JP7515410B2 - 複数のジスルフィド架橋によって安定化され、遺伝子変換によって多様化された長いcdr-h3sで抗体を作製するトランスジェニックニワトリ - Google Patents
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相互参照
本出願は、2018年7月13日に出願された米国仮特許出願第62/684,669号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年7月13日に出願された米国仮特許出願第62/684,669号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
天然ニワトリ抗体の重鎖のCDR3領域は、2つのDセグメントが、VDJ組換え後に重鎖遺伝子座に頻繁に組み込まれるように思われるため、概して、非常に長くなり得る。ニワトリ抗体の重鎖が長いCDR3に対応する能力は、ニワトリが、「長い」CDR、特に空洞、例えば、酵素の活性部位の隙間、GPCRのリガンド結合部位、またはイオンチャネルのポケットなどに伸び得るノブまたは隆起を有する長いCDRを有する改変抗体を発現するための魅力的なシステムにする。そのような「長いCDR3」抗体を産生するようにニワトリを遺伝子操作する際の課題の1つは、ニワトリがその領域において余分な多様性を持つ抗体集団を産生するように、その領域を多様化する方法である。
本開示の特定の態様は、多様化された超長システインに富む重鎖CDR3領域を有する抗体、例えば、重鎖のみの抗体を産生するトランスジェニック動物に関する。
本開示は、以下の[1]から[26]を含む。
[1]トランスジェニックニワトリであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、
(a)CDR3が、30~60アミノ酸長さの範囲にあり、少なくとも2つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、
(b)上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を(a)の上記重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、上記偽遺伝子が、上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、B細胞を含む、トランスジェニックニワトリ。
[2]上記ニワトリの非B細胞が、VHセグメント、Dクラスター、Jセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、上記Dクラスター内の各Dセグメントが、30~60アミノ酸長さの範囲内の異なる配列をコードし、少なくとも2つ)のシステイン残基を含む、上記[1]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[3]上記ニワトリの非B細胞が、(a)の上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および(b)の上記偽遺伝子を含む、上記[1]または[2]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[4]上記偽遺伝子が、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域に対応する配列を含まない、上記[1]~[3]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[5]上記偽遺伝子が、遺伝子変換によって、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する配列を含む、上記[1]~[4]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[6]遺伝子変換によって、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する上記偽遺伝子の配列が、30~60アミノ酸配列長さの範囲内にあるアミノ酸配列をコードし、少なくとも2つのシステイン残基を含む、上記[1]~[5]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[7](a)の上記重鎖可変ドメインが、自律型重鎖(AHC)可変ドメインである、上記[1]~[6]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[8](a)の上記AHC可変ドメインが、30~60アミノ酸長さであり、少なくとも2つのシステイン残基を含むCDR3を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインである、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[9](a)の上記AHC可変ドメインが、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体である、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[10](a)の上記AHC可変ドメインが、ヒト生殖系列重鎖Vセグメント、30~60アミノ酸長さの範囲内のアミノ酸配列をコードし、少なくとも2つのシステイン残基を含むDセグメントによってコードされ、上記AHC可変ドメインが、最大10のラクダ化アミノ酸置換を含む、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[11](b)の上記偽遺伝子が、ヒト生殖系列抗体配列をコードする、上記[1]~[10]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[12]上記偽遺伝子が、600ヌクレオチド未満の長さである、上記[11]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[13]上記偽遺伝子が、300~600ヌクレオチドの長さである、上記[1]~[12]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[14]上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、CH1欠失を含む重鎖をコードする、上記[1]~[13]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[15]上記ニワトリのゲノムが、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、上記[1]~[14]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[16]上記動物のゲノムが、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、上記[1]~[15]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[17]動物が、上記遺伝子座についてホモ接合性である、上記[1]~[16]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[18]動物が、上記遺伝子座についてヘテロ接合性である、上記[1]~[17]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[19](a)上記[1]~[18]のいずれかに記載のトランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、
(b)上記動物から、上記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。
[20]上記抗体が、ポリクローナルである、上記[19]に記載の方法。
[21]上記抗体が、モノクローナルである、上記[19]に記載の方法。
[22](c)上記トランスジェニック動物のB細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、
(d)上記ハイブリドーマをスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、をさらに含む、上記[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23](c)ハイブリドーマを作製せずにB細胞をスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を同定することをさらに含む、上記[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[24]PCRを使用して、上記トランスジェニック動物のB細胞から少なくとも上記重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、上記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、上記[19]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25]上記抗体が、自律型重鎖(AHC)可変ドメイン抗体である、上記[1]~[18]のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生される、モノクローナルまたはポリクローナル抗体。
[26]上記[1]~[18]のいずれかに記載の動物から単離された、B細胞。
本開示は、とりわけ、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、(a)CDR3が30~
60アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも2つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメ
インをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、(b)当該機能的免疫
グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を
(a)の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺
伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、B細胞を含むトラン
スジェニックニワトリを提供する。
