인간 κ 경쇄 유전자간 영역을 추가로 포함한다. 대안적으로, 이러한 유전자간 영역은 내인성 λ 경쇄 자리 내 결실을 만듦으로써 교체된 내인성 κ 경쇄 자리(마우스 Cκ 유전자의 업스트림)로부터 생략될 수 있다. 마찬가지로, 이 실시형태 하에서, 마우스는 인간 λ 경쇄 서열을 함유하는 내인성 κ 경쇄 자리로부터 항체를 만든다.
인간 Vλ 도메인을 발현시키기 위해 마우스를 유전자 조작하기 위한 접근
내인성 CL(예컨대 Cκ 또는 Cλ) 영역에 융합된 인간 Vλ 도메인을 갖는 경쇄를 함유하는 항체를 만드는 유전자 변형된 마우스를 만들기 위한 다양한 접근이 기재된다. 유전자 변형은 각종 실시형태에 있어서, 내인성 경쇄 자리 중 하나 또는 둘 다의 결실을 포함한다. 예를 들어, 제1 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터의 내인성 항체 레퍼토리 결실 및 인간 Vλ-Jλ유전자 분절을 지니는 제2 유전자 클러스터의 Vλ-Jλ 유전자 분절의 전체적 또는 부분적으로 교체로부터 마우스 λ 경쇄를 제거하는 것이 만들어질 수 있다. 마우스, 마우스 배아, 및 세포를 만들기 위해 유전자 변형된 마우스 배아, 세포, 및 표적화 작제물이 또한 제공된다.
하나의 내인성 Vλ-J-Cλ 유전자 클러스터의 결실 및 다른 내인성 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터의 교체는 동물에서 천연 항체 불변 영역 결합 및 기능에서 상대적으로 최소의 파괴를 사용하는데, 각종 실시형태에 있어서, 내인성 Cλ 유전자는 무결함으로 남아있기 때문에, 따라서 내인성 중쇄의 불변 영역과 관련된 정상 기능 및 능력을 보유한다. 따라서 이러한 실시형태에서, 변형은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 기능성 항체 분자의 조립을 위한 기능성 경쇄 불변 영역에 의존하는 다른 내인성 중쇄 불변 영역에 영향을 미치지 않는다. 추가로, 각종 실시형태에 있어서 변형은 내인성 중쇄 및 경쇄를 수반하는 기능성 막-결합 항체 분자의 조립체, 예컨대 마우스 Cλ 영역에 연결된 hVλ 도메인에 영향을 미치지 않는다. 적어도 하나의 기능성 Cλ 유전자가 내인성 자리에서 보유되기 때문에, 내인성 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터의 Vλ-Jλ 유전자 분절의 인간 Vλ-Jλ 유전자 분절로 교체를 함유하는 동물은 동물의 발현된 항체 레퍼토리에 존재하는 인간 Vλ-Jλ 유전자 분절을 통한 면역 반응 동안 항원에 결합될 수 있는 정상 λ 경쇄를 만들 수 있어야 한다.
결실된 내인성 마우스 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터의 개략적 도시(축적 없음)를 도 20에 제공한다. 도시되는 바와 같이, 마우스 λ 경쇄 자리는 2개의 유전자 클러스터로 유기화되며, 이들 둘 다 재조합될 수 있는 기능성 유전자 분절을 함유하여 기능성 마우스 λ 경쇄를 형성한다. 내인성 마우스 Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 유전자 클러스터는 재조합 부위에 측접한 네오마이신 카세트를 지니는 표적화 작제물(표적화 벡터 1)에 의해 결실된다. 다른 내인성 유전자 클러스터(Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4)는 재조합 부위에 측접한 하이그로마이신-티미딘 키나제 카세트를 지니는 표적화 작제물(표적화 벡터 2)에 의해 부분적으로 결실된다. 이 제2 표적화 사건에서, Cλ2-Jλ4-Cλ4 내인성 유전자 분절이 보유된다. 제2 표적화 작제물(표적화 벡터 2)은 제1 표적화 작제물(표적화 벡터 1)에서의 재조합 부위와 상이한 재조합 부위를 사용하여 구성되고, 이에 의해 성공적인 표적화가 달성된 후 선택 카세트를 선택적으로 결실시킨다. 얻어진 이중 표적화된 자리는 기능적으로 침묵화되며, 즉, 내인성 λ 경쇄는 생성될 수 없다. 이 변형된 자리는 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 삽입을 위해 사용되어 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 내인성 마우스 λ 자리를 만들 수 있고, 이에 의해 변형된 자리에서 재조합시, 동물은 내인성 마우스 Cλ 유전자 분절에 연결된 재배열된 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 λ 경쇄를 생성한다.
비기능성인 내인성 λ 유전자를 만들기 위해 마우스를 유전적으로 변형시키는 것은, 각종 실시형태에 있어서, 그것의 항체 레퍼토리에서 배타적으로 κ 경쇄를 나타내는 마우스를 초래하는데, 이는 마우스를 면역 반응에서 λ 경쇄의 역할을 평가하는데 유용하게 하고, Vλ 도메인은 아니지만 Vκ 도메인을 포함하는 항체 레퍼토리를 만드는데 유용하게 한다.
내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 재조합된 마우스 Cλ 유전자에 연결된 hV를 발현시키는 유전자 변형된 마우스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 내인성 마우스 Vλ2-Vλ3-Jλ2 유전자 분절의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로 교체의 개략적 도시(축적 없음)를 도 22a에 제공한다. 도시하는 바와 같이, 비기능성이 만들어진 내인성 마우스 λ 경쇄 자리는 재조합 부위에 측접한 네오마이신 카세트를 포함하는 표적화 작제물 (12/1-λ표적화 벡터)에 의해 교체된다. Vλ2-Vl3-Jλ2 유전자 분절은 12 hVλ 유전자 분절 및 단일 hJλ 유전자 분절을 포함하는 인간 λ 서열을 함유하는 게놈 단편으로 교체된다.
따라서, 이 제1 접근은 단일 hJλ 유전자 분절과 연속적인 내인성 λ 경쇄 자리에서 하나 이상의 hVλ 유전자 분절을 위치시킨다(도 22a).
변형된 내인성 λ 경쇄 자리에 대한 추가적인 변형은 더 많은 hVλ 유전자 분절을 삽입하기 위한 유사한 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 부가 인간 hVλ 유전자 분절의 진행적 삽입을 위해 사용되는 2개의 부가적인 표적화 작제물(+16-λ 및 +12-λ 표적화 벡터)의 개략적 도시를 도 23a에서 제공한다. 도시한 바와 같이, 특이적 인간 hVλ 유전자 분절을 함유하는 부가적인 게놈 단편은 인간 λ 경쇄 서열의 이전의 삽입에 의해 제공된 상동성을 사용하여 연속적 단계에서 변형된 내인성 λ 경쇄 자리 내로 삽입된다. 도시된 각각의 표적화 작제물에 의한 재조합시, 순차저 방식에서, 28개의 부가적인 hVλ 유전자 분절이 변형된 내인성 λ 경쇄 자리 내로 삽입된다. 이는 마우스 Cλ 유전자에 연결된 인간 Vλ, Jλ 유전자 분절을 포함하는 λ 경쇄 단백질을 생성하는 키메라 자리를 만든다. 마우스 λ 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 삽입하기 위한 상기 접근은 Cλ2-Jλ4-Cλ4 유전자 분절의 다운스트림에 위치된 인핸서를 유지한다(표기된 Enh 2.4, Enh 및 Enh 3.1 도 22a 및 도 23a). 이 접근은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 단일의 변형된 대립 유전자를 초래한다(도 25a).
내인성 마우스 λ 경쇄 자리로부터 이러한 유전자를 발현시키는 마우스를 만들기 위한 조성물 및 방법을 포함하여, 마우스 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 hVλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 경쇄를 발현시키는 마우스를 만들기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 방법은 하나의 내인성 마우스 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터 비기능성(예컨대, 표적화된 결실에 의함)을 선택적으로 만드는 단계, 및 마우스에서 hVλ 도메인을 발현시키는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 hVλ 및 Jλ 유전자 분절을 사용하는 단계를 포함한다.
대안적으로, 제2 접근에서, 인간 λ 경쇄 유전자 분절은 내인성 κ 경쇄 자리에 위치될 수 있다. 유전자 변형은, 각종 실시형태에 있어서, 내인성 κ 경쇄 자리의 결실을 포함한다. 예를 들어, 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 내인성 항체 레퍼토리로부터 마우스 κ 경쇄를 제거하기 위해 결실이 만들어질 수 있다. 마우스, 마우스 배아, 및 세포를 만들기 위한 유전자 변형된 마우스 배아, 세포, 및 표적화 작제물이 또한 제공된다.
상기 언급한 이유로, 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 결실은 상대적으로 최소의 파괴를 사용한다. 결실된 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 개략적 도시(축적 없음)를 도 21에 제공한다. 내인성 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 각각 부위-특이적 재조합 부위를 사용하는 2개의 정확하게 위치된 표적화 벡터 사이의 마우스 서열 위치의 재조합 효소-매개 결실을 통해 결실된다. 제1 표적화 벡터(Jκ 표적화 벡터)는 제1 표적화 사건에서 사용되어 마우스 Jκ 유전자 분절을 결실시킨다. 제2 표적화 벡터(Vκ 표적화 벡터)는 대부분의 원위 마우스 Vκ 유전자 분절의 5'에 위치된 서열을 결실시키는 제2의 순차적 표적 사건에서 사용된다. 표적화 벡터는 둘 다 부위-특이적 재조합 부위를 함유하며, 이에 의해 성공적인 표적화가 달성된 후 선택 카세트 둘 다의 그리고 모든 개재된 마우스 κ 경쇄 서열을 선택적으로 결실시킨다. 얻어진 결실된 자리는 기능적으로 침묵되며, 즉, 내인성 κ 경쇄는 생성될 수 없다. 이 변형된 자리는 hVλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 내인성 마우스 κ 자리를 만들기 위한 hVλ 및 Jλ 유전자 분절의 삽입을 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 변형된 자리에서 재조합시, 동물은 내인성 마우스 Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 재배열된 hVλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 λ 경쇄를 생성한다. 인간 λ 경쇄 서열을 포함하는 다양한 표적화 벡터는 이 결실된 마우스 κ 자리와 함께 사용되어 마우스 Cκ 영역에 작동가능하게 연결된 인간 λ 유전자 분절을 함유하는 혼성 경쇄 자리를 만들 수 있다.
따라서, 제2 접근에서 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 단일 인간 Jλ 유전자 분절과 연속적인 마우스 κ 경쇄 자리에서 위치된다(12/1-κ 표적화 벡터, 도 22b).
각종 실시형태에 있어서, 이 접근에 대한 변형은 마우스 항체 레퍼토리 내에서 마우스 κ 자리로부터 인간 λ 경쇄 서열의 사용을 최적화하기 위해 유전자 분절 및/또는 조절 서열을 첨가시킬 수 있다.
제3 접근에서, 하나 이상의 hVλ 유전자 분절은 4개의 hJλ 유전자 서열과 연속적인 마우스 κ 경쇄 자리에 위치된다(12/4-κ 표적화 벡터 도 22b).
제3 접근에서, 하나 이상의 hVλ 유전자 분절은 인간 κ 유전자간 서열 및 단일 hJλ 유전자 서열과 연속적인 마우스 κ 경쇄 자리에서 위치된다(12(κ)1-κ 표적화 벡터, 도 22b).
제4 접근에서, 하나 이상의 hVλ 유전자 분절은 인간 κ 유전자간 서열 4개의 hJλ 유전자 서열과 연속적인 마우스 κ 경쇄 자리에 위치된다(12(κ)4- κ 표적화 벡터 도 22b).
마우스 κ 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 삽입하기 위한 모든 상기 접근은 Cκ 유전자의 업스트림의 κ인트론 인핸서 요소 (Eκi로 표기됨, 도 22b 및 도 23b) 및 Cκ 유전자의 다운스트림의 3' κ인핸서(Ek33'으로 표기됨 도 22b 및 도 23b)를 유지한다. 접근은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 4개의 별개의 변형된 대립 유전자를 초래한다(도 25b).
각종 실시형태에 있어서, 유전자 변형된 마우스는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리의 넉아웃을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, λ 경쇄 자리는 Vλ2 내지 Jλ2 범위의 영역, 및 Vλ1 내지 Cλ1 범위의 영역을 결실시키는 전략에 의해 넉아웃된다(도 20). 내인성 λ 도메인을 발현시키기 위한 내인성 λ 경쇄 자리의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 임의의 전략은 본 개시내용에서 실시형태와 함께 사용에 적합하다.
유전자 변형된 마우스로부터의 람다 도메인 항체
마우스 κ 또는 λ 경쇄 자리 중 하나에서 인간 λ 서열을 포함하는 마우스는 마우스 CL(Cκ 또는 Cλ) 영역에 융합된 hVλ 영역을 포함하는 경쇄를 발현시킬 것이다. 이들은 (a) 기능적으로 침묵화된 경쇄 자리(예컨대, 내인성 마우스 κ 또는 λ 경쇄 자리의 넉아웃)를 포함하는 마우스; (b) 내인성 마우스 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결된 hV 및 hJ 유전자 분절을 포함하는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 포함하는 마우스; (c) 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 hVκ 및 hJκ 유전자 분절을 포함하는 내인성 마우스 κ 경쇄 자리를 포함하는 마우스; (d) 하나의 κ 대립 유전자가 hVκ 및 hJκ를 포함하고; 나머지 κ 대립 유전자는 hVλ 및 hJλ를 포함하며; 하나의 κ 대립 유전자는 hVλ 및 hJλ를 포함하고, 하나의 λ 대립 유전자는 침묵화되거나 또는 넉아웃되거나, 또는 λ 대립유전자는 둘 다 hVλ 및 hJλ를 포함하는; 2개의 중쇄 대립 유전자가 각각이 hVH, hDH, 및 hJH를 포함하는 마우스와 유리하게 교배된다.
Cκ 또는 Cλ중 하나와 관련하여 발현된 hVλ 도메인을 포함하는 항체는 hVλ 도메인을 암호화하는 핵산을 인간 Cλ 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 작제물 내로 클로닝시킴으로써 완전한 인간 항체를 만드는데 사용된다. 얻어진 발현 작제물은 hCλ에 융합된 완전한 hVλ 도메인을 나타내는 항체를 발현시키는데 적합한 숙주 세포 내로 형질감염된다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 위해 제공되고, 본 발명자들이 이들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하려고 의도되는 것은 아니다. 달리 특정되지 않는 경우, 온도는 섭씨로 나타내고 압력은 대기압 근처이다.
실시예 1. 마우스 면역글로불린 유전자의 인간화
마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리의 인간화를 위해 13개의 상이한 BAC 표적화 벡터(BACvec)를 조작하기 위해 인간 및 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC)를 사용하였다. 표 1 및 표 2는 각각 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리의 인간화에 사용되는 모든 BACvec의 작제를 위해 수행된 단계의 상세한 설명을 기술한다.
인간 및 마우스 BAC의 확인. BAC 라이브러리에 의해 스팟팅된 필터의 혼성화(하이브리드화) 또는 마우스 BAC 라이브러리 DNA 풀을 스크리닝하는 PCR에 의해 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리의 5' 및 3' 말단에 걸친 마우스 BAC를 확인하였다. 관심 있는 영역에 상응하는 프로브를 사용하는 표준 조건 하에 필터를 하이브리드화하였다. 관심 있는 표적화된 영역을 플랭킹하는 독특한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 라이브러리 풀을 스크리닝하였다. 동일한 프라이머를 사용하는 부가적인 PCR을 수행하여 소정의 웰을 디콘볼루션하고 관심 있는 상응하는 BAC를 단리하였다. 129 SvJ 마우스 ES 세포(인사이트 제네믹스(Incyte Genomics)/인비트로겐(Invitrogen))로부터 BAC 필터 및 라이브러리 풀 둘 다를 생성하였다. PCR 기반 방법에 의해 인간 BAC 라이브러리 풀(Caltech 라이브러리, 인비트로겐)을 스크리닝함으로써 BAC 라이브러리(Caltech B, C, 또는 D 라이브러리 및 RPCI-11 라이브러리, 리서치 제네믹스(Research Genetics)/인비트로겐)에 의해 스팟팅된 필터의 하이브리드화에 의해 또는 BAC 말단 서열 데이터베이스(Caltech D 라이브러리, TIGR)를 사용하여 전체 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리를 커버하는 인간 BAC를 확인하였다.
박테리아 상동성 재조합 및 결찰에 의한 BACvec의 작제. 박테리아 상동성 재조합(BHR)을 기재된 바대로 수행하였다(Valenzuela et al., 2003; Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P., and Stewart, A.F. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). 대부분의 경우에, PCR 유도 상동성 박스를 클로닝된 카세트에 결찰한 후 결찰 생성물을 겔 단리하고 표적 BAC를 보유하는 BHR 경쟁적 박테리아에 전기천공하여 선형 단편을 생성하였다. 적절한 항생제 페트리 접시에서의 선택 후, 정확하게 재조합된 BAC를 신규한 접합부 둘 다에 걸쳐 PCR에 의해 확인한 후 펄스장 겔에서 제한 분석하고(Schwartz, D.C., and Cantor, C.R. (1984). Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75), 인간 서열에 걸쳐 분포된 프라이머를 사용하여 스팟 확인하였다.
면역글로불린 중쇄 자리의 인간화의 초기 단계에 대해 3개의 순차적 BHR 단계를 사용하여 3hVH BACvec를 작제하였다(도 4a 및 표 1). 제1 단계(단계 1)에서, 마우스 면역글로불린 중쇄 자리(HB1)에 상동성인 영역, 박테리아에서 카나마이신 내성 및 동물 세포(kanR)에서 G418 내성을 부여하는 유전자 및 부위 특이적 재조합 부위(예컨대, loxP)를 포함하는 인간 VH1-3 유전자 분절로부터 BAC 업스트림에 인간 부모로 카세트를 도입한다. 제2 단계(단계 2)에서, 마우스 면역글로불린 중쇄 자리(HB2)에 상동성인 제2 영역 및 박테리아에서 스펙티노마이신(specR)에 내성을 부여하는 유전자를 포함하는 최종 JH 분절로부터 바로 다운스트림에 제2 카세트를 도입한다. 이 제2 단계는 JH6 및 BAC 벡터 클로르암페니콜 내성 유전자(cmR)로부터 다운스트림에 인간 면역글로불린 중쇄 자리 서열을 결실시키는 것을 포함한다. 제3 단계(단계 3)에서, 제1 2단계 동안 첨가되고 상동성의 2개의 영역(HB1 및 HB2)을 통해 BHR에 의해 마우스 BAC(B2)로 통합된 I-CeuI 부위를 사용하여 이중 변형된 인간 BAC(B1)를 이후 선형화하였다. 원하는 생성물에 특이적이도록 제1(cm/kan), 제2(spec/kan) 및 제3(cm/kan) 단계에 대한 약물 선택을 설계한다. 제한 효소에 의한 분해 후 펄스장 겔 전기영동(PFGE)에 의해 변형된 BAC 클론을 분석하여 적절한 작제를 결정하였다(도 4b).
유사한 방식으로, 중쇄 및 κ 경쇄 자리의 인간화에 12개의 부가적인 BACvec를 조작하였다. 몇몇 경우에, 선택 가능한 마커의 조심스런 배치와 함께 BHR에 의한 부모 BACvec 둘 다로의 희귀한 제한 부위의 도입을 통해 2개의 큰 BAC를 결합시키기 위해 BHR 대신에 BAC 결찰을 수행하였다. 이는 특이적 약물 마커 조합에 의한 선택 시 원하는 결찰 생성물의 생존에 허용된다. (상기 기재된 바대로) BHR에 의해 얻은 것과 유사한 방식으로 희귀한 제한 효소에 의한 분해 후 결찰에 의해 얻은 재조합 BAC를 확인하고 스크리닝하였다.
배아줄기(ES) 세포의 변형 및 마우스의 생성. 기재된 바대로 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 방법을 사용하여 ES 세포(F1H4) 표적화를 수행하였다(Valenzuela et al., 2003). 배반포(Valenzuela et al., 2003) 또는 8세포 주사(Poueymirou et al., 2007)에 의해 변형된 ES 세포로부터의 마우스의 유도가 기재되어 있다. PCR 기반 검정(예컨대, 도 3a, 도 3b 및 도 3c)에서 독특한 세트의 프로브 및 프라이머를 갖는 ES 세포 또는 마우스로부터 DNA를 스크리닝함으로써 표적화된 ES 세포 및 마우스를 확인하였다. 리제네론 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)가 모든 마우스 연구를 감독하고 승인하였다.
핵형 분석 및 형광 인시츄 하이브리드화(FISH). 코리엘 셀 레포지토리즈(Coriell Cell Repositories)(Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ)에 의해 핵형 분석을 수행하였다. 기재된 바대로 표적화된 ES 세포에서 FISH를 수행하였다(Valenzuela et al., 2003). 형광 표지된 dUTP 뉴클레오타이드 스펙트럼 오렌지 또는 스펙트럼 그린(Vysis)에 의해 틈 번역(인비트로겐)에 의해 마우스 BAC DNA 또는 인간 BAC DNA에 상응하는 프로브를 표지화하였다.
면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리. 모든 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 연속적 마우스 게놈 서열의 약 3백만개의 염기쌍(Mb)의, 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 기술(예컨대, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al., 2003 참조)을 이용하여 동일한 인간 유전자 분절(도 1a 및 표 1)을 포함하는 연속적 인간 게놈 서열의 약 1개의 Mb의 직접 교체에 의해 9개의 순차 단계로 중쇄 자리의 가변 영역의 인간화를 성취하였다.
JH 유전자 분절과 불변 영역 유전자 사이의 인트론(J-C 인트론)은 전사 인핸서(Neuberger, M.S. (1983). Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. Embo J 2, 1373-1378), 이어서 아이소토프 스위칭 동안 재조합에 필요한 단순한 반복 영역(Kataoka, T., Kawakami, T., Takahashi, N., and Honjo, T. (1980). Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 919-923)을 포함한다. 마우스 내의 인간화 중쇄 자리의 효과적인 발현 및 유형 스위칭 둘 다를 보존하기 위해 마우스 중쇄 인트론 인핸서를 유지시키고 도메인을 스위칭하도록 인간 VH-DH-JH 영역과 마우스 CH 영역 사이의 접합부(근위 접합부)가 선택된다. 모든 교체에서의 이것 및 후속 접합부의 정확한 뉴클레오타이드 위치는 합성된 올리고뉴클레오타이드에 의해 구동된 박테리아 상동성 재조합을 이용하는 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 방법(상기 참조)의 이용에 의해 가능하다. 따라서, 근위 접합부는 최종 JH 유전자 분절로부터 약 200bp 다운스트림에 위치하고, 원위 접합부는 인간 자리의 가장 5'인 VH 유전자 분절의 700개의 업스트림에 그리고 J558.55로도 공지된 마우스 VH1-86 유전자 분절로부터 약 9kb 다운스트림에 위치한다. 마우스 VH1-86(J558.55) 유전자 분절은, 표적화된 129개의 대립 유전자에서 비록 빈약한 RSS 서열을 갖지만, C57BL/6 마우스에서 위유전자이지만 잠재적으로 활성인 것으로 보고된 가장 원위인 중쇄 가변 유전자 분절이다. 마우스 중쇄 자리의 원위 말단은 보고에 의하면 자리 발현 및/또는 재배열을 조절하는 제어 요소를 포함할 수 있다(Pawlitzky et al., 2006).
약 75kb의 마우스 상동성 부문을 사용하여 마우스 게놈 서열의 병존하는 16.6kb 결실과 함께, 마우스 IgH 자리의 근위 말단으로 삽입된 3개의 VH, 모든 27개의 DH 및 9개의 JH 인간 유전자 분절을 포함하는 인간 중쇄 자리의 144kb의 근위 말단을 사용하여 인간 면역글로불린 DNA 서열의 마우스로의 제1 삽입을 성취하였다(단계 A, 도 2a; 벨로시뮨 및 3, 3hVH). 0.2%의 빈도로 발생하는(표 3) 단일 단계(단계 A)에서 이 큰 144kb 삽입 및 수반하는 16.6kb 결실을 수행하였다. 양 측면에 있는 결실된 마우스 서열 및 삽입된 인간 서열 내에 프로브를 사용하여 천연 대립 유전자 손실(LONA) 검정(Valenzuela et al., 2003)에 의해 정확히 표적화된 ES 세포를 점수 매기고, 전체 삽입체에 걸친 다수의 프로브를 사용하여 큰 인간 삽입체의 통합성을 검증하였다(도 3a, 도 3b 및 도 3c). 많은 라운드의 순차적인 ES 세포 표적화가 예상되므로, 이 단계 및 모든 후속 단계에서의 표적화된 ES 세포 클론을 핵형 분석(상기 참조)으로 처리하고, 20개 중 적어도 17개의 스프레드에서 정상 핵형을 나타내는 이 클론만이 후속 단계에 사용되었다.
중쇄 자리의 원위 말단에서 19kb 결실을 생성하는 BACvec로 단계 A로부터의 표적화된 ES 세포를 재표적화하였다(단계 B, 도 2a). 단계 A의 BACvec에 포함된 네오마이신 내성 유전자(neo)와 반대로, 단계 B BACvec는 하이그로마이신 내성 유전자(hyg)를 포함하였다. 동일한 염색체에 대한 성공적인 표적화 시, VH1-86 이외의 모든 마우스 VH 유전자 분절 및 DQ52 이외의 모든 DH 유전자 분절을 포함하는 마우스 중쇄 가변 유전자 자리의 대략 3개의 Mb, 및 2개의 내성 유전자가 loxP 부위에 의해 플랭킹되고; DQ52 및 모든 마우스 JH 사슬 유전자 분절이 단계 A에서 결실되도록 2개의 BACvec로부터의 내성 유전자를 설계한다. 고 G418로 동형접합성에 3hVH 근위 카세트를 구동하고(Mortensen, R.M. et al. (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell Biol 12, 2391-2395), 원위 hyg 카세트의 운명에 따라 동일한 염색체에서 이중 표적화된 ES 세포 클론을 확인하였다. 약물 선택의 부재 하에서도 고 효율(약 11% 이하)의 CRE 재조합효소의 일시적인 발현에 의해 ES 세포에서 loxP 부위에 의해 플랭킹되는 방식으로 변형된 크기가 4개의 Mb인 마우스 분절을 성공적으로 결실시켰다(Zheng, B. et al. (2000) Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20, 648-655). 유사한 방식으로, 본 발명자들은 일시적인 CRE 발현 이후 ES 세포 클론의 8%에서 3개의 Mb 결실을 성취하였다(단계 C, 도 2a; 표 3). 결실된 마우스 서열의 말단에서의 프로브를 사용한 LONA 검정, 및 neo 및 hyg의 손실 및 유일한 남은 loxP 부위를 포함하는 결실점을 따른 PCR 생성물의 존재에 의해 결실을 점수매겼다. 추가로, 형광 인시츄 하이브리드화(데이터 표시 생략)에 의해 결실을 확인하였다.
인간 중쇄 가변 영역의 나머지를 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 방법(단계 E-H, 도 2b)을 이용하여 일련의 5 단계에서 3hVH 대립 유전자에 첨가하고, 각각의 단계는 210kb 이하의 인간 유전자 서열의 정확한 삽입을 포함하였다. 각각의 단계의 경우, 각각의 새로운 BACvec의 근위 말단은 이전의 단계의 가장 원위인 인간 서열과 중첩하도록 설계되고, 각각의 새로운 BACvec의 원위 말단은 단계 A에서 사용된 마우스 상동성의 동일한 원위 영역을 포함하였다. 단계 D, F 및 H의 BACvec는 neo 선별 카세트를 포함하고, 단계 E 및 G의 BACvec는 hyg 선별 카세트를 포함하고, 따라서 G418과 하이그로마이신 사이에 선택이 교대된다. 3hVH 혼성 대립 유전자의 원위 loxP 부위에 걸쳐 독특한 PCR 생성물의 손실에 의해 단계 D에서의 표적화를 평가하였다. 이전의 선별 카세트의 손실에 의해 단계 E 내지 I의 표적화를 평가하였다. 최종 단계(단계 I, 도 2b)에서, Frt 부위를 양 측면에 지닌 neo 선별 카세트(McLeod, M. et al. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367)를 일시적인 FLPe 발현(Buchholz, F. et al. (1998) Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662)에 의해 제거하였다. 단계 D, E 및 G에 대한 BACvec의 인간 서열은 각각 2개의 부모 인간 BAC로부터 유래하고, 단계 F 및 H로부터의 것은 단일 BAC 유래이다. 삽입된 인간 서열에 걸친 다수의 프로브를 사용하여 모든 단계에서 인간 서열의 보유가 확인되었다(상기 기재된 바대로, 예컨대 도 3a, 도 3b 및 도 3c). 정상 핵형 및 생식선 가능성을 갖는 이 클론만이 각각의 단계에서 정방향으로 운반되었다. 최종 단계로부터의 ES 세포는 9개의 순차 조작 후 여전히 생식선에 기여할 수 있었다(표 3). 각각의 중쇄 대립 유전자에 대한 마우스 동형접합이 실행 가능하고, 건강해 보이고, 실질적인 야생형 체액성 면역체계를 입증하였다(실시예 3 참조).
