KR102339724B1 - 신장병증의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨성 신장병증을 앓고 있는 개체에게 당뇨성 신장병증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.

Description

신장병증의 치료 방법 {Method of Treating Nephropathy}
본 발명은 신장병증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
신장병증 (Nephropathy)
신장병증은 신장염 (염증성 신장질환) 및 신장증 (비염증성 신장질환)을 포함하여 신장의 손상에 의한 질환이다. 신장병증의 원인은 만성질환 (전신성 홍반성 루푸스를 포함), 당뇨 및 고혈압, 사구체에 IgA 항체의 증착, 진통제의 투여, 크산틴 산화효소 (xanthine oxidase)의 결핍, 화학요법제, 및 납 또는 그의 염에 장기간 노출 등을 포함한다.
당뇨병과 연관된 신장병증 (당뇨성 신장병증)은 미국 및 다른 여러 선진국에서 말기 신장질환의 가장 흔한 원인이다. 예를 들어, 당뇨성 신장병증은 오늘날 미국에서 말기 신장질환의 거의 35%를 차지하며 연간 환자당 약 $50,000-$65,000의 비용이 소요되어, 미국의 전체 환자를 위해 연간 $20억이 초과되는 비용이 든다. 제1형 당뇨 환자의 약 40%와 제2형 당뇨 환자의 약 5-15%가 결국 말기 신장질환으로 발전한다.
당뇨성 신장병증의 병태생리학적 메커니즘은 불완전하게 이해된다. 알려진 초기 이상 증상은 신장내 고혈압, 하이퍼필터레이션 (사구체 여과율 증가), 및 미세알부민뇨 등을 포함한다. 임상적으로, 초기 신장병증을 식별하기 위한 가장 중요한 검사법은 미세알부민뇨의 검출이다. 당뇨성 신장병증의 위험인자는 고혈당, 고혈압, 신장병증의 가족력, 및 흡연이다. 당뇨성 신장병증은 일반적으로 당뇨병에서 고혈압 및 고혈당증의 결과로 간주되며, 많은 연구자들은 고혈당증이 이 질환의 발달에 주요 요인으로 보고 있다.
지금까지의 의학적 중재는 당뇨성 신장병증의 진행 및 말기 신장질환으로의 발전을 예방하거나 치료하기에 충분히 효과적이지 못하였다. 이와 관련하여 현재의 치료법은 주로 다음과 같은 질환의 합병증 개선에 관한 것이다: 1) 혈압 조절 (ACE-엑제제 또는 안지오텐신 수용체 차단제 (ARBs)); 2) 혈당 수치의 조절; 및 3) 저지방, 저단백 식이, 운동 또는 다른 생활 습관 개선. 그러나, 현재 치료법은 신장 기능의 점진적인 감소와 같은 한계가 있어, 환자는 여전히 신장 교환 치료인 투석 또는 신장 이식을 진행한다.
다른 치료 전략은 신장병 모델에서 주로 증가하는 것으로 확인된 하나 이상의 성장인자를 치료 타켓으로 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, TGF-β 억제에 대한 단독 치료 또는 ACE 억제제와 병용 치료가 검토되고 있다. 혈관내피성장인자 A (VEGF-A) 및 혈관신생과 관련된 다른 인자들은 신장병증의 치료 타겟으로 연구되고 있다.
VEGF와 신장병증
성장인자 VEGF 패밀리는 5개의 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 태반 성장인자 (PIGF))를 포함하며, 이들은 3개의 수용체 타이로신 카이네이즈 (VEGFR-1, -2, 및 -3) 및 세마포린 수용체 (뉴로필린 1 및 2)와 차별적으로 결합한다. 성장인자 VEGF 패밀리는 정상 및 병적 혈관신생 및 림프관신생에 관여한다. VEGF-A는 VEGFR-1, VEGFR-2, NP-1, 및 NP-2에 결합하고; VEGF-B는 VEGFR-1 및 NP-1에 결합한다. VEGF-C와 VEGF-D는 VEGFR-2, VEGFR-3 및 NP-2에 결합하며 주로 림프관신생에 관여한다.
VEGF-A는 VEGF 패밀리 중 가장 많은 연구가 되었으며, 신장 및 신장병증과 관련된 VEGF-A 억제에 대한 연구에서 VEGF-A의 역활은 주로 신장에 유해한 영향을 미친다는 결과를 제공한다. 이러한 연구중 일부는 VEGF-A뿐만 아니라 VEGF-B 및 PlGF의 길항제 역할을 하는 수용성 VEGF 수용체 1 (sFlt-1)의 투여와 관련이 있으며, 단백뇨 및 고혈압을 초래하였다 (Nakagawa et al., Diabetes, 58, p1471-8, 2009). Kosugi et al (Am J Physiol Renal Physiol 298: F609-F616, 2010)은 sFlt-1 치료가 당뇨성 신장병증에 이롭지 않고, 당뇨성 신장질환의 치료에 대한 대안이 필요하다고 결론을 내렸다. db/db 마우스에서 VEGFR-1의 길항제와 관련된 최근 연구 (Yang et al., PLOS ONE, 9(4), e94540, 2014)는 VEGFR-1의 억제는 당뇨성 신장병증을 악화시키고, 실제로는 VEGFR-1의 활성화가 제2형 당뇨성 신장병증에서 치료 양상을 제공할 수 있다고 제안하였다. 상술한 바와 같이, VEGF-B는 VEGFR-1을 통해 신호를 전달하는 리간드 중 하나이며, 비록 비특이적인 방식이기는 하지만 sFlt-1 또는 VEGFR-1의 길항제와 관련된 연구는 VEGF-B 신호전달을 차단한다.
우선권 주장
본 출원은 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 2013년 11월 28일에 출원된 호주 특허출원 제2013904595호 "신장병증의 치료 방법"을 우선권으로 주장한다.
개요
본 발명의 제조에서, 본 발명자들은 신장병증에서 VEGF 신호전달과 연관된 기술분야 및 승인된 신장병증 마우스 모델 (예를 들어, 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병과 관련된 신장병증을 포함하는 당뇨성 신장병증의 고지방식이 마우스 모델)에서 VEGF-B의 신호전달을 억제하는 효과에 대해 연구하였다. 본 발명자들은 VEGF-B의 발현을 억제 (예를 들어, VEGF-B의 발현이 감소 또는 방지된 유전자 변형 마우스의 사용) 또는 VEGF-B의 길항제 (예를 들어, 길항제 항체)의 투여에 의해 이 성장인자의 효과를 연구하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 VEGF-B 신호전달의 억제가 다양한 신장병증 동물 모델에서 유익한 효과를 나타내는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 신장병증, 즉 당뇨성 신장병증 및 신장병증의 치료 (즉, 진행의 지연), 즉, 사용된 치료법에 의존적인 당뇨성 신장병증을 예방할 수 있었다.
본 발명자들은 VEGF-B 신호전달의 길항작용이 사구체간질 (mesangial) 확장, 사구체 및 세관경화증, 사구체간질 (mesangial) 세포외기질 침착, 사구체 기저막의 이상비대 및 신장 (즉, 신장 사구체에서) 지질 축척, 족세포 (podocyte) 손실, 고혈압, 사구체 혈관 재배열을 감소 또는 방지하며, 당뇨환자에서 족세포 (podocyte) 구조를 유지시킨다. 일부의 경우 (즉, 본원의 실시예), 당뇨 환자에서 혈당 수치에 대한 완만한 효과에도 불구하고 신장에는 변화가 생긴다. 이는 VEGF-B의 억제가 혈당조절 이외에 다른 경로를 통해 신장병증에서 치료적/예방적으로 유익한 효과를 제공한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들의 발견은 VEGF-B 신호전달을 억제함으로써 개체의 신장병증 치료 또는 예방 방법의 기초를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 개체의 신장병증 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
일 예에서, 신장병증은 신장염, 즉 염증성 신장질환이다. 예를 들어, 신장병증은 IgA 신장병증이거나, 약물 (예를 들어, 진통제 또는 화학요법제)의 사용, 크산틴 (xanthine) 산화효소 결핍, 다낭성 신장질환에 의해 발생하거나, 만성질환, 즉 염증 또는 자가면역 질환 또는 당뇨병에 의해 발생한다.
