MX2014007682A

MX2014007682A - Ratones con cadena ligera humanizada.

Info

Publication number: MX2014007682A
Application number: MX2014007682A
Authority: MX
Inventors: Andrew J Murphy; Sean Stevens; Karolina A Hosiawa; Lyn Macdonald; Cagan Gurer
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2015-05-11
Also published as: EP2793567A1; IL258561A; JP7152447B2; RU2761639C2; RS67678B1; AU2025202709A9; IL233153A0; JP7507823B2; IL266268B; CN104159444B; PT2793567T; CY1121638T1; MX378871B; JP2022180594A; AU2012323987B2; AU2022221449A1; CA2859408A1; KR20200021552A; HK1202772A1; KR20200108113A

Abstract

Se proveen animales no humanos, tejidos, células y material genético que comprenden una modificación de una secuencia endógena de inmunoglobulina de cadena pesada no humana, y que comprenden actividad de ADAM6 funcional en un ratón, en donde los animales no humanos expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un dominio variable de cadena ligera cognado de inmunoglobulina ? humana.

Description

RATON ES CON CADENA LIGERA HUMANIZADA CAMPO DE LA INVENCION Se describen animales fertiles no humanos genéticamente modificados que expresan secuencias variables de cadena ligera de inmunoglobulina l humana afines a secuencias variables de cadena pesada humanas. Se describen ratones, células, embriones, y tejidos genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifican un ADAM6a funcional en un sitio ADAM6a de ratón, en donde I JS ratones, células, embriones, y tejidos comprenden segmentos de gen de cadena ligera de lambda inmunoglobulina humana que son capaces de reagrupación para formar un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina funcional. las modificaciones incluyen sitios de inmunoglobulina humana y/o humanizada. Se describen ratones que comprenden la función de ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una proteína ADAM6. Se describen ratones genéticamente modificados que comprenden una modificación genética de un sitio de región VH de inmunoglobulina de ratón endógena, y que además comprenden actividad de ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que restaura la fertilidad en el ratón macho.

Se describen animales fértiles no humanos genéticamente modificados que comprenden una eliminación o una modificación de un gen ADAM6 endógeno u homólogo u ortólogo del mismo, y que comprende una modificación genetica que restaura la función de ADAM6 (u homólogo u ortólogo del mismo) como un todo o en parte, en donde los animales no humanos expresan una secuencia variable de inmunoglobulina l humana en el contexto de una secuencia constante de cadena ligera l o K.

ANTECEDENTES Las aplicaciones farmacéuticas para anticuerpos en las dos últimas décadas han apoyado a un gran acuerdo de investigación para hacer anticuerpos que sean adecuados para usarse como terapéuticos humanos. Los terapéuticos de anticuerpo pasados, basándose en anticuerpos de ratón, no fueron ideales como terapéuticos humanos, ya que la administración repetida de anticuerpos de ratón a seres humanos da como resultado problemas de inmunogenicidad que pueden confundir los regímenes de tratamiento a largo plazo. Se desarrollaron soluciones basadas en humanizar anticuerpos de ratón para hacerlos parecer más al ser humano y con menos tipo de ratón. Siguieron métodos para expresar secuencias de inmunoglobulina humana para usarse en anticuerpos, la mayoría basándose en expresión in vitro de bibliotecas de inmunoglobulina humana en fagos, bacterias o levadura. Finalmente se hicieron intentos para hacer anticuerpos humanos útiles a partir de linfocitos humanos, in vitro, en ratones injertados con células hematopoyéticas humanas, y en ratones de trans-cromosoma o transgénicos con sitios deshabilitados de inmunoglobulina endógena. En los ratones transgénicos, fue necesario deshabilitar los genes de inmunoglobulina de ratón endógena de manera que los transgenes completamente humanos integrados de manera aleatoria podrían funcionar como la fuente de secuencias de inmunoglobulina expresadas en el ratón. Dichos ratones pueden hacer anticuerpos humanos adecuados para usarse como terapéuticos humanos, pero estos ratones presentan problemas substanciales con sus sistemas inmunes. Estos problemas (1 ) hacen al ratón impráctico para generar un repertorio de anticuerpo suficientemente diverso, (2) requieren del uso de correcciones extensas de re-diseño por ingeniería genética, (3) proporcionan un proceso de selección clonal sub-óptimo probablemente debido a una incompatibilidad entre elementos humanos y de ratón, y (4) hacen que estos ratones sean una fuente no confiable de poblaciones grandes y diversas de secuencias variables humanas necesarias para se verdaderamente útiles para hacer terapéuticos humanos.

Los ratones transgénicos que contienen transgenes de anticuerpo completamente humanos contienen transgenes aleatoriamente insertados que contienen secuencias variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizadas (secuencias V, D, y J) enlazadas a secuencias constantes de cadena pesada humanas, y secuencias variables de cadena ligera de inmunoglobulma humana no reorganizadas (V y J) enlazadas a secuencias constantes de cadena ligera humanas. Por lo tanto, los ratones generan genes de anticuerpo reorganizados a partir de sitios distintos a los sitios de ratón endógeno, en donde los genes de anticuerpo reorganizados son totalmente humanos. En general, los ratones contienen secuencias de cadena pesada humanas y secuencias de cadena ligera k humanas, aunque también se han reportado ratones con al menos algunas secuencias humanas l. Los ratones transgénicos en general tienen sitios de inmunoglobulina endógena dañados y no funcionales, o modificaciones por ingeniería genética de sitios de inmunoglobulina endógena, de manera que los ratones son incapaces de reorganizar secuencias de anticuerpo humanas en un sitio de inmunoglobulina de ratón endógena. Los cambios inesperados de dichos ratones transgénicos los hacen menos óptimos para generar un repertorio de anticuerpo humano suficientemente diverso en ratones, probablemente debido, al menos en parte, a un proceso de selección clonal sub-óptimo que interconecta moléculas de anticuerpo totalmente humano dentro de un sistema de selección de ratón endógeno.

Existe la necesidad en la téenica para elaborar animales no humanos genéticamente modificados, adecuados, que sean útiles para generar secuencias de inmunoglobulina, incluyendo secuencias de anticuerpo humano, y que sean útiles para generar un repertorio de anticuerpo humano suficientemente diverso. También existe la necesidad de ratones que sean capaces de reorganizar segmentos de gen de inmunoglobulina para formar genes de inmunoglobulina reorganizados útiles, incluyendo dominios variables de cadena pesada humanos que se deriven de dominios variables humano l o humanos K, O que sean capaces de hacer proteínas a partir de sitios de inmunoglobulina, incluyendo sitios que contengan una selección suficientemente diversa de secuencias variables de cadena ligera l humanas y/o k humanas. Existe una necesidad de animales no humanos que puedan generar regiones variables de anticuerpo a partir de segmentos tanto k humanos como l humanos, en donde los segmentos k humanos l como humanos se deriven de dominios variables de cadena ligera humanos. También existe la necesidad de un uso incrementado de animales genéticamente modificados de secuencias l humanas.

BREVE DESCRIPCION DE LA I NVENCION Se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden una modificación que reduce o elimina la actividad de un gen ADAM6 u homólogo u ortólogo del mismo, en donde la modificación da como resultado una pérdida de fertilidad, y los animales además comprenden una secuencia que codifica una actividad que complementa o rescata la pérdida de actividad o reducida de ADAM6 (o actividad homologa u ortóloga), y los animales no humanos además comprenden modificaciones que les permitan expresar regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se deriven de regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana l. En varios aspectos, las regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana l se expresan fusionadas a regiones constantes l o K.

En varios aspectos, la secuencia que codifica la actividad de ADAM6 es contigua con una secuencia de inmunoglobulina humana. En varios aspectos, la secuencia que codifica la actividad de ADAM6 es contigua con una secuencia de inmunoglobulina no humana. En varios aspectos, la secuencia está presente en el mismo cromosoma como el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina no humana del animal no humano. En varios aspectos, la secuencia está presente en un cromosoma diferente al sitio de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano.

Se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden una modificación que mantiene la actividad de un gen ADAM6 u homólogo u ortólogo del mismo, en donde la modificación incluye la inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana corriente arriba de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, y los animales no humanos además comprenden modificaciones que les permiten expresar regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana l derivadas de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En varios aspectos, las regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana l se expresan fusionadas a regiones constantes l o K.

En varios aspectos, la inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana se realiza 3’ o corriente abajo del gen ADAM6 del animal no humano. En varios aspectos, la inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana se realiza en una forma de manera que el gen(es) ADAM6 del animal no humano no es separado, eliminado y/o funcionalmente silenciado d e manera que la actividad de ADAM6 del animal no humano está al mismo nivel o a un nivel comparable como en un animal no humano que no contiene dicha inserción. Las modificaciones ilustrativas de separaciones, eliminaciones y/o funcionalmente silenciado incluyen cualquier modificación que de como resultado una reducción, eliminación y/o perdida de la actividad de las proteínas ADAM6 codificadas por el gen(es) de ADAM6 del animal no humano.

En un aspecto, se proporcionan construcciones de ácido nucleico, células, embriones, ratones, y métodos para hacer ratones que comprendan una modificación que de como resultado una proteína ADAM6 o gen ADAM6 de ratón endógeno no funcional (por ejemplo, una modificación por ingeniería genética de o una eliminación en un gen ADAM6 endógeno), en donde los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan construcciones de ácido nucleico, células, embriones, ratones y métodos para hacer ratones que comprendan una modificación de un sitio de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, el sitio de inmunoglobulina de ratón endógeno es un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación reduce o elimina la actividad de ADAM6 de una celula o tejido de un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una secuencia de nucleótido ectópica que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo; también se proporcionan ratones que comprenden una secuencia de nucleótido endógena que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo, y al menos una modificación genética de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada.

En un aspecto, se proporciona métodos para hacer ratones que comprenden una modificación de un sitio de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan métodos para hacer ratones que comprenden una modificación de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada, en donde la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada modificado (o una eliminación del mismo), y los ratones macho son capaces de generar descendencia mediante apareamiento. En una modalidad, los ratones macho son capaces de producir esperma que pueda viajar desde el útero de un ratón a traves del oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón.

En un aspecto, se proporcionan métodos para hacer ratones que comprenden una modificación de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada y un sito de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos para modificar el sitio de cadena pesada da como resultado ratones macho que exhiben una reducción en fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genética que restaura todo o en parte la reducción de fertilidad. En varias modalidades, la reducción de fertilidad se caracteriza por una incapacidad del esperma de los ratones macho a emigrar desde el útero de un ratón a través del oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón. En varias modalidades, la reducción de fertilidad se caracteriza por el esperma que exhibe un defecto de migración in vivo. En varias modalidades, la modificación genética que restaura todo o parte de la reducción de fertilidad es una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la modificación genética comprende reemplazar sitios variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con sitios variables de cadena pesada de inmunoglobulina de otra especie (por ejemplo, una especie que no es un ratón). En una modalidad, la modificación genética comprende la inserción de sitios variables de cadena pesada de inmunoglobulina ortóloga en sitios variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, la especie es humana. En una modalidad, la modificación genetica comprende la eliminación de un sitio variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena como un todo o en parte, en donde la eliminación da como resultado una pérdida de la función de ADAM6 endógeno. En una modalidad específica, la pérdida de la función de ADAM6 endógena está asociada con una reducción de fertilidad en ratones macho.

En una modalidad, la modificación genética comprende la inactivación de un sitio variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana como un todo o en parte, en donde la inactivación no da como resultado una pérdida de la función de ADAM6 endógeno. La inactivación puede incluir el reemplazo o eliminación de uno o más segmentos de gen no humano endógeno que resultan en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena que es substancialmente incapaz de reorganización para codificar una cadena pesada de un anticuerpo que comprende segmentos de gen no humano endógeno. La inactivación puede incluir otras modificaciones que hacen que el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena sea incapaz de reorganización para codificar la cadena pesada de un anticuerpo, en donde la modificación no incluye el reemplazo de eliminación de segmentos de gen endógeno. Las modificaciones ilustrativas incluyen inversiones y/o translocaciones cromosómicas mediadas por téenicas moleculares, por ejemplo, utilizando un lugar preciso de sitios de recombinación de sitio específico (por ejemplo, teenología Cre-lox). Otras modificaciones ilustrativas incluyen deshabilitar el enlace operable entre los segmentos de gen de ¡nmunoglobulina no humana y las regiones constantes de ¡nmunoglobulina no humana.

En una modalidad, la modificación genetica comprende insertar en el genoma del animal no humano un fragmento de ADN conteniendo uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos DH humano, y uno o más segmentos JH humano de otra especie (por ejemplo, una especie que no es ratón) operablemente enlazados a una o más secuencias de región constante (por ejemplo, un gen de IgM y/o IgG). En una modalidad, el fragmento de ADN es capaz de experimentar reorganización en el genoma del animal no humano para formar una secuencia que codifica un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad, la especie es humana. En una modalidad, la modificación genética comprende la inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de ¡nmunoglobulina humana corriente abajo o 3’ de un gen ADAM6 endógeno del animal no humano de manera que la actividad de ADAM6 (por ejemplo, expresión y/o función de una proteína codificada) es igual o comparable con la de un animal no humano que no comprende la inserción.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón a partir de un alelo ADAM6 endógeno de manera que un ratón macho que tiene la modificación exhibe una fertilidad reducida (por ejemplo, una habilidad altamente reducida para generar descendencia mediante apareamiento), o es esencialmente infértil, debido a la reducción o eliminación de la función de ADAM6 endógeno, en donde los ratones además comprenden una secuencia de ADA 6 ectópico u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón es una modificación (por ejemplo, una inserción, una eliminación, un reemplazo, etc.) en un sitio de inmunoglobulina de ratón.

En una modalidad, la reducción o pérdida de la función de ADAM6 comprende una incapacidad o una incapacidad substancial del ratón para producir esperma que pueda viajar desde el útero de un ratón a través de un oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón. En una modalidad específica, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de las células de esperma producidas en un volumen de cyaculación del ratón son incapaces de viajar a través de un oviducto in vivo después de la copulación y fertilizar un óvulo.

En una modalidad, la reducción o pérdida de la función de ADAM6 comprende una incapacidad para formar o incapacidad substancial para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre una superficie de una célula de esperma del ratón. En una modalidad, la pérdida de la función de ADAM6 comprende una incapacidad substancial para fertilizar un huevo de ratón mediante copulación con un ratón hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, y comprende una proteína (o una secuencia de nucleótido ectópica que codifica una proteína) que confiere funcionalidad ADAM6 al ratón. En una modalidad, el ratón es un ratón macho y la funcionalidad comprende fertilidad mejorada con un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

En una modalidad, la proteína es codificada a través de una secuencia genómica ubicada dentro de un sitio de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el sitio de inmunoglobulina es un sitio de cadena pesada. En otra modalidad específica, el sitio de cadena pesada comprende al menos un segmento de gen VH humano, al menos un DH humano, y al menos un JH humano. En una modalidad, la proteína ectópica es codificada por una secuencia genómica ubicada dentro de un sitio que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el sitio que no es de inmunoglobulina es una sitio transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el sitio transcripcionalmente activo es el sitio ROSA26. En una modalidad específica, el sitio transcripcionalmente activo está asociado con la expresión de tejido específico. En una modalidad, la expresión de tejido específico está presente en tejidos reproductivos. En una modalidad, la proteína es codificada por una secuencia genómica aleatoriamente insertada en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, el ratón comprende una cadena humana/ratón humana o quimérica o una cadena ligera humana/ratón quimérica (por ejemplo, variable humana, constante de ratón o rata) y una cadena pesada constante variable humana/ratón o rata quimérica. En una modalidad específica, el ratón comprende una transgen que comprende un gen de cadena ligera constante quimérica variable humana/rata o ratón operablemente enlazado a un promotor transcripcionalmente activo, por ejemplo, un promotor ROSA26. En una modalidad adicional específica, el transgen de cadena ligera quimérica humana/ratón o rata comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica está ubicada dentro de un sitio de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el sitio de inmunoglobulina es un sitio de cadena pesada. En una modalidad, el sitio de cadena pesada comprende al menos un segmento de gen VH humano, al menos uno DH humano, y al menos uno JH humano. En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica está ubicada dentro de un sitio de inmunoglobulina no humana en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el sitio de inmunoglobulina no humana es un sitio transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el sitio transcripcionalmente activo es el sitio ROSA26. En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica se coloca aleatoriamente insertado en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótido ectópica que complementa la perdida de la función de ADAM6 de ratón. En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica confiere al ratón la habilidad de producir descendencia que es comparable con un ratón de tipo silvestre correspondiente que contiene un gen ADAM6 endógeno funcional. En una modalidad, la secuencia confiere al ratón la habilidad de formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre la superficie de la célula de esperma del ratón. En una modalidad, la secuencia confiere al ratón la habilidad de recorrido desde el útero de un ratón a través de un oviducto de ratón hacia un óvulo de ratón para fertilizar el óvulo.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótido ectópica produce al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% del número de camadas que un ratón de tipo silvestre de la misma edad y raza produce en un período de seis meses.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótido ectópica produce al menos aproximadamente 1 .5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2.5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces aproximadamente 8 veces, o aproximadamente 10 veces o más de progenie cuando procrea durante un período de seis meses que un ratón de la misma edad y la misma raza o una similar que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótido ectópica que está procreando substancialmente durante el mismo período y bajo substancialmente las mismas condiciones.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótido ectópica produce un promedio de al menos aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, o 4 veces más del número de crías por camada en un período de procreación de 4 o 6 meses que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótido ectópica, y que está criando durante el mismo período de tiempo.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótido ectópica es un ratón macho, y el ratón macho produce esperma que cuando se recupera de los oviductos a aproximadamente 5-6 horas después de la copulación refleja una migración desde el oviducto que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, al menos 1 10 veces, o 120 veces o mayor que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótido ectópica.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional cuando copula con un ratón hembra genera esperma que es capaz de cruzar el útero y entrar y cruzar el oviducto dentro de aproximadamente 6 horas a una eficiencia que es aproximadamente igual al esperma de un ratón de tipo silvestre.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional produce al menos aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, o aproximadamente 4 veces o más camadas en un período comparable que un ratón que carece del gen ADAM6 funcional y que carece de la secuencia de nucleótido ectópica.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende, en su línea germinal, una secuencia de ácido nucleico que no es de ratón que codifica una proteína inmunoglobulina, en donde la secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón comprende la inserción de un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón comprende una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende uno o más segmentos de gen V, uno o más segmentos de gen D, y uno o más segmentos de gen J; en una modalidad, la secuencia comprende uno o más segmentos de gen V y uno o más segmentos de gen J. En una modalidad, el uno o más segmentos de gen V, D y J, o uno o más segmentos de gen V y N, están no reorganizados. En una modalidad, el uno o más segmentos de gen V, D y J, o uno o más segmentos de gen V y N, están reorganizados. En una modalidad, después de la reorganización de uno o más de los segmentos de gen V, D y J, o uno o más segmentos de gen V y N, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6_de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, después de la reorganización, el ratón comprende en su genoma al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, después de la reorganización, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en una célula B. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en una célula que no es B.

En un aspecto, se proporcionan ratones que expresan una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o fragmento funcional de la misma a partir de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena, en donde los ratones comprenden una actividad de ADAM6 que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, los ratones macho comprenden un alelo ADAM6 endógeno, no modificado, individual u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un sitio ADAM6 endógeno.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 de ratón ectópico u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que codifica una proteína que confiere la función de ADAM6.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en una ubicación en el genoma de ratón que se aproxima a la ubicación del alelo ADAM6 de ratón endógeno, por ejemplo, 3’ de una secuencia de segmento de gen V y 5’ de un segmento de gen D inicial.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo flanqueada corriente arriba, corriente abajo, o corriente arriba y corriente abajo (con respecto a la dirección de transcripción de la secuencia ADAM6) de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de gen variable de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el segmento de gen variable de inmunoglobulina es un segmento de gen humano. En una modalidad, el segmento de gen variable de inmunoglobulina es un segmento de gen humano, y la secuencia que codifica el ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un ratón está entre los segmentos de gen V; en una modalidad, el ratón comprende dos o más segmentos de gen V humano, y la secuencia está en una posición entre el segmento de gen V final y el segmento de gen V penúltimo; en una modalidad, la secuencia está en una posición que sigue al segmento de gen V final y el primer segmento de gen D.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que está ubicada en una posición en un sitio de inmunoglobulina endógena que es igual a o substancialmente igual a un ratón macho de tipo silvestre. En una modalidad específica, el sitio endógeno es incapaz de codificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo, en donde la región variable comprende o se deriva de un segmento de gen no humano endógeno. En una modalidad específica, el sitio endógeno está colocado en una ubicación en el genoma del ratón macho que lo hace incapaz de codificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo. En varias modalidades, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ubicada en el mismo cromosoma como los segmentos de gen de inmunoglobulina humana y la secuencia ADAM6 codifica una proteína ADAM6 funcional.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho que comprende un gen ADAM6 endógeno no funcional, o una eliminación de un gen ADAM6 endógeno, en su línea germinal; en donde las células de esperma del ratón son capaces de transitar por un oviducto de un ratón hembra y fertilizar un huevo.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho que comprende un gen ADAM6 endógeno funcional y una modificación a un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad, la modificación se hace corriente abajo, o 3’, del gen ADAM6 endógeno.

En una modalidad, la modificación es un reemplazo de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la modificación es una inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana corriente arriba de un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación genetica que reduce la función de ADAM6 de ratón endógeno, en donde el ratón comprende al menos algo de funcionalidad de ADAM6 provista ya sea por un alelo no modificado endógeno que es funcional como un todo o en parte (por ejemplo, un heterocigoto), o por la expresión de una secuencia ectópica que codifica un ADA 6 o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, el ratón comprende una función de ADAM6 suficiente para conferir a ratones macho la habilidad de generar descendencia mediante apareamiento, según comparado con ratones macho que carecen de un ADAM6 funcional. En una modalidad, la función de ADAM6 es conferida por la presencia de una secuencia de nucleótido ectópica que codifica un ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la función de ADAM6 es conferida por un gen ADAM6 endógeno presente en un sitio de inmunoglobulina endógena, en donde el sitio de inmunoglobulina endógena es incapaz de codificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo. Los homólogos u ortólogos de ADAM6 o fragmentos del mismo que son funcionales en un ratón macho incluyen aquellos que restauran, como un todo o en parte, la pérdida de la habilidad para generar descendencia observada en un ratón macho que carece de suficiente actividad de ADAM6 de ratón endógeno, por ejemplo, la pérdida de habilidad en una ratón diseñado por ingeniería genética de ADAM6. En este sentido, los ratones diseñados por ingeniería genética de ADAM6 incluyen ratones que comprenden un sitio endógeno o fragmento del mismo, pero que no es funcional, es decir, que no expresa ADAM6 (ADAMa y/o ADAMb) para nada, o que expresa ADAM6 (ADAMa y/o ADAMb) a un nivel que es insuficiente para soportar una habilidad esencialmente normal para generar descendencia de un ratón macho de tipo silvestre. La pérdida de función puede deberse, por ejemplo, a una modificación en un gen estructural del sitio (es decir, en una región de codificación de ADAM6a o ADAM6b) o en una región reguladora del sitio (por ejemplo, en una secuencia 5’ para el gen ADAM6a, o 3’ de la región de codificación de ADAM6a o ADAM6b, en donde la secuencia controla, todo o en parte, la transcripción de un gen ADAM6, la expresión de un ARN de ADAM6, o la expresión de una proteína ADAM6). En varias modalidades, los ortólogos u homólogos o fragmentos del mismo que son funcionales en un ratón macho son aquellos que permiten a un esperma de un ratón macho (o la mayoría de las células de esperma en la cyaculación de un ratón macho) transitar por un oviducto de ratón y fertilizar un óvulo de ratón.

En una modalidad, los ratones que expresan la región variable de ¡nmunoglobulina humana o su fragmento funcional comprenden una actividad suficiente de ADAM6 para conferir los ratones macho la capacidad de generar descendencia mediante apareamiento con ratones hembra y, en una modalidad, los ratones macho exhiben una capacidad para generar descendencia cuando se aparean con ratones hembra que, en una modalidad, es al menos 25%, en una modalidad, al menos 30%, en una modalidad, al menos 40%, en una modalidad, al menos 50%, en una modalidad, al menos 60%, en una modalidad, al menos 70%, en una modalidad, al menos 80%, en una modalidad, al menos 90%, y en una modalidad, al menos aproximadamente igual que aquella de ratones con uno o dos alelos ADAM6 no modificados endógenos.

En una modalidad, los ratones macho expresan suficiente ADAM6 (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) para permitir a una célula de esperma de los ratones macho a cruzar el oviducto de un ratón hembra y fertilizar un huevo de ratón.

En una modalidad, la funcionalidad de ADAM6 es conferida por una secuencia de ácido nucleico que es contigua con una secuencia cromosómica de ratón (por ejemplo, el ácido nucleico es aleatoriamente integrado en un cromosoma de ratón; o colocado en una ubicación específica, por ejemplo, al dirigir el ácido nucleico a una ubicación específica, por ejemplo, a través de inserción mediada por recombinasa de sitio específico (por ejemplo, mediada por Cre) o recombinación homologa). En una modalidad, la secuencia de ADAM6 está presente en un ácido nucleico que es distinto de un cromosoma del ratón (por ejemplo, la secuencia de ADAM6 está presente en un episoma, es decir de manera extracromosómica, por ejemplo, en una construcción de expresión, un vector, un YAC, un transcromosoma, etc.).

En un aspecto, se proporcionan ratones y células genéticamente modificados que comprenden una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde los ratones expresan al menos una porción de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, al menos una porción de una secuencia humana, en donde los ratones comprenden una actividad de ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la modificación reduce o erradica una actividad de ADAM6 del ratón. En una modalidad, el ratón es modificado de manera que ambos alelos que codifican la actividad de ADAM6 están ya sea ausentes o expresan un ADAM6 que no funciona substancialmente para soportar un apareamiento normal en un ratón macho. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la modificación mantiene la actividad de ADAM6 del ratón y hace que un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena sea incapaz de codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, la modificación incluye inversiones cromosómicas y/o translocaciones que hacen que los segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena sean incapaces de reorganización para codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que está operablemente enlazada a una región constante de cadena pesada.

En un aspecto, se proporcionan ratones y celulas genéticamente modificados que comprenden una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde la modificación reduce o elimina la actividad de ADAM6 expresada de una secuencia de ADAM6 del sitio, y en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo. En varias modalidades, la proteína ADAM6 o fragmento de la misma es codificada por una secuencia de ADAM6 ectópica. En varias modalidades, la proteína ADAM6 o fragmento del mismo es expresada de un alelo ADAM6 endógeno. En varias modalidades, el ratón comprende un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una primera modificación que reduce o elimina la expresión de un ADAM6 funcional a partir del primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón comprende un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una segunda modificación que substancialmente no reduce o no elimina la expresión de un ADAM6 funcional a partir del segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En varias modalidades, la modificación es la inserción de uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana corriente arriba, o 5’, de un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En varias modalidades, la modificación mantiene el gen ADAM6 endógeno en en sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En una modalidad, la segunda modificación está ubicada 3’ (con respecto a la direccionalidad de transcripción del segmento de gen V de ratón) de un segmento de gen V de ratón final y ubicada 5’ (con respecto a la direccionalidad de transcripción de la secuencia constante) de un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (o humana/ratón quimérica) o fragmento del mismo (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una bisagra humana y/o ratón: CH 1 y/o CH2 y/o CH3.

En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer sitio que codifica un primer alelo ADAM6, y la función de ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 endógeno en un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo sitio que codifica un ADAM6 funcional, en donde el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una modificación de un segmento de gen V, D, y/o J. En una modalidad específica, al menos una modificación del segmento de gen V, D, y/o J es una eliminación, un reemplazo con un segmento de gen V, D, y/o J humano, un reemplazo con un segmento de gen V, D, y/o J de camélido, un reemplazo con un segmento de gen V, D, y/o J humanizado o camelizado, un reemplazo de una secuencia de cadena pesada con una secuencia de cadena ligera, y una combinación de los mismos. En una modalidad, al menos una modificación es la eliminación de uno o más segmentos de gen V, D, y/o J de cadena pesada y un reemplazo con uno o más segmentos de gen V y/o J de cadena ligera (por ejemplo, un segmento de gen V y/o J de cadena ligera humana) en el sitio de cadena pesada.

En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer sitio y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo sitio, y I a función de ADAM6 resulta de la expresión de una ADAM6 ectópico en un sitio que no es inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el sitio que no es inmunoglobulina es el sitio ROSA26. En una modalidad específica, el sitio que no es inmunoglobulina es de manera de transcripción activo en el tejido reproductivo.

En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer sitio y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo sitio, y la función de ADAM6 resulta de un gen ADAM6 endógeno en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el gen ADAM6 endógeno es yuxtapuesto por segmentos de gen de inmunoglobulina de ratón.

En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer sitio y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo sitio, y la función de ADAM6 resulta de la expresión de una secuencia de ADAM6 ectópica en el primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer sitio y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo sitio, y la función o actividad de ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 ectópico en el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un diseño por ingeniería genética de ADAM6 de heterocigoto o un homocigoto. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de inmunoglobulina modificada que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada, o una secuencia de inmunoglobulina humana o de ratón o camélido o camelizada. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada está presente en el sitio de inmunoglobulina de cadena pesada endógena. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada comprende una secuencia de gen variable de cadena pesada humana en un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada endógena. En una modalidad, la secuencia de gen variable de cadena pesada humana reemplaza una secuencia variable de cadena pesada endógena en el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En un aspecto, se proporciona un ratón incapaz de expresar un ADAM6 de ratón endógeno funcional de un sitio de ADAM6 de ratón endógeno. En una modalidad, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6, o fragmento funcional del mismo, que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica una proteína que rescata una pérdida de la habilidad para generar descendencia exhibida por un ratón macho que es homocigoto para un diseño por ingeniería genática de ADAM6. En una modalidad específica, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica una proteína ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un sitio de ADAM6 endógeno funcional, y que comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que confiere al ratón una función de ADAM6. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ADAM6 de ratón endógena o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 de ratón endógena comprende una secuencia que codifica ADAM6a y ADAM6b ubicada en un ratón de tipo silvestre entre el segmento de gen V de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón más al 3’ (VH) y el segmento de gen D de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón más al 5’ ( D H ) - En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica el ADAM6a de ratón o fragmento funcional del mismo y/o una secuencia que codifica ADAM6b de ratón o su fragmento funcional, en donde el ADAM6a y/o ADAM6b o fragmento funcional del mismo está operablemente enlazado a un promotor. En una modalidad, el promotor es un promotor humano. En una modalidad, el promotor es el promotor ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 comprende una secuencia localizada entre el primer codón del primer gen de ADAM6 más cerca al segmento de gen DH más hacia 5’ y la secuencia de señal de recombinación del segmento de gen DH más hacia 5’, en donde 5’ está indicado con respecto a la dirección de transcripción de los genes de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el promotor es un promotor viral. En una modalidad específica, el promotor viral es un promotor de citomegalovirus (CMV). En una modalidad, el promotor es un promotor de ubiquitina.

En una modalidad, el promotor es un promotor inducible o de inducción. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en tejidos no reproductivos. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en tejidos reproductivos. En una modalidad específica, la expresión de las secuencias de ADAM6a y/o ADAM6b de ratón o sus fragmentos funcionales está regulada a manera de desarrollo a través del promotor inducible en tejidos reproductivos.

En una modalidad, los ADAM6a y/o ADAM6b de ratón se seleccionan del ADAM6a de SEC I D NO: 2 y/o ADAM6b de la secuencia de SEC ID NO: 2. En una modalidad, el promotor ADAM6 es un promotor de SEC ID NO: 3. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC I D NO: 2 directamente corriente arriba (con respecto a la dirección de transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y extendiéndose hacia el final de SEC I D NO: 3 corriente arriba de la región de codificación de ADAM6. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio de ADAM6a a aproximadamente 0.5 kb, 1 kb, 2 kb, o 3 kb o más corriente arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende SEC ID NO: 3 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es inférti! o que ahora tiene fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a aproximadamente la fertilidad de tipo silvestre. En una modalidad, SEC ID NO: 3 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir una célula de esperma que sea capaz de cruzar el oviducto de un ratón hembra con el fin de fertilizar un huevo de ratón.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico es cualquier secuencia que codifica un gen de ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que cuando se coloca en o se mantiene en un ratón produce un nivel de fertilidad que es igual o comparable con un ratón de tipo silvestre. Un nivel ilustrativo de fertilidad puede ser demostrado a través de la habilidad de un ratón macho para producir una célula de esperma que es capaz de cruzar el oviducto de un ratón hembra con el fin de fertilizar un huevo de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una eliminación de una secuencia de nucleótido endógena que codifica una proteína ADAM6, un reemplazo de un segmento de gen VH de ratón endógeno con un segmento de gen VH humano, y una secuencia de nucleótido ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o su fragmento que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una eliminación de una secuencia de nucleótido de sitio de inmunoglobulina endógena que comprende un gen de ADAM6 endógeno, comprende una secuencia de nucleótido que codifica uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina humana, y en donde la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro o directamente adyacente a la secuencia de nucleótido que codifica uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VH endógeno con una secuencia de nucleótido que codifica un o más segmentos de gen VH, y la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro, o directamente adyacente, a la secuencia de nucleótido que codifica uno o más de los segmentos de gen VH humano. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen DH endógeno por uno o más segmentos de gen DH humano en el sitio de gen DH endógeno.

En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen JH endógeno por uno o más segmentos de gen JH humano en el sitio de gen JH endógeno. En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VH, DH, y J H endógenos y un reemplazo en todos los sitios de gen VH, DH, y J H endógenos por segmentos de gen VH, DH , y JH h umanos, en donde el ratón comprende una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una modalidad, el ratón comprende una inserción de segmentos de gen VH . DH , y JH humanos en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde el ratón comprende un gen ADAM6 que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está colocada entre el penúltimo segmento de gen VH más hacia 3’ de los segmentos de gen VH humanos, y el último segmento de gen VH 3‘ de los segmentos de gen VH humanos presentes. En una modalidad específica, el ratón comprende una eliminación de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón, y un reemplazo con todos o substancialmente todos los segmentos de gen VH humanos, y la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca corriente abajo del segmento de gen humano VH 1 -2 y corriente arriba del segmento de gen humano VH6- 1 .

En una modalidad específica, el ratón comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VH endógenos con una secuencia de nucleótido que codifica uno o más segmentos de gen VH humanos, y la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro, o directamente adyacente a, la secuencia de nucleótido que codifica uno o más de los segmentos VH humanos.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está presente en un transgen en el genoma del ratón. En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón está presente d e manera extracromosómica en el ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde el ratón expresa una célula B que comprende una secuencia de inmunoglobulina reorganizada operablemente enlazada a una secuencia de gen de región constante de cadena pesada, y la célula B comprende en su genoma (por ejemplo, en un cromosoma de célula B) un gen que codifica un ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina reorganizada operablemente enlazada a la secuencia de gen de región constante de cadena pesada comprende una secuencia V, D, y/o J de cadena pesada humana; una secuencia V, D, y/o J de cadena pesada de ratón; una secuencia V y/o J de cadena ligera humana o de ratón. En una modalidad, la secuencia de gen de región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada humana o de ratón seleccionada del grupo que consiste de CH 1 , una bisagra, CH2, CH3, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcionalmente silenciado, en donde la función de ADAM6 es mantenida en el ratón, y además comprende una inserción de uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina humana corriente arriba o 5’ de una o más regiones constantes de cadena pesada de ratón. En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana incluyen uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano y uno o más segmentos de gen JH humano. En una modalidad específica, el ratón además comprende un sitio de cadena ligera endógena funcionalmente silenciada, en donde el ratón comprende una actividad de ADAM6 que es igual o comparable con un ratón de tipo silvestre, y además comprende una inserción de uno o más segmentos de gen de cadena ligera l humano corriente arriba o 5’ de una región constante de cadena ligera de ratón. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprende 12 segmentos de gen nl humano y uno o más segmentos de gen ?l humano. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprende 12 segmentos de gen nl humano y cuatro segmentos de gen JX humano. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprende 28 segmentos de gen VX humano y uno o más segmentos de gen ?l humano. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprenden 28 segmentos de gen \/l humano y cuatro segmentos de gen ?l humano. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprenden 40 segmentos de gen nl humano y uno o más segmentos de gen JX humano. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena ligera l humana comprenden 40 segmentos de gen VX humano y cuatro segmentos de gen ?l humano. En varias modalidades, los cuatro segmentos de gen ?l humano incluyen J l 1 , JX2, JX3 y JX7. En varias modalidades, la región constante de cadena ligera de ratón es una CK de ratón o una CX de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un gen de cadena ligera de inmunoglobulina funcionalmente silenciada, y además comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con uno o más segmentos de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde el ratón carece de un sitio ADAM6 endógeno funcional, y en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótido ectópico que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un sitio o secuencia de ADAM6 de ratón endógeno funcional y que comprende una secuencia de nucleótido ectópica que codifica un sitio de ADAM6 de ratón o fragmento funcional de un sitio o secuencia de ADAM6 de ratón, en donde el ratón es capaz de aparearse con un ratón del sexo opuesto para producir una progenie que comprende el sitio o secuencia de ADAM6 ectópica. En una modalidad, el ratón es un macho. En una modalidad, el ratón es una hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un segmento de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana en un sitio de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena, el ratón carece de una secuencia de ADAM6 funcional endógena en el sitio de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena, y en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótido ectópica que expresa una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en una ratón macho.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica que expresa la proteína ADAM6 de ratón es extracromosómíca. En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica que expresa la proteína ADAM6 de ratón está integrada con uno o más sitios en un genoma del ratón. En una modalidad específica, uno o más de los sitios incluyen un sitio de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena, en donde la cadena pesada se deriva de un segmento de gen V humano, un segmento de gen D, y un segmento de gen J, en donde el ratón comprende una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el ratón comprende una pluralidad de segmentos de gen V humano, pluralidad de segmentos de gen D humano, y una pluralidad de segmentos de gen J humano. En una modalidad, los segmentos de gen D son segmentos de gen D humano. En una modalidad, los segmentos de gen J son segmentos de gen J humano. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de región constante de cadena pesada humanizada, en donde la humanización comprende el reemplazo de una secuencia seleccionada de CH1 , gozne, CH2, CH3, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, la cadena pesada se deriva de un segmento de gen V humano, segmento de gen D humano, segmento de gen J humano, una secuencia CH1 humana, una secuencia de gozne humana o de ratón, una secuencia CH2 de ratón, y una secuencia CH3 de ratón. En otra modalidad específica, el ratón además comprende una secuencia constante de cadena ligera humana.

En una modalidad, el ratón comprende un gen ADAM6 que está flanqueado 5’ y 3’ a través de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, los segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena son incapaces de codificar una cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, el gen ADAM6 del ratón está en una posición que es igual a la de un ratón de tipo silvestre y los sitios de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del ratón que son incapaces de reclasificación para codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En una modalidad, el segmento de gen V es flanqueado 5’ (con respecto a la dirección de transcripción del segmento de gen V) por una secuencia que codifica una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el segmento de gen V es flanqueado 3’ (con respecto a la dirección de transcripción del segmento de gen V) por una secuencia que codifica una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el segmento de gen D es flanqueado 5’ (con respecto a la dirección de transcripción del segmento de gen D) por una secuencia que codifica una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótido ubicada 5’ del segmento de gen D más hacia 5’ y 3’ del segmento de gen V más hacia 3' (con respecto a la dirección de transcripción del segmento de gen V) del sitio de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno modificado.

En una modalidad, la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótido ubicada entre dos segmentos de gen V humano en el sitio de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno. En una modalidad, los dos segmentos de gen V humano son un segmento de gen VHa-2 humano y un segmento de gen VH6-1 .

En una modalidad, la secuencia de nucleótido comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma, una secuencia de ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma, y una combinación de la misma.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido entre los dos segmentos de gen V humano se coloca en una orientación de transcripción opuesta con respecto a los segmentos de gen V humano. En una modalidad específica, la secuencia de nucleótido codifica, de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción de los genes de ADAM6, y la secuencia de ADAM6 seguido por una secuencia de transcripción.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de una secuencia de pseudo-gen de ADAM6 humano entre segmentos de gen V humano, VH1 -2 y VH6-1 , con una secuencia de ADAM6 de ratón o un fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, la secuencia que codifica la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón es una secuencia de ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento de gen DFL16.1 de ratón endógeno (por ejemplo, en un heterocigoto de ratón para el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno modificada), o un segmento de gen DH 1 -1 humano. En una modalidad, el segmento de gen D de la cadena pesada de inmunoglobulma expresada por el ratón se deriva de un segmento de gen DFL16.1 de ratón endógeno o un segmento de gen DH 1 - 1 humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en una célula que lleva ADN de linaje de célula B no reclasificada, pero no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en una célula B que comprende sitios de inmunoglobulina reclasificados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) ocurre en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la cual un gen de ADAM6 de ratón aparece en un ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en todas o substancialmente todas las células que llevan el ADN que no son de linaje de célula B reclasificada; en una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en células de línea germinal del ratón, pero no en un cromosoma de una célula B reclasificada.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en todas o substancialmente todas las células que llevan el ADN , incluyendo celulas B que comprenden sitios de inmunoglobulina reclasificados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) ocurre en el genoma en una posición que es diferente de una posición en donde un ADAM6 de ratón aparece en un ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está en un ácido nucleico que es contiguo al sitio de inmunoglobulina reclasificado. En una modalidad, el ácido nucleico que es contiguo al sitio de inmunoglobulina reclasificado es un cromosoma. En una modalidad, el cromosoma es un cromosoma que se encuentra en un ratón de tipo silvestre y el cromosoma comprende una modificación de un sitio de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende una célula B que comprende en su genoma una secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo está en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo está en un sitio que no es un sitio de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 está sobre un transgen dirigido por un promotor heterólogo. En una modalidad específica, el promotor heterólogo es un promotor de no inmunoglobulina. En una modalidad específica, la célula B expresa una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo.

En una modalidad, 90% o más de las células B del ratón comprende un gen que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo del mismo o un fragmento del mismo que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, el ratón es un ratón macho.

En una modalidad, el genoma de célula B comprende un primer alelo y un segundo alelo que comprenden la secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo. En una modalidad, el genoma de célula B comprende un primer alelo pero no un segundo alelo que comprende la secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde la modificación mantiene uno o más alelos de ADAM6 endógeno y el ratón además comprende una inserción de uno o más segmentos de gen nl humano y uno o más segmentos de gen ?l humano corriente arriba de una región constante de cadena ligera de ratón. En varias modalidades, la región constante de cadena ligera de ratón es una Ol de ratón o una C de ratón.

En una modalidad, la modificación presenta al ratón incapaz de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos de gen de cadena pesada endógeno reclasificados de al menos una alelo de cadena pesada y mantiene un alelo de ADA 6 endógeno ubicado dentro de al menos un alelo de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos de gen de cadena pesada endógeno reclasificados de al menos uno de los alelos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, y los ratones expresan la proteína ADAM6 de un alelo de ADAM6 endógeno. En una modalidad específica, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional que comprende segmentos de gen de cadena pesada endógeno reclasificados de dos alelos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, y los ratones expresan una proteína ADAM6 de uno o más alelos de ADAM6 endógeno.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional de cada alelo de cadena pesada endógena, y los ratones comprenden un alelo de ADAM6 funcional ubicado dentro de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, o 120 o más Mbp corriente arriba (con respecto a la dirección de transcripción del sitio de cadena pesada de ratón) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad específica, el alelo de ADAM6 funcional está en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (por ejemplo, en una región V-D intergénica, entre dos segmentos de gen V, entre un segmento de gen V y uno D, entre un segmento de gen D y uno J, etc.). En una modalidad específica, el alelo de ADAM6 funcional está ubicado dentro de una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento de gen V de ratón final y el primer segmento de gen D de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos de ADAM6 endógeno.

En una modalidad, la modificación hace al ratón incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional de al menos uno de los alelos de ADAM6 endógeno. En una modalidad específica, el ratón es incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional de cada uno de los alelos de ADAM6 endógeno.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de cada alelo de ADAM6 endógeno, y los ratones comprenden una secuencia de ADAM6 ectópica.

En una modalidad, ios ratones son incapaces de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de cada alelo de ADAM6 endógeno, y los ratones comprenden una secuencia de ADAM6 ectópica ubicada entre 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, o 120 o más kb corriente arriba (con respecto a la dirección de transcripción del sitio de cadena pesada de ratón) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad específica, la secuencia de ADAM6 ectópica está en el sitio de cadena pesada endógena (por ejemplo, en una región V-D intergénica, entre dos segmentos de gen V, entre un segmento de gen V y uno D, entre un segmento de gen D y uno J , etc.) . En una modalidad específica, la secuencia de ADAM6 ectópica está ubicada dentro de una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento de gen V de ratón y el primer segmento de gen D de ratón. En otra modalidad específica, la secuencia V-D intergénica endógena de 90 a 100 kb es removida, y la secuencia de ADAM6 ectópica está colocada entre el segmento de gen V final y el primer D.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho infértil, en donde el ratón comprende una eliminación de dos o más alelos de ADAM6 endógeno. En un aspecto, se proporciona un ratón hembra que es un portador de un rasgo de infertilidad de macho, en donde el ratón hembra comprende en su línea germinal un alelo de ADAM6 no funcional o una modificación genética (knockout) de un alelo de ADAM6 endógeno.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un segmento de gen V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógena que son incapaces de reclasificación para codificar una cadena pesada de un anticuerpo, en donde la mayoría de las células B del ratón comprenden un gen de ADAM6 funcional. En varias modalidades, la mayoría de las células B del ratón además comprenden uno o más segmentos de gen \/l humano y uno o más segmentos de gen ?l humano corriente arriba de una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón se selecciona de un CK de ratón y un C de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende segmentos de gen V, D, y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógena que son incapaces de reclasificación para codificar una cadena pesada funcional de un anticuerpo. En una modalidad, el ratón comprende al menos uno y hasta 89 segmentos de gen V, al menos uno y hasta 13 segmentos de gen D, al menos uno y hasta cuatro segmentos de gen J, y una combinación de los mismos; en donde al menos uno y hasta 89 segmentos de gen V, al menos uno y hasta 13 segmentos de gen D, al menos uno y hasta cuatro segmentos de gen J son incapaces de reclasificación para codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, el ratón comprende un gen de ADAM6 funcional ubicado dentro de los segmentos de gen V, D, y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógena intacta. En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena pesada endógeno que incluye un sitio ADAM6 endógeno, en donde el sitio de cadena pesada endógeno comprende 89 segmentos de gen V, 13 segmentos de gen D, y cuatro segmentos de gen J, en donde los segmentos de gen de cadena pesada endógeno son incapaces de reclasificación para codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo y el sitio de ADAM6 codifica una proteína ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un segmento de gen V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde la mayoría de las células B del ratón comprenden una secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo. En una modalidad, la mayoría de las células B del ratón expresan una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable de lambda humana y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

En una modalidad, el ratón carece de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena seleccionados de dos o más segmentos de gen V, dos o más segmentos de gen D, dos o más segmentos de gen J, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionados de al menos uno y hasta 89 segmentos de gen V, al menos uno y hasta 13 segmentos de gen D, al menos uno y hasta cuatro segmentos de gen J, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de un fragmento de ADN genómico del cromosoma 12 que comprende alrededor de tres mega-bases del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, el ratón carece de todos los segmentos de gen V, D, y J de cadena pesada endógeno funcionales. En una modalidad específica, el ratón carece de 89 segmentos de gen VH , 13 segmentos de gen DH y cuatro segmentos de gen JH.

En un aspecto, se proporciona un ratón, en donde el ratón tiene un genoma en la línea germinal que comprende una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación al sitio de cadena pesada de inmunoglobulina comprende el reemplazo de una o más secuencias de región variable de inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón, y en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una modalidad preferida, las secuencias DH y JH y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias VH del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina son reemplazadas por secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón. En una modalidad más preferida, las secuencias DH, JH y todas las VH del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina son reemplazadas por secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón. Las secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón pueden estar no reclasificadas. En una modalidad preferida, las secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón comprende regiones completas DH y J H no reclasificadas y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias VH no reclasificadas de la especie de no ratón. En una modalidad más preferida, las secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón comprenden la región variable completa, incluyendo todas las regiones VH, DH, y J H de la especie de no ratón. La especie de no ratón puede ser Homo sapiens y las secuencias de región variable de inmunoglobulina de no ratón pueden ser secuencias humanas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina de dominio constante de dominio variable humano/no humano, en donde el ratón expresa una proteína ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo del mismo de un sitio diferente a un sitio de inmunoglobulina.

En una modalidad, la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se expresa en una célula B del ratón. En donde la célula B comprende una secuencia de inmunoglobulina reclasificada que comprende una secuencia variable humana y una secuencia constante no humana.

En una modalidad, la secuencia constante no humana es una secuencia de roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer una ratón macho infértil, que comprende presentar un alelo de ADAM6 endógeno de una células ES de donador no funcional (o es decir alelo), introducir la célula ES de donador en un embrión huésped, gestar el embrión huésped en una madre substituta, y permitir que la madre substituta de a luz a una progenie derivada toda o en parte de la célula ES de donador. En una modalidad, el método además comprende procrear la progenie para obtener un ratón macho infértil.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un ratón con una modificación genética de interés, en donde el ratón es infértil, el método comprende los pasos de: (a) hacer una modificación genética de interés en un genoma; (b) modificar el genoma para modificar genéticamente un alelo de ADAM6 endógeno, o presentar un alelo de ADAM6 endógeno no funcional; y, (c) emplear el genoma para hacer un ratón. En varias modalidades, el genoma es de una célula ES o se utiliza en un experimento de transferencia nuclear.

En un aspecto, se proporciona un ratón utilizando un vector de activación, construcción de nucleótido, o una célula como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona una progenie de una camada de un ratón como se describe aquí con un segundo ratón que es un ratón de tipo silvestre o genéticamente modificado.

En un aspecto, se proporciona un método para mantener una cepa de ratón, en donde la cepa de ratón comprende un reemplazo de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heteróloga. En una modalidad, la una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heteróloga son secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, la cepa de ratón comprende una eliminación de uno o más segmentos de gen VH, DH, y/o JH. En una modalidad, el ratón además comprende uno o más segmentos de gen VH h umano, uno o más segmentos de gen DH humano, y/o uno o más segmentos de gen JH. En una modalidad, el ratón comprende al menos 3, al menos 10, al menos 20, al meso 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos VH humano, al menos 27 segmentos de gen DH humano, y al menos seis segmentos de gen JH. En una modalidad específica, el ratón comprende al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos VH humano, los al menos 27 segmentos de gen DH humano, y los al menos seis segmentos de gen JH están operablemente enlazados a un gen de región constante. En una modalidad, el gen de región constante es un gen de región constante de ratón. En una modalidad, el gen de región constante comprende una secuencia de gen de región constante seleccionada de un CH1 , una bisagra, un CH2, un CH3, y/o un CH4 o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el metodo comprende generar un heterocigoto de ratón macho para el reemplazo de la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y procrear al ratón macho heterocigoto con un ratón hembra de tipo silvestre o un ratón hembra que es homocigota o heterocigota para la secuencia de cadena pesada humana. En una modalidad, el método comprende mantener la raza al procrear repetidamente machos heterocigotos con hembras que son de tipo silvestre u homocigotas o heterocigotas para la secuencia de cadena pesada humana.