면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 자리. 중쇄와 유사한 방식으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하는 약 3개의 Mb의 마우스 서열의, 근위 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하는 약 0.5 Mb의 인간 서열의 직접 교체에 의해 8개의 순차적 단계에서 κ 경쇄 가변 영역을 인간화하였다(도 1b; 표 2 및 표 4).
인간 κ 경쇄 자리의 가변 영역은 800kb 스페이서로 분리된 2개의 거의 동일한 400kb 반복부를 포함한다(Weichhold, G.M. et al. (1993) The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity. Genomics 16, 503-511). 반복부가 너무 유사하므로, 근위 반복부를 사용하여 마우스에서 거의 모든 자리 다양성이 재현될 수 있다. 추가로, 원위 반복부를 미싱한 κ 경쇄 자리의 천연 인간 대립 유전자가 보고되어 있다(Schaible, G. et al. (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals. Hum Genet 91, 261-267). 본 발명자들은 약 3개의 Mb의 마우스 κ 경쇄 가변 유전자 서열을 약 0.5 Mb의 인간 κ 경쇄 가변 유전자 서열로 교체하여 모든 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 근위 인간 Vκ 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절로 효과적으로 교체하였다(도 2c 및 도 2d; 표 2 및 4). 중쇄 자리에 대해 실시예 1에 기재된 방법과 반대로, 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하는 전체 마우스 Vκ 유전자 영역은 3단계 과정에서 결실된 후 임의의 인간 서열을 첨가하였다. 처음에, neo 카세트를 가변 영역의 근위 말단에 도입하였다(단계 A, 도 2c). 다음에, hyg 카세트를 κ 자리의 원위 말단에 삽입하였다(단계 B, 도 2c). LoxP 부위는 각각의 선별 카세트 내에 다시 위치하여 CRE 처리는 내성 유전자 둘 다를 따라 남은 3개의 Mb의 마우스 Vκ 영역의 결실을 유도하였다(단계 C, 도 2c).
전체 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 크기가 약 480kb인 인간 게놈 단편을 4개의 순차적 단계로 삽입하였고(도 2d; 표 2 및 4), 중쇄에 사용된 것과 유사한 방법을 이용하여 150kb 이하의 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 단일 단계에서 삽입하였다(실시예 1 참조). 일시적인 FLPe 발현에 의해 최종 하이그로마이신 내성 유전자를 제거하였다. 중쇄에서처럼, 매 단계 후 전체 인간 삽입체의 통합성, 정상 핵형 및 생식선 가능성에 대해 표적화된 ES 세포 클론을 평가하였다. 각각의 κ 경쇄 사슬 대립 유전자에 대한 마우스 동형접합이 생성되고 건강하고 정상 외관을 갖는 것으로 관찰되었다.
실시예 2. 복수의 인간화 면역글로불린 대립 유전자의 조합에 의한 완전한 인간화 마우스의 생성
여러 지점에서, 실시예 1에 기재된 인간 면역글로불린 중쇄 또는 κ 경쇄 가변 레퍼토리의 일부를 보유하는 ES 세포를 미량주사하고 생성된 마우스를 사육하여 인간 생식선 면역글로불린 레퍼토리의 점진적으로 더 큰 분획을 갖는 복수의 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 생성하였다(표 5; 도 5a 및 도 5b). 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1(V1) 마우스는 18개의 인간 VH 유전자 분절 및 16개의 인간 Vκ 유전자 분절과 조합된 모든 인간 DH 및 JH 유전자 분절 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 보유한다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2(V2) 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표)(V3) 마우스는 각각 전체 39개의 VH 및 30개의 Vκ, 및 80개의 VH 및 40개의 Vκ를 보유하는 증가한 가변 레퍼토리를 갖는다. 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 분절, 및 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 암호화하는 게놈 영역이 완전히 교체되므로, 임의의 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에 의해 제조된 항체는 마우스 불변 영역에 연결된 인간 가변 영역을 포함한다. 마우스 λ 경쇄 자리는 모든 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 비접촉으로 남고, 다양한 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) κ 경쇄 자리의 발현 효율에 대한 비교자로서 작용한다.
실시예 1에 기재된 대립 유전자의 하위집단으로부터 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 인간화 둘 다에 대한 마우스 이중 동형접합을 생성하였다. 이중 동형접합 마우스를 생성하기 위해 교배 과정 동안 관측된 모든 유전자형은 거의 멘델 비율로 나타났다. 각각의 인간 중쇄 대립 유전자에 대한 수컷 후손 동형접합은 가임성 감소를 나타냈다. 가임성 감소는 마우스 ADAM6 활성 손실로부터 생겼다. 마우스 중쇄 가변 유전자 자리는 2개의 임베딩된 기능성 ADAM6 유전자(ADAM6a 및 ADAM6b)를 포함한다. 마우스 중쇄 가변 유전자 자리의 인간화 동안, 삽입된 인간 게놈 서열은 ADAM6 위유전자를 포함한다. 마우스 ADAM6은 가임성에 필요할 수 있고, 따라서 인간화 중쇄 가변 유전자 자리에서의 마우스 ADAM6 유전자의 결손은 인간 위유전자의 존재에도 불구하고 이 마우스에서 가임성을 감소시킬 수 있다. 실시예 7-9는 다시 인간화 중쇄 가변 유전자 자리로의 결실된 마우스 ADAM6 유전자의 정확한 교체, 및 인간화 중쇄 면역글로불린 자리를 갖는 마우스에서 야생형 수준의 가임성의 회복을 기술한다.
실시예 3. 인간화 면역글로불린 유전자를 갖는 마우스에서의 림프구 집단
유세포 분석기에 의해 3개의 상이한 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서의 성숙 B 세포 집단을 평가하였다.
간단히 말하면, 표준 방법을 이용하여 골수, 비장 및 흉선으로부터의 세포 현탁액을 제조하였다. 세포를 BD 파민겐(Pharmingen) FACS 염색 완충제 중에 5x105개 세포/㎖로 재현탁시키고, 항마우스 CD16/32(BD Pharmingen)로 차단하고, 적절한 항체 칵테일로 염색하고 모든 제조업자의 지시에 따라 BD 사이토픽스(Cytofix)(상표명)로 고정하였다. 최종 세포 펠렛을 0.5㎖ 염색 완충제 중에 재현탁시키고 BD FACSCalibur(상표명) 및 BD CellQuest Pro(상표명) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 항체(BD Pharmingen)를 질량 희석액/칵테일 중에 제조하고 0.5㎎/105개 세포의 최종 농도로 첨가하였다. 골수(A-D) 염색에 대한 항체 칵테일은 하기와 같다: A: 항마우스 IgMb-FITC, 항마우스 IgMa-PE, 항마우스 CD45R(B220)-APC; B: 항마우스 CD43(S7)-PE, 항마우스 CD45R(B220)-APC; C: 항마우스 CD24(HSA)-PE; 항마우스 CD45R(B220)-APC; D: 항마우스 BP-1-PE, 항마우스 CD45R(B220)-APC. 비장 및 서혜부 림프절(E-H) 염색에 대한 항체 칵테일은 하기와 같다: E: 항마우스 IgMb-FITC, 항마우스 IgMa-PE, 항마우스 CD45R(B220)-APC; F: 항마우스 Ig, 
1, 
2, 
3 경쇄-FITC, anti 마우스 Igκ 경쇄-PE, 항마우스 CD45R(B220)-APC; G: 항마우스 Ly6G/C-FITC, 항마우스 CD49b(DX5)-PE, 항마우스 CD11b-APC; H: 항마우스 CD4(L3T4)-FITC, 항마우스 CD45R(B220)-PE, 항마우스 CD8a-APC. 도 6에 결과가 도시되어 있다.
동형접합 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스의 비장 또는 림프절로부터 단리된 림프구를 마커 B220 및 IgM의 표면 발현을 위해 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다(도 6). 시험된 모든 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 B220+ IgM+ 성숙 B 세포 집단의 크기는 이들이 포함한 VH 유전자 분절의 수와 무관하게 야생형 마우스와 실질적으로 동일하였다. 또한, 동형접합 혼성 인간화 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 마우스, 심지어 오직 3개의 VH 유전자 분절, 그러나 정상 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리를 갖는 마우스 또는 동형접합 혼성 인간화 κ 경쇄 자리를 포함하고 정상 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 갖는 마우스는 또한 이의 말초 구획(비도시)에서 정상 수의 B220+ IgM+ 세포를 가졌다. 이 결과는 인간 가변 유전자 분절 및 마우스 불변 영역을 갖는 키메라 자리가 성숙 B 세포 구획을 완전히 이동시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 중쇄 또는 κ 경쇄 자리에서의 가변 유전자 분절의 수 및 이에 따른 항체 레퍼토리의 이론적 다양성은 성숙 B 세포의 야생형 집단을 생성시키는 능력과 상관되지 않는다. 반대로, 무작위로 통합된 완전 인간 면역글로불린 전이유전자 및 비활성화 마우스 면역글로불린 자리를 갖는 마우스는 이 구획에서 감소한 B 세포수를 갖고, 결핍도는 전이유전자에 포함된 가변 유전자 분절의 수에 따라 달라진다(Green, L.L., and Jakobovits, A. (1998). Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J Exp Med 188, 483-495). 이는 "인시츄 유전자 인간화" 전략이 "넉아웃-플러스-형질전환" 접근법에서 성취되는 무작위로 통합된 전이유전자와 기본적으로 다른 기능성 결과를 생성한다는 것을 나타낸다.
대립유전자 배제 및 자리 선택. 상이한 버전의 인간화 면역글로불린 중쇄 자리에 이형접합인 마우스에서 대립유전자 배제를 유지시키는 능력을 조사하였다.
129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합성 배아 유래의 F1 ES 세포주(F1H4(Valenzuela et al., 2003))에서 면역글로불린 자리의 인간화를 수행하였다. 인간 중쇄 생식선 가변 유전자 서열을 IgMa 단상형을 보유하는 129S6 대립 유전자로 표적화하고, 비변형 마우스 C576BL/6N 대립 유전자는 IgMb 단상형을 보유한다. IgMa 또는 IgMb 대립 유전자에서 발견되는 다형에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석기에 의해 IgM의 이 대립유전자 형태를 구별할 수 있다. 도 6(바닥 줄)에 도시된 것처럼, 각각의 버전의 인간화 중쇄 자리에 대해 이형접합인 마우스에서 확인된 B 세포만이 IgMa(인간화 대립 유전자) 또는 IgMb(야생형 대립 유전자)인 단일의 대립 유전자를 발현한다. 이는 대립유전자 배제에 관여한 기전이 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 온전하다는 것을 나타낸다. 또한, 인간화 대립 유전자(IgMa)에 양성인 B 세포의 상대 수는 존재하는 VH 유전자 분절의 수에 거의 비례한다. 인간화 면역글로불린 자리는 18개의 인간 VH 유전자 분절을 갖는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1 이형접합체 마우스에서 대략 B 세포의 30%로 발현되고 각각 39개 및 80개의 인간 VH 유전자 분절을 갖는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2 및 3(비도시) 이형접합체 마우스에서 B 세포의 50%로 발현되었다. 특히, 인간화 대 야생형 마우스 대립 유전자를 발현하는 세포의 비율(벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1 마우스의 경우 0.5 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2 마우스의 경우 0.9)은 인간화 대 야생형 자리에 포함된 가변 유전자 분절의 수의 비율(벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1 마우스의 경우 0.2 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 2 마우스의 경우 0.4)보다 크다. 이는 대립 유전자 선택의 확률이 하나 또는 다른 염색체의 무작위 선택과 임의의 특정한 V 분절 RSS의 무작위 선택 사이의 중간이라는 것을 나타낼 수 있다. 추가로, 모두는 아니지만 B 세포의 분획이 존재할 수 있고, 1개의 대립 유전자는 재조합에 접근 가능해지고, 이 과정을 완료하고, 다른 대립 유전자가 접근 가능해지기 전에 재조합을 정지한다. 또한, 혼성 인간화 중쇄 자리 또는 야생형 마우스 중쇄 자리 유래의 표면 IgM(sIgM)을 갖는 세포의 균등한 분포는 혼성 자리가 정상 수준에서 작동한다는 증거이다. 반대로, 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 전이유전자는 야생형 마우스 면역글로불린 자리와 빈약하게 경쟁한다(Bruggemann, M. et al. (1989) A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. PNAS 86, 6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon, N. et al. (1993) Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 3720-3724). 이는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에 의해 제조된 면역글로불린이 "넉아웃-플러스-형질전환" 접근법에 의해 제조된 마우스에서 무작위로 통합된 전이유전자에 의해 제조된 것과 기능상 다르다는 것을 추가로 나타낸다.
인간화 대 비인간화 κ 경쇄 자리의 대립유전자 배제를 조사하기 위해 129S6 또는 C57BL/6N에서 Cκ 영역의 다형이 이용 가능하지 않다. 그러나, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 모두 야생형 마우스 λ 경쇄 자리를 보유하고, 따라서, 인간화 κ 경쇄 자리의 재배열 및 발현이 마우스 λ 경쇄 발현을 방지할 수 있는지를 관찰할 수 있다. 마우스 λ 경쇄를 발현하는 세포의 수에 대한 인간화 κ 경쇄를 발현하는 세포의 수의 비율은 κ 경쇄 자리에서 삽입된 인간 Vκ 유전자 분절의 수와 무관하게 야생형 마우스와 비교하여 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 비교적 변하지 않았다(도 6, 위에서부터 세번째 줄). 또한, 이중 양성(κ와 λ) 세포의 수의 증가가 없어, 혼성 κ 경쇄 자리에서의 생산적 재조합이 마우스 λ 경쇄 자리의 재조합을 적절히 억제한다는 것을 나타낸다. 반대로, - 야생형 마우스 λ 경쇄 자리가 아닌 - 비활성화 마우스 κ 경쇄 자리를 갖는 무작위로 통합된 κ 경쇄 전이유전자를 포함하는 마우스가 극적으로 증가된 κ/λ 비를 나타내고(Jakobovits, 1998), 이는 도입된 κ 경쇄 전이유전자가 이러한 마우스에서 잘 작용하지 않는다는 것을 의미한다. 이는 넉아웃-플러스-형질전환" 마우스에 의해 제조된 면역글로불린과 비교하여 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에 의해 제조된 면역글로불린에서 관측된 상이한 기능성 결과를 추가로 나타낸다.
B 세포 발생. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서의 성숙 B 세포 집단이 야생형 마우스에서의 집단과 닮았으므로(상기 기재됨), 조기 B 세포 분화에서의 결함이 성숙 B 세포 집단의 증식에 의해 보상될 수 있다. 유세포 분석기를 사용하여 B 세포 집단의 분석에 의해 B 세포 분화의 다양한 단계를 조사하였다. 표 6은 야생형 한배 새끼와 비교하여 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 특이적 세포 표면 마커를 사용한 FAC에 의해 규정된 각각의 B 세포 계통에서 세포의 분획의 비율을 기재한 것이다.
골수에서 조기 B 세포가 발생하고, B 세포 분화의 상이한 단계는 세포 표면 마커 발현의 유형 및 양의 변화를 특징으로 한다. 표면 발현의 이 차이는 세포 내에 면역글로불린 자리에서 생기는 분자 변화와 상관된다. 프리-B 세포로의 프로-B 이행은 기능성 중쇄 단백질의 성공적인 재배열 및 발현을 요하고, 프리-B로부터 성숙 B 단계로의 이행은 κ 또는 λ 경쇄의 정확한 재배열 및 발현에 의해 지배된다. 따라서, B 세포 분화의 단계 사이의 비효과적인 이행은 소정의 단계에서의 B 세포의 상대 집단의 변화에 의해 검출될 수 있다.
어떠한 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서도 B 세포 분화의 주요 단점이 관측되지 않았다. 인간 중쇄 유전자 분절의 도입은 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 프리-B로의 프로-B의 이행에 영향을 미치는 것으로 보이지 않고, 인간 κ 경쇄 유전자 분절의 도입은 B로의 프리-B의 이행에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 이는 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 보유하는 "역 키메라" 면역글로불린 분자가 B 세포 신호전달 및 동시수용체 분자의 맥락에서 정상으로 작용하여 마우스 환경에서 적절한 B 세포 분화를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 반대로, B 세포 분화 동안 상이한 집단 사이의 균형은 무작위로 통합된 면역글로불린 전이유전자 및 비활성화 내인성 중쇄 또는 κ 경쇄 자리를 포함하는 마우스에서 다양한 정도로 동요된다(Green and Jakobovits, 1998).
실시예 4. 인간화 면역글로불린 마우스에서의 가변 유전자 레퍼토리
비장세포 및 하이브리도마 세포를 포함하는 다양한 공급원으로부터 인간 가변 영역의 역전사효소-중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에 의해 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스의 인간화 항체 레퍼토리에서의 인간 가변 유전자 분절의 사용을 분석하였다. 재배열된 가변 영역 유전자 분절의 가변 영역 서열, 유전자 분절 사용, 체세포 과돌연변이 및 접합 다양성을 결정하였다.
간단히 말하면, 전체 RNA를 TRIzol(상표명)(인비트로겐) 또는 퀴아젠 RNeasy(상표명) 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 1x107 내지 2x107개 비장세포 또는 약 104-105개 하이브리도마 세포로부터 추출하고, 슈퍼스크립트(Superscript)(상표명) III 1단계 RT-PCR 시스템(인비트로겐)을 사용하여 마우스 불변 영역 특이적 프라이머로 프라이밍하였다. 별개로 중쇄 및 κ 경쇄 둘 다에 대한 인간 가변 영역의 각각의 패밀리에 대해 풀링된 리더 프라이머와 쌍을 이룬 상기 언급된 3' 불변 특이적 프라이머를 사용하여 각각의 샘플로부터 2-5㎕의 RNA로 반응을 수행하였다. 제조업자의 지시에 따라 시약 및 프라이머의 용적, 및 RT-PCR/PCR 조건을 수행하였다. 프라이머 서열은 다수의 공급원에 기초한다(Wang, X. and Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). 적절한 경우, 1차 반응에 사용된 동일한 마우스 3'면역글로불린 불변 특이적 프라이머 및 풀링된 패밀리 특이적 골격 프라이머로 끼워진 2차 PCR 반응을 수행하였다. 각각의 반응으로부터의 분취량(5㎕)을 아가로스 전기영동에 의해 분석하고, 몬타지(상표명) 겔 추출 키트(Montage Gel Extraction Kit)(밀리포어(Millipore))를 사용하여 반응 생성물을 아가로스로부터 정제하였다. 정제된 생성물을 TOPO(상표명) TA 클로닝 시스템(인비트로겐)을 사용하여 클로닝하고 전기천공에 의해 DH10β 이. 콜라이 세포로 형질전환하였다. 각각의 클론을 각각의 형질전환 반응으로부터 선택하고, 항생제 선택을 갖는 2㎖ LB 브로쓰 배양액에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 키트 기반 접근법(퀴아젠)에 의해 박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다.
면역글로불린 가변 유전자 사용. 중쇄 및 κ 경쇄 클론 둘 다의 플라스미드 DNA를 ABI 3100 제네틱 어날라이저(Genetic Analyzer)(Applied Biosystems)에서 T7 또는 M13 역 프라이머로 서열분석하였다. 서열 원 데이터를 시퀀서(Sequencher)(상표명)(v4.5, 유전자 코드)에 입력하였다. 인간 VH, DH, JH 및 Vκ, Jκ 분절 사용을 확인하기 위해 각각의 서열을 콘틱으로 조립하고 IMGT V-Quest(Brochet, X., Lefranc, M.P., and Giudicelli, V. (2008). IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res 36, W503-508) 조사 기능을 사용하여 인간 면역글로불린 서열로 정렬하였다. 체세포 과돌연변이 및 재조합 접합부 분석에 대해 서열을 생식선 서열과 비교하였다.
마우스를 RAG 보완(Chen, J. et al. (1993) RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4528-4532)에 의해 초기 중쇄 변형(3hVH-CRE 혼성 대립 유전자, 도 2a의 바닥)을 포함하는 ES 세포로부터 생성하고, cDNA를 비장세포 RNA로부터 제조하였다. 삽입된 인간 유전자 분절 내에 V(D)J 재조합 및 마우스 IgM 또는 IgG 불변 도메인으로의 후속하는 스플라이싱에 의해 발생하는 예상된 키메라 중쇄 mRNA에 특이적인 프라이머 세트(상기 기재)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 이 cDNA 클론(비도시) 유래의 서열은 적절한 V(D)J 재조합이 인간 가변 유전자 서열 내에 발생하고, 재배열된 인간 V(D)J 유전자 분절이 마우스 불변 도메인에 인 프레임으로 적절히 스플라이싱되고, 클래스 스위치 재조합이 발생한다는 것을 나타낸다. 후속하는 혼성 면역글로불린 자리의 mRNA 생성물의 추가의 서열 분석을 수행하였다.
유사한 실험에서, 비면역화 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터의 B 세포를 B220 및 IgM 또는 IgG의 표면 발현에 기초하여 유세포 분석기에 의해 분리하였다. B220+ IgM+ 또는 표면 IgG+(sIgG+) 세포를 풀링하고, RT-PCR 증폭 및 클로닝(상기 기재) 후 VH 및 Vκ 서열을 얻었다. 비면역화 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 1 마우스(표 7) 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 3 마우스(표 8)로부터의 일련의 RT-PCR 증폭된 cDNA에서의 대표적인 유전자 사용을 기록하였다(* 결함 RSS; 손실 또는 위유전자).
표 7 및 표 8에 도시된 것처럼, 거의 모든 기능성 인간 VH, DH, JH, Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 사용하였다. 이 실험의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 검출되지 않았지만 기재된 기능성 가변 유전자 분절 중에서, 몇몇은 결함 재조합 신호 서열(RSS)을 보유하는 것으로 보고되었고, 이에 따라 발현될 것으로 예상되지 않았다(Feeney, A.J. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Immunol Res 21, 195-202). 온전한 및 면역화 레퍼토리 둘 다로부터 단리된 다양한 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터의 몇몇 다른 세트의 면역글로불린 서열의 분석은 낮은 빈도(데이터 표시 생략)에도 불구하고 이 유전자 분절의 사용을 나타냈다. 종합 유전자 사용 데이터는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에 포함된 모든 기능성 인간 VH, DH, JH, Vκ, 및 Jκ 유전자 분절이 다양한 온전한 및 면역화 레퍼토리(데이터 표시 생략)에서 관측된다는 것을 나타낸다. 인간 VH7-81 유전자 분절이 인간 중쇄 자리 서열의 분석에서 확인되었지만(Matsuda, F. et al. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med 188, 2151-2162), 전체 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 3 마우스 게놈의 재서열분석에 의해 확인된 것처럼 이것은 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에 존재하지 않는다.
항체의 중쇄 및 경쇄의 서열이 특히 재배열된 가변 도메인 내에 짧은 폴리펩타이드 분절에서 이례적인 가변성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 공지된 이 영역은 항체 분자의 구조에서 항원에 대한 결합 부위를 생성한다. 개재하는 폴리펩타이드 서열은 골격 영역(FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에서 3개의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3) 및 4개의 FR(FR1, FR2, FR3, FR4)이 존재한다. CDR3인 1개의 CDR이 유전자 분절의 VH, DH 및 JH 및 Vκ 및 Jκ 둘 다의 재조합에 의해 생성되고 항원과 부딪치기 전에 상당한 양의 레퍼토리 다양성을 생성한다는 점에서 이 CDR이 독특하다. 이 결합은 엑소뉴클레아제 활성을 통한 뉴클레오타이드 결실 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)를 통한 비주형 코딩된 부가 둘 다로 인해 부정확하고, 이에 따라 신규한 서열이 재조합 과정으로부터 생기게 한다. FR이 전체로서 가변 영역의 높은 돌연변이성으로 인해 실질적인 체세포 돌연변이를 나타낼 수 있지만, 그러나, 가변성은 가변 영역을 통해 균등하게 분포되지 않는다. CDR은 항원 결합을 허용하는 항체 분자의 표면에서 가변성의 중앙화되고 국소화된 영역이다. 접합 다양성을 나타내는 CDR3 접합부 주위의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터 선택된 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 각각 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다.
도 7a에 도시된 것처럼, 비주형 코딩된 뉴클레오타이드 부가(N-부가)는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터 항체에서 VH-DH 및 DH-JH 접합부 둘 다에서 관측되어, 인간 분절을 갖는 TdT의 적절한 기능을 나타낸다. VH, DH 및 JH 분절의 이의 생식선 대응물에 대한 종점은 엑소뉴클레아제 활성이 또한 발생한다는 것을 나타낸다. 중쇄 자리와 달리, 인간 κ 경쇄 재배열은 Vκ 및 Jκ 분절의 재조합에 의해 형성된 CDR3에서의 TdT 부가를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는다(도 7b). 이는 B 세포로의 프리-B의 이행에서 경쇄 재배열 동안 마우스에서의 TdT 발현 결여로 예상된다. 재배열된 인간 Vκ 영역의 CDR3에서 관측된 다양성은 재조합 사건 동안 엑소뉴클레아제 활성을 통해 주로 도입된다.
체세포 과돌연변이. 체세포 과돌연변이라 불리는 과정에 의해 배 중심 반응 동안 재배열된 면역글로불린 유전자의 가변 영역에 부가적인 다양성을 첨가한다. 체세포 돌연변이된 가변 영역을 발현하는 B 세포는 여포성 수지상 세포에 의해 제시된 항원에 대한 접근을 위해 다른 B 세포와 경쟁한다. 항원에 대한 더 높은 친화도를 갖는 이 B 세포는 추가로 증식하고 클래스 스위칭을 겪은 후 말초에 존재한다. 따라서, 스위칭된 아이소토프를 발현하는 B 세포는 통상적으로 항원과 부딪치고 배 중심 반응을 겪고 온전한 B 세포에 비해 증가된 돌연변이 수를 갖는다. 추가로, 주로 온전한 sIgM+ B 세포로부터의 가변 영역 서열은 항원 선택을 겪은 sIgG+ B 세포로부터의 가변 서열보다 비교적 더 적은 돌연변이를 갖는 것으로 예상된다.
비면역화 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터의 sIgM+ 또는 sIgG+ B 세포 또는 면역화 마우스로부터의 sIgG+ B 세포로부터의 무작위 VH 또는 Vκ 클론으로부터의 서열을 주석 달린 생식선 서열에 대해 이의 생식선 가변 유전자 분절 및 변화와 비교하였다. 생성된 뉴클레오타이드 서열을 인 실리코 번역하고 아미노산 변화를 발생시킨 돌연변이를 또한 주석 달았다. 모든 가변 영역으로부터 데이터를 수집하고, 소정의 지점에서의 백분율 변화를 계산하였다(도 8).
도 8에 도시된 것처럼, 비면역화 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터의 sIgG+ B 세포 유래의 인간 중쇄 가변 영역은 동일한 비장세포 풀로부터의 sIgM+ B 세포에 비해 더 많은 뉴클레오타이드를 나타내고, 면역화 마우스 유래의 중쇄 가변 영역은 심지어 더 많은 변화를 나타낸다. 변화의 수는 상보성 결정 영역(CDR)에서 골격 영역에 비해 증가하여, 항원 선택을 나타낸다. 인간 중쇄 가변 영역으로부터의 상응하는 아미노산 서열은 또한 IgM에 비해 IgG에서 돌연변이의 유의적으로 더 많은 수, 심지어 면역화 IgG에서 심지어 더 많은 수를 나타낸다. 이 돌연변이는 다시 골격 서열과 비교하여 CDR에서 더 흔한 것으로 보이고, 항체가 생체 내 항원 선택된다는 것을 제시한다. 면역화 마우스로부터의 IgG+ B 세포 유래의 Vκ 서열에서 뉴클레오타이드 및 아미노산 돌연변이의 수의 유사한 증가가 관찰되었다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 관측된 유전자 사용 및 체세포 과돌연변이는, 존재하는 실질적으로 모든 유전자 분절이 이 마우스에서 완전한 기능적 역 키메라 항체를 형성하기 위해 재배열할 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 항체는 마우스 면역체계 내에 완전히 참여하여 친화도 선택을 겪고 이의 표적 항원을 효과적으로 중화시킬 수 있는 완전 성숙 인간 항체를 생성하도록 유지한다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 친화도가 높으면서 치료 용도에 적합한 넓은 범위의 인간 항체를 사용하는 다수의 유형의 항원에 대한 튼튼한 면역 반응을 개시할 수 있다(데이터 표시 생략).