예를 들어, 신장병증은 사구체신염 및/또는 사구체경화증이다. 즉, 사구체신염 및/또는 사구체경화증은 증식성 사구체신염 및/또는 사구체경화증이다.
일 예에서, 신장병증 또는 신장염은 다른 질환에 의해 발생하거나 연관되어 있다. 예를 들어, 신장병증은 염증 또는 자가면역질환 (즉, 전신 홍반성 루푸스, 굿파스쳐 (Goodpasture) 증후군), 혈관염 (즉, 베게네육아종증 (Wegener granulomatosus) 또는 현미경적 다발혈관염 (microspcopic polyangitis)), 또는 당뇨병에 의해 발생한다.
일 예에서, 신장병증 또는 신장염은 전당뇨병에 의해 발생하거나 연관되어 있다.
일 예에서, 신장병증 또는 신장염은 제1형 당뇨병에 의해 발생하거나 연관되어 있다.
일 예에서, 신장병증 또는 신장염은 제2형 당뇨병에 의해 발생하거나 연관되어 있다.
예를 들어, 본 발명은 당뇨를 앓고 있는 개체에 당뇨성 신장병증의 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 당뇨성 신장병증을 앓고 있는 개체에 VEGF-B 신호전달 억제제를 투여하여 이러한 상태의 치료에 효과가 있음을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 당뇨성 신장병증을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 당뇨성 신장병증을 잃고 있는 개체에 VEGF-B 신호전달 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
일 예에서, 개체는 신장병증 발병의 위험이 있거나, 신장병증 (즉, 당뇨성 신장병증)이 발병하였다. 예를 들어, 개체는 미세알부민뇨 또는 다량알부민뇨 증상을 앓고 있다. 또 다른 예로, 개체는 고혈압을 앓고 있다.
일 예에서, 본 발명은 신장병증의 발병을 방지 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 미세알부민뇨 또는 다량알부민뇨 증상을 앓고 있는 개체 (즉, 당뇨병 및 미세알부민뇨 또는 다량알부민뇨 증상을 앓고 있는 개체)에 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 예에서, 개체는 미세알부민뇨 증상을 앓고 있다.
일 예에서, 본 발명은 신장병증 (즉, 당뇨성 신장병증)의 발병을 방지 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 고혈압을 앓고 있는 개체 (즉, 당뇨병 및 고혈압을 앓고 있는 개체)에 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 하기 효과 중 하나 이상을 나타내는 유효한 양으로 투여한다.
a) 고혈압의 강하 또는 예방;
b) 사구체 및/또는 세관 경화증의 감소 또는 예방;
c) 사구체간질 세포외 기질 (mesangial extracellular matrix) 증착 및/또는 사구체 기저막 이상비대의 감소 또는 예방;
d) 사구체간질 확장의 감소 또는 예방;
e) 사구체 혈관 재배열의 감소 또는 예방;
f) 신장 지질 축적의 감소 또는 예방;
g) 사구체 지질 축적의 감소 또는 예방;
h) 사구체 콜라겐 증착 및/또는 세동맥 유리질증 (arteriolar hyalinosis)의 감소 또는 예방; 및/또는
i) 다량알부민뇨 (macroalbuminuria)의 감소 또는 예방.
일 예에서, VEGF-B 신호전달 억제 화합물은 구체적으로 VEGF-B 신호전달 억제제이다. 이것은 본 발명의 방법이 다수의 VEGF 단백질의 억제 신호를 포함하지 않는 것을 의미하는 것은 아니며, VEGF-B 신호전달 억제 화합물 (또는 그의 일부)은 VEGF 단백질의 일반적인 억제제가 아니며 VEGF-B에만 특정적이다. 이 용어는 또한, 예를 들어, 하나 (또는 그 이상)의 결합 도메인과 VEGF-B 신호전달을 특이적으로 억제할 수 있고, 또 다른 결합 도메인과 또 다른 단백질의 구체적인 신호전달 억제하는, 이들의 결합 도메인을 포함하는 이중 특이적 항체 또는 단백질을 배제하지 않는다.
일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B에 결합한다. 예를 들어, 화합물은 VEGF-B 또는 특정 VEGF-B에 결합하고, VEGF-B 신호전달을 중화하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질이다.
일 예에서, 화합물은 항체 유사체이다. 예를 들어, 화합물은 면역글로불린, 즉 IgNAR, 낙타 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이다.
일 예에서, 화합물은 도메인 항체 (즉, 중사슬 가변영역만 또는 경사슬 가변영역만에 결합하는 VEGF-B를 포함) 또는 항체의 중사슬만 (즉, 낙타 항체 또는 IgNAR) 또는 그의 가변영역을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 Fv를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 하기 (i) 내지 (xi)로 구성된 군에서 선택된다:
(i) 단일 사슬 Fv 단편 (scFv);
(ii) 이량체 scFv (di-scFv); 또는
(iv) 디아바디 (diabody);
(v) 트리아바디 (triabody);
(vi) 테트라바디 (tetrabody);
(vii) Fab;
(viii) F(ab')2;
(ix) Fv;
(x) 항체의 불변영역에 연결된 (i) 내지 (ix)중 하나, Fc 또는 중사슬 (heavy chain) 불변 도메인 (CH)2 및/또는 CH3; 또는
(xi) 항체.
다른 예에서, 화합물은 항체이다. 구체적인 항체는 전장 (full-length) 및/또는 네이키드 (naked) 항체이다.
일 예에서, 화합물은 재조합, 키메라, CDR 이식된 (grafted), 인간화, 합성인간화 (synhumanized), 영장류화 (primatized), 탈면역화 (deimmunized) 또는 인간 단백질이다.
일 예에서, 화합물은 VEGF-B에 항체 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질이다. 일 예에서, 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 중사슬 가변영역 (VH) 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 경사슬 가변영역 (VL)를 포함하는 단백질이다.
일 예에서, 화합물은 항체 2H10의 인간화된 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 항체 2H10의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDRs)를 포함하는 가변영역을 포함한다. 예를 들어, 단백질은 하기를 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 25-34번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 49-65번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 98-108번째 아미노산을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열번호 4로 표시되는 서열의 23-33번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 4로 표시되는 서열의 49-55번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 4로 표시되는 서열의 88-96번째 아미노산을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 화합물은 항체 2H10의 VH 및 VL, 상기 VH 및 VL의 인간화된 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 하기를 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 25-34번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 49-65번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 98-108번째 아미노산을 포함하는 CDR3; 및
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열번호 4로 표시되는 서열의 23-33번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 4로 표시되는 서열의 49-55번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 4로 표시되는 서열의 88-96번째 아미노산을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 상기 어느 하나의 가변영역 또는 VH는 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 상기 어느 하나의 가변영역 또는 VL는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체이다.
일 예에서, 화합물은 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체이다.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 상기 단백질 또는 항체를 코딩하는 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 항체의 모든 형태이다.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 하기를 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열번호 11을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 12를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 13을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열번호 14를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 15를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 16을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 하기를 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열번호 23을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 25를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열번호 26을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 27을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 28을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 하기를 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열번호 35를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 36을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 37을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열번호 38을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 39를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 40을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 화합물은 조성물에 안에 있다. 예를 들어, 조성물은 상기 기재된 항체 가변영역 또는 VH 또는 VL 또는 항체를 포함하는 단백질을 포함한다. 일 예에서, 조성물은 단백질 또는 항체의 하나 이상의 변이를 추가로 포함한다. 예를 들어, 암호화된 C-말단 라이신 잔기의 결실 변이, 탈아미드 변이 및/또는 글리코실화 변이 및/또는 피로글루타메이트 (pyroglutamate), 즉 단백질의 N-말단을 포함하는 변이 및/또는 N-말단 잔기, 즉 항체 또는 V 영역의 N-말단 글루타민 결실 변이 및/또는 분비 신호의 일부 또는 모두를 포함하는 변이를 포함한다. 암호화된 아스파라긴 잔기의 탈아미드 변이는 아이소아스파틱 (isoaspartic), 및 아스파르트산 이성체로 변형될 수 있으며, 또는 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 경우에는 숙신아미드 (succinamide)가 생성되기도 한다. 암호화된 글루타민 잔기의 탈아미드 변이는 글루타민산이 될 수 있다. 이러한 서열 및 변이의 이종 혼합물을 함유하는 조성물에 대한 기준은 특정 아미노산 서열로 이루어지는 경우가 포함되는 것이다.