En una modalidad, el método comprende obtener células de ratones macho o hembra homocigotos o heterocigotos para la secuencia de cadena pesada humana, y emplear esas células como células de donador o núcleos de las mismas como núcleos de donador, y utilizar las células o núcleos para hacer animales genéticamente modificados utilizando células huésped y/o gestando las células y/o núcleos en madres substitutas.

En una modalidad, solo ratones macho que son heterocigotos para el reemplazo en el sitio de cadena pesada son procreados a ratones hembra. En una modalidad específica, los ratones hembra son homocigotos, heterocigotos, o de tipo silvestre con respecto a un sitio de cadena pesada reemplazada.

En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de secuencias de cadena variable ligera l y/o k en un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena con secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heteróloga. En una modalidad, las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heteróloga son secuencias variables de cadena ligera de inmunoglobulina l y/o k humana.

En una modalidad, el ratón además comprende un transgen en un sitio distinto a un sitio de inmunoglobulina endógena, en donde el transgen comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera l y/o k heteróloga reclasificada o no reclasificada (por ejemplo, VL no reclasificada y JL no reclasificada, o VJ reclasificada) operablemente enlazada (para no reclasificada) o fusionada (para reclasificada) a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera l o k heteróloga es humana. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona de roedor, humano, y primate no humano. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona de ratón, rata, y hámster. En una modalidad, el transgen comprende un promotor de no inmunoglobulina que dirige la expresión de las secuencias de cadena ligera. En una modalidad específica, el promotor es un promotor transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el promotor en un promotor ROSA26.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un brazo de homología corriente arriba y un brazo de homología corriente abajo, en donde el brazo de homología corriente arriba comprende una secuencia que es identica o substancialmente idéntica a una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, el brazo de homología corriente abajo comprende una secuencia que es idéntica o substancialmente idénticas a una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana o de ratón, y dispuesta entre los brazos de homología corriente arriba y corriente abajo está una secuencia que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteínas ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, la secuencia que codifica el gen de ADAM6 de ratón está operablemente enlazada con un promotor de ratón con el cual el ADAM6 de ratón está enlazado en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona un vector de activación que comprende (a) una secuencia de nucleótido que es idéntica o substancialmente idéntica a una secuencia de nucleótido de segmento de gen de región variable humana; y, (b) una secuencia de nucleótido que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón.

En una modalidad, el vector de activación además comprende un promotor operablemente enlazado a la secuencia que codifica el ADAM6 de ratón. En una modalidad específica el promotor es un promotor de ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de nucleótido para modificar un sitio variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde la construcción comprende al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa de sitio específico y una secuencia que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón.

En un aspecto, se proporcionan celulas de ratón y embriones de ratón, incluyendo pero no limitado a células ES, células pluripotentes, y células pluripotentes inducidas, que comprenden modificaciones genéticas como se describe aquí. Se proporcionan células que son XX y células que son XY. También se proporcionan células que comprenden un núcleo que contiene una modificación como se describe aquí, por ejemplo, una modificación introducida en una célula por una inyección pronuclear. También se proporcionan células, embriones, y ratones que comprenden un gen de ADAM6 viralmente introducido, por ejemplo, células, embriones y ratones que comprenden una construcción de transducción que comprende un gen de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se proporcionan una célula de ratón genéticamente modificada, en donde la célula carece de un sitio de ADAM6 de ratón endógeno funcional, y la célula comprende una secuencia de nucleótido ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o su fragmento funcional. En una modalidad, la célula además comprende una modificación de una secuencia de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, la modificación de la secuencia de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena comprende una eliminación seleccionada de una eliminación de un segmento de gen VH de ratón, una eliminación de un segmento de gen DH de ratón, una eliminación de un segmento de gen JH de ratón, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el ratón comprende un reemplazo de una o más secuencias VH, DH, y/o JH de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana se selecciona de VH humana, VL humana, DH humana, JH humana, J L humana, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, la célula es una célula totipotente, una célula pluripotente, o una célula pluripotente inducida. En una modalidad específica, la célula es una célula ES de ratón.

En un aspecto, se proporciona una célula B de ratón, en donde la célula B de ratón comprende un gen de cadena pesada de inmunoglobulina reclasificada, en donde la célula B comprende, sobre un cromosoma de la célula B, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en ratón macho. En una modalidad, la célula B de ratón comprende dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de célula B) que es contigua con el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón reclasificada.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de célula B) que es distinta de la molécula de ácido nucleico que comprende el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón reclasificada.

En una modalidad, la célula B de ratón comprende una secuencia de gen variable de inmunoglobulina de no ratón reclasificada operablemente enlazada a u n gen de región constante de inmunoglobulina de ratón o humana, en donde la célula B comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón somática, que comprende un cromosoma que comprende un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina modificada, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma como el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina modificada. En una modalidad, el ácido nucleico está en un cromosoma diferente al del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina modificada. En una modalidad, la célula somática comprende una copia individual de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, la célula somática comprende al menos dos copias de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad específica, la célula somática es una célula B. En una modalidad específica, la célula es una célula germinal. En una modalidad específica, la celula es una célula madre.

En un aspecto, se proporciona una célula germinal de ratón, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento de la misma) en un cromosoma de la célula germinal, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento de la misma) está en una posición en el cromosoma que es diferente de una posición en un cromosoma de una célula germinal de ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un sitio de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, la secuencia de pacido nucleico está en el mismo cromosoma de la célula germinal como la de un sitio de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un cromosoma diferente de la célula germinal de la célula germinal que el sitio de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el sitio de inmunoglobulina de ratón comprende un reemplazo de al menos una secuencia de inmunoglobulina de ratón con al menos una secuencia de inmunoglobulina de no ratón. En una modalidad específica, al menos una secuencia de inmunoglobulina de no ratón es una secuencia de inmunoglobulina humana.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotente, pluripotente inducida, o totipotente derivada de un ratón como se describe aquí. En una modalidad específica, la célula es una célula madre embriónica de ratón (ES).

En un aspecto, se proporciona una célula o tejido derivado de un ratón como se describe aquí. En una modalidad, la célula o tejido se deriva de bazo, nodo linfático o médula ósea de un ratón como se describe aquí. En una modalidad, la célula es una célula B. En una modalidad, la célula es una célula madre embriónica. En una modalidad, la célula es una célula germinal.

En una modalidad, el tejido se selecciona de tejido conectivo, muscular, nervioso y epitelial. En una modalidad específica, el tejido es tejido reproductivo.

En una modalidad, la célula y/o tejido derivado de un ratón como se describe aquí se aísla para usarse en uno o más ensayos ex vivo. En varias modalidades, uno o más de los ensayos ex vivo incluyen mediciones de propiedades físicas, térmicas, eléctricas, mecánicas, u ópticas, una procedimiento quirúrgico, mediciones de interacciones de diferentes tipos de tejido, el desarrollo de téenicas de formación de imágenes, o una combinación de los mismos.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula o tejido derivado de un ratón como se describe aquí para hacer un anticuerpo. En un aspecto, se proporciona el uso de una célula o tejido derivado de un ratón como se describe aquí para hacer un hibridoma o cuadroma.

En un aspecto, una célula no humana comprende un cromosoma o fragmento del mismo de un animal no humano como se describe aquí. En una modalidad, la célula no humana comprende un núcleo de un animal no humano como se describe aquí. En una modalidad, la célula no humana comprende el cromosoma o fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

En un aspecto, se proporciona un núcleo derivado de un ratón como se describe aquí. En una modalidad, el núcleo es de una celula diploide que no es una célula B.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de nucleótido que codifica una región variable de inmunoglobulina hecha en un ratón como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo hecho en un ratón como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de nucleótido de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina que codifica una región variable de un anticuerpo hecho en un ratón como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab)2, scFv) hecho en un ratón como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un ratón genéticamente modificado, que comprende reemplazar uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina corriente arriba (con respecto a la transcripción de los segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina) de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón con uno o más segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y reemplazar uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina corriente abajo (con respecto a la transcripción de los segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina) del sitio de ADAM6 del ratón con uno o más segmentos de gen de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana que reemplazan uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina endógena corriente arriba de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos de gen V. En una modalidad, los segmentos de gen de inmunoglobulina humana que reemplazan uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina endógena corriente arriba de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos de gen V y D. En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana que reemplazan uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina endógena corriente abajo de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos de gen J. En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana que reemplazan uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina endógena corriente abajo de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos de gen D y J . En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de inmunoglobulina humana que reemplazan uno o más segmentos de gen de inmunoglobulina endógena corriente abajo de un sitio de ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos de gen V, D y J.

En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina corriente arriba y/o corriente abajo del gen de ADAM6 se reemplazan en una célula pluripotente, inducida pluripotente, o totipotente para formar una célula progenitora genéticamente modificada; la célula progenitora genéticamente modificada se introduce en un huésped; y, el huésped que comprende la célula progenitora genéticamente modificada es gestada para formar un ratón que comprende un genoma derivado de la célula progenitora genéticamente modificada. En una modalidad, el huésped es un embrión. En una modalidad específica, el huésped se selecciona de una pre-mórula de ratón (por ejemplo, etapa de célula 8 o 4), un embrión tetraploide, un agregado de células embriónicas, o un blastocito.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un ratón genéticamente modificado, que comprende reemplazar una secuencia de nucleótido de ratón que comprende un segmento de gen de inmunoglobulina de ratón y una secuencia de nucleótido de ADAM6 de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma) con una secuencia que comprende un segmento de gen de inmunoglobulina humana para formar un primer sitio quimérico, después insertar una secuencia que comprende una secuencia que codifica ADAM6 de ratón (o una secuencia que codifica un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma) en la secuencia que comprende el segmento de gen de inmunoglobulina humana para formar un segundo sitio quimérico.

En una modalidad, el segundo sitio quimérico comprende un segmento de gen variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el segundo sitio quimerico comprende un segmento de gen variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el segundo sitio comprende un segmento de gen VH humano o un segmento de gen VL humano operablemente enlazado a un segmento de gen DH humano y un segmento de gen JH humano. En una modalidad más específica, el segundo sitio está operablemente enlazado a un tercer sitio que comprende una secuencia CH1 humana, o un CH 1 humano y una secuencia de bisagra humana, fusionada con una secuencia CH2+CH3 de ratón.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón que comprende una secuencia de nucleótido ectópica que comprende un sitio de ADAM6 de ratón o secuencia para hacer un ratón macho fértil, en donde el uso comprende aparear el ratón que comprende la secuencia de nucleótido ectópica que comprende el sitio o secuencia de ADAM6 de ratón con un ratón que carece de un sitio o secuencia de ADAM6 de ratón endógeno, y obtener una progenie que es una hembra que es capaz de producir una progenie teniendo el sitio o secuencia de ADAM6 ectópica o que es un macho que comprende el sitio o secuencia de ADAM6 ectópica, y el macho exhibe una fertilidad que es aproximadamente igual a una fertilidad exhibida por un ratón macho de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer una secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer un Fab totalmente humano o un F(ab)2 totalmente humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer una línea de célula inmortalizada.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer un hibridoma o cuadroma.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer una biblioteca de fago que contiene regiones variables de cadena pesada humanas y regiones variables de cadena ligera humanas.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para generar una secuencia de región variable para hacer un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar a un ratón, como se describe aquí, con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito del ratón inmunizado de (a), (c) exponer al linfocito a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar a un linfocito que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de región variable del linfocito para generar así una secuencia de región variable.

En una modalidad, el linfocito se deriva del bazo del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de un nodo linfático del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de la médula ósea del ratón.

En una modalidad, el anticuerpo marcado es un anticuerpo conjugado a fluoróforo. En una modalidad, el uno o más anticuerpos conjugados a fluoróforo se seleccionan de una IgM, IgG, y/o una combinación de las mismas.

En una modalidad, el linfocito es una célula B.

En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada. En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena ligera. En una modalidad específica, la secuencia de región variable de cadena ligera es una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina K . En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para hacer un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar a un ratón como se describe aquí con un antígeno de interés, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado de (a), (c) exponer linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B para generar así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para hacer un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar a un ratón como se describe aquí con un antígeno de interes, (b) aislar uno o más nodos linfáticos del ratón inmunizado de (a), (c) exponer linfocitos B de uno o más nodos linfáticos a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B para generar así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para hacer un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar a un ratón como se describe aquí con un antígeno de interés, (b) aislar médula ósea del ratón inmunizado de (a), (c) exponer linfocitos B de la médula ósea a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B para generar así las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera K. En varias modalidades, uno o más de los anticuerpos marcados se seleccionan de una IgM, I g G , y/o una combinación de las mismas.

En varias modalidades, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y ligera k para hacer un anticuerpo humano, que además comprende fusionar las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera amplificadas a secuencias de región constante de cadena pesada y ligera, expresar las secuencias de cadena pesada y ligera fusionadas en una celula, y recuperar las secuencias de cadena pesada y ligera expresadas para generar así un anticuerpo humano.

En varias modalidades, las regiones constantes de cadena pesada humanas se seleccionan de I g M , I g D , IgA, I g E , e IgG. En varias modalidades específicas, la IgG se selecciona de una lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. En varias modalidades, la región constante de cadena pesada humana comprende una CH 1 , una bisagra, una CH2 , una CH3 , una CH4, o una combinación de las mismas. En varias modalidades, la región constante de cadena ligera es una región constante de inmunoglobulina K. En varias modalidades, la célula se selecciona de una célula HeLa, una célula DU 145, una célula Lncap, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3, una célula T47D, una célula THP-1 , una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3, una célula PC12, una célula retinal humana (por ejemplo, una célula PER.C6™), y una célula MC3T3. En una modalidad específica, la célula es una célula CHO.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo de roedor-humano quimérico inverso específico contra un antígeno de interés, que comprende los pasos de inmunizar a un ratón como se describe aquí con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón produciendo un anticuerpo de ratón-humano quimérico inverso específico contra el antígeno, cultivar al menos una célula que produce el anticuerpo de ratón-humano quimérico inverso específico contra el antígeno, y obtener dicho anticuerpo.

En una modalidad, el anticuerpo de ratón-humano quimérico inverso comprende un dominio variable de cadena pesada humano fusionado con un gen constante de cadena pesada de ratón o rata, y un dominio variable de cadena ligera humano fusionado con un gen constante de cadena ligera de rata o humano.

En una modalidad, el cultivo de al menos un anticuerpo de roedor-humano quimérico inverso específico contra el antígeno se realiza en al menos una célula de hibridoma generada de al menos una célula asilada del ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo totalmente humano específico contra un antígeno de interés, que comprende los pasos de inmunizar a un ratón como se describe aquí con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo de roedor-humano quimérico inverso específico contra el antígeno, generar al menos una célula que produce un anticuerpo totalmente humano derivado del anticuerpo de roedor-humano quimérico inverso específico contra el antígeno, y cultivar al menos una célula que produce el anticuerpo totalmente humano, y obtener dicho anticuerpo totalmente humano.

En varias modalidades, al menos una célula aislada del ratón que produce un anticuerpo de roedor-humano quimérico inverso específico contra el antígeno es un esplenocito o una célula B.

En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En varias modalidades, la inmunización con el antígeno de interés se realiza con proteína, ADN , una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para hacer una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina o fragmento de la misma. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se utiliza para hacer un anticuerpo humano o fragmento de unión de antígeno del mismo. En una modalidad, el ratón se utiliza para hacer una proteína de unión a antígeno seleccionada de un anticuerpo, un anticuerpo multi-específico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un scFvm un scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, V-NAR, VHH , VL, F(ab), F(ab)2, DVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable), SVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable individual), o un acoplador de célula B biespecífica (BiTE).

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe aquí para introducir una secuencia de ADAM6 ectópica en un ratón que carece de una secuencia de ADAM6 de ratón endógena funcional, en donde el uso comprende aparear un ratón como se describe aquí con el ratón que carece de la secuencia de ADAM6 de ratón endógena funcional.

En un aspecto, se proporciona el uso de un material g enetico de un ratón como se describe aquí para hacer un ratón que tenga una secuencia de ADAM6 ectópica. En una modalidad, el uso comprende la transferencia nuclear utilizando un núcleo de una célula de un ratón como se describe aquí. En una modalidad, el uso comprende clonar una célula de un ratón como se describe aquí para producir un animal derivado de la célula. En una modalidad, el uso comprende emplear un esperma o un huevo de un ratón como se describe aquí en un procedimiento para hacer un ratón que comprende la secuencia de ADAM6 ectópica.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un ratón macho fértil que comprende un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina modificada, que comprende fertilizar una primera célula madre de ratón que comprende una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con una segunda célula madre de ratón que comprende un gen de ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón hembra; formar una célula fertilizada; permitir que la célula fertilizada se desarrolle a un embrión; y, gestar el embrión en un substituto para obtener un ratón.

En una modalidad, la fertilización se logra al aparear un ratón macho y un ratón hembra. En una modalidad, el ratón hembra comprende el gen de ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo. En una modalidad, el ratón macho comprende el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo.

En un aspecto, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo del mismo o un fragmento funcional de la proteína de ADAM6 correspondiente para restaurar o mejorar la fertilidad de un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación reduce o elimina la función de ADAM6 endógeno.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma del ratón en una posición ectópica. En una modalidad, la secuencia de pacido nucleico se integra en el genoma del ratón en un sitio de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, el sitio de inmunoglobulina endógena es una sitio de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra al genoma del ratón en una posición diferente a un sitio de inmunoglobulina endógena.

En otro aspecto, se proporciona el uso del ratón como se describe aquí para la fabricación de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), o para la fabricación de una secuencia que codifica u na secuencia variable de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), para el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón genéticamente modificada, en donde la célula es incapaz de expresar una cadena pesada que comprende reclasificar segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, y la célula comprende un gen de ADAM6 funcional que codifica una proteína de ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la célula además comprende una inserción de segmentos de gen de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los segmentos de gen de inmunoglobulina humana son segmentos de gen de cadena pesada que están operativamente enlazados a regiones constantes de cadena pesada de ratón de manera que después de la reclasificación codifican una cadena pesada funcional de un anticuerpo que comprende una región variable humana.

Se proporcionan animales, embriones, células, tejidos genéticamente modificados, así como construcciones de ácido nucleico para modificar los animales no humanos, y métodos y composiciones para hacerlos y utilizarlos. Se proporcionan animales y células que generan regiones variables lambda (l) (humanas o no humanas) en el contexto de una cadena ligera kappa (K) , en donde los animales y células comprenden una modificación de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada que elimina o reduce la actividad de una proteína de ADAM6 u homólogo u ortólogo de la misma, en donde los animales además comprenden una modificación genética que restaura la actividad de ADAM6 como un todo o en parte (o la actividad del homólogo u ortólogo de la misma). Se proporcionan ratones que son fértiles y expresan un consanguíneo de dominio variable l humano con un dominio variable de cadena pesada humana, en donde el dominio variable l humano se expresa en el ratón contiguo con una región constante l o K, y en varias modalidades, la región variable l o k es una región constante endógena (por ejemplo, ratón o rata). También se proporcionan ratones y células que generan regiones variables l humanas en el contexto de una cadena ligera k o l, por ejemplo, de un sitio de cadena ligera de ratón endógeno. También se proporcionan métodos para hacer anticuerpos que comprenden regiones variables lambda. También se proporcionan métodos para seleccionar cadenas pesadas que expresan con regiones variables lambda consanguíneas.

Se proporcionan proteínas de unión de antígeno quiméricas y humanas (por ejemplo, anticuerpos), y ácidos nucleicos que las codifican, que comprenden regiones variables somáticamente mutadas, incluyendo anticuerpos que tienen cadenas ligeras que comprenden un dominio variable derivado de un segmento de gen nl humano y ?l humano fusionado a un dominio constante de cadena ligera de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de región variable l humana en una cadena ligera que comprende una región constante de ratón. En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de región variable l humana en una cadena ligera que comprende una región constante K.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa, a partir de un sitio de cadena ligera de ratón endógeno, una cadena ligera que comprende una secuencia de región variable l humana. En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un gen de cadena ligera reclasificado que comprende una secuencia variable l humana enlazada a una secuencia de región constante de ratón; en una modalidad, la secuencia de región constante de ratón es una secuencia constante l; en una modalidad, la secuencia de región constante de ratón es una secuencia constante K.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un segmento de gen variable de cadena ligera l humana (h /l) y un segmento de gen de unión l humano (h^). En una modalidad, los h /l y hJ no reclasificados están en un sitio de cadena ligera de ratón. En una modalidad, el hV/l no reclasificado y hJ no reclasificado están en un transgen y operablemente enlazados a una secuencia de región constante humana o de ratón. En una modalidad, el h /l no reclasificado y Ii?l no reclasificado están en un episoma. En una modalidad, el ratón es capaz de hacer una inmunoglobulina que comprende una cadena ligera que se deriva de una secuencia de h /l no reclasificado y una secuencia de hJ y una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera (CL) de ratón. También se proporcionan métodos y composiciones para hacer y utilizar ratones genéticamente modificados. Se proporcionan anticuerpos que comprenden (a) un dominio variable de cadena pesada humano (hVH) fusionado a una región constante de cadena pesada de ratón, y (b) VL humana fusionada a un dominio CL de ratón; incluyendo en donde uno o más de los dominios variables son somáticamente mutados, por ejemplo, durante la selección de anticuerpo o célula inmune en un ratón de la invención. En una modalidad, el hN/l no reclasificado y hJ no reclasificado están operablemente enlazados con una región constante k humana o de ratón (CK). En una modalidad, el h /l no reclasificado y Ii?l no reclasificado están operablemente enlazados con una región constante l humana o de ratón (Ol).

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende en su línea germinal, en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno, una secuencia de región variable de cadena ligera l humana, en donde la secuencia de región variable lambda humana se expresa en una cadena ligera que comprende una secuencia de gen de región constante de inmunoglobulina de ratón.

En una modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio l. En una modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio K.

En una modalidad, el ratón carece de una secuencia variable de cadena ligera endógena en el sitio de cadena ligera de ratón endógeno.

En una modalidad, todos o substancialmente todos los segmentos de gen de región variable de cadena ligera de ratón endógeno son reemplazadas con uno o más segmentos de gen de región variable l humanos.

En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera l humana comprende una secuencia JX humana. En una modalidad, la secuencia J humana se selecciona del grupo que consiste de JX1 , JX2, JX3, JX7, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera X humana comprende un fragmento del grupo A del sitio de cadena ligera humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo A del sitio de cadena ligera l humana se extiende de hVX3-27 a hVX3-1.

En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera X humana comprende un fragmento del grupo B del sitio de cadena ligera humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo B del sitio de cadena ligera l humana se extiende de hVX5-52 a hVX1 -40.

En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera l humana comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera X h umana comprende al menos un segmento de gen del grupo A y al menos un segmento de gen del grupo B.

En una modalidad, más del 10% del repertorio de la cadena ligera natural del ratón se deriva de al menos dos segmentos de gen hVX seleccionados de 2-8, 2-23, 1 -40, 5-45, y 9-49. En una modalidad, más del 20% del repertorio de la cadena ligera natural del ratón se deriva de al menos tres segmentos de gen h l seleccionados de 2-8, 2-23, 1 -40, 5-45, y 9-49. En una modalidad, más del 30% del repertorio de la cadena ligera natural del ratón se deriva de al menos cuatro segmentos de gen h /l s eleccionados de 2-8, 2-23, 1 -40, 5-45, y 9-49.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia variable l humana fusionada con una región constante de ratón, en donde el ratón exhibe una relación de uso k a uso l de aproximadamente 1 : 1 .

En una modalidad, la cadena ligera de inmunoglobulina se expresa a partir de un sitio de cadena ligera de ratón endógeno.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera l (\/l) y al menos una secuencia J (J), contigua con una secuencia de región constante de cadena ligera de ratón.

En una modalidad, el ratón carece de un segmento de gen VK de ratón y/o JK de ratón funcional.

En una modalidad, la \/l es \/l humana (h /l), y la J es ?l humana (Ii?l). En una modalidad, la h /l y la hJ son segmentos de gen no reclasificados.

En una modalidad, el ratón comprende una pluralidad de segmentos de gen hV/l no reclasificados y al menos un segmento de gen Ii?l. En una modalidad específica, la pluralidad de segmentos de gen h /l no reclasificados son al menos 12 segmentos de gen, al menos 28 segmentos de gen, o al menos 40 segmentos de gen.

En una modalidad, al menos un segmento de gen h J l se selecciona del grupo que consiste de ?l1 , ?l2, ?l3, ?l7, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno se elimina todo o en parte.

En una modalidad, la secuencia de región constante de cadena ligera k de ratón está en un sitio de cadena ligera k de ratón.

En una modalidad, de aproximadamente 10% a aproximadamente 45% de las células B del ratón expresan un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera l humano (N/l) y un dominio constante de cadena ligera k de ratón (CK) .

En una modalidad, el dominio variable l h umano se deriva de una secuencia Iinl/???l reclasificada seleccionada del grupo que consiste de 3-1 /1 , 3-1 /7, 4-3/1 , 4-3/7, 2-8/1 , 3-9/1 , 3-10/1 , 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1 , 3-19/1 , 2-23/1 , 3-25/1 , 1 -40/1 , 1 -40/2, 1 -40/3, 1 -40/7, 7-43/1 , 7-43/3, 1 -44/1 , 1 -44/7, 5-45/1 , 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1 , 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1 , 9-49/2, 9-49/7 y 1 -51 /1 .

En una modalidad, el ratón además comprende una región intergénica VK-JK humana a partir de un sitio de cadena ligera k humana, en donde la región intergénica VK-JK humana es contigua con la secuencia nl y la secuencia J. En una modalidad específica, la región intergénica VK-JK humana está colocada entre la secuencia nl y la secuencia J.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende (a) por lo menos de 12 a por lo menos 40 segmentos de gen de región variable de cadena ligera l humanos no reclasificados y al menos un segmento de gen ?l humano en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno; (b) una secuencia intergenica VK-JK humana ubicada entre los al menos 12 a al menos 40 segmentos de gen de región variable de cadena ligera humanos y al menos una secuencia l humana; en donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende un dominio /l humano y un domino CK de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia variable l y una secuencia constante K.

En una modalidad, el ratón exhibe una relación de uso k a uso l de aproximadamente 1 : 1 .

En una modalidad, una población de células B inmaduras obtenidas de médula ósea del ratón exhibe una relación de uso k a uso l de aproximadamente 1 : 1 .

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un segmento de gen nl y ?l de inmunoglobulina no reclasificado operablemente enlazado a un sitio de cadena ligera de ratón que comprende un gen CL de ratón.

En una modalidad, los segmentos de gen \/l y/o ?l son segmentos de gen humanos. En una modalidad, los segmentos de gen /l y/o ?l son segmentos de gen de ratón y CL es un CK de ratón.

En una modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio de cadena ligera K. En una modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio de cadena ligera l.

En una modalidad, los segmentos de gen /l y ?l no reclasificados están en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno.

En una modalidad, los segmentos de gen \/X y ?l de inmunoglobulina no reclasificados están en un transgen.

En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen V, D, y/o J de cadena pesada con uno o más segmentos de gen V, D, y/o J humanos en un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento de gen nl y J de inmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento de gen variable de cadena ligera l de inmunoglobulina humana no reclasificado (nl) y un segmento de gen de unión l (J ) en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno que comprende un gen CX de ratón.

En una modalidad, el sitio de gen variable de cadena ligera (el “sitio VL”) comprende al menos un segmento de gen VX humano (h /l). En una modalidad, el sitio Vu comprende al menos un segmento de gen ?l humano (h^). En otra modalidad, el sitio VL comprende hasta cuatro segmentos de gen Ii?l. En una modalidad, el sitio V _ comprende una secuencia contigua que comprende una secuencia genómica l humana y k humana.

En una modalidad, el sitio de gen variable de cadena ligera k (el “sitio K”) comprende al menos un segmento de gen V l humano (h /l). En una modalidad, el sitio k comprende al menos un segmento de gen ?l humano (Ii?l). En una modalidad, el sitio k comprende hasta cuatro segmentos de gen hJ . En una modalidad, el sitio k comprende al menos un h /l y al menos un hJ , y carece o substancialmente carece de un segmento de gen de región VK funcional y carece o substancialmente carece de un segmento de gen de región JK funcional. En una modalidad, el ratón no comprende ningún segmento de gen de región VK funcional. En una modalidad, el ratón no comprende ningún segmento de gen de región JK funcional.

En una modalidad, el sitio de gen variable de cadena ligera l (el “sitio l”) comprende al menos un segmento de gen hV . En una modalidad, el sitio l comprende al menos un segmento de gen ?l humano (hJ ). En otra modalidad, el sitio l comprende hasta cuatro segmentos de gen Ii?l.

En una modalidad, el sitio VL comprende una pluralidad de hV s. En una modalidad, la pluralidad de hV s se selecciona con el fin de dar como resultado una expresión de un repertorio de región variable de cadena ligera l que refleja aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, o aproximadamente 90% o más del uso de VX observador en un ser humano. En una modalidad, el sitio VL comprende segmentos de gen hVX 1 -40, 1.44, 2-8, 2-14, 3-21 , y una combinación de los mismos.

En una modalidad, los hVXs incluyen 3-1 , 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-1 1 , y 3-12. En una modalidad específica, el sitio VL comprende una secuencia contigua del sitio de cadena ligera l humana que se expande de VX3-12 a VX3-1 . En una modalidad, el sitio VL comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 o 12 hVXs. En una modalidad específica, los hVXs incluyen 3-1 , 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-1 1 , y 3-12. En una modalidad especifica, el sitio VL comprende una secuencia contigua del sitio l humano que se expande de VX3-12 a VX3-1 . En una modalidad, el sitio VL está en un sitio k endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en un sitio k endógeno y el sitio de cadena ligera l endógeno se elimina en parte o completamente. En una modalidad, el sitio VL está en un sitio k endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en un sitio l endógeno y el sitio k endógeno se elimina en parte o completamente.

En una modalidad, el sitio VL comprende de 13 a 28 hVXs. en una modalidad específica, los hVXs incluyen 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21 , 3-22, 2-23, 3-25, y 3-27. En una modalidad específica, el sitio k comprende una secuencia contigua del sitio l humano que se expande de VX3-17 a VX3-1 . En una modalidad, el sitio VL está en un sitio k endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en un sitio k endógeno y el sitio de cadena ligera l endógeno se elimina en parte o completamente. En otra modalidad, el sitio VL está en un sitio l endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en un sitio l endógeno y el sitio k endógeno se elimina en parte o completamente.

En una modalidad el sitio VL comprende de 29 a 40 hV s. En una modalidad específica. El sitio k comprende una secuencia contigua del sitio l que se expande desde nl3-19 a nl3-1 , y una secuencia contigua del sitio l humano que se expande desde V 5-52 a V 1 -40. En una modalidad específica, toda o substancialmente toda la secuencia entre ?i\/l1 -40 y ?inl3-29 en el ratón genéticamente modificado consiste esencialmente de una secuencia l humana de aproximadamente 959 bp encontrada en naturaleza (por ejemplo, en la población humana) corriente abajo del segmento de gen h\ 1 -40 (corriente abajo de la porción no traducida 3’), un sitio de enzima de restricción (por ejemplo, Pl-Scel), seguido por una secuencia l humana de aproximadamente 3,431 bp corriente arriba del segmento de gen Ii\/l3-29 encontrado en naturaleza. En una modalidad, el sitio VL está en el sitio k de ratón endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en el sitio k de ratón endógeno y el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno se elimina en parte o completamente. En otra modalidad, el sitio VL e stá en el sitio l d e ratón endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en el sitio l de ratón endógeno y el sitio k de ratón endógeno se elimina en parte o completamente.

En una modalidad, el sitio VL comprende al menos un h . En una modalidad, el sitio VL comprende una pluralidad de Ii?lb. en una modalidad, el sitio VL comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, o 7 hJ . En una modalidad específica, el sitio VL comprende cuatro hJ . En una modalidad específica, los cuatro hJ s son h J l 1 , Ii 1l2, ??l3, y Ii?l7. En una modalidad, el sitio VL es un sitio K. En una modalidad específica, el sitio V _ está en el sitio k endógeno y el sitio de cadena ligera l endógena se elimina en parte o completamente. En una modalidad, el sitio VL comprende un h J l . En una modalidad específica, el h J l es hJ 1 . En una modalidad, el sitio VL está en el sitio k endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en el sitio k endógeno y el sitio de cadena ligera l endógena se elimina en parte o completamente. En otra modalidad, el sitio VL está en el sitio l endógeno. En una modalidad específica, el sitio VL está en el sitio l endógeno y el sitio k endógeno se elimina en parte o completamente.

En una modalidad, el sitio VL c omprende al menos un h nl , al menos un Ii?l, y un gen CK de ratón. En una modalidad, el sitio VL comprende al menos un h /l, al menos un hJ , y un gen CK de ratón. En una modalidad específica, el gen CK de ratón es C 2. En una modalidad específica, el gen Cl de ratón es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% identico al CX2 de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo en el sitio de ratón endógeno de los segmentos de gen VK de ratón endógeno con uno o más segmentos de gen h /l, en donde los segmentos de gen hN/l están operablemente enlazados a un gen de región CK de ratón endógeno, de manera que el ratón reclasifica los segmentos de gen nl humano y expresa una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio \/l humano y un CK de ratón. En una modalidad, un 90-100% de segmentos de gen VK de ratón reclasificados son reemplazados con al menos un segmento de gen Iinl no reclasificado. En una modalidad específica, todos o substancialmente todos lo segmentos de gen VK d e ratón endógeno son reemplazados con al menos un segmento de gen hV no reclasificado. En una modalidad, el reemplazo es con al menos 12, al menos 28, o al menos 40 segmentos de gen Iinl n o reclasificados. En una modalidad, el reemplazo es con al menos 7, segmentos de gen hV no reclasificados funcionales, al menos 16 segmentos de gen hV no reclasificados funcionales, o al menos 27 segmentos de gen hV no reclasificados funcionales. En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos los segmentos de gen JK de ratón con al menos un segmento de gen Ii?l no reclasificado. En una modalidad, al menos el segmento de gen ?i?l no reclasificado se selecciona de ?l1 , ?l2, J 3, ?l4, *R5, ld, ?l7, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el uno o más segmentos de gen hJA se selecciona de un segmento de gen h l 3-1 , 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-1 1 , 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21 , 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1 -40, 7-43, 1 -44, 5-45, 7-46, 1 -47, 5-48, 9-49, 1 -50, 1 -51 , 5-52, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el al menos un segmento de gen hJ no reclasificado se selecciona de ?l1 , ?l2, ?l3, ?l7, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de segmentos de gen /l de ratón endógeno en el sitio l de ratón endógeno con uno o más segmentos de gen VA humano en el sitio l de ratón endógeno, en donde los segmentos de gen hVA están operablemente enlazados a un gen de región CA de ratón, de manera que el ratón reclasifica los segmentos de gen hVA y expresa una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio hVA y un CA de ratón. En una modalidad específica, el gen CA de ratón es CX2. En una modalidad específica, el gen CX de ratón es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idénticos a CA2 de ratón. En una modalidad, el 90- 100% de segmentos de gen N/l, de ratón no reclasificados son reemplazados con al menos un segmento de gen hVA no reclasificado. En una modalidad específica, todos o substancialmente todos lo segmentos de gen VA de ratón endógeno son reemplazados con al menos un segmento de gen hVA no reclasificado. En una modalidad, el reemplazo es con al menos 12, al menos 28, o al menos 40 segmentos de gen hVA n o reclasificados.

En una modalidad, el reemplazo con al menos 7 segmentos de gen hV no reclasificados funcionales, al menos 16 segmentos de gen hV no reclasificados funcionales, o al menos 27 segmentos de gen hN/l no reclasificados funcionales. En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos los segmentos de gen ?l de ratón con al menos un segmento de gen ??l no reclasificado. En una modalidad, el al menos un segmento de gen hJ no reclasificado se selecciona de J l 1 , ?l2, J 3, ?l4, ?l5, ?l6, J l7 , y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el uno o más segmentos de gen hV se selecciona de un segmento de gen hV 3-1 , 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-1 1 , 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21 , 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1 -40, 7-43, 1 -44, 5-45, 7-46, 1 -47, 5-48, 9-49, 1 -50, 1 -51 , 5-52, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, al menos un segmento de gen hN/l no reclasificado se selecciona de ?l1 , J 2, ?l3, ?l7, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, se proporciona un ratón geneticamente modificado que comprende una secuencia de región intergénica VK-JK humana ubicada en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno.

En una modalidad, la secuencia de región intergénica VK-JK humana está en un sitio de cadena ligera k endógena de un ratón que comprende un segmento de gen hN/l y hJ , y la secuencia de región intergénica VK-JK humana está dispuesta entre los segmentos de gen hV y Ii?l. En una modalidad específica, los segmentos de gen hV y hJ son capaces de recombinación para formar el dominio variable de cadena ligera l humana funcional en el ratón.

En una modalidad, se proporciona un ratón que comprende una pluralidad de h /l y uno o más hJ , y la secuencia de región intergénica VK-JK humana está dispuesta, con respecto a la transcripción, corriente abajo de la secuencia h /l próxima o más hacia 3’ y corriente arriba o 5’ de la primera secuencia Ii?l.

En una modalidad, la región intergénica VK-JK humana es una región ubicada aproximadamente 130 bp corriente abajo o 3’ de un segmento de gen VK4-1 humano, aproximadamente 130 bp corriente abajo de la región no traducida 3’ del segmento de gen VK4- 1 humano, y se expande a aproximadamente 600 bp corriente arriba o 5’ de un segmento de gen JK 1 humano. En una modalidad específica, la región intergénica VK-JK humana es de aproximadamente 22.8 kb en tamaño. En una modalidad, la región intergénica VK-JK es aproximadamente 90% o más, 91 % o más, 92% o más, 93% o más, 94% o más, o aproximadamente 95% o más idéntica a una región intergénica VK-JK humana que se extiende desde el extremo de la región 3’ no traducida de un segmento de gen VK4- 1 humano a aproximadamente 600 bp corriente arriba de un segmento de gen JK 1 humano. En una modalidad, la región intergénica VK-JK comprende SEC I D NO: 158. En una modalidad, la región intergénica VK-JK comprende un fragmento funcional de SEC I D NO: 158. En una modalidad específica, la región intergénica VK-JK es SEC ID NO: 158.

En un aspecto, se proporcionan un animal no humano, una célula no humana (por ejemplo, una célula ES o una célula pluripotente), un embrión no humano, o un tejido no humano que comprenden la secuencia de región intergénica VK-JK humana citada, en donde la secuencia de región intergénica es ectópica. En una modalidad específica, la secuencia ectópica se coloca en un sitio de inmunoglobulina no humana endógena humanizada. En una modalidad, el animal no humano se selecciona de un ratón, rata, hámster, cabra, vaca, oveja, y un primate no humano.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de región intergénica VK-JK humana citada. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende brazos de activación para activa la secuencia de región intergénica VK-JK humana hacia un sitio de cadena ligera de ratón. En una modalidad específica, el sitio de cadena ligera de ratón es un sitio K. En una modalidad específica, los brazos de activación activan la región intergénica VK-JK humana hacia un sitio k de ratón endógeno modificado, en donde la activación es a una posición entre una secuencia hV y una secuencia hJ .

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende no más de dos alelos de cadena ligera, en donde los alelos de cadena ligera comprenden (a) un segmento de gen nl y Jl humano de inmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno que comprende un gen CL de ratón; y, (b) un segmento de gen VL y J L de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera de ratón endógeno que comprende un gen CL de ratón.

En una modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio K. En otra modalidad, el sitio de cadena ligera de ratón endógeno es un sitio l.

En una modalidad, uno o más de los dos alelos de cadena ligera se selecciona de un alelo k y un alelo l, dos alelos K , y dos alelos l. En una modalidad específica, uno de los alelos de cadena ligera es un alelo l que comprende un gen Ol2.

En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena ligera de ¡nmunoglobulina funcional y un sitio de cadena ligera no funcional, en donde el sitio de cadena ligera funcional comprende un segmento de gen VX y ?l humano de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera k d e ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena ligera de ¡nmunoglobulina funcional y un sitio de cadena ligera no funcional, en donde el sitio de cadena ligera funcional comprende un segmento de gen nl y ?l humano de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno que comprende un gen Ol de ratón. En una modalidad, el gen CX es CX2. En una modalidad específica, el gen CX de ratón es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idéntico al CX2 de ratón.

En una modalidad, el ratón además comprende al menos un alelo de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, el al menos un alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende un segmento de gen VH humano, un segmento de gen DH humano, y un segmento de gen JH humano en un sitio de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada humano que expresa una cadena pesada humana/ratón. En una modalidad, el ratón comprende dos alelos de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón expresa una cadena pesada humana/ratón.

En una modalidad, el ratón comprende un primer alelo de cadena ligera que comprende un hVic no reclasificado y un hJx no reclasificado, en un sitio k de ratón endógeno que comprende un gen CK endógeno; y un segundo alelo de cadena ligera que comprende un h \/l no reclasificado y un Ii?l no reclasificado, en un sitio k de ratón endógeno que comprende un gen CK endógeno. En una modalidad específica, los primero y segundo alelos de cadena ligera son los únicos alelos de cadena ligera funcional del ratón genéticamente modificado. En una modalidad específica, el ratón comprende un sitio l no funcional. En una modalidad, el ratón genéticamente modificado no expresa una cadena ligera que comprende una región constante l.

En una modalidad, el ratón comprende un primer alelo de cadena ligera que comprende un hVx no reclasificado y un hJ no reclasificado, en un sitio k de ratón endógeno que comprende un gen CK endógeno; y un segundo alelo de cadena ligera que comprende un h \/l no reclasificado y un hJ no reclasificado, en un sitio l de ratón endógeno que comprende un gen ?l endógeno. En una modalidad específica, los primero y segundo alelos de cadena ligera son los únicos alelos de cadena ligera funcionales del ratón genéticamente modificado. En una modalidad, el gen CX endógeno es CX2. En una modalidad específica, el gen CX de ratón es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idénticos al CX2 de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende seis alelos de ¡nmunoglobulina, en donde el primer alelo comprende un segmento de gen VX y JX de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón, el segundo comprende un segmento de gen VK y JK de ¡nmunoglobulina reclasificado en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón, el tercero comprende un segmento de gen VX y JX de ¡nmunoglobulina reclasificado en un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno que comprende un gen CX de ratón, el cuarto y el qumto, cada uno independientemente comprende un segmento de gen DH y J H no reclasificado en un sitio de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada de ratón, y el sexto comprende ya sea (a) un segmento de gen VX y JX de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera X de ratón endógeno que comprende un gen CX de ratón, (b) un sitio X que es no funcional, o (c) una eliminación en todo o en parte del sitio X.

En una modalidad, el primer alelo comprende un hVX y hJX no reclasificado. En una modalidad, el segundo alelo comprende un hVic y hÜK no reclasificado. En una modalidad, el tercer alelo comprende un h /l y h J l no reclasificado. En una modalidad, el cuarto y qumto cada uno independientemente comprende un hVH y hDH y hJH. En una modalidad, el sexto alelo comprende un sitio l de ratón endógeno que se elimina todo o en parte.

En una modalidad, el ratón comprende seis alelos de ¡nmunoglobulina, en donde el primer alelo comprende un segmento de gen nl y ?l de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno que comprende un gen C de ratón, el segundo comprende un segmento de gen \/l y ?l de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno que comprende un gen Ol de ratón, el tercero comprende un segmento de gen VK y JK de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera k d e ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón, el cuarto y quinto cada uno independientemente comprende un segmento de gen VH y DH y J H no reclasificado en un sitio de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un gen de cadena pesada de ratón, y el sexto comprende ya sea (a) un segmento de gen VK y JK de ¡nmunoglobulina no reclasificado en un sitio de cadena ligera k d e ratón endógeno que comprende un gen CK de ratón, (b) un sitio k que es no funcional, o (c) una eliminación de uno o más elementos del sitio K.

En una modalidad, el primer alelo comprende un segmento de gen hV/l y Ii?l no reclasificado. En una modalidad, el segundo alelo comprende un segmento de gen hX/l y h J l no reclasificado. En una modalidad, el tercer alelo comprende un segmento de gen hVic y hJic no reclasificado. En una modalidad, el cuarto y qumto cada uno independientemente comprende un segmento de gen hVH y hDH y hJH no reclasificado. En una modalidad, el sexto alelo comprende un sito k de ratón endógeno que está funcionalmente silenciado.

En una modalidad, el ratón genéticamente modificado comprende una célula B que comprende un gen de anticuerpo reclasificado que comprende un dominio hVA reclasificado operablemente enlazado a un dominio CL de ratón. En una modalidad, el dominio CL de ratón se selecciona de un dominio CK de ratón y uno de CX de ratón. En una modalidad específica, el domino Ol de ratón se deriva de un gen CX2. En una modalidad específica, el domino Ol de ratón se deriva de un dominio CX que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idéntico al CX2 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que expresa una región \/l en un CL que es un CK. En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que expresa una región h /l en un CL seleccionado de un CK humano, un C humano, o un CK de ratón. En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que expresa una región h VA. en un CK de ratón.

En una modalidad, aproximadamente 10-50% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 9-28% expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h /l fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad específica , aproximadamente 23-24% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 9-1 1 % expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio hV fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad específica , aproximadamente 19-31 % de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 9-17% expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h\ fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad específica , aproximadamente 21 -38% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 24-27% expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio hV fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad específica , aproximadamente 10-14% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 9-13% expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h /l fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad específica, aproximadamente 31 -48% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 15-21 % expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h /l fusionado a un dominio CK de ratón. En una modalidad específica, aproximadamente 30-38% de los esplenocitos del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 33-48% expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h /l fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad, aproximadamente 52-70% de la médula ósea del ratón son células B (es decir, CD 19-positivo), o en donde aproximadamente 31 -47% de las células B inmaduras (es decir, CD1 9-positivo/B220-positivo intermedio/IgM-positivo) expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio h \/l fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad, aproximadamente 60% de la médula ósea del ratón son células B (es decir, CD19-positivo), o en donde aproximadamente 38.3% de las células B inmaduras (es decir, CD19-positivo/B220-positivo intermedio/IgM-positivo) expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio hV fusionado a un dominio CK de ratón.

En una modalidad, el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable derivado de un segmento de gen V humano y J humano, y un dominio constante derivado de un gen de región constante de ratón. En una modalidad, el gen de región constante de ratón es un gen C . En una modalidad específica, la región C es CX2. En una modalidad específica, el gen CA de ratón se deriva de un gen CA que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% identico a CA2 de ratón. En una modalidad específica, el anticuerpo además comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable derivado de un segmento de gen V humano, D humano y J humano, y un dominio constante de cadena pesada derivado de un gen de región constante de cadena pesada de ratón. En una modalidad, el gen de región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia de bisagra-CH2-CH3 de un dominio constante de cadena pesada. En otra modalidad, el gen de región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia de CH 1 -bisagra-CH2-CH3 de un dominio constante de cadena pesada. En otra modalidad, el gen de región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia de CH 1 -CH2-CH3-CH4 de un dominio constante de cadena pesada. En otra modalidad, el gen de región constante de cadena pesada de ratón comprende una secuencia de CH2-CH3-CH4 de un dominio constante de cadena pesada.

En una modalidad, el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia VA-JA humana reclasificada y una secuencia CK de ratón. En una modalidad, la secuencia VA-JA humana reclasificada se deriva de una reclasificación de segmentos de gen h VA, seleccionados de un segmento de gen 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-14, 3-19, 2-23, 3-25, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 9-49, y 1-51. En una modalidad, la secuencia N/l-?l humana reclasificada se deriva de una reclasificación de segmentos de gen hN/l seleccionados de un segmento de gen l1, ?l2, ?l3, y ?l7.

En una modalidad, el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera l de inmunoglobulina reclasificada que comprende una secuencia nl/?l humana seleccionada de 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 y 1-51/1. En una modalidad específica, la célula B expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana fusionado con un dominio constante de cadena pesada de ratón, y un dominio variable de cadena ligera l de inmunoglobulina humana fusionada con un dominio constante de cadena ligera k de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa un anticuerpo que comprende (a) una cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada derivado de un segmento de gen de región variable de cadena pesada humano no reclasificado, en donde el dominio de cadena pesada está fusionado a una región constante (CH) de cadena pesada de ratón; y, (b) una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera derivado de un h VA y un hJX no reclasificados, en donde el dominio variable de cadena ligera está fusionado a una región CL de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende (i) un sitio de cadena pesada que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen V, D y J de ratón endógeno funcionales por todos o substancialmente todos los segmentos de gen V, D, y J humanos funcionales, un gen CH de ratón, (ii) un primer sitio de cadena ligera k que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VK y JK de ratón endógeno funcionales por todos, substancialmente todos, o una pluralidad de, segmentos de gen hVX y hJX funcionales, y un gen c | de ratón, (iii) un segundo sitio de cadena ligera k que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VK y JK de ratón endógeno funcionales con todos, substancialmente todos, o una pluralidad de segmentos de gen hVK y hÜK funcionales, y un gen CK de ratón. En una modalidad, el ratón no expresa un anticuerpo que comprende una región CX. En una modalidad, el ratón comprende una eliminación de un gen CX y/o un segmento de gen VX y/o JX. En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena ligera X no funcional. En una modalidad específica, el sitio de cadena ligera X se elimina todo o en parte.

En una modalidad, el ratón comprende (i) un sitio de cadena pesada que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen V, D y J de ratón endógeno funcionales por todos o substancialmente todos los segmentos de gen V, D y J humanos funcionales, un gen CH de ratón, (ii) un primer sitio de cadena ligera l que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen VX y JX de ratón endógeno funcionales por todos, substancialmente todos, o una pluralidad de segmentos de gen hN/l y hJ funcionales, y un gen CX de ratón, (iii) un segundo sitio de cadena ligera l que comprende un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen nl y ?l de ratón endógeno funcionales por todos, substancialmente todos, o una pluralidad de segmentos de gen hV/l y Ii?l funcionales, y un gen Ol de ratón. En una modalidad específica, el gen CX de ratón es CX2. En una modalidad específica, el gen Ol de ratón se deriva de un gen Ol que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 98% idéntico a CX2 de ratón.

En una modalidad, el ratón comprende la eliminación de un gen CK y/o un segmento de gen VK y/o JK. En una modalidad, el ratón comprende un sitio de cadena ligera k no funcional.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que expresa un anticuerpo, en donde más del 10%, más del 15%, más del 20%, más del 25%, más del 30%, más del 35%, más del 40%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, o más del 90% del anticuerpo IgG total producido por el ratón comprende un dominio variable derivado de l, y en donde el ratón expresa anticuerpos que comprenden un dominio variable derivado de k fusionado con una región CK de ratón. En modalidades específicas, aproximadamente 15-40%, 20-40%, 25-40%, 30-40%, o 35-40% del anticuerpo total producido por el ratón comprende un dominio variable derivado de l.