실시예 5. 림프구성 구조 및 혈청 아이소토프의 분석
H&E로 염색된 야생형 또는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터의 조직 샘플의 비장, 서혜부 림프절, 페이어(Peyer) 패치 및 흉선의 전체 구조를 광학 현미경으로 조사하였다. 루미넥스(Luminex)(상표명) 기술을 이용하여 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터 수집된 혈청에서의 면역글로불린 아이소토프의 수준을 분석하였다.
림프구성 장기 구조. 림프구성 조직의 구조 및 기능은 조혈 세포의 적절한 발생에 부분적으로 의존한다. B 세포 발생 또는 기능의 결함은 림프구성 조직의 구조 변경으로 나타날 수 있다. 염색된 조직 절편의 분석 시, 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스 사이의 2차 림프구성 장기의 외관의 유의적인 차이가 확인되지 않았다(데이터 표시 생략).
혈청 면역글로불린 수치. 각각의 아이소토프의 발현 수준은 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스에서 유사하다(도 9a, 도 9b 및 도 9c). 이는 가변 유전자 분절의 인간화가 클래스 스위칭 또는 면역글로불린 발현 및 분비 시 명확한 불리한 효과를 갖지 않고 따라서 이 기능에 필요한 모든 내인성 마우스 서열을 명확히 유지한다는 것을 나타낸다.
실시예 6. 인간화 면역글로불린 마우스에서의 면역화 및 항체 제조
외래 항원 공격에 대한 체액성 반응을 조사하기 위해 상이한 버전의 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 항원으로 면역화하였다.
면역화 및 하이브리도마 발생. 단백질, DNA, DNA 및 단백질의 조합, 또는 항원을 발현하는 세포 형태로 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 마우스를 항원으로 면역화하였다. 동물을 통상적으로 전체 2회 내지 3회 동안 3주마다 부스팅하였다. 각각의 항원 부스팅 후, 각각의 동물로부터의 혈청 샘플을 수집하고 혈청 역가 결정에 의해 항원 특이적 항체 반응에 대해 분석하였다. 융합 전에, 복강내 및/또는 정맥내 주사를 통해 원하는 바대로 마우스에 5㎍의 단백질 또는 DNA의 최종 융합전 부스트를 투여하였다. 비장세포를 수확하고 제조업자 제시 프로토콜(Cyto Pulse Sciences Inc., 메릴랜드주 글렌 버니 소재)에 따라 전기융합 챔버에서 Ag8.653 골수종 세포에 융합하였다. 배양 10일 후, ELISA 검정을 이용하여 항원 특이성에 대해 하이브리도마를 스크리닝하였다(Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York). 대안적으로, 항원 특이적 B 세포를 면역화 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스로부터 직접 단리하고 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 표준 기술을 이용하여 스크리닝하여 관심 대상 항원에 특이적인 인간 항체를 얻었다.
혈청 역가 결정. 동물 항항원 혈청 반응을 모니터링하기 위해, 각각의 부스팅 약 10일 후 혈청 샘플을 수집하고, 항원 특이적 ELISA를 이용하여 역가를 결정하였다. 간단히 말하면, Nunc MaxiSorp(상표명) 96웰 플레이트를 4℃에서 밤새 2㎍/㎖ 항원으로 코팅하고 소 혈청 알부민(시그마(Sigma), 미조리주 세이트 루이스 소재)으로 차단하였다. 연속 3배 희석의 혈청 샘플을 실온에서 1시간 동안 플레이트에 결합하도록 하였다. 이후, 플레이트를 0.05% 트윈(Tween)-20을 포함하는 PBS로 세척하고, 각각 전체 IgG 역가를 위해 HRP 접합 염소 항마우스 Fc(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., 펜실베니아주 웨스트 글로브 소재)를 사용하여 또는 아이소토프 특이적 역가를 위해 바이오틴 표지된 아이소토프 특이적 또는 경쇄 특이적 폴리클론 항체(SouthernBiotech Inc.)를 사용하여 결합 IgG를 검출하였다. 바이오틴 표지된 항체의 경우, 플레이트 세척 후, HRP 접합 스트렙타빈(Pierce, 일리노이주 락포드 소재)을 첨가하였다. BD OptEIA(상표명)(BD Biosciences Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 같은 비색 기질을 사용하여 모든 플레이트를 전개시켰다. 1M 인산으로 반응을 중지시킨 후, 450nm에서의 광학 흡광도를 기록하고, 그래프 패드(Graph Pad)로부터의 프리즘(Prism)(상표명) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 2배 배경 신호를 얻기에 필요한 희석은 역가로 정의된다.
일 실험에서, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 인간 인터류킨-6 수용체(hIL-6R)로 면역화하였다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 hIL-6R로 면역화된 야생형 마우스에 대한 대표적인 세트의 혈청 역가가 도 10a 및 도 10b에 도시되어 있다.
벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 마우스는 유사한 역가 범위로 IL-6R에 대해 강한 반응을 개시시켰다(도 10a). 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 코호트로부터의 몇몇 마우스는 단일 항원 부스팅 후 최대 반응에 도달하였다. 이 결과는 이 항원에 대한 면역 반응 강도 및 동역학이 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 마우스에서 유사하다는 것을 나타낸다. 혈청에서 발견된 항원 특이적 항체의 특정한 아이소토프를 조사하기 위해 이 항원 특이적 항체 반응을 추가로 분석하였다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 그룹 둘 다는 IgG1 반응을 주로 발생시켜(도 10b), 체액성 반응 동안 클래스 스위칭이 각각의 유형의 마우스에서 유사하다는 것을 제시한다.
용액 중의 항원에 대한 항체 결합의 친화도 결정. 항원에 대한 항체-결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA 기반 용액 경쟁 검정을 통상적으로 설계하였다.
간단히 말하면, 순화 배지 중의 항체를 0 내지 10㎎/㎖ 범위의 항원 단백질의 연속 희석으로 예비혼합하였다. 이후, 항체 및 항원 혼합물의 용액을 실온에서 2 내지 4시간 동안 항온처리하여 결합 평형에 도달하였다. 이후, 정량적 샌드위치 ELISA를 사용하여 혼합물 중의 유리 항체의 양을 측정하였다. 96웰 Maxisorb(상표명) 플레이트(VWR, 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재)를 4℃에서 밤새 PBS 용액 중의 1㎍/㎖의 항원 단백질로 코팅한 후 BSA 비특이적 차단하였다. 이후, 항체-항원 혼합물 용액을 이 플레이트에 옮긴 후 1시간 동안 항온처리하였다. 이후, 플레이트를 세척 완충제로 세척하고, 플레이트 결합 항체를 HRP 접합 염소 항마우스 IgG 폴리클론 항체 시약(Jackson Immuno Research Lab)으로 검출하고, BD OptEIA(상표명)(BD Biosciences Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 같은 비색 기질을 사용하여 전개시켰다. 1M 인산으로 반응을 중지시킨 후, 450nm에서의 광학 흡광도를 기록하고, 그래프 패드로부터의 프리즘(상표명) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 용액 중의 항원의 농도에 대한 신호의 의존성은 4개의 매개변수 맞춤 분석으로 분석되고, 용액 중의 항원의 부재 하의 항체 샘플로부터의 신호의 50% 감소를 성취하는 데 필요한 항원 농도인 IC50으로서 기록하였다.
일 실험에서, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 hIL-6R(상기 기재)로 면역화하였다. 도 11a 및 도 11b는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 및 야생형 마우스로부터 항-hIL6R 항체에 대한 대표적인 세트의 친화도 측정을 나타낸다.
면역화 마우스에 제3 항원 부스팅을 투여한 후, 혈청 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 비장세포를 선택된 야생형 및 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스 코호트로부터 단리하고 Ag8.653 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 형성하고 선택(상기 기재) 하에 성장시켰다. 제조된 전체 671개의 항-IL-6R 하이브리도마 중에서, 236개가 항원 특이적 항체를 발현하는 것으로 확인되었다. 항원 양성 웰로부터 수확된 배지를 사용하여 용액 경쟁 ELISA를 이용하여 항원에 대한 항체 친화도를 결정하였다. 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스 유래의 항체는 용액 중에 항원에 대한 결합에 있어서 넓은 범위의 친화도를 나타냈다(도 11a). 더욱이, 236개 중 49개의 항-IL-6R 하이브리도마가 실험실내 생체검정(데이터 표시 생략)에서 수용체에 대한 결합으로부터 IL-6을 차단하는 것으로 확인되었다. 추가로, 이 49개의 항-IL-6R 차단 항체는 야생형 마우스의 평행 면역화 유래의 차단 항체와 유사한 높은 용액 친화도의 범위를 나타냈다(도 11b).
실시예 7. 마우스 ADAM6 표적화 벡터의 작제
인간화 중쇄 자리로의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 삽입을 위한 표적화 벡터를 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 유전자 조작 기술(상기 참조)을 이용하여 작제하여 닥터 프레드 알트(Fred Alt) 박사(Havard University)로부터 얻은 박테리아 인공 염색체(BAC) 929d24를 변형시켰다. 인간화 중쇄 자리의 인간 VH1-2와 VH6-1 유전자 분절 사이에 위치한 인간 ADAM6 위유전자(hADAM6ψ)의 표적화된 결실에 대한 하이그로마이신 카세트 및 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 포함하는 게놈 단편을 포함하도록 929d24 BAC DNA를 조작하였다(도 12).
처음에, 업스트림(5') 서열의 약 800bp 및 다운스트림(3') 서열의 약 4800bp인 마우스 ADAM6b 유전자를 포함하는 게놈 단편을 929d24 BAC 클론으로부터 서브클로닝하였다. 업스트림(5') 서열의 약 300bp 및 다운스트림(3') 서열의 약 3400bp인 마우스 ADAM6a 유전자를 포함하는 제2 게놈 단편을 929d24 BAC 클론으로부터 분리하여 서브클로닝하였다. 마우스 ADAM6b 및 ADAM6a 유전자를 포함하는 2개의 게놈 단편을 Frt 재조합 부위를 양 측면에 지니는 플랭킹된 하이그로마이신 카세트에 결찰하여 표적화 벡터(마우스 ADAM6 표적화 벡터, 도 20; 서열번호 3)를 생성하였다. 상이한 제한 효소 부위를 인간화 중쇄 자리로의 결찰을 위해 마우스 ADAM6b 유전자 후 표적화 벡터의 5' 말단 및 마우스 ADAM6a 유전자 후 3' 말단(도 12의 하부)으로 조작하였다.
마우스 ADAM6 표적화 벡터의 후속 결찰을 위해 인간화 자리의 인간 VH1-2와 VH6-1 유전자 분절 사이에 위치한 인간 ADAM6 위유전자를 포함하는, 인간 중쇄 자리에 의한 마우스 중쇄 자리의 교체를 포함하는 BAC 클론으로 별개의 변형을 만들었다(도 13).
간단히 말하면, 인간 VH1-2 유전자 분절의 3' 위치(hADAM6ψ와 관련하여 5') 및 인간 VH6-1 유전자 분절의 5' 위치(hADAM6ψ와 관련하여 3'; 도 13의 중간 참조)에서 인간 게놈 서열을 포함하는 상동성 부문을 포함하도록 loxP 재조합 부위를 양 측면에 지니는 네오마이신 카세트를 조작하였다. 이 표적화 작제물의 삽입 부위의 위치는 인간 ADAM6 상의 유전자의 약 1.3kb 5' 및 약 350bp 3'에 있다. 표적화 작제물은 또한 마우스 ADAM6 표적화 벡터와 동일한 제한 부위를 포함하여 인간 ADAM6 위유전자의 결실을 포함하는 변형된 BAC 클론과 마우스 ADAM6 표적화 벡터 사이에 후속하는 BAC 결찰을 허용한다.
작제물 둘 다로부터 유래한 BAC DNA의 분해 후, 게놈 단편을 함께 결찰하여 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이소성으로 위치한 게놈 서열을 포함하는 인간화 중쇄 자리를 포함하는 조작된 BAC 클론을 작제하였다. 인간화 중쇄 자리 내의 인간 ADAM6 유전자의 결실 및 ES 세포에서 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열의 삽입을 위한 최종 표적화 작제물은, 5'로부터 내지 3'로, 인간 VH1-2 유전자 분절의 인간 게놈 서열 3'의 약 13kb를 포함하는 5' 게놈 단편, 마우스 ADAM6b 유전자의 다운스트림에 있는 마우스 게놈 서열의 약 800bp, 마우스 ADAM6b 유전자, 마우스 ADAM6b 유전자의 업스트림에 있는 게놈 서열의 약 4800bp, 5' Frt 부위, 하이그로마이신 카세트, 3'Frt 부위, 마우스 ADAM6a 유전자의 다운스트림에 있는 마우스 게놈 서열의 약 300bp, 마우스 ADAM6a 유전자, 마우스 ADAM6a 유전자의 업스트림에 있는 마우스 게놈 서열의 약 3400bp 및 인간 VH6-1 유전자 분절의 인간 게놈 서열 5'의 약 30kb를 포함하는 3' 게놈 단편(도 13의 하부)을 포함하였다.
인간화 중쇄 자리 내에 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성으로 위치한 마우스 게놈 서열을 포함하는 생성된 변형된 ES 세포로 인간화 중쇄 자리를 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하기 위해 조작된 BAC 클론(상기 기재)을 사용하였다. 타크만(TAQMAN)(상표명) 프로브를 사용하여 정량적 PCR 검정에 의해 인간화 중쇄 자리 내에 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 양성 ES 세포를 확인하였다(Lie, Y.S. and Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). 변형된 영역 사이에 위치한 프라이머 및 프로브를 사용하여 PCR에 의해 인간화 중쇄 자리의 변형된 부분 밖의 업스트림 및 다운스트림 영역을 확인하여, 하이그로마이신 카세트 및 인간화 중쇄 자리 내의 이소성 마우스 게놈 서열의 존재를 확인하였다. 업스트림 삽입점에 따른 뉴클레오타이드 서열은 삽입점의 업스트림에 인간 중쇄 게놈 서열을 나타내는 하기 및 삽입점에 존재하는 마우스 게놈 서열에 연속하여 연결된 (하기 문단 내에 포함된) I-Ceu I 제한 부위를 포함하였다: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG(서열번호 4). 표적화된 영역의 3' 말단에서 다운스트림 삽입점에 따른 뉴클레오타이드 서열은 마우스 게놈 서열을 나타내는 하기 및 삽입점의 다운스트림에 인간 중쇄 게놈 서열과 연속하여 연결된 (하기 문단 내에 포함된) PI-Sce I 제한 부위를 포함하였다: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG(서열번호 5).
상기 기재된 표적화된 ES 세포를 공여체 ES 세포로서 사용하고 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 마우스 조작 방법(예컨대, 미국 7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754 참조)에 의해 8-세포기 마우스 배아로 도입하였다. 인간화 중쇄 자리 내에 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 존재를 검출하는 대립 유전자 검정(Valenzuela et al., 2003)의 변형을 이용한 유전자형 분석에 의해 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 서열을 포함하는 인간화 중쇄 자리를 보유하는 마우스를 확인하였다.
마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 포함하는 인간화 중쇄 자리를 보유하는 마우스를 FLPe 결실자 마우스 균주로 생육하여(예컨대, 문헌[Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140] 참조), 예컨대 ES 세포시에서 또는 배아에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 Frt화 하이그로마이신 카세트를 제거하였다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스에서 보유되었다.
Pup를 유전자형 분석하고, 마우스 ADAM6 유전자 발현 및 가임성을 규명하기 위해 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 인간화 중쇄 자리에 대한 pup 이형접합성을 선택하였다.
실시예 8. ADAM6 구제 마우스의 규명
유세포 분석기. BD LSR II 시스템(BD Bioscience)에서 FAC에 의한 림프구 세포 집단의 확인 및 분석을 위해 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리(H/κ)에 대한 25주령의 동형접합에서의 3마리의 마우스 및 인간 중쇄 자리(H/κ-A6)의 대립 유전자 둘 다 내에 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 인간 중쇄 및 인간 κ 경쇄에 대한 18-20주령의 동형접합에서의 3개의 마우스를 희생시켰다. 림프구를 특이적 세포 계통에 대해 게이팅하고 다양한 B 세포 발생기에 걸쳐 진행에 대해 분석하였다. 동물로부터 수집된 조직은 혈액, 비장 및 골수를 포함하였다. EDTA(BD Biosciences)를 갖는 BD 마이크로 용기 관에 혈액을 수집하였다. 소 태아 혈청, 피부르산나트륨, HEPES, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 겐타마이신이 보충된 완전 RPMI 배지로 수세하여 대퇴골로부터 골수를 수집하였다. 혈액, 비장 및 골수 집단으로부터의 적혈구를 염화암모늄계 용해 완충제(예컨대, ACK 용해 완충제)로 용해한 후, 완전 RPMI 배지로 세척하였다.
세포 집단의 염색을 위해, 다양한 조직 공급원으로부터의 1x106개 세포를 얼음에서 10분 동안 항마우스 CD16/CD32(2.4G2, BD Biosciences)와 항온처리한 후, 하기 항체 칵테일 중 하나 또는 이들의 조합으로 얼음에서 30분 동안 표지화하였다.
골수: 항마우스 FITC-CD43(1B11, BioLegend), PE-c키트(2B8, BioLegend), PeCy7-IgM(II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220(RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19(1D3, BD Biosciences).
말초 혈액 및 비장: 항마우스 FITC-κ(187.1, BD Biosciences), PE-λ(RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM(II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3(145-2C11, BD), A700-CD19(1D3, BD), APC-eFluor780-B220(RA3-6B2, eBioscience). 표지된 항체와 항온처리 후, 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드 중에 고정하였다. 데이터 획득을 LSRII 유세포 분석기에서 수행하고 FlowJo로 분석하였다. 대표적인 H/κ 및 H/κ-A6 마우스로부터의 결과가 도 14 내지 도 18에 도시되어 있다.
이 결과는 H/κ-A6 마우스의 B 세포가 골수 및 말초 구획에서의 H/κ 마우스와 유사한 방식으로 B 세포 발생기를 통해 진행하고, 이들이 말초에 진입하면 정상 패턴의 성숙을 나타낸다는 것을 보여준다. H/κ-A6 마우스는 H/κ 마우스와 비교하여 증가된 CD43intCD19+ 세포 집단을 나타낸다(도 16b). 이는 H/κ-A6 마우스에서 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 인간화 중쇄 자리로부터 가속된 IgM 발현을 나타낼 수 있다. 말초에서, H/κ-A6 마우스의 B 및 T 세포 집단은 정상이고 H/κ 마우스와 유사한 것으로 보인다.
고환 형태 및 정자 규명. 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 갖는 마우스의 불임성이 고환 및/또는 정자 생성 결합으로 인한 것인지 결정하기 위해, 고환 형태 및 부고환의 정자 함량을 조사하였다.
간단히 말하면, 그룹(그룹 1: 인간 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 동형접합, mADAM6-/-; 그룹 2: 인간 중쇄 가변 유전자 자리에 대한 마우스 이형접합 및 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대한 동형접합, mADAM6+/-)마다 5마리의 마우스의 2개의 그룹으로부터의 고환을, 부고환은 온전히 한 채, 절제하고 칭량하였다. 이후, 시편을 고정하고 파라핀 중에 포매하고 절개하고 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색으로 염색하였다. 고환 절편(마우스당 2개의 고환, 전체 20개)을 정자 생성 흔적 및 형태의 결함에 대해 조사하고, 정자의 존재에 대해 부고환 절편을 조사하였다.
이 실험에서, 고환 중량 또는 형태의 차이가 mADAM6-/- 마우스와 mADAM6+/- 마우스 사이에서 관측되지 않았다. 고환 및 부고환 둘 다의 모든 유전자형에서 정자가 관측되었다. 이 결과는 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 부재가 고환 형태의 검출 가능한 변화를 발생시키지 않고, 이 2개의 유전자의 존재 및 부재 하에 마우스에서 정자가 생성된다는 것을 입증한다. 수컷 ADAM6-/- 마우스의 가임성 결함을 따라서 적은 정자 생성으로 인한 것이 아니다.
정자 운동성 및 이동. 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원이 결여된 마우스는 정자 운동성 또는 이동의 결함으로 인해 불임이다. 정자 운동성은 정자가 자궁으로부터 나팔관으로 통과하는 능력으로 정의되고, 보통 마우스에서의 수정에 필요하다. 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b의 결실이 이 과정에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, mADAM6-/- 마우스에서 정자 이동을 평가하였다. 정자 운동성을 또한 조사하였다.
간단히 말하면, (1) 인간 중쇄 가변 유전자 자리에 이형접합이고 for 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 동형접합(ADAM6+/-)인 마우스; (2) 인간 중쇄 가변 유전자 자리에 동형접합이고 인간 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 동형접합(ADAM6-/-)인 마우스; (3) 인간 중쇄 가변 유전자 자리에 동형접합이고 야생형 κ 경쇄에 동형접합(ADAM6-/-mk)인 마우스; 및 (4) 야생형 C57 BL/6 마우스(WT)의 고환으로부터 정자를 얻었다. 검사에 의하면 정자 수 또는 전체 정자 운동성의 유의적인 비정상이 관측되지 않았다. 모든 마우스의 경우, 난구 확산이 관측되어, 각각의 정자 샘플이 난구 세포에 침투하고 실험실내 투명대에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 결과는 ADAM6-/- 마우스가 난구에 침투하고 투명대에 결합할 수 있는 정자를 갖는다는 것을 입증한다.
상기 기재된 바대로 마우스로부터의 정자를 사용하여 실험실내 마우스 난자의 수정(IVF)을 수행하였다. IVF 다음날에 ADAM6-/-에 분할된 배아의 수가 약간 적었고, 난에 결합된 정자가 적었다. 이 결과는 난자에 일단 노출되면 ADAM6-/- 마우스로부터의 정자가 난구에 침투하고 투명대에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
다른 실험에서, 정자 이동 검정에서 자궁으로부터 나팔관을 거쳐 이동하는 ADAM6-/- 마우스로부터의 정자의 능력을 결정하였다.
간단히 말하면, 5마리의 과잉 배란된 암컷 마우스의 제1 그룹을 5마리의 ADAM6-/- 수컷과 설정하였다. 5마리의 과잉 배란된 마우스의 제2 그룹을 5마리의 ADAM6+/- 수컷과 설정하였다. 성교하는 짝짓기 쌍이 관측되었고, 성교 5시간 내지 6시간 후 모든 암컷으로부터 자궁 및 부착 나팔관을 제거하고 분석을 위해 수세하였다. 수세 용액을 배란을 확인하기 위해 난에 대해 확인하고 정자 수를 얻었다. 2의 상이한 방식으로 정자 이동을 평가하였다. 처음에, 자궁으로부터 나팔관 둘 다를 제거하고 식염수로 수세하고 확인된 임의의 정자를 계수하였다. 배란의 증거로서 난의 존재가 또한 언급된다. 둘째로, 나팔관을 자궁에 부착한 채 두고 조직 둘 다를 고정하고 파라핀 중에 포매하고 절개하고 염색하였다(상기 기재). 자궁 및 나팔관 둘 다에서 정자의 존재에 대해 절편을 조사하였다.
5마리의 ADAM6-/- 수컷과 짝짓기한 5마리의 암컷의 경우, 나팔관으로부터의 수세 용액에서 매우 적은 정자가 확인되었다. 5마리의 ADAM6+/- 수컷과 짝짓기한 5마리의 암컷의 나팔관으로부터의 수세 용액은 5마리의 ADAM6-/- 수컷과 짝짓기한 5마리의 암컷의 나팔관으로부터의 수세 용액에 존재하는 것보다 약 25배 내지 30배 높은(평균, n = 10개의 나팔관) 정자 수준을 나타냈다.
자궁 및 나팔관의 조직학적 절편을 제조하였다. 자궁 및 나팔관(둔덕 융기)에서 정자 존재에 대해 절편을 조사하였다. 나팔관 및 자궁의 조직학적 절편의 검사에 의하면, ADAM6-/- 마우스와 짝짓기한 암컷 마우스의 경우, 나팔관에서가 아니라 자궁에서 정자가 관찰되었다는 것을 나타낸다. 추가로, ADAM6-/- 마우스와 짝짓기한 암컷으로부터의 절편은 자궁난관 접합부(UTJ)에서 정자가 관찰되지 않는다는 것을 나타낸다. ADAM6+/- 마우스와 짝짓기한 암컷으로부터의 절편에서, UTJ 및 나팔관에서 정자가 확인되었다.
이 결과는 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여된 마우스가 생체내 이동 결함을 나타내는 정자를 만든다는 것을 나타낸다. 모든 경우에, 자궁 내에 정자가 관측되어, 배란 및 정자 방출이 명확히 정상으로 나타내지만, 정자 수 또는 조직학적 관찰에 의해 측정된 배란 후 나팔관 내에 정자가 적거나 없는 것으로 관측된다는 것을 나타낸다. 이 결과는 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여된 마우스가 자궁으로부터 나팔관으로 이동하는 능력 부족을 나타내는 정자를 생성한다는 것을 나타낸다. 정자가 난이 수정되는 나팔관으로 자궁-난관 접합부를 횡단할 수 없으므로 이 결함은 명확히 불임을 발생시킨다. 종합하면, 모든 이 결과는 합해져서 정상 운동성을 갖는 정자가 자궁난관 접합부 및 나팔관을 거쳐 자궁 밖으로 이동하도록 지시하고 따라서 난에 접근하는 것을 도와 수정 사건을 성취한다는 가설을 지지한다. ADAM6이 이를 성취하는 기전은 직접적으로 ADAM6 단백질의 작용에 의해 또는 하기 기재된 바대로 정자 세포에서 다른 단백질, 예컨대 다른 ADAM 단백질과의 조직적 발현에 의할 수 있다.
ADAM 유전자 패밀리 발현. ADAM 단백질의 복합체는 성숙 정자의 표면에 대한 복합체로서 존재하는 것으로 알려져 있다. 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원이 결여된 마우스는 정자 성숙으로서 이 복합체를 잃고, 성숙 정자에서 다수의 ADAM 단백질의 감소를 나타낸다. ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 결함이 유사한 방식으로 다른 ADAM 단백질에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 고환(미성숙 정자) 및 부고환(성숙 정자)로부터의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯을 분석하여 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준을 결정하였다.
이 실험에서, 4개의 ADAM6-/- 및 4개의 ADAM6+/- 마우스로부터 단백질 추출물을 분석하였다. 결과는 ADAM2 및 ADAM3의 발현이 고환 추출물에서 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, ADAM2 및 ADAM3 둘 다는 부고환 추출물에서 극적으로 감소하였다. 이는 ADAM6-/- 마우스의 정자에서의 ADAM6a 및 ADAM6b의 부재가 발현 및 아마도 정자 성숙(예컨대, ADAM2 및 ADAM3)으로서 다른 ADAM 단백질의 기능에 직접적인 영향을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 ADAM6a 및 ADAM6b가 적절한 정자 이동에 중요할 수 있는 정자의 표면 위의 ADAM 단백질 복합체의 일부라는 것을 제시한다.
실시예 9. ADAM6 구제 마우스에서의 인간 중쇄 가변 유전자 이용
타크만(상표명) 프로브(상기 기재)를 사용하여 정량적 PCR 검정에 의해 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여(mADAM6-/-)되거나 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 이소성 게놈 단편을 포함(ADAM6+/+; 실시예 1 참조)하는 인간 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자 자리에 대해 동형접합인 마우스에 대해 선택된 인간 중쇄 가변 유전자 이용을 결정하였다.
간단히 말하면, CD19+ B 세포를 마우스 CD19 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 mADAM6-/- 및 ADAM6+/+ 마우스의 비장으로부터 정제하고, 전체 RNA를 RNeasy(상표명) 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. RNase 비함유 DNase 컬럼 상 처리(퀴아젠)를 이용하여 게놈 RNA를 제거하였다. 약 200ng의 mRNA를 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성(First Stand cDNA Synthesis) 키트(인비트로겐)를 사용하여 cDNA로 역전사한 후 ABI 7900 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 타크만(상표명) 범용 PCR 마스터 믹스(Universal PCR Master Mix)(Applied Biosystems)로 증폭하였다. 각각의 유전자의 상대 발현을 마우스 κ 불변 영역(mCκ)으로 정규화하였다. 표 9는 이 실험에서 사용된 센스/안티센스/타크만(상표명) MGB 프로브 조합을 기재한 것이다.