[1]トランスジェニックニワトリであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、
(a)CDR3が、30~60アミノ酸長さの範囲にあり、少なくとも2つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、
(b)上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を(a)の上記重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、上記偽遺伝子が、上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、B細胞を含む、トランスジェニックニワトリ。
[2]上記ニワトリの非B細胞が、VHセグメント、Dクラスター、Jセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、上記Dクラスター内の各Dセグメントが、30~60アミノ酸長さの範囲内の異なる配列をコードし、少なくとも2つ)のシステイン残基を含む、上記[1]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[3]上記ニワトリの非B細胞が、(a)の上記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および(b)の上記偽遺伝子を含む、上記[1]または[2]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[4]上記偽遺伝子が、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域に対応する配列を含まない、上記[1]~[3]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[5]上記偽遺伝子が、遺伝子変換によって、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する配列を含む、上記[1]~[4]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[6]遺伝子変換によって、(a)の上記重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する上記偽遺伝子の配列が、30~60アミノ酸配列長さの範囲内にあるアミノ酸配列をコードし、少なくとも2つのシステイン残基を含む、上記[1]~[5]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[7](a)の上記重鎖可変ドメインが、自律型重鎖(AHC)可変ドメインである、上記[1]~[6]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[8](a)の上記AHC可変ドメインが、30~60アミノ酸長さであり、少なくとも2つのシステイン残基を含むCDR3を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインである、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[9](a)の上記AHC可変ドメインが、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体である、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[10](a)の上記AHC可変ドメインが、ヒト生殖系列重鎖Vセグメント、30~60アミノ酸長さの範囲内のアミノ酸配列をコードし、少なくとも2つのシステイン残基を含むDセグメントによってコードされ、上記AHC可変ドメインが、最大10のラクダ化アミノ酸置換を含む、上記[7]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[11](b)の上記偽遺伝子が、ヒト生殖系列抗体配列をコードする、上記[1]~[10]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[12]上記偽遺伝子が、600ヌクレオチド未満の長さである、上記[11]に記載のトランスジェニックニワトリ。
[13]上記偽遺伝子が、300~600ヌクレオチドの長さである、上記[1]~[12]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[14]上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、CH1欠失を含む重鎖をコードする、上記[1]~[13]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[15]上記ニワトリのゲノムが、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、上記[1]~[14]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[16]上記動物のゲノムが、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、上記[1]~[15]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[17]動物が、上記遺伝子座についてホモ接合性である、上記[1]~[16]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[18]動物が、上記遺伝子座についてヘテロ接合性である、上記[1]~[17]のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
[19](a)上記[1]~[18]のいずれかに記載のトランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、
(b)上記動物から、上記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。
[20]上記抗体が、ポリクローナルである、上記[19]に記載の方法。
[21]上記抗体が、モノクローナルである、上記[19]に記載の方法。
[22](c)上記トランスジェニック動物のB細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、
(d)上記ハイブリドーマをスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、をさらに含む、上記[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23](c)ハイブリドーマを作製せずにB細胞をスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を同定することをさらに含む、上記[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[24]PCRを使用して、上記トランスジェニック動物のB細胞から少なくとも上記重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、上記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、上記[19]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25]上記抗体が、自律型重鎖(AHC)可変ドメイン抗体である、上記[1]~[18]のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生される、モノクローナルまたはポリクローナル抗体。
[26]上記[1]~[18]のいずれかに記載の動物から単離された、B細胞。
本開示は、とりわけ、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、(a)CDR3が30~
60アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも2つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメ
インをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、(b)当該機能的免疫
グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を
(a)の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺
伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、B細胞を含むトラン
スジェニックニワトリを提供する。
そのような動物では、重鎖可変ドメインをコードする核酸は、体細胞超変異によって、および任意に、偽遺伝子による遺伝子変換を介して変異し、多様な「節のある」CDR3を有する抗体を発現する機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子をもたらし得、「節のある」CDR3は比較的長く、抗体結合表面にノブまたは隆起を形成する。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するだろう。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
定義
「決定する」、「測定する」、「評価する(evaluating)」、「評価する(assessing)」、および「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書において互換的に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および/または定性的決定の両方を含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。「~の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するのかどうかを決定することを含む。
「決定する」、「測定する」、「評価する(evaluating)」、「評価する(assessing)」、および「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書において互換的に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および/または定性的決定の両方を含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。「~の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するのかどうかを決定することを含む。