En una modalidad, el dominio variable derivado de l se deriva de un hX/l y un ??l. En una modalidad, el dominio variable derivado de l está en una cadena ligera que comprende una región CK de ratón. En una modalidad específica, la región variable derivada de l está en una cadena ligera que comprende una región CX de ratón. En otra modalidad específica, la región Cí e s una región CX2. En una modalidad, el dominio variable derivado de k se deriva de un hN/k y un hÜK, y en una modalidad específica, está en una cadena ligera que comprende una región CK de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN asilada que comprende un brazo de homología corriente arriba y un brazo de homología corriente abajo, en donde los brazos de homología corriente arriba y corriente abajo activan la construcción a un sitio k de ratón, y la construcción comprende un segmento h /l funcional no reclasificado y un segmento Ii?l funcional no reclasificado, y una secuencia de selección o de marcador.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende, de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar una secuencia l de ratón corriente arriba de MX2 de ratón, un casete de selección flanqueado 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa, y un brazo de activación para activar una secuencia l de ratón 3’ de ?l2 de ratón. En una modalidad, el casete de selección es un casete Frt’ed Hyg-TK. En una modalidad, el brazo de activación 3’ comprende C 2, ?l4, Ol4 de ratón, y un mejorador 2.4 de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende, de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activa el sitio 5’ l de ratón con respecto a V 'l , un casete de selección flanqueado 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa, y un brazo de activación 3’ para activar una secuencia l de ratón 3’ con respecto al Ol1 de ratón. En una modalidad, el casete de selección es un casete de neomicina en rebanada. En una modalidad, el brazo de activación 3’ comprende el mejorador l 3’ de ratón y mejorador 3.1 l 3’ de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3' con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito l 5’ de ratón con respecto a V 2, un casete de selección flanqueado con 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa, y un brazo de activación 3’ para activar una secuencia 3’ l de ratón con respecto a ?l2 de ratón y 5’ con respecto a Ol2 de ratón. En una modalidad, el casete de selección es un casete Frt’ed higromicina-TK. En una modalidad, el brazo de activación 3’ comprende los segmentos de gen Ol2-?l4-Ol4 de ratón y mejorador 2.4 l de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito l 5’ de ratón con respecto a \/l2, un casete de selección flanqueado con 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa, un fragmento genómico humano que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de hV 3-12 corriente abajo al extremo de hJ 1 , y un brazo de activación 3’ para activar una secuencia 3’ l de ratón con respecto a ?l2 de ratón. En una modalidad, el casete de selección es un casete Frt’ed neomicina. En una modalidad, el brazo de activación 3’ comprende los segmentos de gen (3l2-?l4-Ol4 de ratón y un mejorador 2.4 l de ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de h\ 3-12 corriente abajo al extremo de hJ 1.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito l 5’ de ratón con respecto a Ml2, un casete de selección flanqueado con 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa y un fragmento genómico humano que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de Iinl3-27 corriente abajo al extremo de hV 2-8. En una modalidad, el casete de selección en un casete Frt’ed higromicina. En una modalidad, el fragmento genómico humano comprende un brazo de activación 3’. En una modalidad específica, el brazo de activación 3’ comprende aproximadamente 53 kb del sitio de cadena ligera l humano de h\ 3-12 corriente abajo al extremo de hV 2-8.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de h /l 3-27 corriente abajo al extremo de h\ 3-12.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito l 5’ de ratón con respecto a VX2, un casete de selección flanqueado con 5’ y 3’ con sitios de reconocimiento de recombinasa, un primer fragmento genómico humano que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de hV 5-52 corriente abajo al extremo de hVX1 -40, un sitio de enzima de restricción, y un segundo fragmento genómico humano que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de Iinl3-29 corriente abajo al extremo de hV 82K. En una modalidad, el casete de selección es un casete Frt'ed neomicina. En una modalidad, el sitio de enzima de restricción es un sitio para una endonucleasa de alojamiento. En una modalidad específica, la endonucleasa de alojamiento es Pl-Scel. En una modalidad, el segundo fragmento genómico humano es un brazo de activación 3’. En una modalidad específica, el brazo de activación 3’ comprende aproximadamente 27 kb del sitio de cadena ligera l humana de hV 3-29 corriente abajo al extremo de hV 82K.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende una región contigua del sitio de cadena ligera l humana de h\ 5-52 corriente abajo al extremo de h\ 1 -40.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito k 5’ de ratón con respecto a segmentos de gen VK endógeno, dos sitios de reconocimiento de recombinasa yuxtapuestos, una casete de selección 3’ a los sitios de reconocimiento de recombinasa yuxtapuestos, y un brazo de activación 3’ para activar una secuencia 5’ k de ratón con respecto a los segmentos de gen variables de cadena ligera K. En una modalidad, los sitios de reconocimiento de recombinasa yuxtapuestos están en una orientación opuesta con respecto uno al otro. En una modalidad específica, los sitios de reconocimiento de recombinasa son diferentes. En otra modalidad específica, los sitios de reconocimiento de recombinasa son un sitio lox P y un sitio /ox51 1 . En una modalidad, el casete de selección es un casete de neomicina.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un brazo de activación para activar el sito k 5’ de ratón con respecto a segmentos de gen JK de ratón, un casete de selección, un sito de reconocimiento de recombinasa 3’ al casete de selección, y un brazo de activación para activar una secuencia 3’ k de ratón con respecto a los segmentos de gen JK de ratón y 5’ al mejorador intrónico k de ratón. En una modalidad, el casete de selección es un casete de higromicina-TK. En una modalidad, el sito de reconocimiento de recombinasa está en la misma dirección con respecto a la transcripción como el casete de selección. En una modalidad específica, el sito de reconocimiento de recombinasa es un sitio lox P.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ADN aislada, que comprende de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción, un primer fragmento genómico de ratón que comprende una secuencia 5’ de los segmentos de gen VK de ratón endógeno, un primer sito de reconocimiento de recombinasa, un segundo sito de reconocimiento de recombinasa, y un segundo fragmento genómico de ratón que comprende la secuencia 3’ de los segmentos de gen JK de ratón endógeno y 5’ del mejorador intrónico k de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde la modificación genética comprende una modificación con una o más construcciones de ADN descritas aquí o anteriormente.

En un aspecto, se proporciona el uso de una construcción de ADN aislada para hacer un ratón como se describe aquí. En un aspecto, se proporciona el uso de una construcción de ADN aislada como se describe aquí en un método para hacer una proteína de unión a antígeno.

En un aspecto, se proporciona una célula madre no humana que comprende un vector de activación que comprende una construcción de ADN como se describe aquí y anteriormente. En un aspecto, se proporciona una célula madre no humana, en donde la célula madre no humana se deriva de un ratón aquí descrito.

En una modalidad, la célula madre no humana es una célula madre embriónica (ES). En una modalidad específica, la células ES es una célula ES de ratón.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula madre no humana como se describe aquí para hacer un ratón como se describe aquí. En un aspecto, se proporciona el uso de una célula madre no humana como se describe aquí para hacer una proteína de unión a antígeno.

En un aspecto, se proporciona un embrión de ratón, en donde el embrión de ratón comprende una modificación genética como se proporciona aquí. En una modalidad, se proporciona un embrión de ratón huésped que comprende una célula ES de donador, en donde la célula ES de donador comprende una modificación genética como se describe aquí. En una modalidad, el embrión de ratón es un embrión de la etapa de pre-mórula. En una modalidad específica, el embrión de la etapa de pre-mórula es un embrión de etapa de 4-célula o un embrión de etapa 8-célula. En otra modalidad específica, el embrión de ratón es un blastocito.

En un aspecto, se proporciona el uso de un embrión de ratón como se describe aquí para hacer un ratón como se describe aquí. En un aspecto, se proporciona el uso de un embrión de ratón como se describe aquí para hacer una proteína de unión a antígeno.

En un aspecto, se proporciona una célula no humana, en donde la célula no humana comprende una secuencia de gen de cadena ligera de inmunoglobulina reclasificada derivada de un ratón genéticamente modificado como se describe aquí. En una modalidad, la célula es una célula B. En una modalidad, la célula es un hibridoma. En una modalidad, la célula codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que está somáticamente mutado.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula no humana como se describe aquí para hacer un animal no humano como se describe aquí. En un aspecto, se proporciona el uso de una célula no humana como se describe aquí para hacer una proteína de unión a antígeno. En una modalidad, el animal no humano se selecciona de un ratón, rata, hámster, oveja, cabra, vaca, y un primate no humano.

En un aspecto, se proporciona una célula B de ratón que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende (a) una región variable de un segmento de gen h /l y un segmento de gen Ii?l; y (b) un gen CL de ratón. En una modalidad, el gen CL de ratón se selecciona de un gen CK y uno CX. En una modalidad específica, el gen CX es Ol2. En una modalidad específica, el gen Ol de ratón se deriva de un gen CX que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idéntico a X2 de ratón. En una modalidad, la célula B de ratón además expresa una cadena pesada cognada que comprende (c) una región variable derivada de un hVH, hDH, y un segmento hJH. En una modalidad, la célula B no comprende un gen l reclasificado. En otra modalidad, la célula B no comprende un gen k reclasificado.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un anticuerpo en un animal no humano genéticamente modificado, que comprende: (a) exponer un animal no humano genéricamente modificado a un antígeno, en donde el animal tiene un genoma que comprende al menos un hN/l y al menos Ii l en un sitio de cadena ligera endógena, en donde el sitio de cadena ligera endógena comprende un gen CL no humano; (b) permitir que el animal genéticamente modificado desarrolle una respuesta inmune al antígeno; y, (c) aislar del animal de (b) un anticuerpo que específicamente reconoce al antígeno, o aislar del animal de (b) una célula que comprende un dominio de inmunoglobulina que específicamente reconoce el antígeno, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de h /l, un Ii?l y un gen CL de animal. En una modalidad específica, el gen CL no humano es un gen CK de ratón. En una modalidad, el animal no humano se selecciona de un ratón, rata, hámster, conejo, oveja, cabra, vaca, y un primate no humano.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer un anticuerpo en un animal no humano geneticamente modificado, que comprende: (a) exponer un animal genéticamente modificado a un antígeno, en donde el animal tiene un genoma que comprende al menos un hV/l en un sitio k endógeno y al menos un hJ en el sitio K, en donde el sitio k comprende un CK no humano; (b) permitir que el animal genéticamente modificado desarrolle una respuesta al antígeno; y, (c) aislar del animal de (b) un anticuerpo que específicamente reconoce al antígeno, o aislar del ratón de (b) una célula que comprende un dominio de inmunoglobulina que específicamente reconoce el antígeno, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de ?inl, un Ii?l y un gen CK no humano.

En una modalidad, el gen constante de cadena ligera k se selecciona de un gen CK humano y un gen CK de ratón.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer un anticuerpo en un animal no humano genéticamente modificado, que comprende; (a) exponer un animal no humano genéticamente modificado a un antígeno, en donde el animal tiene un genoma que comprende al menos un hN/l en un sitio de cadena ligera l y al menos un JX en el sitio de cadena ligera l, en donde el sitio de cadena ligera l comprende un gen CX no humano; (b) permitir que el animal genéticamente modificado desarrolle una respuesta inmune al antígeno; y, (c) aislar del animal de (b) un anticuerpo que específicamente reconoce al antígeno, o aislar del animal de (b) una célula que comprende un dominio de inmunoglobulina que específicamente reconoce al antígeno, o identificar en el animal de B una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o ligera que une el antígeno, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un h nl , un h*U, y un gen CX no humano. En una modalidad, el animal no humano se selecciona de ratón, rata, hámster, oveja, cabra, vaca, y un primate no humano.

En una modalidad, el gen constante de cadena ligera l se selecciona de un gen CX humano y un gen CX no humano. En una modalidad, el gen constante de cadena ligera l es un gen CX humano. En una modalidad específica, el gen CX humano se selecciona de CX1 , CX2, CX3, y CX7. En una modalidad, el gen constante de cadena ligera X es un gen CX de ratón o rata. En una modalidad específica, el gen CX de ratón se selecciona de CX1 , CX2, y CX3. En una modalidad específica, el gen CX de ratón se deriva de un g en CX q ue es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% identico al CX2 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un gen de anticuerpo reclasificado en un animal no humano genéticamente modificado, que comprende: (a) exponer un animal no humano genéticamente modificado a un antígeno, en donde la modificación genética comprende un hVX y un hJX en un sitio de cadena ligera endógeno, en donde el sitio de cadena ligera endógeno comprende un gen CL no humano o fragmento funcional del mismo; y (b) identificar un gen de inmunoglobulina reclasificado en dicho animal no humano, en donde el gen de inmunoglobulina reclasificado comprende un segmento de gen de región variable de cadena ligera l y un gen CL o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el método además comprende clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del animal, en donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un anticuerpo que comprende un nl humano y un CL de ratón.

En una modalidad, el gen CL de ratón o fragmento funcional del mismo se selecciona de un gen CL humano y un gen CL de ratón, o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer un gen de anticuerpo reclasificado en un animal no humano genéticamente modificado, que comprende: (a) exponer un animal no humano genéticamente modificado a un antígeno, en donde la modificación genética comprende un \\/l y un Ii?l en un sitio de cadena ligera K, en donde el sitio de cadena ligera k comprende un gen CK no humano o fragmento funcional del mismo; y, (b) identificar un gen de inmunoglobulina reclasificado en dicho animal, en donde el gen de inmunoglobulina reclasificado comprende un segmento de gen de región variable de cadena ligera l y un gen CK O fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el gen constante de cadena ligera k o fragmento funcional del mismo se selecciona de un gen CK humano y un gen CK no humano (por ejemplo, ratón o rata), o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el método además comprende clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del animal, en donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un anticuerpo que comprende un nl humano y un CK no humano (por ejemplo, ratón o rata).

En una modalidad, se proporciona un método para hacer un gen de anticuerpo reclasificado en un animal no humano genéticamente modificado, que comprende: (a) exponer un animal no humano genéticamente modificado a un antígeno, en donde la modificación genética comprende un hN/l y un hJ en un sitio de cadena ligera l no humana, en donde el sitio de cadena ligera l no humana comprende un gen CX no humano o fragmento funcional del mismo; y (b) identificar un gen de ¡nmunoglobulina reclasificado en dicho animal, en donde el gen de ¡nmunoglobulina reclasificado comprende un segmento de gen de región variable de cadena ligera l y un gen Ol o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el gen constante de cadena ligera l o fragmento funcional del mismo se selecciona de un gen CX humano y un gen CX de ratón o rata, o fragmento funcional del mismo. En una modalidad específica, el gen constante de cadena ligera l es un gen CX de ratón o rata, o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el método además comprende clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o ligera del animal, en donde la región variable de cadena pesada y/o ligera es de un anticuerpo que comprende un nl humano y un CX no humano (por ejemplo, ratón o rata).

En un aspecto se proporciona un metodo para hacer un anticuerpo, que comprende exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno, permitir al animal montar una respuesta inmune que comprende hacer un anticuerpo que específicamente se une al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reclasificada en el animal que codifica la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico reclasificada en el animal que codifica una secuencia de dominio variable de cadena ligera cognada de un anticuerpo, en donde el anticuerpo específicamente se al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y ligera fusionados a dominios constantes humanos para hacer un anticuerpo deseado, en donde el anticuerpo deseado comprende una cadena ligera que comprende un dominio nl fusionado a un dominio CL. En una modalidad, el dominio V l, es humano y el dominio CL es un dominio CX humano o de ratón o rata. En una modalidad, el dominio /l es de ratón o rata y el dominio CL es un dominio CK humano o de ratón.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer un anticuerpo, que comprende exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno, permitir al animal montar una respuesta inmune que comprende hacer un anticuerpo que específicamente se une al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reclasificada en el ratón que codifica la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico reclasificada en el animal que codifica una secuencia de dominio variable de cadena ligera cognada de un anticuerpo, en donde el anticuerpo específicamente se al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y ligera fusionados a secuencias de ácido nucleico de dominios constantes humanos para hacer un anticuerpo deseado, en donde el anticuerpo deseado comprende una cadena ligera que comprende un dominio \/l fusionado a un dominio CK .

En una modalidad, se proporciona in método para hacer un anticuerpo, que comprende exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno, permitir al animal montar una respuesta inmune que comprende hacer un anticuerpo que específicamente se une al antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico reclasificada en el animal que codifica un dominio variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico reclasificada que codifica una secuencia de dominio variable de cadena ligera cognada de un anticuerpo, en donde el anticuerpo específicamente se une al antígeno, y emplear las secuencias de ácido nucleico fusionadas a secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio constante de cadena pesada humano y un dominio constante de cadena ligera humano para hacer un anticuerpo derivado de secuencias humanas, en donde el anticuerpo que específicamente se une al antígeno comprende una cadena ligera que comprende un dominio nl humano fusionado a una región C no humana (por ejemplo, ratón o rata).

En una modalidad, la región CX es de ratón, y en una modalidad se selecciona de Ol1 , CX2 y Ol3. En una modalidad específica, la región CX de ratón es CX2.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer una secuencia de gen de región variable de cadena ligera de anticuerpo reclasificada, que comprende (a) exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno; (b) permitir al animal montar una respuesta inmune; (c) identifica una célula en el animal que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de dominio VX humana reclasificada fusionada a un dominio CL no humano, en donde la célula también codifica una cadena pesada cognada que comprende un dominio VH humano y un dominio CH no humano, y en donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VX humano y una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio VH humano cognado; y (e) utilizar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VX humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano cognado para hacer un anticuerpo totalmente humano. En una modalidad, el animal no humano y los dominios no humanos se selecciona de ratón y rata.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer una secuencia de gen de región variable de cadena ligera de anticuerpo reclasificada, que comprende (a) exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno; (b) permitir al animal montar una respuesta inmune; (c) identificar una célula en el animal que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de dominio /l humana reclasificada contigua a la misma molecula de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio CK del animal no humano, en donde la célula también codifica una cadena pesada cognada que comprende un dominio VH y un dominio CH del animal no humano, y en donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar de la célula una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio VA humano y una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH humano cognado; y (e) utilizar la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VA humano y la secuencia de ácido nucleico clonada que codifica el dominio VH humano cognado para hacer un anticuerpo totalmente humano.

En una modalidad, se proporciona un método para hacer una secuencia de gen de región variable de cadena ligera de anticuerpo reclasificada, que comprende (a) exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno, (b) permitir al animal montar una respuesta inmune al antígeno; (c) identificar una célula en el animal que comprende ADN que codifica una secuencia de dominio VA no humano del animal, en donde la célula también codifica una cadena pesada cognada que comprende un dominio VH humano y un dominio CH no humano del animal, y en donde la célula expresa un anticuerpo que se une al antígeno; (d) clonar de la célula una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VA, humano reclasificado y una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH humano cognado; y, (e) utilizar la secuencia de ácido nucleico clonado que codifica el dominio \/X humano y la secuencia de ácido nucleico clonado que codifica el dominio VH humano cognado para hacer un anticuerpo totalmente humano. En una modalidad, el animal no humano es un ratón y el dominio CX es C 2 de ratón. En una modalidad específica, el dominio CX de ratón se deriva de un gen CX que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idéntico al CX2 de ratón En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado que expresa una cadena ligera derivada de l humana fusionada a una región constante de cadena ligera endógena (CL), en donde el animal, después de la inmunización con antígeno, hace un anticuerpo que comprende un dominio V l humano fusionado a un dominio CL no humano del animal. En una modalidad, el dominio CL no humano se selecciona de un dominio CK y un dominio CX. En una modalidad, el dominio CX es un dominio CK. En una modalidad, el animal es un ratón. En una modalidad, el dominio CL de ratón es un dominio CX. En una modalidad específica, el dominio Ol es CX2. En una modalidad específica, el dominio CX de ratón se deriva de un gen CX. En una modalidad específica, el dominio CX de ratón se deriva de un gen Ol que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% idéntico al CX2 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado que comprende un sitio de cadena ligera k o l endógena modificada como se describe aquí que expresa una pluralidad de cadenas ligeras l de inmunoglobulina asociadas con una pluralidad de cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una modalidad, la cadena pesada comprende una secuencia humana. En varias modalidades, la secuencia humana se selecciona de una secuencia variable, un CH1 , una bisagra, un CH2, un CH3, y una combinación de los mismos. En una modalidad, la pluralidad de cadenas ligeras inmunoglobulina l comprende una secuencia humana. En varias modalidades, la secuencia humana se selecciona de una secuencia variable, una secuencia constante, y una combinación de las mismas. En una modalidad, el animal comprende un sitio de inmunoglobulina endógena deshabilitado y expresa la cadena pesada y/o cadena ligera l de un transgen o episoma extracromosómico. En una modalidad, el animal comprende un reemplazo en un sitio endógeno (no humano) de algunos o todos los segmentos de gen de cadena pesada no humana endógena (es decir, V, D, J), y/o algunas o todas las secuencias constantes de cadena pesada no humana endógenas (por ejemplo, CH1 , bisagra, CH2, CH3, o una combinación de los mismos), y/o algunas o todas las secuencias de cadena ligera no humanas endógenas (por ejemplo, V, J, constante, o una combinación de los mismos), con una o más secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano adecuado para hacer anticuerpos que tienen una cadena ligera derivada de l humana, en donde todos o substancialmente todos los anticuerpos hechos en el animal no humano se expresan con una cadena ligera derivada de l humana. En una modalidad, la cadena ligera derivada de l humana se expresa de un sitio de cadena ligera endógeno. En una modalidad, el sitio de cadena ligera endógeno es un sitio de cadena ligera K. En una modalidad específica, el animal es un ratón y el sitio de cadena ligera k es un sitio de cadena ligera k de ratón.

En un aspecto, se proporciona un metodo para hacer una cadena ligera derivada de l para un anticuerpo humano, que comprende obtener de un animal no humano como se describe aquí una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada, y emplear la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada para hacer un anticuerpo humano.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer una proteína de unión a antígeno, que comprende exponer un animal no humano como se describe aquí a un antígeno; permitir al animal no humano montar una respuesta inmune; y obtener del animal no humano una proteína de unión a antígeno que se une al antígeno, u obtener del animal no humano una secuencia que será empelada para hacer una proteína de unión a antígeno que se une al antígeno.

En un aspecto, se proporciona una célula derivada de un animal no humano (por ejemplo, un ratón o rata) como se describe aquí. En una modalidad, la célula se selecciona de una célula madre embriónica, una célula pluripotente, una célula pluripotente inducida, una célula B, y un hibridoma.

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende una modificación genética como se describe aquí. En una modalidad, la célula es una célula de ratón. En una modalidad, la célula se selecciona de un hibridoma y un cuadroma. En una modalidad, la célula expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia variable l humana fusionada con una secuencia constante de ratón. En una modalidad específica, la secuencia constante de ratón es una secuencia constante k de ratón.

En un aspecto, se proporciona un tejido derivado de un animal no humano como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano o una célula como se describe aquí para hacer una proteína de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es una proteína humana. En una modalidad, la proteína humana es un anticuerpo humano.

En un aspecto, se proporciona una proteína de unión a antígeno hecha por un animal no humano, célula, tejido, o método como se describe aquí. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es una proteína humana. En una modalidad, la proteína humana es un anticuerpo humano.

Cualquiera de las modalidades y aspectos aquí descritos pueden ser utilizados en conjunto entre sí, a menos que se indique o sea aparente a partir del contexto. Otras modalidades serán evidentes para aquellos expertos en la téenica a partir de una revisión de la presente descripción.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1A muestra una ilustración general, no a escala, de un reemplazo genómico directo de aproximadamente tres megabases (Mb) de un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente una megabase (Mb) del sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos).

La Figura 1 B muestra una ilustración general, no a escala, de un reemplazo genómico directo de aproximadamente tres megabases (Mb) de un sitio de gen variable de cadena ligera de inmunoglobulina k de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente 0.5 megabases (Mb) de la primera, o próxima, de dos repeticiones casi identicas del sitio de gen variable de cadena ligera de inmunoglobulina k humana (símbolos abiertos).

La Figura 2A muestra una ilustración detallada, no a escala, de tres pasos iniciales (A-C) para un reemplazo genómico directo de un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la eliminación de todos los segmentos de gen VH, DH y JH y un reemplazo con tres segmentos de gen VH humano, DH y JH todos humanos. Se muestra un vector de activación para una primera inserción de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana (3hVHBACvec) con un brazo de homología de ratón 5’ de 67 kb, un casete de selección (rectángulo abierto), un sitio de recombinación de sitio específico (triángulo abierto), un fragmento genómico humano de 145 kb y un brazo de homología de ratón 3’ de 8 kb. Se muestran segmentos de gen de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación de sitio específico (triángulos abiertos) insertados de vectores de activación subsecuentes.

La Figura 2B muestra una ilustración detallada, no a escala, de seis pasos iniciales (D-l) para un reemplazo genómico directo de un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la inserción de 77 segmentos de gen VH humanos adicionales y la remoción de un casete de selección final. Se muestra un vector de activación para la inserción de segmentos de gen VH humanos adicionales (18hVHBACvec) a la inserción inicial de segmentos de gen de cadena pesada (3hVH-CRE Alelo Híbrido) con un brazo de homología de ratón 5’ de 20 kb, un casete de selección (rectángulo abierto), un fragmento genómico humano de 196 kb y un brazo de homología humano de 62 kb que traslapa con el extremo 5’ de la inserción inicial de segmentos de gen de cadena pesada humana que se muestra con un sitio de recombinación de sitio específico (triángulo abierto) ubicado en los segmentos de gen humano. Se muestran segmentos de gen inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos abiertos) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por vectores de activación subsecuentes.

La Figura 2C muestra una ilustración detallada, no a escala, de tres pasos iniciales (A-C) para un reemplazo genómico directo de un sitio de gen variable de cadena ligera de inmunoglobulina k de ratón que da como resultado la eliminación de todos los segmentos de gen VK y JK (Igic-CRE Alelo H íbrido). Se muestran casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación de sitio específico (triángulos abiertos) insertados de los vectores de activación.

La Figura 2D muestra una ilustración detallada, no a escala, de cinco pasos iniciales (D-H) para un reemplazo genómico directo de un sitio de gen variable de cadena ligera de inmunoglobulina k de ratón que da como resultado la inserción de todos los segmentos de gen VK y JK en la repetición próxima y eliminación del casete de selección final (40hVKdHyg Alelo Híbrido). Se muestran segmentos de gen de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por vectores de activación subsecuentes.

La Figura 3A muestra una ilustración detallada, no a escala, de una estrategia de clasificación incluyendo las ubicaciones de iniciador/sonda de PCR cuantitativa (qPCR) para detectar la inserción de secuencias de gen de cadena pesada humanas y la pérdida de secuencias de gen de cadena pesada de ratón en células madre embriónicas (ES) activadas. La estrategia de clasificación en células ES y ratones para una primera inserción de gen pesada humana se muestra con grupos de iniciador/sonda de qPCR para la región eliminada (sondas C y D “perdidas”), la región insertada (sondas G y H de “hlgG”) y regiones de flanqueo (sondas A, B, E y F de “retención”) en un cromosoma de ratón no unificado (superior) y un cromosoma correctamente activado (inferior).

La Figura 3B muestra un cálculo representativo de un número de copia de sonda observado en células ES parentales y modificadas para una primera inserción de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Se calculó el número de copia de sonda observado para las sondas A a la F como 2/2AACt. AACt se calculó como prom[ACt(muestra) - medACt(control)], en donde ACt es la diferencia en Ct entre sondas de prueba y de referencia (entre 4 y 6 sondas de referencia dependiendo del ensayo). El término medACt(control) es el ACt medio de múltiples muestras de ADN no activado (>60) de células ES parentales. Cada clon de célula ES modificado se analizó por sextuplicado. Para calcular los números de copia de sondas G y H de IgH en células ES parentales, se asumió que estas sondas tienen un número de copia de 1 en células ES modificadas y se utiliza un Ct máximo de 35 aunque no se observa ninguna amplificación.

La Figura 3C muestra un cálculo representativo de números de copia para cuatro ratones de cada genotipo calculado utilizando solo las sondas D y H . Ratones de tipo silvestre: Ratones WT; heterocigoto de ratones para una primera inserción de segmentos de gen de inmunoglobulina humana; Ratones H ET; homocigoto de ratón para una primera inserción de segmentos de gen de inmunoglobulina humana; Ratones homo.

La Figura 4A muestra una ilustración detallada, no a escala, de los tres pasos empleados para la construcción de 3hVHBACvec a traves de recombinación homologa bacteriana (BHR, según siglas en inglés). Se muestran segmentos de gen de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación de sitio específico (triángulos abiertos) insertados de vectores de activación.

La Figura 4B muestra electroforesis de gel de pulso-campo (PFGE, según siglas en inglés) de tres clones BAC (B1 , B2 y B3) después de digestión Notl. Los marcadores M1 , M2 y M3 son de baja escala, escala media y marcadores de PFG de escalera lambda, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, MA).

La Figura 5A muestra una ilustración esquemática, no a escala, de modificaciones secuenciales del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con cantidades en aumento de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Se hicieron ratones homocigotos a partir de cada una de las tres diferentes etapas de humanización de cadena pesada. Los símbolos abiertos indican secuencia humana; los símbolos cerrados indican secuencia de ratón.

La Figura 5B muestra una ilustración esquemática, no a escala, de modificaciones secuenciales del sitio de cadena ligera de inmunoglobulina k de ratón con cantidades en aumento de segmentos de gen de cadena ligera de inmunoglobulina k h umana. Se hicieron ratones homocigotos a partir de cada una de las tres diferentes etapas de humanización de cadena ligera K . LOS símbolos abiertos indican secuencia humana; los símbolos cerrados indican secuencia de ratón.

La Figura 6 muestra gráficas de punto de FACS de poblaciones de célula B en ratones de tipo silvestre y humanizados VELOCI MMU NE®. Células del bazo (fila superior, tercera fila desde arriba y fila inferior) o nodo linfático ingumal (segunda fila desde arriba) de ratones de tipo silvestre (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1 ), VELOCIMMUNE® 2 (V2) o VELOCI MMUNE® 3 (V3) se tiñeron para células B que expresan IgM en superficie (fila superior, y segunda fila desde arriba), inmunoglobulina se superficie conteniendo cadenas ligeras ya sea k o l (tercera fila desde arriba) o IgM de superficie de haplotipos específicos (fila inferior), y poblaciones separadas por FACS.

La Figura 7A muestra secuencias CDR3 de cadena pesada representativas de anticuerpos VELOCIMMUNE® aleatoriamente seleccionados alrededor de la unión VH- DH-J H ( CDR3), demostrando diversidad de unión y adiciones de nucleótido. Las secuencias de CDR3 de cadena pesada se agruparon de acuerdo con el uso de segmento de gen DH, la línea germinal de las cuales se proporciona por arriba de cada grupo en negritas. Los segmentos de gen VH para cada secuencia CDR3 de cadena pesada se observan entre paréntesis en el extremo 5’ de cada secuencia (por ejemplo, 3-72 es VH3-72 humana). Los segmentos de gen JH para cada CDR3 de cadena pesada se observan entre paréntesis en el extremo 3’ de cada secuencia (por ejemplo, 3 es JH3). SEC I D NOs para cada secuencia mostrada son como sigue procediendo desde arriba hacia abajo: SEC I D NO: 21 ; SEC I D NO: 22; SEC ID NO: 23; SEC I D NO: 24; SEC ID NO: 25; SEC ID NO: 26; SEC ID NO: 27; SEC I D NO: 28; SEC ID NO: 29; SEC ID NO: 30; SEC ID NO: 31 ; SEC I D NO: 32; SEC ID NO: 33; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 39.

La Figura 7B muestra secuencias CDR3 de cadena ligera representativas de anticuerpos VELOCI MMUNE® aleatoriamente seleccionados alrededor de la unión VK-JK (CDR3), demostrando diversidad de unión y adiciones de nucleótido. Los segmentos de gen VK para cada secuencia de CDR3 de cadena ligera se observan entre paréntesis en el extremo 5’ de cada secuencia (por ejemplo, 1 -6 es VK 1 -6 humana). Los segmentos de gen JK para cada CDR3 de cadena ligera se observan entre paréntesis en el extremo 3’ de cada secuencia (por ejemplo, 2 es JK 1 humana). SEC ID NOs para cada secuencia mostrada son como sigue procediendo desde arriba hacia abajo: SEC I D NO: 40; SEC I D NO: 41 ; SEC ID NO: 42; SEC ID NO: 43; SEC I D NO: 44; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 46; SEC ID NO: 47; SEC I D NO: 48; SEC ID NO: 49; SEC ID NO: 50; SEC ID NO: 51 ; SEC ID NO: 52; SEC ID NO: 53; SEC ID NO: 54; SEC I D NO: 55; SEC ID NO: 56; SEC ID NO: 57; SEC ID NO: 58.

La Figura 8 muestra frecuencias de hipermutación somática de cadenas pesada y ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® clasificados (después de alineación de secuencias de línea germinal comcidentes) como porcentaje de secuencias cambiadas en cada posición de nucleótido (NI : columna izquierda) o aminoácido (AA; columna derecha) entre grupos de 38 (IgM no inmunizada), 28 (IgG no inmunizada), 32 (IgK no inmunizada de IgG), 36 (IgG inmunizada) o 36 (IgK de IgG inmunizada) secuencias las barras sombreadas indican las ubicaciones de las CDRs.

La Figura 9A muestra niveles de inmunoglobulina en suero para los isotipos IgM e IgG en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o de VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La Figura 9B muestra niveles de inmunoglobulina en suero para el isotipo IgA en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o de VELOCI MMUNE® (barras cerradas).

La Figura 9C muestra niveles de inmunoglobulina en suero para el isotipo I g E en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o de VELOCI MMUNE® (barras cerradas).

La Figura 10A muestra titulaciones de IgG de antígeno específico contra el receptor de interleucina-6 (IL-6R) de suero de siete ratones de VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo silvestre (WT) despues de dos rondas (sangrado 1 ) o tres rondas (sangrado 2) de inmunización con el ectodominio de IL-6R.

La Figura 10B muestra titulaciones de isotipo específico de IgG de I L-6R específico de siete ratones de VELOCI MMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo silvestre (WT).

La Figura 1 1 A muestra la distribución de afinidad de anticuerpos monoclonales de receptor de anti-interleucina-6 generados en ratones de VELOCI MMUNE®.

La Figura 1 1 B muestra el bloqueo de antígeno específico de anticuerpos monoclonales de receptor de anti-interleucina-6 generados en ratones de VELOCIMMUNE® (VI) y ratones de tipo silvestre (WT).

La Figura 12 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de ADAM6a de ratón y genes de ADAM6b en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Un vector de activación (Vector de Activación mADAM6) utilizado para la inserción de ADAM6a y ADAM6b en un sitio de cadena pesada endógeno humanizado se muestra con un casete de selección (HYG: higromicina) flanqueado por sitios de recombinación de sitio específico (Frt) incluyendo sitios de restricción diseñados por ingeniería genética en los extremos 5’ y 3’.

La Figura 13 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de un pseudo-gen de ADAM6 humano (hADAM6 ) ubicado entre segmentos 1 -2 de gen variable de cadena pesada humana (VH1 -2) y 6-1 (VH6- 1 ) . Un vector de activación para recombinación homologa bacteriana (Vector de Activación IiA?A bY) para elimina un pseudo-gen de ADAM6 humano y sitios de restricción únicos de inserto en un sitio de cadena pesada humana se muestra con un casete de eliminación (NEO: neomicina) flanqueado por sitios de recombinación de sitio específico (loxP) incluyendo sitios de restricción diseñados por ingeniería genática en los extremos 3’ y 5’. Se muestra una ilustración, no a escala, del sitio de cadena pesada humanizada activado resultante conteniendo un fragmento genómico que codifica para los genes de ADAM6a y ADAM6b de ratón incluyendo un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación de sitio específico.

La Figura 14A muestra gráficas de contorno de FACS de linfocitos encerrados en bandas individuales para la expresión superficial de IgM y B220 en la medula ósea para homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón insertado que comprende genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de células B inmaduras (B220'ntlgM+) y maduras (B220altolgM+) se observa en cada gráfica de contorno.

La Figura 14B muestra el número total de células B inmaduras (B220'n,lgM+) y maduras (B220al,olgM+) en la médula ósea de fémures de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+'+).

La Figura 15 muestra gráficas de contorno de células B encerradas en CD19+ para la expresión superficial de c-kit y CD43 en la médula ósea para homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+ ,+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de celula pro-B (CD19+CD43+c-kit+) y pre-B (CD19+CD43 ckit ) se observa en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo, respectivamente, de cada gráfica de contorno.

La Figura 15B muestra el número total de células pro-B (CD19 + CD43 + ckit+) y célula pre-B (CD19 + CD43 ckit ) en la médula ósea aislada de fémures de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La Figura 16A muestra gráficas de contorno de FACS de linfocitos encerrados en bandas individuales para expresión superficial de CD 19 y CD43 en la médula ósea para homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana ( H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de células B inmaduras (CD1 9 + CD43 ), pre-B (CD1919CD43int) y pro-B (CD1 9+CD43+) se observa en cada gráfica de contorno.

La Figura 16B muestra histogramas de células B inmaduras CD19+CD43 ) y pre-B (CD1919CD43int) en la medula ósea de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+ /+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La Figura 17A muestra gráficas de contorno de FACS de linfocitos encerrados en bandas individuales para expresión superficial de CD19 y CD43 en esplenocitos para homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+k·) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de células B (CD19+CD43 ) y T (CD19 CD43+) se observa en cada gráfica de contorno.

La Figura 17B muestra gráficas de contorno de FACS para células B encerradas en CD19+ para expresión superficial de cadena ligera de e Igx en el bazo de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+k·) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de células B ^l+ (cuadrante superior izquierdo) e lg+ (cuadrante inferior derecho) se observa en cada gráfica de contorno.

La Figura 17C muestra el número total de células B CD19+ en el bazo de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana ( H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La Figura 18A muestra gráficas de contorno de FACS para células B encerradas en CD19+ para expresión superficial de IgD e IgM en el bazo de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+/+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). El porcentaje de células B maduras (CD19+lgDal,0lgM'nt) se observa para gráfica de contorno. La flecha sobre la gráfica de contorno derecha ilustra el procedimiento de maduración de células B con relación a la expresión superficial de IgM e IgD.

La Figura 18B muestra el número total de células B en el bazo de homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana (H+ /+K-) y homocigotos de ratones para sitios de gen variable de cadena pesada humana y cadena ligera k humana teniendo un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes de ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+) durante la maduración de CD19 + lgMaltolgDint a CD19+lgMintlgDalt0.

La Figura 19 muestra una ilustración detallada, no a escala, del sitio de cadena ligera l humana incluyendo los grupos de segmentos de gen nl (A, B y C) y los pares de región JX y CX (pares J-C).

La Figura 20 muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de activación utilizada para inactivar el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno.

La Figura 21 muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de activación utilizada para inactivar el sitio de cadena ligera k de ratón endógeno.

La Figura 22A muestra una ilustración general, no a escala, de un vector de activación inicial para activar el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno con secuencias de cadena ligera l humana incluyendo 12 segmentos de gen Ii /l y 1 segmento de gen Ii?l (Vector de Activación 12/1 -l).

La Figura 22B muestra una ilustración general, no a escala, de cuatro vectores de activación inicial para activar el sitio de cadena ligera k de ratón endógeno con secuencias de cadena ligera l humana incluyendo 12 segmentos de gen hV y 1 segmento de gen hJ (Vector de Activación 12/1 -l), 12 segmentos de gen ?inl y 1 , 2, 3, y 7 segmentos de gen Ii?l (Vector de Activación 12/4-k), 12 segmentos de gen Iinl, una secuencia genómica VK-JK humana y 1 segmento de gen Ii?l (Vector de Activación 1 2(K) 1 -K) y 12 segmentos de gen h /l, una secuencia genómica VK-JK humana y 1 , 2, 3 y 7 segmentos de gen Ii?l (Vector de Activación 12(K)4-K) .

La Figura 23A muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de activación para la inserción progresiva de 40 segmentos de gen hV y un segmento de gen ??l individual en el sitio de cadena ligera l de ratón.

La Figura 23B muestra una ilustración general, no a escala, de una estrategia de activación para la inserción progresiva de 40 segmentos de gen hV y un segmento de gen ?l individual en el sitio de cadena ligera k de ratón.

La Figura 24 muestra una ilustración general, no a escala, de los pasos de ingeniería genética de activación y molecular empleados para hacer vectores únicos de activación híbridos l-k humanos para la construcción de un sitio de cadena ligera híbrida conteniendo una secuencia intergénica k humana, múltiples segmentos de gen Ii?l, o ambos.

La Figura 25A muestra una ilustración general, no a escala, de la estructura de sitio para un sitio de cadena ligera l de ratón modificado conteniendo 40 segmentos de gen Iinl y un segmento de gen hü individual operablemente enlazado al gen CX2 endógeno.

La Figura 25B muestra una ilustración general, no a escala, de la estructura de sitio para cuatro sitios de cadena ligera k de ratón modificado, independientes conteniendo 40 segmentos hV y ya sea uno o cuatro segmentos de gen I^l con o sin una secuencia genómica VK-JK humana contigua operablemente enlazada al gen CK endógeno.

La Figura 26A muestran gráficas de contorno de esplenocitos ^l+ e lg c+ encerrados en CD19+ de un ratón de tipo silvestre (WT), un homocigoto de ratón para 12 segmentos h /l y cuatro segmentos hJ incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (12Iinl-nk?k-4hJ ) y un homocigoto de ratones para 40 segmentos hVX y un segmento de gen Ii?l (40Iinl-1 Ii?l).

La Figura 26B nuestra el número total de celulas B CD19+ e n bazos cosechados de ratones de tipo silvestre (WT), homocigotos de ratones para 12 segmentos Iinl y cuatro segmentos de gen Ii?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana ( 1 2IIV -VKJK-4hJ ) y un homocigoto de ratones para 40 segmentos hV y un segmento de gen hJ (40hV -1 ??l).

La Figura 27A, en el panel superior, muestra gráficas de contorno de esplenocitos encerrados en bandas individuales y teñidos para células B y T (CD19+ y CD3 + , respectivamente) de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos Iinl y cuatro segmentos de gen Jl incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (12hV -VKJK-4hJ ). El panel inferior muestra gráficas de contorno de esplenocitos encerrados en CD19+ y teñidos para la expresión de ^l+ e lgK+ de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos hV y cuatro segmentos de gen J incluyendo una secuencia genómica VK- JK humana (12h\^-VicJK-4hJ ).

La Figura 27B muestra el número total de células B CD19+, CD19 + lgK+ y CD19 + lg + en bazos cosechados de ratones de tipo silvestre (WT) y homocigotos de ratones para 40 segmentos h /l y cuatro segmentos de gen l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (12h\ -VicJK-4hJ ).

La Figura 27C muestra gráficas de contorno de esplenocitos encerrados en CD 19+ y teñidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M ( I g M ) de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos hV/l y cuatro segmentos de gen ?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (12Iinl-\/k?k-4Ii?l). En cada una de las gráficas de contorno se muestran células B maduras (72 para WT, 51 para 40hV -VKÜK-4hJ ) y de transición ( 13 para WT, 22 para 40h\ -VicJK-4h ?l).

La Figura 27D muestra el número total de células B CD19+, células B de transición (CD19 + lgMal,0lgDbai°) y maduras (CD 19+lgMbajolgDalto) en bazos cosechados de ratones de tipo silvestre (WT) y homocigotos de ratones para 40 segmentos hX/l y cuatro segmentos de gen ?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (401inl-nk?k-4|-ul).

La Figura 28A, en el panel superior, muestra gráficas de contorno de médula ósea teñida para células B y T (CD19+ y CD3+, respectivamente) de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos Iinl y cuatro segmentos de gen ?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (40IIV -VKJK- 4hJ ). El panel inferior muestra gráficas de contorno de medula ósea encerrada en CD19+ y teñida para ckit+ y CD43+ de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos segmentos Iinl y cuatro segmentos de gen ?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (401i\/l-nk?k-41i ?l). En las gráficas de contorno del panel inferior se observan células B Pro y Pre.

La Figura 28B muestra el número de células B Pro (CD19+CD43+ckit+) y Pre (CD19+CD43 ckit ) en médula ósea cosechada de los fémures de ratones de tipo silvestre (WT) y homocigotos de ratones para 40 segmentos segmentos hVX y cuatro segmentos de gen ?l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (401inl-nk?k-41i?l).

La Figura 28C muestra gráficas de contorno de médula ósea encerrada en bandas individuales teñidas para inmunoglobulina M (IGM) y B220 de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos segmentos hV y cuatro segmentos de gen J i ncluyendo una secuencia genómica VK-JK h umana (401inl-n^k-4I^l). En cada una de las gráficas de contorno se observan células B inmaduras, maduras y pro/pre.

La Figura 28D muestra el número de células B inmaduras (B220'n,lgM+) y maduras (B220al,olgM + ) en médula ósea aislada de los fémures de ratones de tipo silvestre (WT) y homocigotos de ratones para 40 segmentos hVX y cuatro segmentos de gen Jl incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (40Iinl-n^k-4I·^l).

La Figura 28E muestra gráficas de contorno de médula ósea encerrada en células B inmaduras (B220mtlgM + ) y maduras (B220altolgM+) teñidas para expresión de I g l e Igx aisladas de los fémures de un ratón de tipo silvestre (WT) y un homocigoto de ratón para 40 segmentos h /l y cuatro segmentos de gen JX incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (40h\ -VicJK-4h R).

La Figura 29 muestra una alineación de secuencia de nucleótido de la unión VX-JX-CK de 18 clones de RT-PCR independientes amplificados de ARN de esplenocito de ratones que portan secuencias de gen de cadena ligera l humana en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno. A6 = SEC I D NO: 1 15; B6 = SEC ID NO: 1 16; F6 = SEC ID NO: 1 17; B7 = SEC I D NO: 1 18; E7 = SEC I D NO: 119; F7 = SEC I D NO: 120; C8 = SEC ID NO: 121 ; E12 = SEC I D NO: 122; 1 -4 = SEC I D NO: 123; 1 -20 = SEC I D NO: 124; 3B43 = SEC I D NO: 125; 5-8 = SEC ID NO: 126; 5-19 = SEC I D NO: 127; 1010 = SEC ID NO: 128; 1 1 A1 = SEC I D NO: 129; 7A8 = SEC ID NO: 130; 3A3 = SEC I D NO: 131 ; 2-7 = SEC I D NO: 132. Las bases en minúsculas indican bases de no línea germinal que resultan ya sea de la mutación y/o N adición durante la recombinación. Los aminoácidos de consenso dentro de la región de Estructura de trabajo 4 (FWR4) codificados por la secuencia de nucleótido de Ki?l1 y CK de ratón se observan en la parte inferior de la alineación de secuencia.

La Figura 30 muestra una alineación de secuencia de nucleótido de la unión nl-?l-CK de 12 clones de RT-PCR independientes amplificados de ARN de esplenocito de ratones que portan secuencias de gen de cadena ligera l humana incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana contigua en un sitio de cadena ligera k de ratón endógeno. 5-2 = SEC ID NO: 145; 2-5 = SEC ID NO: 146; 1 -3 = SEC ID NO: 147; 4B-1 = SEC I D NO: 148; 3B-5 = SEC I D NO: 149; 7A-1 = SEC I D NO: 150; 5-1 = SEC ID NO: 151 ; 4A-1 = SEC I D NO: 152; 1 1A-1 = SEC I D NO: 153; 5-7 = SEC I D NO: 154; 5-4 = SEC ID NO: 155; 2-3 = SEC I D NO: 156. Las bases en minúsculas indican bases de no línea germinal que resultan ya sea de la mutación y/o N adición durante la recombinación. Los aminoácidos de consenso dentro de la región de Estructura de trabajo 4 (FWR4) codificados por la secuencia de nucleótido de ?l y CK de ratón se observan en la parte inferior de la alineación de secuencia.

La Figura 31 muestra una alineación de secuencia de nucleótido de la unión N/l-?l-Ol de 3 clones de RT-PCR independientes amplificados de ARN de esplenocito de ratones que portan secuencias de gen de cadena ligera l humana en un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno. 2D1 = SEC ID NO: 159; 2D9 = SEC ID NO: 160; 3E 15 = SEC ID NO: 161 . Las bases en minúsculas indican bases de no línea germinal que resultan ya sea de la mutación y/o N adición durante la recombinación. Los aminoácidos de consenso dentro de la región de Estructura de trabajo 4 (FWR4) codificados por la secuencia de nucleótido de 1i?l1 y 0X2 de ratón se observan en la parte inferior de la alineación de secuencia.

DESCRIPCION DETALLADA Esta invención no está limitada a metodos particulares, y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También se debe entender que la terminología aquí utilizada es para el propósito de describir solo modalidades particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos y frases utilizados aquí incluyen los significados que los términos y frases han alcanzado en la téenica, a menos que lo contrario sea claramente indicado o claramente evidente del contexto en el cual se utiliza el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser utilizados en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales particulares. Todas las publicaciones mencionadas se incorporan aquí pro referencia.

La frase “substancial” o “substancialmente” cuando se utiliza para referirse a una cantidad de segmentos de gen (por ejemplo, “substancialmente todos” los segmentos de gen V) incluyen segmentos de gen tanto funcionales como no funcionales e incluyen, en varias modalidades, por ejemplo, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más de todos los segmentos de gen; en varias modalidades, “substancialmente todos” los segmentos de gen incluye, por ejemplo, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de segmentos de gen funcionales (es decir, no pseudo-gen).

El termino “reemplazo” incluye en donde una secuencia de ADN se coloca en un genoma de una célula de tal manera que reemplaza una secuencia dentro del genoma con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón), en el sitio de la secuencia genómica. La secuencia de ADN así colocada puede incluir uno o más secuencias reguladoras que son parte del ADN fuente utilizado para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, mejoradores, regiones no traducidas 5’- o 3’-, secuencias de señal de recombinación apropiadas, etc.). Por ejemplo, en varias modalidades, el reemplazo es una substitución de una secuencia endógena para una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto de gen de la secuencia de ADN así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar como una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un gen o dominio de inmunoglobulina, y el fragmento de ADN codifica uno o más genes o dominios de inmunoglobulina humana). En varias modalidades, un gen endógeno o fragmento del mismo se reemplaza con un gen humano correspondiente o fragmento del mismo. Un gen humano correspondiente o fragmento del mismo es un gen humano o fragmento del mismo que es un ortólogo de, un homólogo de, o es substancialmente idéntico o la misma estructura y/o función, como el gen endógeno o fragmento del mismo que es reemplazado.

El término “contiguo” incluye referencia a la ocurrencia en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, dos secuencias de ácido nucleico son “contiguas” si ocurren en la misma molécula nucleica pero con interrumpidas por otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia V(D)J reclasificada es “contigua” con una secuencia de gen de región constante, aunque el codón final de la secuencia V(D)J no es seguido inmediatamente por el primer codón de la secuencia de región constante. En otro ejemplo, dos secuencias de segmento de gen V con “contiguas” si ocurren en el mismo fragmento genómico, aunque pueden ser separadas por la secuencia que no codifica un codón de la región V, por ejemplo, pueden ser separadas por una secuencia reguladora, por ejemplo, un promotor u otra secuencia. En una modalidad, una secuencia contigua incluye un fragmento genómico que contiene secuencias genómicas dispuestas como se encuentran en un genoma de tipo silvestre.

La frase “derivado(a) de” cuando se utiliza con respecto a una región variable “derivada de” un gen citado o segmento de gen incluye la habilidad de rastrear la secuencia de regreso a un segmento de gen no reclasificado o segmentos de gen que fueron reclasificados para formar un gen que expresa el domino variable (que representa, en donde es aplicable, diferencias de empalme y mutaciones somáticas).