이 실험에서, 분석된 샘플에서 모든 4개의 인간 VH 유전자의 발현이 관측되었다. 추가로, 발현 수준은 mADAM6-/- 및 ADAM6+/+ 마우스와 필적하였다. 이 결과는 변형 부위(VH3-23 및 VH1-69)에 원위이고 변형 부위(VH1-2 및 VH6-1)에 근위인 인간 VH 유전자는 모두 조합하여 기능적으로 발현된 인간 중쇄를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 결과는 인간 중쇄 게놈 서열에 삽입된 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 게놈 단편이 그 자리 내에 인간 중쇄 유전자 분절의 V(D)J 재조합에 영향을 미치지 않고, 이 마우스가 인간 중쇄 유전자 분절을 정상 방식으로 재조합하여 기능성 중쇄 면역글로불린 단백질을 제조할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10. 마우스 면역글로불린 경쇄 자리의 결실
마우스 κ 및 λ 경쇄 자리를 비활성화하기 위해 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리를 변형시키기 위해 벨로시겐(VELOCIGENE)(등록상표) 기술(예컨대, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659] 참조)을 이용하여 다양한 표적화 작제물을 만들었다.
마우스 λ 경쇄 자리의 결실. Vλ-Jl-Cλ 유전자 클러스터의 표적화된 결실을 통해 내인성 마우스 λ 경쇄 자리를 비활성화하기 위해 상동성 재조합에 의해 마우스 BAC 클론 RP23-135k15(인비트로겐)로부터의 DNA를 변형하였다(도 20).
간단히 말하면, Vλ1 유전자 분절의 5' 서열을 포함하는 5' 마우스 상동성 부문 및 Cλ1 유전자 분절의 3' 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 부문을 갖는 loxP 부위를 양 측면에 지니는 네오마이신 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하여 단일 표적화 사건으로 Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 유전자 분절을 포함하는 전체 근위 클러스터를 결실시켰다(도 20, 표적화 벡터 1).
표적화 작제물이 Vλ2 유전자 분절의 5' 서열을 포함하는 5' 마우스 상동성 부문 및 내인성 Cλ2 유전자 분절에 대한 5' 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 부문을 포함한다는 것을 제외하고는 Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4를 포함하는 원위 내인성 마우스 λ 유전자 클러스터를 정확히 결실시키기 위해 제2 표적화 작제물을 제조하였다(도 20, 표적화 벡터 2). 따라서, 제2 표적화 작제물은 Vλ2-Jλ2를 정확히 결실시키면서, 내인성 마우스 λ 자리에서 Cλ2-Jλ4-Cλ4를 온전히 두었다. 핵형분석 및 당해 분야에 공지된 스크리닝 방법(예컨대, 타크만(등록상표))에 의해 비활성화 내인성 λ 자리(상기 기재)를 포함하는 ES 세포를 확인하였다. 이후, DNA를 변형된 ES 세포로부터 단리하고 CRE 재조합효소에 의해 처리하여, 네오마이신 마커 유전자를 포함하는 근위 표적화 카세트의 결실을 중재하여, 결실점에서 단일 loxP 부위만을 남겼다(도 20, 하부).
마우스 κ 경쇄 자리의 결실. 2단계 과정에서 마우스 κ 경쇄 자리를 비활성화하기 위해 상동성 재조합에 의해 마우스 BAC 클론 RP23-302g12 및 RP23-254m04(인비트로겐)로부터 DNA를 변형하기 위해 상기 기재된 유사한 방법을 이용하여 몇몇 표적화 작제물을 만들었다(도 21).
간단히 말하면, hyg-TK 카세트에 대한 3'인 단일 loxP 부위를 포함하는 하이그로마이신-티미딘 키나제(hyg-TK) 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하여 단일 표적화 사건으로 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 Jκ 유전자 분절(1-5)을 결실시켰다(도 21, Jκ 표적화 벡터). 이 표적화 벡터를 만들기 위해 사용된 상동성 부문은 내인성 마우스 Jκ 유전자 분절의 5' 및 3'인 마우스 게놈 서열을 포함하였다. 제2 표적화 사건에서, 가장 원위인 내인성 마우스 Vκ 유전자 분절에 대한 업스트림(5')에 마우스 게놈 서열의 일부를 결실시키기 위해 제2 표적화 벡터를 제조하였다(도 21, Vκ 표적화 벡터). 이 표적화 벡터는 네오마이신 카세트 및 loxP 부위인 인버티드 lox511 부위를 포함하였다. 이 표적화 벡터를 만들기 위해 사용된 상동성 부문은 가장 원위인 마우스 Vκ 유전자 분절의 업스트림에 마우스 게놈 서열을 포함하였다. ES 세포에서 DNA를 표적화하기 위해 순차적 방식(즉, Jκ 이어서 Vκ)으로 표적화 벡터를 사용하였다. 핵형분석 및 당해 분야에 공지된 스크리닝 방법(예컨대, 타크만(등록상표))에 의해 이중 표적화 염색체(즉, 표적화 벡터 둘 다로 표적화된 단일 내인성 마우스 κ 자리)를 보유하는 ES를 확인하였다. 이후, DNA를 변형된 ES 세포로부터 단리하고 Cre 재조합효소로 처리하여, 선별 카세트 둘 다 및 내인성 마우스 Vκ 유전자 분절의 결실을 중재하면서, 2개의 병치된 lox 부위를 서로에 반대 배향으로 남겼다(도 21, 하부; 서열번호 59).
따라서, 하기 기재된 표적화 벡터를 사용하여 정확한 방식으로 재배열되지 않은 인간 λ 생식선 유전자 분절을 점진적으로 삽입하여 온전한 인핸서 및 불변 영역을 포함하는 2개의 변형된 내인성 경쇄 자리(κ 및 λ)를 생성하였다.
실시예 11. 인간 λ 경쇄 소형 자리에 의한 마우스 경쇄 자리의 교체
상기 기재된 유사한 방법을 이용하여 인간 λ 유전자 분절을 내인성 마우스 κ 및 λ 경쇄 자리로 점진적으로 삽입하도록 다중 표적화 벡터를 조작하였다. 내인성 경쇄 자리에 다수의 독립적인 초기 변형을 하여 각각 마우스 경쇄 불변 유전자 및 인핸서에 작동적으로 연결된 hVλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 키메라 경쇄 자리를 제조하였다.
12개의 인간 Vλ 및 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 인간 λ 소형 자리. RP11-729g4(인비트로겐)라 칭하는 인간 BAC 클론을 사용하여 클러스터 A 기원의 제1의 12개의 연속 인간 Vλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절 또는 4개의 hJλ 유전자 분절을 포함하도록 일련의 초기 표적화 벡터를 조작하였다. 도 22a 및 도 22b는 각각 마우스 λ 및 κ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절의 초기 삽입체를 제조하기 위해 작제된 표적화 벡터를 나타낸다.
초기 표적화 벡터의 제1 세트에 대해, 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절을 포함하는 729g4 BAC 클론 유래의 124,125bp DNA 단편은 3' 마우스 상동성 부문의 결찰을 위해 hJλ1 유전자 분절의 다운스트림(3')에 PISceI 부위 996bp를 포함하도록 조작하였다. 2개의 상이한 세트의 상동성 부문을 이 인간 단편으로의 결찰을 위해 사용하였고; 상동성 부문의 하나의 세트는 135k15 BAC 클론 유래의 내인성 마우스 λ 서열을 포함하고(도 22a), 또 다른 세트는 각각 마우스 BAC 클론 RP23-302g12 및 RP23-254m04 기원의 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 5' 및 3'에 내인성 κ 서열을 포함하였다(도 22b).
12/1-λ 표적화 벡터에 대해(도 22a), PI-SceI 부위는 마우스 Cλ2-Jλ4-Cλ4 및 실시예 10에 기재된 변형된 마우스 λ 자리의 인핸서 2.4를 포함하는 27,847bp DNA 단편의 5' 말단에서 조작하였다. 약 28kb 마우스 단편은, 5'로부터 3'로, hJλ1 유전자 분절, hJλ1 유전자 분절의 3'에 있는 996bp의 인간 λ 서열, 마우스 Cλ2 유전자에 대해 5'에 있는 1229bp의 마우스 λ 서열, 마우스 Cλ2 유전자 및 약 28kb의 마우스 단편의 나머지 부분을 포함하는 3' 접합부를 생성시키는, 약 124kb 인간 λ 단편으로의 결찰에 의해 3' 상동성 부문으로서 사용하였다. 인간 Vλ3-12 유전자 분절 기원의 업스트림(5')은 내인성 마우스 λ 자리의 5' 서열에 상응하는 23,792bp의 마우스 게놈 DNA를 포함하는, 5' 마우스 상동성 부문의 개시부 전에 부가적인 1456bp의 인간 λ 서열이다. 인간 λ 서열의 5' 상동성 부문 및 개시부 사이에 Frt 부위를 양 측면에 지니는 네오마이신 카세트가 있다.
따라서, 12/1-λ 표적화 벡터는, 5'로부터 3'로, 내인성 λ 자리의 5'에 약 24kb의 마우스 λ 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 부문, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, 제1의 12개의 연속 hVλ 유전자 분절 및 hJλ 유전자 분절을 포함하는 약 123kb의 인간 게놈 λ 서열, PI-SceI 부위, 및 내인성 Cλ2-Jλ4-Cλ4 유전자 분절을 포함하는 약 28kb의 마우스 게놈 서열, 마우스 인핸서 2.4 서열 및 인핸서 2.4의 다운스트림(3')에 부가적인 마우스 게놈 서열을 포함하는 3' 상동성 부문을 함유한다(도 22a).
유사한 방식으로, 마우스 κ 서열을 포함하는 마우스 상동성 부문이 내인성 κ 자리로의 표적화가 상동성 재조합에 의해 성취될 수 있도록 사용된다는 것을 제외하고는, 12/1-κ 표적화 벡터(도 22b)는 동일한 약 124 인간 λ 단편을 사용하였다. 따라서, 2/1-κ 표적화 벡터는, 5'로부터 3'로, 내인성 κ 자리의 5'에 약 23kb의 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 부문, I-CeuI 부위, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, 제1의 12개의 연속 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절을 포함하는 약 124kb의 인간 게놈 λ 서열, PI-SceI 부위 및 내인성 Cκ 유전자, Eκi 및 Eκ3'을 포함하는 약 28kb의 마우스 게놈 서열 및 Eκ3'의 다운스트림(3')에 부가적인 마우스 게놈 서열을 포함하는 3' 상동성 부문을 포함한다(도 22b, 12/1-κ 표적화 벡터).
이들 2개의 초기 표적화 벡터 중 하나에 의한 상동성 재조합으로 재조합 시 키메라 λ 경쇄의 형성을 유도하는 내인성 마우스 경쇄 불변 유전자 및 인핸서(Cκ 또는 Cλ2 및 Eκi/Eκ3' 또는 Enh2.4/Enh3.1)에 작동적으로 연결된 12hVλ 유전자 분절 및 hJλ1 유전자 분절을 포함하는 변형된 마우스 경쇄 자리(κ 또는 λ)를 생성하였다.
12개의 인간 Vλ 및 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 갖는 인간 λ 소형 자리. 키메라 λ 경쇄 자리에 다양성을 부가하기 위한 다른 접근법에서, 제3 초기 표적화 벡터는 클러스터 A로부터의 제1의 12개의 연속 인간 Vλ 유전자 분절 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절을 마우스 κ 경쇄 자리로 삽입하도록 조작한다(도 22b, 12/4-κ 표적화 벡터). hJλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7 유전자 분절을 함유하는 DNA 분절은 신생 DNA 합성(Integrated DNA Technologies)에 의해 제조하고, 이는 각각 Jλ 유전자 분절 및 각각의 Jλ 유전자 분절의 5' 및 3'에 바로 있는 영역 둘 다 기원의 약 100bp의 인간 게놈 서열을 포함한다. PI-SceI 부위는 약 1kb의 DNA 단편의 3' 말단 내로 조작하고 클로로람페니콜 카세트에 결찰하였다. 상동성 부문은 인간 BAC 클론 729g4의 hJλ1 유전자 분절에 대한 5' 및 3' 위치에서 인간 λ 서열로부터 PCR 증폭시켰다. 중간 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 5' Frt 부위에 대해 5'에 I-CeuI 부위를 또한 포함하는 Frt 부위룰 양 측면에 지니는 네오마이신 카세트를 갖는 인간 Vλ3-12 유전자 분절의 업스트림(5')에서 이미 표적화된 변형된 729g4 BAC 클론에서 수행하였다. 이중 표적화된 729g4 BAC 클론은, 5'로부터 3'로, I-CeuI 부위, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, 제1의 12 hVλ 유전자 분절을 포함하는 약 123kb의 단편, 인간 Jλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절을 포함하는 약 1kb의 단편, PI-SceI 부위 및 클로로람페니콜 카세트를 포함한다. 중간 표적화 벡터를 ICeuI 및 PI-SceI와 함께 분해하고 후속하여 변형된 마우스 BAC 클론(상기 기재)에 결찰하여 제3 표적화 벡터를 생성하였다.
이 결찰은 인간 λ 서열을 내인성 κ 경쇄 자리로 삽입하기 위한 제3 표적화 벡터를 생성시키고, 벡터는, 5'로부터 3'로, 내인성 마우스 κ 자리의 5'에 약 23kb의 게놈 서열을 포함하는 5' 마우스 상동성 부문, I-CeuI 부위, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, 제1의 12 hVλ 유전자 분절을 포함하는 약 123kb의 단편 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절을 포함하는 약 1kb의 단편, PI-SceI 부위 및 내인성 마우스 Cκ 유전자, Eκi 및 Eκ3'을 포함하는 약 28kb의 마우스 게놈 서열 및 Eκ3'의 다운스트림(3')에 부가적인 마우스 게놈 서열을 포함하는 3' 상동성 부문을 포함한다(도 22, 12/1-κ 표적화 벡터). 제3 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, 키메라 인간 λ/마우스 κ 경쇄를 형성시키는, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된, 12 hVλ 유전자 분절 및 4개의 hJλ 유전자 분절을 포함하는 변형된 마우스 κ 경쇄 자리를 생성하였다.
통합된 인간 κ 경쇄 서열을 갖는 인간 λ 소형 자리. 유사한 방식으로, 인간 λ 유전자 분절의 내인성 κ 경쇄 자리로의 초기 삽입체(도 22b, 12/1-λ 및 12/4-κ 표적화 벡터)를 제조하기 위해 조작된 것과 유사한 2개의 부가적인 표적화 벡터는 연속 인간 λ 및 κ 게놈 서열을 포함하는 독특하게 작제된 표적화 벡터를 사용하여 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 점진적으로 삽입하기 위해 조작하였다. 이 표적화 벡터는 인간 Vκ4-1과 Jκ1 유전자 분절 사이에 천연적으로 위치한 약 23kb의 인간 κ 게놈 서열을 포함하도록 작제하였다. 이 인간 κ 게놈 서열을 인간 Vλ와 인간 Jλ 유전자 분절 사이에 이들 2개의 부가적인 삽입 벡터(도 22b, 12(κ)-κ 및 12(κ)4-κ 표적화 벡터) 내에 특이적으로 위치시켰다.
인간 κ 게놈 서열을 함유하는 표적화 벡터 둘 다는 상기된 변형된 RP11-729g4 BAC 클론을 사용하여 제조하였다(도 24). 이 변형된 BAC 클론은 NotI 및 AsiSI 제한 부위를 양 측면에 지니는 스펙티노마이신 선별 카세트로 표적화하였다(도 24, 상부 좌측). 스펙티노마이신 카세트에 의한 상동성 재조합은, 5'로부터 3'로, I-CeuI 부위, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, 제1의 12 hVλ 유전자 분절을 포함하는 약 123kb의 단편, hVλ3-1 유전자 분절의 노나머 서열에 대해 약 200bp 다운스트림(3')에 NotI 부위, 스펙티노마이신 카세트 및 AsiSI 부위를 포함하는 이중 표적화된 729g4 BAC 클론을 생성시켰다. 인간 κ 서열을 포함하는 별개의 인간 BAC 클론(CTD-2366j12)은, 2회 별도의 시점에 hVκ4-1과 hJκ1 유전자 분절 사이의 위치에서 제한 부위를 조작하여 이중 표적화된 변형된 729g4 BAC 클론 내에 포함된 hVλ 유전자 분절과의 결찰을 위한 약 23kb의 단편의 후속하는 클로닝이 가능하도록 표적화하였다(도 24, 상부 우측).
간단히 말하면, 2366j12 BAC 클론은 크기가 약 132kb이고 hVκ 유전자 분절 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, Vκ 유전자 분절의 다운스트림에 인간 κ 게놈 서열, hJκ 유전자 분절 1-5, hCκ 및 인간 κ 자리의 약 20kb의 부가적인 게놈 서열을 포함한다. 이 클론을 먼저 Frt 부위를 양 측면에 지니는 하이그로마이신 카세트 및 3' Frt 부위의 다운스트림(3')에 있는 NotI 부위를 포함하는 표적화 벡터로 표적화하였다. 이 표적화 벡터에 대한 상동성 부문은 BAC 클론 내에 Vκ 유전자 분절의 5' 및 3'에 인간 게놈 서열을 포함하여 이 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합 시 Vκ 유전자 분절은 결실되고 NotI 부위는 hVκ 4-1 유전자 분절의 약 133bp의 다운스트림에서 조작된다(도 24, 상부 우측). 이 변형된 2366j12 BAC 클론을 3' 말단에서 2개의 표적화 벡터로 독립적으로 표적화하여 hJλ1 유전자 분절, PI-SceI 부위 및 AsiSI 부위 또는 4개의 hJλ 유전자 분절(상기 참조), PI-SceI 부위 및 AsiSI 부위를 포함하는 인간 λ 게놈 단편을 또한 포함하는 클로로람페니콜 카세트를 갖는 hJκ 유전자 분절을 결실시킨다(도 24, 상부 우측). 이들 2개의 유사한 표적화 벡터에 대한 상동성 부문은 hJκ 유전자 분절의 5' 및 3'에 있는 서열을 포함한다. 이들 제2 표적화 벡터 및 변형된 2366J12 BAC 클론에 의한 상동성 재조합은, 5'로부터 3'로, 5' Frt 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' Frt 부위, NotI 부위, Vκ4-1과 Jκ1 유전자 분절 사이에 유전자간 영역을 포함하는 인간 κ 자리의 22,800bp의 게놈 단편, hJλ1 유전자 분절 또는 hJλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7을 포함하는 인간 λ 게놈 단편, PI-SceI 부위 및 클로로람페니콜 카세트를 포함하는 이중 표적화된 2366j12 클론을 생성시켰다(도 24, 상부 우측). 2개의 부가적인 변형을 만들기 위한 2개의 최종 표적화 벡터는 이중 표적화된 729g4 및 2366j12 클론을 사용하는 2개의 결찰 단계에 의해 성취하였다.
이중 표적화된 729g4 및 2366j12 클론을 NotI 및 AsiSI로 분해하여 각각 네오마이신 카세트 및 hVλ 유전자 분절을 포함하는 하나의 단편 및 Vκ4-1과 Jκ1 유전자 분절 사이의 유전자간 영역을 포함하는 인간 κ 자리의 약 23kb의 게놈 단편, hJλ1 유전자 분절 또는 hJλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7 유전자 분절을 포함하는 게놈 단편, PI-SceI 부위 및 클로로람페니콜 카세트를 포함하는 다른 단편을 생성하였다. 이들 단편의 결찰은, 5'로부터 3'로, hVλ 유전자 분절, Vκ4-1과 Jκ1 유전자 분절 사이에 인간 κ 게놈 서열, hJλ1 유전자 분절 또는 hJλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7 유전자 분절을 포함하는 게놈 단편, PI-SceI 부위 및 클로로람페니콜 카세트를 포함하는 2개의 독특한 BAC 클론을 생성시켰다(도 24, 하부). 이후, 이들 새로운 BAC 클론을 I-CeuI 및 PI-SceI로 분해하여 업스트림 네오마이신 카세트 및 연속 인간 λ 및 κ 서열을 포함하는 독특한 단편을 방출시키고, 5'로부터 3'로, 내인성 κ 자리의 5'에 있는 마우스 게놈 서열, I-CeuI 부위, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위, hVλ 유전자 분절(3-12 내지 3-1), Vλ3-1의 약 200bp 다운스트림에 있는 NotI 부위, 인간 Vκ4-1 및 Jκ1 유전자 분절 사이에서 천연적으로 발견되는 약 23kb의 인간 κ 서열, hJλ1 유전자 분절 또는 hJλ1, Jλ2, Jλ3 및 hJλ7 유전자 분절을 포함하는 게놈 단편, 마우스 Eκi, 마우스 Cκ 유전자 및 Eκ3'를 포함하는 변형된 마우스 BAC 클론 302g12에 결찰하였다(도 22, 12hVλ-VκJκ-hJλ1 및 12hVλ-VκJκ-4hJλ 표적화 벡터). 이들 표적화 벡터 둘 다에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, 키메라 인간 l/마우스 κ 경쇄를 형성시키는, 12hVλ 유전자 분절, 인간 κ 게놈 서열 및 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 1개 또는 4개의 hJλ 유전자 분절을 포함하는 2개의 별개의 변형된 마우스 κ 경쇄 자리를 생성하였다.
실시예 12. 인간 λ 경쇄 소형 자리로의 부가적인 인간 Vλ 유전자 분절이 조작
부가적인 hVλ 유전자 분절은 유사한 표적화 벡터 및 방법을 이용하여 실시예 11에 기재된 각각의 초기 변형에 독립적으로 부가하였다(도 23a, +16-λ 표적화 벡터 및 도 23b, +16-κ 표적화 벡터).
16개의 부가적인 인간 Vλ 유전자 분절의 도입. 16개 부가적인 hVλ 유전자 분절을 실시예 112에 기재된 변형된 경쇄 자리로 부가하기 위한 표적화 벡터를 작제하는 데 사용되는 업스트림(5') 상동성 부문은 내인성 κ 또는 λ 경쇄 자리의 5'에 있는 마우스 게놈 서열을 포함한다. 3' 상동성 부문은 모든 표적화 벡터에 대해 동일하고 실시예 11에 기재된 바와 같이 변형의 인간 λ 서열의 5' 말단과 중첩하는 인간 게놈 서열을 포함한다.
간단히 말하면, 2개의 표적화 벡터는 실시예 11에 기재된 변형된 마우스 경쇄 자리에 16개 부가적인 hVλ 유전자 분절의 도입을 위해 조작하였다(도 23a 및 도 5b, +16-λ 또는 +16-κ 표적화 벡터). 클러스터 A 기원의 21개의 연속 hVλ 유전자 분절을 포함하는 인간 BAC 클론 RP11-761113(인비트로겐) 기원의 약 172kb의 DNA 단편을 내인성 κ 또는 λ 경쇄 자리에 대해 5'에 있는 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 부문 및 인간 게놈 λ 서열을 포함하는 3' 상동성 부문과 조작하였다. 이들 표적화 작제물에 사용되는 5' 마우스 κ 또는 λ 상동성 부문은 실시예 11에 기재된 것과 동일한 5' 상동성 부문이다(도 23a 및 도 23b). 3' 상동성 부문은 실시예 11에 기재된 약 123kb의 단편의 인간 게놈 λ 서열의 동등한 5' 말단에 상응하는 인간 게놈 λ 서열의 53,057bp 중첩을 포함한다. 이들 2개의 표적화 벡터는, 5'로부터 3'로, 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 5'에 있는 약 23kb의 게놈 서열 또는 내인성 λ 경쇄 자리의 5'에 있는 약 24kb의 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 마우스 상동성 부문, 5' Frt 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' Fit 부위, 및 실시예 12에 기재된 인간 λ 서열의 5' 말단과 약 53kb가 중첩하고 표적화 작제물에 대해 3' 상동성 부문으로서 작용하는 21개의 연속 hVλ 유전자 분절을 포함하는 171,457bp의 인간 게놈 λ 서열을 포함한다(도 23a 및 도 23b, +16-λ 또는 +16-κ 표적화 벡터). 이들 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, 키메라 경쇄를 형성시키는, 각각 28hVλ 유전자 분절 및 내인성 마우스 불변 유전자(Cκ 또는 Cλ2)에 작동적으로 연결된 hJλ1 유전자 분절을 포함하는 독립적으로 변형된 마우스 κ 및 λ 경쇄 자리를 생성하였다.
유사한 방식으로, +16-κ 표적화 벡터를 또한 사용하여 16개의 부가적인 hVλ 유전자 분절을, 통합된 인간 κ 서열의 존재 및 부재 하에 다수의 hJλ 유전자 분절을 혼입시키는 실시예 11에 기재된 다른 초기 변형에 도입하였다(도 22b). 다른 초기 변형을 포함하는 내인성 마우스 κ 자리에서의 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, 키메라 λ-κ 경쇄를 형성시키는, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열의 존재 또는 부재 하에 28 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절을 포함하는 마우스 κ 경쇄 자리를 생성하였다.
12개의 부가적인 인간 Vλ 유전자 분절의 도입. 부가적인 hVλ 유전자 분절을 독립적으로 유사한 표적화 벡터 및 방법을 이용하여 상기된 변형 각각에 부가하였다. 부가적인 hVλ 유전자 분절을 포함하는 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합으로부터 얻은 최종 자리 구조는 도 25a 및 도 25b에 도시되어 있다.
간단히 말하면, 상기 기재된 변형된 마우스 κ 및 λ 경쇄 자리로 12개 부가적인 hVλ 유전자 분절의 도입을 위해 표적화 벡터를 조작하였다(도 23a 및 도 23b, +12-λ 또는 12-κ 표적화 벡터). 클러스터 B 기원의 12개의 연속 hVλ 유전자 분절을 포함하는 인간 BAC 클론 RP11-22I18(인비트로겐) 기원의 93,674bp의 DNA 단편은 내인성 마우스 κ 또는 λ 경쇄 자리에 대해 5'에 있는 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 부문 및 인간 게놈 λ 서열을 포함하는 3' 상동성 부문으로 조작하였다. 이 표적화 작제물에 사용되는 5' 상동성 부문은 상기 기재된 16 hVλ 유전자 분절의 부가를 위해 사용되는 동일한 5' 상동성 부문이다(도 23a 및 도 23b). 3' 상동성 부문은 BAC 클론 RP11-761I13으로부터 인간 λ 서열의 27,468bp의 게놈 단편에 포함된 인간 Vλ3-29P 유전자 분절에 대해 약 3431bp 5'에 있는 PI-SceI 부위를 조작함으로써 제조하였다. 이 PI-SceI 부위는 약 94kb의 부가적인 인간 λ 서열 단편을, +16-λ 또는 +16-κ 표적화 벡터(도 23a 및 도 23b)를 사용하는 이전의 변형에서 인간 λ 서열의 5' 말단과 중첩하는 약 27kb의 인간 λ 서열 단편으로 연결하기 위한 결찰점으로서 작용한다. 이들 2개의 표적화 벡터는, 5'로부터 3'로, 내인성 κ 경쇄 자리의 5'에 있는 약 23kb의 마우스 게놈 서열, 또는 내인성 λ 경쇄 자리의 5'에 있는 약 24kb의 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 부문, 5' Frt 부위, 네오마이신 카세트, 3' Frt 부위 및 16개 부가적인 hVλ 유전자 분절의 삽입 기원의 인간 λ 서열의 5' 말단과 약 27kb 중첩하고 이 표적화 작제물에 대해 3' 상동성 부문으로서 작용하는, 16 hVλ 유전자 분절 및 PI-SceI 부위를 포함하는 121,188bp의 인간 게놈 λ 서열을 포함한다(도 23a 및 도 23b, +12-λ 또는 12-κ 표적화 벡터). 이 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, 키메라 경쇄를 형성시키는, 내인성 마우스 불변 유전자(Cκ 또는 Cλ2)에 작동적으로 연결된 40 hVλ 유전자 분절 및 인간 Jλ1을 포함하는 변형된 마우스 κ 및 λ 경쇄 자리를 독립적으로 생성하였다(도 23a 및 도 23b의 하부).
유사한 방식으로, +12-κ 표적화 벡터를 또한 사용하여 12개 부가적인 hVλ 유전자 분절을 통합된 인간 κ 서열의 존재 또는 부재 하에 다수의 hJλ 유전자 분절을 혼입시키는 다른 초기 변형에 도입하였다(도 22b). 다른 변형을 포함하는 내인성 마우스 κ 자리에서 이 표적화 벡터에 의한 상동성 재조합은, 재조합 시, λ-κ 경쇄를 형성시키는, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열의 존재 및 부재 하에 40 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1, 2, 3 및 7 유전자 분절을 포함하는 마우스 κ 경쇄 자리를 생성하였다.