「遺伝子」という用語は、プロモータ領域、コード配列、および3’UTRからなる核酸配列を指す。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「核酸」という用語は、DNA、RNA、一本鎖または二本鎖およびそれらの化学修飾を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響を与えられるように、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる(すなわち、コード配列がプロモータの転写制御下にある)場合、コード配列と作動可能に連結されている。同様に、イントロンがコード配列に作動可能に連結されている場合、イントロンは、mRNAからスプライシングされて、コード配列の発現を提供する。「連結されていない」は、会合される遺伝的要素が互いに密接に会合しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
「ホモ接合性」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。トランスジェニック動物は、トランスジーンについてホモ接合性であるか、または相同染色体上の同じ遺伝子座に対応物がない場合、トランスジーンについてヘミ接合性であり得る。
遺伝子に関する「内因性」という用語は、遺伝子が細胞に固有であること、すなわち、遺伝子が非改変細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、野生型細胞のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る(自然界に見られるように)。内因性遺伝子は、ゲノム内に野生型遺伝子と同じ遺伝子座に存在する場合、改変内因性遺伝子であり得る。そのような改変内因性遺伝子の例は、外来核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在し得る。
「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列(複数可)の発現を目的として生成されたか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、一般に組換えDNAを指す。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在し得る。
「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された2つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。
「選択可能なマーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にすることを可能にする、宿主において発現することができるタンパク質を指す。選択可能なマーカーの例には、抗菌剤(例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール)に対する耐性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養上の利点などの代謝上の利点を付与するタンパク質、ならびに細胞に機能的または表現型の利点(例えば、細胞分裂)を付与するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入する」という用語は、「トランスフェクション」および「形質転換」、ならびに細胞に核酸を導入する他の全ての方法を含み、核酸配列は、細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアDNA)に取り込まれ得るか、または自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る。
「コード配列」という用語は、転写および翻訳されると、適切な調節要素の制御下に置かれたときに、例えば、インビボでタンパク質を産生する核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、コード配列は、連続的なORFを有し得るか、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されたORFを有し得る。この実施形態において、非コード配列は、プレmRNAからスプライシングされて、成熟mRNAを産生する。
ある遺伝子座を別の遺伝子座で置き換えるという文脈での「置き換える」という用語は、単一のステッププロトコルまたは複数のステッププロトコルを指す。
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアDNA)に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアDNA)に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
「複数」という用語は、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも5000、少なくとも10,000、もしくは少なくとも50,000、またはそれ以上を指す。ある特定の場合において、複数は、少なくとも10~50を含む。他の実施形態において、複数は、少なくとも50~1,000であり得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞に関してであり、インビトロで培養される細胞を指す。動物が単離された細胞を含有すると記載されている場合、それらの単離された細胞は、インビトロで培養され、次いで動物に移植された。
「子孫(progeny)」または「子孫(off-spring)」という用語は、特定の動物または細胞に由来し、その子孫であるすべての将来の世代を指す。したがって、子孫、F1、F2、F3、世代などがこの定義に含まれるように、任意の連続する世代の動物の子孫が本明細書に含まれる。
「トランスジェニック動物」という語句は、外来核酸(すなわち、動物に固有ではない組換え核酸)を含有する細胞を含む動物を指す。外来核酸は、動物のすべての細胞、または動物のすべてではないがいくつかの細胞に存在し得る。外来核酸分子は、「トランス遺伝子」と呼ばれ、1つ以上の遺伝子、cDNAなどを含有し得る。トランス遺伝子を初期胚からの受精卵母細胞または受精細胞に挿入することによって、結果として生じるトランスジェニック動物は完全にトランスジェニックであり得、安定して外来核酸をその生殖系列に伝達することができる。あるいは、外来核酸は、それを含有する組換え細胞または組織を動物に移入して、例えば、移植して、部分的にトランスジェニック動物を産生することによって導入され得る。あるいは、トランスジェニック動物は、遺伝子改変された体細胞からの核の移入によって、または胚性幹細胞もしくは始原生殖細胞などの遺伝子改変された多能性細胞の移入によって産生され得る。キメラ動物は、生殖系列内の別の動物によって供与された細胞を有し得、その場合、動物の子孫は、供与された細胞内の染色体に対してヘテロ接合性であり得る。供与された細胞が外因性核酸(すなわち、細胞に内因性ではない核酸)を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸(すなわち、動物に固有ではない組換え核酸)を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランス遺伝子」と呼ばれ得る。
「ハイブリッド動物」、「トランスジェニックハイブリッド動物」などの語句は、本明細書では互換的に使用されて、ある特定の特質を有する第1の動物とある特定の特質を有する第2の動物との交配から得られた動物を意味する。例えば、本開示のハイブリッド動物は、共通軽鎖を産生する第1のトランスジェニック動物と、合成重鎖を産生する第2のトランスジェニック動物との交配から得られたトランスジェニック子孫を指し得る。ハイブリッド動物は、免疫化され、抗原特異性抗体の産生源として使用され得る。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は当業者に十分に理解されており、抗原に特異的に結合する1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。抗体の一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、各対が1本の軽鎖および1本の重鎖を有する2対の同一の抗体鎖からなる。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒に抗原への結合に関与し、定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。
認識されている免疫グロブリンのポリペプチドには、カッパおよびラムダの軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、デルタ、イプシロン、およびミューの重鎖、または他の種における等価物が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」(約25kDaまたは約214アミノ酸の)は、NH2末端における約110アミノ酸の可変領域、およびCOOH末端におけるカッパまたはラムダの定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」(約50kDaまたは約446アミノ酸の)は、同様に可変領域(約116アミノ酸の)および前述の重鎖定常領域の1つ、例えば、ガンマ(約330アミノ酸の)を含む。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、Fab、Fv、scFv、およびFdフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的な結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン(ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー)などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。この用語には、Fab’、Fv、F(ab’)2、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体もまた包含される。