La frase “funcional” cuando se utiliza con respecto a un segmento de gen de región variable o segmento de gen de unión se refiere al uso en un repertorio de anticuerpo expresado; por ejemplo, en segmentos de gen \/l 3-1 , 4-3, 2-8, etc. , son funcionales, mientras que los segmentos de gen \/l 3-2, 3-4, 2-5, etc. , son no funcionales.

Un “sitio de cadena pesada” incluye una ubicación en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, en donde se encuentran secuencias de ADN de región variable de cadena pesada de ratón de tipo silvestre (VH), de diversidad de cadena pesada (DH), de unión de cadena pesada (JH), y constante de cadena pesada (CH).

Un “sitio K” incluye una ubicación en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, en donde se encuentran secuencias de ADN de región variable k de ratón de tipo silvestre (VK) , de unión k (JK), y constante k (CK) .

Un “sitio l” incluye una ubicación en un cromosoma, por ejemplo, un cromosoma de ratón, en donde se encuentran secuencias de ADN de región variable l de ratón de tipo silvestre ( \/l) , de unión l (?l), y constante l (Ol).

El término “célula”, cuando se utiliza junto con la expresión de una secuencia incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen aquellas de procariotas y eucariotas (célula individual o célula múltiple), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp. , Streptomyces spp. , etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal no humano, células humanas, células B, o fusiones de célula tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, de chango, de hámster, de rata, o de ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariótica y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO, K1 , DXB-1 1 CHO. Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1 , riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293M MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC5, Colo205, HB 8065, HL-60 (por ejemplo, BHK21 ), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1 , U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea de célula derivada de una de las células antes mencionadas. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula retinal que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La frase “región de determinación de complementariedad”, o el término “CDR”, incluye una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico de genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones de estructura de trabajo en una región variable de una cadena ligera o una pesada de una molecula de ¡nmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de célula T). Una CDR puede ser codificada, por, por ejemplo, una secuencia de línea germinal o una secuencia reclasificada o no reclasificada, y, por ejemplo, por una célula B o una célula T sin tratamiento previo o madura. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden ser codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de línea germinal) que no con contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reclasificada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de célula B, por ejemplo, como resultado de la división o conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación de V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

La frase “segmento de gen” o “segmento” incluye la referencia a un segmento de gen de inmunoglobulina V (ligera o pesada) o D o J (ligera o pesada), que incluye secuencias no reclasificadas en sitios de inmunoglobulina (en, por ejemplo, seres humanos y ratones) que pueden participar en una reclasificación (mediada, por ejemplo, por recombinasas endógenas) para formar una secuencia V/J o V/D/J. A menos que se indique otra cosa, los segmentos V, D y J comprenden secuencias de señal de recombinación (RSS, según siglas en inglés) que permiten la recombinación V/J o recombinación V/D/J de acuerdo con la regla 12/23. A menos que se indique otra cosa, los segmentos además comprenden secuencias con las cuales se asocian por naturaleza o sus equivalentes funcionales (por ejemplo, para promotores y líderes de segmentos V).

El termino “no reclasificado” incluye el estado de un sitio de inmunoglobulina, en donde los segmentos de gen V y los segmentos de gen J (para cadenas pesadas, y también segmentos de gen D) son mantenidos separadamente pero son capaces de ser unidos para formar un gen V(D)J reclasificado que comprende un V,(D),J individual del repertorio V(D)J.

La frase “escala micromolar" significa 1 -999 micromolar; la frase “escala nanomolar” significa 1 -999 nanomolar; la frase “escala picomolar” significa 1 -999 picomolar.

El término “animales no humanos” pretende incluir cualesquiera animales no humanos tales como ciclostomas, peces óseos, peces cartilaginosos tales como tiburones y rayas, anfibios, reptiles, mamíferos, y ves. Los animales no humanos adecuados incluyen mamíferos. Los mamíferos adecuados incluye primates no humanos, carbas, borregos, cerdos, perros, vacas y roedores. Los animales no humanos adecuados se seleccionan de la familia de roedores incluyendo rata y ratón. En una modalidad, los animales no humanos con ratones.

El ratón, como un modelo genético, ha sido enormemente mejorado a través de teenologías transgénicas y de modificación por ingeniería genética (“knockout”), las cuales se han permitido para el estudio de los efectos de sobre-expresión dirigida o eliminación de genes específicos. A pesar de todas sus ventajas, el ratón sigue presentando obstáculos genéticos que lo hacen un modelo imperfecto para enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para probar terapéuticos humanos o hacerlos. En primer lugar, aunque aproximadamente 99% de los genes humanos tienen una homología de ratón (Waterson, R. H. et al. (2002) Initial sequencing y comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562), los terapéuticos potenciales por lo general fallan para una reacción cruzada, o reaccionan en forma cruzada inadecuadamente, con ortólogos de los objetivos humanos pretendidos. Para obviar este problema, los genes objetivo seleccionados pueden ser “humanizados”, es decir, el gen de ratón puede ser eliminado y reemplazado por la secuencia de gen ortóloga humana correspondiente (por ejemplo, US 6,586,251 , US 6,596,541 , y US 7, 105,348, incorporadas aquí por referencia). I nicialmente, los esfuerzos para humanizar genes de ratón a través de una estrategia de “humanización por Knokout más transgénica” produjeron un cruce de ratón portando una eliminación (es decir, knockout o modificación por ingeniería genética) del gen endógeno con un ratón portando un transgen humano aleatoriamente integrado (ver, por ejemplo, Bril, W.S. et al (2006) Tolerance to factor VIII en a transgenic mouse expressing human factor VII I cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341 -347; Homanics, G.E. et al. (2006) Production and characterization of murine models of classic and intermedíate maple syrup uriñe disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D. et al. (2006) A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia. Genomics 88(3) : 309-15; Pan, Q. et al. (2006) Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function human CD3delta/epsilon heterodimer restores the detective preTCR function in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice. Mol Immunol 43, 1741 -1750). Pero esos esfuerzos fueron obstaculizados pro limitaciones de tamaño; las teenologías convencionales de “knockout” (modificación por ingeniería genetica” no fueron suficientes para reemplazar directamente genes grandes de ratón con sus contrapartes genómicas humanas grandes. Un aspecto directo para dirigir el reemplazo homólogo, en donde un gen de ratón endógeno es directamente reemplazado por el gen de contraparte humano a la misma ubicación genética precisa del gen de ratón (es decir, en el sitio de ratón endógeno), es raramente intentado por las dificultades técnicas. Hasta ahora, los esfuerzos en el reemplazo directo involucraron procedimientos elaborados y pesados, limitando así la longitud de material genético que puede ser manejado y la precisión a la cual pueden ser i plementados.

Los transgenes humanos exógenamente introducidos se reclasifican en células B de precursor en ratones (Alt, F.W. , Blackwell, T. K. , and Yancopoulos, G. D. (1985). Immunoglobulin genes ¡n transgenlc mice. Trends Genet 1 , 231 -236). Este hallazgo fue explotado por ratones de ingeniería utilizando el aspecto de knockout más transgénico para expresar anticuerpos humanos (Green, L. L. et al. (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 13-21 ; Lonberg, N. (2005). Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23, 1 1 17-1 125; Lonberg, N. et al. (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856-859; Jakobovits, A. et al. (2007) From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol 25, 1 134-1 143). Los sitios de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina k de ratón endógeno fueron inactivados en estos ratones mediante eliminación activada de porciones pequeñas pero criticas de cada sitio endógeno, seguido por la introducción de sitios de gen de inmunoglobulina humana como transgenes grandes aleatoriamente integrados, como se describió anteriormente, o mini-cromosomas (Tomizuka, K. et al. (2000) Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragmente containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Nati Acad Sci U S A 97, 722-727). Dichos ratones representaron un importante avance en ingeniería genética; los anticuerpos monoclonales totalmente humanos aislados de ellos produjeron un potencial terapéutico para tratar una variedad de enfermedades humanas (Gibson, T. B. et al. (2006) Randomized phase I I I trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cáncer. Clin Colorectal Cáncer 6, 29-31 ; Jakobovits et al. , 2007; Kim, Y. H. et al. (2007) Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase I I studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma. Blood 109(1 1 ):4655-62; Lonberg, 2005; Maker, A.V. et al. (2005) Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase l/ll study. Ann Surg Oncol 12, 1005-1016; McClung, M. R. , Lewiecki, E. M. et al. (2006) Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821 -831 ). Pero, como se discutió anteriormente, estos ratones exhiben un desarrollo comprometido de célula B y deficiencias inmunes cuando se comparan con ratones de tipo silvestre. Dichos problemas potencialmente limitan la habilidad de los ratones para soportar una respuesta humoral vigorosa y, consecuentemente, generan anticuerpos totalmente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden deberse a; (a) una funcionalidad ineficiente debido a la introducción aleatoria de los transgenes de inmunoglobulina humana y de la expresión incorrecta resultante debido a la falta de elementos de control corriente arriba y corriente abajo (Garrett, F. E. et al. (2005) Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and ¡n vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, 151 1 -1525; Manís, J. P. et al. (2003) Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory región. Mol I mmunol 39, 753-760; Pawlitzky, I . et al. (2006) Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking región of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU .1 , Pax5, and E2A. J Immunol 176, 6839-6851 ); (2) interacciones ineficientes entre especies entre dominios constantes humanos y componentes de ratón del complejo de señalización de receptor de celula B sobre la superficie de la célula, que puede dañar los procesos de señalización requeridos para una maduración, proliferación y sobrevivencia normales de células B (Hombach, J. et al. (1990) Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class. Nature 343, 760-762); y (3) interacciones ineficientes entre especies entre inmunoglobulinas humanas solubles y receptores Fe de ratón que pueden reducir la selección de afinidad (Rao, S. P. et al. (2002) Differential expression of the inhibitory IgG Fe receptor FcgammaRI I B on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells. J Immunol 169, 1859-1868) and immunoglobulin serum concentrations (Brambell, F.W. et al. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P. , and Anderson, C.L. (1996). The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor. Proc Nati Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Rao et al. , 2002; Hjelm, F. et al. (2006) Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J I mmunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F. , and Ravetch, J .V. (2007). Fc-receptors as regulators of immunity. Adv Immunol 96, 179-204). Estas deficiencias pueden ser corregidas a través de humanización in situ de solo las regiones variables de los sitios de inmunoglobulina de ratón dentro de sus ubicaciones naturales en los sitios de cadena pesada y ligera endógenos. Esto efectivamente podría dar como resultado ratones que hacen anticuerpos “quiméricos inversos” (es decir, V humana; C de ratón) que pueden ser capaces de interacciones normales y selección con en ambiente del ratón basado en regiones constantes de ratón de retención. Además, dichos anticuerpos quiméricos inversos pueden ser fácilmente reformateados en anticuerpos totalmente humanos para propósitos terapéuticos.

Los animales genéticamente modificados que comprenden un reemplazo en el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con secuencias de inmunoglobulina heterólogas (por ejemplo, de otra especie) pueden hacerse junto con reemplazos en sitios de cadena ligera de inmunoglobulina endógena o junto con transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina quimérica o totalmente humanos o totalmente de ratón, etc.). Las especies a partir de las cuales se derivan las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heteróloga pueden variar ampliamente; como con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina empleadas en reemplazos de secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina o transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina.

En varias modalidades, las secuencias de ácido nucleico de reglón variable de inmunoglobulina, por ejemplo, segmentos V, D, y/o J, se obtienen de un ser humano o un animal no humano. Los animales no humanos adecuados para proporciona segmentos V, D, y/o J incluyen, por ejemplo, pescado óseo, pescado cartilaginoso, tal como tiburones y rayas, anfibios, reptiles, mamíferos, aves (por ejemplo, pollos). Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, primates no humanos, carbas, ovejas, cerdos, perros, bovinos (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), venado, camellos, hurones y roedores y primates no humanas (por ejemplo, chimpances, orangutanes, gorilas, titíes, babumos). Los animales no humanos adecuados se seleccionan de la familia de roedores incluyendo ratas, ratones y hámsteres. En una modalidad, los animales no humanos son ratones. Como es claro a partir del contexto, se pueden utilizar varios animales no humanos como fuentes de dominios variables o segmentos de gen de región variable (por ejemplo, tiburones, rayas, mamíferos (por ejemplo, camellos, roedores, tales como ratones y ratas).

De acuerdo con el contexto, los animales no humanos también se utilizan como fuentes de secuencias de región constante que se utilizarán con relación a secuencias o segmentos variables, por ejemplo, se pueden utilizar secuencias constantes de roedor en transgenes operablemente enlazados a secuencias variables humanas y no humanas (por ejemplo, secuencias variables humanas y de primate no humano operablemente enlazadas a, por ejemplo, secuencias constantes de roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). De esta manera, en varias modalidades, los segmentos V, D, y/o J humanos están operablemente enlazados a secuencias de gen de región constante de roedor (por ejemplo, ratón o rata o hámster). En algunas modalidades, los segmentos V, D, y/o J humanos (o uno o más genes VDJ o VJ reclasificados) están operablemente enlazados o fusionados a una secuencia de gen de región constante de ratón, rata, o hámster en, por ejemplo, un transgen integrado en un sitio que no es un sitio de inmunoglobulina endógena.

En una modalidad específica, se proporciona un ratón que comprende un reemplazo de segmentos de gen VH , DH y JH en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con uno o más segmentos VH, DH y J H humanos, en donde uno o más de los segmentos VH, DH y J H están operablemente enlazados a un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena; en donde el ratón comprende un transgen en un sitio distinto a un sitio de inmunoglobulina endógena, en donde el transgen comprende un segmento Vu humano y JL humano no reclasificado o reclasificado, operablemente enlazado a una región constante de ratón rata o humana.

En una modalidad específica, se proporciona un ratón que comprende una inserción de uno o más segmentos de gen VH, DH y J H humanos en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad, la inserción es corriente arriba de un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena; en una modalidad, la inserción es corriente abajo de un segmento de gen variable (V) endógeno; en una modalidad, la inserción es corriente abajo de un segmento de diversidad (D) endógeno; en una modalidad, la inserción es corriente abajo de un segmento de unión (J) endógeno. En varias modalidades, la inserción es tal que uno o más delos segmentos de gen VH, DH y J H humanos se colocan en un enlace operable con uno o más genes constantes de cadena pesada endógenos.

Se describe un método para un reemplazo grande genético in situ de los sitios de gen variables de inmunoglobulina de línea germinal de ratón por sitios de gen variables de inmunoglobulina de línea germinal humana, mientras se mantiene la habilidad de los ratones para generar progenie. Específicamente, se describe el reemplazo preciso de seis megabases de sitios de en variable de inmunoglobulina k de cadena ligera y cadena pesada de ratón con sus contrapartes humanas mientras se deja intacto a las regiones constantes de ratón. Como resultado, se han creado ratones que tienen un reemplazo preciso de su completo repertorio variable de inmunoglobulina de línea germinal por secuencias variables de inmunoglobulina de línea germinal humana equivalentes, mientras se mantienen regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas están enlazadas a regiones constantes de ratón para formar sitios de inmunoglobulina humana-ratón quimérica que se reclasifican y expresan a niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados como “quimeras inversas”, es decir, comprenden secuencias de región variable humanas y secuencias de región constante de ratón. Estos ratones que tienen regiones variables de inmunoglobulina humanizada que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón se denominan ratones de VELCOI MMUN E®.

Los ratones humanizados de VELCOIMMUNE® exhiben un sistema inmune humoral totalmente funcional que, de manera esencial, distinguible de aquel de ratones de tipo silvestre. Presentan poblaciones de célula normales en todas las etapas del desarrollo de la célula B. exhiben una morfología normal de órgano linfoide. Las secuencias e anticuerpo de ratones de VELCOIMMUNE® exhiben una reclasificación normal de V(D)J y frecuencias normales de hiper-mutación somática. Las poblaciones de anticuerpo, en estos ratones, reflejan distribuciones de isotipo que resultan de la conmutación normal de clase (por ejemplo, c/s-conmutación normal de isotipo). La inmunización de ratones de VELCOI MMUNE® da como resultado fuertes respuestas inmunes humorales que generan grandes repertorios de anticuerpos diversos teniendo dominios variables de inmunoglobulina humana adecuados como candidatos terapéuticos. Esta plataforma proporciona una plenitud de fuentes de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana naturalmente de afinidad madura para hacer anticuerpos farmacéuticamente aceptables y otras proteínas de unión de antígeno.

Es el preciso reemplazo de secuencias variables de inmunoglobulina de ratón por secuencias variables de inmunoglobulina humana el que permite hacer ratones de VELCOI MMUNE®. Aún más, un preciso reemplazo de secuencias de inmunoglobulina de ratón endógeno en sitios de cadena pesada y ligera con secuencias de inmunoglobulina humana equivalentes, a través de recombinación de expansiones muy grandes de secuencias de inmunoglobulina humanas, puede presentar ciertos retos debido a la evolución divergente de los sitios de inmunoglobulina entre el ratón y el hombre. Por ejemplo, las secuencias intergénicas intercaladas dentro de los sitios de inmunoglobulina no son idénticas entre ratones y humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre ratones y seres humanos en sus sitios de inmunoglobulina pueden seguir dando como resultado anormalidades en ratones humanizados, particularmente, cuando se humanizan o manipulan ciertas porciones de sitios de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno. Algunas modificaciones en los sitios de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón son nocivas. Las modificaciones nocivas pueden incluir, por ejemplo, pérdida de la habilidad de los ratones modificados a aparearse y producir progenie. En varias modalidades, el diseño por ingeniería genética de secuencias de inmunoglobulina humana en el genoma de un ratón incluye métodos que mantiene secuencias endógenas que cuando están ausentes en cepas de ratón modificadas son nocivas. Los efectos nocivos ilustrativos pueden incluir la incapacidad de propagar cepas modificadas, pérdida de función de genes esenciales, incapacidad para expresar polipéptidos, etc. Dichos efectos nocivos pueden estar directa o indirectamente relacionados con la modificación diseñada por ingeniería genética con el genoma del ratón.

Se realizó un reemplazo preciso, a gran escala, ¡n situ de seis megabases de las regiones variables de los sitos de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera de ratón (VH-DH-JH y VK-JK) con las 1.4 megabases correspondientes de secuencias genómicas humanas, mientras que las secuencias de ratón de flanqueo se dejaron intactas y funcionales dentro de los sitios híbridos, incluyendo todos los genes de cadena constante de ratón y regiones de control de transcripción de sitio (Figura 1 A y Figura 1 B). Específicamente, las secuencias de gen VH, DH, JH , VK y JK humanas se introdujeron a traves de inserción escalonada de 13 vectores de activación BAC quiméricos portando fragmentos de traslape de los sitios variables de línea germinal humanos en células ES de ratón utilizando teenología de diseño por ingeniería genética de VELCOIMMUNE® (ver, Patente de E.U.A. No. 6, 586,251 y Valenzuela, D.M. et al. (2003). High throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21 , 652-659).

La humanización de los genes de inmunoglobulina de ratón representa la modificación genética más grande para el genoma de ratón hasta la fecha. Aunque los esfuerzos previos con transgenes de inmunoglobulina humana aleatoriamente integrados han sido satisfechos con algún éxito (discutido anteriormente), el reemplazo directo de los genes de inmunoglobulina de ratón con sus contrapartes humanas dramáticamente incrementa la eficiencia con la cual se pueden generar eficientemente anticuerpos totalmente humanos en ratones de otra manera normales. Además, dichos ratones exhiben una diversidad dramáticamente incrementada de anticuerpos totalmente humanos que pueden ser obtenidos despues de inmunización con virtualmente cualquier antígeno, según comparado con ratones que portan sitios endógenos deshabilitados y transgenes de anticuerpo totalmente humanos. Múltiples versiones de sitios reemplazados, humanizados exhiben niveles completamente normales de células B maduras e inmaduras, en contraste con ratones con transgenes humanos aleatoriamente integrados, los cuales exhiben poblaciones de célula B significativamente reducidas en varias etapas de diferenciación. Aunque los esfuerzos para incrementar el número de segmentos de gen humano en ratones transgénicos humanos han reducido dichos defectos, los repertorios de inmunoglobulina expandidos, en conjunto no han corregido las reducciones en poblaciones de célula B según comparado con ratones de tipo silvestre.

A pesar de la función inmune humoral casi de tipo silvestre observada en ratones con sitios reemplazados de inmunoglobulina (es decir, ratones de VELCOIMMUNE®), existen otros retos encontrados cuando se emplea un reemplazo directo de la inmunoglobulina que no es encontrado en algunos aspectos que emplean transgenes aleatoriamente integrados. Las diferencias en la composición genética de los sitios de inmunoglobulina entre ratones y seres humanos han conducido al descubrimiento de secuencias benéficas para la propagación de ratones con segmentos de gen de inmunoglobulina reemplazados. Específicamente, los genes de ADAM6 de ratón localizados dentro del sitio de inmunoglobulina endógena opcionalmente están presentes en ratones con sitios de inmunoglobulina reemplazados, debido a su papel de fertilidad.

Ubicación Genómica y Función de ADAM6 de Ratón Ratones macho que carecen de la habilidad para expresar cualquier proteína ADAM6 funcional sorprendentemente exhiben un defecto en la habilidad de los ratones para aparearse y para generar progenie. Los ratones carecen de la habilidad de expresar una proteína ADAM6 funcional en virtud de un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen de región variable de inmunoglobulina de ratón por segmentos de gen de región variable humana. La pérdida de la función de ADAM6 resulta porque el sitio de ADAM6 está ubicado dentro de una región del sitio de gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena, cerca del extremo 3’ del sitio de segmento de gen VH de los segmentos de gen DH. Con el fin de crear ratones que sean homocigotos para un reemplazo de todos o substancialmente todos los segmentos de gen variable de cadena pesada de ratón endógeno por segmentos de gen variable de cadena pesada humano, en general es un aspecto molesto establecer machos y hembras que sean cada uno homocigoto para el reemplazo y esperar un apareamiento productivo. Las camadas con éxito presentan frecuencia y tamaño bajos. Más bien, se han empleado machos heterocigotos para el reemplazo para aparearse con hembras homocigotas para el reemplazo para generar progenies que son heterocigotas para el reemplazo, entonces criar un ratón homocigoto a partir de estos. Los inventores han determinado que la probable causa de la pérdida de fertilidad en los ratones macho es la ausencia, en ratones macho hom o cigotos, de una pro teína ADAM6 funcional.

En varios aspectos, los ratones macho que comprenden un gen de ADAM6 dañado (es decir, no funcional, o marginalmente funcional) exhiben una reducción o eliminación de fertilidad. Ya que en los ratones (y otros roedores) el gen de ADAM6 está ubicado en el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina, los inventores han determinado que con el fin de propagar los ratones, o crear y mantener una cepa de ratones, que comprendan un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina reemplazado, se empelan varios esquemas modificados de crianza o propagación. La baja fertilidad, o infertilidad, de ratones macho homocigotos, para un reemplazo del sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, hace que sea difícil el mantenimiento de dicha modificación en una cepa de ratón. En varias modalidades, el mantenimiento de la cepa comprende evitar los problemas de infertilidad exhibidos por ratones macho homocigotos para el reemplazo.

En un aspecto, se proporciona un método para mantener una cepa de ratón como se describe aquí. La cepa de ra‘ón no necesita comprender una secuencia de ADAM6 ectópica, y, en varias modalidades, la cepa de ratón es homocigota o heterocigota para un knockout (por ejemplo, un knockout funcional) de ADAM6.

La cepa de ratón comprende una modificación de un sitio de cadena pesada que da como resultado una reducción o pérdida de fertilidad en un ratón macho. En una modalidad, la modificación comprende una eliminación de una región reguladora y/o una región de codificación de un gen de ADAM6. En una modalidad específica, la modificación comprende una modificación de un gen de ADAM6 endógeno (región reguladora y/o de codificación) que reduce o elimina la fertilidad en un ratón macho que comprende la modificación; en una modalidad específica, la modificación reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que homocigoto para la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón es homocigota o heterocigota para un knockout (por ejemplo, un knockout funcional) o una eliminación de un gen de ADAM6.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al aislar, de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación, una célula, y al emplear la célula de donador en un embrión huésped, y al gestar el embrión huésped y la célula de donador en una madre substituta, y al obtener, de la madre substituta, una progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, la célula de donador es una célula ES. En una modalidad, la célula de donador es una célula pluripotente, por ejemplo, una célula pluripotente inducida.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al aislar, de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación, una secuencia de ácido nucleico que comprende la modificación, y al introducir la secuencia de ácido nucleico en un núcleo huesped, y al gestar una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico y el núcleo huésped en un animal adecuado. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se introduce en un embrión de ovocito huésped.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al aislar, de un ratón que es homocigoto o heterocigoto para la modificación, un núcleo, y al introducir el núcleo en una célula huésped, y al gestar el núcleo y la célula huésped en un animal adecuado para obtener una progenie que es homocigota o heterocigota para la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al emplear fertilización in vitro (IVF, según siglas en inglés) de un ratón hembra (tipo silvestre, homocigoto para la modificación, o heterocigota para la modificación) empleando un esperma de un ratón macho que comprende la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es heterocigota para la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es homocigoto para la modificación genética.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al criar un ratón machi que es heterocigoto para la modificación genética con un ratón hembra para obtener una progenie que comprenda la modificación genetica, al identificar una progenie macho y hembra comprendiendo la modificación genética, y al emplear un macho que es heterocigoto pata la modificación genética en una crianza con una hembra que es de tipo silvestre, homocigota, o heterocigota para la modificación genética para obtener una progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, el paso de criar un macho heterocigoto para la modificación genética con una hembra de tipo silvestre, una hembra heterocigota para la modificación genética, o una hembra homocigota para la modificación genética es repetida con el fin de mantener la modificación genética en la cepa de ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para mantener una cepa de ratón que comprende un reemplazo de un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que comprende criar la cepa de ratón con el fin de generar ratones macho heterocigotos, en donde los ratones macho heterocigotos son criados para mantener la modificación genética en la cepa. En una modalidad específica, la cepa no es mantenida por ninguna crianza de un macho homocigoto con una hembra de tipo silvestre, o una hembra homocigota o heterocigota para la modificación genética.

La proteína ADAM6 es un miembro de la familia de proteínas ADAM, en donde ADAM es un acrónimo para una Desintegrina y Metaloproteasa. La familia de proteínas ADAM es grande y diversa, las diversas funciones incluyendo adhesión de célula. Algunos miembros de la familia de ADAM están implicados en la espermatogenesis y fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína fertilina, la cual está implicada en interacciones de esperma-huevo. ADAM3, o ciritestina, parece ser necesaria para la unión de esperma a la zona pelúcida. La ausencia ya sea de ADAM2 o ADAM3 da como resultado la infertilidad. Se ha postulado que ADAM6, ADAM3, y ADAM6 forman un complejo sobre la superficie de las células de esperma de ratón.

El gen de ADAM6 humano, normalmente encontrado entre segmentos de gen VH, VH 1 -2 y VH6-1 , parece ser un pseudo-gen (Figura 12). En ratones, existen dos genes de ADAM6, ADAM6a y ADAM6b, que se encuentran en una región intergénica entre segmentos de gen VH y DH, y en el ratón los genes de ADAM6a y ADAM6b se orientan en una orientación de transcripción opuesta a aquella de los segmentos de gen de inmunoglobulina circundante (Figura 12). En ratones, un sitio de ADAM6 funcional aparentemente es requerido para fertilización normal. Un sitio o secuencia de ADAM6 funcional, entonces, se refiere a un sitio o secuencia de ADAM6 que puede complementar o rescatar la fertilización drásticamente reducida exhibida en ratones macho con la falta de sitios de ADAM6 endógenos no funcionales.

La posición de la secuencia intergénica en ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b hace a la secuencia intergénica susceptible a modificación cuando se modifica una cadena pesada de ratón endógeno. Cuando los segmentos de gen VH son eliminados o reemplazados, o cuando los segmentos de gen DH son eliminados o reemplazados, existe una alta probabilidad que un ratón resultante exhibirá un severo deficit de fertilidad. Con el fin de compensar el déficit, el ratón es modificado para incluir una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que complementará la pérdida en la capacidad de ADAM6 debido a una modificación del sitio de ADAM6 de ratón endógeno. En varias modalidades, el completamiento de la secuencia de nucleótido es una que codifica un ADAM6a de ratón, un ADAM6b de ratón, o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que rescata el déficit de fertilidad. Alternativamente, se pueden emplear métodos adecuados para conservar el sitio de ADAM6 endógeno, mientras hace que las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina endógena que flanquean el sitio de ADAM6 de ratón sean incapaces de reclasificación para codificar una región variable de cadena pesada endógena funcional. Los métodos alternativos ilustrativos incluyen la manipulación de grandes porciones de cromosomas de ratón que colocan a los sitios de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de tal forma que son incapaces de reclasificación para codificar una región variable de cadena pesada funcional que está operativamente enlazada a un gen constante de cadena pesada endógeno. En varias modalidades, los métodos incluyen inversiones y/o translocaciones de fragmentos cromosómicos de ratón conteniendo segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

La secuencia de nucleótido que rescata la fertilidad puede ser colocada en cualquier posición adecuada. Puede ser colocada en la región intergenica, o en cualquier posición adecuada en el genoma (es decir, de forma ectópica). En una modalidad, la secuencia de nucleótido puede ser introducida en un transgen que aleatoriamente se integra en el genoma de ratón. En una modalidad, la secuencia puede ser mantenida de manera ectópica, es decir, en un ácido nucleico separado en lugar de un cromosoma de ratón. Las posiciones adecuadas incluyen posiciones que son transcripcionalmente permisibles o activas, por ejemplo, un sitio ROSA26 (Zambrowicz et at. , 1997, PNAS USA 94:3789-3794), un sitio BT-5 (Michael et al. , 1999, Mech. Dev. 85:35-47), o en un sitio Oct4 (Wallace et al. , 2000, Nucleic Acids Res. 28: 1455-1464). Se describen secuencias de nucleótido de activación para activar transcripcionalmente sitios, por ejemplo, en US 7,473,557, incorporada aquí para referencia.

Alternativamente, la secuencia de nucleótido que rescata la fertilidad puede ser acoplada con un promotor inducible con el fin de facilitar la expresión óptima en las células y/o tejidos apropiados, por ejemplo, tejidos reproductores. Los promotores inducibles ilustrativos incluyen promotores activados mediante medios físicos (por ejemplo, promotor de choque térmico) y/o químicos (por ejemplo, I PTG o tetracielina).

Además, la expresión de la secuencia de nucleótido puede ser enlazada a otros genes con el fin de lograr la expresión, en etapas específicas, de desarrollo o dentro de tejidos específicos. Dicha expresión puede ser lograda al colocar la secuencia de nucleótido en enlace operable con el promotor de un gen expresado en una etapa específica de desarrollo. Por ejemplo, las secuencias de inmunoglobulina de una especie diseñada por Ingeniería genática en el genoma de una especie huesped se colocan en un enlace operable con una secuencia de promotor de un gen CD 19 (gen específico de célula B) a partir de la especie huésped. Se logra la expresión específica de célula B en etapas de desarrollo preciso cuando se expresan las inmunoglobulinas.

Aún otro método para lograr una fuerte expresión de una secuencia de nucleótido insertada es emplear un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen SV40, CMV, U BC, EF1 A, PGK y CAGG. En una forma similar, la secuencia de nucleótido deseada se coloca en enlace operable con un promotor constitutivo seleccionado, el cual proporciona un alto nivel de expresión de la proteína(s) codificada por la secuencia de nucleótido.

El término “ectópica(o)" pretende incluir un desplazamiento, o una colocación en una posición que es normalmente encontrada por naturaleza (por ejemplo, colocación de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición como en la que la secuencia de ácido nucleico se encuentra en un ratón de tipo silvestre). El término en varias modalidades se utiliza en el sentido de su objeto siendo fuera de su posición normal o apropiada. Por ejemplo, la frase “secuencia de nucleótido ectópica que codifica ..." se refiere a una secuencia de nucleótido que aparece en una posición en la cual normalmente no se encuentra en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia de nucleótido ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón (o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que proporciona un beneficio de fertilidad igual o similar en los ratones macho), la secuencia puede ser colocada en una posición diferente en el genoma del ratón que en el normalmente encontrado en una ratón de tipo silvestre. En tales casos, se crearán uniones de secuencia novedosas de ratón al colocar la secuencia en una posición diferente en el genoma del ratón que en un ratón de tipo silvestre. Un homólogo u ortólogo funcional de ADAM6 de ratón es una secuencia que confiere un rescate de pérdida de fertilidad (por ejemplo, pérdida de la habilidad de un ratón macho para generar progenie al aparearse) que se observa en un ratón ADAM6 . Los homólogos u ortólogos funcionales incluyen proteínas que tienen al menos aproximadamente 89% de identidad o más, por ejemplo, hasta 99% de identidad, con la secuencia de aminoácido de ADAM6a y/o a la secuencia de aminoácido de ADAM6b, y que pueden complementar, o rescatar la habilidad para aparearse con éxito, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una eliminación o knockout de ADAM6a y/o ADAM6b.

La posición ectópica puede ser en cualquier parte (por ejemplo, como con una inserción aleatoria de un transgen conteniendo una secuencia de ADAM6 de ratón), o puede estar, por ejemplo, en una posición que se aproxime (pero no precisamente es igual a) a su ubicación en un ratón de tipo silvestre (por ejemplo, en un sitio de inmunoglobulina de ratón endógeno modificada, pero ya sea corriente arriba o corriente abajo de su posición natural, por ejemplo, dentro de un sitio de inmunoglobulina modificado pero entre diferentes segmentos de gen, o en una posición diferente en una secuencia intergenica V-D de ratón). Un ejemplo de una colocación ectópica es mantener la posición normalmente encontrada en ratones de tipo silvestre dentro del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, mientras hace que los segmentos de gen de cadena pesada endógenos circundantes sean capaces de reclasificación para codificar una cadena pesada funcional conteniendo una región constante de cadena pesada endógena. En este ejemplo, esto puede lograrse a través de inversión del fragmento cromosómico que contiene los sitios variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, por ejemplo, utilizando, sitios de recombinación de sitio específico diseñados por ingeniería genética colocados en posiciones que flanquean el sitio de región variable. De esta manera, después de la recombinación, los sitios de región variable de cadena pesada endógenos se colocan a una gran distancia lejos de los genes de región constante de cadena pesada endógenos evitando así la reclasificación para codificar una cadena pesada funcional conteniendo una región constante de cadena pesada endógena. Otros métodos ilustrativos para obtener el silenciamiento funcional del sitio de gen variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógena mientras se mantiene un sitio de ADAM6 funcional serán evidentes para los expertos en la téenica después de leer esta descripción y/o en combinación con métodos bien conocidos. Con dicha colocación del sitio de cadena pesada endógeno, los genes de ADAM6 endógenos son mantenidos y el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena es funcionalmente silenciado.

Otro ejemplo de una colocación ectópica es la colocación dentro de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada. Por ejemplo, un ratón que comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen VH endógeno por segmentos de gen VH, en donde el reemplazo remueve una secuencia de ADAM6 endógena, puede ser diseñado por ingeniería genática para tener una secuencia de ADAM6 de ratón ubicada dentro de la secuencia que contiene los segmentos de gen VH humanos. La modificación resultante podría generar una secuencia de ADAM6 de ratón (ectópico) dentro de una secuencia de gen humano, y la colocación (ectópica) de la secuencia de ADAM6 de ratón dentro de la secuencia de gen humano puede acercarse a la posición del pseudo-gen de ADAM6 humano (es decir, entre dos segmentos V) o puede acercarse a la posición de la secuencia de ADAM6 de ratón (es decir, dentro de la región intergénica V-D). Las uniones de secuencia resultantes creadas por la unión de una secuencia de ADAM6 de ratón (ectópico) dentro de o adyacente a una secuencia de gen humano (por ejemplo, una secuencia de gen de inmunoglobulina) dentro de la línea germinal del ratón podrían ser novedosas según comparado con la misma posición o una similar en el genoma de un ratón de tipo silvestre.

En varias modalidades, se proporcionan animales no humanos que carecen de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo, en donde la falta de hace que el animal no humano sea infértil, o substancialmente reduzca la fertilidad del animal no humano. En varias modalidades, la falta de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo se debe a una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. Una reducción substancial en fertilidad, por ejemplo, es una reducción en fertilidad (por ejemplo, frecuencia de crianza, cachorros por camada, camadas por año, etc.) de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% o más. En varias modalidades, los animales no humanos son suplementados con un gen de ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un macho del animal no humano, en donde el gen de ADAM6 suplementado u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo rescata la reducción en fertilidad en toda la parte o en una parte substancial. Un rescata de fertilidad en una parte substancial es, por ejemplo, una restauración de la fertilidad de manera que el animal no humano exhibe una fertilidad que es al menos 70%, 80%, o 90% o más según comparado con un sitio de cadena pesada no modificada (es decir, un animal sin una modificación al gen de ADAM6 u ortólogo u homólogo de mismo).

La secuencia que confiere después al animal genéticamente modificado (es decir, el animal que carece de un ADAM6 funcional u ortólogo u homólogo del mismo, debido a, por ejemplo, una modificación de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina), en varias modalidades, se selecciona de un gen de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo. Por ejemplo, en un ratón, la perdida de la función de ADAM6 es rescatada al agregar, en una modalidad, un gen de ADAM6 de ratón. En una modalidad, la pérdida de la función de ADAM6 en el ratón es rescatada al agregar un ortólogo u homólogo de una especie estrechamente relacionada con respecto al ratón, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón de una cepa o especie diferente, una rata de cualquier especie, un roedor; en donde la adición del ortólogo u homólogo al ratón rescata la pérdida de fertilidad debido a la pérdida de la función de ADAM6 o la pérdida de un gen de ADAM6. Los ortólogos y homólogos de otras especies, en varias modalidades, se seleccionan de una especie filogenéticamente relacionada y, en varias modalidades, exhiben un porcentaje de identidad con el ADAM6 endógeno (u ortólogo) que es aproximadamente 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, o 97% o más; y que rescatan la pérdida de fertilidad relacionada con ADAM6 (en un ratón) o relacionada con el ortólogo de ADAM6. Por ejemplo, en una rata macho genéticamente modificada que carece de la función de ADAM6 (por ejemplo, una rata con una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena reemplazada por una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o un knockout en la región de cadena pesada de inmunoglobulina de rata), la pérdida de fertilidad en la rata es rescatada por la adición de un ADAM6 de rata o, en algunas modalidades, un ortólogo de un ADAM6 de rata (por ejemplo, un ortólogo de ADAM6 de otra cepa o especie de rata, o, en una modalidad, de un ratón).

De esta manera, en varias modalidades, los animales genéticamente modificados que no exhiben fertilidad o una reducción de fertilidad debido a la modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 (u ortólogo u homólogo de la misma) o una región reguladora operablemente enlazada con la secuencia de ácido nucleico, comprenden una secuencia de pacido nucleico que complemente, o restaura, la pérdida de fertilidad en donde la secuencia de ácido nucleico que complementa o restaura la pérdida de fertilidad es de una cepa diferente de la misma especie o de una especie filogenéticamente relacionada. En varias modalidades, el completamiento de la secuencia de ácido nucleico es un ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo. En varias modalidades, el completamiento del ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de un animal no humano que está estrechamente relacionado con el animal genéticamente modificado teniendo el defecto de fertilidad. Por ejemplo, cuando en animal genéticamente modificado es un ratón de una cepa particular, un ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional puede ser obtenido de un ratón de otra cepa, o un ratón de una especie relacionada. En una modalidad, cuando el animal genéticamente modificado que comprende el defecto de fertilidad es del orden Rodentia, el ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional es de otro animal del orden de Rodentia. En una modalidad, el animal genéticamente modificado que comprende el defecto de fertilidad es de un suborden Myomoropha (por ejemplo, jerbos, ratones saltarines, hámsteres de tipo ratón, ratas y ratones del Nuevo Mundo, arvicolinos, ratones y ratas muroideos, gerbilinos, ratones espinosos, ratas de crin, ratones trepadores, ratones Petromyscus barbouri, ratas de cola blanca, ratas y ratones de Madagascar, lirones espinosos, ratas topo, ratas de bambú, ratones zokors), y el ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo se selecciona de un animal del orden Rodentia, o del sub orden Myomorpha.

En una modalidad, el animal genéticamente modificado es de la superfamilia Dipodoidea, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Muroidea. En una modalidad, el animal genéticamente modificado es de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Dipodoidea.

En una modalidad, el animal genéticamente modificado es un roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 es de una especie diferente dentro de la superfamilia Muroidea. En una modalidad, el animal genéticamente modificado es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres de tipo ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, arvicolinos), Muridae (ratones y ratas muroideos, gerbilinos, ratones espinosos, ratas de crin), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones Petromyscus barbouri, ratas de cola blanca, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, ratones zokors); y el ortólogo u homólogo de ADAM6 se selecciona de una especie diferente de la misma familia. En una modalidad específica, el roedor genéticamente modificado se selecciona de un ratón o rata muroideo (familia Muridae), y el ortólogo u homólogo de ADAM6 es de una especie seleccionada de un gerbilino, ratón espinoso, rata de crin. En una modalidad, el ratón genéticamente modificado es de un miembro de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 es de una especie diferente de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor genéticamente modificado es un ratón de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 es de una rata, gerbilino, ratón espinoso, o rata de crin de la familia Muridae.

En varias modalidades, uno o más ortólogos u homólogos de ADAM6 de roedor o fragmentos funcionales de los mismos de un roedor en una familia restaura la fertilidad para un roedor genéticamente modificado de la misma familia que carece de un ortólogo u homólogo de ADAM6 (por ejemplo, Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, arvicolinos), Muridae (ratones y ratas muroideos, gerbilinos, ratones espinosos, ratas de crin)).

En varias modalidades, los ortólogos, homólogos de ADAM6 y fragmentos de los mismos se analizan para funcionalidad al determinar si el ortólogo, homólogo o fragmento restaura la fertilidad para un animal no humano macho genéticamente modificado que carece de la actividad de ADAM6 (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, que comprende un knockout de ADAM6 o su ortólogo). En varias modalidades, la funcionalidad se define como la habilidad de un esperma de un animal genéticamente modificado que carece de un ADAM6 endógeno u ortólogo u homólogo del mismo para emigrar a un oviducto y fertilizar un óvulo de la misma especie del animal genéticamente modificado.

En varios aspectos, los ratones que comprenden eliminaciones o reemplazos del sitio de región variable de cadena pesada endógena o sus porciones pueden hacerse para que contengan una secuencia de nucleótido ectópica que codifica una proteína que confiere beneficios de fertilidad similares al ADAM6 de ratón (por ejemplo, un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en una ratón). La secuencia de nucleótido ectópica puede incluir una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que es un homologo u ortólogo de ADAM6 (o fragmento del mismo) de una cepa de ratón diferente o una especie diferente, por ejemplo, una especie de roedor diferente, y que confiere un beneficio en fertilidad, por ejemplo, número incrementado de camadas durante un período específico de tiempo, y/o número incrementado de cachorros por camada, y/o la habilidad de un espermatozoide de una ratón macho a atravesar a través de un oviducto de ratón para fertilizar el huevo de un ratón.

En una modalidad, el ADAM6 es un homólogo u ortólogo que es al menos de 89% a 99% idéntico a una proteína ADAM6 de ratón (por ejemplo, de al menos 89% a 99% idéntico al ADAM6a de ratón o ADAM6b de ratón). En una modalidad, la secuencia de nucleótido ectópica codifica una o más proteínas independientemente seleccionadas de una proteína al menos 89% idéntica al ADAM6a de ratón, una proteína al menos 89% idéntica al ADAM6b de ratón, y una combinación de las mismas. En una modalidad, el homólogo u ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón, o cobayo que está o se modifica para ser aproximadamente 89% idéntica a ADAM6 de ratón y/o ADAM6b de ratón. En una modalidad, el homólogo u ortólogo está o es al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a un ADAM6 de ratón y/o ADAM6b de ratón.

En un aspecto, se proporcionan ratones no humanos, en donde los animales no humanos comprenden (a) una inserción de uno o más segmentos de gen VX y JX humano corriente arriba de una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana, (b) una inserción de uno o más segmentos de gen VH, uno o más segmentos de gen DH y uno o más segmentos de gen JH corriente arriba de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, y (c) una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, las regiones constantes de cadena pesada y/o ligera no humanas son regiones constantes de ratón (por ejemplo, seleccionadas de regiones constantes de ratón, rata o hámster). En una modalidad, la región constante de cadena ligera no humana es una región constante de roedor. En una modalidad específica, la región constante de cadena ligera es una región CK de ratón o una CK de rata. En una modalidad específica, la región constante de cadena ligera es una región C de ratón o una CK de rata. Los animales no humanos adecuados incluyen roedores, por ejemplo, ratones, ratas y hámsteres. En una modalidad, el roedor es un ratón o una rata.

En una modalidad, el animal no humano comprende de al menos 12 a al menos 40 segmentos de gen nl y al menos un segmento de gen l humano. En una modalidad específica, el animal no humano comprende 12 segmentos de gen \/l humano y al menos un segmento de gen ?l humano. En una modalidad específica, el animal no humano comprende 28 segmentos de gen nl humano y al menos un segmento de gen J humano. En una modalidad, el animal no humano comprende 40 segmentos de gen nl humano y al menos un segmento de gen ?l humano. En varias modalidades, al menos un segmento de gen ?l humano se selecciona de ?l1 , ?l2, ?l3 y ?l7. En una modalidad específica, el animal no humano comprende al menos cuatro segmentos de gen JX humano. En una modalidad, al menos los cuatro segmentos de gen ?l humano comprenden al menos J l 1 , ?l2, ?l3 y ?l7.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma es ectópica en el animal no humano. En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma (que es funcional en el animal no humano) está presente en la misma ubicación según comparado con un sitio de ADAM6 no humano de tipo silvestre. En una modalidad, el animal no humano es un ratón y la secuencia de nucleótido codifica una proteína ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma y está presente en una ubicación ectópica en el genoma del animal no humano. En una modalidad, el animal no humano es un ratón y la secuencia de nucleótido codifica una proteína ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma y está presente dentro de segmentos de gen de inmunoglobulina. En una modalidad específica, los segmentos de gen de inmunoglobulina son segmentos de gen de cadena pesada. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena pesada son humanos. En una modalidad, los segmentos de gen de cadena pesada son segmentos de gen de cadena pesada endógenos del animal no humano. En una modalidad, el ratón comprende una secuencia contigua ectópica que comprende uno o más segmentos de gen de cadena pesada endógenos no reclasificados, y la secuencia de ADAM6 está dentro de la secuencia contigua ectópica.

En una modalidad, el animal no humano carece de un segmento de gen VL y/o JL de inmunoglobulina endógena en un sitio de cadena delgada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad, el animal no humano comprende segmentos de gen VL y/o JL de inmunoglobulina endógena que son incapaces de reclasificación para formar un dominio VL de inmunoglobulina en el animal no humano. En una modalidad, todos o substancialmente todos los segmentos de gen VK y JK de inmunoglobulina endógena son reemplazados por uno o más segmentos de gen nl y ?l humano. En una modalidad, todos o substancialmente todos los segmentos de gen nl y ?l de inmunoglobulina endógena son reemplazados por uno o más segmentos de gen nl y ?l humano. En una modalidad, todos o substancialmente todos los segmentos de gen VL y JL están intactos en el animal no humano y el animal no humano comprende uno o más segmentos de gen /l humano y uno o segmentos de gen ?l humano insertados entre segmentos de gen VL y/o JL de inmunoglobulina endógena y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, los segmentos de gen VL y JL de inmunoglobulina endógena se hacen incapaces de reclasificación para formar un dominio VL de un anticuerpo en el animal no humano. En varias modalidades, el sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena del animal no humano es un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina K. En varias modalidades, el sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena del animal no humano es un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina l. En varias modalidades, los segmentos de gen VL y JL de inmunoglobulina endógena son segmentos de gen VK y JK. En varias modalidades, los segmentos de gen VL y JL de inmunoglobulina endógena son segmentos de gen Ul y ?l.

En una modalidad, el animal no humano además comprende una región intergénica VK-J K humana de un sitio de cadena ligera k humana, en donde la región intergénica VK-JK humana es contigua con uno o más de los segmentos de gen VX y JX humano. En una modalidad específica, la región intergénica VK-JK humana está colocada entre un segmento de gen VX humano y un segmento de gen JX humano.

En un aspecto, se proporcionan células y/o tejidos derivados de animales no humanos como se describe aquí, en donde las células y/o tejidos comprenden (a) una inserción de uno o más segmentos de gen VX humano corriente arriba de una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana, (b) una inserción de uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano y uno más segmentos de gen JH humano corriente arriba de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, y (c) una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, las regiones constantes de cadena pesada y/o ligera no humanas son regiones constantes de ratón. En una modalidad, las regiones constantes de cadena pesada y/o ligera no humanas son regiones constantes de rata. En una modalidad, las regiones constantes de cadena pesada y/o ligera no humanas son regiones constantes de hámster.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma es ectópica en la célula y/o tejido. En una modalidad, la secuenciad e nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma está presente en la misma ubicación según comparado con un sitio de ADAM6 no humano de tipo silvestre. En una modalidad, la célula y/o tejido no humano se deriva de un ratón y la secuencia de nucleótido codifica una proteína ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma y está presente en una ubicación ectópica. En una modalidad, la célula y/o tejido no humano se deriva de un ratón y la secuencia de nucleótido codifica una proteína ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma y está presente dentro de segmentos de gen de inmunoglobulina. En una modalidad específica, los segmentos de gen de inmunoglobulina son segmentos de gen de cadena pesada. En una modalidad, una secuencia contigua de segmentos de gen de cadena pesada endógeno se coloca de manera ectópica en el animal no humano, en donde la secuencia contigua de segmentos de gen de cadena pesada endógeno ectópicamente colocados comprenden un gen ADAM6 que es funcional en el ratón (por ejemplo, en una ratón macho).

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano como se describe aquí para hacer una proteína de unión a antígeno, en donde el animal no humano expresa (a) un anticuerpo que comprende (i) una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio \/l humano y una región constante de cadena ligera no humana, y (ii) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un dominio VH humano y una región constante no humana; y (b) una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es humana. En una modalidad, el animal no humano es un roedor y las regiones constantes no humanas son regiones constantes de roedor. En una modalidad específica, el roedor en un ratón.

En un aspecto, se proporciona una celula o tejido no humano derivado de un animal no humano como se describe aquí. En una modalidad, la célula o tejido no humano comprende uno o más segmentos de gen \/l de inmunoglobulina humana y al menos un o más segmentos de gen J de inmunoglobulina humana contiguos con el gen de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana y uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano y uno o más segmentos de gen JH humano contiguos con el gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, en donde la célula o tejido expresa una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, el gen de región constante de cadena ligera no humana es un CK de ratón o Ol de ratón.

En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma es ectópica. En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma está ubicada en una posición que es igual a la de una célula no humana de tipo silvestre. En varias modalidades, la célula no humana es una célula B de ratón. En varias modalidades, la célula no humana es una célula madre embriónica.

En una modalidad, el tejido se deriva de bazo, médula ósea o nodos linfáticos del animal no humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula o tejido derivado de un animal no humano como se describe aquí para hacer un hibridoma o cuadroma.