실시예 13. 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 표적화된 ES 세포의 확인
이전의 실시예에 따라 제조된 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 전기천공하여 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위해 변형된 ES 세포를 생성하였다. 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 유전자 분절의 삽입체를 포함하는 ES 세포는 정량적 타크만(등록상표) 분석으로 확인하였다. 특이적 프라이머 세트 및 프로브는 인간 λ 서열 및 관련 선별 카세트의 삽입(대립 유전자의 수득, GOA), 내인성 마우스 서열 및 임의의 선별 카세트의 상실(대립 유전자의 상실, LOA) 및 플랭킹 마우스 서열의 보유(대립 유전자 보유, AR)를 위해 설계하였다. 인간 λ 서열의 각각의 부가적인 삽입을 위해, 부가적인 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 이전에 표적화된 인간 서열의 보유를 확인하기 위해 사용된 이전의 프라이머 세트 및 프로브 뿐만 아니라 부가적인 인간 λ 서열의 존재를 확인하였다. 벨로시뮨0은 정량적 PCR 검정에 사용되는 프라이머 및 관련 프로브를 기재한 것이다. 표 11은 ES 세포 클론에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절의 각각의 절편에 대한 삽입을 확인하기 위해 사용되는 조합을 기재한 것이다.
인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 ES 세포는 임의로 FLP를 발현하는 작제물로 형질감염시켜 인간 Vλ5-52-Vλ1-40 유전자 분절을 포함하는 표적화 작제물의 삽입에 의해 도입된 Frt화 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 23a 및 도 23b). 네오마이신 카세트는 임의로 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 교배하여 제거될 수 있다(예컨대, 미국 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 14. 내인성 경쇄 자리로부터 인간 λ 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용하고 벨로시마우스 방법에 의해 8-세포기 마우스 배아에 도입하였다(예컨대, 미국 특허 7,294,754 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조). 인간 λ유전자 분절을 독립적으로 보유하는 벨로시마우스(VELOCIMICE)(공여체 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 마우스)은 독특한 인간 λ 유전자 분절의 존재를 검출하는 변형된 대립 유전자 검정의 변형(Valenzuela et al., 상기 참조)을 사용한 유전자형 분석에 의해 확인하였다(상기 참조).
인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 마우스의 κ:λ 경쇄 사용. 단일 유전자 분절을 갖는 hVλ 유전자 분절의 3개의 연속적인 삽입 각각에 대한 마우스 동형접합체(도 23b) 및 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 단일 hJλ 유전자 분절 또는 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 갖는 hVλ 유전자 분절의 제1 삽입에 대한 마우스 동형접합체(도 23b)는 유세포 분석기를 사용하여 비장세포에서 κ 및 λ 경쇄 발현에 대해 분석하였다.
간단히 말하면, 비장은 마우스 그룹(그룹당 3마리 내지 7마리 동물)으로부터 수확하고 유리 슬라이드를 사용하여 분쇄하였다. ACK 용해 완충제로 적혈구 세포(RBC)를 용해시킨 후(Lonza Walkersville), 비장세포는 마우스 CD19(클론 1D3; BD Biosciences), 마우스 CD3(17A2; Biolegend), 마우스 Igκ(187.1; BD Biosciences) 및 마우스 Igλ(RML-42; Biolegend)에 특이적인 형광 염료 접합 항체로 염색하였다. BD(상표명) LSR II 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 획득하고 FLOWJO(상표명) 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 표 12는 각각의 유전자 변형을 보유하는 동물 그룹 기원의 비장세포에서 관찰된 B 세포(CD19+), κ 경쇄(CD19+Igκ+Igλ_) 및 λ 경쇄(CD19+Igκ-Igλ+) 발현에 대한 평균 % 값을 나타낸다.
유사한 실험에서, 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 12 hVλ 및 4개 hJλ 유전자 분절의 제1 삽입을 위한 동형접합인 마우스(도 22b의 하부) 및 40 hVλ 및 1개의 hJλ 유전자 분절에 대해 동형접합인 마우스(도 23b의 하부 또는 도 25b의 상부) 기원의 비장 구획의 B 세포 함량을 유세포 분석기(상기 기재)를 사용하여 Igκ 및 Igλ 발현에 대해 분석하였다. 도 26a는 각각의 그룹 기원의 대표적인 마우스에 대한 CD19+ B 세포에서 Igλ 및 Igκ 발현을 나타낸다. 비장마다 CD19+ B 세포의 수를 또한 각각의 마우스에 대해 기록하였다(도 26b).
또 다른 실험에서, 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대해 동형접합인 마우스 기원의 비장 및 골수 구획의 B 세포 함량(도 26b의 하부)은 다양한 세포 표면 마커의 유세포 분석기를 사용하여 B 세포 발생을 통한 진행에 대해 분석하였다.
간단히 말하면, 야생형, 및 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대해 동형접합인 마우스의 2개의 그룹(각각 N=3, 9 내지 12주령, 수컷 및 암컷)을 희생시키고 비장 및 골수를 수확하였다. 골수는 완전 RPMI 배지(태아 소 혈청, 피루브산나트륨, 헤페스(Hepes), 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 젠타마이신이 보충된 RPI 배지)로 수세하여 대퇴골로부터 수집하였다. 비장 및 골수 집단으로부터의 RBC를 ACK 용해 완충제(Lonza Walkersville)로 용해한 후, 완전 RPMI 배지로 세척하였다. 1x106개 세포를 얼음에서 10분 동안 항마우스 CD16/CD32(2.4G2, BD Biosciences)와 항온처리한 후, 선택된 항체 패널로 얼음에서 30분 동안 표지화하였다.
골수 패널: 항마우스 FITC-CD43(1B11, BioLegend), PE-c키트(2B8, BioLegend), PeCy7-IgM(II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, BioLegend), APC- B220(RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19(ID3, BD) 및 퍼시픽 블루(Pacific Blue)-CD3(17A2, BioLegend).
골수 및 비장 패널: 항마우스 FITC-Igκ(187.1, BD), PE-Igλ(RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM(II/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, BioLegend), 퍼시픽 블루-CD3(17A2, BioLegend), APC- B220(RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19(ID3, BD).
염색 후, 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드 중에 고정시켰다. 데이타 획득은 FACSCANTOII(상표명) 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 수행하고 FLOWJO(상표명) 소프트웨어(Tree Star, Inc.)로 분석하였다. 도 27a 내지 도 27d는 각각의 그룹 기원의 하나의 대표적인 마우스의 비장 구획에 대한 결과를 보여준다. 도 10a 내지 도 10e는 각각의 그룹 기원의 하나의 대표적인 마우스의 골수 구획에 대한 결과를 나타낸다. 도 28a 내지 도 28e는 각각의 그룹 기원의 하나의 대표적인 마우스의 골수 구획에 대한 결과를 나타낸다. 표 13은 다양한 유전적 변형을 보유하는 동물 그룹 기원의 비장세포에서 관측된 B 세포(CD19+), κ 경쇄 (CD19+Igκ+Igλ-), 및 λ 경쇄(CD19+Igκ-Igλ+) 발현에 대한 평균 % 값을 나타낸다. 표 14는 야생형, 및 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대해 동형접합인 마우스의 골수에서 관측된 B 세포(CD19+), 성숙 B 세포(B220hiIgM+), 미성숙 B 세포(B220intIgM+), κ 경쇄(B220intIgM+Igκ+)를 발현하는 미성숙 B 세포 및 λ 경쇄(B220intIgM+Igλ+)를 발현하는 미성숙 B 세포에 대한 평균 % 값을 나타낸다. 이 실험은 상기 기재된 마우스의 부가적인 그룹으로 반복되고 유사한 결과를 나타냈다(데이터 표시 생략).
인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 마우스에서의 인간 Vλ 유전자 사용. 인간 λ 서열(hVλ3-12-hVλ3-1 및 hJλ1, 도 23b)의 제1 삽입에 대해 이형접합인 마우스 및 인간 λ 서열(hVλ5-52-hVλ3-1 및 hJλ1, 도 23b)의 제3 삽입에 대해 동형접합인 마우스는 비장세포로부터 단리된 RNA를 사용하는 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 인간 λ 경쇄 유전자 사용에 대해 분석하였다.
간단히 말하면, 비장을 수확하고 멸균 1회용 백 중에 5% HI-FBS를 갖는 10㎖의 RPMI-1640(시그마)으로 관류하였다. 이후, 단일 비장을 포함하는 각각의 백을 스토마셔(Stomacher)(상표명)(Seward)에 위치시키고 30초 동안 배지 세팅에서 파쇄하였다. 파쇄된 비장은 0.7㎛ 세포 스트레이너(strainer)를 사용하여 여과한 후 원심분리(10분 동안 1000rpm)로 펠렛화하고 RBC는 3분 동안 BD Pharm Lyse(상표명)(BD Biosciences)에서 용해시켰다. 비장 세포는 RPMI-1640으로 희석하고 다시 원심분리한 후, 1㎖의 PBS PBS(Irvine Scientific) 중에 재현탁시켰다. RNA는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 펠렛화된 비장 세포로부터 단리하였다.
RT-PCR을 인간 hVλ 유전자 분절 및 마우스 Cκ 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 비장세포 RNA에 대해 수행하였다(표 15). PCR 생성물은 겔 정제하고 pCR2.1-TOPO TA 벡터(인비트로겐)로 클로닝하고 클로닝 부위를 플랭킹하는 위치에서 벡터 내에 위치하는 프라이머 M13 정배향(GTAAAACGAC GGCCAG; 서열번호 113) 및 M13 역배향(CAGGAAACAG CTATGAC; 서열번호 114)을 이용하여 서열분석하였다. 인간 λ 서열의 제1 및 제3 삽입으로부터 유래하는 84개의 전체 클론을 서열분석하여 hVλ 유전자 사용을 측정하였다(표 16). 선택된 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ1-mCκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열은 도 29에 도시되어 있다.
유사한 방식으로, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 경쇄 유전자 서열의 제3 삽입(즉, 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40 hVλ 유전자 분절 및 4개의 hJλ 유전자 분절, 도 25b의 하부)에 동형접합인 마우스는 비장세포로부터 단리된 RNA를 사용하는 RT-PCR에 의해 인간 λ 경쇄 유전자 사용에 대해 분석하였다(상기 기재). 26개의 선택된 RT-PCR 클론에 대한 상기 인간 λ 경쇄 유전자 분절 사용은 표 17에 기재되어 있다. 선택된 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ-mCκ 접합부의 뉴클레오타이드 서열은 도 30에 도시되어 있다.
유사한 방식으로, 내인성 마우스 Cλ2 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 경쇄 유전자 분절의 제1 삽입(12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1, 도 22a 및 도 23a)에 대해 동형접합인 마우스는 비장세포로부터 단리된 RNA를 사용하는 RT-PCR에 의해 인간 λ 경쇄 유전자 사용에 대해 분석하였다(상기 기재). hVλ 유전자 분절에 특이적인 프라이머(표 15)는 마우스 Cλ2 유전자에 특이적인 2개의 프라이머; Cλ2-1(서열번호 162) 또는 Cλ2-2(서열번호 163) 중 하나와 쌍을 형성한다.
hλ1로 재배열된 다수의 hVλ 유전자 분절은 내인성 마우스 λ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 마우스 기원의 RT-PCR 클론으로부터 관측되었다. 선택된 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ-mCλ2 접합부의 뉴클레오타이드 서열은 도 31에 도시되어 있다.
도 29는 단일 hJλ 유전자 분절과 함께 hVλ 유전자 분절의 제1 및 제3 삽입을 보유하는 마우스 기원의 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ1-mCκ 접합부의 서열을 나타낸다. 도 29에 나타낸 서열은 마우스 Cκ 유전자에 재조합된 hJλ1을 갖는 상이한 hVλ 유전자 분절을 포함하는 독특한 재배열을 예시한다. 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1을 포함하는 단일 변형된 내인성 κ 자리를 보유하는 이형접합성 마우스 및 40 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1을 포함하는 2개의 변형된 내인성 κ 자리를 보유하는 동형접합 마우스는 둘 다 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 유전자 분절을 생성하고 인간 λ 경쇄를 발현하는 B 세포를 생성한다. 이들 재배열은 키메라 자리가 이들 마우스 내에 다수의 독립적인 B 세포에서 독립적으로 인간 λ 유전자 분절을 재배열할 수 있다는 것을 입증한다. 추가로, 내인성 κ 경쇄 자리에 대한 이들 변형은 hVλ 유전자 분절 중 어느 것이 작동 불가능하게 하지 않았거나 hJλ1과 재배열하는 것으로 관측된 16개의 상이한 hVλ 유전자 분절에 의해 입증된 바와 같이 B 세포 발생 동안에 다수의 hVλ 및 hJλ(Jλ1) 유전자 분절과 키메라 자리가 재조합하는 것을 방해하지 않았다(표 16). 추가로, 이들 마우스는 내인성 면역글로불린 경쇄 레퍼토리의 일부로서 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 인간 Vλ-Jλ 유전자 분절을 포함하는 기능성 항체를 제조하였다.
도 30은 인간 Vκ-Jκ 게놈 서열을 포함하는 40 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절에 대해 동형접합인 마우스 기원의 선택된 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ-mCκ 접합부의 서열을 나타낸다. 도 30에 나타낸 서열은 다수의 상이한 hVλ 유전자 분절이 재배열되고 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된, 전체 키메라 자리에 걸쳐 있는, 다수의 상이한 hVλ 유전자 분절을 포함하는 부가적인 독특한 재배열을 도시한다. 40 hVλ 및 4개의 hJλ 유전자 분절을 포함하는 변형된 내인성 κ 자리를 포함하는 동형접합 마우스는 또한 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 유전자 분절을 생성하고 인간 λ 경쇄를 발현하는 B 세포를 생성할 수 있다. 이들 재배열은 추가로 모든 단계의 키메라 자리가 이들 마우스 내에 다수의 독립적인 B 세포에서 인간 λ 유전자 분절을 독립적으로 재배열할 수 있다는 것을 입증한다. 추가로, 내인성 κ 경쇄 자리에 대한 이들 부가적인 변형은 인간 λ 유전자 분절의 각각의 삽입이 hVλ 및/또는 Jλ 유전자 분절 중 어느 것도 작동될 수 없도록 하지 않거나, 26개의 선택된 RT-PCR 클론으로부터 모든 4개의 hJλ 유전자 분절(표 17)과 재배열하는 것으로 관측된 12개의 상이한 hVλ 유전자 분절에 의해 입증된 바와 같이 B 세포 발생 동안에 키메라 자리가 hVλ 및 Jλ 유전자 분절과 재조합하는 것을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 추가로, 이들 마우스는 내인성 면역글로불린 경쇄 레퍼토리의 일부로서 마우스 Cκ 영역에 작동적으로 연결된 인간 Vλ-Jλ 유전자 분절을 포함하는 기능성 항체를 제조하였다.
도 31은 12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1에 대해 동종접합인 마우스 기원의 3개의 각각의 RT-PCR 클론에 대한 hVλ-hJλ-mCλ2 접합부의 서열을 나타낸다. 도 31에 나타낸 서열은 hJλ1이 재배열되고 마우스 Cλ2 유전자에 작동적으로 연결된 제1 삽입의 길이에 걸쳐 있는, 상이한 hVλ 유전자 분절을 포함하는 부가적인 독특한 재배열을 도시한다(2D1 = Vλ2-8Jλ1; 2D9 = Vλ3-10Jλ1; 3E15 = Vλ3-1Jλ1). 하나의 클론은 hVλ-hJλ 접합부에서 N 첨가로 인한 비생산적인 재배열을 입증하였다(2D1, 도 31). 이것은, 재조합 동안에 유전자 분절의 연결이 부정확한 것으로 나타남으로써 V(D)J 재조합에서 일반적이다. 이 클론은 이들 마우스의 경쇄 레퍼토리에 존재하는 비생산적인 재조합을 나타내지만, 이것은 항체 유전자 중에 접합 다양성에 기여하는 유전적 기전이 이들 마우스에서 정상적으로 작동하여 보다 큰 다양성을 갖는, 경쇄를 함유하는 항체 레퍼토리를 형성한다는 것을 입증한다.
12 hVλ 유전자 분절 및 hJλ1을 포함하는 변형된 내인성 λ 자리를 함유하는 동형접합 마우스는 또한 내인성 마우스 Cλ 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 유전자 분절을 생성하고 마우스 Cλ 영역에 연결된 hVλ 영역을 포함하는 역 키메라 λ 경쇄를 발현하는 B 세포를 생성할 수 있다. 이들 재배열은 추가로, 다른 경쇄 자리(즉, λ 자리)에 위치한 인간 λ 경쇄 유전자 분절이 이들 마우스에서 다수의 독립적인 B 세포에서 인간 λ 유전자 분절을 독립적으로 재배열할 수 있다는 것을 입증한다. 추가로, 내인성 λ 경쇄 자리에 대한 변형은 인간 λ 유전자 분절의 삽입이 hVλ 및/또는 hJλ1 유전자 분절의 어느 것도 비작동성이도록 하지 않거나 B 세포 발생 동안에 키메라 자리가 hVλ 및 hJλ1 유전자 분절을 재조합하는 것을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 추가로, 이들 마우스는 또한 내인성 면역글로불린 경쇄 레퍼토리의 일부로서 마우스 Cλ 영역에 작동적으로 연결된 인간 Vλ-Jλ 유전자 분절을 포함하는 기능성 항체를 생성하였다.
이 실시예에 나타낸 바와 같이, 내인성 κ 및 λ 경쇄 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 보유하는 마우스는 인간 λ 경쇄 유전자 분절을 재배열할 수 있고, 기능성 경쇄가 비장 및 골수 둘 다에서 B 세포 발생의 다양한 시점에서 요구되기 때문에, 마우스의 정상적인 항체 레퍼토리의 일부로서 마우스 Cκ 및/또는 Cλ 영역의 구조로 이들을 발현할 수 있다. 추가로, B 세포의 조기 하위집단(예를 들어, 프레-, 프로- 및 전이 B 세포)은 야생형 한배 새끼와 비교하여 이들 마우스에서 정상적인 표현형을 입증한다(도 27d, 도 28a 및 도 28b). 골수 및 말초 B 세포 집단에서의 작은 결함이 관찰되고 이는 자가 반응성 미성숙 B 세포의 결실 및/또는 마우스 중쇄와 인간 λ 경쇄의 차선의 연결에 기여할 수 있다. 그러나, 이 마우스에서 관측된 Igκ/lgλ 사용은 마우스에서 관측된 것보다 인간 경쇄를 더 발현하는 상황을 나타낸다.
실시예 15. 내인성 경쇄 자리로부터 인간 λ 경쇄를 발현하는 마우스의 교배
재배열되지 않은 인간 λ 유전자 분절을 보유하는 마우스를, 반대 내인성 경쇄 자리(κ 또는 λ)에서 결실을 포함하는 또 다른 마우스와 교배한다. 예를 들어, 내인성 κ 자리에 위치한 인간 λ 유전자 분절은, 내인성 λ 경쇄 자리에서 또한 결실을 보유하는 마우스에 존재하는 유일한 기능성 경쇄 유전자 분절이다. 상기 방식으로, 얻어진 후손은 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 인간 λ 경쇄만을 발현한다. 교배는 당해 분야에 인지된 표준 기술 및 대안적으로 상업적 회사(예를 들어, Jackson Laboratory)에 의해 수행한다. 내인성 κ 자리에서 인간 λ 경쇄 유전자 분절 및 내인성 λ 경쇄 자리의 결실을 보유하는 마우스 균주는 독특한 역 키메라(인간-마우스) λ 경쇄의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 스크리닝한다.
재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 자리를 보유하는 마우스는 또한 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 자리가 인간 중쇄 가변 유전자 자리로 대체됨을 포함하는 마우스와 교배한다(US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 유전 조작된 마우스). 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스는 부분적으로 내인성 마우스 불변 영역 자리에 작동적으로 연결된 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 것을 포함하여 항원 자극에 응답하여 인간 중쇄 가변 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생성한다. 항체의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 단리될 수 있고 인간 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된다. 이후, DNA는 항체의 완전한 인간 중쇄를 발현할 수 있는 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 교배 스케줄에 따라, 내인성 마우스 중쇄 자리가 내인성 κ 경쇄 자리에서 인간 중쇄 자리 및 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 자리로 교체된 것을 포함하는 마우스를 얻었다. 체세포로 돌연변이된 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 관심 대상 항원과의 면역화 시 단리될 수 있다.
실시예 16. 인간 중쇄 및 인간 λ 경쇄를 발현하는 마우스로부터의 항체의 생성
다른 내인성 Ig 자리(상기 기재)의 변형 및 결실을 포함하는 다양한 원하는 균주에 대한 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 자리를 포함하는 마우스를 교배한 후, 선택된 마우스를 관심 대상 항원과 면역화시켰다.
일반적으로, 단일의 재배열되지 않은 인간 생식선 경쇄 영역 중 하나를 포함하는 벨로시뮨(VELOCIMMUNE)(등록상표) 마우스를 항원으로 공격하고, 림프구 세포(예를 들어, B 세포)를 동물의 혈청으로부터 회수하였다. 림프구 세포는 골수종 세포주와 융합하여 불멸의 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있고 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 면역화에 사용되는 항원에 특이적인 인간 중쇄 및 인간 λ 경쇄를 포함하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인하였다. 중쇄 및 λ 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리하고 중쇄 및 경쇄의 표지화하였다람직한 이소형 불변 영역에 연결시킬 수 있다. 내인성 마우스 λ 자리와 비교하여 부가적인 hVλ 유전자 분절의 존재로 인해, 경쇄 레퍼토리의 다양성이 급격히 증가하고 면역화 시 항원 특이적 레퍼토리에 대해 보다 높은 다양성을 부여한다. 생성된 클로닝된 항체 서열이 후속적으로 CHO 세포와 같은 세포에서 제조될 수 있다. 대안적으로, 항원 특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA는 항원 특이적 림프구(예를 들어, B 세포)로부터 직접 단리될 수 있다.
처음에, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고 친화도 키메라 항체를 단리하였다. 상기된 바와 같이, 친화도, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 대해 항체를 규명하고 선택한다. 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역으로 교체하여 체세포로 돌연변이된 중쇄 및 본 발명의 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 자리로부터 유래된 인간 λ 경쇄를 생성하였다. 적합한 인간 불변 영역은 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1, lgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함한다.
실시예 17. ADAM6 마우스 및 인간 λ 가변 마우스의 교배
내인성 ADAM6 유전자 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체의 변형을 포함하고, 추가로 마우스에 ADAM6 기능을 부여하는 유전자를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 마우스를 인간 또는 마우스 λ 또는 κ 불변 유전자에 작동적으로 연결된 인간 λ 가변 분절(예컨대, V 및 J 분절)을 포함하는 변형을 포함하는 마우스와 교배하였다. 인간 λ 가변 분절을 포함하는 마우스는 변형된 내인성 λ 또는 κ 자리에서, 또는 전이유전자에 존재하는 가변 분절을 가질 수 있다. 마우스를 교배하고 후손을 필요한 대로 추가로 상호교배하고, ADAM6 기능을 나타내고 또한 인간 또는 마우스 λ 또는 κ 불변 영역(경우에 따라 그럴 수 있음)의 구조에서 인간 λ 서열을 발현하는 가임 마우스에 대해 후손을 스크리닝하였다.
이소성 ADAM6 서열(또는 마우스에서 ADAM6 기능을 부여하는 ADAM6의 오솔로그 또는 상동체의 서열)을 추가로 포함하는 인간화 중쇄 가변 자리(모든 또는 실질적으로 모든 마우스 V, D, 및 J 분절을 교체하는 인간 V, D, 및 J 분절)를 포함하는 마우스를 마우스 λ 자리 및/또는 the 마우스 κ 자리에서 인간 λ 경쇄 V 및 J 분절에 의한 모든 또는 실질적으로 모든 경쇄 V 및 J 분절의 교체를 포함하는 마우스와 교배하였다. 후손을 필요한 대로 추가로 교배하고, 중쇄 불변 서열과 융합된 인간 VH 및 λ 또는 κ 경쇄 불변 서열과 융합된 동족 인간 λ VL을 포함하는 항체를 발현하는 마우스를 확인하였다.
마우스를 관심 대상 항원에 노출시키고 면역 반응을 생성하도록 허용하였다. 관심 대상 항원에 특이적인 항체를 확인하고, 인간 VH 서열 및 인간 λ 가변 서열(마우스 κ 불변 영역에 연결된 인간 λ 가변 서열 포함)을 확인하고 사용하여, 인간 불변 영역 유전자와 조합된 가변 도메인 서열을 조작하여 인간 항체를 만들었다.
일 예에서, 내인성 마우스 중쇄 자리에서 인간 V, D, 및 J 분절에 의한 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 중쇄 V, D, 및 J 분절의 교체를 포함하고, λ 불변 서열에 작동적으로 연결된 내인성 마우스 λ 자리에서 하나 이상의 인간 λ 가변 서열에 의한 모든 또는 실질적으로 모든 λ 경쇄 가변 서열의 교체를 포함하는 경쇄 대립 유전자를 포함하고, 하나 이상의 인간 λ 가변 서열에 의한 내인성 κ 자리에서의 모든 또는 실질적으로 모든 κ 경쇄 가변 서열의 교체를 포함하는 경쇄 대립 유전자를 포함하는 교배에 의해 마우스를 생성하였다. 동물을 관심 대상 항원에 노출시키고, 면역 반응을 개시시켰다. 관심 대상 항원에 결합하는 항체는 마우스 λ 또는 마우스 κ 불변 영역에서 인간 λ 가변 도메인과 동족인 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것으로 확인되었다. 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 사용하여, 인간 불변 영역 서열과 조합된 가변 서열을 조작하여 완전한 인간 항체를 만들었다.