일 예에서, 화합물은 VEGF-B 신호전달을 억제 또는 VEGF-B의 발현을 방지하는 억제제이다. 예를 들어, 화합물은 안티센스, siRNA, RNAi, 라이보좀 및 DNAzyme으로 구성된 군에서 선택되는 것이다.
일 예에서, VEGF-B는 포유류 VEGF-B, 즉 인간 VEGF-B이다.
일 예에서, 개체는 포유류, 즉 인간과 같은 영장류이다.
본 명세서에 기술된 치료 방법은 신장병증의 치료 또는 예방을 위해 추가 화합물을 투여하는 것을 더 포함한다.
여기에 기술된 당뇨성 신장병증의 치료 방법은 당뇨병의 치료 또는 예방 (또는 진행 지연)을 위한 추가 화합물을 투여하는 것을 더 포함한다. 예시적인 화합물은 여기에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 신장병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 신장병증의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 신장병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 패키지와 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
예시 신장병증 및 화합물은 본 명세서에 기재되어 있으며, 이전 세 단락의 제시된 예를 준용하여 적용된다.
도 1a는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스 (n=5 그룹, 왼쪽 그래프) 및 마른 야생형 (wt)과 마른 Vegfb -/- 마우스 (n=4-6/group, 오른쪽 그래프)의 소변내 알부민/크레아티닌 비 (ACR)를 ELISA로 측정한 것을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 1b는 db/db 및 db/db// Vegfb +/- 마우스 (그룹당 n=5)의 꼬리 (tail-cuff) 혈압 (수축기 및 이완기 혈압)을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 2a는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장 절편에서 세관 기저막 (BM)의 두께를 측정하여 세관 부분의 이상을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 db/db 대조군과 비교하였고, ## P<0.01은 28주령의 마른 야생형 마우스와 비교하였다.
도 2b는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장 절편에서 사구체간질 (mesangial) 확장을 측정하여 사구체 경화증을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 2c는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장 절편에서 프레임 (n= 4/group)당 세포사멸 사구체를 측정하여 사구체의 세포사멸을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 3a는 마른 야생형, db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 동물의 신장 절편에서 투과전자현미경 (TEM) 분석을 이용하여 사구체 기저막의 두께를 측정하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=3-4. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ### P<0.001은 마른 db + 대조군과 비교하고 **P<0.01은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 3b는 마른 야생형, db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 동물의 신장 절편에서 투과전자현미경 (TEM) 분석을 이용하여 슬릿의 수를 측정하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=3-4. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ### P<0.001은 마른 db + 대조군과 비교하고 **P<0.01은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 4a는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 동물의 신장 절편에서 오일 레드 O (ORO) 분석을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05는 db/db 대조군과 비교하였다.
도 4b는 db/db, db/db// Vegfb +/-, db/db// Vegfb -/- 및 야생형 동물의 사구체 및 세뇨관 부분을 오일 레드 O (ORO) 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05 및 ###P<0.001은 마른 대조군과 비교한 것이며, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 5a는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/-의 사구체에서 시냅토포딘 (synaptopodin)을 염색하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 5b는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/-의 사구체에서 pecam을 염색하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 6a는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스 신장 절편의 사구체에서 콜라겐 IV를 염색하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 6b는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스 신장 절편의 사구체에서 α-SMA 를 염색하고 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 db/db 대조군과 비교하였다.
도 6c는 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스 신장 절편에서 동맥의 두께를 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05는 db/db 대조군과 비교하였다.
도 7은 마른 야생형, 6주령 db/db// BKS 및 21주령 db/db// BKS 마우스의 사구체 및 세관 부분을 오일 레드 O (ORO) 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. n=5-7. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05 및 ##P<0.01은 세관과 사구체를 비교한 것이고, *P <0.05는 6주령 db/db// BKS와 21주령 db/db// BKS 사구체를 비교한 것이다.
도 8은 db/db// BKS 마우스의 당뇨성 신장병증 (DN) 진행에서 족세포 (podocyte)의 감소와 사구체 지질 축적의 상관관계를 보여주는 2개의 그래프이다. 왼쪽은 아디포필린 (adipophilin) 염색의 정량화를 보여주며, 오른쪽은 시냅토포딘 (synaptopodin) 염색의 정량화를 보여준다. 그룹당 n=3-5. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01는 마른 db + 대조군과 비교한 것이며, *P <0.05는 6주령 db/db//BKS와 21주령 db/db//BKS 사구체를 비교한 것이다.
도 9는 마른 db + , 및 6-, 12- 및 21-주령 db/db// BKS의 신장에서 Vegfb , Vegfr1, Fatp4 및 Fatp3 mRNA의 상대적인 발현을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. * P < 0.05, ** P < 0.01는 마른 대조군과 비교하였다. Vegfb는 혈관내피성장인자 B; Vegfr1은 혈관내피성장인자 수용체 1; Fatp3는 지방산 수송체 3; Fatp4는 지방산 수송체 4이다.
도 10a는 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 소변내 알부민/크레아티닌 비를 분석하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05, **P<0.01는 고지방식이 대조군과 비교한 것이다.
도 10b는 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 소변내 알부민을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05, **P<0.01는 고지방식이 대조군과 비교한 것이다.
도 11a는 고지방식이 Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에서 사구체간질 (mesangial) 확장을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 고지방 (HFD)식이 야생형, Vegfb +/-, Vegfb -/- 마우스 및 마른 야생형 대조군 동물에서 분석하였다. 그룹당 n= 5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이며, 스케일바는 50nm이다. #P<0.05, ###P<0.001는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, **P<0.01는 고지방식이 대조군과 비교한 것이다.
도 11b는 고지방식이 Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에서 사구체 영역을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 고지방 (HFD)식이 야생형, Vegfb +/-, Vegfb -/- 마우스 및 마른 야생형 대조군 동물에서 분석하였다. 그룹당 n= 5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이며, 스케일바는 50nm이다. #P<0.05, ###P<0.001는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, **P<0.01는 고지방식이 대조군과 비교한 것이다.
도 12는 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편을 오일 레드 O (ORO) 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n= 5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05는 고지방식이 야생형과 비교한 것이다.
도 13은 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편에서 사구체를 아디포필린 (adipophilin) 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, **P<0.05는 고지방식이 야생형과 비교한 것이다.
도 14a는 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편을 콜라겐 IV 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n= 5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05, **P<0.01는 고지방식이 야생형과 비교한 것이다.
도 14b는 고지방 (HFD)식이 야생형, 고지방식이 Vegfb +/-, 고지방식이 Vegfb -/- 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편에서 세동맥의 두께를 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n= 5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01는 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05, **P<0.01는 고지방식이 야생형과 비교한 것이다.