En un aspecto, se proporciona una célula no human que comprende un genoma modificado como se describe aquí, en donde la célula no humana es un ovocito, un embrión huésped, o una fusión de una célula de un animal no humano como se describe aquí y una célula de un animal no humano diferente.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula o tejido derivado de un animal no humano como se describe aquí para hacer un anticuerpo totalmente humano. En una modalidad, el anticuerpo totalmente humano comprende un dominio VH humano y un dominio \ l humano aislados de una animal no humano como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona un método para hacer un anticuerpo que se une a un antígeno de interés, en donde el método comprende, (a) exponer una animal no humano, como se describe aquí, a un antígeno de interés, (b) aislar uno o más linfocitos B del animal no humano, en donde uno o más de los linfocitos B expresa un anticuerpo que une el antígeno de interés, y (c) identificar una secuencia de pacido nucleico que codifica una cadena ligera de ¡nmunoglobulina del anticuerpo que une ese antígeno de interés, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina comprende un dominio nl humano y un dominio constante de cadena ligera no humano, y (d) emplear la secuencia de ácido nucleico de (c) con una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana para hacer un anticuerpo humano que une el antígeno de interés.

En una modalidad, el dominio constante de cadena ligera no humana es un ratón CK. En una modalidad, el dominio constante de cadena ligera no humana es un ratón C . En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho fértil que comprende la modificación en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el ratón macho fértil comprende una secuencia ADAM6 ectópica que es funcional en el ratón macho.

ADAM6 ectópica en ratones con cadena pesada humanizada Desarrollos en activación de gen, por ejemplo, el desarrollo de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), ahora permiten la recombinación de fragmentos genómicos relativamente grandes. La ingeniería de BAC ha permitido la capacidad de elaborar grandes eliminaciones, y grandes inserciones, dentro de células ES de ratón.

Los ratones que toman anticuerpos humanos han estado disponibles por algún tiempo ahora. Aunque representan un avance importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones presentan un número de anormalidades significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, presentan desarrollo de célula B comprometido. El desarrollo comprometido puede ser debido a una variedad de diferencias entre los ratones transgénicos y ratones de tipo silvestre.

Los anticuerpos humanos pueden no interactuar de manera óptima con la célula pre B de ratón o r eceptores de célula B e n la superficie de células de ratón que señalan maduración, proliferación, o supervivencia durante selección clónica. Los anticuerpos completamente humanos pueden no interactuar de manera óptima con un sistema receptor de Fe de ratón; ratones expresan receptores Fe que no presentan una correspondencia uno a uno con receptores Fe humanos. Finalmente, varios ratones que hacen anticuerpos completamente humanos no incluyen todas las secuencias de ratón genumas, por ejemplo, elementos potenciadores corriente abajo y otros elementos de control de sitio, que pueden requerirse para desarrollo de célula B de tipo silvestre.

Los ratones que hacen anticuerpos completamente humanos generalmente comprenden s itios de ¡nmunoglobulina endógenos que son deshabilitados de alguna forma, y transgenes humanos que comprenden segmentos de gen de ¡nmunoglobulina variables y constantes se introducen en una ubicación aleatoria en el genoma de ratón. Siempre y cuando el sitio endógeno se deshabilite lo suficiente para no reclasificar segmentos de gen para formar un gen de ¡nmunoglobulina funcional, la meta de elaborar anticuerpos completamente humanos en tal ratón puede lograrse, a pesar de desarrollo de celula B comprometido.

Aunque se ha forzado a elaborar anticuerpos completamente humanos a partir del sitio del transgen humano, generar anticuerpos humanos en un ratón es aparentemente un procedimiento no favorecido. En algunos ratones, el procedimiento es tan desfavorecido para resultar en la formación de cadenas pesadas variables humanas quiméricas/constantes de ratón (pero no cadenas ligeras) a través del mecanismo de trans-conmutación. Mediante este mecanismo, las transcripciones que codifican anticuerpos completamente humanos se someten a conmutación de isotipo en trans a partir del isotipo humano a un isotipo de ratón. El procedimiento es en trans, debido a que el transgen completamente humano está localizado aparte del sitio endógeno que retiene una copia no dañada de un gen de región constante de cadena pesada de ratón. Aunque en tales ratones la trans-conmutación es fácilmente evidente el fenómeno aún es insuficiente para rescatar desarrollo de célula B, que permanece francamente dañado. En cualquier caso, los anticuerpos trans-conmutados elaborados en tales ratones retienen cadenas ligeras completamente humanas, ya que el fenómeno de trans-conmutación aparentemente no ocurre con respecto a cadenas ligeras; trans-conmutación presumiblemente confía en secuencias de conmutación en sitios endógenos utilizados (a pesar de ser diferente) en conmutación de isotipo normal en cis. De esa forma, incluso cuando ratones diseñados para elaborar anticuerpos completamente humanos seleccionan un mecanismo de trans- conmutación para elaborar anticuerpos con regiones constantes de ratón, la estrategia aún es insuficiente para rescatar desarrollo de celula B normal.

Un problema primario al elaborar terapéuticos humanos basados en anticuerpo es elaborar una diversidad suficientemente grande de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana para identificar dominios variables útiles que específicamente reconocen epítopos particulares y los unen con una afinidad deseable, usualmente, pero no siempre, con alta afinidad. Antes del desarrollo de ratones VELOCIMMUNE® (descritos aquí), no existe ninguna indicación que ratones que expresan regiones variables humanas con regiones constantes de ratón exhiban cualquier diferencia significativa a partir de ratones que elaboraron anticuerpos humanos de un transgen. Sin embargo, esa suposición fue incorrecta.

Los ratones VELOCI MMUNE®, que contienen un reemplazo preciso de regiones variables de inmunoglobulina de ratón con regiones variables de inmunoglobulina humana en los sitios de ratón endógenos, presentan una similitud sorprendente y notable con ratones de tipo silvestre con respecto a desarrollo de célula B. En un desarrollo sorprendente y desconcertante, los ratones VELOCIMMUNE® presentaron una respuesta de tipo silvestre, esencialmente normal a inmunización que difirió únicamente en un aspecto significativo de ratones de tipo silvestre, las regiones variables generadas en respuesta a inmunización son completamente humanas.

Los ratones VELOCIMMUNE® contienen un reemplazo a gran escala, preciso de reglones variables de línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (IgH) y cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena ligera K, Igx) con regiones variables de inmunoglobulina humana correspondientes, en los sitios endógenos. En total, se reemplazaron aproximadamente seis megabases de sitios de ratón con aproximadamente 1 .5 megabases de secuencia genómica humana. Este reemplazo preciso resulta en un ratón con sitios de inmunoglobulina híbridos que elaboran cadenas pesadas y ligeras que tienen regiones variables humanas y una región constante de ratón. El reemplazo preciso de segmentos VH-DH-J H y VK-JK de ratón dejan secuencias de ratón de flanqueo intactas y funcionales en los sitios de inmunoglobulina híbrida. El sistema inmune humoral del ratón funciona como aquel de un ratón de tipo silvestre. El desarrollo de celula B es ininterrumpido en cualquier aspecto significativo y se genera una diversidad rica de regiones variables humanas en el ratón con reto de antígeno.

Los ratones VELOCI MMUNE® son posibles debido a que los segmentos de gen de inmunoglobulina para cadenas pesadas y ligeras k se reclasifican similarmente en humanos y ratones, y no se dice que sus sitios sean los mismos o incluso casi los mismos, claramente no lo son. Sin embargo, los sitios son suficientemente similares y puede lograrse humanización del sitio de gen de variable de cadena pesada al reemplazar aproximadamente tres millones de pares bases en secuencia de ratón contigua que contiene todos los segmentos de gen VH, DH, y JH con aproximadamente un millón de bases de secuencia genómica humana contigua que cubre básicamente la secuencia equivalente de un sitio de ¡nmunoglobulina humana.

En algunas modalidades, un reemplazo adicional de ciertas secuencias de gen de región constante con secuencias de gen humano (por ejemplo, reemplazo de secuencia CH 1 de ratón con secuencia CH1 humana, y reemplazo de secuencia CL de ratón con secuencia CL humana) resulta en ratones con sitios de ¡nmunoglobulina híbrida que elaboran anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, elaborar fragmentos de anticuerpo completamente humanos, por ejemplo, Fab completamente humano. Los ratones con sitios de ¡nmunoglobulina híbrida exhiben reclasificación de segmento de gen variable normal, híper-permutación somática normal, y conmutación de clase normal. Estos ratones exhiben un sistema inmune humoral que se puede distinguir de ratones de tipo silvestre, y presentan poblaciones de celula normales en todas las etapas de desarrollo de célula B y estructuras de órgano linfoide normales, incluso en donde los ratones carecen de un repertorio completo de segmentos de gen de región variable humana. La inmunización de estos ratones resulta en respuestas humorales resistentes que presentan una gran diversidad de uso de segmento de gen variable.

El reemplazo p reciso de segmentos de gen de región variable de línea germinal de ratón permite la elaboración de ratones que tienen sitios de inmunoglobulina parcialmente humana. Debido a que los sitios de inmunoglobulina parcialmente humana reclasifican, y permutan, y clasifican conmutación manualmente, los sitios de inmunoglobulina parcialmente humana generan anticuerpos en un ratón que comprenden regiones variables humanas. Secuencias de nucleótido que codifican las regiones variables pueden identificarse y clonarse, entonces fusionarse (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso particular, que resulta en un anticuerpo o proteína de unión de antígeno derivada completamente de secuaces humanas.

Se utiliza humanización a gran escala mediante métodos de recombinación para modificar células madre embriónicas de ratón (ES) para reemplazar de manera precisa hasta tres megabases del sitio de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón que incluye esencialmente los tres segmentos de gen VH, DH, y JH de ratón con segmentos de gen humanos equivalentes con hasta una secuencia genómica humana de megabase que contiene algunos o esencialmente todos los segmentos de gen VH, DH y J H humanos. Hasta un segmento de megabase medio del genoma humano que comprende una de dos repeticiones que codifican esencialmente todos los segmentos de gen VK y JK humanos se utilizaron para reemplazar un segmento de tres megabases de la sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que contiene esencialmente los todos los segmentos de gen VK y JK de ratón.

Los ratones con tales sitios de inmunoglobulina reemplazados pueden comprender una alteración o eliminación del sitio ADAM6 de ratón endógeno, que normalmente se encontró entre el segmento de gen VH en su mayoría 3’ y el segmento de gen DH en su mayoría 5’ en el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. La alteración en esta región puede llevar a la reducción o eliminación de funcionalidad del sitio ADAM6 de ratón endógeno. Si se utilizan los segmentos de gen VH en su mayoría 3’ del repertorio de cadena pesada humana en un reemplazo, una región intergenica que contiene un pseudo-gen que parece ser un pseudo-gen ADAM6 humano está presente entre estos segmentos de gen VH, es decir, entre VH1 -2 y VH1 -6 humanos. Sin embargo, los ratones macho que comprenden esta secuencia intergénica humana exhiben una reducción en fertilidad.

Se describen ratones que comprenden los sitios reemplazados como se describió anteriormente, y que también comprenden en una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 de ratón, en donde los ratones exhiben fertilidad esencialmente normal. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica comprende un ADAM6a de ratón y/o una secuencia de ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de los mismos colocados entre un segmento de gen VH1 -2 humano y un segmento de gen VH6-1 humano en un sitio de cadena pesada endógeno modificado. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica es SEC I D NO: 3, colocada entre VH 1 -2 y VH 1 -6 humanos en el sitio de cadena pesada endógena modificada. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de SEC I D NO: 3 son opuestas con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos de gen VH humanos circundantes. Aunque ejemplos aquí muestran rescate de fertilidad al colocar la secuencia ectópica entre los segmentos de gen VH humano indicados, expertos reconocerán que la colocación de la secuencia ectópica en cualquier sitio permisivo de manera de transcripción adecuado en el genoma de ratón (o incluso de manera extracromosómica) se esperará que rescate similarmente fertilidad en un ratón macho.

El fenómeno de complementar un ratón que carece de un sitio de ADAM6 funcional c on una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo es un método general que es aplicable al rescatar cualquiera de los ratones con sitios de ADAM6 endógenos no funcionales o mínimamente funcionales. De esa forma, muchos ratones que comprenden una modificación de alteración de ADAM6 del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina pueden rescatarse con las composiciones y métodos de la invención. Por consiguiente, la invención comprende ratones con una gran variedad de modificaciones de sitios de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden función de ADAM6 endógeno. Algunos ejemplos (no limitantes) se proporcionan en esta descripción. Además de los ratones VELOCI MMUNE® descritos, las composiciones y métodos relacionados con ADAM6 pueden utilizarse en muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando modifican un sitio de cadena pesada en una gran variedad de formas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópica que codifica una proteína de ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen de VH de ratón con uno o más segmentos de gen VH humano, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen DH de ratón y segmentos de gen JH con DH humano y segmentos de gen JH humano; en donde el ratón carece de un CH1 y/o región de bisagra. En una modalidad, el ratón elabora una proteína de unión de dominio variable individual que es un dímero de cadenas de ¡nmunoglobulina seleccionadas de: (a) VH - humanos - CH1 de ratón -CH2 - de ratón - CH3 - de ratón; (b) VH humano - bisagra de ratón -CH2 de ratón - CH3 de ratón; y, (c) VH - humano - CH2 de ratón - CH3 de ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótido que rescata la fertilidad se coloca dentro de una secuencia de región variable de cadena pesada de ¡nmunoglobulina humana (por ejemplo, entre segmentos de gen VH 1 -2 y VH 1 -6 humano.) En un ratón que tiene un reemplazo de uno o más segmentos de gen variable de cadena pesada de ¡nmunoglobulina de ratón (mVH’s, mDH’s, y/o mJH’s) con uno o más segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanos (hVH’s, hDH’s, y/o hJH’s) y el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos de gen variable de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón (mVK’s, y/o mJK’s) con uno o más segmentos de gen variable de cadena ligera k de inmunoglobulina humana (hV ’s, y/o hJ ’s). En una modalidad, la secuencia de nucleótido se coloca entre un segmento de gen VH1 -2 humano y un segmento de gen VH1 -6 humanos en un ratón VELOCIMMUNE® (US 6,596,541 y US 7, 105,348, incorporados aquí por referencia). En una modalidad, el ratón VELOCIMMUNE® así modificado comprende un reemplazo con todos o sustancialmente todos los segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (todos hVH’s, hDH’s, y hJH’s) y todos o sustancialmente todos los segmentos de gen variable de cadena ligera x de inmunoglobulina humana (hVx’s, y hJic’s).

Una modalidad, uno o más segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprenden aproximadamente tres megabases de sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprenden al menos 89 segmentos de gen VH, al menos 13 segmentos de gen DH con al menos cuatro segmentos de gen JH o una combinación de los mismos del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, uno o más segmentos de gen variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprenden aproximadamente una megabase de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, uno o más segmentos de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprenden al menos 80 segmentos de gen VH, al menos 27 segmentos de gen DH, al menos seis segmentos de gen JH, o una combinación de los mismos de un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón comprenden aproximadamente tres megabases del sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, uno o más segmentos de gen variable de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón comprenden ai menos 137 segmentos de gen VK, al menos cinco segmentos de gen JK O una combinación de los mismos del sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina ratón. En una modalidad, uno o más segmentos de gen variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humana comprenden aproximadamente media megabase de un sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humana comprenden la repetición próxima (con respecto a la región constante k de inmunoglobulina) de un sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina humana. En una modalidad, uno o más segmentos de gen variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humana comprenden al menos 40 segmentos de gen VK , al menos cinco segmentos de gen JK o una combinación de los mismos de un sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, se coloca la secuencia de nucleótido entre dos segmentos de gen de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los dos segmentos de gen de inmunoglobulina humana son segmentos de gen de cadena pesada.

En un aspecto, un sitio de ADAM6 de ratón funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente a la mitad de segmentos de gen de ratón que están presentes en sitio de región variable de cadena pesada de ratón endógeno, dicho sitio incapaz de reclasificación para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región constante de cadena pesada endógena. En una modalidad, el sitio de cadena pesada de ratón endógena comprende al menos uno y hasta 89 segmentos de gen VH, al menos uno y hasta 13 segmentos de gen DH, al menos uno y hasta cuatro segmentos de gen JH y una combinación de los mismos. En varias modalidades, un sitio de ADAM6 de ratón funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) codifica una o más proteínas ADAM6 que son funcionales en el ratón, en donde la una o más proteínas ADAM6 comprenden SEC I D NO: 1 , SEC ID NO: 2 y/o una combinación de los mismos.

En un aspecto, un sitio de ADAM6 de ratón funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente a la mitad de los segmentos de gen VH humano que reemplazan segmentos de gen VH de ratón endógeno. En una modalidad, se remueven al menos 89 segmentos de gen VH de ratón y se reemplazan con uno o más segmentos de gen VH humano, y en sitio de ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 3’ de los segmentos de gen VH humano, o entre dos segmentos de gen VH humano. En una modalidad específica, en sitio de ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos de gen VH dentro de aproximadamente 20 kilo-bases (kb) hasta aproximadamente 40 kilo-bases (kb) del término 3’ de los segmentos de gen VH humano insertados. En una modalidad específica, en sitio de ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos de gen VH dentro de aproximadamente 29 kb y hasta aproximadamente 31 kb del termino 3’ de los segmentos de gen VH humano insertados. En una modalidad específica, en sitio de ADAM6 de ratón está presente dentro de aproximadamente 30 kb del término 3’ de los segmentos de gen VH humano insertados. En una modalidad específica, en sitio de ADAM6 de ratón está presente dentro de aproximadamente 30, 184 bp del término 3’ de los segmentos de gen VH humano insertados. En una modalidad específica, el reemplazo incluye segmentos de gen VH 1 -2 y VH 1 -6 , y en sitio de ADAM6 ratón está presente hacia abajo del segmento de gen VH1 -2 y hacia arriba del segmento de VH6-1 . En una modalidad específica, el sitio de ADAM6 de ratón está presente entre un segmento de gen VH1 -2 humano y un segmento de gen VH1 -6 humano, en donde el extremo 5’ del sitio de ADAM6 de ratón es aproximadamente 13,848 bp desde el término 3’ del segmento de gen VH 1 -2 humano y el extremo 3’ del sitio de ADAM6 es aproximadamente 29,737 bp 5’ del segmento de gen VH 1 -6 humano.

En una modalidad específica, en sitio de ADAM6 de ratón comprende SEC ID NO: 3 de un fragmento del mismo que confiere la función de ADAM6 dentro de celulas del ratón. En una modalidad específica, la disposición de segmentos de gen VH humano entonces es la siguiente (de corriente arriba a corriente abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos de gen VH humano): VH1 -2 humano -sitio de ADAM6 de ratón - VH1 -6 humano. En una modalidad específica, el pseudo-gen de ADAM6 entre VH1 -2 humano y VH 1 -6 humano se reemplaza con el sitio de ADAM6 de ratón. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del sitio de ADAM6 de ratón es opuesto con respecto a dirección de transcripción cuando se compara con la orientación de los segmentos de gen VH humano. Alternativamente, el sitio de ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento de gen VH humano en su mayoría 3’ y el segmento de gen DH en su mayoría 5’. Esto puede ser el caso si el segmento DH en su mayoría 5’ es de ratón o humano.

Similarmente, un ratón modificado con uno o más segmentos de gen VL humana (por ejemplo segmentos VK O nl) que reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón endógeno pueden modificarse para mantener el sitio de ADAM6 de ratón endógeno, como se describió anteriormente, por ejemplo, al emplear un vector de activación que tiene un brazo de homología corriente abajo que incluye un sitio de ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo, o para reemplazar un sitio de ADAM6 de ratón dañado con una secuencia ectópica colocada entre dos segmentos de gen VL humano o entre los segmentos de gen VL humano y un segmento de gen DH (ya sea humano de ratón, por ejemplo, nl + m/hDH), un segmento de gen J (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, VK + JH)· En una modalidad, el reemplazo incluye dos o más segmentos de gen VL humanos, y el sitio de ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo está presente entre los dos segmentos de gen VL en su mayoría 3’. En una modalidad específica, la disposición de segmentos de gen VL humano entonces es la siguiente (de corriente arriba a corriente abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos de gen humano): VL3’-1 -humano - sitio de ADAM6 de ratón - VL3 humano. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del sitio de ADAM6 de ratón es opuesto con respecto a la dirección de transcripción cuando se compara con la orientación de los segmentos de gen VL humano. Alternativamente, el sitio de ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento de gen VL humano en su mayoría 3’ y el segmento de gen DH en su mayoría 5’. Este puede ser el caso si el segmento DH en su mayoría 5’ es de ratón o humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón con un reemplazo de uno o más segmentos de gen VH de ratón endógeno, y que comprende al menos un segmento de gen DH de ratón endógeno. En tal ratón, la modificación de los segmentos de gen VH de ratón endógeno pueden comprender una modificación de uno o más de los segmentos de gen VH en su mayoría 3’, pero no el segmento de gen DH en su mayoría 5’, en donde se tiene cuidado que la modificación de uno o más segmentos de gen VH en su mayoría 3’ no alteren o presenten el sitio de ADAM6 de ratón endógeno no funcional. Por ejemplo, en una modalidad el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón endógeno con uno o más segmentos de gen VH humano, y el ratón comprende uno o más segmentos de gen DH endógeno y un sitio de ADAM6 de ratón endógeno funcional.

En otra modalidad, el ratón comprende la modificación de segmentos de gen VH en su mayoría 3’ de ratón endógeno, y una modificación de uno o más segmentos de gen DH de ratón endógeno, y la modificación se lleva a cabo para mantener la integridad del sitio de ADAM6 de ratón endógeno al grado que el sitio de ADAM6 endógeno permanece funcional. En un ejemplo, tal modificación se realiza en dos pasos: (1 ) reemplazar los segmentos de gen VH de ratón endógeno en su mayoría 3’ con uno o más segmentos de gen VH humano que emplean un vector de activación con un brazo de homología corriente arriba y un brazo de homología corriente abajo en donde el brazo de homología corriente abajo i ncluye todo o una porción del sitio de ADAM6 de ratón funcional; (2) entonces reemplazar un segmento de gen DH de ratón endógeno con un vector de activación que tiene un brazo de homología ascendente que incluye toda o una porción funcional de un sitio de ADAM6 de ratón.

En varios aspectos, emplear ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un homólogo ortólogo u homólogo o funcional del mismo se utilizan en donde modificaciones alteran la función de ADAM6 de ratón endógeno. La probabilidad de alterar la función de ADAM6 endógeno es alta cuando se elaboran modificaciones a sitios de inmunoglobulina de ratón, en particular cuando se modifican regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y secuencias circundantes. Por lo tanto, tales ratones proporcionan un beneficio particular cuando evaluaron ratones con sitios de cadena pesada de inmunoglobulina que se eliminan en todo o en parte, son humanizados en todo o en parte, o son reemplazados (por ejemplo, con secuencias VK O \/l) en todo o en parte. Métodos para elaborar las modificaciones genéticas descritas para los ratones descritos a continuación se conocen por aquellos expertos en la téenica.

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón, o una proteína sustancialmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína de ADAM6 de ratón, son particularmente útiles en conjunto con modificaciones a un sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que alteran o eliminan la secuencia de ADAM6 de ratón endógena. Aunque se describe principalmente en conexión con ratones que expresan anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, tales ratones son útiles en conexión con cualquier modificación genética que altera genes ADAM6 de ratón endógeno. Los expertos reconocerán que esto abarca una gran variedad de ratones geneticamente modificados que contienen modificaciones de sitios de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Estos incluyen, por ejemplo, ratones con una eliminación o un reemplazo de todos o una porción de segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, sin importar otras modificaciones. Ejemplos no limitantes se describen a continuación.

En algunos aspectos, se proporcionan ratones genéticamente modificados que comprenden un ratón ectópico, roedor, u otro gen ADAM6 (u ortólogo u homólogo o fragmento) funcional en un ratón, y uno o más segmentos de gen de región variable y/o constante de inmunoglobulina humana. En varias modalidades, otros ortólogos u homólogos o fragmentos de gen ADAM6 funcionales en un ratón pueden incluir secuencias de secuencias de bobino, canino, de primate, de conejo u otras no humanas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópica que codifica una proteína de ADAM6 funcional, o reemplazo de todos o sustancialmente todos los genes VH de ratón con uno o más segmentos de gen VH humanos; un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen DH de ratón con uno o más segmentos de gen DH humanos; y un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen JH de ratón con uno o más segmentos de gen JH humano.

En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia de nucleótido CH 1 de ratón con una secuencia de nucleótido CH1 humano. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia de nucleótido de bisagra de ratón con una secuencia de nucleótido de bisagra humana. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de un sitio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL y JL) con un sitio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia de nucleótido de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia de nucleótido de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los VL, J L, y CL son secuencias de cadena ligera k de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el ratón comprende una secuencia de región constante de inmunoglobulina CH2 de ratón y de CH3 de ratón fusionada con una bisagra humana y una secuencia de CH1 humana, de manera que los sitios de inmunoglobulina de ratón se reclasifiquen para formar un gen que codifica una proteína de unión que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región CH1 humana, una región de bisagra humana, y una región de CH2 de ratón y de CH3 de ratón; y (b) un gen que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano y una región constante humana.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópíca que codifica una proteína de ADAM6 funcional, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón con uno o más segmentos de gen VL humano, y opcionalmente un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen DH y/o segmentos de gen JH con uno o más segmentos de gen DH humano y/o segmentos de gen JH , opcionalmente un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen DH y segmentos de gen JH con uno o más segmentos de gen JL humano.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH, DH, y J H con uno o más VL, uno o más DH, y uno o más segmentos de gen J (por ejemplo, (JK y ?l), en donde los segmentos de gen están enlazados de manera operativa a una región de bisagra de ratón endógena, en donde el ratón forma un gen de cadena de inmunoglobulina reclasificada que contiene, desde 5’ hasta 3’ en la dirección de transcripción, humano VL humano - DH humano o de ratón - J humano de ratón - bisagra de ratón - CH2 de ratón - CH3 de ratón. En una modalidad, la región J es una región J humana. En una modalidad, la región J es una región JH humana. En una región, la región J es una región ?l humana. En una modalidad, la región VL humana se selecciona de una región /l humana y una región VK humanos.

En modalidades específicas, el ratón expresa un anticuerpo de dominio variable individual que tiene una región constante de ratón o humana y una región variable derivada de un VK humano, un DH humano y un JK humano; un VK humano, un DH humano, y un JH humano; nl humano, un DH humano, y un Jl humano; un nl humano, un DH humano, y un JH humano; un V* humano, un DH humano, y un ?l humano; un /l humano, un DH humano, y un JK humano. En una modalidad específica, se modifican secuencias de reconocimiento de recombinación para permitir que ocurran reclasificaciones productivas entre segmentos de gen V, D, y J mencionados o entre segmentos de gen V y J mencionados.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópica que codifica una proteína de ADAM6 funcional (ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón con uno o más segmentos de gen VL humano, un reemplazo de todos o sustancialmente todo el segmento de gen DH de ratón y segmentos de gen JH con segmentos de gen JL humano; en donde el ratón carece de una región de CH 1 y/o de bisagra.

En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CH1 - En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica una región de bisagra. En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CH1 y una región de bisagra.

En una modalidad específica, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (l o K) fusionado con un dominio CH2 de ratón que está fijado un dominio CH3 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón con uno o más segmentos de gen VL humano, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos de gen DH y JH de ratón con segmentos de gen JL humano.

En una modalidad, el ratón comprende una eliminación de una secuencia de gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región CH1 . una región de bisagra, una región CH1 y una de bisagra, y una región CH 1 y una región de bisagra y una región CH2.

En una modalidad, el ratón elabora una proteína de unión de dominio de variable individual que comprende un homodímero seleccionado de los siguientes: (a) VL humano - CH1 de ratón - CH2 de ratón - CH3 de ratón; (b) VL humano - bisagra de ratón - CH2 de ratón - CH3 de ratón; (c) VL humanos - CH2 de ratón - CH3 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón con un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada endógena a que comprende un sitio de ADAM6 de ratón endógeno deshabitado o eliminado, en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un anticuerpo humano o de ratón o humano/de ratón u otro quimérico. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgen integrado que está integrado aleatoriamente dentro del genoma de ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico es un episoma (por ejemplo, un cromosoma) no encontrado en un ratón de tipo silvestre.

En una modalidad, el ratón además comprende un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena deshabilitado. En una modalidad específica, el sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena se selecciona de un sitio de cadena ligera kappa (K) y lambda (l). En una modalidad específica, el ratón comprende un sitio de cadena ligera k endógena deshabilitada y un sitio de cadena ligera l deshabitada, en donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un dominio de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el dominio de cadena ligera de inmunoglobulina humana se selecciona de un dominio de cadena ligera k humana y un dominio de cadena ligera l humana. En una modalidad específica, el ratón comprende un sitio de cadena ligera k endógeno o deshabilitado, en donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina humana/de ratón (es decir, variable humana/constante de ratón) y una cadena ligera de inmunoglobulina humana/de ratón que comprende un dominio nl humano. En una modalidad, la cadena ligera de inmunoglobulina humana/de ratón comprende un CK de ratón. En una modalidad, la cadena ligera de inmunoglobulina humana/de ratón comprende un CX de ratón. En una modalidad específica, el CX de ratón es un CX2.

En un aspecto, se proporciona un animal genéticamente modificado que expresa un anticuerpo quimérico y expresa una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma que es funcional en el animal genéticamente modificado.

En una modalidad, el animal genéticamente modificado se selecciona de un ratón y una rata. En una modalidad, el animal genéticamente modificado es un ratón, y la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma es de una cepa de ratón que es una cepa diferente del animal genéticamente modificado. En una modalidad, el animal genéticamente modificado es un roedor de la familia Cricetidae (por ejemplo, un hámster, una rata o ratón del nuevo mundo, un arvicolino), y el ortólogo u homólogo de proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Muridae (por ejemplo, ratón o rata muroideo, gerbilinos, ratón espinoso, rata de crin). En una modalidad, el animal genéticamente modificado es un roedor de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo de proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Cricetidae.

En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y una secuencia de región constante de un corredor. En una modalidad, el roedor se selecciona de un roedor de la familia Cricetidae y un roedor de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es un ratón. En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es una rata. En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y un dominio constante de un animal seleccionado de un ratón o rata; en una modalidad específica, el ratón o rata se selecciona de la familia Cricetidae y la familia Muridae. En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable de cadena pesada humana, un dominio variable de cadena ligera humana y una secuencia de región constante derivada de un roedor seleccionado de ratón y rata, en donde el dominio variable de cadena pesada humana y la cadena ligera humana son cognados. En una modalidad específica, el cognado incluye que los dominios variables de cadena pesada humana y de cadena ligera humana sean de una célula B individual que expresa el dominio variable de cadena ligera humana y el dominio variable de cadena pesada humana juntos y presenten los dominios variables juntos sobre la superficie de una célula B individual.

En una modalidad, el anticuerpo quimérico se expresa de un sitio de inmunoglobulina en una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico se expresa desde un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno reclasificado. En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa desde un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena reclasificada. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un transgen reclasificado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reclasificada derivada de una secuencia de ácido nucleico no reclasificada integrada en el genoma del animal en un sitio diferente a un sitio de inmunoglobulina endógena). En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimerico se expresa a partir de un transgen reclasificado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reclasificada derivada de una secuencia de ácido nucleico no reclasificada integrada en el genoma del animal en un sitio diferente a un sitio de inmunoglobulina endógena).

En una modalidad específica, el transgen se expresa a partir de un sitio activo por transcripción, por ejemplo, un sitio ROSA26, por ejemplo, un sitio de ROSA26 murino (por ejemplo, ratón).

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina inmunizada, en donde el sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada comprende una secuencia de ADAM6 no humana u ortólogo u homólogo de la misma.

En una modalidad, el animal no humano es un roedor seleccionado de un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, el ortólogo u homólogo ADAM6 no humano es una secuencia que se ortóloga y/u homologa a una secuencia de ADAM6 de ratón, en donde el ortólogo u homólogo es funcional en el animal no humano.

En una modalidad, el animal no humano se selecciona de un ratón con una rata, y un hámster y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un animal no humano seleccionado de un ratón una rata y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un ratón y un ortólogo u homólogo de ADAM6 es de un animal que se selecciona de una especie de ratón diferente, una rata, y un hámster.

En una modalidad específica, el animal no humano es una rata, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una especie de rata diferente, un ratón y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un hámster, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de un especie diferente de hámster, un ratón, y una rata.

En una modalidad específica, el animal no humano es del suborden Myomorphia, y la secuencia ADAM6 es de un animal seleccionado de un roedor de la superfamilia Dipodoidea y un roedor de la superfamilia Muroidea. En una modalidad específica, el ratón es un ratón de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es un ratón o una rata o un hámster de la superfamilia Muroidea.

En una modalidad, el sitio de cadena pesada humanizada comprende uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano y uno o más segmentos de gen JH humano. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH humano, y uno o más segmentos de gen DH humano y uno o más segmentos de gen JH humanos se enlazan de manera operativa a uno o más genes de región constante humanos, quiméricos y/o de roedor (por ejemplo, ratón o rata). En una modalidad, los genes de región constante son de ratón. En una modalidad, los genes de región constante son de rata. En una modalidad, los genes de región constante son de hámster. En una modalidad, los genes de región constante comprenden una secuencia seleccionada de una bisagra, un CH2 , un CH3, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, los genes de región constante comprenden una bisagra, un CH2 , y una secuencia de CH3.

En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana es contigua con una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se coloca dentro de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento de gen V, D y/o J.

En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana está yuxtapuesta con un segmento de gen V. En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se coloca entre dos segmentos de gen V. Una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana esta yuxtapuesta entre un segmento de gen V y D. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 de ratón está colocada entre un segmento de gen V y J. En una modalidad, la secuencia ADAM6 de ratón está yuxtapuesta entre un segmento de gen D y uno J.

En aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, que comprende una célula B que expresa un cognado de dominio VH humano y un dominio VL humano de un sitio de inmunoglobulina, en donde el animal no humano expresa una proteína no humana sin inmunoglobulina del sitio de inmunoglobulina. En una modalidad, la proteína no humana sin inmunoglobulina es una proteína ADAM . En una modalidad específica, la proteína ADAM es una proteína ADAM6 u homólogo ortólogo o fragmento funcional de la misma.

En una modalidad el animal no humano es un roedor (por ejemplo, ratón o rata). En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor de la subfamilia Murinae se selecciona de un ratón y una rata.

En una modalidad, la proteína no humana sin inmunoglobulina es una proteína de roedor. En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, los dominios VH y VL humano se fijan directamente o a través de un enlazador a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. En una modalidad específica, la secuencia de dominio constante comprende una secuencia seleccionada de una bisagra, un CH2 y CH3, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el dominio VL humano se selecciona de un dominio Vx o Ml.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, que comprende en su línea germinal una secuencia de inmunoglobulina humana, en donde el esperma de un animal no humano macho está caracterizado por un defecto de migración in vivo. En una modalidad, el defecto de migración in vivo comprende una incapacidad del esperma del animal no humano macho para migrar de un útero a través de un oviducto de un animal no humano hembra de la misma especie. En una modalidad, el animal no humano carece de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En una modalidad específica, la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma incluye una proteína ADAM6a y/o ADAM6b o fragmentos funcionales de la misma. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, se selecciona el roedor de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende una secuencia de inmunoglobulina humana contigua con una secuencia no humana que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos de gen VH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen DH . En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen JH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen VH, uno o más segmentos de gen DH y uno o más segmentos de gen JH.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos de gen VH q ue tienen una alta frecuencia en repertorios humanos naturales. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH no comprenden más de dos segmentos de gen VH, no más de tres segmentos de gen VH, no más de cuatro segmentos de gen VH, no más de cinco segmentos de gen VH, no más de seis segmentos de gen VH, no más de siete segmentos de gen VH, no más de ocho segmentos de gen VH, no más de nueve segmentos de gen VH, no más de 10 segmentos de gen VH, no más de 1 1 segmentos de gen VH, no más de 12 segmentos de gen VH, no más de 13 segmentos de gen VH, no más de 14 segmentos de gen VH, no más de 15 segmentos de gen VH, no más de 16 segmentos de gen VH , no más de 17 segmentos de gen VH, no más de 18 segmentos de gen VH, no más de 19 segmentos de gen VH, no más de 20 segmentos de gen VH, no más de 21 segmentos de gen VH, no más de 22 segmentos de gen VH o no más de 23 segmentos de gen VH- En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH comprenden cinco segmentos de gen VH. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH comprenden 10 segmentos de gen VH. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen comprenden 15 segmentos de gen VH - En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH c omprenden 20 segmentos de gen VH.

En varias modalidades, los segmentos de gen se seleccionan de VH6- 1 , VH 1 -2 , VH 1 -3 , VH2-5 , VH3-7 , VH 1 -8 , VH3-9 , VH3- 1 1 , VH3-1 3 , VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1 -45, VH1 -46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61 , VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 y VH3-74. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, y VH6-1. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-18, VH 1 -46, VH 1 -69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 y VH5-51. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH1-15, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-51. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 y VH4-59. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 y VH4-39. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH1-18, VH3-23 y VH4-39. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH3-21, VH3-23 y VH3-30. En varias modalidades, los segmentos de gen VH se seleccionan de VH3-23, VH3-30 y VH4-39.

En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 18 segmentos de gen VH, 27 segmentos de gen DH y seis segmentos de gen JH. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 39 segmentos de gen VH, 27 segmentos de gen DH y seis segmentos de gen JH- En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 80 segmentos de gen VH, 27 segmentos de gen DH y seis segmentos de gen JH.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón, y el ratón comprende un reemplazo de segmentos de gen VH de ratón endógeno con uno o más segmentos de gen VH humano, en donde los segmentos de gen VH humano están enlazados operativamente a un gen de región CH d e ratón, de manera que el ratón reclasifique I os segmentos de gen VH humanos y exprese una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio VH humano y un CH de ratón. En una modalidad, 90-100% de segmentos de gen VH de ratón no reclasificados se reemplazan con al menos un segmento de gen VH humano no reclasificado. En una modalidad específica, todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VH de ratón endógeno se reemplazan con al menos un segmento de gen VH humano no reclasificado. En una modalidad, el reemplazo es con al menos 19, al menos 39, o al menos 80 u 81 segmentos de gen VH humano no reclasificados. En una modalidad, el reemplazo es con al menos 12 segmentos de gen VH humanos no reclasificados funcionales, al menos 25 segmentos de gen VH humano no reclasificados funcionales, o al menos 43 segmentos de gen VH humano no reclasificados funcionales. En una modalidad, el ratón compren un reemplazo de todos los segmentos DH y JH de ratón con al menos un segmento DH humano no reclasificado y al menos un segmento JH humano no reclasificado. En una modalidad, el por lo menos un segmento DH humano no reclasificado se selecciona de 1 - 1 , 1 -7, 1 -26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el por lo menos un segmento JH humano no reclasificado se selecciona de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen VH humanos se selecciona de un 1 -2, 1 -8, 1 -24, 1 -69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-1 1 , 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31 , 4-39, 4-59, 5-51 , un 6-1 segmento de gen VH humano, y una combinación de los mismos.

En varias modalidades, la secuencia de inmunoglobulina humana está en enlace operable con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, el roedor, por ejemplo, el ratón, rata o hámster). En una modalidad, la región constante es un humano, humano/ratón quimérico o humano/rata quimérico o humano/hámster quimérico, o un ratón, una rata, o una región constante de hámster. En una modalidad, es una región constante de roedor (por ejemplo, ratón o hámster). En una modalidad específica, el roedor es un ratón o rata. En varias modalidades, la región constante comprende al menos un dominio CH2 y un dominio CH3.

En una modalidad, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina se localiza en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, el roedor, por ejemplo, el ratón o rata o hámster). En una modalidad, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana se localiza en un sitio de cadena pesada sin inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano, en donde el sitio de cadena no pesada es un sitio activo de manera de transcripción. En una modalidad específica, el sitio de cadena no estaba es un sitio ROSA26.

En varios aspectos, el animal no humano además comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana (por ejemplo, uno o más secuencias V y J de cadena ligera no reclasificadas, o una o más secuencias VJ reclasificadas) en la línea germinal del animal no humano. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia cadena ligera l de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen V l, . En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen ?l. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de gen \/l y uno o más segmentos de gen ?l.

En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 12 segmentos de gen VX y uno o más segmentos de gen ?l. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 12 segmentos de gen /l y cuatro segmentos de gen JX.

En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 28 segmentos de gen nl y un segmento de gen l. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 28 segmentos de gen /l y cuatro segmentos de gen J .

En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 40 segmentos de gen nl y un segmento de gen ?l. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 40 segmentos de gen VX y cuatro segmentos de gen ?l.

En varias modalidades, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana está en enlace operable con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). En una modalidad, la región constante es un humano, humano/roedor quimérico, ratón, rata o hámster) . En una modalidad específica, la región constante es una región constante de ratón o rata. En una modalidad específica, la región constante es una región constante k de ratón (ITICK) o una región constante k de rata (TCK) . En una modalidad específica, la región constante es una región constante l de ratón (mCI) o una región constante l de rata (rCX). En una modalidad, la región CX de ratón es una región Ol2 de ratón.

En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se localiza en un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano. En una modalidad específica, el sitio de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano es un sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el sitio de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano es un sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se localiza en un sitio de cadena ligera sin inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano que es activada a manera de transcripción. En una modalidad específica, el sitio sin inmunoglobulina es un sitio ROSA26.

En un aspecto, se proporciona un método para elaborar un anticuerpo humano, en donde el anticuerpo humano comprende dominios variables derivados de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable codificadas en una célula de un animal no humano como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido que comprende anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se deriva de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable aisladas de un animal no humano como se describe aquí. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo únicamente de cadena pesada. En una modalidad, el polipéptido es un fragmento variable de cadena individual (por ejemplo, un scFv).

En un aspecto, se proporciona uso de un animal no humano como se describe aquí para elaborar un anticuerpo. En varias modalidades, el anticuerpo comprende uno o más dominios variables que se derivan de una o más secuencias de ácido nucleico de región variable aisladas del animal no humano. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden segmentos de gen de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden segmentos de gen de cadena ligera de inmunoglobulina.

Ratones que Expresan Dominios Variables l Humanos Animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, ratones, ratas, etc.) que comprenden una modificación que reduce fertilidad debido a pérdida de una a ctividad de proteína ADAM ( por ejemplo, dependiente de ADAM6) pueden criarse con animales no humanos como se describe aquí que comprenden secuencias variables l humanas en genes ligeros constantes no humanos endógenos, o humanos (por ejemplo, transgénico). Por ejemplo, animales no humanos tales como ratones o ratas que comprenden un gen ADAM6 dañado (o un gen ADAM6 eliminado), por ejemplo, animales con sitios de cadena pesada de inmunoglobulina humanizados, se combinan con ratones que comprenden un sitio de cadena ligera (endógeno o transgénico) que comprenden segmentos l humanos y segmentos J L enlazados a genes de región constante de cadena ligera humana o no humana (por ejemplo ratón o rata endógena), en donde los animales no humanos comprenden una actividad que restaura la fertilidad dependiente de ADAM. La modificación genetica que restaura la fertilidad dependiente de ADAM puede ser en animal no humano, por ejemplo, en un ratón con una cadena pesada humanizada, o en un ratón con segmentos variables l humanizados. La progenie comprende genes que forman una cadena pesada humanizada (es decir, resultan en expresar un dominio variable de cadena pesada humana) y un sitio de cadena ligera humanizada (es decir, resulta en expresar un dominio variable de cadena ligera l, fusionado con una región l o k humana o no humana), en donde los animales exhiben una fertilidad que es incrementada cuando se compara con un ratón que carece de una actividad ADAM6 o actividad de un ortólogo u homólogo de ADAM6.

Los ratones genéticamente diseñados VELOCIMMUNE® comprenden un reemplazo de segmentos de gen V(D)J no reclasificado en sitios de ratón endógeno con segmentos de gen V(D)J humano. Los ratones VELOCI MUNE® expresan anticuerpos quiméricos que tienen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón (ver, por ejemplo, Patente de E. U.A. No. 7,605,237). La mayoría de otros reportes se refieren a ratones que expresan anticuerpos completamente humanos de transgenes completamente humanos en ratones que tienen sitios de inmunoglobulina endógenos deshabitados.

Se codifican cadenas ligeras de anticuerpo por uno de dos sitios separados: kappa (K) y lambda (l). Las cadenas ligeras de anticuerpo de ratón son principalmente del tipo K. LOS ratones que forman anticuerpos de ratón, y ratones modificados que elaboran anticuerpos completamente humanos o humanos - de ratón quiméricos, presentan una desviación en uso de cadena ligera. Los seres humanos también exhiben desviación de cadena ligera, pero no se pronuncian así como en ratones; la relación de cadenas ligeras k a cadenas ligeras l en ratones es aproximadamente 95:5, mientras en humanos la relación es aproximadamente 60:40. La desviación más pronunciada en ratones no se piensa que afecte severamente diversidad de anticuerpo, debido a que en ratones en sitio variable l no es tan diverso en el primer caso. Esto no es así en seres humanos. El sitio de cadena ligera l humana es ricamente diverso.

El sitio de cadena ligera l humana se extiende sobre 1 ,000 kb y contiene más de 80 genes que codifican segmentos variables (V) o de unión (J) (Figura 19). Dentro del sitio de cadena ligera l humana, más de la mitad de todos los dominios \/l observados se codifican por los segmentos de gen 1 -40, 1 -44, 2-8, 2-14, y 3-21 . En general, aproximadamente 30 o parte de los segmentos de gen \/l humanos se cree que son funcionales. Existen siete segmentos de gen J únicamente cuatro de los cuales se consideran como segmentos de gen ?l generalmente funcionales, J l 1 , J 2, ?l3, y ?l7.

En sitio de cadena ligera l en humanos es similar en estructura al sitio l tanto de ratones como de humanos en cuanto a que el sitio de cadena ligera l humana tiene varios segmentos de gen de región variable que son capaces de recombinarse para formar una proteína de cadena ligera funcional. El sitio de cadena ligera l humana contiene aproximadamente 70 segmentos de gen V y 7 pares de segmentos de gen ?l-Ol. Únicamente cuatro de estos pares de segmentos de gen ?l-Ol parecen ser funcionales. En algunos alelos, un qumto par de segmentos de gen l-Ol es de manera reportado a un pseudo-gen (Ol6). Los 70 segmentos de gen l parecen contener 38 segmentos de gen funcionales. Las 70 secuencias \/l se disponen en tres grupos, de los cuales todos contienen diferentes miembros de distintos grupos de familia de gen V (grupos A, B y C; Figura 19). Esta es una fuente potencialmente rica de diversidad relativamente descubierta para generar anticuerpos con regiones V humanas en animales no humanos.

En contraste severo, el sitio de cadena ligera l de ratón contiene únicamente dos o tres (dependiendo de las cepas) segmentos de gen de región \/l de ratón (Figura 20). Al menos por esta razón, no se pensó que la desviación k severa en ratones es particularmente perjudicial a la diversidad de anticuerpo total.

De acuerdo con mapas publicados del sitio de cadena ligera l de ratón, el sitio consiste esencialmente de dos grupos de segmentos de gen con un intervalo de aproximadamente 200 kb (Figura 20). Los dos grupos contienen dos conjuntos de genes V, J, y C que son capaces de reclasificación independiente: nl2-?l2-?l2-?l4-Ol4 y Ol1 -?l3-Ol3-?l1 -Ol1 . Aunque V l 2 se ha encontrado que se recombina con todos los segmentos de gen ?l, \/l1 parece recombinarse de manera exclusiva con Ol1 . Se cree que Ol4 es un pseudo-gen con sitios de empalme defectuosos.

El sitio de cadena ligera k de ratón es bastante diferente. La estructura y número de segmentos de gen que participan en los segmentos de recombinación que llevan a una proteína de cadena ligera funcional desde el sitio k de ratón es mucho más complejo (Figura 21 ). De esa forma, las cadenas ligeras de ratón l no contribuyen ampliamente a la diversidad de una población de anticuerpo en un ratón típico.

Explotar la diversidad rica del sitio de cadena ligera l humana en ratones probablemente resultaría, entre otras cosas, en una fuente de un repertorio humano más completo de dominios V de cadena ligera. Los intentos previos para cubrir esta diversidad utilizaron transgenes humanos que contienen fragmentos del sitio de cadena ligera l humana incorporados aleatoriamente en los genomas de ratón (ver, por ejemplo, US 6,998, 514 y US 7,435,871 ). Los ratones que contienen estos transgenes aleatoriamente integrados expresan de manera reportada cadenas ligeras l completamente humanas, sin embargo, en algunos casos, uno o ambos sitios de cadena ligera endógena permanecen intactos. Esta situación no es deseable ya que las secuencias de cadena ligera l humana contienen con la cadena ligera de ratón (k O l) en el repertorio de anticuerpo expresado del ratón.

En contraste, los inventores describen ratones genéticamente modificados que son capaces de expresar una o más secuencias de ácido nucleico de cadena ligera l directamente desde un sitio de cadena ligera de ratón, incluyendo por reemplazo de un sitio de cadena ligera de ratón endógena. Los ratones genéticamente modificados capaces de expresar secuencias de cadena ligera l humana de un sitio endógeno además pueden criarse a ratones que comprenden un sitio de cadena pesada humana y de esa forma se utilizan para expresar anticuerpos que comprenden regiones V (pesada y ligera) que son completamente humanas. En varias modalidades, las regiones V se expresan con regiones constantes de ratón. En varias modalidades, segmentos de gen de inmunoglobulina de ratón no endógena están presentes y las regiones V se expresan con regiones constantes humanas. Estos anticuerpos se probarían útiles en numerosos aplicaciones, tanto de diagnóstico así como terapeuticas.

Pueden realizarse muchas ventajas para varias modalidades para expresar proteínas de enlace derivadas de segmentos de gen nl y ?l humana en ratones. Pueden realizarse ventajas al colocar secuencias l humanas en sitio de cadena ligera endógena, por ejemplo, el sitio k o l de ratón. Los anticuerpos elaborados de tales ratones pueden tener cadenas ligeras que comprenden dominios nl humanos fusionados con una región CL de ratón, específicamente una región CK O CX de ratón. Los ratones también expresarán dominios \/l humanos que son adecuados para identificación y clonación para uso con regiones CL humanas, específicamente regiones CK y/o CX. Debido a que el desarrollo de célula B en tales ratones es de una u otra forma normal, es posible generar dominios VX compatibles (incluyendo dominios VX somáticamente mutados) en el contexto de cualquiera de regiones Ol o CK.

Los ratones geneticamente modificados se describen y comprenden un segmento de gen \/l no reclasificado en un sitio de cadena ligera k o l de inmunoglobulina. Los ratones que expresan anticuerpos que comprenden una cadena ligera que tiene un dominio nl humano fusionado con una región CK y/o CX se describen.

En un aspecto, un dominio no humano genéticamente modificado se describe y comprende (1 ) uno o más segmentos de gen V humano no reclasificado y uno o más segmentos de gen ?l humano no reclasificado en un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena del animal no humano, (2) uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano, y uno o más segmentos de gen JH humano en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del animal no humano, en donde el animal no humano es capaz de expresar una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6 es funcional en un macho del animal no humano. En un aspecto, un animal no humano genéticamente modificado se describe y expresa anticuerpos que contienen cadenas pesadas que comprenden dominios VH humanos y regiones constantes de cadena pesada no humana y cadenas ligeras que comprenden dominios VA, humanos y regiones constantes de cadena ligera no humana, en donde los animales no humanos son capaces de expresar una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En varias modalidades, el animal no humano es un roedor. En una modalidad, el roedor es un ratón o una rata.