이 실시예에 기재된 마우스는 본 명세서 및 도면에 기재된 하나 이상의 Vκ-Jκ 유전자간 영역을 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> Humanized Light Chain Mice
<130> WO/2013/096142
<140> PCT/US2012/069981
<141> 2012-12-17
<150> US 61/578,097
<151> 2011-12-20
<160> 163
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 754
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val
1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val
20 25 30
Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser
35 40 45
Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln
50 55 60
Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu Arg Phe Arg Gly Gln Arg His
65 70 75 80
Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu
85 90 95
Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Glu Tyr Pro Phe
100 105 110
Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Leu Gln
115 120 125
Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Ile
130 135 140
Lys Leu Asp Asn Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln
145 150 155 160
Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr
165 170 175
Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro
180 185 190
Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Leu Ser Ser Lys
195 200 205
Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr
210 215 220
His Ser Val Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Asp Lys Leu Ser Ser Thr Val
225 230 235 240
Glu Tyr Leu Phe Lys Val Ile Ser Leu Met Asp Thr Tyr Leu Thr Asn
245 250 255
Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Glu Ala
260 265 270
Asp Pro Phe Ser Gln Asp Phe Arg Val Pro Gly Gly Gln Ala His Thr
275 280 285
Phe Tyr Glu Arg Val Phe Tyr Ala His Phe Arg Pro Asp Ala Gly Ala
290 295 300
Ile Ile Asn Lys Asn Ser Pro Gly Asp Asp Ala Val Asn Pro Ala Glu
305 310 315 320
Arg Ser Ile Cys Ser Pro Ser Ala Leu Ile Cys Leu Gly Gln His Gly
325 330 335
Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Ile Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg
340 345 350
Ser Leu Gly Leu Lys His Asp Glu Gly Tyr Cys Ile Cys Gln Arg Arg
355 360 365
Asn Thr Cys Ile Met Phe Lys Asn Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser
370 375 380
Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Asp Leu
385 390 395 400
Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu
405 410 415
Thr Tyr Lys Phe Cys Gly Asn Phe Lys Val Asp Asn Asn Glu Gln Cys
420 425 430
Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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610 615 620
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485 490 495
Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Asp Gly
500 505 510
Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu
515 520 525
Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile
530 535 540
Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser
545 550 555 560
Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu
565 570 575
Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Glu His Val Ser
580 585 590
Phe His Gln Ser Ile Ile Ser Gly Phe Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu
595 600 605
His Arg Gly Thr Glu Thr Thr Asp Ala Gly Met Val Arg His Gly Thr
610 615 620
Pro Cys Ser Lys Ser Lys Phe Cys Asp Gln Gly Ala Cys Ser Gly Ser
625 630 635 640
Leu Ser His Leu Gly Tyr Asp Cys Thr Pro Glu Lys Cys Ser Phe Arg
645 650 655
Gly Val Cys Asn Asn His Arg Asn Cys His Cys His Phe Gly Trp Lys
660 665 670
Pro Pro Glu Cys Lys Glu Glu Gly Leu Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly
675 680 685
Ser Pro Pro Val Gln Arg His Thr Ile Lys Gln Lys Gln Glu Pro Val
690 695 700
Val Tyr Leu Arg Ile Leu Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Leu Phe Val Ala
705 710 715 720
Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg
725 730 735
Phe Glu Asp Leu Gln Ala Thr Leu Arg Ser Gly Gln Gly Pro Ala Arg
740 745 750
Asp Lys Pro Lys
755
<210> 3
<211> 13894
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
gtcctaaggt agcgagggat gacagattct ctgttcagtg cactcagggt ctgcctccac 60
gagaatcacc atgccctttc tcaagactgt gttctgtgca gtgccctgtc agtggaaatc 120
tggagagcat gcttccatga gcttgtgagt agtatatcta gtaagccatg gctttgtgtt 180
aatggtgatg ttctacatac cagttctctg gcttaataat gaggtgatga ttctatgttc 240
ctgtaacgct tcctcaactg ggtcctaagt ctttcttcac tccatctatt cctctaagga 300
atgatcctga aaatcccatc acaaactata ggagatggga accatcaaaa aacacagtga 360
caaagaggtg ggaacgcatc agggttcagg aaccatattt taaaaagata tcgtaaataa 420
cttcttaaaa gagatataga caaatctcca ttaatacgga gaccagaggc ctaaggctaa 480
gaaccaatgg tggctcaagg tctcctgcta cccgaggagc aaacgtagag cagtttctaa 540
tgatttattt aaaatataga atcaaaagta ccagtttgca attttgaaag atttatttca 600
gcaatgcaac aacatcaggt ggtgccgagt ccaacacgtc ttatgtccca tgatataaac 660
aaaggccatc cagaactgtg gactggagtt ctaccttgtc ccctaatgac attcagattt 720
tttttccatt ctctttatct tagaggagac agggggctaa ctcattttac ttgtcctttg 780
cttgttcttg ccaagaacgt aaagcagctt gcaagtcttc aaacctaaat atcttagtaa 840
ctcctacacg agtggcaatg ccaaagagca gtgcaacaaa gaggaagtaa atacgaccaa 900
agagtattct taaatacact actggctcta ggttctgttt tattatgcgc ctttgaaccg 960
gaggggaccc actgtctatg ctcccactgt gtccctcttc tttgcacttt ggagggctcc 1020
aaccaaaatg gcaatggcaa ttccgacgat tgttacacac tcctctgaaa ttgcattttt 1080
ctggggtgca gtcataaccc aaacgagata aacttccatt gcaagctcct cgatcacaga 1140
acttacccct tgaacacggg gtaccatgtc tcaccaatcc agcatctgct gtttctgtcc 1200
cacgatgttc atcaagccca aagcaggtaa ccccagagat aaccgattga tggaatgaaa 1260
catgttcttg caaaaatgga agattggtga cattggtaca ctgcaacctt ccacacagct 1320
tgtcctgatc agcacaagca ttgaatgtga ggctttcttc tgctctagta caatgcccaa 1380
atcgaaaccg ttgtttgttg atgtcatagc acttaatatt agcattctta gcacttacac 1440
caaagatttc catgcattgt atgttgcgat cagtgcagtt acctttatag cagtaaccct 1500
cttctgagca tggtgtccca tcttgcagat aagtgtcatc tgggcaaatg aacttagagc 1560
cactacagta ctctggaaga tcacatatgt tctggatagg tctgcagagt gtcccagaag 1620
gactgtaagt gcaatttgca cagcataatt ctttatcaca aatgctacca ggtgttaacc 1680
tgcaatcatt tccacagcag ggatctgaat aacatgcctt ttgggagcca cagtcacact 1740
gctcattgtt atctactttg aagtttccac aaaacttata agtcaatgat gtattataat 1800
aaacatgacg gtcatagaaa agacatggca tcagatcagg agtattaagt atgttgctta 1860
tctctgcaag ggaacaattg ctgaaagcat ctgttaattg aggatttttg aacatgatgc 1920
aggtgttcct tctctggcag atacagtacc cctcatcatg ttttaggcct aaactccttc 1980
caacacgatt ggttattata atagataaaa ataaaggatt tcgaccatgt tgaccaagac 2040
aaattagggc tgagggagaa catatactcc tctcagctgg attaacagca tcatctcctg 2100
gcgaattctt gttaattata gctcctgcat caggcctaaa atgagcataa aatactctct 2160
catagaaagt atgagcctgc cctcctggaa ctcgaaaatc ttgtgaaaat ggatcagcct 2220
cggtatacac agtcatgaga aagacatagt accgcatatg aagattggtc agataggtgt 2280
ccattaaact aatgacttta aacaaatact caacagtaga tgaaagtttg tcacctccag 2340
aagcactata tacagaatgg gttgcttgaa agtggccttt tatagcagct ggatgtgtag 2400
cgtaattctt actagatagt ctgggagctc catctgcata ttccaatctg gaggagggag 2460
aacctgtatt atggctccag tgcttccatg cattcatagg ccctgtgtca tcagactcag 2520
atactatctg agaaacaagg tgttcaaagc tctgtgaatc attgaggggt ttgatttcat 2580
aggtaaggtt atccaacttt atgacccctg acaggccccc ataacaagta tccacagtga 2640
ccatggattg caggatcccc tccaggtagc caatatagta acaatctaca ggaaaaaagg 2700
ggtactccat ctgtaaggct ccttggtcat cttgagttgt cagcaacaag tgtctgggcc 2760
aaatgagtgt ctttctccgc aggtggatga tatgtctctg gccccgaaaa cgcaagctat 2820
acgagagcag tctttgtgct tgaagtcctt tggtatggta gatctccttc cgaggaataa 2880
ccacctccga tgagatgtaa cgccaagtgg gatggccttg agaacaccag actggaacca 2940
ggaggagcag ccagagtgca aatagcaaga ggaggaccct ggggaccaca ggtctttcca 3000
ctagcctcat gccccaggtc agagataaca tcctgggtgg agctaactcc ctctgctgtg 3060
gccactgcct ggtctagaaa atactgacag aggactaaaa acctcctcag gctcccaacc 3120
taagtggtta cccagacaac tggagttagg taacagtcac tgggtgtggc aggaattgag 3180
tctgaatgtg ttagctgagg ttgaggttaa atattgtcaa aagggatgtc tataaatgtg 3240
cctggacaag aaaagtcaga agcagcaagg agtgtctctg acaggctcaa tcctttcttt 3300
tctttttttg aagttcaaaa tatcatttcc acgtgaatgt atttggttcc cagtgtgact 3360
ctgggtctct ttctaggagt caatatttct ttatatcttg gctcatgttt ttcacagttg 3420
ttctaacttc ttgttttgtt ttgtttgttt gtttgtttga aagttagaag taaatactgt 3480
ctatattagc cttttagcta taaatgattg tttttatttc ttctaatcat gttttgtttg 3540
agttttggtt aaactattta caaatgagtt ttttttttcc ttttgggtgt tgctcgaaag 3600
tttggagctt tctgttaata ttgtgttgtt gtttctccaa tattattaga cctgagaatt 3660
ctacctgggt acctgtgaac tccagaattt ttaaaaattc catctcttgg gaacattatc 3720
tctgaccccg tctgaggccg aagtggctgt ccccctccaa cctttagtat ctttctttcc 3780
tgactattgg gatttcttca agcaatcagg ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag 3840
actgtcggta tgaacgtcga agagtctgcc acacactccg ggttcatcaa cagtgctttc 3900
gcgtctctta cttttgtaga aggaaatgca gcctctgagt tttctccaag aaatcattga 3960
tgaaagggtg aaaagatggg tatcacccgg agttcatgac aagccctggc tcagacacgt 4020
gagcaaggtc tacagcccca aagataggct gccctgcaac atgtatttat aagataggag 4080
aaaaaaatgg gtagttggag ggttgatcaa cttacttcct ctcaaacata tatatctcat 4140
ctaagtgtgc aggggaaaac tctgtagaac tactgggata cctgctcacc cccaggagcc 4200
tcatgaataa gtctctgctt ctgccttgta gccatgagca ttactgcacc tgatacccct 4260
gcagcttcct agggaagagg gaggaagtga cttggcccct gtctggttaa ggtaagagga 4320
gataaatccc ttctcattga ttagggtgag aggggtcatg tgctctatca ttggtgaccc 4380
agttgggaca tgggtttata ccaaagtcat cactctgagg ttctgtgtac caccaggctg 4440
aactcccata tcctacatgg acataggaca acaccaagca gaaggaggtt ttaggactaa 4500
actgaaggac agagatgcgg tttctaaaca actagggagt gccagggcca gcctctctaa 4560
ccactatagg acactgtgga gtctggttac aaagagagat tactcaaggt ccttagcact 4620
gattacagag catatctcag atgccttctg ctgaccagat gtatctttgc ataatctgcc 4680
tatccagatt cagaaaattg atgccacata gccaagtgga ctttcaggaa cagacgattt 4740
aaaaacaggc agagagatgt gagagaaagg agaaggagag agagaaggga gagggagaga 4800
agagagaggg agacggagaa ggaaagaggg agaaggagaa ggagagaagg ggcatggaca 4860
gagggaggga cagaaggaga gaggagatag agagggggat aaggaagaag ggagggaggg 4920
agagagagag aaggctaagt ctttccatac ctgggtccca atacctctta taacccaagc 4980
acatggtttc acatatcaca atgcggttgg gatatagata actgtaaata cttgtgaaaa 5040
taatggggct gagatctggg gttttcatga tagtttcaaa gtcaccgtac tgactaaaac 5100
cttccactgg cccatctcca gcttcctaat ctgagggtat caaatttccc actaagtgtg 5160
tttagaaaga tctccacctt tttgcccttg tcttccagtg ccccacctac gttctggtct 5220
cccacatctg atgtcttctc agtgattctg gccctgcctg ctccacagct acaaacccct 5280
tcctataatg agctctgtgc tgagccatca tcctgaatca atccacctta agcagatgtt 5340
ttgcttattt ttcctgtgtc catactacag aggaaaggta ggcatgtaga agctgaagca 5400
tctcacctca ttccaagcac cctcagtctc taaatgtgcc cccttgtttc cagaagtgca 5460
acctcaagca tcttttattc attcatctta gagggccaca tgtgctgtag tgttataaga 5520
tgaaatttaa agcattaatt attcctaaca agccaattaa acaagccaaa aacattcatc 5580
agtcattccc atggaacctc tgaagcatct tcctgctcta accttgggtt ttccagggct 5640
gctctgggat cacaggagct gtcctgtcta ccagccatat aaaggcagac ctatcagaat 5700
tacaccagac ttctcaccat agactataaa agccagaata tcctggacag atgttataca 5760
gaaactaaga gaacacaaat gccagcccag gctactatac ccagcaaaac tctcaattac 5820
catcgatgaa gaaaccaaga tattccatta caagtccaaa tttacacaat atctttccat 5880
aaatccagcc ctacaaagga tagcagatgg aaaactccaa cacaggtagg aaaactacac 5940
cctagaaaga gcactaaagt aatcatcttt caacacactc aaaagaagat aaccacacaa 6000
acataattcc acctctaaca acaaaaataa agtaggcaac aatcactatt ccttaatatc 6060
tcttttaaca tcaatggact caattctcca ataaaaagac atagactaac agactgaata 6120
cataaacagg acacagcatt ttgctgcata aagcaaacac agcgttactt ttttttttct 6180
aaatgacatt ttttattaga tattgtcttt attgacattt caaatgttat cccctttcct 6240
ggtttaccct ctgaaatccc ctatctcctc cccctccccc tgctcaccaa tccacccact 6300
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tgagtcccac catgttttct tttgttggtg gtttcatgcc agggagctct tggagtactg 6480
attggttcat attgttgttc tccctatggg gttacaaaac ccttcaactt cttgggtcct 6540
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ctccttccat gactatttta ttcctccctc taagaaggac cgaagtattc atactttggt 6840
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tttaatagct gaggagtact ccattgtgta aatgtaccac attttctgta cccattgttc 7080
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tccacatcct caccaacatc tgctgtcacc tcaatttgtt cttagtgatt cagacaggtg 7380
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tttaagtgtt tctcagccat tcagtattct tcagttgaga attcactgtt tagctctgta 7500
ctcaggtttt tttaataggg ttatttggtt ttctggagtc taacgtcttg aattctttct 7560
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aaccctatct tcgaggatct tccccacttt ctcctctata agtttcagtg tctctattat 7800
tgtgctgagg ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa 7860
cttccctagg gtttaaaccc gcggtggagc tctgatgtgg gaacgcttca gtgttcagga 7920
accatatgat ttatttaaaa tatagaatca aaagtaccaa tttgcagttt tgaaagattt 7980
attccagtgt aagcattagc aatgcaccaa catcaggtga tttctgaatc caacacgtct 8040
tatgtcctca tgatattaaa aaaaaaaaaa ggccatccag aactgtgaac ttgagttcta 8100
ccttgttccc tactgacatt cagattttct tttttgcatt ctctttatct tacaggagac 8160
aggaggggag ggctaactca ttttactttg gcttgtccct tgctggtcct tgcccagaac 8220
gtaaagtagc ttgcaagtct tcaaatctaa aaatcttagt aactcctaca cgagtggcaa 8280
tgccaaagag cagtgcaaca aagaggaagt aaatacgacc aaagagtatt cttaaataca 8340
ccactggctc ttgtttttgt tttattgtgt gcctttgaac tggaggggac ccactgtcta 8400
tgctcccact tagtccctct tctttgcact ctggaggctt ccaaccaaaa tgacaatggc 8460
aattccgatg attgttacac actcctctaa aactgcattt ttctggggtg cagtcataac 8520
ccaaatgaga taaacttcca ctgcaagctc cttgatcaca gaacttactt ttggagcagg 8580
gggtaccatg tctcaccatt ccagcatctg ttgtttctgt cccacgatgt tcatcaagcc 8640
caaagcaggt aaacccagag ataatcgatt gatggaatga aacatgttct tgcaaatatg 8700
gaagattggt gacattggta cactgcaacc ttccacacag cttgtcctga tcagcacaag 8760
cattgaatgt gaggctttct tctgctctag tacaatgccc aaatcgaaac cgttgtttgt 8820
tgatgtcata gcacttaata ttagcattct tagcacttac accaaagatt tccatgcatt 8880
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catcttgcag ataagtgtca tctgggcaaa tgtatttagt cccattacag tactctggaa 9000
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cacagcataa ttctttatca caaatgctac caggtgttaa cctgcaatca tttccacagc 9120
agggatctga ataacatgcc ttttgggagc cacagtcaca ctgctcatcg ttatctactt 9180
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aaagacatgg catcagacca ggagtattaa gtatgttgct tatctctgca agggaacaat 9300
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agacacagta cccctcatca tattttaagc ctaaactcct tccaacacga ttggttatta 9420
taggagataa aaataaagga tttcgatcat atttaccaat acaaattagg gctaaggaag 9480
aacatatact cctctcagct ggattaacct ggttatcttg tggcccatac ttattaagta 9540
aaactcctgc atcaggctta aatttattat aaaagactga cacatagtaa ttataagccg 9600
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gaaagacata gtaccgcata tgaagattgg tcagataggt gtccattaaa ctaatgactt 9720
gaaacaaata cccaacagta gatgaaagtt tgtcacctgc agcagaatta tatacagaat 9780
tggttgcttg aaagtggcct tttatagcag ctggatgtgt agcgtagttc ttactagata 9840
ttctgggagc tccatctgca tattccaatc tggaggaggg agaacctgta ttatggctcc 9900
agtgcttcca tgcattcata ggccctgtgt catcagactc agatactatc tgagaaacaa 9960
ggtgttcaaa gctctgtgaa tcattgaggg gtttgatttc ataggtaagg tcatctaact 10020
tcatgacccc tgacaggccc ccataacaag tatccacagt gaccatggat tgtgggatcc 10080
cctccaggta gccaatatag taacaatcta caggaaaaaa ggggtaatcc atctgtaagg 10140
ctccttggtc atcttgagtt gtcagcaaca agtgtctggg ccaaatgagt gtctttctcc 10200
gcaggtggat gatatgtctc tggccccgaa aatgcaagct atatgagagc agtctttgtg 10260
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ggttgaggtt aaatattgtc aaaagggatg tctataaatg tgcctggaca agaaaagtca 10680
gaagcagcaa ggagtgtctc tgacaggctc aatcctttct tttctttttt tgaagttcaa 10740
aatatcattt ccacgtgaat gtatttggtt cccagtgtga ctctgggtct ctttctagga 10800
gtcaatattt ctttatatct tggctcatgt ttctcacagt tgttctaatt tcttgttttg 10860
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aatgattgtt tttatttctt ctaatcatat tttgtttgag ttttggttaa actatttaca 10980
aatgagtttt ttttttttcc ttttgggtgt tgctcgaaag tttggagctt tctgttaata 11040
ttgtgttgtt atttttccaa tattattaga cctgagaatt ctatctgggt acctgtgaac 11100
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agcaatcagg ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag actgccggta tgaacgtcga 11280
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ttattattat tattaactta aggcatttta ttagatattt tcttcattta gttttcaaat 11700
gttatccccg gaacctccta tactctctcc ctgccctgct ccccaaccca cccactccta 11760
catcctggcc ctggcattcc cctatactgt ggcagatgat cttcgtaaga ccaagagcct 11820
ttcctcccat tgatggccta ctaggctatc ctcttttaca tatgcaacta gagtcacagc 11880
tctggggagg tattgcttag ttcatattgt ttttcctcct atagggttgc agatcccttt 11940
agctccttgg gtactttctc tagctcctcc attgggggcc ctgtgttcca tccaatagat 12000
gactgtgagc atccacttct gtatttgcca ggtattggca tggatcttac tgcaccttct 12060
gaactctcta agcagctttc ctggtcacct ccaggagcct catgaataag tctctgcttc 12120
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gaggaagtgg cttggcccct gtctggttaa ggtaagagga gataaatccc ttctcatgaa 12240
ttagggtgag aagggtcatg tgctctatca ttggtgacca acttggggac atgggcttat 12300
acagtcatca ctctgaggct ctgtgtacca ccagactgaa ctcccatatc ctacatgcac 12360
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gagaaaggag aaggagagag agaagggaga gggagagaag agagagggag acggagaagg 12720
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tactacagag gaagggtagg catgtagaag ctgaggcatc tcatctcact ctaagcaccc 13320
tcagtctcta aatgtgcccc tttgtttcca gcagttcagc ctcaagcatc ttttattcac 13380
tcgtcttaga gggacacatg tgctgtagtg ttataagatg aaatttaaag cattagttat 13440
tcccaacaag ccaattaaac aagccaaaaa cattcatcag tcattcccat ggaacctctg 13500
aagcatcttc ctgctctaac cttgagtttc ctagggctgc tgtgggatca caggagctgt 13560
cctgtttacc agcctatcct gtcccacggg attcagttat tagtgggtgc gagggggacc 13620
gcaaacctgg aagaaaatgg gattggaaga gaaaagagaa acgaagacca agtagatctt 13680
ttcctatcaa ggtcttcgtt tattaggctg aggtgcctgg tgtaaagcat gcatcgcggg 13740
gaataggaag gggtcgaggg ggaattttac aaagaacaaa gaagcgggca tctgctgaca 13800
tgagggccga agtcaggctc caggcagcgg gagctccacc gcggtggcgc catttcatta 13860
cctctttctc cgcacccgac atagataaag ctta 13894
<210> 4
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
ccagcttcat tagtaatcgt tcatctgtgg taaaaaggca ggatttgaag cgatggaaga 60
tgggagtacg gggcgttgga agacaaagtg ccacacagcg cagccttcgt ctagaccccc 120
gggctaacta taacggtcct aaggtagcga ggggatgaca gattctctgt tcagtgcact 180
cagggtctgc ctccacgaga atcaccatgc cctttctcaa gactgtgttc tgtgcagtgc 240
cctgtcagtg g 251
<210> 5
<211> 245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 5
aggggtcgag ggggaatttt acaaagaaca aagaagcggg catctgctga catgagggcc 60
gaagtcaggc tccaggcagc gggagctcca ccgcggtggc gccatttcat tacctctttc 120
tccgcacccg acatagataa agcttatccc ccaccaagca aatcccccta cctggggccg 180
agcttcccgt atgtgggaaa atgaatccct gaggtcgatt gctgcatgca atgaaattca 240
actag 245
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 6
caggtacagc tgcagcagtc a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 7
ggagatggca caggtgagtg a 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 8
tccaggactg gtgaagc 17
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 9
tagtcccagt gatgagaaag agat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 10
gagaacacag aagtggatga gatc 24
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
tgagtccagt ccaggga 17
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 12
aaaaattgag tgtgaatgga taagagtg 28
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 13
aaccctggtc agaaactgcc a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 14
agagaaacag tggatacgt 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 15
aactacgcac agaagttcca gg 22
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 16
gctcgtggat ttgtccgc 18
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 17
cagagtcacg attacc 16
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 18
tgagcagcac cctcacgtt 19
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
gtggcctcac aggtatagct gtt 23
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
accaaggacg agtatgaa 18
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
gctagtagtg gggcctacag gccttttgat atc 33
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
gcaaaagccc aggggagtgg gagctactac acctatgctt ttgatatc 48
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
gcgagagagg gtatagtggg aactactgag gactttgatt ac 42
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
gcgagaggga cagtgggagc cctctttgac tac 33
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
gcgaaaccta gtgggagcta ctcctggttc gacccc 36
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
gcgagaggag gagggtataa ctggaactcg aatgcttttg atatc 45
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 27
gcgagaggat ataactggaa ctactttgac tac 33
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
gcgaaagagt ataactggaa ccactggtac tttgactac 39
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
gcgagagaga taactggaac cccctttgac tac 33
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
gcgaggggat ataactggaa cttttctttt tttgactac 39
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
gcgagaggta actggaactc tctgggcttt gactac 36
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
gcgaaaaggg ctactatggt tcggggagct cttgactac 39
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
gcgagagata ttactatggt tcggggagtt attataacga aggtctacgg tatggacgtc 60
<210> 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
gcgagagagt atagcagctt tgactac 27
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 35
gcgagagaga gtatagcagc tcgttgtgac tac 33
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
gcaagagagg ataggagctc gcccctcggg tactttgact ac 42
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 37
gcgagagatc ttggggaagg ctac 24
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 38
accacccata actggggagg gtttgactac 30
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
gcgagagata ggggaccg 18
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 40
caacagagtt atagtacccc tccggagacg 30
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
caacagctta atagttaccc tcggacg 27
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
caacagctta atagttacca ttcact 26
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
caacatttta atagttaccc gctcact 27
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 44
cagcagtata ataactggcc tctcact 27
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 45
ctacagcata atagttaccc gtggacg 27
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
ctacagcata atagttaccc tcggacg 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
cagcagtatg gtagctcacc tcggacg 27
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
atgcaaggta cacactggcc gtggacg 27
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 49
atgcaaggtt cacactggcc gtacact 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 50
atgcaaggta cacactggcc gctcact 27
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
caacagtatg ataatctccc tcccact 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 52
caacagtatg ataatctccc attcact 27
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
caacagtatg ataatctccc cgtcact 27
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 54
caacagtatg ataatctccc gatcacc 27
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 55
caacggattt acaatgccga cacc 24
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
caacagagtt acagtacccc catgtacact 30
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
caacagagtt acagtacccc tctcact 27
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
caacagagtt acagtactcc tcccact 27
<210> 59
<211> 219
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 59
actttcagaa tgttcttgaa cagtctctga gaaacacgga agacggccgc ataacttcgt 60
atagtataca ttatacgaag ttattctaga cccccgggct cgataactat aacggtccta 120
aggtagcgac tcgagataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc catggtaagc 180
ttacgtggca tacagtgtca gattttctgt ttatcaagc 219
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 60
agctgaatgg aaacaaggca a 21
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 61
ggagacaatg ccccagtga 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 62
tcccataggg ctaggatttc c 21
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 63
tcccctcaca ctgttcccc 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 64
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 65
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 66
tcaacctttc ccagcctgtc t 21
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 67
ccccagagag agaaaacaga tttt 24
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 68
ccctggtgaa gcatgtttgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 69
tgtggcctgt ctgccttacg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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cacacctaga ccccggaagt c 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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tcgctttgcc agttgattct c 21
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<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
tgcggccgat cttagcc 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 74
gcaaacaaaa accactggcc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 75
ggccacattc catgggttc 19
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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ccatgactgg gcctctgtag ac 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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caagtcaggg tgctaatgct gtatc 25
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
cacagcttgt gcagcctcc 19
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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gggcactgga tacgatgtat gg 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
tcataggtag gtctcagttt g 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
tgatctgcgc tgtttcatcc t 21
<210> 82
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
tgacatgaac catctgtttc tctctcgaca a 31
<210> 83
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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agagacgctc cgaggtcaag gtgctctag 29
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
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<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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accctctgct gtccct 16