抗体は、例えば、Fv、Fab、および(Fab’)2、ならびに二機能性(すなわち、二重特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia and Scheidegger,Eur.J.Immunol.1987,17(1):105-111)および単鎖(例えば、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988,85(16):5879-5883およびBird et al.,Science.1988,242(4877):423-426、これらは、参照により本明細書に組み込まれる)。(一般的には、Hoodら、“Immunology”、Benjamin、N.Y.、2nd ed1984およびHunkapiller and Hood,Nature.1986,323(6083):15-16を参照されたい)を含む様々な他の形態で存在し得る。
「キメラ抗体」は、抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作することによって、異なる種に属している抗体可変および定常領域遺伝子から構築されている抗体を指す。例えば、ニワトリまたはウサギモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントは、ガンマ1およびガンマ3などのヒト定常セグメントに結合され得る。療法用キメラ抗体の例は、ニワトリまたはウサギ抗体からの可変または抗原結合ドメイン、およびヒト抗体からの定常またはエフェクタードメインから構成されているハイブリッドタンパク質であるが(例えば、A.T.C.C.デポジットアクセッション番号CRL9688の細胞によって作製された抗Tacキメラ抗体)、他の哺乳動物種も使用され得る。
「偽遺伝子」という用語は、開始および/または停止コドンを含有する場合も含まない場合もあるオープンリーディングフレームを含有する非転写核酸領域を説明するために使用される。アミノ酸配列は、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列をインシリコで翻訳して、アミノ酸配列を産生することができるという意味で、偽遺伝子によって「コード」され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の文脈では、偽遺伝子は、プロモータ領域、組換えシグナル配列、またはリーダー配列を含有しない。
「上流」および「下流」という用語は、転写の方向に関して使用される。
「特異的な結合」という用語は、異なる検体の均質な混合物中に存在する特定の検体に優先的に結合する抗体の能力を指す。ある特定の実施形態において、特異的な結合の相互作用によって、試料中の望ましい検体と望ましくない検体とが区別され、いくつかの実施形態において、約10~100倍またはそれ以上を超えて(例えば、約1000~10,000倍を超えて)区別するであろう。
ある特定の実施形態において、抗体/検体の複合体において特異的に結合する場合、抗体と検体との間の親和性は、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、10-10M、10-11M未満、または約10-12M未満のKD(解離定数)を特徴とする。
重抗体鎖または軽抗体鎖の「可変領域」は、CDR1、CDR2、CD3、およびフレームワーク領域(CDRは、「相補性決定領域」を指す)を含有する鎖のN末端成熟ドメインである。抗体の重鎖および軽鎖の両方が、可変ドメインを含有する。すべてのドメイン、CDR、および残基番号は、配列アラインメントおよび構造知識に基づいて割り当てられる。フレームワークおよびCDR残基の同定および番号付けは、Chothiaら(Chotia et al.,J.Mol.Biol.1998,278(2):457-479)によって記載されている通りである。
VHは、抗体重鎖の可変ドメインである。VLは、抗体軽鎖の可変ドメインである。
「遺伝子」および「遺伝子座」という用語は、本明細書において互換的に使用される。どちらの用語も、遺伝子が活性転写されている、または無傷であることを意味しない。どちらの用語も、不活性化された遺伝子を包含する。
本明細書で使用される場合、「キメラ」ニワトリは、少なくとも2つの供給源からのかなりの数の遺伝的に異なる細胞を含有するニワトリである。キメラ動物は、ある動物からの細胞を別の動物の胚に移植することによって、または培養細胞(例えば、改変されたゲノムを有する)を胚に移植することによって作製され得る。移植された細胞は、宿主胚に組み込まれる前に培養物から収集され得る。胚は動物に成長し、結果として生じる動物は、宿主からの細胞、ならびに移植された細胞を含有し得る。供与された細胞が外因性核酸(すなわち、細胞に内因性ではない核酸)を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸(すなわち、動物に固有ではない組換え核酸)を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランス遺伝子」と呼ばれ得る。
「不活性化」という用語は、遺伝子によってコードされたタンパク質が発現されないという意味で発現されない遺伝子を示すことを意図する。遺伝子は、遺伝子のコード配列および/または調節配列の一部を除去することによって不活性化され得る。破壊された、例えば、「ノックアウト」遺伝子は、不活性化遺伝子の一種である。発現されたヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられている発現された内因性配列を含有したことのある遺伝子座は、不活性化された内因性遺伝子を含有する。そのため、発現されたヒト免疫グロブリン配列を含有する遺伝子座は、内因性免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられた場合、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有し得る。多くの場合、これは、内因性配列をノックアウトし(例えば、配列の少なくとも一部を削除することによって)、次いで、内因性配列によって占められていたことのある位置にヒト免疫グロブリン配列を挿入することによって行うことができる。
「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された2つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。
「遺伝的に連結された」という用語は、減数分裂中に遺伝的要素が一緒に遺伝する傾向があるように、同じ染色体上に存在する2つの遺伝的要素を指す(すなわち、要素は、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満の組換え頻度を有する)。互いに密接に連結している2つの遺伝的要素は、染色体の乗換え事象(または「組換え」)中に異なる染色分体に分離される可能性が低くなる。組換え中に2つの遺伝的に連結された要素が分離される可能性は、2つの要素間の配列の量に依存し、「組換え頻度」と呼ばれる可能性のパーセンテージに計算され得る。
「自律型重鎖可変ドメイン」という用語は、すなわち、自律的に凝集することなく、およびまたは関連する軽鎖なしに、折りたたまれて、抗原に自律的に結合することができる、重鎖可変ドメインを指す。「重鎖のみ」または「HCO」抗体、サメ抗体、VHH抗体、ラクダ科動物、および単一ドメイン抗体はすべて、自律型重鎖可変ドメインを含む抗体の例である。そのような抗体を産生するためのいくつかの戦略は、Janssens et al(Proc.Natl.Acad.Sci.2006 103:15130-5)、Bruggemann et al(Crit.Rev.Immunol.2006 26:377-90)、Zou et al(J.Immunol.2005 175:3769-79)、およびNguyen et al(Immunology 2003 109:93-101)において概説される。自律型重鎖可変ドメインは、VH抗体の可変ドメインにラクダ化置換を導入することによって作製され得る。
例示的な実施形態の説明
本主題発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
本主題発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の10分の1までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法かつ/または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「and」、および「the」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「1つの細胞(a cell)」への言及は、複数の細胞を含み、「1つの候補薬剤(a candidate agent)」への言及は、1つ以上の候補薬剤および当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。特許請求の範囲は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して、「唯一」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として役割を果たすことを意図している。
本明細書に論じられる公開物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によりそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および/または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明のためにその刊行物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
上記のように、トランスジェニック動物が、提供される。ある特定の実施形態において、動物は、比較的少数の軽鎖遺伝子を有する任意の非ヒト動物、またはそれらの一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物であり得、そのため、動物は、様々な任意の異なる動物であり得る。一実施形態において、動物は、トリ、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウなどのキジ目のメンバー、あるいはアヒルまたはガチョウなどのガンカモ目のメンバー、あるいは哺乳動物、例えば、ウサギなどのウサギ目動物(lagomorph)、またはウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギなどの家畜であり得る。