En una modalidad, el dominio constante de cadena ligera no humano es un dominio CK O Ol. En una modalidad, la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma se codifica por una secuencia ectópica en la línea germinal del ratón. En una modalidad, la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma se codifica mediante una secuencia endógena del animal no humano.

En una modalidad, el sitio de cadena ligera endógena del animal no humano es un sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina. En una modalidad, el sitio de cadena ligera endógena del animal no humano es un sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina.

En una modalidad, el animal no humano carece de un segmento de gen VL y J L endógeno en el sitio de cadena ligera endógena. En una modalidad específica, el segmento de gen VL y J L es un segmento de gen VK y/o JK. En una modalidad específica, el segmento de gen VL y JL es un segmento de gen \/l y J .

En una modalidad, los segmentos de gen VL y J L del animal no humano se reemplazan por uno o más segmentos de gen \/l humano y uno o más Jl humanos. En una modalidad específica, los segmentos de gen VL y J L de los segmentos del animal no humano son segmentos de gen K. En una modalidad específica, los segmentos de gen VL y J L del animal no humano son segmentos de gen l.

En una modalidad, uno o más de los segmentos de gen nl son de un fragmento del grupo A del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo A se extiende desde V 3-27 humano a través de nl3- 1 humano. En una modalidad específica, el fragmento del grupo A se extiende desde \/l3-12 humano a través de ?l1 humano. En una modalidad, uno o más segmentos de gen nl humano son desde un fragmento de grupo B del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo B s e extiende desde nl5-52 humano a través de nl1 -40 humano. En una modalidad específica, uno o más segmentos de gen nl humanos son de un fragmento del grupo A y de un fragmento del grupo B del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana como se describe aquí.

En una modalidad, el animal no humano comprende al menos 12 segmentos de gen \/l humano. En una modalidad, el animal no humano comprende al menos 28 segmentos de gen \/l humano. En una modalidad, el animal no humano comprende al menos 40 segmentos de gen \/l humano.

En una modalidad, el por lo menos un segmento de gen ?l humanos se selecciona del grupo que consiste de ?l1 , ?l2, ?l3, ?l7, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, se proporciona un animal macho no humano fértil, en donde el animal no humano fértil expresa (1 ) una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio \/l humano o dominio VK humano, y (2) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un dominio VH humano, en donde el animal no humano macho comprende un sitio de región variable de cadena pesada modificado y un gen ADAM6 ectópico que es funcional en el animal no humano macho. En una modalidad, el animal no humano macho es un ratón.

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano como describe aquí para elaborar una proteína de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es humana. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno comprende un dominio VH humano y/o un dominio \/l humano derivado de un animal no humano como se describe aquí.

En un aspecto, se proporciona una célula o tejido derivado de un animal no humano como se describe aquí. En una modalidad, el tejido es derivado de un bazo, médula ósea o un nodo linfático. En una modalidad, la célula es una célula B. En una modalidad, la célula es una célula madre embriónica (ES). En una modalidad, la célula es una célula germinal.

En un aspecto, se proporciona un ovocito que comprende un genoma diploide de un animal no humano genéticamente modificado como se describe aquí.

Transcripciones Estériles del Sitio de Cadena Ligera de Inmunoglobulina k Se reflejan variaciones del tema para expresar secuencias l de inmunoglobulina humana en ratones en varias modalidades de ratones genéticamente modificados capaces de tal expresión. De esa forma, en algunas modalidades, los ratones geneticamente modificados comprenden cierta secuencia(s) no codificante de un sitio h umano. En una modalidad, el ratón genéticamente modificado comprende segmentos de gen \J y ?l humano en un sitio de cadena ligera k e ndógena, y a demás comprende un fragmento genómico d e cadena ligera k humana. En una modalidad específica, el fragmento genómico de cadena ligera k humana es una secuencia no codificante naturalmente encontrada entre un segmento de gen VK humano y un segmento de gen JK humano.

Los sitios de cadena ligera k de humano y de ratón contienen secuencias que codifican transcripciones estériles que carecen de un codón de inicio y un marco de lectura abierto, que se consideran como elementos que regulan transcripción de los sitios de cadena ligera K. Estas transcripciones estériles surgen de una secuencia intergénica localizada corriente abajo o 3’ del segmento de gen VK más próximo y hacia corriente arriba o 5’ del potenciador intrónico de cadena ligera k (EKÍ) que está corriente arriba del gen de región constante de cadena ligera k (CK) . Las transcripciones estériles surgen de la reclasificación de la secuencia intergénica para formar un segmento VKJK 1 fusionado con un CK.

Un reemplazo d el sitio d e cadena ligera k c orriente a rriba del gen CK removería la región intergénica que codifica las transcripciones estériles. Por lo tanto, en varias modalidades, un reemplazo de secuencia de cadena ligera k de ratón corriente arriba del gen CK de ratón con segmentos de gen de cadena ligera l humana resultaría en sitio d e cadena ligera k de ratón humanizada que contiene segmentos de gen VX y JX humano pero no la región intergénica de cadena ligera k que codifica las transcripciones estériles.

Como se describe aquí, la humanización del sitio de cadena ligera k de ratón endógeno con segmentos de gen de cadena ligera l humana, en donde la humanización remueve la región intergénica, resulta en una caída severa en uso del sitio de cadena ligera K, acoplada con un aumento marcado en uso de cadena ligera X. Por lo tanto, aunque un ratón humanizado que carece de la región intergénica es útil en cuanto a que puede hacer anticuerpos con dominios variables de cadena ligera humana (por ejemplo, dominios l o k humano), el uso del sitio disminuye.

También se describe la humanización del sitio de cadena ligera k de ratón endógena con segmentos de gen VX y JX humano acoplados con una inserción de una región intergénica k humana para crear un sitio VX que contiene, con respecto a transcripción, entre el segmento de gen VX humano final y el primer segmento de gen JX humano, una región intergénica K; que exhibe una población de célula B con una expresión superior a un sitio que carece de la región intergénica K. Esta observación es consistente con una hipótesis que la región intergénica, directamente a través de una transcripción estéril, o indirectamente, suprime el uso desde el sitio de cadena ligera X endógena. Bajo tal hipótesis, incluyendo una región intergenica resultaría en una disminución en uso del sitio de cadena ligera l endógena, dejando al ratón una elección restringida pero para emplear el sitio modificado (l en K) para generar anticuerpos.

En varias modalidades, un reemplazo d e secuencia de cadena ligera k de ratón hacia arriba de gen CK de ratón con secuencia de cadena ligera l humana además comprende una región intergénica de cadena ligera k humana dispuesta, con respecto a transcripción, entre la región no trasladada 3’ del segmento de gen en su mayoría 3’ y 5’ al primer segmento de gen ?l humano. Alternativamente, tal región intergénica puede ser omitida de un sitio de cadena ligera k endógena reemplazada (corriente arriba del gen CK de ratón) al elaborar una eliminación en el sitio de cadena ligera l endógena. De forma similar, bajo esta modalidad, el ratón genera anticuerpos a partir de un sitio de cadena ligera k endógeno que contiene secuencias de cadena ligera l humana.

Aspectos para Diseñar, por Ingeniería, Ratones para Expresar Dominios nl Humanos Se describen varios aspectos para elaborar ratones genéticamente modificados que elaboran anticuerpos que contienen una cadena ligera que tiene un dominio nl humano fusionado con una región CL (por ejemplo, CK O CX) endógena. Se describen modificaciones genéticas y, en varias modalidades, comprenden una eliminación de uno o ambos sitios de cadena ligera endógena. Por ejemplo, para eliminar cadenas ligeras l d e ratón del repertorio de anticuerpo endógeno puede elaborarse una eliminación de un primer grupo de gen /l-?l-?l y reemplazo, en todo o en parte, de los segmentos de gen /l-?l de un segundo grupo de gen con segmentos de gen N/l-?l humano. Generalmente, tambien se proporcionan embriones de ratón genéticamente modificado, células, y construcciones de enfoque para elaborar ratones, embriones de ratón, y células.

La eliminación de un grupo de gen nl-?l-Ol endógeno de reemplazo de los segmentos de gen nl-?l de otro grupo de gen nl-?l-Ol endógeno emplea una alteración relativamente mínima en asociación y fusión de región constante de anticuerpo natural en el animal, en varias modalidades, debido a que los genes CX endógenos se dejan intactos y por lo tanto retienen funcionalidad y capacidad normales para asociar con la región constante de una cadena pesada endógena. De esa forma, en tales modalidades la modificación no afecta otras regiones constantes de cadena pesada endógena dependientes de regiones constantes de cadena ligera funcionales para ensamble de una molécula de anticuerpo funcional que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Además, en varias modalidades la modificación no afecta el ensamble de una molécula de anticuerpo limitada a membrana funcional que involucra una cadena pesada endógena y una cadena ligera, por ejemplo, un dominio h /l enlazado a una región CX de ratón. Debido a que se retiene al menos un gen CX funcional en el sitio endógeno, animales que contienen un reemplazo de los segmentos de gen nl-?l de un grupo de gen /l- l-Ol endógeno con segmentos de gen /l-?l humano deben ser capaces de elaborar cadenas ligeras l normales que son capaces de enlazar antígeno durante una respuesta inmune a traves de los segmentos de gen nl-?l humano presentes en el repertorio de anticuerpo expresado en el animal.

Una ilustración esquemática (no a escala) de un grupo de gen \/l-?l-Ol de ratón endógeno s e proporciona en la Figura 20. Como se ilustra, el sitio de cadena ligera l de ratón se organiza en dos grupos de gen, de los cuales ambos contienen segmentos de gen de función capaces de recombinarse para formar una cadena ligera l de ratón de función. El grupo de gen nl1 - l3-Ol3-?l1 -Ol1 de ratón endógeno se elimina por una construcción de activación ( Vector de Activación 1 ) con un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación. El otro grupo de gen endógeno (nl2-nl3-?l2-Ol2-?l4-Ol4) se elimina en parte por una construcción de enfoque (Vector de Activación 2) con un casete de higromicina-timidina cinasa flanqueado por sitios de recombinación. En el segundo evento de activación, se retienen los segmentos de gen endógeno Ol2-?l4-Ol4. La segunda construcción de activación (Vector de Activación 2) se construye utilizando sitios de recombinación que son diferentes que aquellos en la primera construcción de activación (Vector de Activación 1 ) permitiendo con ello la eliminación selectiva del casete de selección después que se ha logrado una activación exitosa. El sitio activado doble resultante se silencia de manera funcional en cuanto a que no puede producirse ninguna cadena ligera l endógena. Este sitio modificado puede utilizarse para el inserción de segmentos de gen nl y ?l humano para crear un sitio l de ratón endógeno que comprende segmentos de gen nl y ?l humano, por lo cual, con recombinación en el sitio modificado, el animal produce l cadenas ligeras que comprenden segmentos de gen nl y ?l humano reclasificados enlazados a un segmentos de gen CX de ratón endógeno.

La modificación genética de un ratón para presentar segmentos de gen l endógeno no funcionales, en varias modalidades, resulta en un ratón que exhibe exclusivamente cadenas ligeras k en su repertorio de anticuerpo, elaborando el ratón útil para evaluar el papel de cadenas ligeras l en la respuesta inmune, y útil para elaborar un repertorio de anticuerpo que comprende dominios VK pero no dominios VX.

Un ratón genéticamente modificado que expresa un h /l enlazado a un gen CX de ratón que ha sido recomendado en el sitio de cadena ligera X de ratón endógeno puede elaborarse mediante cualquier método conocido en la téenica. Una ilustración esquemática (no a escala) del reemplazo de los segmentos de gen nl2-nl3-?l2 de ratón endógeno con segmentos de gen VX y JX humano se proporciona en la Figura 22A. Como se ilustra, el sitio de cadena ligera X de ratón endógeno que ha sido presentado no funcional se reemplaza con una construcción de activación (Vector de activación 12/1 -l) que incluye un casete en neomicina flanqueado por sitios de recombinación. Los segmentos de gen VX2-VX3-JX2 son reemplazados con un fragmento genómico que contiene secuencia l humana que incluye 12 segmentos de gen hVX y un segmento de gen h JX individual.

De esa forma, este primer aspecto coloca uno o más segmentos de gen hJX en el sitio de cadena ligera l endógena contigua con un segmento de gen hVX individual (Figura 22A).

Pueden lograrse modificaciones adicionales al sitio de cadena ligera l endógena modificada al utilizar téenicas similares para insertar más segmentos de gen hVX. Por ejemplo, ilustraciones esquemática de dos construcciones de activación adicionales (Vectores de Activación + 16-X y + 12-X) utilizados para inserción progresiva de segmentos de gen hVX humana adicional se proporcionan en la Figura 23A. Como se ilustra, fragmentos genómicos adicionales que contienen segmentos de gen hVX humano específico se insertan en el sitio de cadena ligera l endógena modificada en pasos sucesivos utilizando homología proporcionada por la inserción previa de secuencias de cadena ligera l humana. Con la recombinación con cada construcción de activación ilustrada, en forma secuencial, se insertan 28 segmentos de gen hVX adicionales dentro del sitio de cadena ligera l endógena modificado. Esto crea un sitio quimérico que produce una proteína de cadena ligera l que comprende segmentos de gen VX-JX humano enlazado a un Ol de ratón.

Los aspectos anteriores para insertar segmentos de gen de cadena ligera l humana en el sitio l de ratón, mantiene los potenciadores colocados hacia abajo de los segmentos de gen Ol2-?l4-Ol4 (designados Potenciadores 2.4, Potenciador y Potenciador 3.1 Figuras 22A y Figura 23A). Este aspecto resulta en un alelo modificado individual en el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno (Figura 25A).

Se proporcionan composiciones y métodos para elaborar un ratón que expresa una cadena ligera que comprende segmentos de gen h /l y ?l enlazados de manera operativa a un segmento de gen CX de ratón, incluyendo composiciones y un método para elaborar un ratón que expresa tales genes a partir de un sitio de cadena ligera l de ratón endógena. Los métodos incluyen presentar selectivamente un grupo de gen V -J -CX de ratón endógeno no funcional (por ejemplo, mediante una eliminación activada), y empleando segmentos de gen hVX y ?l en el sitio de cadena ligera l de ratón endógena para expresar un dominio hN/l en un ratón.

Alternativamente, en un segundo aspecto, pueden colocarse segmentos de gen de cadena ligera l humana en el sitio de cadena ligera k endógena. La modificación genética, en varias modalidades, comprende una eliminación del sitio de cadena ligera k endógena. Por ejemplo, para limitar cadenas ligeras k de ratón del repertorio de anticuerpo endógeno puede elaborarse una eliminación de los segmentos de gen VK y JK de ratón. Tambien se proporcionan embriones de ratón genéticamente modificado, células, y construcciones de activación para elaborar los ratones, embriones de ratón, y células.

Por las razones mencionadas anteriormente, la eliminación de los segmentos de gen VK y JK de ratón emplea una alteración relativamente mínima. Se proporcionan una ilustración esquemática (no a escala) de segmentos de gen VK y JK de ratón eliminados en la Figura 21 . Los segmentos de gen VK y JK de ratón endógenos se eliminan a través de eliminación mediada por recombinasa de posición de secuencias de ratón entre dos vectores de activación precisamente colocados cada uno que emplea sitios de recombinación específicos de sitio. Se emplea un primer vector de activación (Vector de activación JK) en un primer evento de activación para eliminar los segmentos de gen JK de ratón. Se emplea un segundo vector de activación (Vector de activación VK) en un segundo evento de activación secuencial para eliminar una secuencia localizada 5’ del segmento de gen VK de ratón más lejano. Ambos vectores de activación contienen sitios de recombinación específicos de sitio permitiendo con ello la eliminación selectiva de ambos casetes de selección y todas las secuencias de cadena ligera k de ratón de intervención después que se ha logrado una activación exitosa. El sitio eliminado resultante es silenciado de manera funcional en cuanto a que no puede producirse ninguna cadena ligera k endógena. Este sitio modificado puede utilizarse para la inserción de segmentos de gen hN/l y ?l para crear un sitio k de ratón endógeno que comprende segmentos de gen hX l y ?l, por lo cual, con la recombinación en el sitio modificado, el animal produce cadenas ligeras l que comprenden segmentos de gen hV y ?l reclasificados enlazados de manera operativa a un segmento de gen CK de ratón endógeno. Pueden utilizarse varios vectores de activación que comprenden secuencias de cadena ligera l humana en conjunto con este sitio k de ratón eliminado para crear un sitio de cadena ligera híbrido que contienen segmentos de gen l humano enlazados de manera operativa con una región CK de ratón.

De esa forma, un segundo aspecto coloca uno o más segmentos de gen nl humano en el sitio de cadena ligera k de ratón contigua con un segmento de gen ?l humano individual (Vector de activación 12/1 -K, Figura 22B).

En varias modalidades, pueden elaborarse modificaciones de este aspecto para agregar segmentos de gen y/o secuencias obligatorias para optimizar el uso de las secuencias de cadena ligera l humana desde el sitio k de ratón dentro del repertorio de anticuerpo de ratón.

En un tercer aspecto, se colocan una o más segmentos de gen hV en el sitio de cadena ligera k de ratón contiguo con cuatro secuencias de gen Ii?l (Vector de activación 12/4-K Figura 22B).

En un tercer aspecto, se colocan uno o más segmentos de gen hV en sitio de cadena ligera k de ratón contiguo con una secuencia ¡ntergénica k humana y una secuencia de gen hJ individual (Vector de activación 1 2(K) 1 -K, Figura 22B).

En un cuarto aspecto, se colocan uno o más segmentos de gen hVX en el sitio de cadena ligera k de ratón contiguo con una secuencia ¡ntergénica k humana a cuatro secuencias de gen Ii?l (Vector de activación 12(K)4-K Figura 22B).

Todos los aspectos anteriores para insertar segmentos de gen de cadena ligera l humana en el sitio k de ratón, mantienen el elemento potenciador intrónico k hacia arriba del gen CK (designados EKÍ ; Figura 22B y Figura 23B) y el potenciador k 3’ del gen CK (designado EK3’, Figura 22B y Figura 23B). Los aspectos resultan en cuatro alelos modificado separados en el sitio de cadena ligera k de ratón endógena (Figura 25B).

En varias modalidades, el ratón genéticamente modificado comprende una eliminación del sitio de cadena ligera l de ratón endógena. En una modalidad, el sitio de cadena ligera l es eliminado por una estrategia que elimina la región que abarca nl2 a J 2, y la región que abarca nl1 a Ol1 (Figura 20). Cualquier estrategia que reduzca o elimine la capacidad del sitio de cadena ligera l endógena para expresar dominios l endógenos es adecuada para usarse con modalidades en esta descripción.

Anticuerpos de Dominio Lambda de Ratones Geneticamente Modificados Los ratones que comprenden secuencias l humanas en cualquiera del sitio de cadena ligera k o l de ratón expresarán una cadena ligera que comprende una región hV/l fusionada a una región CL (CK O Ol) de ratón. Estos se crían ventajosamente a ratones que (a) comprenden u n sitio d e cadena ligera funcionalmente silenciado (por ejemplo, una eliminación del sitio de cadena ligera k o l de ratón endógena); (b) comprenden un sitio de cadena ligera l de ratón endógeno que comprende segmentos de gen hV y hJ enlazados de manera operativa a un gen CX de ratón endógeno; (c) comprenden un sitio de cadena ligera k de ratón endógena que comprende segmentos de gen h /k y hJx enlazados de manera operativa a un gen CK de ratón endógeno; y, (d) un ratón en el cual un alelo k comprende hVKS y hJKs; el otro alelo k comprende hV s y Ii?lb; un alelo l comprende hV s y hJ s y un alelo l silenciado o eliminado, o ambos alelos l que comprenden Ii /le y Ii?lb; y, dos alelos de cadena pesada cada uno que comprende hVHs, hDHs, y hJHs.

Los anticuerpos que comprenden los dominios h /l expresados en el contexto de cualquiera CK O CX se utilizan para elaborar anticuerpos completamente humanos al clonar los ácidos nucleico que codifican los dominios h /l en construcciones de expresión que portan genes que codifican CX humano. Construcciones de expresión resultante son transfectadas en células huésped adecuadas para expresar anticuerpos que presentan un dominio completamente h /l fusionado con hC .

EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir cómo elaborar y utilizar métodos de composiciones de la invención, y no pretende limitar el alcance de lo que consideran los inventores como su invención. A menos que se indique de otra forma, la temperatura se indica en Celsius, y las presiones están en o cerca de la atmosférica.

Ejemplo 1. Humanización de Genes de Inmunoglobulina de Ratón Se utilizaron cromosomas artificiales bacterianos humanos y de ratón (BACs) para diseñar 13 diferentes de vectores de activación BAC (BACvecs) para humanización de los sitios de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera k de ratón. Los Cuadros 1 y 2 mencionan descripciones detalladas de los pasos realizados para la construcción de todos los BACvecs empleados para la humanización de los sitios de cadena de inmunoglobulina y cadena ligera k de ratón, respectivamente.

Identificación de BAC Humanos y de Ratón. BAC de ratón que abarcan los extremos 5’ y 3’ de los sitios de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera k se identificaron mediante hibridización de filtros indicados con biblioteca BAC o por grupos de ADN de biblioteca BAC de ratón de filtración de PCR. Se hibridizaron filtros bajo condiciones estándares utilizando sondas que correspondieron a las regiones de interés. Se filtraron grupos de biblioteca mediante PCR utilizando pares de iniciador único que flanquean la región activada de interés. Se realizó PCR adicional utilizando los mismos iniciadores para desentrelazar una cavidad dada y aislar el BAC correspondiente de interés. Ambos filtros de BAC y grupos de bibliotecas se generaron a partir de 129 células ES de ratón SvJ (Incyte Genomics/lnvitrogen). Se identificaron BAC humanos que cubren toda la cadena pesada de inmunoglobulina y sitios de cadena ligera k ya sea por hibridización de filtros indicados por biblioteca de BAC (bibliotecas de Caltech B, C, o D y biblioteca RPCI-1 1 , Research Genetics/lnvitrogen) a través de filtración de grupos de bibliotecas de BAC humano (bibliotecas Caltech, Invitrogen) por un método basado en PCR o al utilizar una base de datos de secuencia de extremo BAC (biblioteca Caltech D, TIGR).

Construcción de BACvecs mediante recombinación y ligadura homóloga bacteriana. Recombinación homologa bacteriana (BHR) se realizó como se describió (Valenzuela y otros, 2003; Zhang, Y. , Buchholz, F., Muyrers, J. P. , y Stewart, A. F. (1998). A new logic for DANA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). En la mayoría de los casos, se generaron fragmentos lineales al ligar cuadros de homología derivados de PCR a casetes clonados seguidos por aislamiento de gel de productos de ligadura y electroporación en bacterias competentes de BFIR que albergan el BAC objetivo. Después de selección en placas de Petri antibióticas apropiadas, se identificaron BAC correctamente recombinados mediante PCR a través de ambas funciones novedosas seguidas por análisis de restricción en geles de campo pulsado (Schwartz, D.C. y Cantor, C. R. (1984)). Seapration of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 65-75) y revisión de punto mediante PCR utilizando iniciadores distribuidos a través de las secuencias humanas.

Se construyeron 3hVH BACvec utilizando tres pasos de BHR secuenciales para el paso inicial de humanización del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina (Figura 4A y Cuadro 1 ). En el siguiente paso (Paso 1 ), se introdujo un casete en un BAC parental humano hacia arriba desde el segmento de gen VH1 -3 humano que contiene una región de homología al sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB1), un gen que confiere resistencia a canamicina en bacteria y resistencia G418 en células animales (kanR) y un sitio de recombinación específico de sitio (por ejemplo, loxP). En el segundo paso (Paso 2), se introdujo un segundo casete sólo corriente abajo desde el último segmento JH que contiene una segunda región de homología al sitio de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB2) y un gen que confiere resistencia en bacterias a estreptomicina (specR). Este segundo paso incluyó eliminar secuencias de sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humana hacia abajo desde JH6 y el gen de resistencia cloranfenicol de vector BAC (cmR). En el tercer paso (Paso 3), el BAC humano doblemente modificado (B1 ) entonces sea alineó utilizando sitios I- Ceul que han sido agregados durante los primeros dos pasos e integrados en un BAC de ratón (B2) mediante BHR a través de dos regiones de homología (HB1 y HB2). Las selecciones de fármaco para primer (cm/kan), segundo (spec/kan) y tercer (cm/kan) pasos se designaron para ser específicos para los productos deseados. Se analizaron clones de BAC modificados mediante electroforesis de gel que presentado por impulso (PFGE) después de digestión con enzimas de restricción para determinar construcción apropiada (Figura 4B).

En una forma similar, se diseñaron 12 BACvecs adicionales para humanización de los sitios de cadena pesada y cadena ligera K. En algunos casos, se realizó ligadura de BAC en sitio de BHR para unir dos BAC grandes a través de introducción de sitios de restricción raros en ambos BACvecs párenteles mediante BHR junto con colocación cuidadosa de marcadores seleccionables. Esto permitió la supervivencia de producto de ligadura deseado con selección con combinaciones de marcador de fármaco específicas. Se identificaron y filtraron BAC recombinantes obtenidos mediante ligadura después de digestión con enzimas de restricción raras en una forma similar a aquellos obtenidos mediante BHR (como se describió anteriormente).

CUADRO 1 BACvec Paso Descripción Proceso CUADRO 2 BACvec Paso Descripción Proceso Modificación de celulas madre embrionarias (ES) y generación de ratones. Se realizó activación de célula ES (F1 H4) utilizando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® como se describió (Valenzuela y otros, 2003). La derivación de ratones de células ES modificadas por blastocito (Valenzuela y otros, 2003) o inyección de ocho células (Poucymirou y otros, 2007) fue como se describió. Se confirmaron células ES activadas y ratones al filtrar ADN de células ES o ratones con grupos únicos de zonas e iniciadores y un ensayo basado en PCR (por ejemplo, Figura 3A, 3B y 3C). Se revisaron todos los estudios de ratón y se aprobaron por el Comité de Cuidado y Uso Animal Institucional de Regeneración (IACUC).

Análisis de cariotipo e hibridización in situ fluorescente (FISH). Se realizó análisis de cariotipo por Depósitos de Celula de Coriell (Instituto para Investigación Médica de Coriell, Camden, NJ). Se realizó FISH sobre células ES activadas como se describió (Valenzuela y otros, 2003). Se etiquetaron sondas correspondientes a cualquiera de ADN de BAC de ratón o ADN de BAC humano mediante traducción nick (I nvitrogen) con el espectro de nucleótidos dUTP etiquetado de manera fluorescente naranja o verde de espectro (Vysis).

Sitio de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina.

Se logró humanización de la región variable del sitio de cadena pesada en nueve pasos secuenciales por el reemplazo directo de aproximadamente tres millones de pares base (Mb) de secuencia genómica de ratón contigua, todos los segmentos de gen VH, DH, y JH con aproximadamente un Mb de secuencia genómica humana contigua que contiene los segmentos de gen humano equivalentes (Figura 1A y Cuadro 1 ) utilizando teenología de ingeniería genética VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, Patente de E. U.A. No. 6,586,251 y Valenzuela y otros, 2003).

El intrón entre segmentos de gen JH y genes de región constante (el intrón J-C) contiene un potenciador de transcripción (Neuberger, M.S. (1983). Expression and regulation of immunoglobulin heavy Chain gene transfected into lymphoid cells. Embo J 2, 1373-1378) seguido por una región de repeticiones simples requeridas para recombinación durante conmutación de ¡sotipo (Kataoka, T. , Kawakami, T. , Takahashi, N. , y Honjo, T. (1980). Rearrangement of immunoglobulin gamma 1 -chain gene and mechanism for heavy chain class s witch. Proc Nati Acad Sci U S A 77, 919-923). La unión entre región VH-DH-J H humana y la región CH de ratón (la unión próxima) se eligió para mantener el potenciador intrónico de cadena pesada de ratón y con dominio de conmutación con el fin de preservar tanto expresión como clase eficientes cambiando del sitio de cadena pesada humanizado dentro del ratón. La posición exacta de nucleótido de estas uniones subsecuentes de todos los reemplazos fue posible mediante el uso del método de ingeniería genética VELOCIGENE® (anterior), que empleó recombinación homologa bacteriana impulsada por oligonucleótidos sintetizados. De esa forma, se colocó la unión próxima aproximadamente 200 bp hacia abajo desde el último segmento de gen JH y se colocó la unión distal varios cientos hacia abajo del segmento de gen VH en su mayoría 5’ del sitio humano y aproximadamente 9 kb hacia abajo desde el segmento de gen VH1 -86 de ratón, también conocido como J558.55. El segmento de gen VH1 -86 (J558.55) de ratón en el segmento de gen variable de cadena pesada muy distal, reportó ser un pseudo-gen en ratones C57BL/6, pero potencialmente activo, a pesar de tener una deficiente secuencia RSS, en el alelo 129 activado. El extremo distal del sitio de cadena pesada de ratón de manera reportada puede contener elementos de control que regulan expresión de sitio y/o reclasificación (Pawlitzky y otros, 2006).

Una primera inserción de secuencia de ADN de inmunoglobulina humana en el ratón se logró utilizando 144 kb d el extremo próximo del sitio de cadena pesada humana que contiene 3 VH, todos los 27 DH y 9 JH segmentos de gen se insertaron en el extremo próximo del sitio IgH de ratón, con un concomitante de eliminación de 16.6 kb de secuencia genómica d e ratón, utilizando aproximadamente 75 kb d e brazos de homología de ratón (Paso A, Figura 2A; Cuadros 1 y 3, 3hVH). Esta gran inserción 144 kb y eliminación 16.6 kb acompañantes se realizó en un paso individual (Paso A) que ocurrió con una frecuencia de 0.2% (Cuadro 3). Se calificaron células ES correctamente activadas mediante un ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA) (Valenzuela y otros, 2003) utilizando sondas dentro y que flanquean la secuencia de ratón eliminada y dentro de la secuencia mal insertada, y se verificó la integridad de la inserción humana grande utilizando múltiples sondas que abarcan toda la inserción (Figuras 3A, 3B y 3C). Debido a que se anticiparon muchas rondas de activación de célula ES secuencial, clones de célula ES activadas en esto, y todos los pasos subsecuentes se sometieron a análisis cariotípico (anterior) y únicamente se utilizaron aquellos clones que muestran cariotipos normales a al menos en 17 de 20 dispersiones para pasos subsecuentes.

Se volvieron a activar células ES activadas del Paso A con un BACvec que produjo una eliminación de 19 kb en el extremo distal del sitio d e cadena pesada (Paso B, Figura 2A). El paso B B ACvec contuvo un gen de resistencia a higromicina (hyg) en contraste con el gen de resistencia a neomicina (neo) contenido en el BACvec del Paso A. Los genes de resistencia de los dos BACvecs se diseñaron de manera que, con activación exitosa al mismo cromosoma, aproximadamente 3 Mb del sitio de gen variable de cadena pesada de ratón que contiene los tres segmentos de gen VH de ratón diferentes a VH1 -86 y todos los segmentos de gen DH diferentes a DQ52, así como en los dos genes de resistencia, fueron flanqueados por los sitios loxP; DQ52 y todos de los segmentos de gen de cadena JH de ratón se eliminaron en el Paso A. Se identificaron clones de célula ES activadas de manera doble sobre el mismo cromosoma al impulsar el casete próximo 3hVH para homocigosidad en G418 (Mortensen, R. M. y otros (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell Biol 12, 2391 -2395) y después del destino del casete hyg distal. Los segmentos de ratón de hasta 4 Mb de tamaño, que han sido modificados en una forma para ser flanqueada por sitios loxP, se han eliminado exitosamente en células ES mediante expresión transitoria de recombinasa CRE con otras deficiencias (hasta «1 1 %) incluso en la ausencia de selección de fármaco (Zheng, B. y otros (2000) Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP; range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20, 648-655). En una forma similar, los inventores lograron una eliminación de 3 Mb en 8% de clones de células ES después de expresión de CRE transitorio (Paso C, Figura 2A; Cuadro 3). La eliminación se calificó mediante el ensayo LONA utilizando sondas en cualquier extremo de la secuencia de ratón eliminada, así como la perdida de neo y de hyg y la aparición de un producto PCR a través del punto de eliminación que contiene el mismo sitio loxP restante. Además, se confirmó la eliminación mediante hibridización in situ de fluorescencia (datos no mostrados).

El resto de la región variable de cadena pesada humana se agregó al alelo 3hVH en una serie de 5 pasos utilizando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® (Pasos E-H, Figura 2B), con cada paso involucrando inserción precisa de hasta 210 kb d e secuencias de gen humano. Para cada paso, el extremo próximo de cada nuevo BACvec se diseñó para traslaparse con la mayoría de secuencias humanas distales del paso previo y el extremo distal de cada nuevo BACvec contuvo la misma región distal de homología de ratón como se utilizó en el Paso A. Los BACvecs de pasos D, F y H contuvieron casetes de selección de neo, mientras aquellos pasos E y G contuvieron casetes de selección de hyg, de esa forma se alternaron selecciones entre G418 e higromicina. Se analizó la activación en el Paso D por la pérdida del producto de PCR único a través del sitio loxP distal de Alelo Híbrido 3hVH- Se analizó la activación para los Pasos E a I por pérdida de casete de selección previo. En el paso final (Paso I , Figura 2B), el casete de selección de neo, flanqueado por sitios Frt (McLeod, M. y otros ( 1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367) , se removió por expresión de FLPe transitoria (Buchholz, F. y otros (1998) Imporved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). Las secuencias humanas de los BACvecs para Pasos D, E y G se derivaron de dos BAC humanos parenterales cada uno, mientras aquellos de los Pasos F y H fueron de BAC individuales. Se confirmó retención de secuencias humanas en cada paso utilizando múltiples sondas que abarcan las secuencias humanas insertadas (como se describió anteriormente, por ejemplo Figuras 3A, 3B y 3C). Únicamente se transportaron hacia adelante esos clones con potencial de cariotipo y de línea germinal normal en cada paso. Las células ES desde el paso final aún fueron capaces de contribuir a la línea germinal después de nueve manipulaciones secuenciales (Cuadro 3). Fueron viables ratones homocigotos para cada uno de los alelos de cadena pesada, parecieron saludables y mostraron un sistema humoral esencialmente tipo silvestre (ver Ejemplo 3).

CUADRO 3 Alelo Secuencia Construcción de Eficiencia de % VH VH Híbrido Humana Enfoque Enfoque de uso Total Funcional Sitio de Gen Variable de Cadena Ligera k de Inmunoglobulina. La región variable de cadena ligera k se humanizó en ocho pasos secuenciales por el reemplazo directo de aproximadamente 3 Mb de secuencia de ratón que contiene todos los segmentos de gen VK y JK con aproximadamente 0.5 Mb de secuencia humana que contiene los segmentos de gen VK y JK humanos próximos en una forma similar a aquella de la cadena pesada (Figura 1 B; Cuadros 2 y 4).

La región variable del sitio de cadena ligera k humana contiene dos repeticiones de 400 kb casi identica separadas por un separador de 800 kb (Weichhold, G.M. y otros (1993) The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organizaed en oposite polarity. Genomics 16, 503-51 1 ). Debido a que las repeticiones son tan familiares, casi toda la diversidad del sitio puede ser reproducida en ratones al utilizar la repetición próxima. Además, se ha reportado un alelo humano natural del sitio de cadena ligera k que carece de la repetición distal (Schaible, G. y otros (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and halotypes of Causasoid and non-Vaucasoid indivuals. Hum Genet 91 , 261 -267). Los inventores reemplazaron aproximadamente 3 Mb de secuencia de gen variable de cadena ligera k de red ratón con aproximadamente 0.5 Mb de secuencia de gen variable de cadena ligera k humana para reemplazar efectivamente todos los segmentos de gen VK y JK de ratón con el VK humano próximo y todos los segmentos de gen JK humano (Figura 2C y 2D; Cuadros 2 y 4). En contraste con el metodo descrito en el Ejemplo 1 para el sitio de cadena pesada, se eliminó toda la región de gen VK de ratón, que contiene los segmentos de gen VK y JK, en un proceso de tres pasos antes que se agregara cualquier secuencia humana. En primer sitio, se introdujo un casete de neo en el extremo próximo de la región variable (Paso A, Figura 2C). Después, se insertó un casete de hyg en el extremo distal del sitio k (Paso B, Figura 2C). De nuevo se situaron los sitios de LoxP dentro de cada casete de selección de manera que el tratamiento de CRE indujo eliminación de los 3 Mb restantes de la región de VK de ratón junto con ambos genes de resistencia (Paso C, Figura 2C).

Un fragmento genómico humano de aproximadamente 480 kb de tamaño que contiene toda la región variable de cadena ligera k de ínmunoglobulina se insertó en cuatro pasos secuenciales (Figura 2D; Cuadros 2 y 4), con hasta 150 kb de secuencia de cadena ligera k de Ínmunoglobulina humana insertada en un paso individual, utilizando métodos similares a aquellos empleados para la cadena pesada (ver Ejemplo 1 ). Se removió el gen de resistencia a higromicina final por expresión de FLP transitoria. Como con la cadena pesada, se evaluaron clones de célula ES activados para integridad de selección humana completa, cariotipo normal y potencial de línea germinal despues de cada paso. Se generaron ratones homocigotos para cada uno de los alelos de cadena ligera k y se encontró que son saludables y de apariencia normal.

CUADRO 4 Alelo Secuencia Construcción de Eficiencia de % VK VK Híbrido Humana Activación Activación de uso Total Funcional Ejemplo 2. Generación de Ratones Completamente Humanizados por Combinación de Alelos de Inmunoglobulina Humanizados Múltiples En varios puntos, se micromyectaron células ES de los repertorios variables de cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera k humana como se describió en el Ejemplo 1 y los ratones resultantes cultivados para crear múltiples versiones de ratones VELOCIMMUNE® con fracciones progresivamente más grandes de los repertorios de inmunoglobulina de línea germinal humana (Cuadro 5; Figuras 5A y 5B). Los ratones VELOCI MMU NE® 1 (V1 ) poseen 18 segmentos de gen VH humano y todos los segmentos de gen DH humano combinados con 16 segmentos de gen VK humano y todos los segmentos de gen JK humano. Los ratones VELOCIMMUNE® 2 (V2) y VELOCI MMUNE® (V3) han aumentado repertorios variables que portan un total de 39 VH y 30 VK, y 80 VH y 40 VK respectivamente. Ya que la regiones genómicas que codifican los segmentos de gen VH, DH , y J H y segmentos de gen VK y JK, se han reemplazado completamente, anticuerpos producidos por cualquier versión de ratones VELOCIMMUNE® contiene regiones variables humanas enlazadas a regiones constantes de ratón. Los sitios de cadena ligera l de ratón permanecen intactas en todas las versiones de los ratones VELOCI MMUNE® y sirven como un comparador por eficiencia de expresión de los varios sitios de cadena ligera k VELOCI MMU NE®.

Los ratones doblemente homocigóticos para humanizaciones de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera k se generaron de un subgrupo de los alelos descritos en el Ejemplo 1 . Todos los genotipos observados durante el curso de la crianza para generar los ratones doblemente homocigotos ocurrieron aproximadamente en proporciones mendelianas. La progenie macho homocigótica para cada una de uno de los alelos de cadena pesada humana mostró fertilidad reducida. La fertilidad reducida resultó en la pérdida de actividad de ADAM6 de ratón. El sitio de gen variable de cadena pesada de ratón contiene dos genes ADAM6 funcionales incorporados (ADAM6a y ADAM6b). Durante la humanización del sitio de gen variable de cadena pesada de ratón, la secuencia genómica humana insertada contuvo un pseudo-gen ADAM6. ADAM6 de ratón puede ser requerido para fertilidad, y de esa forma carece de genes ADAM6 de ratón en sitios de gen variables de cadena pesada humanizada que pueden llevar a fertilidad reducida en estos ratones sin importar la presencia del pseudo-gen humano. Los Ejemplos 7-9 describen el reemplazo preciso de genes ADAM6 de ratón regresados en un sitio de gen variable de cadena pesada humanizado, y restauración de un nivel tipo silvestre de fertilidad en ratones con un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada humanizada.

CUADRO 5 Versión de ratón Cadena Pesada Cadena ligera k VELOCIMMUNE® V Aleló Gen VH 5' ¡eíó Gen VK humano humano 5’ Ejemplo 3. Poblaciones de Linfocito en Ratones con Genes de Inmunoglobulina Humanizados Se evaluaron poblaciones de celula B maduras en las tres versiones diferentes de ratones VELOCIMMUNE® por citometría de flujo.

Brevemente, se elaboraron suspensiones de célula de médula ósea, base o timo utilizando métodos estándares. Se volvieron a suspender las células en 5x105 células/ml en regulador de pH de tinción BD Pharmigen FACS, bloqueado con CD16/32 anti-ratón (BD Pharmingen) , teñido con el cóctel apropiado de anticuerpos y fijado con BD Cyofix™ todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se volvieron a s uspender gránulos de celulas finales en 0.5 mi de regulador de pH de tinción y se analizaron utilizando un software BD FACS CALI BUR™ y BD CELLQUEST PRO™. Se prepararon todos los anticuerpos (BD Pharmigen) en una dilución/cóctel de masa y se agregaron a una concentración final de 0.5 mg/105 células. Los cócteles de anticuerpo para tinción de médula ósea (A-D) son como a continuación: lgMb-FITC anti-ratón, lgMa-PE anti-ratón, CD45R(B220)-APC anti-ratón; B: CD43(S7)-PE anti-ratón, CD45R(B220)-APC anti-ratón; C: CD24(HSA)-PE antiratón; CD45R(b220)-APC anti-ratón; D: BP-1 -PE anti-ratón, CD45R(B220)-APC anti-ratón. Los cócteles de anticuerpo para tinción de nodo linfático ingumal (E-H) son como a continuación: E: lgMb-FITC anti-ratón, lgMa-PE anti-ratón, CD45R(B220)-APC antiratón; F: FITC de cadena ligera Ig, [1 , [2, [3 anti-ratón, PE de cadena ligera Igi anti-ratón, CD45R(B220)-APC anti-ratón; G: Ly6G/C-FITC anti-ratón, CD49b(DX5)-PE anti-ratón, CD1 1 b-APC antiratón; H: CD4(L3T4)-FITC anti-ratón, CD45R(B220)-PE anti-ratón, CD8a-APC anti-ratón. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Se tiñeron linfocitos aislados del bazo o nodo linfático de ratones VELOCIMMUNE® homocigótica para expresión de superficie de los marcadores B220 e IgM y se analizaron utilizando citometría de flujo (Figura 6). Los tamaños de las poblaciones de célula B madura B220* IgM en todas las versiones de ratones VELOCIMMUNE® probados fueron virtualmente identicos a aquellos de ratones de tipo silvestre, sin importar el número de segmentos de gen VH que contuvieron. Además, ratones que contienen sitios de cadena pesada de inmunoglobulina inmunizados híbridos homocigóticos, incluso aquellos únicamente con 3 segmentos de gen VH pero sitios de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón normal o ratones que contienen sitios de cadena ligera k humanizados híbridos homocigóticos con sitios de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón normal, también tuvieron números normales de células B220+ lgM+ en sus compartimentos periféricos (no mostrados). Estos resultados indican que sitios quiméricos con segmentos de gen variables humanos y regiones constantes de ratón pueden llenar completamente el compartimento de célula B madura. Además, el número de segmentos de gen variable en cualquiera de la cadena pesada o sitios de cadena ligera K, y de esa forma la diversidad teórica del repertorio de anticuerpo, no se correlacionaron con la capacidad de crear poblaciones tipo silvestre de células B maduras. En contraste, los ratones con transgenes de inmunoglobulina completamente humanos aleatoriamente integrados y sitios de inmunoglobulina de ratón inactivados tuvieron números reducidos de células B en estos compartimentos, con la severidad del déficit dependiendo del número de segmentos de gen variables incluidos en el transgen (Green, L.L., y Jakobovits, A. (1998). Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yaest artificial chromosomes. J Exp ed 188, 483-495). Esto demuestra que la estrategia de “humanización genetica in situ" resulta en un resultado funcional fundamentalmente diferente a los transgenes aleatoriamente integrados logrados en el aspecto de “eliminación más transgénico”.

Exclusión Alélica y Elección de Sitio. La capacidad de mantener exclusión alélica se examinó en ratones heterocigóticos por diferentes versiones del sitio de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

La humanización de los sitios de inmunoglobulina se llevó a cabo en una línea F1 ES (F1 H4 (Valenzuela y otros, 2003)), derivado de embriones heterocigóticos 129S6/SvEvTac y C57BL/6NTac. Las secuencias de gen variable de línea germinal de cadena pesada humana se activó al alelo 129S6, que lleva el haplotipo lgMa, mientras el alelo C576BL/6N de ratón no modificado lleva el haplotipo lgMb. Estas formas alélicas de IgM pueden distinguirse por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos a los polimorfismos encontrados en los alelos lgMa o lgMb. Como se muestra en la Figura 6 (fila inferior), las células B i dentificadas en ratones heterocigóticos para cada versión del sitio de cadena pesada humanizada únicamente expresan un alelo individual, ya sea lgMa (el alelo humanizado) o lgMb (el alelo de tipo silvestre). Esto demuestra que los mecanismos involucrados en exclusión alélica son intactos en ratones VELOCI MMUNE®. Además, el número relativo de células B positivas para el alelo humanizado (lgMa) es aproximadamente proporcional al número de segmentos de gen VH presentes. El sitio de inmunoglobulina humanizado se expresa aproximadamente 30% de las celulas B en ratones heterocigóticos VELOCIMMUNE® 1 , que tienen 18 segmentos de gen VH humano, y el 50% de las células B en ratones heterocigóticos VELOCI MMUNE® 2 y 3 (no mostrados), con 39 y 80 segmentos de gen VH humano, respectivamente. Notablemente, la relación de células que expresan los alelos de ratón tipo humanizado contra silvestre (0.5 para ratones VELOCI MMUNE® 1 y 0.9 para ratones VELOCIMMUNE® 2) es mayor que la relación del número de segmentos de gen variable contenidos en los sitios tipo humanizados contra de tipo silvestre (0.2 para ratones VELOCIMMUNE® 1 y 0.4 para ratones VELOCI MMUNE® 2). Esto puede indicar que la posibilidad de elección de alelos intermedia entre una elección aleatoria de uno o el otro cromosoma y una elección aleatoria de cualquier RSS de segmento V particular. Además, puede haber una fracción de células B, pero no toda, en donde un alelo se vuelve accesible para recombinación, completa el proceso y cierra la recombinación antes que el otro alelo se vuelva accesible. Además, la distribución uniforme de células que tienen superficie IgM (slgM) derivadas de cualquiera del sitio de cadena pesada humanizado híbrido o el sitio de cadena pesada de ratón de tipo silvestre es evidencia que el sitio híbrido está operando a un nivel normal. En contraste, los transgenes de inmunoglobulina humana aleatoriamente integrados compiten de manera deficiente con sitios de inmunoglobulina de ratón de tipo silvestre (Bruggemann, M. y otros (1989) Arepertorie of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. PNAS 86, 6709-6713; Green y otros, 1994; Tuaillon, N. y otros (1993) Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombinaction in transgenic mice: gene-segment use in mu y gamma transcripts. Proc Nati Acad Sci USA 90, 3720-3724). Esto además demuestra las inmunoglobulinas producidas por ratones VELOCIMMUNE® que son funcionalmente diferentes a aquellas producidas por los transgenes aleatoriamente integrados en ratones elaborados mediante aspectos de “eliminación más transgenico”.

Polimorfismos de las regiones CK no están disponibles en 129S6 o C57BL/6N para examinar la exclusión alélica de sitios de cadena ligera k humanizados contra no humanizados. Sin embargo, todos los ratones VELOCIMMUNE® poseen sitios de cadena ligera l de ratón de tipo silvestre, por lo tanto, es posible observar si la reclasificación y expresión de sitios de cadena ligera k humanizada puede prevenir expresión de cadena ligera l ratón. La relación del número de células que expresa la cadena ligera k humanizada con relación al número de células que expresan cadena ligera l de ratón fue relativamente sin cambios en ratones VELOCIMMUNE® comparado con el ratón de tipo silvestre, sin importar el número de segmentos de gen VK humano insertados en el sitio de cadena ligera k (Figura 6, tercera fila desde arriba). Además no hubo ningún aumento en el número de células positivas dobles (K más l), indicando que la recombinación productiva en los sitios de cadena ligera k híbridos resulta en su presión apropiada de recombinación de los sitios de cadena ligera l de ratón. En contraste, los ratones que contienen transgenes de cadena ligera k aleatoriamente integrados con sitios d e cadena ligera k de ratón inactivados, pero sitios de cadena ligera l de ratón de tipo silvestre, exhiben relaciones l/k dramáticamente aumentadas (Jakobovits, 1998), que implican que los transgenes de cadena ligera k introducidos no funcionan bien en tales ratones. Esto además demuestra el resultado funcional diferente observado en inmunoglobulinas elaboradas por ratones VELOCIMMUNE® cuando se compara con aquellos elaborados por ratones “eliminado más transgénico”.

Desarrollo de célula B. Debido a que las poblaciones de célula B maduras en ratones VELOCI MMUN E® se parecen a aquellas de los ratones de tipo silvestre (descritos anteriormente), es posible que se compensen defectos en diferenciación de célula B temprana por la expansión de poblaciones de célula B madura. Las varias etapas de diferenciación de célula B se examinaron por análisis de poblaciones de célula B utilizando citometría de flujo. El Cuadro 6 describe la relación de la fracción de células en cada linaje de célula B definido por FAC, utilizando marcadores de superficie de célula específicos, en ratones VELOCIMMUNE® comparados con crías de la misma camada de tipo silvestre.

El desarrollo temprano de célula B ocurre en la médula ósea, y diferentes etapas de diferenciación de célula B se caracterizan por cambios en los tipos y cantidades de expresión en acabado de superficie de celula. Estas diferencias en expresión de superficie se correlacionan con los cambios moleculares que ocurren en los sitios de inmunoglobulina dentro de la célula. La transición de célula pro-B a pre-B requiere la reclasificación y expresión exitosas de proteína de cadena pesada funcional, mientras la transición de la etapa pre-B a B madura es regida por la reclasificación y expresión correctas de una cadena ligera k o l. De esa forma, pueden detectarse transición ineficiente entre etapas de diferenciación de célula B por cambios en las poblaciones relativas de células B en una etapa data.

CUADRO 6 Médula Osea Bazo Versión de Pro-B Pre-B B220'° B220'° B220™ lgM+ B220hi Ratones CD43hi CD24hi lgM+ lgM+ lgM+ lgM+ VELOCIMMUNE® B22010 B22q'° Inmaduro Maduro Emergente Maduro No se observaron defectos mayores en diferenciación de célula B en cualquiera de los ratones VELOCI MMUNE®. La introducción de segmentos de gen de cadena pesada humano no parece afectar la transición de pro-B a pre-B, y la introducción de segmentos de gen de cadena ligera k humana no afecta la transición de pre-B a B en ratones VELOCI MMUNE®. Esto demuestra que moléculas de inmunoglobulina "quiméricas inversas" que poseen regiones variables humanas y constantes de ratón funcionan normalmente en el contexto de señalización de celula B y moléculas co-receptoras que llevan a diferenciación de célula B apropiada en ambiente de ratón. En contraste, el balance entre las diferentes poblaciones durante diferenciación de célula B se perturba a grados variables en ratones que contienen transgenes de inmunoglobulina aleatoriamente integrados y cadena pesada endógena inactivada o sitios de cadena ligera k (Green y Jakobovits, 1998).