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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ccaagcagga ggtgctcagt tcccaa 26
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 87
tccacactgt cggctgggag ctca 24
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 89
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
ctgttcctct aaaactggac tccacagtaa atggaaa 37
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 90
tgccgcttat acaacactgc catctgc 27
<210> 91
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 91
agaagaagcc tgtactacag catccgtttt acagtca 37
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 92
gggctacttg aggaccttgc t 21
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 93
gacagccctt acagagtttg gaa 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 94
aagaccagga gctctgccta agt 23
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 95
cccatcacga actgaagttg ag 22
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 96
cagggcctcc atcccaggca 20
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
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ccccagtgtg tgaatcactc taccctcc 28
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 98
cctctcctcc tcaccctcct 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> variation
<222> (4)...(4)
<223> r=a or g
<220>
<221> variation
<222> (9)...(9)
<223> s=c or g
<220>
<221> variation
<222> 11, 12, 13
<223> y=c or t
<400> 99
atgrccdgst yyyctctcct 20
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 100
ctcctcactc agggcaca 18
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> variation
<222> (18)...(18)
<223> s=c or g
<400> 101
atggcctggg ctctgctsct 20
<210> 102
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> variation
<222> (11)...(11)
<223> y=c or t
<220>
<221> variation
<222> (13)...(13)
<223> s=c or g
<400> 102
atggcctgga ycsctctcc 19
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> variation
<222> 11, 16, 18, 21
<223> y=c or t
<220>
<221> variation
<222> (15)...(15)
<223> r=a or g
<220>
<221> variation
<222> (20)...(20)
<223> m=a or c
<400> 103
tcaccatggc ytggrycycm ytc 23
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 104
tcaccatggc ctgggtctcc tt 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> variation
<222> (16)...(16)
<223> m=a or c
<220>
<221> variation
<222> (19)...(19)
<223> y=c or t
<400> 105
tcaccatggc ctggamtcyt ct 22
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 106
tcaccatggc ctgggctcca ctactt 26
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 107
tcaccatggc ctggactcct 20
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 108
tcaccatggc ctggatgatg ctt 23
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 109
taaatatggc ctgggctcct ct 22
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 110
tcaccatgcc ctgggctctg ct 22
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 111
tcaccatggc cctgactcct ct 22
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 112
cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 113
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 114
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 114
caggaaacag ctatgac 17
<210> 115
<211> 440
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 115
gggcctgggc tctgctgctc ctcaccctcc tcactcaggg cacagggtcc tgggcccagt 60
ctgccctgac tcagcctccc tccgcgtccg ggtctcctgg acagtcagtc accatctcct 120
gcactggaac cagcagtgac gttggtggtt ataactatgt ctcctggtac caacagcacc 180
caggcaaagc ccccaaactc atgatttatg aggtcagtaa gcggccctca ggggtccctg 240
atcgcttctc tggctccaag tctggcaaca cggcctccct gaccgtctct gggctccagg 300
ctgaggatga ggctgattat tactgcagct catatgcagg cagcaacaat ttcgtcttcg 360
gaactgggac caaggtcacc gtcctagggg ctgatgctgc accaactgta tccatcttcc 420
caccatccag taagcttggg 440
<210> 116
<211> 441
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 116
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctcc ctccgcgtcc gggtctcctg gacagtcagt caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcacta agcggccctc aggggtccct 240
gatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccgtctc tgggctccag 300
gctgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcag gcagcaacaa ttatgtcttc 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420
ccaccatcca gtaagcttgg g 441
<210> 117
<211> 441
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 117
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctcc ctccgcgtcc gggtctcctg gacagtcagt caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagta agcggccctc aggggtccct 240
gatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccgtctc tgggctccag 300
gctgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcag gcagcaacaa ttatgtcttc 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420
ccaccatcca gtaagcttgg g 441
<210> 118
<211> 438
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 118
atggcctggg ctctgctcct caccctcctc actcagggca cagggtcctg ggcccagtct 60
gccctgactc agcctccctc cgcgtccggg tctcctggac agtcagtcac catctcctgc 120
actggaacca gcagtgacgt tggtggttat aactatgtct cctggtacca acagcaccca 180
ggcaaagccc ccaaactcat gatttatgag gtcagtaagc ggccctcagg ggtccctgat 240
cgcttctctg gctccaagtc tggcaacacg gcctccctga ccgtctctgg gctccaggct 300
gaggatgagg ctgattatta ctgcagctca tatgcaggca gcaacaatta tgtcttcgga 360
actgggacca aggtcaccgt cctaggggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagta agcttggg 438
<210> 119
<211> 438
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 119
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctcc ctccgcgtcc gggtctcctg gacagtcagt caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagta agcggccctc aggggtccct 240
gatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccgtctc tgggctccag 300
gctgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcag gcagcaacaa tgtcttcgga 360
actgggacca aggtcaccgt cctaggggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagta agcttggg 438
<210> 120
<211> 441
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 120
atggcctggg ctctgctcct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctcc ctccgcgtcc gggtctcctg gacagtcagt caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagta agcggccctc aggggtccct 240
gatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccgtctc tgggctccag 300
gctgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcag gcagcaacaa ttatgtcttc 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420
ccaccatcca gtaagcttgg g 441
<210> 121
<211> 442
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 121
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctcc ctccgcgtcc gggtctcctg gacagtcagt caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagta agcggccctc aggggtccct 240
gatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccgtctc tgggctccag 300
gctgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcag gcagcaacaa tttatgtctt 360
cggaactggg accaaggtca ccgtcctagg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt 420
cccaccatcc agtaagcttg gg 442
<210> 122
<211> 428
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 122
ccttcatttt ctccacaggt ctctgtgctc tgcctgtgct gactcagccc ccgtctgcat 60
ctgccttgct gggagcctcg atcaagctca cctgcaccct aagcagtgag cacagcacct 120
acaccatcga atggtatcaa cagagaccag ggaggtcccc ccagtatata atgaaggtta 180
agagtgatgg cagccacagc aagggggacg ggatccccga tcgcttcatg ggctccagtt 240
ctggggctga ccgctacctc accttctcca acctccagtc tgacgatgag gctgagtatc 300
actgtggaga gagccacacg attgatggcc aagtcggttg tgtcttcgga actgggacca 360
aggtcaccgt cctaggggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagta 420
agcttggg 428
<210> 123
<211> 441
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 123
atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120
tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca 180
ggaacagccc ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300
ggggacgagg ccgattatta ctgcggaaca tgggatagca gcctgagtgc ttatgtcttc 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420
ccaccatcca gtgagcagtt a 441
<210> 124
<211> 441
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 124
atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120
tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca 180
ggaacagccc ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300
ggggacgagg ccgattatta ctgcggaaca tgggatagca gcctgagtgc ggcttttttt 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420
ccaccatcca gtgagcagtt a 441
<210> 125
<211> 345
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 125
cccgggcaga gggtcaccat ctcttgttct ggaagcagct ccaacatcgg aagtaatact 60
gtaaactggt accagcagct cccaggaacg gcccccaaac tcctcatcta tagtaataat 120
cagcggccct caggggtccc tgaccgattc tctggctcca agtctggcac ctcagcctcc 180
ctggccatca gtgggctcca gtctgaggat gaggctgatt attactgtgc agcatgggat 240
gacagcctga atggttatgt cttcggaact gggaccaagg tcaccgtcct aggggctgat 300
gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca tccagtgagc agtta 345
<210> 126
<211> 432
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 126
atggcctgga cccctctcct gctccccctc ctcactttct gcacagtctc tgaggcctcc 60
tatgagctga cacagccacc ctcggtgtca gtgtccccag gacaaacggc caggatcacc 120
tgctctggag atgcattgcc aaaaaaatat gcttattggt accagcagaa gtcaggccag 180
gcccctgtgc tggtcatcta tgaggacagc aaacgaccct ccgggatccc tgagagattc 240
tctggctcca gctcagggac aatggccacc ttgactatca gtggggccca ggtggaggat 300
gaagctgact actactgtta ctcaacagac tacagtggta atcatgtctt cggaactggg 360
accaaggtca ccgtcctagg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420
agtgagcagt ta 432
<210> 127
<211> 426
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 127
atggcctgga ctcctctctt tctgttcctc ctcacttgct gcccagggtc caattcccag 60
gctgtggtga ctcaggagcc ctcactgact gtgtccccag gagggacagt cactctcacc 120
tgtggctcca gcactggagc tgtcaccagt ggtcattatc cctactggtt ccagcagaag 180
cctggccaag cccccaggac actgatttat gatacaagca acaaacactc ctggacacct 240
gcccggttct caggctccct ccttgggggc aaagctgccc tgaccctttc gggtgcgcag 300
cctgaggatg aggctgagta ttactgcttg ctctcctata gtggtgctta tgtcttcgga 360
actgggacca aggtcaccgt cctaggggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatcc 426
<210> 128
<211> 331
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 128
agtggtcctg ggacagacgg ccaggattac ctgtggggga aacaacattg gaagtaaaaa 60
tgtgcactgg taccagcaga agccaggcca ggcccctgtg ctggtcatct atagggataa 120
caaccggccc tctgggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactcgggga acacggccac 180
cctgaccatc agcagagccc aagccgggga tgaggctgac tattactgtc aggtgtggga 240
cagcagcact tatgtcttcg gaactgggac caaggtcacc gtcctagggg ctgatgctgc 300
accaactgta tccatcttcc caccatccag t 331
<210> 129
<211> 417
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 129
actcctctcc tcctcctgtt cctctctcac tgcacaggtt ccctctcgca ggctgtgctg 60
actcagccgt cttccctctc tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg 120
cgcagtggca tcaatgttgg tacctacagg atatactggt accagcagaa gccagggagt 180
cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc 240
cccagccgct tctctggatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct 300
gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cagcgcttat 360
gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctaggggctg atgctgcacc aactgta 417
<210> 130
<211> 393
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 130
tttctgttcc tcctcacttg ctgcccaggg tccaattctc agactgtggt gactcaggag 60
ccctcactga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtgcttc cagcactgga 120
gcagtcacca gtggttacta tccaaactgg ttccagcaga aacctggaca agcacccagg 180
gcactgattt atagtacaag caacaaacgc tcctggaccc ctgcccggtt ctcaggctcc 240
ctccttgggg gcaaagctgc cctgacactg tcaggtgtgc agcctgagga cgaggctgag 300
tattactgcc tgctctacta tggtggtgct tatgtcttcg gaactgggac caaggtcacc 360
gtcctagggg ctgatgctgc accaactgta tcc 393
<210> 131
<211> 417
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 131
atggcctggg ctctgctgct cctcactctc ctcactcagg acacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gacagtcgat caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga tgttgggagt tataaccttg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gagggcagta agcggccctc aggggtttct 240
aatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgacaatctc tgggctccag 300
gctgaggacg aggctgatta ttactgctgc tcatatgcag gtagtagcac ttatgtcttc 360
ggaactggga ccaaggtcac cgtcctaggg gctgatgctg caccaactgt atccatc 417
<210> 132
<211> 348
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 132
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cacttatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccggcctg ggggctgatg ctgcacca 348
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 133
aacaaccgag ctccaggtgt 20
<210> 134
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 134
agggcagcct tgtctccaa 19
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 135
cctgccagat tctcaggctc 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 136
catcacaggg gcacagactg 20
<210> 137
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 137
gatttgctga gggcagggt 19
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 138
ccccaagtct gatccttcct t 21
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 139
gctgaccaac gatcgcctaa 20
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 140
taagcgccac actgcacct 19
<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 141
cctgccagat tctcaggctc cctg 24
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 142
ctgattggag acaaggctgc cct 23
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 143
ccttcatact cttgcatcct cccttctcca 30
<210> 144
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 144
ttccttctct tctgtgactc aattatttgt ggaca 35
<210> 145
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 145
tctggcacct cagcctccct ggccatcact gggctccagg ctgaggatga ggctgattat 60
tactgccagt cctatgacag cagcctgagt ggttctgtgt tcggaggagg cacccggctg 120
accgccctcg gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
<210> 146
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 146
tctggcacct cagcctccct ggccatcact gggctccagg ctgaggatga ggctgattat 60
tactgccagt cctatgacag cagcctgagt ggttatgtct tcggaactgg gaccaaggtc 120
accgtcctag gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
<210> 147
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 147
tctggcacct cagcctccct ggccatcagt gggctccagt ctgaggatga ggctgattat 60
tactgtgcag catgggatga cagcctgaat ggtgctgtgt tcggaggagg cacccagctg 120
accgccctcg gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
<210> 148
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 148
tctggcacct cagcctccct ggccatcagt gggctccggt ccgaggatga ggctgattat 60
tactgtgcag catgggatga cagcctgagt ggtcgggtgt tcggcggagg gaccaagctg 120
accgtcctag gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
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<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 149
tcggggaaca cggccaccct gaccatcagc agagcccaag ccggggatga ggctgactat 60
tactgtcagg tgtgggacag cagcactgct gtgttcggag gaggcaccca gctgaccgcc 120
ctcggggctg atgctgcacc aactgtatcc atc 153
<210> 150
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 150
tcagggacaa tggccacctt gactatcagt ggggcccagg tggaggatga agctgactac 60
tactgttact caacagacag cagtggtaat gctgtgttcg gaggaggcac ccagctgacc 120
gccctcgggg ctgatgctgc accaactgta tccatc 156
<210> 151
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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tcagggacaa tggccacctt gactatcagt ggggcccagg tggaggatga agctgactac 60
tactgttact caacagacag cagtggtaat catagggtgt tcggcggagg gaccaagctg 120
accgtcctag gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
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<212> DNA
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<223> synthetic
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tctggcacct cagcctccct ggccatcact gggctccagg ctgaggatga ggctgattat 60
tactgccagt cctatgacag cagcctgagt ggttatgtct tcggaactgg gaccaaggtc 120
accgtcctag gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 153
gatgcttcgg ccaatgcagg gattttactc atctctgggc tccagtctga ggatgaggct 60
gactattact gtatgatttg gcacagcagc gctgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 120
accgtcctag gggctgatgc tgcaccaact gtatccatc 159
<210> 154
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 154
cttgggggca aagctgccct gacactgtca ggtgtgcagc ctgaggacga ggctgagtat 60
tactgcctgc tctactatgg tggtgctcgg gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc 120
ctaggggctg atgctgcacc aactgtatcc atc 153
<210> 155
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 155
cttgggggca aagctgccct gaccctttcg ggtgcgcagc ctgaggatga ggctgagtat 60
tactgcttgc tctcctatag tggtgctcga gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc 120
ctaggggctg atgctgcacc aactgtatcc atc 153
<210> 156
<211> 165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 156
tcaggcctga atcggtacct gaccatcaag aacatccagg aagaggatga gagtgactac 60
cactgtgggg cagaccatgg cagtgggagc aacttcgtgt ctgtgttcgg aggaggcacc 120
cagctgaccg ccctcggggc tgatgctgca ccaactgtat ccatc 165
<210> 157
<211> 164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 157
tctggcacgt cagccaccct gggcatcacc ggactccaga ctggggacga ggccgattat 60
tactgcggaa catgggatag cagcctgagt gctggccccg ggtgttcggc ggagggacca 120
agctgaccgt cctaggggct gatgctgcac caactgtatc catc 164
<210> 158
<211> 22800
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 158
aagctctaaa actacaaact gctgaaagat ctaatgacta ggacagccta gtaattttca 60
taggggcata aatgtgaaac gccttgtgca tcgtagaaga aagcagaaga gaaagcattc 120
ccaatttctt aactgccttt tacctatatt aatcagtaat atactggctt ttacctctgt 180
taatcataat aaacaaattc tcaataaatt ttatcgatac tcttcaatgc ctgctcagca 240
acattttccg aaggcagctc aagatattaa ataactcata agggccaacc tcctattgca 300
gcattctttg ggatttaacc agtttcccaa gactcttttc acaatgttaa gatgttagaa 360
atagatccaa aactaggtga tatatcccct agtaaaactg tgaggtcaaa cttgtctggc 420
taatgcttcc atttaaaaat ttctctttct tgatccttca ttgtatgtac acaataaatc 480
aggggaaaac tttaactgag tgaatcaaag tattctcatt attataatag gagcttcaca 540
cacacacaaa aaaatcaatt ctattactct cagcctcagt tcctaaagcc aagttaaagt 600
cctgttctaa gatcattgtt gcatgaccat atgtattcca ggtctaatct aaactgtgga 660
taaatcccag caggacatta gagatttttg tgagagtaag catataggat tcagggttta 720
tgagctttag atttttcttg tcaaaatgaa tgagagttgc catatctaaa aattattccc 780
agataaataa aattcactac ctagaattaa tttatgcata taagtagaaa tgctatctcc 840
ctttttacca tccaaagtgg aaagcctcat ggaactagaa attaatatta gaaaaatcag 900
ttaataaaag tatgtcattt catcaattca ataagttata atagcaaaaa accataataa 960
attatcactt aaatgtcaat acatttataa actatggtac ataaatagga tattgaatag 1020
ccattgatgc tcctgatgaa aattagcagg cagtgataaa tgataaatat gaagcacatg 1080
tcaataaata aaataagttt tatgtaattt aggagaaaat ggtgataatg acacaaaatg 1140
tgaattatgg atgcatctat aaaattcttt gtacatttgt gaattgtaaa tatttatctt 1200
agagacatta ttactttgta tatgttccat ttgctcacct atatgtccca gtctccttac 1260
aaatgctatg gccaaagaaa taggcataca tacatccttt gcaggctgag gcaggaaaaa 1320
gatcttacgg aattttccag tctatccttt atctgtataa gcaacttaag aggccatgtg 1380
ctccaaatgg tgcaaataca agatggtaga gcctctgtct gcctggatcc ttgagtggct 1440
gcatggagca gagcaccttt ctggccctgg tgaagattgt agcatgagca agatataagc 1500
atttgttgga gctaggccat gagatttggg gcagtggtat aacctaccct attatggaaa 1560
atataaatac acaaaacaga aaagagagag agaagtgaga gaagactgtg agagaagtgc 1620
atgagagaag actgtgtttt gttcatttcc tataatccta tatcaccatg ggatcctgtg 1680
ccttctggtg atcaaactaa tgttctacag ctccaaagaa gaatgctcgc ctaacgtctc 1740
cattccaatg acctagagac taaaagccaa aaagaacctt agaaattatc tattgcattc 1800
tttgatgtaa ggaaatatct tagagggcac agatagaaat atcttaaccc aggtcactta 1860
gttcgtggca gagctgaggc taaaaccagg ccttttgact cctaattttg tgctctttac 1920
accttctcac atcacttctc caacccaaag tctagcagaa aaggctaaaa taagatatat 1980
gcatagattt gctattataa gtccatgtac ttcctcagac gctttaagat ggggcttctc 2040
atggttcaca ataagcagca gagggaagtg aataactatc ttcgtctccc ctactgctat 2100
ttgtgcagtt tgaagcttat ctcttaaatc atgttttctt ctcgtagtaa atactacaac 2160
ttgtgccttt tatgtgtgta taaattttaa tataattttt ttccatgaac cattcaagta 2220
aaatggacac tccaaaaaga tgttcaataa ggttacatgg cttcacattg ccccctctac 2280
accatcttgt ggagctacac attcacctca cccaaatttg agaaaaataa tcaagaaaat 2340
gactctcact agcagtgaga ccaagtccat aagcactaat gtcatcagtg cacactgcag 2400
cctcatgctg ccaagcatgt tttgggcgta tccctggact ggtttggtga catgatcaaa 2460
ggtacatttt ccacctgcat agccccatcc tggatctata gccttccttg tgtctttgtg 2520
aacaacctag tgtgaactca aagtatgaga cagatctcaa ttaatttaga aagtttattt 2580
tcccaagatt aaggacaagc ccatgataaa gcctccagag gtcctgatat atgtgcccaa 2640
gggggtcggg gcacagcttg gtgttataca ttttagggag acaagaaaca tcaatcgata 2700
tgtagaagat gtgcatcgct ttggtctgga aaggtgtgac aactcaaggc agggaagggg 2760
gcttcctgct ggggttgcat tgttttgagt ctctgatcag cctttcacat gtgaaaggca 2820
ggtagagaaa tagtcattta tgccttagtc tggcttattg aaacagtagg gcagaagaag 2880
cattgcatat gcatttgtct gaagtgaaca gagggatgac tttgagctct gtcctttctt 2940
tgtccacaag gaattacctt gtgggcaaat tgtgagggag gtatgtagct tttttttctt 3000
tgtagctatc ttatttagga ataaaatggg aggcaggttt gcctgatgca attcccagct 3060
tgactttccc ttttggctta gtgatttttg gggtcctgag gtttattttt tctttcacat 3120
tagtataact acttttcttt ttctaattcc ttttctactt gtatgtgtta cagctgactt 3180
atgttacttg caaaaagaat tctgactaat gcaccatctg actagaaggc agggttcttc 3240
gatgataacg aatcctccag aatctagtaa acagaattgc ctgaaaaaga ggtgggtgtc 3300
ttcttgggga atttctcatg gcaatgaatg gcaactggcc aaaggattta tgaccagact 3360
gagctctctt ttatctattc tgttactcac caagacctat tagggtttgt gctccacagg 3420
gacactggtt tctaagttct agggttaaac agtccactcc caggcccacc acaccatacc 3480
ctcctgacat ctggtgaaca gcaataaaat tgtttcttat tctgaaaatc ctccaatact 3540
tccaccatcc ccaaaaatgc agtggaggag gagagaaaat gaattgttcc attagagaac 3600
acaatatcca ttatattatt cttggccttt gagatacctt acaaaacaaa tacaaaaaaa 3660
gtcccaattt aacatctttt aataatcttt acaaaacaga acacatctcc tttcttgata 3720
atagtcaaga ggctcagtgg caactgtggt gaaaagtgtc agattctggt catgtttcaa 3780
aggtagaaaa aatagaattt gttaacatat tggatgtgag gcgtgggaga aacgtgaaat 3840
caaggtggtt gcaagtgttt aacctgagca actagagaat ttggaaggac attttctgag 3900
atggggaagg caggcgggaa tcagggatta gagttgaaca tattagacat ttgagatgcc 3960
tgctagacct ctaattggca atatcccttg gacaggtgga tgaatatgcg tgattctgga 4020
gttcgggaaa tagtccgggt ggagatgcaa atttgggaaa cagggcgagg ttactagcaa 4080
tgagttaaat caatgaaggc aggctgggac ctggcaggta acccaacaag tagaggtcga 4140
agagatgaga agaaaacagc acaggagact tagaagcagt ggtcaggagg aaggagttga 4200
accaagaaag tgatgtccca gagccaacaa aataaggatt tcttttctgt ttacaaatgt 4260
aaaattaaaa ggtttaataa aaagaaaatt tacttttatg gttggttgtt attaagtggt 4320
ccaaacactg tctcctattt gtagaatcag aactctctca tggcagtaga aaatttggaa 4380
agttactttt taaaaggtgt gtgcactgct gccctttgct ggtcaagttt atgcactgca 4440
aattccaagg acgattgctc gtcagctttt ctcctttaaa atagctcagg ctgtacaagc 4500
tagaaagaac ctcgcaagat attccttcca acatttgcat ttgacttatg ggaagtgcag 4560
gttcagccag aaaagttgtg tgcaaggccg tttatgtaag tttatcagac ctgattctta 4620
cggctcttcc cattgtttcg agcctccctt ccattcactt cccgctcata cgcgaccaag 4680
tataggacag gagtagttat tctgcacttt atagcagctc cactgtctgg cactctgatg 4740
ttctttaatt acaagcttta tgacagtgat tctcaacctg ctccactgcc tccacctagt 4800
ggcagaaaga agaaaatgtg tgtaactcgg gagtctctgg tctgaaagct ccggggtatc 4860
atttcttcaa agtcttgagc ttgtttttgt ttgtatttat ttatttattt gttttagaga 4920
caaggtctcg cactgcactc cagcctggga gacagagcga gacaattcag gatctatcta 4980
gtgaataaag agatatcagt aatgactgtt ttatattgtg gctgtagcgc attcgaggga 5040
taattcgatt ctgttctgct ttcgaatgca tggctcactg taacctccaa ctcccgggct 5100
caagcgatcc tcctacctca gcttctccag tagttgagct tgatttattt taaagtttca 5160
taaaattttg gcatttcttt ccacaatatg gccatgtgtg ctttactata aaatattttc 5220
atcacaaaat ttacatcgct ggaaatcccc ataagccagt ttgagaaaca caacccaaga 5280
aagcagaaca gactcaaatt atcccttaaa tcccccttaa ccacaaatat aaaacagtcc 5340
gtgactgggc gtgttggctt acacctgtaa tcccagcact ttgggaggcc aaggcgggtg 5400
gattacttga gctcaggagt tcaagaccag cctggccaac atggtgaaac cccgtcccta 5460
ttaaaaatac aaaattattc aggagttgtg gcaggcagtt gtaatcccag ctacttggga 5520
ggctgaggca ggagaatcac ttgaacccag gaggtggagg ttgtagtgag ccaagattgt 5580
gccagtgcac tccagcctgg gcaacagagc gagacttcca tcttaaaaaa aaaaaattaa 5640
gtaaataaaa tataaaaaaa taaagcagtc cctattgata tctctttatt cactaaatca 5700
acctggaatt gacctgaatt ctgatttttt tttcatcatg gattttttgc attaattttg 5760
attgtttaaa tattgcatta aaatattatt tatcttgact actgagtttg cgggacctcc 5820
ttaaaattta tgaccaaggc aatgcctcac tcactcgcct taccataatc tgggccacat 5880
atcaggggct ccaatagcaa gcaacatgac ttttgaacag ctaagacttc tctcttcact 5940
gtgaagacca gatgggccct gcaaacagtg taacctctac atgaaaatgc acgagattcc 6000
aactacaacc aggcacaaaa gactctgatg gtgaagtccc agccctccaa gtcccaactt 6060
cctgaaggga aagagcaccc caagttctga ccagaggcca gagtcataac gaagatggaa 6120
tgtgagcttg acatagaagg ggtggtagca cctggctcag taatgaagag gctttcggtc 6180
ctgaaggaag agctcagcac attcaaagat tagaagggag gtcccagtca taggagcagg 6240
gaaggagaga aggcccaata agaaacacag acaggaggga ggggtcaggg caagatcata 6300
ctggaaacaa ctagagagct aataaaagtc acagtgccca gtccccacat ggaccagact 6360
cttcggaatc tctaggcatc aatttgggca ccagtagttt tcaaagttct ccagaagatt 6420
ctatgcacac cagccaaggg tgggaaccac aggtgttggc ctagggatca tgacaatgag 6480
tttctaagtg caataagaaa cctccagaga gtttaagcag gggaataatt tgatttgttt 6540
cttgtttgtg atttttaaag atcagtctgg ttactgtgtg taagacaata atccagaaaa 6600
tctgttgctc atgaaccaca tatctgtaaa tttgcttccc ctgtaactgg atctaaccaa 6660
caaaaattag tacttactaa gaaattacat gcccagggac tatgctaagt aattcataaa 6720
cactatttta tttactcctc acagcaagtt tataagagaa acgttattat ttccacattt 6780
cggatgagaa atttgaggct tggggaaagt taagtaattt acctaatgtc acacccagtt 6840
cataagatgc agagttaaga ttctaattct gtgtctaagt tgatgctcca tcaaacacac 6900
cacgcctcca actaggaagc aacatgctgg ccagaggatg ctgtcatcaa gtttacagaa 6960
tggttagatt tctaggcaca gatgaataaa tcaacatgtt ggtttgcaat agaatgaatc 7020
tatccagctc tgaatttgca tccaagggtt tgtgagcaca caagtctaaa agtgtggcct 7080
cagctctgct aacttcatca aggtgaatac ctaggaggcc accctctgag accaccagat 7140
ggacagtcca ccatctgttt acagatggta aagccacata ccagctttgc catctgatgt 7200
tctctattca cattcaacat ttatacaaga aatagtcata tggatccttt tcaatagaca 7260