도 15a-f는 db/db// BKS 마우스에 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 후 분석한 것을 보여주는 그래프이다. 도 15a는 미처리 동물에서 식후 혈당 수치를 보여준다. 화살표는 예방 또는 치료를 시도한 시작 시점의 포도당 수준을 나타낸다. 도 15b는 미처리 db/db// BKS 마우스에서 알부민/크레아티닌의 비 (ACR)를 보여준다. 화살표는 예방 또는 치료를 시도한 시작 시점의 ACR을 나타낸다. 도 15c 및 도 15d는 db/db// BKS 마우스의 수컷 (6C 그룹당 n=5) 및 암컷 (6D 그룹당 n=5)에 anti-VEGF-B를 예방적으로 처리한 후 식후 혈당 수치를 보여준다. 도 15e 및 도 15f는 db/db// BKS 마우스의 수컷 (도 15e 그룹당 n=5) 및 암컷 (도 15f 그룹당 n=5)에 anti-VEGF-B를 치료적으로 처리한 후 식후 혈당 수치를 보여준다. anti-VEGF-B (2H10)의 투여 주기는 각각의 그래프에 표시하였다.
도 16a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체간질 (mesangial) 확장으로 측정한 사구체 경화증을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01는 대조군 항체를 처리한 db/db// BKS 마우스와 비교한 것이다.
도 16b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 크기 측정에 의한 세관 경화증을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01는 대조군 항체를 처리한 db/db//BKS 마우스와 비교한 것이다.
도 17a는 db/db// BKS 마우스 또는 마른 db+ 대조군에 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방법으로 처리한 후 신장 절편에서 사구체 족세포 (podocin) 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01은 마른 db+ 대조군과 비교한 것이며, **P<0.01, ***P<0.001은 대조군 항체 처리한 db/db와 비교한 것이다. 그룹당 n=3-7.
도 17b는 db/db// BKS 마우스에 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방법으로 처리한 후 신장 절편에서 사구체 pecam 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이다.
도 18a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 아디포필린 (adipophilin) 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.05은 마른 db+ 대조군과 비교한 것이며, 그룹당 n=3-7이다.
도 18b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 시냅토포딘 (synaptopodin) 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이며, 그룹당 n=3-5이다.
도 19는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 골라겐 IV 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이며, 그룹당 n=3-5이다.
도 20a-c는 당뇨병 db/db// BKS 마우스에 2H10를 예방적으로 사용하여 VEGF-B의 약학적 억제에 의한 혈장 지질 프로파일의 개선을 보여주는 그래프이다. anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리한 db/db// BKS 마우스 (그룹당 n=8) 및 마른 db/+ 동물 (n=3)에서 분석하였다. 혈장의 HDL-c 및 LDL-c 수준 (도 11a), 비-에스테르형 지방산 (NEFAs) 수준 (도 11b) 및 케톤 (도 11b)의 수준. #/*P<0.05, ##/**P<0.01는 마른 db+ 또는 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다.
도 21a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방적으로 처리한 마른 db+ 및 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 기저막 (GBM) 두께를 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=3-4. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01는 마른 db + 대조군 및 **P<0.01는 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 21b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 예방적으로 처리한 마른 db+ 및 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 실릿의 수를 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=3-4. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01는 마른 db + 대조군 및 **P<0.01는 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 22는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리한 db/db// BKS 마우스 및 마른 db+ 의 신장 절편에서 사구체 및 세관 부분을 오일 레드 O 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=3-7. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.001는 마른 db + 대조군과 비교한 것이며, **P<0.01는 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 23a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 8주간 처리한 암컷 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체간질 (mesangial) 확장으로 측정한 사구체 경화증을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***p<0.001은 대조군과 비교한 것이다.
도 23b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 8주간 처리한 수컷 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체간질 (mesangial) 확장으로 측정한 사구체 경화증을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다.
도 24는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 8주간 처리한 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 오일 레드 O 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***p<0.001은 대조군과 비교한 것이다.
도 25a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 pecam 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이다.
도 25b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 시냅토포딘 (synaptopodin) 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이다 (그룹당 n=4-5).
도 26a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 8주간 처리한 db/db// BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 콜라겐 IV 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05는 대조군과 비교한 것이다.
도 26b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 α-SAM 염색을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이다 (그룹당 n=4-5).
도 26c는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 db/db//BKS 마우스의 신장 절편에서 사구체 세동맥 두께를 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군과 비교한 것이다 (그룹당 n=4-5).
도 27a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스 또는 마른 동물 (그룹당 n=3-7)의 소변내 알부민/크레아티닌 비 (ACR)를 ELISA로 측정하여 정량화하여 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. 시작 시점과 종료 시점은 치료 기간의 전과 후의 ACR을 보여준다. *P<0.05, **P<0.01은 대조군 처리된 동물과 비교한 것이다.
도 27b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스 또는 마른 동물 (그룹당 n=3-7)의 크레아티닌 클리어런스 측정에 의한 사구체 여과율을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 27c는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스 또는 마른 동물 (그룹당 n=3-7)의 꼬리 (tail-cuff) 혈압 (수축기 및 이완기 혈압)을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 27d는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 8주간 처리한 db/db//BKS 마우스 또는 마른 동물 (그룹당 n=4)의 몸무게 (왼쪽 그래프), 신장 무게 (가운데 그래프) 및 몸무게 당 신장 무게 (오른쪽 그래프)를 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 대조군 처리된 db/db와 비교한 것이다.
도 28은 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물에서 혈당 수준을 보여주는 그래프이다. 식후 혈당 수준은 처리 기간의 마지막 시점에 측정하였다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01은 마른 대조군 동물과 비교하였다.
도 29a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물 (그룹당 n=5-10)에서 소변내 알부민 수준을 보여주는 그래프이다. ACR은 알부민/크레아티닌 비. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, ***P<0.001은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 29b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물 (그룹당 n=5-10)에서 ELISA로 측정한 소변내 알부민/크레아티닌 비를 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, ***P<0.001은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 30a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물 (그룹당 n=5-10)에서 혈장의 중성지방 수준을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 30b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물 (그룹당 n=5-10)에서 혈장의 비-에스테르화 지방산 (NEFAs) 수준을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 30c는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물 (그룹당 n=5-10)에서 혈장의 케톤 수준을 보여주는 그래프이다. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ##P<0.01은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 31a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물에서 사구체간질 (mesangial) 확장을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, ***P<0.001은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 31b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물에서 사구체 영역을 정량화하여 보여주는 그래프이다. 그룹당 n=5-10. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. #P<0.05, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, ***P<0.001은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 32는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편에서 사구체를 오일 레드 O 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. ##P<0.01은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, **P<0.01은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 33a는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편에서 콜라겐 IV 염색으로 정량화하여 보여주는 그래프이다. #P<0.05은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 33b는 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 치료적으로 처리한 고지방식이 마우스 및 마른 대조군 동물의 신장 절편에서 세동맥 두께를 정량화하여 보여주는 그래프이다. #P<0.05은 마른 대조군 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 고지방식이군과 비교한 것이다.
도 34a는 스트렙토조토신 (STZ) 주사 전, 후 형당 수치를 보여주는 그래프이다. 마른 대조군 동물은 STZ를 투여하지 않았으며, STZ 주사 후 고혈당 (혈당 수치 12mM 이상)이 된 동물은 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리하였다. 그룹당 n=3-7. 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이다.
도 34b는 스트렙토조토신 (STZ) 주사하고 (마른 대조군 동물 제외) anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리한 마우스 및 마른 대조군 동물에서 혈당 수치를 보여주는 그래프이다. 마른 대조군 동물은 STZ를 주사하지 않았다 (그룹당 n=3-7). 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01, ###P<0.001은 마른 대조군 동물과 비교한 것이다.
도 35a는 스트렙토조토신 (STZ) 주사 및 스트렙토조토신 (STZ) 주사 후 1주일간 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리한 마우스에서 알부민/크레아티닌 비 (ACR)를 보여주는 그래프이다. 마른 대조군 동물 및 db/db 동물은 STZ를 주사하지 않았다. 소변내 알부민/크레아티닌 비 (ACR)는 ELISA로 측정하였다 (그룹당 n=3-6). 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01은 STZ 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 STZ 동물과 비교한 것이다.