Ejemplo 4. Repertorio de gen variable en ratones de inmunoglobulina humanizada Se analizó uso de segmentos de gen variable humano en el repertorio de anticuerpo humanizado de ratones VELOCIMMUNE® mediante reacción de transcriptasa-polimerasa i nversa (RT-PCR) de regiones variables humanas de múltiples fuentes incluyendo esplenocitos y células de hibridoma. Se determinaron la secuencia de región variable, uso de segmentos de gen, hipermutación somática, y diversidad de unión de segmentos de gen de región variable reclasificados.

Brevemente, se extrajo ARN total de 1 x 107-2 x 107 de esplenocitos o aproximadamente 104-105 células de hibridoma utilizando TRIZOL™ (invitrogen) o Qiagen RNEASY™ Mini Kit (Qiagen) y se cebó con iniciadores específicos de región constantes de ratón utilizando el sistema RT-PCR de un paso SUPERSCRIPT™ II I (I nvitrogen). Se llevaron a cabo reacciones con 2-5 mI de ARN con cada muestra utilizando los iniciadores específicos constantes 3’ mencionados anteriormente emparejados con iniciadores guía agrupados para cada familia de regiones variables humanas tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera K, de manera separada. Se realizaron volúmenes de reactivos iniciadores, y condiciones de RT-PCR/PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de iniciadores se basaron en múltiples fuentes (Wang, X. y Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable región gene analysis by single cell RT-PCR. J Immunol Methods 244:217-225; grupos de iniciador de Ig , Novagen). En donde sea apropiado, se llevaron a cabo reacciones de PCR secundarias anidadas con iniciadores de estructura específicos de familia agrupados y el mismo iniciador específico de constante inmunoglobulina 3’ de ratón utilizado en una región primaria. Se analizaron alícuotas (5 pL) para cada reacción por electroforesis de agarosa y se purificaron productos de reacción a partir de la agarosa utilizando un Kit de Extracción de Gel MONTAGE™ (Millipore). Se clonaron productos purificados utilizando el Sistema de Clonación TA TOPO™ ( Invitrogen) y se transformaron en celulas ?H 10b mediante electroporación. Se seleccionaron clones individuales para cada reacción de transformación y se cultivaron en cultivos de caldo LB de 2 mi con selección de antibiótico durante la noche a 37°C. Se purificó ADN de plásmido de cultivos bacterianos mediante un aspecto basado en kit (Qiagen).

Uso de gen variable de inmunoglobulina. Se secuenció ADN de piásmido tanto de iones de cadena pesada como de cadena ligera k con cualquiera de iniciadores inversos T7 o M 13 en el Analizador Genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Se importaron datos de secuencia sin procesar en SEQUENCHER™ (v4.5, códigos de gen). Cada secuencia se ensambló en contigs y se alineó a secuencias de inmunoglobulina humana utilizando la función de búsqueda I MGT V-Quest 8Brochet, X. , Lefranc, M. P. , y Giudicelli, V. (2008): IMGT/V-QUEST: el sistema altamente personalizado e integrado para análisis de secuencia V-J y V-J-D estandarizado de IG ITR y CDR. Nucleic Avids Res 36, W503-508) para identificar el uso de segmento VH, DH, y JH y VK, JK humano. Se compararon secuencias con secuencia de línea germinal para análisis de hipermutación somática y de unión de recombinación.

Se generaron ratones de células ES que contienen la modificación de cadena pesada inicial (alelo híbrido de 3hVH-CRE, parte inferior de la Figura 2A) mediante complementación de RAG (Chen, J y otros (1993) complementación de blastocito deficiente de RAG-2: un ensayo de función de gen en desarrollo de linfocito. Proc Nati Acad Sci U S A 90, 4528-4532), y se preparó ADNc a partir de ADN de esplenocito. Se amplificó ADNc utilizando grupos de iniciador (descritos anteriormente) específicos para el ARNm de cadena pesada quimérico previsto que surgiría por recombinación de V(D)J dentro de los segmentos de gen humano insertados y empalme subsecuente a cualquiera de los dominios constantes IgM o IgG de ratón. Secuencias derivadas de estos clones de ADNc (no mostrados) demostraron que recombinación de V(D)J apropiada ocurrió dentro de las secuencias de gen variable humano, que los segmentos de gen V(D)J humano reclasificado se empalman apropiadamente en marco a dominios de constante de ratón y que ocurrió recombinación de conmutación de clase. Se realizó análisis de secuencia adicional de productos mar de sitios de inmunoglobulina híbridos subsecuentes.

En un experimento similar, las células B de ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® no inmunizados separados por citometría de flujo basándose en expresión de superficie de B220 y IgM o IgG. Se agruparon células B220+ lgM+ o lgG+ de superficie y se obtuvieron secuencias VH, y VK después de amplificación y clonación de RT-PCR (descrito anteriormente). El uso de gen representativo en un grupo de ADNc amplificados de RT-PCR de ratones VELOCI MMUNE® 1 no inmunizados (Cuadro 7) y ratones VELOCIMMUNE® 3 (Cuadro 8) se registró (*RSS defectuoso; ffaltante o pseudo-gen).

CUADRO 7 VH Observado DH Observado VK Observado JK Observado JH Observado CUADRO 8 VH Observado DH Observado V Observado Jx Observado JH Observado Como se muestra en los Cuadros 7 y 8, se utilizan casi todos los segmentos de gen VH, DH, JH . VK y JK humano funcionales. De los segmentos de gen variables funcionales descritos pero no detectados en los ratones VELOCI MMUNE® de este experimento, se ha reportado que varios poseen secuencia de señal de recombinación defectuosas (RSS), y de esa forma, no se esperaría que se expresen (Feency, A.J. (2000) Factores que influencian información de repertorio de celula B. I mmunol Res 21 , 195-202). Análisis de varios grupos de secuencias de inmunoglobulina a partir de varios ratones VELOCIMMUNE®, aislados de repertorios tanto nativos como inmunizados, han mostrado el uso de estos segmentos de gen, a pesar de ser a frecuencias inferiores (datos no mostrados). Datos de uso de gen agregados han mostrado que todos los segmentos de gen VH, DH , J H VK y JK humanos funcionales contenidos en ratones VELOCI MMU NE® han sido observados en varios repertorios nativos e inmunizados (datos no mostrados). Aunque el segmento de gen VH7-81 humano ha sido identificado en el análisis de secuencias de sitio de cadena pesada humana (Matsuda y otros (1998) la secuencia de nucleótido completa del sitio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. J Exp Med 188, 2151 -2162), no está presente en los ratones VELOCI MMUNE® como se confirmó por el re- secuenciamiento de todo el genoma de ratón VELOCI MMUNE® 3.

Las secuencias de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos son conocidas por mostrar variabilidad excepcional. Especialmente en segmentos de polipeptido cortos dentro del dominio variable reclasificado. Estas regiones, conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes complementarias (CDR) crean el sitio de unión para antígeno en la estructura de la molécula de anticuerpo. Las secuencias de polipéptido de intervención son denominadas regiones de estructura (FR). Existen tres CDR (CDR1 , CDR2, CDR3) y 4 FR (FR1 , FR2, FR3, FR4) tanto en cadenas pesadas como ligeras. Una CDR, CDR3, es única en cuanto a que la CDR se crea por combinación de los segmentos de gen VH, DH y JH y VK y JK y genera una cantidad significativa de diversidad del repertorio antes que se encuentre antígeno. Esta unión es imprecisa debido tanto a eliminaciones de nucleótido a través de actividad de exonucleasa y adiciones codificadas sin plantilla a través de deoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y, de esa forma, permite que secuencias novedosas den como resultado el proceso de recombinación. Aunque FR puede mostrar mutación somática sustancial debido a la alta capacidad de mutación de la región variable como un todo, la variabilidad, sin embargo, no se distribuye uniformemente a través de la región variable. Las CDR son regiones concentradas y localizadas de alta variabilidad en la superficie de la molécula de anticuerpo que permiten enlace de antígeno. Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo seleccionadas de ratones VELOCI MMUNE® alrededor de la unión CDR3 que demuestran diversidad de unión se muestran en las Figuras 7A y 7B, respectivamente.

Como se muestra en la Figura 7A, se observan adiciones de nucleótido c odificadas sin plantillas ( N-adiciones) tanto en la unión VH-DH y DH-J H en anticuerpos de ratones VELOCIMMUNE®, indicando una función apropiada de TdT con los segmentos humanos. Los puntos finales de los segmentos VH, DH, y JH con relación a sus contrapartes de celula madre de indican que también ha ocurrido actividad de exonucleasa. Diferente al sitio de cadena pesada, las reclasificaciones de cadena ligera k humana exhiben poca ninguna de las adiciones TdT en CDR3, que se forma por la recombinación de los segmentos VK y JK (Figura 7B). Esto es esperado debido a la falta de expresión TdT de ratones durante reclasificaciones de cadena ligera en la transición de célula pre-B a B. La diversidad observada en el CDR3 de regiones VK humana reclasificada se introduce de manera predominante a través de actividad de exonucleasa durante el evento de recombinación.

Hipermutación somática. Se agrega diversidad adicional a las regiones variables de genes de inmunoglobulina reclasificados durante la región central germinal por un proceso denominado hipermutación somática. Células B que expresan regiones variables somáticamente mutadas compiten con otras células B para acceso a antígeno presentado por las células de dendríticas foliculares. Esas células B con afinidad superior para el antígeno además se expandirán y se someterán a conmutación de clase antes de salir a la periferia. De esa forma, células B que expresan isotipos conmutados típicamente han encontrado antígeno y se han sometido a reacciones centrales germinales y tendrán números aumentados de mutaciones con relación a células B inexpertas. Además, se puede esperar que secuencias de región variable de células slgM+ o slgG+ predominantemente inexpertas tengan relativamente menos mutaciones que secuencias variables de células slgG+ que se han sometido a selección de antígeno.

Las secuencias de clones VH, o Vx de células slgG+ o slgG + B de ratones VELOCIMMUNE® inmunizadas o células slgG+B de ratones inmunizados se compararon con sus segmentos de gen variable de línea germinal y cambios con relación a la secuencia de línea germinal. Las secuencias de nucleótido resultantes se tradujeron i n silico y también se anotaron mutaciones que llevan a cambios de aminoácido. Los datos fueron intercalados de todas las regiones variables y se calculó el porcentaje de cambio en la posición dada (Figura 8).

Como se muestra en la Figura 8, las regiones variables de cadena pesada humana derivaron de células slgG+B de ratones VELOCIMMUNE® no inmunizados que exhiben muchos más nucleótidos con relación a células slgG + B de los mismos grupos de esplenocitos, y regiones variables de cadena pesada derivadas de ratones inmunizados exhiben incluso más cambios. El número de cambios aumenta en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) con relación a las regiones de estructura, indicando selección de antígeno. Las secuencias de aminoácido correspondientes de las regiones variables de cadena pesada humana tambien exhiben número significativamente superiores de mutaciones en IgG vs IgM e incluso más en IgG inmunizado. Estas mutaciones de nuevo parecen ser más frecuentes en las CDR comparadas con las secuencias de estructura, sugiriendo que los anticuerpos fueron seleccionados por antígeno in vivo. Un aumento similar en el número de las mutaciones de nucleótido y aminoácido se observa en las secuencias VK derivadas de células lgG+B de ratones inmunizados.

El uso de gen e hipermutación somática observados en ratones VELOCIMMUNE® demuestran que esencialmente todos los segmentos de gen presentes son capaces de reclasificación para formar anticuerpos quiméricos completamente inversos de manera funcional en estos ratones. Además, anticuerpos VELOCI MMUNE® participan completamente dentro el sistema inmune de ratón para someterse a selección y maduración de afinidad para crear anticuerpos humanos completamente maduros que pueden neutralizar efectivamente su antígeno objetivo. Los ratones VELOCIMMUNE® son capaces de montar respuestas inmunes resistentes a múltiples clases de antígenos que resultan en uso de una gran variedad de anticuerpos humanos que son tanto de alta afinidad como adecuados para uso terapéutico (datos no mostrados).

Ejemplo 5. Análisis de estructura linfoide e isotipos en suero Las estructuras brutas de bazo, nodos linfáticos ingumales, parches de Pcyer y timo de muestras de ratones de tipo silvestre o VELOCIMMUNE® teñidos con H&E se examinaron por microscopía de luz. Los niveles de isotipos de inmunoglobulina en suero recolectados de ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® se analizaron utilizando teenología LUMINEX™.

Estructura de órgano linfoide. La estructura y función de los tejidos linfoides son en parte dependientes del desarrollo apropiado de celulas hematopoyéticas. Un defecto en desarrollo de célula B o función puede exhibirse como una alteración en la estructura de los tejidos linfoides. Con análisis de secciones de tejido teñidas, no se identificó ninguna diferencia significativa en aparición de órganos linfoides secundarios entre ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® (datos no mostrados).

Niveles de inmunoglobulina en suero. El nivel de expresión de cada isotipo es similar en ratones de tipo silvestre y VELOCI MMUNE® (Figuras 9A, 9B y 9C). Esto demuestra que la humanización de los segmentos de gen variables no tuvo ningún efecto adverso evidente con conmutación de clase o expresión y secreción de inmunoglobulina y por lo tanto aparentemente mantienen todas las secuencias de ratón endógenas necesarias para estas funciones.

Ejemplo 6. Inmunización y producción de anticuerpos en ratones de inmunoglobulina humanizada Se inmunizaron diferentes versiones de ratones VELOCI MMUNE® con antígeno para examinar la respuesta humoral a reto de antígeno externo.

Inmunización y desarrollo de hibridoma. Pueden inmunizarse ratones VELOCIMMUNE® y tipo silvestre con un antígeno en la forma de proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína, o celulas que expresan el antígeno. Animales fueron típicamente sobrealimentados cada tres semanas para un total de dos a tres veces. Después de cada sobrealimentación en cada aumento de antígeno, se recolectaron y analizaron muestras de suero para cada animal para respuestas de anticuerpo específicas de antígeno por determinación de titulación de suero. Antes de fusión, los ratones recibieron un aumento de pre-fusión final de 5 mg de proteína o ADN, como se desee, a través de inyecciones intra-peritoneales y/o intravenosas. Se recolectaron esplenocitos y se fusionaron a células de mieloma Ag8.653 en una cámara de electrofusión de acuerdo con el protocolo sugerido de fabricación (Cyto Pulse Sciences I nc. , Glen Burnie, MD). Diez días después de cultivo, se filtraron hibridomas por especificidad específica utilizando un ensayo ELISA (Harlow, E. and Lañe, D. (1988) Anticuerpos: un manual de laboratorio. Coid Spring Harbor Press, Nueva York). Alternativamente, células B específicas de antígeno fueron aisladas directamente de ratones VELOCIMMUNE® inmunizadas y se filtraron utilizando téenicas estándares, incluyendo aquellas aquí descritas, para obtener anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés.

Determinación de titulación en suero. Para verificar la respuesta de suero de suero anti-antígeno animal, se recolectaron muestras de suero aproximadamente 10 días después de cada aumento y las titulaciones se determinaron utilizando ELISA específica de antígeno. Brevemente, se revistieron placas de 96 cavidades Nunc, MAXISORP™ con 2 mg/ml de antígeno durante la noche a 4°C y se bloquearon con albúmina de suero b ovino Sigma, St. Louis, MO). Se dejaron unir muestras de suero en diluciones de 3 veces en serie a las placas durante una hora a temperatura ambiente. Las placas entonces fueron lavadas con PBS conteniendo 0.05% de Tween-20 y se detectaron IgG enlazados utilizando Fe antiratón de cada conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, I nc. , West Grove, PA) para titulación de IgG total, o anticuerpos policlonales específicos de isotipo específicos de cadena ligera etiquetados con biotina (SouthernBiotech Inc.) para titulaciones específicas de isotipo, respectivamente. Para anticuerpos etiquetados con biotina, después de lavado de placa, se agrega estreptavidina conjugada con HRP (Pierce, Rockford, IL). Todas las placas se desarrollaron utilizando sustratos colorimétricos tal como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Después se detiene la reacción con 1 M de ácido fosfórico, se registraron absorciones ó pticas a 450 nm y se analizaron los datos utilizando software de PRISM™ de Graph Pad. Se definieron como titulación diluciones requeridas para obtener dos veces de señal de fondo.

En un experimento, se inmunizaron ratones VELOCIMMUNE® con receptor de interleucina 6 humana (hl L-6R). Un grupo representativo de titulaciones en suero para ratones VELOCIMMUNE® y tipo silvestre inmunizados con hl L-6R se muestra en las Figuras 10A y 10B.

Los ratones VELOCIMMUNE® y tipo silvestre montaron respuestas fuertes hacia el VELOCIMMUNE® con rangos de titulación similares (Figura 10A). Varios ratones los grupos VELOCIMMUNE® y tipo silvestre alcanzan una respuesta máxima despues de un aumento de antígeno individual. Estos resultados indican que la fuerza y respuesta inmune y cinética a este antígeno fueron similares en ratones VELOCIMMUNE® y tipo silvestre. Estas respuestas de anticuerpo específico de antígeno además se analizaron para examinar los isotipos particulares de los anticuerpos específicos de antígeno encontrados en el suero. Ambos grupos VELOCI MMUNE® y tipo silvestre predominantemente extrajeron una respuesta lgG1 (Figura 10B), que sugiere que la conmutación de clase durante la respuesta humoral es similar en ratones de cada tipo.

Determinación de afinidad de unión de anticuerpo a antígeno en solución. Un ensayo de competencia de solución basado en ELISA se diseñó típicamente para determinar l a afinidad de unión de anticuerpo a antígeno.

Brevemente, se pre-mezclaron anticuerpos en medios acondicionados con diluciones en serie de proteína de antígeno que varía desde 0 hasta 10 mg/ml. Las soluciones de la mezcla de anticuerpo y antígeno entonces se incubaron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente para alcanzar equilibrios de unión. Las cantidades de anticuerpo libre en las mezclas entonces se miden utilizando ELISA intermedio cuantitativo. Se revistieron placas MAXISORB™ de noventa y seis cavidades (VWR, West Chester, PA) con 1 mg/ml de proteína de antígeno en solución de PBS durante la noche a 4°C seguido por bloqueo no específico de BSA. La solución de mezcla de anticuerpos de antígeno entonces se transfirió a estas placas seguido por incubación de una hora. Las placas entonces se lavaron con regulador de pH de lavado y se detectaron anticuerpos enlazados a placa con un reactivo de anticuerpo policlonal IgG antiratón de cada conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Lab) y se desarrollaron utilizando sustratos colorimetricos tal como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Después que se detiene la reacción con 1 M de ácido fosfórico, se registraron absorciones ópticas a 450 nm y se analizaron los datos utilizando software PRISM™ de Graph Pad. La dependencia de las señales en las concentraciones de antígeno en solución se analizó con un análisis de ajuste de cuatro parámetros y se reportó como IC50, la concentración de antígeno requerida para lograr 50% de reducción de la señal de las muestras de anticuerpo sin presencia de antígeno en solución.

En un experimento, se inmunizaron ratones VELOCIMMUNE® con hlL-6R (como se describió anteriormente). Las Figuras 1 1 A y 1 1 B muestran un grupo representativo de medidas de afinidad para anticuerpos anti-hlL6R de ratones VELOCIMMUNE® y tipo silvestre.

Despues los ratones inmunizados recibieron un tercer aumento de antígeno, se determinaron titulaciones en suero mediante ELISA. Se aislaron esplenocitos de grupos de ratón de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® seleccionados y se fusionaron con células de mieloma Ag8.653 para formar hibridomas bajo selección (como se describió anteriormente). De un total de 671 hibridomas anti-IL-6R producidos, se encontró que 236 expresan anticuerpos específicos de antígeno. Se utilizaron medios recolectados de cavidades positivas para antígeno para determinar la afinidad de anticuerpo de unión a antígeno utilizando un ELISA de competencia de solución. Los anticuerpos derivados de ratones VELOCIMMUNE® exhiben una gran variedad de afinidad en unión a antígeno en solución (Figura 1 1 A). Además, 49 de 236 hibridomas anti-IL-6R se encontró que bloquean I L-6 para que se una al receptor en un bioensayo in vitro (datos no mostrados). Además, estos 49 anticuerpos de bloqueo de anti-IL-6R exhibieron un rango de afinidades de alta solución similar a aquel de anticuerpos de bloqueo derivados de la inmunización paralela de ratones de tipo silvestre (Figura 1 1 B) .

Ejemplo 7. Construcción de un vector de activación de ADAM6 de ratón Un factor de activación para inserción de genes ADAM6a y ADAM6b de ratón en un sitio de cadena pesada humanizada ase construyó utilizando teenología de ingeniería genética VELOCI MMUNE® (anterior) para modificar un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) 929d24 obtenido de Dr. Fred Alt (Harvard University). Se diseñó por ingeniería genética 929d24 BAC ADN para contener fragmentos genómicos que contienen los genes de ADAM6a y ADAM6b de ratón y un casete de higromicina para eliminación activada de un pseudo-gen ADAM6 humano (IiAOAMbY) localizado entre segmentos de gen VH 1 -2 y VH6-1 humanos de un sitio de cadena pesada humanizada (Figura 12).

En primer sitio, se subclonó un fragmento genómico que contiene el gen ADAM6b de ratón, ~800 bp de secuencia corriente arriba (5’) y -4800 bp de secuencia corriente abajo (3’) del clon 929d24 BAC. Un segundo fragmento genómico que contiene el gen ADAM6a de ratón, -300 bp de secuencia corriente arriba (5’) y ~3400 bp de secuencia corriente abajo (3’), se subclonó de manera separada del clon 929d24 BAC. Se ligaron los dos fragmentos genómicos que contienen los genes ADAM6b y ADAM6a de ratón a un casete de higromicina flanqueado por sitios de recombinación de Frt para crear el vector de activación (Vector de activación de ADAM6b de ratón, Figura 20; SEC I D NO: 3). Se diseñaron por ingeniería genética diferentes sitios de enzima de restricción sobre el extremo 5’ del vector de activación después del gen ADAM6b de ratón y sobre el extremo 3’ después del gen ADAM6a de ratón (parte inferior de la Figura 12) para ligadura dentro del sitio de cadena pesada humanizada.

Se elaboró una modificación separada a un clon BAC que contiene un reemplazo del sitio de cadena pesada de ratón con el sitio de cadena pesada humana, incluyendo el pseudo-gen ADAM6 humano localizado entre los segmentos de gen VH1 -2 y VH6-1 humanos del sitio humanizado para ligadura subsecuente del vector de activación ADAM6 de ratón (Figura 13).

Brevemente, se diseñó por ingeniería genética un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación loxP para contener brazos de homología que contienen secuencia genómica humana en posiciones 3’ del segmento de gen VH 1 -2 humana (5’ con respecto a ?iA?AMQY) y 5’ de segmento de gen VH6-1 humano (3’ con respecto a IiA?AMdY; ver mitad de la Figura 13). La ubicación del sitio de inserción de esta construcción de enfoque fue aproximadamente 1 .3 kb 5’ y ~350 bp 3’ del pseudo-gen ADAM6 humano. La construcción de enfoque también incluyó los mismos sitios de restricción que el vector de activación ADAM6 de ratón para permitir ligadura de BAC subsecuente entre el clon de BAC modificado que contiene la eliminación del pseudo-gen ADAM6 humano y el vector de activación ADAM6 de ratón.

Después de digestión de ADN de BAC derivado de ambas construcciones, se ligaron los fragmentos genómicos juntos para construir un clon de BAC diseñado por ingeniería genética que contiene un sitio de cadena pesada humanizado que contiene una secuencia genómica ectópicamente colocada que comprende secuencias de nucleótido ADAM6a y ADAM6b de ratón. La construcción de a ctivación final para la eliminación del gen ADAM6 humano dentro de un sitio de cadena pesada humanizada e inserción de secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en celulas ES contuvo, desde 5’ hasta 3’, un fragmento genómico 5’ que contiene ~13 bp de secuencia genómica humana 3’ del segmento de gen VH1 -2 humano, -800 bp de secuencia genómica de ratón corriente abajo del gen ADAM6b de ratón, el gen ADAM6b de ratón, -4800 bp de secuencia genómica corriente arriba del gen ADAM6b de ratón, un sitio Frt 5’, un casete de higromicina, un sitio Frt 3’, -300 bp de secuencia genómica de ratón corriente abajo del gen ADAM6a de ratón, el gen ADAM6a de ratón, -3400 bp de secuencia genómica de ratón corriente arriba del gen ADAM6a de ratón, y un fragmento genómico 3’ que contiene -30 kb de secuencia genómica humana 5’ del segmento de gen VH6-1 humano (parte inferior de la Figura 13).

Se utilizó el clon de BAC diseñado por ingeniería genética (descrito anteriormente) para electroporar células ES de ratón que contuvieron un sitio de cadena pesada humanizado para células ES modificadas creadas que comprenden una secuencia genómica de ratón ectópicamente colocada que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de un sitio de cadena pesada humanizada. Se identificaron células ES positivas que contienen el fragmento genómico de ratón ectópico dentro del sitio de cadena pesada humanizada mediante un ensayo de PCR cuantitativo utilizando sondas TAQMAN™ (Lie, Y.S. y Pretropoulos, C.J. (1998) Avances en teenología de PCR cuantitativa: ensayos de nucleasa 5’. Curr Opin Biotechnol 9(1 ):43-48). Las regiones corriente arriba y corriente abajo fuera de la porción modificada del sitio de cadena pesada humanizada se confirmaron por PCR utilizando iniciadores y sondas localizados dentro de la región modificada para confirmar la presencia de la secuencia genómica de ratón ectópica dentro del sitio de cadena pesada humanizada así como el casete de higromicina. La secuencia de nucleótido a traves del punto de inserción corriente arriba incluyó lo siguiente, que indica secuencia genómica de cadena pesada humana corriente arriba del punto de inserción y un sitio de restricción l-Ceu I (contenido dentro del paréntesis a continuación) enlazado de manera contigua a secuencia genómica de ratón presente en el punto de inserción: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTCC (SEC I D NO:4). La secuencia de nucleótido a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3’ de la región activada incluyó lo siguiente, que indica secuencia genómica de ratón y un sitio de restricción Pl-Sce (contenido dentro del paréntesis a continuación) enlazado de manera contigua con secuencia genómica de cadena pesada humana descendente del punto de inserción: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEC ID NO:5).

Se utilizaron células ES activadas descritas anteriormente como células ES donante y se introdujeron en un embrión de ratón de etapa de 8 células por el método de ingeniería de ratón VELOCI MOUSE® (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 7,6598,442, 7, 574,259, 7,294,754). Se identificaron ratones que tienen un sitio de cadena pesada humanizada que contiene una secuencia genómica de ratón ectópica que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón por genotipado utilizando una modificación de ensayo de alelo (Valenzuela y otros, 2003) que detectaron la presencia de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro del sitio de cadena pesada humanizada.

Se criaron ratones que tienen un sitio de cadena pesada humanizada que contiene genes ADAM6a y ADAM6b de ratón a una cepa de ratón de delator de FLP (ver, por ejemplo, Rodríguez C.l . y otros, (2000) Ratones se eliminadores de alta eficiencia muestran que FLP es una alternativa a Cre-loxP. Genética de naturaleza 25: 139-140) con el fin de remover cualquier casete de higromicina Frt’ed introducido por el vector de activación que no se remueve, por ejemplo, en la etapa de célula ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de hjgromicina se retiene en los ratones.

Las crías fueron genotipadas y una cría heterocigótica para un sitio de cadena pesada humanizada que contiene un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón se selecciona para caracterizar la expresión de gen ADAM6 de ratón y fertilidad.

Ejemplo 8. Caracterización de ratones de rescate ADAM6 Citometría de flujo. Tres ratones a la edad de 25 semanas homocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y tres ratones a la edad de 18-20 semanas homocigóticos para cadena pesada humana y ligera k humana que tienen el fragmento genómico de ratón ectópico que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón con ambos alelos del sitio de cadena pesada humana (H/K-A6) se sacrificaron para identificación y análisis de poblaciones de celula de linfocito por FAC en el Sistema BD LSR I I (BD Bioscience). Se sincronizaron linfocitos para linajes de célula específicos y se analizaron por progreso a través de varias etapas de desarrollo de célula B. Los tejidos recolectados de los animales incluyeron sangre, bazo y médula ósea. La sangre fue recolectada en tubos microtainer BD con EDTA (BD Bioscience). Se recolectó médula ósea del fémur al nivelarse con medio de RPMI completo complementado con suero de cabra fetal, piruvato de sodio, HEPES, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, y gentamicina. Glóbulos rojos de preparación de sangre, bazo y medula ósea se alisaron con un regulador de pH de lisis basado en cloruro de amonio (por ejemplo regulador de pH de lisis ACK), seguidos por lavado con el medio RPMI completo.

Para la tinción de poblaciones celulares, se incubaron 1 x 10® células de las varias fuentes de tejido con CD16/CD32 anti-ratón (2.4G2, BD Biosciences) sobre hielo durante 10 minutos, seguido por etiquetado con uno o una combinación de los siguientes cócteles de anticuerpo durante 30 minutos sobre hielo.

Médula ósea: FITC-CD43 anti-ratón ( 1 B 1 1 , BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), Pecy7-lgM (11/41 , eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (1 1 -26c.2a, BioLegend, APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1 D3, BD Biosciences).

Sangre periférica y b azo: FITC-k anti-ratón (187.1 , BD Biosciences), RE-l (RML-42, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41 , eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (1 1 -26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C1 1 , BD), A700-CD19 (1 D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Después de incubación con los anticuerpos etiquetados, las células se lavaron y se fijaron en 2% de formaldehído. Se realizó la adquisición de datos en un citómetro de flujo LSRI I y se analizó con FlowJo. Los resultados de un ratón H/k y H/K-A6 representativo se muestran en las Figuras 14-18.

Los resultados demuestran que las células B de ratones H/K-A6 progresan a través de las etapas de desarrollo de célula B en una forma similar a ratones H/k en los compartimentos de médula ósea y periféricos, y muestran patrones normales de mutación una vez que ingresan a la periferia. Los ratones H/ -A6 demostraron una población de célula CD43mtCD19+ aumentada cuando se compara con ratones H/k ( Figura 16B). Esto puede indicar una expresión de IgM acelerada del sitio de cadena pesada humanizada que contiene un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en ratones H/K-A6. En la periferia, poblaciones de célula B y T d e ratones H/K-A6 parecen normales y similares a ratones H/K.

Morfología de testículos y caracterización de esperma. Para determinar si la infertilidad en ratones que tienen sitios variables de carga pesada de inmunoglobulina humanizada es debida a defectos de testículos y/o producción de esperma, se examinó la morfología de testículo y contenido de esperma del epidídimo.

Brevemente, se realizó la disección de pruebas de dos grupos de cinco ratones por grupo (Grupo 1 : ratones homocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y ligera K, mADAMe^ ; Grupo 2: ratones heterocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y homocigóticos para sitios de gen variable de cadena ligera K, mADAM6+/ ) con el epidídimo intacto y pesado. Los especímenes entonces fueron fijados, embebidos en parafina, seccionados y teñidos con tinción de hematoxilina y eosina (HE). Se examinaron secciones de testículos (dos testículos por ratón, para un total de 20) por defectos en morfología y evidencia de producción de esperma, mientras se examinaron secciones de epidídimo para presencia de esperma.

En este experimento, no se observó ninguna diferencia en peso o morfología de testículos entre ratones mADAMe '- y ratones mADAM6+/\ Se observó esperma en todos los fenotipos, tanto en los testículos como en el epidídimo. Estos resultados establecen que la ausencia de genes ADAM6a y ADAM6b d e ratón no lleva a cambios detectables en morfología de testículos, y que el esperma se produce en ratones en la presencia y ausencia de estos dos genes. Los defectos en fertilidad de ratones mADAMB 7 macho por lo tanto no es probable que sea debido a baja producción de esperma.

Motilidad y migración de esperma. Los ratones que carecen de otros miembros de la familia de gen ADAM son infértiles debido a defectos en motilidad o migración de esperma. La migración de esperma se define como la capacidad de que el esperma pase desde el útero hacia el oviducto, y es normalmente necesaria para la fertilización en ratones. Para determinar si la eliminación de ADAM6a y ADAM6b de r atón afecta este proceso, se evalúo la migración de esperma en ratones ihAOAMd 7 . También se examinó la motilidad de esperma.

Brevemente, se obtuvo esperma de testículos de (1 ) ratones heterocigóticos de sitios de gen variable de cadena pesada humana y homocigóticos para sitios de gen variable de cadena ligera k humana (ADAM6+/ )¡ (2) ratones homocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y homocigóticos para sitios de gen variable de cadena ligera k humana (ADAM6 7 ); (3) ratones homocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y homocigóticos para cadena ligera k tipo silvestre (A?AMb ' hik); y, (4) ratones C57 BL/6 tipo silvestre (WT). No se observaron anomalías significativas en el conteo de esperma o motilidad de esperma general por inspección. Para todos los ratones, se observó una dispersión de cúmulo, indicando que cada muestra de esperma fue capaz de penetrar las células de cúmulo y enlazar la zona transparente in vitro. Estos resultados establecen que ratones, ADAM6 tienen esperma que son capaces de penetrar el cúmulo y enlazarse a la zona pelúcida.

Se realizó fertilización de óvulo de ratón in vivo (IVF) utilizando esperma de ratones como se describió anteriormente. Estuvo presente un número ligeramente inferior de embriones separados para ADAM6 /_ el día después de ID, así como un número reducido de esperma enlazado a los huevos. Estos resultados establecen que el esperma de ratones ADAM6 ' , una vez expuesto a un óvulo, es capaz de penetrar el cúmulo y enlazarse con la zona pelúcida.

En otro experimento, la capacidad del esperma de ratones ADAM6 ' de migrar desde el útero y a través del oviducto se determinó en un ensayo de migración de esperma.

Brevemente, se estableció un primer grupo de cinco ratones hembra súperovulados con cinco machos ADAM6_/\ Se estableció un segundo grupo de cinco ratones hembra súperovulados con cinco machos ADAM6+/\ Los pares comcidentes se observaron para copulación, y 5 a 6 horas después de la copulación, el útero y oviducto unido de todas las hembras se removió y se descargó para análisis. Las soluciones de lavado se revisaron para huevos para verificar la ovulación y obtener un conteo de esperma. Se evalúo la migración de esperma en dos formas diferentes. Primero, se removieron ambos oviductos del útero, se lavaron con solución salina, y se contó cualquier esperma identificado. La presencia de huevos también se observó como evidencia de ovulación. En segundo sitio, los oviductos se dejaron unidos al útero y se fijaron ambos tejidos, se embebieron e n parafina, se seccionaron y tiñeron (como se describió anteriormente). Las secciones se examinaron para presencia de esperma tanto en el útero como en ambos oviductos.

Para las cinco hembras cruzadas con cinco machos ADAM6 , se encontró muy poco esperma en la solución de lavado del oviducto. Las soluciones de lavado de los oviductos de las cinco hembras cruzadas con los cinco machos ADAM6+/ exhibieron un nivel de esperma de aproximadamente 25 a 30 veces superior (promedio, n = 10 oviductos) que presenten soluciones de lavado de los oviductos de las cinco hembras cruzadas con los cinco machos ADAM6 .

Se prepararon secciones histológicas de útero y oviducto. Se examinaron las secciones para presencia de esperma en el útero y el oviducto (el colliculus tubarius). Las secciones histológicas de oviducto y útero revelaron que para ratones hembra cruzadas con ratones ADAM6 ; , se encontró esperma en el útero pero no en el oviducto. Además, las secciones de hembras cruzadas con ratones ADAMS^ revelaron que no se encontró esperma en la unión útero tubal (UTJ). En secciones de hembras cruzadas con ratones ADAM6+/\ se identificó esperma en la UTJ y en el oviducto.

Estos resultados establecen que los ratones que carecen de genes ADAM6a y A DAM6b hacen que el esperma exhiba u n defecto de migración in vivo. En todos los casos, se observó esperma dentro del útero, indicando la copulación y liberación de esperma que ocurre aparentemente como normal, pero se observó poco o ningún esperma dentro de los oviductos despues de copulación según medido por conteo de esperma u observación histológica. Estos resultados establecen que ratones que carecen de genes ADAM6a y ADAM6b producen esperma que exhibe una incapacidad para migrar del útero al oviducto. Este defecto aparentemente conduce a infertilidad debido a que los espermatozoides son incapaces de cruzar la unión de túbulo uterino dentro del oviducto, en donde se fertilizan los huevos. Tomados conjuntamente, todos estos resultados convergen al soporte de la hipótesis de que los genes ADAM6 de ratón ayudan a dirigir esperma con motilidad normal para migrar fuera del útero, a través de la unión útero tubal y el oviducto, y de esa forma acercan a un huevo para lograr el evento de fertilización. El mecanismo con el cual ADAM6 logra esto puede ser directamente por acción de las proteínas ADAM6, o a través de la expresión coordinada con otras proteínas, por ejemplo, otras proteínas ADAM, en la célula de esperma, como se describe a continuación.

Expresión de la familia de gen ADAM. Un complejo de proteína ADAM se conoce por estar presente con un complejo sobre la superficie de esperma de maduración. Los ratones que carecen de otros miembros de familia de gen ADAM pierden este complejo a medida que madura el esperma, y exhiben una función de proteínas ADAM múltiples en esperma maduro. Para determinar si una falta de gen es ADAM6a y ADAM6b afecta otras proteínas ADAM en una forma similar, se analizaron tinciones Western de extractos de proteína de testículos (esperma inmaduro) y epidídimo ( esperma de maduración) para determinar los niveles de expresión de otros miembros de familia de gen ADAM.

En este experimento, se analizaron extractos de proteína de cuatro ratones ADAM6 y cuatro ADAM6+/ . Los resultados mostraron que la expresión de ADAM2 y ADAM3 no fue afectada en extractos de testículo. Sin embargo, ambos ADAM2 y ADAM3 fueron reducidos dramáticamente en extractos de epidídimo. Esto demuestra que la ausencia de ADAM6a y ADAM6b en esperma de ratones ADAM6_/ puede tener una afección directa en la expresión y tal vez la función de otras proteínas ADAM a medida que el esperma madura (por ejemplo, ADAM2 y ADAM3). Esto sugiere que ADAM6a y ADAM6b son parte de un complejo de proteína ADAM sobre la superficie de esperma, que puede ser crítico para una migración apropiada de esperma.

Ejemplo 9. Utilización de gen variable de cadena pesada humana en ratones de rescate ADAM6 Se determinó el uso de gen variable de cadena pesada humana seleccionada para ratones homocigóticos para sitios de gen variable de cadena pesada humana y ligera k y a s ea que carecen de genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (mADAM6_/ ) o que contienen un fragmento genómico ectópico que codifica para genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (ADAM6+/+; ver Ejemplo 1 ) por un ensayo de PCR cuantitativo utilizando sondas TAQMAN TM (como se describió anteriormente).

Brevemente, se purificaron células CD19+ B de los bazos de ratones mADAM6 /_ y mADAM6+/+ utilizando microperlas CD19 de ratón (Miltenyi Biotec) y se purificó ARN total utilizando el minikit RNEASY™ (Qiagen). Se removió ARN genómico utilizando un tratamiento en columna de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen). Se transcribieron de manera inversa 200 ng de ARNm en ADNc utilizando el equipo First Stand cDNA Synthesis (Invitrogen) y entonces se amplificó con la Mezcla Maestra de PCR universal TAQMAN™ (Applied Biosystems) utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI 7900 (Applied Biosystems). Se normalizó la expresión relativa de cada gen a la Constante k de ratón (mCic). El Cuadro 9 describe las combinaciones de sonda MGB de sentido/antisentido/TAQMAN™ utilizadas en este experimento.

CUADRO 9 VH Secuencia (5’-3’) SEC ID NOs: Humano En este experimento, la expresión de los cuatro genes VH humanos se observó en las muestras analizadas. Además, los niveles de expresión fueron comparables entre ratones mADAMe ' y ADAM6+/+. Estos resultados demuestran que genes VH humanos fueron tanto distales al sitio de modificación (VH3-23 y VH1 -69) como proximales al sitio de modificación (VH1 -2 y VH6-1 ) todos fueron capaces de recombinarse para formar una cadena pesada humana funcionalmente expresada. Estos resultados demuestran que el fragmento genómico ectópico que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón insertadas en una secuencia genómica de cadena pesada humana no afectan recombinación de V(D)J de segmentos de gen de cadena pesada humana dentro del sitio, y estos ratones son capaces de recombinar segmentos de gen de cadena pesada humana en forma normal para producir proteínas de inmunoglobulina de cadena pesada funcional.

Ejemplo 10. Eliminación de los sitios de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón Se elaboraron varias construcciones de enfoque utilizando teenología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, patente de E. U.A. no. 6,586,251 de Valenzuela y otros (2003) Ingeniería de alto rendimiento del genoma de ratón acoplado con el análisis de expresión de alta resolución, Nature Biotech. 21 (6):652-659) para modificar bibliotecas de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) genómico de ratón para desactivar los sitios de cadena ligera k y l de ratón.

Eliminación del sitio de cadena ligera l de ratón. Se modificó ADN de RP23-135k15 de clon de BAC de ratón (Invitrogen) por recombinación homologa para desactivar el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno a través de eliminación activada de los grupos de gen nl-?l-?l (Figura 20).

Brevemente, se eliminó todo el grupo proximal que comprende segmentos de gen VX1 -J 3-C 3-J 1 -C 1 en un evento de activación individual utilizando un vector de activación que comprende un casete de neomicina flanqueado por sitios loxP con un brazo de homología de ratón 5’ que contiene secuencias 5’ del segmento de gen VX1 y un brazo de homología de ratón 3’ que contiene la secuencia 3’ del segmento de gen Ol1 (Figura 20, Vector de activación 1’.

Se prepara una segunda construcción de enfoque para eliminar de manera precisa el grupo de gen l de ratón endógeno que contiene nl2-?l2-Ol2-?l4-Ol4 excepto que la construcción de enfoque contuvo un brazo de homología de ratón 5’ que contuvo la secuencia 5’ del segmento de gen nl2 y un brazo de homología de ratón 3’ que contuvo la secuencia 5’ para el segmento de gen Ol2 endógeno (Figura 20, Vector de activación 2). De esa forma, la segunda construcción de enfoque eliminó de manera precisa nl2-?l2, mientras dejó Ol2-?l4-Ol4 intacto en el sitio l de ratón endógeno. Se confirmaron celulas ES que contienen un sitio l endógeno desactivado (como se describió anteriormente) mediante métodos de cariotipo y filtrado (por ejemplo, TAQMAN™) conocidos en la téenica. Luego se aisló ADN de las células ES modificadas y se sometió a tratamiento con recombinasa CRE mediando con ello la eliminación del casete de activación próximo que contiene el marcador de neomicina, dejando únicamente un sitio loxP individual en el punto de eliminación (Figura 20, parte inferior).

Eliminación de sitio de cadena ligera k de ratón. Se elaboraron varias construcciones de activación utilizando métodos similares descritos anteriormente para modificar ADN de RP23-302g12 y RP23-254m04 de clones de BAC de ratón (Invitrogen) por recombinación homologa para desactivar el sitio de cadena ligera k de ratón en un proceso de dos pasos (Figura 21 ).

Brevemente, se eliminaron segmentos de gen JK (1 -5) del sitio de cadena ligera k de ratón endógeno en un evento de activación individual utilizando un vector de activación que comprende un casete de higromicina-timidina cinasa (hyg-TK) que contiene un sitio loxP individual 3’ al casete hyg-TK (Figura 21 , Vector de activación JK) . LOS brazos de homología utilizados para elaborar este vector de activación contuvieron secuencia genómica de ratón 5’ y 3’ de los segmentos de gen JK de ratón endógeno. En un segundo evento de activación, se preparó un segundo vector de activación para eliminar una porción de secuencia genómica de ratón corriente arriba (5’) al segmento de gen VK de ratón endógeno más distal (Figura 21 , Vector de activación VK) . Este vector de activación contuvo un sitio lox51 1 invertido, un sitio loxP y un casete de neomicina. Los brazos de homología utilizados para elaborar este vector de activación contuvieron secuencia genómica de ratón corriente arriba del segmento de gen VK de ratón más distal. Los vectores de activación se utilizaron en una forma secuencial (es decir, JK entonces VK) para activar ADN en células ES. ES que tiene un cromosoma de activación doble (es decir, un sitio k de ratón endógeno individual activado con ambos vectores de activación) se confirmó mediante métodos de cariotipo y filtrado (por ejemplo, TAQMAN™) conocidos en la téenica. Entonces se aisló ADN de las células ES modificadas y se sometió a tratamiento con recombinasa Cre mediando con ello la eliminación de segmentos de gen VK de ratón endógeno y ambos casetes de selección, mientras deja dos sitios lox yuxtapuestos en orientación opuesta con relación entre sí (Figura 21 , parte inferior; SEC I D NO:59).

De esa forma, dos sitios de cadena ligera endógena modificados (K y l) que contienen potenciador intacto y regiones constantes se crearon para insertar de manera progresiva segmentos de gen de línea germinal l humana en una forma precisa utilizando vectores de activación descritos a continuación.

Ejemplo 11. Reemplazo de sitios de cadena ligera de ratón con un mini-sitio de cadena ligera l humano Se diseñaron por ingeniería genética vectores de activación múltiples para inserción progresiva de segmentos de gen humano l en los sitios de cadena ligera k y l de ratón endógeno utilizando métodos similares como se describió anteriormente. Se elaboraron múltiples modificaciones iniciales independientes a los sitios de cadena ligera endógena cada una produciendo un sitio de cadena ligera quimérico que contiene segmentos de gen hN/l y ?l enlazados de manera operativa a genes y potenciadores constantes de cadena ligera de ratón.

Mini-sitio l conteniendo 12 segmentos de gen nl humano y uno ?l humano. Se diseñó por ingeniería genética una serie de vectores de activación inicial para contener los primeros 12 segmentos de gen nl humano consecutivos del grupo A y un segmento de gen ?i?l? : o cuatro segmentos de gen hJ utilizando un clon de BAC humano llamado RP1 1 -729g4 (Invitrogen). Las Figuras 22A y 22B muestran los vectores de activación que se construyeron para elaborar una inserción inicial de segmentos de gen de cadena ligera l humana en los sitios de cadena ligera l y k de ratón, respectivamente.

Para un primer grupo de vectores de activación inicial, se diseñó por ingeniería genetica un fragmento de ADN de 124, 125 bp del clon de BAC 729g4 conteniendo 12 segmentos de gen hV/l y un segmento de gen hJ 1 para contener un sitio Pl-Scel 996 bp corriente abajo (3’) del segmento de gen ?i?l? para ligadura de un brazo de homología de ratón 3’. Se utilizaron dos grupos diferentes de brazos homolog ía para ligadura a este fragmento humano; un grupo de brazos de homología contuvo secuencias l de ratón endógeno del clon 135k 15 BAC (Figura 22A) y otro grupo contuvo secuencia k e ndógena 5’ y 3’ d e los segmentos de gen VK y JK d e ratón de RP23-30g 12 y RP23-254m04 de clones de BAC de ratón, respectivamente (Figura 22B).

Para el Vector de activación 12/1 -l (Figura 22A), se diseñó por ingeniería genética un sitio de Pl-Scel en el extremo 5’ de un fragmento de ADN de 27,847 bp conteniendo ^2-*1l4-Ol4 de ratón y potenciador 2.4 del sitio l de ratón modificado descrito en el Ejemplo 10. Se utilizó el fragmento de ratón de ~28 kb como un brazo de homología 3’ mediante ligadura al fragmento l humano -124 kb, que creó una unión 3’ que contiene, desde 5’ hasta 3’, un segmento de gen hJ 1 , 996 bp de secuencia hJ 1 humana 3’ del segmento de gen l, 1229 bp d e secuencia l de ratón 5’ a I gen 0X2 de ratón, el gen 0 2 de ratón y la porción restante del fragmento de ratón de -28 kb. Segmento de gen nl3-12 corriente arriba (5’) del segmento de gen de 1456 bp humano estuvo un l adicional de secuencia l humana antes del inicio del brazo de homología de ratón 5’, que contuvo 23,792 bp de ADN genómico de ratón correspondiente a secuencia 5’ del sitio l de ratón endógeno. Entre el brazo de homología 5’ y el inicio de la secuencia l humana estuvo un casete de neomicina flanqueado por sitios Frt.

De esa forma, el Vector de activación 12/1 -l incluyó, de 5’ a 3’, un brazo de homología 5’ que contiene -24 kb de secuencia genómica l de ratón 5’ del sitio l endógeno, un sitio Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio Frt 3’, -123 kb de secuencia l genómica humana que contiene los primeros 12 segmentos de gen hV consecutivos y un segmento de gen hJ 1 , un sitio Pl-Scel, y un brazo de homología 3’ q ue contiene -28 kb de secuencia genómica de ratón incluyendo los segmentos de gen Ol2-?l4-Ol4 endógenos, la secuencia de potenciador 2.4 de ratón y secuencia genómica de ratón adicional descendente (3’) del potenciador 2.4 (Figura 22A).

En una forma similar, el Vector de activación 1 2/1 -K (Figura 22B) empleó el mismo fragmento l humano -124 con la excepción que brazos de homología de ratón que contienen secuencia k de ratón se utilizó de manera que podría lograrse la activación al sitio k endógenos por recombinación homóloga. De esa forma, el Vector de activación 1 2/1 -K incluyó, de 5’ a 3’, un brazo de homología 5’ que contiene -23 kb de secuencia genómica de ratón 5’ del sitio k endógeno, un sitio l-Ceul, un sitio 5’ Frt, un casete de neomicina, un sitio de Frt 3’, ~124 kb de secuencia l genómica humana que contiene los primeros 12 segmentos de gen h /l consecutivos y un segmento de gen hJ 1 , un sitio de Pl-Scel, y un brazo de homología 3’ que contiene ~28 kb de secuencia genómica de ratón incluyendo el gen CK de ratón endógeno, EKÍ y EK3’ y secuencia genómica de ratón adicional descendente (3’) de EK3’ (Figura 22B, Vector de activación 12/1 -K) .

La recombinación homologa de cualquiera de estos dos vectores de activación inicial creó un sitio de cadena ligera de ratón modificado (k O l) conteniendo 12 segmentos de gen 12 ?inl y un segmento de gen Ii?l? operativamente enlazados al gen constante de cadena ligera de ratón endógeno y gen de potenciadores (CK O C 2 y EKÍ/EK3’ O Enh 2.4/Enh 3.1 ), que, con recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera l quimérica.

Mini-sitio l humano con 12 segmentos de gen nl humano y cuatro de gen ?l humano.