gtactgggga aattgaattg ccatatgcag aagaatggaa ctagacctct atctctcacc 7320
aaatacaaaa gttaactcaa gacagattaa agacttacat ataagacctg taactacaaa 7380
aacactagaa gaaaacctag ggaaaatgct tctggaatta atctaggtga agaactcagg 7440
actaagatat caaaagcaca agcaccaaaa caaaaataga caaacaggac ttaattaaac 7500
tagaacgctt ctgaacagca agagaaataa tcaatagagt gaacagataa tctgcagaat 7560
gggtgaaaat atttgcaaac tatgcatcct acagggaaat aatgtccaga atttagaagg 7620
aactcaaaca attcaacaac aacagcaaaa taaccccacc aaaaaagtgg gcaaaggaca 7680
tgaatagaca tttttcaaaa gaaggtatat gatatggttt ggctctgtgt ctccacccag 7740
atctcacctt aaattgtaat aatccccaca tatcatggga gagacccggt gggaggtaat 7800
tgaatcatgg gggcaggttt gtcccatgct gttctcatga tactgaataa gtcctatgag 7860
atctgatgat tttataaagg ggagttcccc tgcacacact ctcttgcctg cctccatgta 7920
atatgtgcct ttgcttctcc tttgccttct gccatgattg tgaggcctct ccagccatat 7980
ggaactgagt caattaaacc actttttctt tgtaaattac ccaatcttgg gtatgtcttt 8040
attagcagca taagaacaga ctaatacagt gtacaaatgg ccaagaagcg tacaaaaaac 8100
aaaatgctca aatcactaat cactagagaa tcgcaagtta aaaccacaat gagatattat 8160
cttacagcag tcagaatgcc tattattaaa acaccaaaaa ataacatgtt ggcaaggatg 8220
cagagaaaag ggaatactta cacattatta gtgggaatgt aaactagtac agcttctgtg 8280
gaaaacacta tggagatttc tcaaagaact agaaatagaa ctaccatgtg gttcagcaat 8340
accacaactg ggtatctacc caaagggaaa taaattatta tataaaaaag atatctgcac 8400
tcacttgttt attgcagcac tattcacaat agcaaagata tggaatcaac ccaagtgtcc 8460
atcaacagat gattggataa agaaaacgtg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtat 8520
acacatacca caatgaaata ctattcagct ataaagaaaa gaatgaaatc atgtcttttg 8580
cagcaatgtg gttggaactg gaggccatta tcttaagtgg ataattcaaa aacagaaggt 8640
caaatgtcac atgttctcac ttataagtgg gagctaaatg atgtgtacac atggacatag 8700
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cagacttcac cactacacag tatagctatg tagcaaaatt gcacctgtat tgcttaaatt 8880
tatacaagta aaaaaaagat cgtacgaatt ctgtttttta ttctctatga aattactact 8940
gagagtatta tccaatgccg tttctatgca gtgcccccaa tattatccat ttagcagctc 9000
ctatgcaatg ccccaagata gaaattgtct tcaactttta tcccaggaaa accttcagtc 9060
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tcatttagtc ggtttccaag aagctcagaa ccagatttta tgttcaatca aaaactgctt 9180
attttaagtg aggtttactg aggtataaat tacaataaaa gccacctttt cgtgtatatt 9240
tctataagtt ttggcaaatg catagctgtg taaccacaac cacattcaag atataggaca 9300
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gattcatctt tgctgtttcg tgtagcacta gttcactgtc tattgttgag tagtattcca 9540
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aaatgatttt ataattctag taagtttata ggtttatggg gtttttacgt acttttctac 10860
ccaacttgtc tataagactt taatgaatca cttagaattt ttaaaataat ttattattac 10920
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tctgacctgg tttatatcgt atcattgatt ttgttactta gcaagcacag tgatccatta 11040
ggcctatgta ggctcatggt ttatacaaca ctgccatctg ctgacagagt gtgacagtca 11100
cagtcagcaa cacgagacca ctttattttc atttttagtg tttatagaaa tatgaatata 11160
cacaaatagt ataatgaacc ctaagcttca caaattaaca ttttgctaat cttgtttcaa 11220
ctaccgcctc ccccctcatc caattactct gttctctcac ctcctcacac acagacactg 11280
gcagtatttt tcagccaatc attaatacgt tgccaactga taaggacttt taaaaaacaa 11340
ccaccattcc attatgattc ccagcataat tgagagtaat tccctaatat ccaataccca 11400
ttttctattc caatttcctt gattgtcttt aaactgtttt taccctaagt ttgcttaaat 11460
caaagtccag gtcctgttaa acatatggtt aagttttacc caaacccaaa taaataaata 11520
aataaataaa taaataacct attttttcca attccaggga atagtgaaag agggtaaatg 11580
ccattattta gaaacataaa tcacatcata ggactagaat tatcttgaag tcaaaattga 11640
agactgaaaa tggaaaagaa aggtatagac taaacttatt taaaaacttc aatgcagaac 11700
tctaagagaa gatattagaa agttgtacca gcattcatta ttcagtattc atcagtattc 11760
actcagctat atgtagttga aatctaacta gaggagcttg atcagataaa gagatacatt 11820
tttctcacca aggcggactc tggaggcagg tggttcagag ctagacagct gctgcaggac 11880
ccaggtcctt tccctgcctg ctcctccact ctagcttgtg actttcatcc tgcaagatgg 11940
gtgtttctgc caagttccag atagaagaag atagaacaca aaggagaaat aagcagtggt 12000
gcctctgtcc atcaagcaaa atttttccag aaatgcacaa tagatttcag atgatgtctc 12060
aacagtccta actgcaaaga agctgaggaa ttagattttt ggctgggaca ctgttgccct 12120
gtaaaaaaat tgggattctg ttattaaaga ataagaggag ggaagaaaga ttgaaaactc 12180
ctatgcaata gtgaaaaaaa taagaaactc aataaaaaag tgggcatacc ttaaaaacag 12240
gcaattcaca acagatgaga ccccaatagc caataaacat ttttaaatgg tcaacctcat 12300
gagtgatcag aaaacacaaa tatgtatttt aaaccaaaaa taaaatacaa tgtattgacc 12360
atttgagtgg aaaaaaatta aaaagcctga taatatcaag tattggagag gatgtagagt 12420
gaggaaactc catggaggac ctatcattgc aaatgtggga atgaaactta atacacgaat 12480
ttgaggccaa tttgtaaatt gaaaaatgcg cacaccctgc aaccaagtac cccttgcaat 12540
atttttgaaa agacaaaaac gttatgtaaa tggaatcatg caatatgtga cctttatact 12600
cagcataatg cccctcagat ccattgaagt catgtgtatc aacagctcac tatttttttt 12660
ttaatttttt ttagagacag agtctcactc tgtcacacag ggtggagtgc agtggcgaga 12720
tcataactct ctctagcagc ctcgaactcc tgggctcaag catcctcctg cctcagcctc 12780
ccaagtagct aggactacag gcatgggaca caacacacag ctaatttttt taaatttttt 12840
ttagagacat ggtctcacta tgttgcctac gctggtctca aactcctagg tcaagcgatt 12900
ctcccacctc tacttcacaa agtgctgtag gtatgtaggt atggattgta ggtatgaacc 12960
accgtgccca actcactact ttttattact aattattcca tgggatggat gtaccgcagt 13020
ttgttttacc attaatctat tgtaggacat tttgactgat tccagttttt ttttaataca 13080
aataaaacca ctatgaatag ttgtgtattg tatacgtttt tgtgctaagt tttcattttt 13140
ctgggataag ttttcatttc tttgggcttt tactgtatcc ttgatattat aatatgttac 13200
atcttcagtt ttattctatt caatatataa tcttttattt tccttgaaat ctcccatgga 13260
ttgtttagaa gtgtgttgtt ttgtttccaa gggtttggca tttttcccat tatttttcta 13320
ttatcgattt ccagtttgat tccaggtggt cagagaacac acttcatgtg atttcagttc 13380
tattaaattt gttgaggttt gttacatggc ccagtatatg gcaattttgg tatatgttcc 13440
atgagcactt gaaaagaatg cgaattctgc tggtgctggt tggagttttc cagcaatgtt 13500
gatttatgat cttactcatt gatggtggtg ttgagtttga tgtgttctta cgatggcagc 13560
tttaacattc ttgtcaggta attctaacgt ctctgtcatg tcagtattag cgcctcttaa 13620
ctgtctcatc aaagctgaga ttttcctggt tcccctggtt cctgttggga tgtgtggttt 13680
tcatttgaaa tctggacttt ggagtattgt gttatgaggc tttggatctc atttaaactc 13740
atctcagcga atttcctctc ttgccactca ggaaggagaa gttgggtgtt tgaatggagc 13800
agagccgtta ctgcctaaga attgttttac tgggcttccc ctttctttct cctttgacta 13860
gagagagcca gctttttatt agggctttat gtttttctgg gcctgttggt gtttctgggt 13920
tgacaaactt ctccagaacc aagtctggaa tggatgaggc aaaaagaaac cccgtggaat 13980
gcactgctgg gtcgctcctt gggtcccaat gttcctaact ggtctgcctt cttctctcca 14040
gcttccagag tcttcataag tttgctttac gtacaatgtc cggggttttt actttacttg 14100
agagaaatag gtaaaagtaa ttctactcca tctttcagga agcaaaagcc cccttgtgta 14160
tttttttaaa ctttcaaaaa caaaacaaaa ggcagctgca acagtaaaga agctagtaac 14220
acccttggtg ggaaattcaa gtccaaatac acattttaag tttggctagc cagtgagaac 14280
atcagaatag ttcaggtttt aaacaaattt atatttatga ttatgcatat actaaaagct 14340
gaaggcatct tatatttact aagcacctat tttgttcttg ttaaaaagac agaattccat 14400
tccctaggaa atttgacctg gcagctggag ctgatccacc tggccactag agcacagagc 14460
agggagagta gtagccctgc cccagccacc cctcaagaca ggattctttc tctgggaact 14520
gtaggtaaca ctaaatcgtt ctggaacaca acaacgaaag aagaaaggaa agagaaagaa 14580
agaaaggaag aaagagagag agaaggaagg aagggaggga gggaaggaag gaaggggaag 14640
ggaagggaat ggaagggaag gaaggaagga aaaggaagga agggagggag agagggagga 14700
aggaaggaaa ggaaaggaag gaaggaagaa ggaaagaaaa aaagaaagaa agaagaaaga 14760
aagaaagaca agaaagaaag aaagaaagaa agaaagggga aagaaaagaa agaggaaaga 14820
aagagaaaga aagaaaagaa agaaaggaaa gaaagagaaa gaaagaaaaa gaaagagaaa 14880
gaaagagaaa gacaagaaag aaaaaggaaa gaaaagaaag agaaagaaaa gaaagaaagg 14940
aaagaaagag aaagaaagaa aaagaaagaa agaaaagaag aaagagaaag aaagaaagaa 15000
aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaaaag aaaaagaaag gagaaaatga cagcaattac 15060
ttttgcaaca acctaatata agttttttaa aagttaaata ttctgttcca tgcattgctg 15120
gataccttat aaataacagg gcatcctatg acctgaattt cccaaattat gagttgaggg 15180
tttgaactag ttttaaaaaa caaggaggcc aggcgcactg gctcatgcct gtaatcccag 15240
cactttggga ggctgaggca ggtggatcac gaggtcagga gctcgagacc agccttacca 15300
acatagtgaa acaccgcctc tactaaaaat acaaaaatta gccgggcgtg atggtgcgca 15360
cctgtaatct cagctactca gcaggctgag gcaggagaat cgcttgaacc cagaaggcgg 15420
aggttgcagt gagccaagat cacagcattg cactccagcc tgggcgacag agggagactc 15480
cgtcttcaaa aaaaaaaaaa aagacaagga atctgtaaaa caggcactgg aagtatatgc 15540
acttttattt tcattctatg ctatccgatg cctactgcta tttcccttca tatttaacct 15600
ccaacagctg cattttgctc cctccagacc acctgattgg agctcacgtg ctcccacaca 15660
gtacctccaa ccagagagag tcgagtccca cagaaaggcg taacaatcac cagtaatttt 15720
gcacttattt tacattgtgc cttgatacag agtactcaat gaatgctctt tgaatcatat 15780
ttaataaata tgtgtatttg ggattgtagc atattgcagc tacctggata tataatttaa 15840
ttagaaaaaa aattttgtgt ggctcaatca acaaacgact tttctctctc tctctttctc 15900
tttctccctc tctctctctt tcttctcagt tgatgttgct ggagttcagt gttgtgcaga 15960
tggcagtgac aaatgccatg ggcacatgag atatgataaa aggtccctga agaaggtgga 16020
gaaccagtta tcttatgaaa ttttccagag tgggtactgg atctctcctg tctggcacca 16080
tgctggcctc agcccaaggg gaatttcctt ccagagacag agggcagtga ttgaggtggg 16140
gagacagatc gtaacactga gacttacatg aggacaccaa acagaaaaaa ggtggcaagt 16200
atagaaaatt ctttcttctg gacagtcttc tctgttctaa cttcagcaaa attctccccc 16260
cagtggatgc tattgcacaa ccctacatat gctatgtttt ttcctataca cacttaccta 16320
tgataaaatg cattaattag tcacagtaag aggttaacaa caataactag taataaaata 16380
gaacaattca gtaaaataag agttacttga gcacaaacac taggatatca tgacagtcaa 16440
tctgatgacc aagagggcta ctaagcatct aaacaggagg gtaagtgtag acagcatgga 16500
gacgctggac aaagggatga ttcagtccca ggctggtatg gagcggaagg gcatgatatg 16560
tcatcacgct actaaggcac acaatttaaa atgagtaaat tcttatttct agaaatttct 16620
ttttaatatt ttcagactac agttgcctac aggtaactga aaccccagaa agcaaaattg 16680
ttgataagga ggtactactg tacatcgtcc tttgaaccaa ctttatcatt tgctagtata 16740
tacatatata cctacataca tacatataca catacctgca cacacctata tgtatacgta 16800
cacacacaca cacgcacaca cacacactca catctactaa tgttagaata agtttgctaa 16860
ataagatgca caacttgtta atgtcctaca gagcaataaa accataagca ttggggttat 16920
cttttctact agataaaaat ccattatcat tttcataaag ttttctttac attaacatct 16980
aacttttgca atctagtttt taatcatcat aaataggaag caaatgaact gtttctctag 17040
tgaatcaaat atccttgaaa acatacatag tcatcttttt ggtttatttt tatttttaga 17100
taaattattt aaagttttaa ataatttaac attcacaata gtttgtgact gtatattttg 17160
acttggtcct tcaaacttaa tttgtacttt tatgtatcgt gcttacctca attttttatt 17220
cacttttcct aaactttgct ggattggttt attatttttg tctatttctt ttccttctag 17280
tggtttggga gggtttttta aatcccatta ctattgaatg cctattaact tgcccccttt 17340
ttctttcaat ctctattccc acggcctgaa gcatgagggc caagctgtct gtaaccagca 17400
gagagatgac ccaggtgtta ttccactctc cactgtccac ctatcaccat tcccagcccg 17460
atagctctga agtacggctt ttctggggct ctgtggggaa aactagaact ggctgcttca 17520
aggacacctc ctgtttttgc aatggaaaaa atgtttctaa attccagttt ctctatgaat 17580
tcaatgacat ggtttaaatc tctgtggtgt tcttcaaagt tttttcttct aataggacct 17640
ctcatgattc tccaaccacg aaataaattc attatcattt ttatatttct tctgtcattg 17700
caaaggaggt tttgaaagag tggaggacgc gctaatgaac tcaaaaatcc acactattcc 17760
ttgtttccat ctgttgttca ttcattgttt ccattggcct gtccgcctcc tatcctcctt 17820
cttagacttg gagctctagc ctcagccagg atagggaaaa gagagatcag actgttactt 17880
tgtctatgta gaaaaggaag acataagaaa ctccattttg atctgtatcc tgaacaattg 17940
ttttgccttg agatgctgtt aatctgtaac tttagcccca accttgtgct cacagaaaca 18000
tgtgttgtat ggaatcaaga tttaagggat ctagggctgt gcagaatgtg ccttgttaac 18060
aacatgttta caggcagtat gcttggtaaa agtcatcgcc attctccatt ctcgattaac 18120
taggggcaca gtgcactgcg gaaagccgca gggacctctg cccaggaaaa ctgggtattg 18180
tccaaggttt ctccccactg agacagcctg agatatggcc ttgcgggatg ggaaagatct 18240
gaccgtcccc cagcctgaca cccgtgaagg gtctgcgctg aggaggatta gtaaaagagg 18300
aaggcctctt gcggttgaga taagaggaag ccctctgtct cctgcatgcc cctgggaacg 18360
gcatgtctca gtgtaaaacc tgattgtaca ttcgttctat tctgagatag gagaaaaccg 18420
ctctgtggct ggaggcgaga tatgctggcg gcaatgctgc tctgttgttc tttactacac 18480
tgagatgttt gggtgagaga agcataaatc tggcctacgt gcacatccag gcatagtacc 18540
ttcccttgaa tttacttgtg acacagattc ctttgctcac atgttttctt gctgaccttc 18600
tccccactat caccctgttc tcctgccgca ttccccttgc tgaggtagtg aaaatagtaa 18660
tcaataaata ctgagggaac tcagagaccg gtgccagcgc gggtcctccg tatgctgagt 18720
gacggtccct tgggcccact gttccttctc tatactttgt ctctgtgtct tatttctttt 18780
ctcagtctct cgtcccacct gacgagaaat acccacaggt gtggaggggc tggacacccc 18840
ttcgagccag gattatcagg gcatttgggg gtctgcaaaa ctaagcccca actcatcgat 18900
ttcacaactt catccagagc cagcctgaac agtagttgcc catgatttct atgccttaat 18960
acgagaagag aacatagggg ctgggtgcca agtaggtaga cagggagggc agggaactct 19020
aagacagagc ttgaggggct cattcctctt gcaaaatgaa acaaaaacca cagcactgaa 19080
tatgtaaatc tcggtggctg aacccctcct aggatagtaa gccctgacac aattgctgct 19140
atcttctctt tctctcaagg aagtcaaaaa acacctgcag ccttactgtc cccttggaaa 19200
caagatgaac atctacattt tctaaagtgg gacaagaatc tctgttcata tttatgtccc 19260
atgcatttgc acgtggccgg acaaaggact ttgcttctgc cagcacatct gtcttcagat 19320
atgagaggaa acagacacaa cctggaggcg gcaaagaagc agctctttct caagtgacct 19380
cctctatctc cctacttcct ggctaatggg gcagccttga tccttgggaa tccaggacag 19440
atatccactc gtgacaaact agctggaaga atgacaacca atcaggttcc aagcaccact 19500
ggatgtgaac cacagaattt cctcctctcc ttgtggaatg tcagcttacg tctgacaaaa 19560
aatgtaaaac tgagagagtt acaatcttaa ggaggagtca agctaaagca gaaagaatca 19620
cctactctgg actccagcat gactgctgag ctcaaatata tatagagaga gaaagaacca 19680
caaacttgaa gatggatatc agctacagac tttcctgagt caggtaggga aatggccatc 19740
cctcaaacct tgcaaaaggc aaacttatgc cattgtgtcc tctgacatac tgggtgatgt 19800
actgtatgtt actgatgtga ggggaacttc ctaaattggc tagtaaatta tgccaaataa 19860
aaagcaaaaa tgatatttct tgaaatgtta catctgagga acattgctaa aataatttat 19920
cagtagtttt caggatgatt tatagatgtg cattgaagtg tgtacttgtg ctctctctct 19980
cctctctctc tctctttctc tcctctctct cgctctttct ctccttgccc ccctccctcc 20040
ctgactttcc ttcctgtccc ctccacagca gtttatattt tttttctgat aatctaactt 20100
tgctgagggt tcaatgtaaa gcaccttcag tgatgagtta gttggaatgt tccccaagaa 20160
attctatttc cagcactctt ttacatgaaa tccaagaagc tctcagacta tcttactgac 20220
accttgcctt tcctcaacag atcaatctta tcaatgtcca tcacagatat tttgtagaac 20280
ggtggatcct ggcagagtct cacagatgct tctgagacaa catttgcttt caaaaaatga 20340
accacacaca tcctaaagat ctcagccact tcccatgttt cattttgtgt tacagcaaac 20400
atcacaacaa tcattcctac agatcaccac tgcatgtgat caataaaata gtttttgcaa 20460
caatggtact tatgataatc atcttttatt gtttacaaat actgctttac aatagttatt 20520
cggttgcact gttcatatta gatttccaat tagctcactt aggaacataa gtccctcgaa 20580
cagctcagtc atctttttca ttcctgtttc tatcccctac atctctttcc tttgcagacg 20640
actatctcct acactgaaac aggaaagctt ttaccttttt ggcatgcttg atttaaagat 20700
tatagaaaag tatttgacaa agaaaactca cacatgtgtg tacatatctt ttaaaaagtt 20760
atgtttatgc attgcacagg aatatcgaga atgctaatag gcaatgtcag agtttactgt 20820
ttttcaaaat tagtacagtt ttattatttc taaaaactat aaaatgaata tattcacatc 20880
accatacaga agagtaggag gagatggcat aaagtgtcat tgttcctcct ctgcaatccc 20940
aggagataac taccaagcac aatttatgtc ttttaaaatt cagcccgtat ttatatacat 21000
atatattcaa tgtagatggg atcatgatat ctcaccacac atactcttca gtgacctgca 21060
ttttcacaaa caccttccac gtaactatat agaagtctac gtcttcccct taatgtctgc 21120
tttgtgctac attgtaaagc tctagcacag tttaaccaaa ctcctattaa tgaggatttt 21180
agttattttt cactctttaa acaatatttc catgtgtagt cttatacata cgtctgtaca 21240
cacttatccc agtctaagga gttcctttta ccttccccca tcccagcatt ccctgtcacg 21300
cttgttgctt ccgttgagtg actttactcc tggagtataa tctgcgtata gttcagttaa 21360
aaacatggga tctgagttta ggtcacagct ctgccactta ctgccataag ccagttcctt 21420
gacctctctg ccctcaagtt tttgcaccta caaagtaggg gataatatta gttcctagtt 21480
catagagtct tgggaataat taaatgtgat gatccatgta caatgtctgg cacttagtaa 21540
gtgctcaata aatgtcaccc tttatgattg gtattgcgtg tatgtctgca gagaaaatca 21600
ctttgtgtcc cctttaaaaa aggactatgc ccttggtcag ctattttgca cattaaattt 21660
cacttgccaa tattaactct ccacctctaa cttgatccct ctccttcctc atcttctggt 21720
gagaccaaat gctaattctg ctattcaagg caactagcaa agctgccagt gacagaatca 21780
aataaaccta cccctaatct ttagaattgt agttatgatt tctgttgtaa aagttactgt 21840
tgtggcagtc agtattagtc tttggtctat gatagcatct ctgatctatt attgaytttc 21900
aattakgtat ttttttttat ttattctgaa aatgtttgtt aagcatttgc taagtaaaga 21960
tactggackg agcctcccaa atacagggca aataaaacat caaacagctt ataatttaga 22020
agggtagaag agaatctgaa agcaggtaaa aataaacagg cactcggctg ggcgcggtgg 22080
ctcacgcctg taatcccagc actttgggag gccgaggtgg gcggatcacg aggtcaggag 22140
atcgagacca tcctggctaa cacggtgaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaatta 22200
gcgaggcgtg gtggcgggcg cctttagtcc cagctagtcg ggaggctgag gcaggagaat 22260
ggtgtgaacc cgggaggcgg agcttgcagt gagccaagat cgcaccactg cactccagcc 22320
tgggygacag agcgagactc cgtctcaaaa aaaataaata aataaaataa aaaataatta 22380
ggtactctag gcccagtgac ctgtctctgt actctgtaaa ttcaggtcac ctgctcaggg 22440
ctaatctgag agaaggtctc tcttcagttg aattttgaaa gacaattagc agttcacaag 22500
ctaacccagg tggacaaaga tgttcccaag cagagggagt gcttgtgaaa gctggaggcc 22560
atagaaaaac tctaaggagt gtagggaggt gggagtaatg tatggaaggg gtggagatgg 22620
aaggttaaga gagatacaag gctgcaaaaa tggagctgga ctcaaaagaa aatactgaaa 22680
aggtcttcag tgttgttgat gagattacta tggaaacact atggaacact gggactccat 22740
ggcagctcca aagatggcat gcgcctggtc cagctcagta agagctgagc tcttcctgtg 22800
<210> 159
<211> 154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 159
tctggcaaca cggcctccct gaccgtctct gggctccagg ctgaggatga ggctgattat 60
tactgcagct catatgcagg cagcaacaat ttaagtcttc ggaactggga ccaaggtcac 120
cgtcctaggt cagcccaagt ccactcccac tctc 154
<210> 160
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 160
tcagggacaa tggccacctt gactatcagt ggggcccagg tggaggatga agctgactac 60
tactgttact caacagacag cagtggtaat cattatgtct tcggaactgg gaccaaggtc 120
accgtcctag gtcagcccaa gtccactccc actctc 156
<210> 161
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 161
tctgggaaca cagccactct gaccatcagc gggacccagg ctatggatga ggctgactat 60
tactgtcagg cgtgggacag cagcactgcc gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc 120
ctaggtcagc ccaagtccac tcccactctc 150
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 162
aggtggaaac acggtgagag t 21
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 163
ccactcgggg aaaagttgga a 21
Claims (77)
- 비-인간 동물(non-human animal)로서,
(a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림에 있는 1개 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 삽입체,
(b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림에 있는 1개 이상의 인간 VH, 1개 이상의 인간 DH 및 1개 이상의 인간 JH유전자 분절의 삽입체, 및
(c) ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되,
상기 ADAM6 단백질은 이소성(ectopic) ADAM6 핵산 서열로부터 발현되는 것인 비-인간 동물. - 제1항에 있어서, 상기 비-인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 마우스, 래트 또는 햄스터 불변 영역로부터 선택된 것인 비-인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 설치류 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 영역인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 설치류 경쇄 불변 영역은 래트 Cκ 영역인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 설치류 경쇄 불변 영역은 마우스 Cλ 영역인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 설치류 경쇄 불변 영역은 래트 Cλ 영역인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 적어도 12 내지 적어도 40개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제8항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 12개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제8항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 28개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제8항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 40개의 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 및 이들의 조합으로부터 선택된 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간은 적어도 4개의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제13항에 있어서, 상기 적어도 4개의 인간 Jλ 유전자 분절은 적어도 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 비-인간 동물에서 이소성인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 비-인간 ADAM6 자리(locus)와 비교해서 동일한 위치에 존재하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-인간 동물의 게놈에서 이소성 위치에 존재하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 면역글로불린 유전자 분절 내에 존재하는 것인 비-인간 동물.
- 제18항에 있어서, 상기 면역글로불린 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제19항에 있어서, 상기 중쇄 유전자 분절은 인간인 것인 비-인간 동물.
- 제19항에 있어서, 상기 중쇄 유전자 분절은 상기 비-인간 동물의 내인성 중쇄 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 분절을 결여하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 상기 비-인간 동물 내에서 면역글로불린 VL 도메인을 형성하기 위하여 재배열하는 것이 불가능한 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부가 1개 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로 교체되어 있는 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부가 1개 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로 교체된 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절의 전부 혹은 실질적으로 전부가 비-인간 동물에서 온전(intact)하며, 상기 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 분절과 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 사이에 삽입된 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제26항에 있어서, 온전한 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 비-인간 동물에서 항체의 VL 도메인을 형성하도록 재배열될 수 없게 된 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 인간 κ 경쇄 자리로부터의 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역을 더 포함하되, 상기 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 1개 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절과 연속적인 것인 비-인간 동물.
- 제28항에 있어서, 상기 인간 Vκ-Jκ 유전자간 영역은 인간 Vλ 유전자 분절과 인간 Jλ 유전자 분절 사이에 위치된 것인 비-인간 동물.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 조직.
- 항원 결합 단백질을 제작하기 위한, 제30항의 세포 또는 조직의 용도.
- 하이브리도마 또는 쿼드로마를 제작하기 위한, 제30항의 세포 또는 조직의 용도.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 세포는 B 세포인 것인 용도.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 조직은 비-인간 동물의 비장, 골수 또는 림프절로부터 유래된 것인 용도.
- 완전한 인간 항체를 제작하기 위한 제30항의 세포 또는 조직의 용도.
- 인간 Vλ 도메인 및/또는 인간 VH 도메인을 제작하기 위한, 제30항의 세포 또는 조직의 용도.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 마우스로부터 유래된 것인 용도.
- 제공된 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 제작하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 비-인간 동물을 관심 대상 항원에 노출시키는 단계,
(b) 상기 비-인간 동물의 하나 이상의 B 림프구를 단리시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 B 림프구는 상기 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 발현하는 것인, 상기 단리시키는 단계,
(c) 그 관심 대상 항원에 결합하는 상기 항체의 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 동정하는 단계로서, 상기 면역글로불린 경쇄는 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 도메인을 포함하는 것인, 상기 동정하는 단계, 및
(d) 상기 (c)의 핵산 서열을 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열로 이용해서 상기 관심 대상 항원에 결합하는 인간 항체를 제작하는 단계를 포함하는, 관심 대상 항원에 결합하는 항체의 제작방법. - 제38항에 있어서, 상기 비-인간 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ인 것인, 관심 대상 항원에 결합하는 항체의 제작방법.
- 제38항에 있어서, 상기 비-인간 경쇄 불변 영역은 마우스 Cλ인 것인, 관심 대상 항원에 결합하는 항체의 제작방법.
- 제38항에 있어서, 상기 항체는 인간 VH 도메인 및 비-인간 CH 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 것인, 관심 대상 항원에 결합하는 항체의 제작방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 마우스인 것인, 관심 대상 항원에 결합하는 항체의 제작방법.
- 유전자 변형된 비-인간 동물로서,
(a) 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에 있는 하나 이상의 재배열되지 않은(unrearranged) 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절, 및
(b) 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 있는 1개 이상의 인간 VH 유전자 분절, 1개 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 1개 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하되,
상기 비-인간 동물은 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편을 발현할 수 있는 것인 비-인간 동물. - 제43항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 인간 VH 도메인 및 비-인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄와, 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 함유하는 항체를 발현하는 것인 비-인간 동물.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 비-인간 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 도메인인 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편은 상기 마우스의 생식선 내의 이소성 서열에 의해 암호화되는 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAM6 단백질 또는 그의 기능성 단편은 상기 비-인간 동물의 내인성 서열에 의해 암화화된 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물의 내인성 경쇄 자리는 면역글로불린 λ 경쇄 자리인 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물의 내인성 경쇄 자리는 면역글로불린 κ 경쇄 자리인 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 내인성 경쇄 자리에서 내인성 VL 및/또는 JL 유전자 분절을 결여하고 있는 것인 비-인간 동물.
- 제50항에 있어서, 상기 VL 및/또는 JL 유전자 분절은 Vκ 및/또는 Jκ 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제50항에 있어서, 상기 VL 및/또는 JL 유전자 분절은 Vλ 및/또는 Jλ 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물의 VL 및 JL 유전자 분절은 1개 이상의 인간 Vλ 및 1개 이상의 인간 Jλ 유전자 분절로 교체된 것인 비-인간 동물.
- 제53항에 있어서, 상기 VL 및 JL 유전자 분절은 κ 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제53항에 있어서, 상기 VL 및 JL 유전자 분절은 λ 유전자 분절인 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 상기 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편으로부터 유래된 것인 비-인간 동물.
- 제56항에 있어서, 상기 클러스터 A의 단편은 인간 Vλ3-27로부터 인간 Vλ3-1을 통해 연장되는 것인 비-인간 동물.
- 제56항에 있어서, 상기 클러스터 A의 단편은 인간 Vλ3-12로부터 인간 Jλ1을 통해 연장되는 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편으로부터 유래된 것인 비-인간 동물.
- 제59항에 있어서, 상기 클러스터 B의 단편은 인간 Vλ5-52로부터 인간 Vλ1-40을 통해 연장되는 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편으로부터 그리고 클러스터 B의 단편으로부터 유래된 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 적어도 12개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 적어도 28 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 적어도 40개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1개의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 비-인간 동물.
- 제43항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 설치류인 것인 비-인간 동물.
- 제66항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 래트인 것인 비-인간 동물.
- 항원-결합 단백질을 제작하기 위한, 제43항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 비-인간 동물의 용도.
- 제68항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질은 인간인 것인 용도.
- 제68항에 있어서, 항원-결합 단백질은 항체인 것인 용도.
- 제43항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 조직.
- 제71항에 있어서, 상기 조직은 비장, 골수 또는 림프절로부터 유래된 것인 세포 또는 조직.
- 제71항에 있어서, 상기 세포는 B 세포인 것인 세포 또는 조직.
- 제71항에 있어서, 상기 세포는 배아줄기(ES) 세포인 것인 세포 또는 조직.
- 제69항에 있어서, 상기 세포는 생식 세포인 것인 세포 또는 조직.
- 인간 Vλ 도메인 또는 인간 Vκ 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄 및 인간 VH 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현하는 가임 비-인간 수컷 동물로서, 상기 수컷 비-인간 동물은 해당 수컷 비-인간 동물 내에서 기능적인 이소성 ADAM6 유전자 및 변형된 중쇄 가변 영역 자리를 포함하는 것인 가임 비-인간 수컷 동물.
- 제76항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 마우스인 것인 가임 비-인간 수컷 동물.
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