도 35b는 스트렙토조토신 (STZ) 주사 및 스트렙토조토신 (STZ) 주사 후 1주일간 anti-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체 (C)를 처리한 마우스에서 알부민 수준을 보여주는 그래프이다. 마른 대조군 동물은 STZ를 주사하지 않았다. 소변내 알부민 수준은 ELISA로 측정하였다 (그룹당 n=3-6). 수치는 평균±표준오차 (±s.e.m.)이다. ##P<0.01은 STZ 동물과 비교한 것이며, *P<0.05은 대조군 처리된 STZ 동물과 비교한 것이다.
서열목록에 대한 정보
서열번호 1 - N-말단 신호 서열 21개 아미노산을 함유하는 인간 VEGF-B186 이성체의 아미노산 서열
서열번호 2 - N-말단 신호 서열 21개 아미노산을 함유하는 인간 VEGF-B167 이성체의 아미노산 서열
서열번호 3 - 항체 2H10의 VH의 아미노산 서열
서열번호 4 - 항체 2H10의 VL의 아미노산 서열
서열번호 5 - 인간화된 항체 2H10의 VH의 아미노산 서열
서열번호 6 - 인간화된 항체 2H10의 VL의 아미노산 서열
서열번호 7 - 항체 4E12의 VH의 아미노산 서열
서열번호 8 - 항체 4E12의 VL의 아미노산 서열
서열번호 9 - 항체 2F5의 VH의 아미노산 서열
서열번호 10 - 항체 2F5의 VL의 아미노산 서열
서열번호 11 - 항체 2H10의 VL CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 12 - 항체 2H10의 VL CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 13 - 항체 2H10의 VL CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 14 - 항체 2H10의 VH CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 15 - 항체 2H10의 VH CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 16 - 항체 2H10의 VH CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 17 - 항체 2H10의 VL CDR1의 아미노산 서열
서열번호 18 - 항체 2H10의 VL CDR2의 아미노산 서열
서열번호 19 - 항체 2H10의 VL CDR3의 아미노산 서열
서열번호 20 - 항체 2H10의 VH CDR1의 아미노산 서열
서열번호 21 - 항체 2H10의 VH CDR2의 아미노산 서열
서열번호 22 - 항체 2H10의 VH CDR3의 아미노산 서열
서열번호 23 - 항체 2F5의 VL CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 24 - 항체 2F5의 VL CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 25 - 항체 2F5의 VL CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 26 - 항체 2F5의 VH CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 27 - 항체 2F5의 VH CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 28 - 항체 2F5의 VH CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 29 - 항체 2F5의 VL CDR1의 아미노산 서열
서열번호 30 - 항체 2F5의 VL CDR2의 아미노산 서열
서열번호 31 - 항체 2F5의 VL CDR3의 아미노산 서열
서열번호 32 - 항체 2F5의 VL CDR1의 아미노산 서열
서열번호 33 - 항체 2F5의 VL CDR2의 아미노산 서열
서열번호 34 - 항체 2F5의 VL CDR3의 아미노산 서열
서열번호 35 - 항체 4E12의 VL CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 36 - 항체 4E12의 VL CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 37 - 항체 4E12의 VL CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 38 - 항체 4E12의 VH CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 39 - 항체 4E12의 VH CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 40 - 항체 4E12의 VH CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열번호 41 - 항체 4E12의 VL CDR1의 아미노산 서열
서열번호 42 - 항체 4E12의 VL CDR2의 아미노산 서열
서열번호 43 - 항체 4E12의 VL CDR3의 아미노산 서열
서열번호 44 - 항체 4E12의 VH CDR1의 아미노산 서열
서열번호 45 - 항체 4E12의 VH CDR2의 아미노산 서열
서열번호 46 - 항체 4E12의 VH CDR3의 아미노산 서열
일반
본 명세서를 통해, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥에서 다르게 요구되지 않는다면, 단일의 단계에 대해서, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질 조성의 그룹은 하나 및 복수의(즉, 하나 이상의) 이들 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질 조성의 그룹을 포함하도록 취해질 것이다.
당업자는 본 명세서가 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 변경의 여지가 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서는 모든 변형 및 변경을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서는 또한 본 명세서 내에 개별적으로 또는 총괄적으로 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징의 모든 및 임의의 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 명세서는 본 명세서에 기재된 구체예에 의해 범주가 제한되지 않으며, 이는 단지 예시의 목적을 위한 것으로 의도된다. 기능상-동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 명세서의 범주 내에서 명확하다.
본 발명의 실시예는 본 명세서에 특별히 언급하지 않는 한 발명의 다른 예에 준용하여야 한다.
신장병증의 예방 또는 치료와 관련하여, 본 발명의 실시예는 신장병증을 앓고 있는 개체에서 선천성 면역 반응 (예를 들어, 소화기계의 선천성 면역 반응 및/또는 전신성 선천성 면역 반응)을 억제 또는 예방하기 위해 준용하여야 한다.
달리 구체적으로 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 것이다 (예를 들어, 세포 배양물, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학).
달리 표시되지 않는다면, 본 명세서에 이용되는 재조합 단백질, 세포 배양물, 및 면역기법은 당업자에게 잘 공지된 표준 방법이다. 이러한 기법은 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press(1995 및 1996), 및 F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988, 현재까지의 모든 최신 정보를 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지의 모든 최신 정보를 포함)과 같은 자료의 문헌을 통해 기재되고 설명된다.
본 명세서의 가변영역 및 이것의 부분, 항체 및 이것의 단편의 기재 및 정의는 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991, Bork et al., J Mol . Biol . 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol . 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 및/또는 Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997]의 논의에 의해 더 명확해질 수 있다.
단백질 또는 항체에 대한 본 명세서의 설명은 제조 및/또는 저장 동안 생성된 단백질 또는 항체의 임의의 변이를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 제조 또는 보관 동안의 항체는 탈아미드화 (즉, 아스파라긴 또는 글루타민 잔기에서) 및/또는 변형된 글리코실화 및/또는 글루타민 잔기의 피로글루타민으로의 전환 및/또는 N-말단 또는 C-말단 잔기의 제거 또는 "부럼짐 (clipped)" 및/또는 불완전하게 처리된 신호 서열의 전체 또는 일부를 가짐으로써, 항체의 말단에 남아 있다. 특정 아미노산 서열을 포함하는 조성물은 상기 언급된 것 또는 암호화된 서열 및/또는 상기 언급된 것의 변이 또는 암호화된 서열의 이종 혼합일 수 있다고 이해된다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 하나를 의미하는 것으로 이해될 것이며, 두 의미를 다 또는 두 의미 중 하나에 대한 명확한 지원을 제공하기 위하여 취해질 것이다.
본 명세서를 통해, 단어 "포함하다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계 그룹을 제외하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 용어 "로부터 유래된"은 공급원으로부터 직접 필수적이지는 않을지라도, 특정 정수가 특정 공급원으로부터 얻어질 수 있다는 것을 표시하도록 취해질 수 있다.
선택된 정의
VEGF-B는 VEGF-B186 및 VEGF-B167의 두 가지 주요 이성체가 존재하는 것으로 알려져 있다. VEGF-B186는 NCBI 레퍼런스 서열: NP_003368.1, NCBI 단백질 등록번호 NP_003368, P49765 및 AAL79001, 및 서열번호 1로 표시된다. 본 발명의 맥락에서, VEGF-B186의 서열은 N-말단 신호 서열 12개 아미노산 (즉, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 12)이 결실 되어 있다. VEGF-B167는 NCBI 레퍼런스 서열: NP_001230662.1, NCBI 단백질 등록번호 AAL79000 및 AAB06274 , 및 서열번호 2로 표시된다. 본 발명의 맥락에서, VEGF-B167의 서열은 N-말단 신호 서열 12개 아미노산 (즉, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 12)이 결실 되어 있다. VEGF-B의 추가 서열은 본 명세서에서 제공하는 서열을 사용하여 결정 및/또는 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스 및/또는 표준기술을 사용하여 결정 (즉, Ausubel et al., (저자), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트 포함) 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))할 수 있다. 인간 VEGF-B는 hVEGF-B 축약할 수 있다. 일 예에서, 본 명세서의 VEGF-B는 VEGF-B167 이성체이다.