本開示のいくつかは、1つ以上のトランス遺伝子を含有するトランスジェニックニワトリに関する。多くの動物の免疫グロブリン遺伝子座のヌクレオチド配列が知られており、同じく、そのような動物のゲノムを改変するための方法も知られているため、下記の一般的な概念は、任意の好適な動物、特に一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物に容易に適合され得る。転写された免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子の可変領域と、異なる可変領域を含有する作動可能に連結された(上流の)偽遺伝子との間の遺伝子変換による抗体多様性の生成は、例えば、Butler(Rev.Sci.Tech.1998 17:43-70)、Bucchini(Nature1987 326:409-11)、Knight(Adv.Immunol.1994 56:179-218)、Langman(Res.Immunol.1993 144:422-46)、Masteller(Int.Rev.Immunol.1997 15:185-206)、Reynaud(Cell1989 59:171-83)、およびRatcliffe(Dev.Comp.Immunol.2006 30:101-118)などの様々な公開物に記載されている。
上記のように、トランスジェニックニワトリが、提供される。いくつかの実施形態において、トランスジェニックニワトリは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、(a)CDR3が30~60アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、(b)当該機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を(a)の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、B細胞を含む。いくつかの実施形態において、ニワトリの非B細胞は、VHセグメント、Dクラスター、Jセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、Dクラスター内の各Dセグメントは、30~60アミノ酸長さの範囲の、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含む異なる配列をコードする。これらの実施形態において、(a)の機能遺伝子は、B細胞において、VHセグメント、Dクラスター、およびJセグメント間のVDJ組換えから生じたものであり、から生じたものであり、Dクラスター内の各Dセグメントは、30~60アミノ酸長さの範囲の、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含む異なる配列をコードする。換言すれば、Dクラスター内のDセグメントはすべて、互いに異なり、各Dセグメントは、長く、領域内のジスルフィド結合の結果として高度に折りたたまれると予想されるCDR3配列をコードする。VDJ組換え中に選択されたDセグメントは大部分がランダムであるため、異なるB細胞が、VDJ組換え後に異なるDセグメントを含むため、重鎖CDR3配列は、この動物では多様化するべきである。例えば、いくつかの実施形態において、Dクラスター内に50個のDセグメントがある場合、B細胞は、体細胞超変異および/遺伝子変換がさらなる変異を行う前に、50個の重鎖CDR3コード配列を含むべきである。重鎖のCDR3は、いくつかの哺乳動物の成長因子、サイトカイン、およびいくつかの毒素に存在する、「システインノット」または「ノッティン」モチーフを有するべきである。古典的なノッティンは、3つのジスルフィド架橋を有する。天然ニワトリ抗体もまた、H3にジスルフィドを特徴とするが、通常はより短いH3にたった1つの架橋、場合によっては2つの架橋がある。ノットまたはノブを含む抗体は、例えば、Wang et al Cell 153:1379-1393に記載されている。ウシ抗体は、一般に、現在のシステムで維持することができる「茎およびノブ」の構造を有する(例えば、Haakenson Front.Immunol.2019 9:1262およびWang et al 上記を参照されたい)。超長CDR H3領域を有するいくつかのウシ抗体Fab断片の結晶構造が公開されている(例えば、Wang、上記およびStanfield et al,Sci Immunol 2016:aaf7962を参照されたい)。これらの抗体のCDR H3領域が、1つのタイプIβターン、1つの保存されたジスルフィド結合、および3つの逆平行β鎖を含むノブ領域を支持するβリボン茎からなる同じ一般構造を採用することが見出される。支持されているノブ領域は、抗体の他のCDR Iによって生成される従来の抗原結合表面から遠く離れており、そのため、抗原を凹型エピトープと結合する可能性がある。
他の実施形態において、ニワトリの非B細胞は、(a)の機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および(b)の偽遺伝子を含む。これらの実施形態において、機能的免疫グロブリン重鎖は、ニワトリのすべての細胞において同じであり得る(ただし、B細胞においてのみ発現される)。これらの実施形態において、重鎖CDR3領域は、体細胞超変異および/遺伝子変換によって多様化され得る。
偽遺伝子は、機能遺伝子の重鎖CDR3コード配列を多様化してもしなくてもよい。そのため、いくつかの実施形態において、偽遺伝子は、(a)の重鎖可変ドメインのCDR3領域に対応する配列を含まない。これらの実施形態において、CDR3コード配列は、体細胞超変異のみによって多様化され得る。他の実施形態において、偽遺伝子は、遺伝子変換により、(a)の重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する配列を含み得る。これらの実施形態において、遺伝子変換により、(a)の重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する偽遺伝子の配列は、30~60アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードする。換言すれば、偽遺伝子から機能的遺伝子に供与された配列はまた、長く、システインに富むコード配列も含み得る。
任意の実施形態において、機能的重鎖遺伝子によってコードされるCDR3は、30~60アミノ酸長さの範囲であり、3~10のシステイン残基を含む。同様に、偽遺伝子は、30~60アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも3~10のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードし得る。これらの実施形態において、機能的V領域および偽遺伝子のHC CDR3は、図1に示されるような「ノブおよび茎」構造を有するように設計され得、茎配列は、二次構造予測アルゴリズムを使用して予測され、ノブ配列は、偽遺伝子ごとに異なり得、各偽遺伝子において、ノブをコードする配列は多様であり、ノブ形成を促進するために複数のcysコドンを含む。多くの例では、配列は、4つ、6つ、8つ、または10のシステインを有し得る。これらの実施形態において、機能的VによってコードされるCDR3領域は、上記のWangの図S1に示される配列のうちのいずれかであり得、偽遺伝子によってコードされるCDR3領域は、上記のWangの図S1に示される他のCDR3配列であり得る。
いくつかの実施形態において、(a)の重鎖可変ドメインは、自律型重鎖(AHC)可変ドメインであり得る。上記のように、自律型重鎖(AHC)可変ドメインを実装し得る多くの方法がある。1つの方法は、例えば、ヒト抗体のラクダ化によるものである。
ヒトおよびマウスからの典型的な「天然」抗体は、重鎖および軽鎖からなる。軽鎖がない場合、これらの抗体の重鎖は、適切に折りたたまれず、凝集する。「ラクダ化」とは、VHドメイン(この用語はヒトおよびマウスIgGからの結合ドメインのタイプを表す)が、それ自体で(すなわち、軽鎖なしで)エピトープに結合することができ、凝集しないように変更されるプロセスを指す。ラクダ科動物(例えば、ラクダ科動物、ラマ科など)は、単一のN末端ドメイン(VHH)が完全に抗原結合することができる軽鎖を欠く機能的抗体を産生するため、「ラクダ科」という用語は、このプロセスの造語である。これらの自律型重鎖抗体は、高い安定性および溶解性を有する。サメおよび他の軟骨魚もまた、VHH抗体を産生する。
従来のVHドメインと同様に、自律型重鎖抗体は、免疫グロブリンドメインのコア構造を形成する4つのフレームワーク領域(FR)と、抗原結合に関与する3つの相補性決定領域(CDR)を含む。例えば、Conrath et al.,Antigen binding and solubility effects upon the veneering of a camel VHH in framework-2 to mimic a VH,J Mol Biol,2005,350:112-25を参照されたい。ヒトおよびラクダ科の可変ドメインの配列比較は、ラクダ科のプロセスにつながり、ヒトVHドメインへの凝集抵抗性のVHHドメインのいくつかの特徴的な残基の転移が含まれる。例えば、Davies et al.,‘Camelising’human antibody fragments:NMR studies on VH domains,FEBS Lett,1994,339:285-90を参照されたい。例えば、VHHの特徴は、従来のVHドメインで保存され、VLドメインを含む疎水性界面の形成に関与する4つのFR2位置(位置37、44、45、および47;Kabat番号付け)にアミノ酸置換の存在である。具体的には、ラクダ科動物のFRの配列およびヒトVH3ファミリーの配列は、通常はVHドメインで高度に保存されている、FR2の3つの残基(44、45、および47)を除いては、非常に類似していた。例えば、Conrath et al.,2005を参照されたい。これらの溶媒曝露された残基(そのほとんどはラクダ科動物では親水性である)は、以前の軽鎖界面に位置し、VLドメインとの会合を妨げる。軽鎖可変ドメイン(VL)の界面によるVHの非特異的結合は、フレームワーク2および4(Val37F、G44E、L45R、W47G、およびW103R)のアミノ酸変異によって防止された。Da Silva et al,Camelized rabbit-derived VH single-domain intrabodies against Vif strongly neutralize HIV-1 infectivity J Mol Biol.2004 Jul 9;340(3):525-42を参照されたい。ラクダ化のための他の戦略は、Tanha et al Protein Eng Des Sel.2006 Improving solubility and refolding efficiency of human V(H)s by a novel mutational approach Nov;19(11):503-9およびDavies et al,Single antibody domains as small recognition units:design and in vitro antigen selection of camelized,human VH domains with improved protein stability.Protein Eng.1996 Jun;9(6):531-7を参照されたい。