En otro aspecto para agregar diversidad a un sitio de cadena ligera l quimérico, se diseñó por ingeniería genética un tercer vector de activación inicial para insertar los primeros 12 segmentos de gen nl humano consecutivos del grupo A y segmentos de gen hJ 1 , 2, 3 y 7 en el sitio de cadena ligera k de ratón (Figura 22B, Vector de activación 1 2/4-K) . Un segmento de ADN que contiene segmentos de gen h J l 1 , ?l2, ?l3 y ?l7 se elaboró mediante síntesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies) incluyendo cada segmento de gen ?l y secuencia económica humana de -100 bp tanto desde ambas de las regiones 5’ y 3’ intermedias de cada segmento de gen ?l. Se diseñó por ingeniería genetica un sitio de Pl-Scel en el extremo 3’ de este fragmento de ADN -1 kb y se ligó un casete de cloranfenicol. Los brazos de homología fueron amplificados por PCR de secuencia l humana en posiciones 5’ y 3’ con relación al segmento de gen Ii?l? del clon de BAC 729g4. Se realizó recombinación homologa con este vector de activación intermedio en un clon de BAC 729g4 modificado que ha sido previamente activado corriente arriba (5’) del segmento de gen V 3-12 humano con un casete de neomicina flanqueado por sitios Frt, que también contuvo un sitio l-Ceul 5’ al sitio Frt 5’. El clon 729g4 BAC activado doble incluyó de 5’ a 3’ de un sitio l-Ceul, un sitio de Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio de Frt 3’, un fragmento -123 kb que contiene los primeros 12 segmentos de gen h /l, un fragmento -1 kb que contiene segmentos de gen J l 1 , 2, 3 y 7 humanos, un sitio de Pl-Scel, y un casete de cloranfenicol. Este vector de activación intermedio fue digerido junto con l-Ceul y Pl-Scel y subsecuentemente se ligó en el clon de BAC de ratón modificado (descrito anteriormente) para crear el tercer vector de activación.

Esta ligadura resultó en un tercer vector de activación para inserción de secuencias l humanas en el sitio de cadena ligera k endógena, que incluyó, desde 5’ hasta 3’, un brazo de homología de ratón 5’ que contiene -23 kb de secuencia genómica 5’ del sitio k de ratón endógeno, un sitio l-Ceul, un sitio de Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio de Frt 3’, un fragmento de -123 kb que contiene los primeros 12 segmentos de gen hN/l, un fragmento -1 kb que contiene segmentos de gen hJX1 , 2, 3 y 7, un sitio Pl-Scel y un brazo de homología 3’ que contiene -28 kb de secuencia genómica de ratón incluyendo el gen CK de ratón endógeno, EK¡ y Ek3’ y secuencia genómica de ratón adicional corriente abajo (3’) de EK3’ (Figura 22B, Vector de activación 1 2/4-K) . La recombinación homologa con este tercer vector de activación creó un sitio de cadena ligera k de ratón modificado que contiene 12 segmentos de gen hV y cuatro segmentos de gen hJ enlazados de manera operativa al gen CK de ratón endógeno que, con recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera lI-iumana quimérica/k de ratón.

Mini-sitio l humano con secuencia de cadena ligera k humana integrada. En una forma similar, dos vectores de activación adicionales similares a aquellos diseñados por ingeniería genética para elaborar una inserción inicial de segmentos de gen l humano en el sitio de cadena ligera k endógeno (Figura 22B, Vectores de activación 12/1 -K y 1 2/4-K) se diseñaron por ingeniería genética para insertar de manera progresiva segmentos de gen de cadena ligera l humano utilizando vectores de activación únicamente construidos que contienen secuencias genómicas l y k humanas contiguas. Se construyeron estos vectores de activación para incluir una secuencia genómica -23 kb humana k localizada naturalmente entre segmentos de gen VK4- 1 y JK 1 humano. Esta secuencia genómica k humana se coloca específicamente en estos dos vectores de activación adicionales entre segmentos de gen nl humano y J humano (Figura 22B, Vectores de activación 1 2(K) 1 -K y 1 2(K)4K) .

Se elaboraron ambos vectores de activación conteniendo la secuencia genómica k humana utilizando el clon de BAC RP1 1 -729g4 descrito anteriormente (Figura 24). El clon de BAC modificado fue activado con un casete de selección de estreptomicina flanqueado por sitios de restricción de Notl y AsiSI (Figura 24, izquierda superior). La recombinación homologa con el casete de estreptomicina resultó en un clon de BAC 729g4 activado doblemente que incluyó, desde 5’ hasta 3’, un sitio de l-Ceul, un sitio de Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio de Frt 3’, un fragmento de -123 kb que contiene los primeros 12 segmentos de gen 12 hV , un sitio de Notl aproximadamente 200 bp corriente abajo (3’) a la secuencia de nonámero del segmento de gen Iinl3-1 , un casete de estreptomicina y un sitio de AsiSI . Un clon de BAC humano separado conteniendo secuencia k humano (CTD-2366j 12) se activó dos veces independiente para diseñar por ingeniería genetica sitios de restricción en ubicaciones entre segmentos de gen hVic4-1 y hJx1 para permitir clonación subsecuente de un fragmento -23 kb para ligadura con los segmentos de gen Iinl contenidos en el clon de BAC 729g4 modificado activado doble (Figura 24, derecha superior).

Brevemente, el clon de BAC 2366j 12 es aproximadamente de 132 kb de tamaño y contiene segmentos de gen hVic 1 -6, 1 -5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1 , secuencia genómica k humana corriente abajo de los segmentos de gen VK, segmentos de gen hJic 1 -5, el hCic y aproximadamente 20 kb de secuencia generica adicional del sitio k humano. Este clon fue activado primero con un vector de activación que contiene un casete de higromicina flanqueado por sitios de Frt y un sitio de Notl corriente abajo (3’) del sitio de Frt 3’. Los brazos de homología para este vector de activación contuvieron secuencia genómica humana 5’ y 3’ de los segmentos de gen VK dentro del clon de BAC de manera que con recombinación homologa con este vector de activación, se eliminaron los segmentos de gen VK y se diseñó por ingeniería genética un sitio de Notl -133 bp corriente abajo del segmento de gen IIVK4- 1 (Figura 24, derecha superior). El clon de BAC 2366j 12 modificado fue activado independientemente con dos vectores de activación en el extremo 3’ para eliminar los segmentos de gen hJx con un casete de cloranfenicol q ue también contuvo ya sea un segmento de gen hJ 1 , un sitio de Pl-Scel y un sitio de AsiSI o un fragmento genómico l h umano que contiene cuatro s egmentos de gen ?i?l (anterior), un sitio de Pl-Scel y un sitio de AsiSI (Figura 24, derecha superior). Los brazos de homolog ía de estos dos vectores de activación similares contuvieron secuencia 5’ y 3’ de los segmentos de gen hÜK. La recombinación homologa con estos segundos vectores de activación y el clon de BAC 2366j 12 modificado generaron un clon 2366j 12 activado doble que incluyó, desde 5’ hasta 3’, un sitio de Frt 5’, un casete de higromicina, un sitio de Frt 3’, un sitio de Notl, un fragmento genómico de 22,800 bp del sitio k humano que contiene la región intergénica entre los segmentos de gen VK4- 1 y JK 1 , y hace un segmento de gen hJ 1 o un fragmento genómico l humano que contiene Ii?l? , ?l2, ?l3 y ?l7, un sitio de Pl-Scel y un casete de cloranfenicol (Figura 24, derecha superior). Se lograron dos vectores de activación finales para elaborar las dos modificaciones adicionales por dos pasos de ligadura utilizando los clones de 729g4 y 2366j 12 doblemente activados.

Se digirieron clones 729g4 y 2366j 12 doblemente activados con Notl y AsiSI generando un fragmento que contiene casete de neomicina y segmentos de gen hX/l y otro fragmento que contiene fragmento genómico de ~23 kb del sitio k humano que contiene la región intergenica entre los segmentos de gen VK4- 1 y JK1 , ya sea un segmento de gen hJ 1 o un fragmento genómico que contiene segmentos de gen h J l 1 , ?l2, ?l3 y ?l7, en sitio Pl-Scel y el casete de cloranfenicol, respectivamente. La ligadura de estos fragmentos generó dos clones de BAC únicos que contienen desde 5’ hasta 3’ de los segmentos de gen h /l, la secuencia genómica k humana entre los segmentos de gen VK4- 1 y JK 1 , ya sea un segmento de gen hJX1 o un fragmento genómico que contiene segmentos de gen h J l 1 , ?l2, ?l3 y ?l7, un sitio de Pl-Scel y un casete de cloranfenicol (Figura 24, parte inferior). Estos nuevos clones de BAC entonces fueron digeridos con Ceul y Pl-Scel para liberar los fragmentos únicos que contienen el casete de neomicina corriente arriba y las secuencias l y k humanas contiguas y ligadas en un clon de BAC 302g 12 de ratón modificado que contuvo desde 5’ hasta 3’ secuencia genómica de ratón 5’ del sitio k e ndógeno, un sitio l-Ceul, un sitio de Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio de Frt 3’, segmentos de gen h /l (3-12 a 3-1 ), un sitio de Notl -200 bp corriente abajo de nl3-1 , ~23kb de secuencia k humana naturalmente encontrada entre los segmentos de gen VK4- 1 y JK 1 humano, ya sea un segmento de gen Ii?l? o un fragmento genómico que contiene segmentos de gen Ii?l? , ?l2, ?l3 y ?l7, el EKÍ de ratón, el gen CK de ratón y EK3’ (Figura 22, Vectores de activación 12hV -VicJK-h ?l1 y 12Iinl-nk?·k-4I·i?l). La recombinación homologa con ambos de estos vectores de activación creó dos sitios de cadena ligera k de ratón modificadas que contienen 12 segmentos de gen Iinl, secuencia genómica k humana, y cualquiera de uno o cuatro segmentos de gen hV enlazados de manera operativa al gen CK de ratón endógeno que, con recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera humana/K de ratón quimérica.

Ejemplo 12. Diseño por ingeniería genética de Segmentos de gen nl humanos adicionales en un mini-sitio de cadena ligera l humana Se agregaron segmentos de gen hV adicionales independientemente a cada una de las modificaciones iniciales descritas en el Ejemplo 1 1 utilizando vectores y métodos de activación similares (Figura 23A, Vector de activación +16-l y Figura 23B, + 1 6-K Vector de activación).

Introducción de 16 segmentos de gen nl humano adicionales. Brazos de homología corriente arriba (5’) utilizados para construir vectores de activación para agregar 16 segmentos de gen hN l adicionales a los sitios de cadena ligera modificados descritos en el Ejemplo 1 1 contuvieron secuencia 5’ genómica de cualquiera de los sitios de cadena ligera k o l endógena. Los brazos de homología 3’ fueron los mismos para los vectores de activación y contuvieron secuencia genómica humana que se traslapa con el extremo 5’ de la secuencia l humana de las modificaciones como se describe en el Ejemplo 1 1.

Brevemente, se diseñaron por ingeniería genética dos vectores de activación para la introducción de 16 segmentos de gen hN l adicionales a los sitios de cadena ligera de ratón modificados descritos en el Ejemplo 1 1 (Figuras 23A y 5B, Vector de activación + 16-l o + 16-K) . Un fragmento de ADN -172 kb de RP1 1 -761 I 13 de clon de BAC humana (Invitrogen) conteniendo 21 segmentos de gen hV consecutivos del grupo A se diseñó por ingeniería genética con un brazo de homología 5’ que contiene secuencias genómica de ratón 5' para cualquiera de los sitios de cadena ligera k o l endógenos y un brazo de homología 3’ que contiene secuencia l genómica humana. Los brazos de homolog ía k o l de ratón 5’ utilizados en estas construcciones de activación fueron los mismos brazos de homolog ía 5’ descritos en el Ejemplo 1 1 (Figuras 23A y 23B). El brazo de homología 3’ incluyó un traslape de 53,057 bp de secuencia l genómica humana correspondiente al extremo 5’ equivalente del fragmento -123 kb de secuencia l genómica h umana descrito en el Ejemplo 1 1 . Estos dos vectores de activación incluyeron, desde 5’ hasta 3’, un brazo de homología de ratón 5’ que contiene ya sea -23 kb de secuencia genómica 5’ del sitio de cadena ligera k de ratón endógena o -24 kb de secuencia genómica de ratón 5’ del sitio de cadena ligera l endógena, un sitio de Frt 5’, un casete de higromicina, un sitio de Frt 3’ y 171 ,457 bp de secuencia l genómica humana que contiene 21 segmentos de gen h /l consecutivos, -53 kb de los cuales se traslapa con el extremo 5’ de la secuencia l humana descrita en el Ejemplo 12 y sirve como el brazo de homología 3’ para esta construcción de enfoque (Figuras 23A y 23B, Vectores de activación +16-l o + 16-K) . La recombinación homologa con estos vectores de activación que creó sitios de cadena ligera k o l de ratón independientemente modificados cada uno que contiene 28 segmentos de gen 28 ?inl y un segmento de gen Iinl enlazado de manera operativa a genes constantes de ratón endógenos (CK O Ol2) que, después de recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera quimérica.

En una forma similar, el Vector de activación + 16-K también se utilizó para introducir los 16 segmentos de gen Iinl adicionales a las otras modificaciones iniciales descritas en el Ejemplo 1 1 que incorporaron múltiples segmentos de gen hV con o sin una secuencia k humana integrada (Figura 22B). La recombinación homologa con este vector de activación en el sitio k de ratón endógeno que contiene las otras modificaciones iniciales creó sitios de cadena ligera k de ratón que contienen 28 segmentos de gen h /l y segmentos de gen h J l 1 , 2, 3 y 7 con y sin una secuencia genómica VK-JK humana operativamente enlazada al gen CK de ratón endógeno que, despues de recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera l-k quimérica.

Introducción de 12 segmentos de gen nl humano adicionales. Se agregaron segmentos de gen Iinl adicionales independientemente a cada una de las modificaciones descritas anteriormente utilizando vectores y métodos de activación similares. La estructura de sitio final que resulta de recombinación homologa con vectores de activación que contienen segmentos de gen hV adicionales se muestran en las Figuras 25A y 25B.

Brevemente, se diseñó por ingeniería genética un vector de activación para introducción de 12 segmentos de gen hVX adicionales a los sitios de cadena ligera k y l de ratón modificados descritos anteriormente (Figuras 23A y 23B, Vectores de activación +12-l o 1 2-K) . Un fragmento de ADN 93,674 bp de RP1 1 -22I 18 de clon de BAC humano (Invitrogen) que contiene 12 segmentos de gen hV consecutivos del grupo B se diseñó con un brazo de homología 5’ que contiene secuencia genómica de ratón 5’ a cualquiera de los sitios de cadena ligera k o l de ratón endógena y un brazo de homología 3’ que contiene secuencia l genómica humana. Los brazos de homología 5’ utilizados en esta construcción de enfoque fueron los mismos brazos de homología 5’ utilizados para la adición de 16 segmentos de gen h /l descritos anteriormente (Figuras 23A y 23B). El brazo de homología 3’ se elaboró al diseñar por ingeniería genética un sitio de Pl-Scel -3431 bp 5’ al segmento de gen \/l3-29R humano contenido en un fragmento genómico 27,468 bp de secuencia l humana de RP1 1 -761 I 13 de clon de BAC. Este sitio de Pl-Scel sirvió como un punto de ligadura para unir el fragmento de ~94 kb de secuencia l adicional al fragmento de ~27 kb de secuencia l humana que se traslapa con el extremo 5’ de la secuencia l humana en la modificación previa utilizando los Vectores de activación +16-l o + 16-K (Figuras 23A y 23B). Estos dos vectores de activación incluyeron, desde 5’ hasta 3’, un brazo de homología 5’ que contiene ya sea ~23 kb de secuencia genómica de ratón 5' del sitio de cadena ligera k endógena o ~24 kb de secuencia genómica d e ratón 5’ del sitio de cadena ligera l endógena, un sitio de Frt 5’, un casete de neomicina, un sitio de Frt’ y 121 , 188 bp de secuencia l genómica humana que contiene 16 segmentos de gen 16 Iinl y un sitio Pl-Scel, ~27 kb de los cuales se traslapan con el extremo 5’ de la secuencia l humana a partir de la inserción de 16 segmentos de gen hV adicionales y sirve como el brazo de homología 3’ para esta construcción de activación (Figuras 23A y 23B, Vectores de activación +12-l o 1 2-K) . La recombinación homologa con estos vectores de activación creó independientemente sitios de cadena ligera k y l de ratón modificados que contienen 40 segmentos de gen hV y humano J[1 enlazado operativamente a los genes constantes de ratón endógenos CK O Ol2), que, despues de recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera quimérica (parte inferior de las Figuras 23A y 23B).

En una forma similar, también se utilizó el Vector de activación + 1 2-K para introducir los 12 segmentos de gen hV adicionales a las otras modificaciones iniciales que incorporaron múltiples segmentos de gen hV con y sin una secuencia k humana integrada (Figura 22B). La recombinación homologa con este vector de activación en el sitio k de ratón endógeno que contiene las otras modificaciones creó un sitio de cadena ligera k de ratón que contiene 40 segmentos de gen Iinl y segmentos de gen hV!1 , 2, 3 y 7 con y sin una secuencia genómica VK-JK humana enlazada operativamente al gen CK de ratón endógeno que, después de recombinación, lleva a la formación de una cadena ligera l-k quimérica.

Ejemplo 13. Identificación de células ES activadas que tienen segmentos de gen de cadena ligera l humana Se utilizó ADN de BAC activado elaborado de acuerdo con los siguientes Ejemplos para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricos que expresan segmentos de gen de cadena ligera l humana. Se identificaron células ES conteniendo una inserción de segmentos de gen de cadena ligera TAQMAN® humana mediante un ensayo de l cuantitativo. Se diseñaron por ingeniería genética grupos de iniciadores específicos y sondas para inserción de secuencias l humanas y casetes de selección asociados (ganancia de alelo, GOA), pérdida de secuencia de ratón endógenas y cualquier casete de selección (pérdida de alelo, LOA) y retención de secuencias de ratón de flanqueo ( retención d e alelo, AR). Para cada inserción adicional de secuencias l humanas, se utilizaron grupos de iniciador adicionales y sondas para confirmar la presencia de las secuencias l humanas adicionales así como los grupos de iniciador previos y sondas utilizadas para retención de las secuencias humanas previamente activadas. El Cuadro 10 describe los iniciadores y sondas asociadas utilizados en los ensayos de PCR cuantitativos. El Cuadro 1 1 describe las combinaciones utilizadas para confirmar la inserción de cada sección de segmentos de gen de cadena ligera l humana en clones de célula en ES.

Las células de ES que tienen los segmentos de gen de cadena ligera l humana se transfectaron opcionalmente con una construcción que expresa FLP con el fin de remover el casete de neomicina Frt’ed introducido por la inserción de la construcción de activación que contiene segmentos de gen V 5-52-V 1 -40 humano (Figuras 23A y 23B). El casete de neomicina puede removerse opcionalmente mediante crianza para ratones que expresan recombinasa de FLP (por ejemplo, US 6,774,279). Opcionalmente, el casete de neomicina se retiene en los ratones.

CUADRO 10 Iniciador SEC ID NO: Sonda SEC ID NO: CUADRO 11 Ejemplo 14. Generación de ratones que expresan cadena ligera l humana a partir de un sitio de cadena ligera endógena Se utilizaron celulas ES activadas descritas anteriormente como células ES de donador y se introdujeron en un embrión de célula de tapa de 8 células por el método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, Patente de E.U .A. No. 7,294,754 y Poucymirou y otros (2007) Ratones de generación de F0 que son esencialmente derivados de manera completa de las células ES activadas en gen donante permitiendo los análisis fenotípicos inmediatos Nature Biotech. 25(1 ):91 -99. VELOCIMICE® (Ratones F0 completamente derivados de la célula ES de donador) independientemente llevando segmentos de gen l humanos se identificaron m ediante el g enotipo utilizando una modificación de ensayo de alelo (Valenzuela y otros, anteriormente) que detecta la presencia de los segmentos de gen l humana únicos (anteriormente).

Uso de cadena ligera K^ d e ratones que tienen segmentos de gen de cadena ligera l humana.

Ratones homocigóticos para cada tres inserciones sucesivas del segmento de gen hV/l con un segmento de gen h /l individual (Figura 23B) y ratones homocigóticos para una primera inserción de segmentos de gen h /l con cualquiera de un segmento de gen h /l individual o 4 segmentos de gen JX humana incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana (Figura 22B) se analizaron para expresión de cadena ligera k y l en esplenocitos utilizando citometría de flujo.

Brevemente, se recolectaron bazos de grupos de ratones (que varían desde 3 hasta 7 animales por grupo) y se molieron utilizando placa de vidrio. Despues de lisis de glóbulos rojos (RBC) con regulador de pH de lisis ACK (Lonza Walkersville), los esplenocitos se tiñeron con anticuerpos conjugados de tinte fluorescente específicos para ratón CD19 (clon 1 D3; BD Biosciences), CD de ratón (17A2; Biolegend), IgK de ratón (187.1 ; BD Biosciences) y I g l de ratón (RML-42; Biolegend). Se adquirieron datos utilizando un citómetro de flujo BD™ LSR I I (BD Biosciences) y se analizaron utilizando software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). El Cuadro 12 describe los valores de porcentaje promedio para células B (CD19+), cadena ligera k (O? 19 + ^k+^l ), y expresión de cadena ligera l (CD19+lgK lg +) observado en esplenocitos de grupos de animales que tienen cada modificación genética.

En un experimento similar, contenidos de célula B del compartimento esplénico de ratones homocigóticos para una primera inserción de 12 segmentos de gen hN/l y 4 hN/l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana enlazada de manera operativa al gen CK de ratón (parte inferior de la Figura 22B) y ratones homocigóticos para 40 segmentos de gen h /l y uno h /l (parte inferior de la Figura 23B o parte superior de la Figura 25B) se analizaron para expresión de Igaic y I g l utilizando citometría de flujo (como se describió anteriormente). La Figura 26A muestra la expresión de I g l y IgK en células CD19+B para un ratón representativo de cada grupo. El número de células CD19+B por bazo también se registró para cada ratón (Figura 26B).

En otro experimento, contenidos de célula B del bazo y compartimentos de médula ósea de ratones homocigóticos para 40 segmentos de gen hV y 4 h /l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana enlazada operativamente al gen CK de ratón (parte inferior de la Figura 26B) se analizaron por progreso a través de desarrollo de célula B utilizando citometría de flujo de varios marcadores de superficie celular.

Brevemente, dos grupos (n = 3 cada uno, 9-12 semanas de edad, machos y hembras) de ratones de tipo silvestre y homocigóticos para 40 segmentos de gen h /l y 4 h /l incluyendo una secuencia genómica económica VK-JK humana enlazada operativamente al gen CK ratón se sacrificaron y se recolectaron bazos y médula ósea. Se recolectó médula ósea del fémur al liberarse con medio RPMI completo (medio RPMI complementado con suero de cabra fetal, piruvato de sodio, Hepes, 2-mercaptoetanol aminoácidos no esenciales, y gentamicina). RBC de preparaciones de bazo y médula ósea se Usaron con regulador de pH de lisis ACK (Lonza Walkersville), seguido por lavado con medio RPMI completo. Se incubaron 1 x106 células con CD16/CD32 anti-ratón (2.4G2, BD Biosciences) sobre hielo durante 10 minutos, seguido por etiquetado con un panel de anticuerpo seleccionado durante 30 minutos sobre hielo.

Panel de médula ósea: FITC-CD43 anti-ratón ( 1 B 1 1 , BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41 , eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (1 1 -26c.2a, BioLegend), APC-B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (I D3, BD) y Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).

Panel de médula ósea y bazo: FITC-lgx anti-ratón (187.1 , BD) PE-lg (RML-42, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41 , ebioscience), PerCp-Cy5.5-lgD (1 1 -26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC-B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).

Después de tinción, las células se lavaron y se fijaron en 2% de formaldehído. Se realizó adquisición de datos en un citómetro de flujo FACSCANTOII™ (BD Biosciences) y se analizaron con software FLOWJO™ (Tree Star, Inc ). Las Figuras 27A-27D muestran los resultados para el compartimento esplénico de un ratón representativo de cada grupo. Las Figuras 28A y 28E muestran los resultados del compartimento de médula ósea de un ratón representativo de cada grupo. El cuadro 13 describe los valores de porcentaje promedio para células B (CD19+), cadena ligera k (CD 19 + lgK+lg ), y expresión de cadena ligera l (CD19 + lgic lg +) observada en esplenocitos de grupos de animales que tienen varias modificaciones genéticas. El cuadro 14 describe los valores de porcentaje promedio para células B (CD19+), células B maduras (B220h'lgM+), células B inmaduras (B220mtlgM), células B inmaduras que expresan cadena ligera k (B220'ntlgM + ) y células B inmaduras que expresan cadena ligera l (B220'n,lgM+lg +) observadas en médula ósea de tipos silvestre y ratones homocigóticos para 40 segmentos de gen h /l y 4 h /l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana enlazada operativamente al gen CK de ratón. Este experimento se repitió con grupos adicionales de los ratones descritos anteriormente y demostraron resultados similares (datos no mostrados).

CUADRO 12 CUADRO 13 CUADRO 14 Uso de gen nl humano en ratones que tienen segmentos de gen de cadena ligera l humana Se analizaron ratones heterocigóticos para una primera inserción de secuencias l humanas (Iinl3-12-Iinl3-1 y hV 1 , Figura 23B) y homocigóticos para una tercera inserción de secuencias l humanas (hV 5-52-h\ 3-1 y h /lI , Figura 23B) para uso de gen de cadena ligera l humana por reacción de cadena de transcriptasa de polimerasa inversa (RT-PCR) utilizando ARN aislado de esplenocitos.

Brevemente, se recolectaron bazos y se inyectaron con 10 mi de RPMI-1640 (Sigma) con 5% de HI-FBS en bolsas desechables esterilizadas. Cada bolsa conteniendo un bazo individual entonces se colocó en un STOMACHER™ (Seward) y se homogeneizó en un medio establecido durante 30 segundos. Se filtraron bazos homogeneizados utilizando un colador de célula de 0.7 mm y se formó a pellas con una centrífuga (1000 rpm durante 10 minutos) y los RBC se Usaron en BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) durante 3 minutos. Los esplenocitos se diluyeron con RPMI-1640 y se centrifugaron de nuevo, seguido por nueva suspensión en 1 mi de PBS (Irvine Scientific). Se aisló el ARN de los esplenocitos granulados utilizando téenicas estándares conocidas en la técnica.

Se realizó RT-PCR en ARN de esplenocito utilizando iniciadores específicos para segmentos de gen hV/l humano y el gen CK de ratón (Cuadro 15) . Se purificaron con gel y clonaron productos de PCR en vector pCR2.1 -TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron con iniciadores M 13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; SEC ID NO: 1 13) y M 13 inverso (CAGGAAACAG CTATGAC; SEC ID NO: 1 14) localizados dentro del vector en ubicaciones que flanquean el sitio de conexión. Se secuenciaron 84 clones totales derivados de las primeras y terceras inserciones de secuencias l humanas para determinar el uso de gen hV/l (Cuadro 16). La secuencia de nucleótido de la unión h\ -h\ 1 -mCic para clones RT-PCR seleccionado se muestra en la Figura 29.

En una forma similar, ratones homocigóticos para una tercera inserción de secuencias de gen de cadena ligera l humana (es decir 40 segmentos de gen h /l y cuatro segmentos de gen h /l incluyendo una secuencia genómica VK-JK humana, parte inferior de la Figura 25B) operativamente enlazadas al gen CK de ratón endógeno se analizaron para uso de gen de cadena ligera l humana por RT-PCR utilizando ARN aislado de esplenocitos (como se describió anteriormente). El uso de segmento de gen de cadena ligera l para 26 clones RT-PCR seleccionados se muestra en el Cuadro 17. La secuencia de nucleótido de la unión hV¾-hV -mCK para clones RT-PCR seleccionados se muestra en la Figura 30.

En una forma similar, ratones homocigóticos para una primera inserción de segmentos de gen de cadena ligera l humana (12 segmentos de gen h /l y hV 1 , Figura 22A y Figura 23A) operativamente enlazados al gen C 2 de ratón endógeno se analizaron para uso de gen de cadena ligera l por RT-PCR utilizando ARN aislado de esplenocitos (como se describió anteriormente). Los iniciadores específicos para segmentos de gen h /l (Cuadro 15) se emparejaron con uno de dos iniciadores específicos para el gen Ol2 de ratón; Ol2-1 (SEC ID NO: 162) o C 2-2 (SEC I D NO: 163).

Múltiples segmentos de gen h /l reclasificados para h /lI se observaron a partir de los clones de RT-PCR de ratones que tienen segmentos de gen de cadena ligera l humana en el sitio de cadena ligera l de ratón endógeno. La secuencia de nucleótido de la unión hV - hV -mC 2 para clones RT-PCR seleccionados se muestra en la Figura 31 .

CUADRO 15 Iniciador 5’ hN l Secuencia (5’-3’j SEC ID NO: CUADRO 16 h/l No. de clones observados CUADRO 17 Clon hN/l ?l La Figura 29 muestra la secuencia de la unión de hV -hJ 1 -mCK para clones RT-PCR de ratones que tienen una primera y tercera inserción de segmentos de gen h /l con un segmento de gen hV/l individual. Las secuencias mostradas en la Figura 29 ilustran reclasificaciones únicas que involucran diferentes segmentos de gen hVX con hJ 1 recombinado con el gen CK de ratón. Ratones heterocigóticos que tienen un sitio k endógeno modificado individual que contiene 12 segmentos de gen h /l y hJ 1 de ratones homocigóticos que llevan dos sitios k endógenos modificados conteniendo 40 segmentos de gen h /l y h J l 1 fueron ambos capaces de producir segmentos de gen l humano enlazados operativamente al gen CK de ratón y producir celulas B que expresaron cadenas ligeras l humanas. Estas reclasificaciones demuestran que los sitios quiméricos fueron capaces de reclasificar independientemente segmentos de gen l humano en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, estas modificaciones al sitio de cadena ligera k endógena no presentó ninguno de los segmentos de gen h l inoperables o previene que el sitio quimérico recombine múltiples segmentos de gen hN/l y un hJ (?l1 ) durante desarrollo de célula B como se evidenció por 16 segmentos de gen h /l diferentes que se observaron para reclasificación con Ii?l? (Cuadro 16). Además, estos ratones hicieron anticuerpos funcionales que contienen segmentos de gen /l-?l humano reclasificados enlazados operativamente a genes CK de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de ¡nmunoglobulina endógena.

La Figura 30 muestra la secuencia de la unión hV -hJ 1 -mCic para clones de RT-PCR seleccionados de ratones homocigóticos para 40 segmentos de gen hV y 4 hV/l incluyendo una secuencia genómica /l-?l humana. Las secuencias mostradas en la Figura 30 ilustran reclasificaciones únicas adicionales que involucran múltiples segmentos de gen h /l diferentes, que abarcan todo el sitio quimerico, con múltiples segmentos de gen hN/l diferentes reclasificados y enlazados de manera operativa al gen CK de ratón. Ratones homocigóticos que llevan sitios k endógenos modificados que contienen 40 segmentos de gen hN/l y 4 h /l también fueron capaces de producir segmentos de gen l humano enlazados operativamente al gen CK de ratón y producir células B que expresan cadenas ligeras l humanas. Estas reclasificaciones además demuestran que todas las etapas de sitios quiméricos fueron capaces de redistribuir independientemente segmentos de gen l humano en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, estas modificaciones adicionales al sitio de cadena ligera k endógena demuestra que cada inserción de segmentos de gen l humano no presenta ninguno de los segmentos de gen hN/l y/o ?l inoperables o previenen que el sitio quimérico recombine los segmentos de gen h /l y ?l durante desarrollo de célula B como se evidenció por 12 segmentos de gen hN/l diferentes que se observaron para reclasificación con los 4 segmentos de gen hN/l (Cuadro 17) desde los 26 clones de RT-PCR seleccionados. Además, estos ratones así como anticuerpos funcionales bien elaborados que contienen segmentos de gen nl-?l humano enlazados operativamente a regiones CK de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

La Figura 31 muestra la secuencia de la unión Iinl-???l-itiOl2 de tres clones de RT-PCR individuales de ratones homocigóticos para 12 segmentos de gen h /l y Ii?l? . Las secuencias mostradas en la Figura 31 ilustran reclasificaciones únicas adicionales que involucran diferentes segmentos de gen nl, abarcando la longitud de la primera inserción, con Ii?l? reclasificado y enlazado operativamente al gen C 2 de ratón (2D1 = nl2-8?l1 ; 2D9 = /l3-10 ?l 1 ; 3E 15 = nl3-ul1 ). Un clon demostró una reclasificación no productiva debido a N adiciones en la unión ??nl- Ii ?l ( 201 , Figura 31 ). Esto no es poco común en recombinación V(D)J ya que la unión de segmentos de gen durante recombinación ha sido mostrada por ser imprecisa. Aunque este clon representa un recombinante no productivo presente de repertorio de cadena ligera de estos ratones, esto demuestra que el mecanismo genético que contribuye a la diversidad de unión entre genes de anticuerpo está operando normalmente en estos ratones y llevando a un repertorio de anticuerpo que contiene cadenas ligeras con mayor diversidad.

Ratones homocigóticos que tienen sitios l endógenos modificados que contienen 12 segmentos de gen h /l y Ii?l? también fueron capaces de producir segmentos de gen l humano enlazados operativamente a un gen CX de ratón endógeno y producir células B que expresaron cadenas ligeras X quiméricas inversas que contienen regiones hVX enlazadas a regiones CX de ratón. Estas reclasificaciones además demuestran que segmentos de gen de cadena ligera l humana colocados en el otro sitio de cadena ligera (es decir, el sitio l) fueron capaces de redistribuir independientemente segmentos de gen l humano en múltiples células B independientes en estos ratones. Además, las modificaciones del sitio de cadena ligera l endógena demuestran que la inserción de segmentos de gen l humanos no presentó ninguno de los segmentos de gen hVX y/o hJX1 inoperable o previene la pérdida quimérica de recombinar segmentos de gen hVX y hJX1 durante desarrollo de célula B. Además, estos ratones también hicieron anticuerpos funcionales que contienen segmentos de gen VX-JX humano enlazados operativamente a una región CX de ratón como parte del repertorio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

Como se muestra en este ejemplo, ratones que llevan segmentos de gen de cadena ligera X humana en los sitios de cadena ligera k y X endógena son capaces de redistribuir segmentos de gen de cadena ligera X humana y expresarlos en el contexto de una región CK y/o CX de ratón como parte del repertorio de anticuerpo normal del ratón debido a que se requiere una cadena ligera funcional en varios puntos de revisión en desarrollo de célula B tanto en el bazo como en la médula ósea. Además, subgrupos tempranos de celulas B (por ejemplo, células B pre-, pro- y de transición) demuestran un fenotipo normal en estos ratones cuando compara con crías de la misma cámara de tipo silvestre (Figuras 27D, 28A y 28B). Un pequeño déficit en médula ósea y poblaciones de célula B periférica se observó, lo que puede atribuirse a u na e liminación de un subgrupo de células B inmaduras auto-reactivas y/o asociación subóptima de cadena ligera l humana con cadena pesada de ratón. Sin embargo, el uso de Igic/lg observado en estos ratones demuestra una situación que es más como expresión de cadena ligera humana en lo que se observó en los ratones.

Ejemplo 15. Crianza de ratones que expresan cadenas ligeras l humanas a partir de un sitio de cadena ligera endógena Para optimizar el uso de segmentos de gen l humano en un sitio de cadena ligera de ratón endógena, ratones que tienen los segmentos de gen l humano no reclasificados se criaron para otro ratón que contiene una eliminación en el sitio de cadena ligera endógena opuesta (cualquiera de k o l). Por ejemplo, los segmentos de gen l humano colocados en el sitio k endógeno serían los únicos segmentos de gen de cadena ligera funcionales presentes en un ratón que también transportaron una eliminación en el sitio de cadena ligera l endógena. De esta forma, la progenie obtenida expresaría únicamente cadenas ligeras l humanas como se describió en los ejemplos anteriores. La crianza se realiza por téenicas estándares reconocidas en la técnica y, alternativamente, por compañías comerciales, por ejemplo, The Jackson Laboratory. Las cepas de ratón que tienen segmentos de gen de cadena ligera l humana en el sitio k e ndógeno y una eliminación del sitio d e canal ligeras l endógena se filtran por presencia de cadenas ligeras l (humanos-de ratón) quimericas inversas únicas y ausencia de cadenas ligeras l de ratón endógena.

También se criaron ratones que tienen un sitio de cadena ligera l humana no reclasificada con ratones que contienen un reemplazo del sitio de gen variable de cadena pesada de ratón endógena con el sitio d e gen variable de cadena pesada humana (ver US 6,956,541 , Regeneron Pharmaceuticals, los ratones genéticamente diseñados VELOCI MMUNE®). El ratón VELOCIMMUNE® incluye, en parte, tener un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada humanas enlazadas operativamente a sitios de región constante de ratón endógenos de manera que el ratón produce anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada de ratón en respuesta a estimulación antihigiénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos puede aislarse y enlazarse operativamente con ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada humana. El ADN entonces puede expresarse en una célula capaz de expresar la cadena pesada completamente humana del anticuerpo. Después de un programa de crianza adecuado, se obtienen ratones que llevan un reemplazo del sitio de cadena pesada de ratón endógena con el sitio de cadena pesada humana en un sitio de cadena ligera l humana no reclasificado en el sitio de cadena ligera k endógena. Anticuerpos que contienen regiones variables de cadena pesada humana somáticamente multada y regiones variables de cadena ligera l humana pueden aislarse con inmunización con un antígeno de interes.

Ejemplo 16. Generación de anticuerpos a partir de ratones que expresan cadenas pesadas humanas y cadenas ligeras l humanas Después de criar ratones que contienen el sitio de cadena ligera l humana no reclasificado a varias cepas deseadas que contienen modificaciones y eliminaciones de otros sitios de Ig endógenos (como se describió anteriormente), se inmunizan ratones seleccionados con un antígeno de interés.

Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® que contiene una de las regiones de cadena ligera de línea germinal humana reclasificadas individuales se atacó con un antígeno, y se recuperaron células linfáticas (tal como células B) del suero de los animales. Las células linfáticas pueden ser fusionadas con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y tales líneas celulares de hibridoma son filtradas y seleccionadas para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que contienen cadena pesada humana y cadena ligera l humana que son específicas para el antígeno utilizado para inmunización. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras l puede aislarse y enlazarse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y cadena ligera. Debido a la presencia de los segmentos de gen h /l adicionales cuando se comparan con el sitio l de ratón endógeno, la diversidad del repertorio de cadena ligera aumenta dramáticamente y confiere diversidad superior sobre el repertorio específico de antígeno con inmunización. Las secuencias de anticuerpo clonadas resultantes pueden producirse subsecuentemente en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno (por ejemplo, células B).

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describió anteriormente, los anticuerpos son caracterizados y seleccionados para características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón son reemplazadas con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano que contiene una cadena pesada humana somáticamente mutada y una cadena ligera l humana derivada de un sitio de cadena ligera l humana no reclasificado de la invención. Regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, tipo silvestre o I g G 1 , lgG2; lgG3, o lgG4 modificados.

Ejemplo 17. Crianza de ratones ADAM6 y ratones de variable l humana Cualquiera de los ratones aquí descritos que comprenden una modificación de un gen ADAM6 endógeno u ortólogo u homólogo del mismo, y además comprenden un gen que confiere función ADAM6 en el ratón, se cría con un ratón que comprende una modificación que comprende un segmento de variable l humano (por ejemplo, un segmento V y J) enlazado operativamente a un gen constante l o k humano o de ratón. El ratón que comprende el segmento de variable l humana puede tener el segmento de variable presente en un sitio l o k endógeno modificado, o en un transgen. Los ratones son criados y la progenie es cruzada adlcionalmente, si es necesario, y la progenie se filtra para ratones fértiles que exhiben la función ADAM6 y que también expresan la secuencia l humana en el contexto de una región constante l o k humana o de ratón, como pueda ser el caso.

Un ratón que comprende un sitio variable de cadena pesada humanizada (segmentos humanos V, D, y J que reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos V, D, y J de ratón) que además comprende una secuencia ADAM6 ectópica (o una secuencia de un ortólogo u homólogo de ADAM6 que confiere función ADA 6 en el ratón) se cría con un ratón que comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos V y J de cadena ligera con segmento V y J de cadena ligera l humana en el sitio l de ratón y/o el sitio k de ratón. Adicionalmente se cría progenie según sea necesario, y se identifican r atones que expresan un anticuerpo que comprende un VH humano fusionado con una secuencia constante de cadena pesada, y l VL humano de cognado con una secuencia constante de cadena ligera l o K.

Los ratones son expuestos a un antígeno de interes y se deja generar una respuesta inmune. Se identificaron anticuerpos específicos para el antígeno de interés, y se identificaron y emplearon secuencias VH humanas y secuencias variables l humanas (incluyendo secuencias variables l humanas enlazadas a regiones constantes k de ratón) para elaborar un anticuerpo humano al diseñar las secuencias de dominios variable en combinación con genes de región constante humanos.

En un caso, se crea un ratón mediante crianza que comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos V, D, y J de cadena pesada de ratón con segmentos V, D, y J humanos en el sitio de cadena pesada de ratón endógeno, y que comprende un alelo de cadena ligera que comprende un reemplazo de todas o sustancialmente todas las secuencias variables de cadena ligera l con una o más secuencias variables l humanas en un sitio l de ratón endógeno enlazado operativamente a una secuencia constante l, y que comprende un alelo de cadena ligera que comprende un reemplazo de todas o sustancialmente todas las variables de cadena ligera k en un sitio k endógeno con una o más secuencias variables l humanas. El animal está expuesto a un antígeno de interés y se deja para montar una respuesta inmune. Se identificaron anticuerpos que enlazan el antígeno de interés que comprenden cognado de dominios variables de cadena pesada humanos con dominios variables l humanos en una región constante l de ratón o k de ratón. Se emplearon secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios variables para elaborar un anticuerpo completamente humano al diseñar por ingeniería genética las secuencias variables en combinación con secuencias de región constante humana.

Los ratones como se describió en este ejemplo comprenden una o más de las regiones intergénicas VK-JK descritas aquí en el texto y las figuras.

Claims

REIVINDICACIONES

1 .- Un animal no humano que comprende: (a) una inserción de uno o más segmentos de gen VX. y ?l humano corriente arriba de una región constante de cadena ligera ¡nmunoglobulina no humana, (b) una inserción de uno o más segmentos de gen VH humanos, uno o más segmentos de gen DH humanos, un y uno o más JH humanos corriente arriba de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, y (c) una secuencia de nucleótido que codifica la proteína ADAM6 o un fragmento funcional de la misma, en donde la proteína ADAM6 es expresada de una secuencia de ácido nucleico ADAM6 ectópica.

2.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las regiones constantes de cadena pesada y/o ligera no humana se seleccionan de regiones constantes de ratón, rata o hámster.

3.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la región constante de cadena ligera no humana es una región constante de roedor.

4.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región constante de cadena ligera de roedor es una región CK de ratón.

5.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región constante de cadena ligera de roedor es una región CK de rata.

6.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región constante de cadena ligera de roedor es una región CX de ratón.

7.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región constante de cadena ligera de roedor es una región CX de rata.

8.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el animal no humano comprende de al menos 12 a al menos 40 segmentos de gen VX humano y al menos un segmento de gen ?l humano.

9.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el animal no humano comprende 12 segmentos de gen VX humano y al menos un segmento de gen ?l humano.

10.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el animal no humano comprende 28 segmentos de gen VX humano y al menos un segmento de gen ?l humano.

1 1 .- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el animal no humano comprende 40 segmentos de gen VX humano y al menos un segmento de gen ?l humano.

12.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el por lo menos un segmento de gen ?l humano se selecciona de ?l1 , JX2, ?l3, ?l7 y una combinación de los mismos.

13.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el no humano comprende al menos cuatro segmentos de gen J humano.

14.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos cuatro segmentos de gen ?l humano comprenden al menos ?l1 , ?l2, ?l3 y ?l7.

15.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma es ectópica en el animal no humano.

16.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma está presente en la misma ubicación cuando se compara con un sitio ADAM6 no humano de tipo silvestre.

17.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma está presente en una ubicación ectópica en el genoma animal no humano.

18.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma está presente dentro de segmentos de gen de inmunoglobulina.

19.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 18, en donde los segmentos de gen de inmunoglobulina son segmentos de gen de cadena pesada.

20.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 19, en donde los segmentos de gen de cadena pesada son humanos.

21 .- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 19, en donde los segmentos de gen de cadena pesada son segmentos de gen de cadena pesada endógena del animal no humano.

22.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el animal no humano carece de un segmento de gen VL y/o JL de inmunoglobulina endógena en un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

23.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el animal no humano comprende segmentos de gen VL y/o JL de inmunoglobulina endógena que son incapaces de reclasificación para formar un dominio VL de inmunoglobulina en el animal no humano.

24.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VK y JK de inmunoglobulina endógena se reemplazan con uno o más segmentos de gen nl y ?l humano.

25.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde todos o sustancialmente todos los segmentos de gen nl y ?l de inmunoglobulina endógena se reemplazan con uno o más segmentos de gen nl y ?l humano.

26.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde todos o sustancialmente todos los segmentos de gen VL y JL de inmunoglobulina endógena están intactos en el animal no humano y el animal no humano comprende uno o más segmentos de gen VX humano y uno o más segmentos de gen JX humano insertados entre segmentos de gen VL y/o J L de inmunoglobulina endógena y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

27.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 26, en donde los segmentos de gen VL y JL de inmunoglobulina endógena intactos se hacen incapaces de reclasificación para formar un dominio VL de un anticuerpo en el animal no humano.

28.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el animal no humano además comprende una región intergenica VK-JK humana de un sitio de cadena ligera k humana, en donde la región intergénica VK-JK humana es contigua con uno o más de los segmentos de gen nl y JX humano.

29.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la región intergénica VK-JK humana se coloca entre un segmento de gen VX humano y un segmento de gen JX humano.

30.- Una célula o tejido derivado del animal no humano de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones precedentes.

31 .- Uso de la célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 30 para elaborar una proteína de unión a antígeno.

32.- Uso de la célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 30 para elaborar un hibridoma o cuadroma.

33.- Uso de acuerdo con la reivindicación 31 o 32, en donde la celula es una célula B.

34.- Uso de acuerdo con la reivindicación 31 o 32, en donde el tejido se deriva de bazo, médula ósea o nodo linfático del animal no humano.

35.- Uso de la célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 30 para elaborar un anticuerpo completamente humano.

36.- Uso de la célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 30 para elaborar un dominio nl humano y/o un dominio VH humano.

37.- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 -36, en donde la célula o tejido es uno derivado de un ratón.

38.- Un método para elaborar un anticuerpo que se une a un antígeno de interés se proporciona, en donde el método comprende, (a) exponer a un animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -29 a un antígeno de interés, (b) aislar uno o más linfocitos B del animal no humano, en donde uno o más de los linfocitos B expresan un anticuerpo que une el antígeno de interés, y (c) identificar la secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina del anticuerpo que une ese antígeno de interés, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina comprende un dominio nl humano y un dominio constante de cadena ligera no humana, y (d) emplear la secuencia de ácido nucleico de (c) con una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana para elaborar un anticuerpo humano que une el antígeno de interes.

39.- El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la región constante de cadena ligera no humana es CK de ratón.

40.- El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la región constante de cadena ligera no humana es CA de ratón.

41 .- El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un dominio VH humano y un dominio CH no humano.

42.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38-41 , en donde el animal no humano es un ratón.

43.- Un animal no humano genéticamente modificado que comprende, (a) uno o más segmentos de gen VA humano no reclasificados y uno o más segmentos de gen J humano no reclasificados en un sitio de cadena ligera de inmunoglobulina endógena del animal no humano, (b) uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano, y uno o más segmentos de gen JH humano en un sitio de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del animal no humano, en donde el animal no humano es capaz de expresar una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma.

44.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 43 en donde el animal no humano expresa anticuerpos que contienen cadenas pesadas que comprenden dominios VH h umanos y regiones constantes de cadena pesada no humanas y cadenas ligeras que comprenden dominios nl humanos y regiones constantes de cadena ligera no humanas.

45.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 43 o 42, en donde el dominio constante de cadena ligera no humana es un dominio CK O C .

46.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-45, en donde la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma se codifica por una secuencia ectópica en la línea germinal del ratón.

47.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-46, en donde la proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma se codifica por una secuencia endógena del animal no humano.

48.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en donde el sitio de cadena ligera endógena del animal no humano es en sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina.

49.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en donde el sitio de cadena ligera endógena del animal no humano es su sitio de cadena ligera k de inmunoglobulina.

50.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-49, en donde el animal no humano carece de un segmento de gen VL y/o JL endógeno en el sitio de cadena ligera endógena.

51 .- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el segmento de gen VL y/o JL son un segmento de gen VK y/o JK.

52.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el segmento de gen VL y/o JL son un segmento de gen nl y/o JA.

53.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-52, en donde los segmentos de gen VL y JL del animal no humano se reemplazan por uno o más segmentos de gen VA humano y uno o más segmentos de gen ?l humano.

54.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 53, en donde los segmentos de gen VL y JL son segmentos de gen K.

55.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 53, en donde los segmentos de gen VL y JL son segmentos de gen l.

56.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-55, en donde los segmentos de gen \/l humanos son un fragmento del grupo A del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana.

57.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el fragmento del grupo A se extiende desde VA3-27 humano a VA3-1 humano.

58.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el fragmento del grupo A se extiende desde /l3-12 humano a ?l1 humano.

59.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-55, en donde uno o más segmentos de gen nl humano son de un fragmento del grupo B del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana.

60.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el fragmento del grupo B se extiende desde nl5-52 humano a \/l1 -40 humano.

61 .- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-55, en donde uno o más de los segmentos de gen \/l humano son de un fragmento del grupo A y uno de un fragmento del grupo B del sitio de cadena ligera l de inmunoglobulina humana.

62.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las indicaciones 43-61 , en donde el animal no humano comprende al menos 12 segmentos de gen nl humano.

63.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el animal no humano comprende al menos 28 segmentos de gen nl humano.

64.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el animal no humano comprende al menos 40 segmentos de gen nl humano.

65.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el por lo menos un segmento de gen ?l humano se selecciona del grupo que consiste de J l 1 , ?l2, ?l3, ?l7, y una combinación de los mismos.

66.- El animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-65, en donde el animal no humano es un roedor.

67.- El animal no humano de acuerdo con la reivindicación 66, en donde el roedor es un ratón o una rata.

68.- Uso del animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-67 para elaborar una proteína de unión a antígeno.

69.- Uso de acuerdo con la reivindicación 68, en donde la proteína de unión a antígeno es humana.

70.- Uso de acuerdo con la reivindicación 68, en donde la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo.

71 .- Una célula o tejido derivado de un animal no humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43-67.

72.- La célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 71 , en donde el tejido se deriva de un bazo, médula ósea o un nodo linfático.

73.- La célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 71 , en donde la célula es una célula B.

74.- La célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 71 , en donde la célula es una célula madre embriónica (ES).

75.- La célula o tejido de acuerdo con la reivindicación 69, en donde la célula es una célula germinal.

76.- Un animal macho no humano fértil que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio Ul humano o un dominio VK humano, y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un dominio VH humano, en donde el animal no humano macho comprende un sitio de región variable de carga pesada modificado y un gen ADAM6 ectópico que es funcional en el animal no humano macho.

77.- El animal no humano macho fertil de acuerdo con la reivindicación 76, en donde el animal no humano es un ratón.