본 명세서의 VEGF-B는 WO2006/012688에 기재된 것과 같이 VEGF-B10-108 펩타이드를 포함한다.
용어 "신장병증"은 신장의 손상 또는 질환을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 신장에서 신장 섬유화 및/또는 사구체 질환 (즉, 사구체경화증, 사구체신염) 및/또는 만성 신부전증, 및 말기 신장질환 및/또는 신장장애를 일으킬 수 있는 모든 임상-병리학적 변화를 포함한다. 대표적인 신장병증은 고혈압성 신장병증, 당뇨성 신장병증, 및 진통성 신장병증, 면역-매개 사구체병증 (즉, IgA 신장병증 또는 버거씨병, 루푸스 신염), 허혈성 신장병증, HIV-연관 신장병증, 막성 신장병증, 사구체신염, 사구체경화증, 방사선 조영제에 의해 야기된 신장병증, 독성 신장병증, 진통제에 의한 신독성, 시스플라틴 (cisplatin) 신장병증, 이식 신장병증과 같은 다른 유형의 신장병증, 및 사구체 이상 또는 손상의 다른 형태; 사구체 모세혈관 손상 (관 섬유증)이다. 일 구체예에서는, 용어 "신장병증 (nephropathy)" 또는 "신장병증 (nephropathies)"은 개체의 소변내 알부민과 같은 단백질의 존재 (예, 단백뇨) 및/또는 신장 기능의 부전이 존재하는 장애 또는 질환을 구체적으로 지칭한다. 신장병증은 종종 소변에 알부민의 존재에 기초하여 (미세알부민뇨 또는 대량알부민뇨), 증가된 혈중 질소 농도 (즉, 20mg/dL 이상) 및/또는 증가된 혈장내 크레아티닌 수준 (즉, 남성 1.3mg/dL 이상 및 여성 1.1mg/dL 이상)에 의해 진단한다.
용어 "섬유증"은 섬유조직, 또는 섬유종 또는 섬유변성의 이상 진행을 의미한다. 섬유증은 다양한 부상 또는 질병에 의해 발생할 수 있다. 섬유증은 예를 들어, 콜라겐 및 피브로넥틴의 과잉 생산 및 침착 증가를 포함하여 세포외기질 성분의 비정상적 생산, 축척, 또는 침착과 일반적으로 연관된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "신장 섬유증 (kidney fibrosis)" 또는 "신장 섬유증 (renal fibrosis) 또는 "신장의 섬유화 (fibrosis of the kidney)"는 신장 기능의 저하 또는 장애를 초래하는, 콜라겐과 같은 세포외기질 성분의 과잉 생산 또는 비정상 침착과 관련된 질환 또는 질병을 말한다.
용어 "신장염"은 신장의 염증을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 맥락에서, 신장염은 신장의 염증을 특징으로 하는 신장병증을 포함한다. 염증은 사구체, 세관, 또는 사구체 및 세관 주위의 간질 조직과 관련될 수 있다. 일반적으로 신염은 사구체신염 (즉, 사구체의 염증) 또는 간질성 신염 (즉, 신장 세관 사이 공간의 염증) 중 하나이다.
용어 "사구체"는 증식성 질환 및 비증식성 질환의 하위 종류로 구분될 수 있는 신장질환의 종류를 포함한다. 명칭과 같이 "증식성" 질환은 사구체 세포의 수가 현저히 증가하는 사구체신염의 형태이며, 반면 "비증식성" 질환은 세포수의 증가가 존재하지 않는 사구체신염 형태이다. 대표적인 증식성 질환은 IgA 신장병증, 후감염 사구체신염, 막증식성 사구체신염 및 급성 진행성 사구체신염을 포함한다. 대표적인 비증식성 질환은 미세변화질환, 국소 분절성 사구체경화증, 얇은 기저막 질환 및 막성 사구체신염을 포함한다.
"당뇨성 신장병증"은 단백뇨, 고혈압, 부종 및 신부전을 특징으로 임상병리적으로 정의된다. 당뇨성 신장병증의 특징은 사구체경화증, 혈관구조의 변형, 및 세뇨관간질성 질환을 포함한다. 당뇨성 신장병증의 첫번째 임상적 증거는 소변내 단백뇨의 존재 (즉, 미세알부민뇨 또는 대량알부민뇨)다. 당뇨성 신장병증은 일반적으로 다음과 같은 특징이 있다: 1) 사구체경화증; 2) 주로 작은 세동맥에서 혈관 구조의 변형; 및 3) 세뇨관간질성 질환. 당뇨성 신장병증의 가장 특징적인 양상은 사구체간질의 확장 및 기저막의 비후에 의해 검출되는 사구체 손상이다. 당뇨성 신장병증의 첫번째 임상적 증거는 알부민뇨 또는 단백뇨의 존재이다.
"미세알부민뇨"는 24시간 모은 소변 당 30-300mg 알부민의 존재 및/ 또는 단일 샘플에서 30-300mg/L 알부민의 존재를 의미한다. 일반적으로, 이들 모두는 2~3개월 동안 3개의 시료중 적어도 2개 이상을 측정해야 한다. 미세알부민뇨는 알부민/크레아티닌 비 (ACR)가 여성은 ≥3.5mg/mmol 또는 남성은 ≥2.5 mg/mmol 또는 30-300μg/mg의 알부민/크레아티닌으로 정의할 수 있다. 알부민 수준은 예를 들어, 시판되는 계량봉 (dipsticks) (즉, 인디케이터로 브로모페놀블루를 포함)을 사용하여 평가할 수 있다.
용어 "대량알부민뇨"는 미세알부민뇨에서 관찰되는 것보다 더 높은 알부민의 양 (또는 더 높은 ACR)의 존재를 의미한다.
용어 "단백뇨"는 소변내 총 단백질의 양이 약 ≥30mg/dL 또는 단백질/크레아티닌 비가 45 mg/mmol 보다 큰 것을 의미한다.
"고혈압"은 개체 (즉, 인간 피험자)가 수축기 혈압 140 mm Hg 이상 및/또는 이완기 혈압 90 mm Hg 이상을 말한다. 본 명세서에 기술된 방법 또는 사용의 일 예에서, 개체는 수축기 혈압 약 120-139 mm Hg 이상 및/또는 이완기 혈압 80-89 mm Hg 이상을 갖는 고혈압 전단계이다.
용어 "재조합"은 인위적 유전자 재조합의 생성물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 항체 가변영역을 포함하는 재조합 단백질과 관련하여, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생하는 천연 재조합 생성물인 개체에서의 천연-발생 항체는 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 항체가 분리되는 경우, 이는 항체 가변영역을 포함하는 분리된 단백질로 간주될 것이다. 유사하게, 상기 단백질을 암호화하는 핵산이 분리되고 재조합 수단을 이용하여 발현되는 경우, 생성된 단백질은 항체 가변영역을 포함하는 재조합 단백질이다.
재조합 단백질은 또한, 예를 들어, 상기 단백질이 발현되는 세포, 조직 또는 개체 내에 있는 경우, 인위적 재조합 수단에 의해 발현되는 단백질도 포함한다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩타이드 사슬, 즉, 펩타이드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산 또는 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 일련의 폴리펩타이드 (즉, 폴리펩타이드 복합체)를 포함하는 것으로 해석될 것이다. 예를 들어, 일련의 폴리펩타이드 사슬은 적합한 화학적 또는 디술파이드 결합을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비공유적 결합의 예는 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스력 및 소수성 상호작용을 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 사슬"은 앞선 단락으로부터 펩타이드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
당업자는 "항체"가 다수의 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 VL을 포함하는 폴리펩타이드 및 VH를 포함하는 폴리펩타이드로 구성되는 가변영역을 포함하는 단백질이 되는 것으로 일반적으로 생각된다는 것을 인식할 것이다. 또한 항체는 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 이 중 일부는 불변영역 또는 불변 단편 또는 결정성 단편 (fragment crystallizable, Fc)으로 배열될 수 있다. VH 및 VL은 상호작용하여 하나 또는 소수의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로, 포유류의 경사슬은 κ 경사슬 또는 λ 경사슬 중 하나이며, 포유류의 중사슬은 α, δ, ε, γ, μ이다. 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 용어 "항체"는 인간화된 항체, 영장류 항체, 인간 항체, 합성인간화 항체 및 키메라 항체를 포함한다.