VHHをヒト化するための類似の突然変異アプローチも試みられてきた。例えば、Conrath et al.,2005を参照されたい。Vincke et al.,General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold,J Biol Chem,2009,284:3273-84も参照されたい。VHHの親水性の増加は、主に、以前のVL界面の前述の変更に依存するが、CH1ドメインと接触する従来のVHドメイン上にわずかに疎水性のパッチを形成する位置の一部のアミノ酸もまた、VHHの親水性残基に変更される。例えば、Lesk et al.,Elbow motion in the immunoglobulins involves a molecular ball-and-socket joint,Nature,1988 Sep 8,335(6186):188-90を参照されたい。Muyldermans et al.,Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains,Protein Eng,1994 Sep,7(9):1129-35も参照されたい。
そのため、いくつかの実施形態において、任意のVH抗体は、FR2の位置37、44、45、および47、ならびに任意に、FR4の位置103のうちの1つ以上で任意の疎水性残基のラクダ化アミノ酸置換を非疎水性残基(Kabat番号付け)に作製することによってラクダ化され得る。ラクダ化アミノ酸置換は、非疎水性残基を有する1つ以上の位置での任意の疎水性残基グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、プロリン(Pro)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)、およびトリプトファン(Trp)の置換を含み得る。
重鎖のみの抗体は、自律的重鎖可変ドメインと呼ばれるもの、すなわち、自律的に凝集することなく、およびまたは関連する軽鎖なしに、折りたたまれて、抗原に自律的に結合することができる、重鎖可変ドメインを有する。自律型重鎖可変ドメインを含む抗体を産生するための戦略は、例えば、Janssens et al(Proc.Natl.Acad.Sci.2006 103:15130-5)、Bruggemann et al(Crit.Rev.Immunol.2006 26:377-90)、Zou et al(J.Immunol.2005 175:3769-79)、およびNguyen et al(Immunology 2003 109:93-101)において概説される。
いくつかの実施形態において、(a)の自律型重鎖可変ドメインは、30~60アミノ酸長さであり、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含むCDR3を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインである。この可変ドメインは、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体のものであり得、例えば、その多くは当該技術分野で周知である。他の実施形態において、(a)の自律型重鎖可変ドメインは、ヒト生殖系列重鎖Vセグメント、30~60アミノ酸長さの範囲の、少なくとも2つ(例えば、最大10、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つ)のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードする、Dセグメント、およびヒトJセグメントによってコードされ、当該可変ドメインは、最大10のラ
クダ化アミノ酸置換を含む。
クダ化アミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、(b)の偽遺伝子は、(任意のDセグメントを除く)ヒト生殖系列抗体配列をコードする。いくつかの実施形態において、偽遺伝子は、600ヌクレオチド未満の長さ、例えば、300~600ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態において、(b)の偽遺伝子において、FR1、FR2、およびFR3、ならびに、存在する場合、任意にFR4をコードする配列が、組み合わされて、(a)の可変ドメイン内の対応するFR1、FR2、およびFR3、ならびに任意にFR4をコードする組み合わされた配列と少なくとも90%同一である。偽遺伝子における各個々のFRについて、配列同一性のレベルは、多くの場合、少なくとも80%、例えば、少なくとも90%または少なくとも95%であり得る。いくつかの実施形態において、(b)の偽遺伝子においてCDRをコードする配列は、(a)の可変ドメインにおいて対応するCDRをコードする配列と90%以下同一である。換言すれば、いくつかの実施形態において、偽遺伝子によってコードされるFW配列と比較して、偽遺伝子によってコードされるCDRにはより多様性があり得る。
任意の実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、CH1欠失を含む重鎖をコードし得る。これらの実施形態において、動物のゲノムはまた、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子も含み得る。あるいは、動物のゲノムは、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含み得る。
任意の実施形態において、トランスジェニックニワトリは、その遺伝子座についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
(a)トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、(b)当該動物から、抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法も、提供される。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。これらの実施形態において、本方法は、(c)トランスジェニック動物のB細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、(d)当該ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、をさらに含み得る。あるいは、本方法は、(c)ハイブリドーマを作製せずにB細胞をスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を同定することを含み得る。任意のスクリーニング方法において、本方法は、PCRを使用して、トランスジェニック動物のB細胞から少なくとも重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、当該増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、を含み得る。
トランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も提供され、抗体は多様な毒素様HC CDR3を有し、いくつかの実施形態において、自律型重鎖(AHC)可変ドメイン抗体であり得る。
動物から単離されたB細胞も提供される。
トランスジェニック動物は、発現されて(すなわち、転写されて、その後翻訳されるmRNAを産生する)、抗体の重鎖を産生し、機能的重鎖遺伝子(この場合、これはニワトリであり、他の多くの種がそのすぐ上流にある)に作動可能に連結されている機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、複数の異なる偽遺伝子重鎖可変領域と、を含み、偽遺伝子の可変領域は、遺伝子変換によって(すなわち、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列を偽遺伝子可変領域の配列で置換することによって)機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の配列を変化させるという点で、機能的免疫グロブリン重鎖に作動可能に連結されている。トランスジェニック動物では、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との間の遺伝子変換は、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列を、可変領域の全長までわずか単一のコドンだけ変更する。ある特定の場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子可変領域から少なくとも1つのCDR(例えば、CDR1、CDR2、またはCDR3)の配列を機能的遺伝子の可変領域に供与し得る。したがって、トランスジェニック動物によって産生された抗体の重鎖は、偽遺伝子可変領域から機能的重鎖遺伝子の可変領域に供与される任意の配列によってコードされている。異なる配列が動物の異なる細胞に供与されるため、動物の抗体レパートリーは、どの配列が偽遺伝子可変領域から機能的遺伝子の可変領域に供与されるかによって決定される。
いくつかの実施形態において、ヒト機能的遺伝子および偽遺伝子のフレームワークセグメントは、互いに同一またはほぼ同一であり得るが、機能的遺伝子および偽遺伝子のCDRセグメントは異なり得、それにより、遺伝子変換が、偽遺伝子と生殖細胞系列配列のCDRセグメント間で起こり得る。さらに、CDRは、長さが異なり得る。ある特定の実施形態において、重鎖CDR1は、6~12アミノ酸残基長さの範囲にあり得、重鎖CDR2は、4~12アミノ酸残基長さの範囲にあり得、重鎖CDR3は、30~60アミノ酸残基長さの範囲にあり得るが、これらの範囲外の長さのCDRを有する抗体が想定されている。