용어 "전장 항체", "무결함 항체" 또는 "전체 항체"는 상호호환적으로 사용되며 항체의 항원 결합 단편과 대조적으로 실질적으로 무결함 형태인 항체를 말한다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중사슬 및 경사슬을 가지는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 그것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "가변영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 예를 들어 상보성 결정 영역 (CDR); 즉, CDRl, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열, 및 프레임워크 영역(FR)을 포함하는, 본 명세서에 정의된 항체의 경사슬 및/또는 중사슬 부분을 말한다. 예를 들어, 가변영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)를 포함한다. IgNAR 유래의 단백질의 경우, CDR2가 결실되어 있다. VH는 중사슬의 가변영역을 지칭한다. VL은 경사슬의 가변영역을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "상보적 결정 영역"(동의어, CDR; 즉, CDRl, CDR2, 및 CDR3)은 이것의 존재가 특정 항원 결합에 대한 주된 기여자가 되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변영역은 전형적으로 CDRl, CDR2 및 CDR3으로 확인되는 3개의 CDR 영역을 가진다. 한 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 매릴랜드주 베데스다에 소재한 미국국립보건원의 카바트의 면역학적 관심 단백질의 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest)에 따라서 1987 및 1991에 정의되거나, 또는 본 명세서에 개시된 다른 넘버링 시스템, 예를 들어, 표준 (canonical) 넘버링 시스템 Chothia 및 Lesk J. Mol Biol . 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; 및/또는 Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; IMGT 넘버링 시스템 Lefranc et al., Devel. And Compar . Immunol ., 27: 55-77, 2003; 또는 AHO 넘버링 시스템 Honnegher 및 Plukthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001으로 정의된다.
"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변영역 잔기이다.
본원에서 사용되는 용어 "Fv"는, VL 및 VH가 화합하여 항원 결합 도메인을 갖는, 즉 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는, 다수의 폴리펩타이드 또는 단일 폴리펩타이드로 구성된 임의의 단백질을 의미하는 것으로 해석될 것이다. 항원 결합 도메인을 형성하는 VL 및 VH은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재하거나 상이한 폴리펩타이드 사슬에 존재할 수 있다. 또한, 본원의 Fv (뿐만 아니라 본원의 임의의 단백질)은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 할 수 없는 다수의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유도되는 단편뿐만 아니라 재조합 수단을 이용하여 생성되는 이러한 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 일부 예에서, VH는 중사슬 불변영역 (CH) 1에 연결되지 않고/않거나 VL은 경사슬 불변영역 (CL)에 연결되지 않는다. 예시적인 Fv 포함 폴리펩타이드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 보다 고차원의 복합체, 또는 이의 불변영역 또는 도메인, 예를 들어, CH2 또는 CH3 도메인에 연결된 이전의 것, 예를 들어, 미니바디를 포함한다. "Fab 단편"은 면역글로불린의 일가 항원-결합 단편으로 이루어지며, 온전한 경사슬 및 중사슬의 일부로 이루어진 단편을 수득하도록 효소 파파인으로 전체 항체를 분해함으로써 생성되거나, 재조합 수단을 이용하여 생성될 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 온전한 경사슬 및 VH를 포함하는 중사슬의 일부 및 단일 불변영역으로 이루어진 분자를 수득함으로써 수득될 수 있다. 2개의 Fab' 단편은 각 항체에 대해 이러한 방식으로 처리하여 수득된다. Fab' 단편은 또한 재조합 수단으로 생성될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 디술파이드 결합에 의해 함께 유지된 2개의 Fab' 단편의 다이머로 이루어지며, 후속적 환원 없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리하여 수득된다. "Fab2" 단편은, 예를 들어, 루신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일사슬 Fv" 또는 "scFv"는 경사슬의 가변영역 및 중사슬의 가변영역이 적합한 가요성 폴리펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결된 항체의 가변영역 단편 (Fv)을 포함하는 재조합 분자이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결합하다"는 단백질의 상호 작용 또는 항원과 항원 결합부위의 상호작용을 의미하며, 상호작용은 항원의 특정 구조 (예: 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존적이라는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 단백질을 일반적으로 인식하고 결합하기 보다는 특정한 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합하는 경우, 표지된 "A" 및 상기 단백질을 포함하는 반응물 중 에피토프 "A" (또는 유리, 비표지된 "A")를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합되는 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 본원의 단백질이 대안적 항원 또는 세포보다 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 더욱 빈번히, 보다 신속히 보다 긴 지속기간 동안 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 화합한다는 것을 의미하는 것으로 해석될 것이다. 예를 들어, 단백질은 다른 성장인자 (즉, VEGF-A) 또는 다반응성 자연 항체 (즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 다양한 항원에 결합하는 것으로 알려진 자연 발생 항체)에 의해 일반적으로 인식되는 항원에 결합하는 것보다 상당히 더 큰 친화도 (예: 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 또는 100배 또는 150배 또는 200배)로 VEGF-B와 결합한다. 일반적으로, 반드시는 아니나, 결합은 특이적 결합을 의미하며, 각각의 용어는 다른 용어에 대한 명시적 지지를 제공하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "중화"는 단백질이 VEGF-R1을 통해 세포 내에서 VEGF-B- 신호전달을 차단, 감소 또는 방지할 수 있음을 의미하는 것으로 고려되어야한다. 중화를 측정하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고/있거나 본원에 기재된다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적 VEGF-B 신호전달의 억제"는 VEGF-B 신호전달 억제 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 하나 또는 그 이상의 VEGF 단백질 (예를 들어, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF)에 의해 검출 가능하게 또는 현저히 신호전달을 억제하지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "현저히 신호전달을 억제하지 않는"은 본원에 기기재된 화합물의 존재하에 VEGF-B 이외의 VEGF 단백질에 의한 신호전달 (즉, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF에 의한 신호전달)의 억제의 정도는 본원에 기재된 화합물의 부재하에서 (즉, 아이소타입 대조군 항체의 존재하에 수행될 수 있는 대조군 분석에서)보다 통계적으로 현저히 낮은 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출 가능하게 신호전달을 억제하지 않는"은 본원에 기재된 화합물은 본원에 기재된 화합물의 부재하에서 (즉, 아이소타입 대조군 항체의 존재하에 수행될 수 있는 대조군 분석에서)검출되는 신호전달 수준의 10% 또는 8% 또는 6% 또는 5% 또는 4% 또는 3% 또는 2% 또는 1% 이하에 의한 VEGF-B 이외의 VEGF 단백질 (즉, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF에 의한 신호전달)의 신호전달을 억제하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~를 예방하는", "~를 예방하다" 또는 "예방"은 본원의 화합물의 투여로 적어도 하나의 증상의 전개가 정지 또는 저해되는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~를 치료하는", "~를 치료하다" 또는 "치료"는 본원의 화합물의 투여로 특정 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상이 감소 또는 제거되는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 인간을 포함한 모든 동물, 예를 들어, 포유동물을 의미하는 것으로 해석될 것이다. 예시적인 대상은 이로 제한됨이 없이, 인간 및 비-인간 영장류를 포함한다. 예를 들어, 개체는 인간이다.