いくつかの実施形態において、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列はヒトであり得、すなわち、ヒト抗体のヌクレオチドおよび/もしくはアミノ酸配列、または生殖系列配列を含有し得る。これらの実施形態において、CDRおよびフレームワークの両方がヒトであり得る。他の実施形態において、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列はヒトではなく、代わりに、ヒト配列と少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%以上同一であり得る。例えば、ヒト配列と比較して、導入された転写可変領域は、1つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸置換を含有し得る。任意の生殖系列ヒトVHセグメントは、VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、およびVH7-81の配列から選択され得る。異なる生殖細胞系列配列の説明については、PCTWO2005/005604を参照されたい。
いくつかの実施形態において、定常領域を含む重鎖遺伝子座の一部、イントロン領域の一部、および3’UTRは、動物に対して内因性であり得、機能的遺伝子の可変ドメインを含む重鎖遺伝子座の残り、イントロンの残り、および偽遺伝子は、動物に対して外因性であり得、すなわち、組換え的に作製され、機能的遺伝子が産生され、偽遺伝子が遺伝子変換によって機能的遺伝子に配列を供与することができるような方法で定常ドメイン、部分イントロン、および3’UTRの近位で動物に導入され得る。ある特定の場合では、動物の重鎖遺伝子座は、作動可能な連結において、イントロン領域と、定常ドメインをコードする領域と、3’非翻訳領域と(イントロン領域、定常ドメインをコードする領域、および3’非翻訳領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して内因性である)、複数の偽遺伝子重鎖可変領域とを含有し得、複数の偽遺伝子重鎖可変領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性である。
ある特定の実施形態において、対象のトランスジェニック動物によって産生された抗体は、内因性定常ドメインおよび動物に対して外因性である可変ドメインを含有し得る。これらの実施形態において、内因性定常領域が用いられ得るため、抗体は依然としてクラススイッチおよび親和性成熟を受け得、これによって動物は、正常な免疫系の発達を受け、正常な免疫応答を開始することができる。特定の実施形態において、トランスジェニックニワトリは、IgM、IgY、およびIgAをコードする重鎖遺伝子座に3つの内因性定常領域を有する。B細胞の発達の初期段階では、B細胞は、IgMを発現する。親和性成熟が進むにつれて、クラススイッチは、定常領域をIgYまたはIgAに変換する。IgYは、卵黄に沈着した予備を介して約200mgのIgYを受け取る成体および初生ヒヨコの両方に体液性免疫を提供する。IgAは、主にリンパ組織(例えば、脾臓、パイエル板、およびハーダー腺)および卵管に見られる。
軽鎖および/または重鎖遺伝子座に存在する導入された偽遺伝子可変領域の数は変動し得、特定の実施形態において、1~50個、例えば、2~50個、または10~25個の範囲であり得る。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域のうちの少なくとも1個(例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも5個、少なくとも10個以上)は、転写された軽鎖可変領域に対して逆配向であり得る。同様に、特定の実施形態において、複数の偽遺伝子重鎖可変領域のうちの少なくとも1個(例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも5個、少なくとも10個以上)は、重鎖の転写された可変領域に対して逆配向であり得る。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子可変領域は交互の配向ではなく、ある特定の場合には、転写された可変領域に対して反対配向である一連の少なくとも5個または少なくとも10個の隣接する偽遺伝子領域を含有し得る。一実施形態において、転写された可変領域から最も遠位にある偽遺伝子領域は、転写された可変領域と同じ配向にあり、最も遠位の領域と転写された可変領域との間の偽遺伝子領域は、転写可変領域に対して逆配向にある。
偽遺伝子は、典型的には、転写領域の配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも300の連続するヌクレオチドの配列を含有する。いくつかの実施形態において、偽遺伝子におけるフレームワーク配列は、機能的遺伝子における対応するフレームワーク配列と少なくとも90%同一であり、CDRは、より少ない配列同一性を有する。
上記のトランスジェニック動物は、動物のゲノムを組換え改変することによって作製され得る。トランスジェニック動物、例えば、マウスおよびニワトリなどを産生するための方法は知られており、特に、遺伝子変換を使用する動物のゲノムを改変するための方法がまた知られており(例えば、Sayegh,Vet.Immunol.Immunopathol.1999 72:31-7およびKamihira,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2004 91:171-89(トリの場合)、ならびにBosze,Transgenic Res.2003 12:541-53およびFan,Pathol.Int.1999 49:583-94(ウサギの場合)、ならびにSalamone J.Biotechnol.2006 124:469-72(ウシの場合)を参照されたい)、同じくこれらの種の多くの生殖系列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の構造および/または配列も知られており(例えば、Butler Rev Sci Tech 1998 17:43-70およびRatcliffe Dev Comp Immunol 2006 30:101-118)、上記の動物は、本開示で供与される通常の方法によって作製され得る。トランスジェニックニワトリを作製するための方法が知られている。例えば、8,592,644、US8,889,662、Collarini et al(Poult Sci.2015 94:799-803)、van de Lavoir(Nature.2006 441:766-9)、およびSchusser et al(Proc Natl Acad Sci USA.2013 110:20170-5を参照されたい。
自律型重鎖(AHC)可変ドメインを含む抗体を産生するための方法も、提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、上記のようにトランスジェニック動物を抗原で免疫化することを含み得、抗体がポリクローナルである場合、本方法は、動物の出血からの抗体を単離することを含み得る。動物が共通軽鎖配列についてホモ接合である場合、ポリクローナル抗血清中の抗体のすべては、自律型重鎖(AHC)可変ドメイン抗体であるはずである。モノクローナル抗体が所望される場合、本方法は、b)免疫化されたトランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、c)ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原特異性ハイブリドーマを同定することと、d)抗原特異性ハイブリドーマから抗原特異性抗体を単離することと、を含み得る。あるいは、B細胞をスクリーニングすることもできる。
ある特定の実施形態において、動物は、GD2、EGF-R、CEA、CD52、CD20、Lym-1、CD6、補体活性化受容体(CAR)、EGP40、VEGF、腫瘍関連糖タンパク質TAG-72 AFP(アルファ-胎児性タンパク質)、BLyS(TNFおよびAPOL-関連リガンド)、CA125(癌抗原125)、CEA(癌胎児性抗原)、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(TCRに関連するヘテロ多量体)、CD4、CD11a(インテグリンアルファ-L)、CD14(単球分化抗原))、CD20、CD22(B細胞受容体)、CD23(低親和性IgE受容体)、CD25(IL-2受容体アルファ鎖)、CD30(サイトカイン受容体)、CD33(骨髄細胞表面抗原)、CD40(腫瘍壊死因子受容体))、CD44v6(白血球の接着を仲介する)、CD52(CAMPATH-1)、CD80(CD28およびCTLA-4の共刺激因子)、補体構成成分C5、CTLA、EGFR、エオタキシン(サイトカインA11)、HER2/neu、HER3、HLA-DR、HLA-DR10、HLA ClassII、IgE、GPiib/iiia(インテグリン)、インテグリンaVβ3、インテグリンa4β1およびa4β7、インテグリンβ2、IFN-ガンマ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6R(IL6受容体)、IL-12、IL-15、KDR(VEGFR-2)、ルイス、メソセリン、MUC1、MUC18、NCAM(神経細胞接着分子)、癌胎児性フィブロネクチン、PDGFβR(ベータ血小板由来成長因子受容体)、PMSA、腎癌抗原G250、RSV、E-セレクチン、TGFベータ1、TGFベータ2、TNFα、DR4、DR5、DR6、VAP-1(血管接着タンパク質1)、またはVEGFなどで免疫化されて、療法用抗体が産生され得る。
抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の便利な方法でトランスジェニック宿主動物に投与され得、所定のスケジュールに従って投与され得る。
免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物からの血清または乳汁は、抗原に特異的な医薬品グレードのポリクローナル抗体の精製のために分画され得る。トランスジェニックトリの場合、抗体は、卵黄を分画することによって作製され得る。濃縮された精製免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー(親和性、イオン交換、ゲル濾過など)、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーによる選択的沈殿によって得ることができる。
モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞、例えば、脾臓細胞が、免疫化されたトランスジェニック動物から単離され、ハイブリドーマの産生のために形質転換細胞株との細胞融合に使用され得るか、または抗体をコードするcDNAが、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、トランスフェクトされた細胞で発現され得る。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第0 583 980 A1号、米国特許第4,977,081号、WO97/16537、およびEP0491 057 B1を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。クローン化されたcDNA分子からのモノクローナル抗体のインビトロ産生は、Andris-Widhopf et al.,J Immunol Methods 242:159(2000)、およびBurton,Immunotechnology 1:87(1995)によって記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗体がまだヒトフレームワーク領域を含有しない場合、本方法は、抗体をヒト化することをさらに含み得、本方法は、抗体の定常ドメインをヒト定常ドメインと交換して、キメラ抗体を作製すること、ならびにある特定の場合には、例えば、CDRグラフト化またはリサーフェシングなどによって抗体の可変ドメインをヒト化することを含み得る。ヒト化は、Winter(Jones et al.,Nature 321:522(1986)、Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)、Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988))、Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993)、Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)、Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)、Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)、米国特許第5,723,323号、同第5,976,862号、同第5,824,514号、同第5,817,483号、同第5,814,476号、同第5,763,192号、同第5,723,323号、同第5,766,886号、同第5,714,352号、同第6,204,023号、同第6,180,370号、同第5,693,762号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,225,539号、同第4,816,567号、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755、WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP229246の方法に従って行われ得、各々は、そこに引用されている参考文献を含めて参照により本明細書に完全に組み込まれる。
そのため、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、トランスジェニック動物から抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法も提供される。本方法は、トランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、を含み得る。あるいは、B細胞は、ハイブリドーマを作製せずにスクリーニングされ得る。
抗体の重鎖可変ドメインは、動物の免疫系によって「自然に」作製される。そのような抗体は、ある特定の場合には、宿主細胞によって翻訳後改変(例えば、グリコシル化)され得、トランスジェニック動物の種に特徴的なグリコシル化パターンおよび組成を有し得る。
上記のトランスジェニック動物のいずれかによって産生された抗体の抗原特異性結合領域の配列は、所望される場合、重鎖可変ドメインの多様な集団のコード配列のすべてまたはいずれかがPCRプライマーの単一の対を使用してcDNAから増幅され得るため、比較的簡単に得られるはずである。各抗体の特異性および親和性は、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列によってのみ決定されるべきであるため、同族の軽鎖を同定または配列決定する必要はない。そのため、抗原特異性重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、比較的簡単に得られるはずである。上記のように、場合によっては、抗原特異性重鎖を発現する細胞を選択するために、B細胞またはハイブリドーマを機能的にスクリーニングすることができる。重鎖可変ドメインコード配列は、B細胞(例えば、PBMC)の濃縮または非濃縮集団からまとめて増幅され得る。配列がB細胞の非濃縮集団から増幅される場合、抗原特異性可変ドメインをコードする配列は、抗原特異性でない配列よりも高度に発現され(B細胞の活性化のため)、かつより可変的なクレードに潜在的に属するため、識別可能であるはずである。さらに、これらの重鎖は結合のために特定の軽鎖を必要としないため、フォローアップ作業を実行する前に、どの軽鎖がどの重鎖と対であるかを決定する必要はない。
Claims (10)
- B細胞を含むトランスジェニックニワトリであって、重鎖可変ドメインを含む抗体を産生することができ、前記B細胞において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、
(a)CDR3が、30~60アミノ酸長さの範囲にあり、3~10個のシステイン残基を含む前記重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、
(b)前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を(a)の前記重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、前記偽遺伝子が、前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にあり、
前記偽遺伝子が、遺伝子変換によって、(a)の前記重鎖可変ドメインのCDR3領域のコード配列を多様化する配列を含み、前記偽遺伝子配列が、30~60アミノ酸配列長さの範囲内にあり、3~10個のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードし、
(a)の前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および(b)の前記偽遺伝子が、前記CDR3が多様化されノブおよび茎構造を有する機能的重鎖可変ドメインを生じる、トランスジェニックニワトリ。 - 前記ニワトリの非B細胞が、VHセグメント、Dクラスター、Jセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、前記Dクラスター内の各Dセグメントが、30~60アミノ酸長さの範囲内にあり、3~10個のシステイン残基を含む異なる配列をコードする、請求項1に記載のトランスジェニックニワトリ。
- 前記ニワトリの非B細胞が、(a)の前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および(b)の前記偽遺伝子を含む、請求項1または2に記載のトランスジェニックニワトリ。
- (a)の前記重鎖可変ドメインが、自律型重鎖(AHC)可変ドメインである、請求項1~3に記載のトランスジェニックニワトリ。
- (a)の前記AHC可変ドメインが、30~60アミノ酸長さであり、3~10個のシステイン残基を含むCDR3を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインであり、
(a)の前記AHC可変ドメインが、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体であって、(a)の前記AHC可変ドメインが、ヒト生殖系列重鎖Vセグメント、30~60アミノ酸長さの範囲内にあり、3~10個のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードするDセグメントによってコードされ、
前記AHC可変ドメインが、最大10のラクダ化アミノ酸置換を含む、請求項4に記載のトランスジェニックニワトリ。 - (b)の前記偽遺伝子が、ヒト生殖系列抗体配列をコードする、請求項1~5のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
- 前記偽遺伝子が、600ヌクレオチド未満の長さである、請求項6に記載のトランスジェニックニワトリ。
- 前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、CH1欠失を含む重鎖をコードするか、または
前記ニワトリのゲノムが、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、請求項1~7のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。 - 前記ニワトリのゲノムが、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、請求項1~8のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
- (a)請求項1~9のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリを抗原で免疫化する工程と、
(b)前記トランスジェニックニワトリから、前記抗原に特異的に結合する抗体を得る工程と、を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法。
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WO2013059159A1 (en) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Crystal Bioscience, Inc. | In vivo method for generating diversity in a protein scaffold |
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