신장병증의 치료
본 명세서는, 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 신장병증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
일 예에서, 개체는 당뇨병을 앓고 있다. 예를 들어, 당뇨병을 앓고 있는 개체는 다음과 같은 당뇨의 임상적으로 허용된 마커를 가진다:
i) 공복혈당이 7nmol/L 또는 126mg/dl과 같거나 더 높음;
ii) 일상혈당 (하루 중 언제든 측정)이 11.1nmol/L 또는 200 mg/dl과 같거나 더 높으며 당뇨 증상을 가짐;
iii) 2시간 간격으로 측정한 경구당부하 검사 (OGTT) 값이 11.1nmol/L 또는 200 mg/dl과 같거나 더 높음. OGTT는 2시간 또는 3시간 간격으로 제공된다.
일 예에서, 개체는 제1형 당뇨병을 앓고 있다.
일 예에서, 개체는 제2형 당뇨병을 앓고 있다.
일 예에서, 개체는 당뇨성 신장병증을 앓고 있다. 예를 들어, 개체는 제1형 당뇨병과 관련된 신장병증을 앓고 있다. 예를 들어, 개체는 제2형 당뇨병과 관련된 신장병증을 앓고 있다.
일 예에서, 개체는 당뇨성 신장병증의 발병 위험이 있다. 예를 들어, 개체는 제1형 당뇨병과 관련된 신장병증의 발병 위험이 있다. 예를 들어, 개체는 제2형 당뇨병과 관련된 신장병증의 발병 위험이 있다.
일 예에서, 개체는 미세알부민뇨 증상을 앓고 있다. 이 예에 따르면, 본 발명에 따른 치료는 미세알부민뇨를 감소시킨다 (예를 들어, 24시간 모은 소변 당 및/또는 단일 샘플에서 약 30mg 보다 적은 알부민 및/또는 여성에서 3.5mg/mmol 또는 남성에서 2.5 mg/mmol 보다 적은 ACR 또는 30μg/mg 보다 적은 알부민/크레아티닌).
다른 예에서, 본 발명에 따른 치료는 미세알부민뇨에서 대량알부민뇨로의 진행을 예방하고 지연시킨다.
일 예에서, 개체는 사구체 여과율 감소, 즉, 크레아티닌 클리어런스 정도 측정에 의해 (예를 들어, 90mL/min/1.73m2 미만)을 앓고 있다. 일 예에서, 본 발명의 방법은 사구체 여과 속도를 향상시킨다.
또 다른 예에서, 개체는 고혈압 또는 고혈압 전단계를 앓고 있다. 일 예에서, 본 발명의 방법은 개체의 수축기 및/또는 이완기 혈압을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mm Hg 또는 그 이상 낮추는 효과가 있다.
일 예에서, 임상 반응의 향상 및/또는 질병 진행의 지연의 결과가 기술된 어느 실시예에 있어서 본 명세서에 기재된 방법으로 수행한다.
"임상 반응"이란 질병의 증상이 개선되는 것을 의미한다. 임상 반응은 예를 들어, 치료 개시일 또는 초기 투여로부터 약 8주 이내와 같이 일정한 시간 내에 달성되는 것일 수 있다. 임상 반응은 또한 >24주 또는 ≥48주와 같이 일정기간 동안 유지될 수 있다.
신장기능 및 신장기능 부전 파라미터의 정량적 평가는 당업계, 예를 들어, Levey (Am J Kidney Dis . 22(1):207-214, 1993)에 잘 알려져 있다. 신장 기능/기능 장애의 측정을 위한 분석의 예는 다음과 같다: 혈청내 크레아티닌 수준; 크레아티닌 클리어런스 속도; 시스탄 C 클리어런스 속도, 24시간 소변내 크레아티닌 클리어런스, 24시간 소변내 단백질 분비; 사구체 여과율 (GFR); 소변내 알부민 크레아티닌 비 (ACR); 알부민 배출비 (AER); 및 신장 생검 (biopsy).
VEGF -B 신호전달 억제
항체 가변영역을 포함하는 단백질
구체적인 VEGF-B 신호전달 억제제는 항체 가변영역을 포함한다. 예를 들어, VEGF-B에 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화하는 항체 또는 항체 단편이다.
일 예에서, 항체 가변영역은 VEGF-B에 특이적으로 결합한다.
가변영역을 포함하는 적합한 항체 및 단백질은 당업계에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 WO2006/012688에 개시되어 있다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 VEGF-B 또는 이의 항원 결합 단편에 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 항체 2H10 또는 키메라, 이식되거나 인간화된 형태의 CDR 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2H10은 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 이 항체의 예시적인 키메라 및 인간화 버전은 WO2006/012688에 개시되어 있다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 VEGF-B 또는 이의 항원 결합 단편에 4E12의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 4E12 또는 키메라, 이식되거나 인간화된 형태의 CDR 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 4E12은 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체 4E12의 인간화된 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 항체 4E12의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함하는 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) VH에 있어서:
(a) 서열번호 7의 25-34번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 7의 49-65번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 7의 98-108번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) VL에 있어서:
(a) 서열번호 8의 24-34번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 8의 50-65번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 8의 89-97번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 VEGF-B 또는 이의 항원 결합 단편에 2F5의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 일 예에서, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 2F5 또는 키메라, 이식되거나 인간화된 형태의 CDR 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2F5은 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체 2F5의 인간화된 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 항체 2F5의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함하는 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) VH에 있어서:
(a) 서열번호 9의 25-34번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 9의 49-65번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 9의 98-107번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) VL에 있어서:
(a) 서열번호 10의 24-34번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 8의 50-65번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 8의 89-96번째 아미노산으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.
다른 예에서, 이의 가변영역을 포함하는 항체 또는 단백질은 표준 방법 (즉, 당업계에 공지되거나 본원에 간략하게 설명)을 사용하여 제조된다.
면역화 기반의 방법
항체를 제조하기 위하여, VEGF-B 또는 에피토프 함유 단편 또는 이의 단백질 또는 이의 변형된 형태 또는 암호화하는 핵산과 같은 ("면역원")을 선택적으로 임의의 적절한 또는 바람직한 아쥬반트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화하여, 주사 가능한 조성물의 형태로 개체 (예를 들어, 비인간 동물 개체, 즉, 마우스, 랫트, 닭 등)에 투여한다. 태표적으로 비인간 동물은 쥐과 동물 (즉, 랫트 또는 마우스)과 같은 포유류이다. 접종은 비강, 근육, 피하, 정맥, 피부, 복강, 또는 다른 알려진 경로로 할 수 있다. 선택적으로, 면역원은 여러번 투여한다. 항체의 제조 및 특성화를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 마우스에서 항-VEGF-B 항체의 제조 방법은 WO2006/012688에 개시되어 있다.
다클론 항체의 생산은 면역화 다음 면역화된 동물의 혈액을 여러 시점에서 샘플링하여 모니터할 수 있다. 원하는 항체 역가를 달성하기 위해, 필요한 경우 2차 보강 접종을 할 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지 보강 접종 및 역가 측정을 반복한다. 원하는 수준의 면역원성을 획득하면, 면역화된 동물을 채혈하여 혈청을 분리하고 저장하고/또는 동물을 단클론 항체 (mAbs)를 제조하는데 사용한다.
단클론 항체는 본원에 의해 고려되는 하나의 예시적 항체이다. 일반적으로, 단클론 항체의 제조는 항체 생산 세포를 자극하기에 충분한 조건하에서 면역원으로 개체 (즉, 설치류, 마우스 또는 랫트)를 면역화시키는 것을 포함한다. 몇몇 예에서, 인간 항체를 발현하고 뮤린 항체 단백질을 발현하지 않도록 유전자 조작된 마우스는 항체를 생산하도록 면역화되었다 (예를 들어, PCT/US2007/008231 및/또는 Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859에 개시). 면역화 다음에, 항체 생산 체세포 (즉, B 림포사이트)는 불멸화 세포와 융합된다 (예를 들어, 불멸화 골수종 세포). 이러한 융합 세포 (하이브리도마) 생산을 위한 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975). 하이브리도마 세포는 항체 생산을 위해 충분한 조건하에서 배양될 수 있다.
본 발명은, 예를 들어, ABL-MYC 기술 (Largaespada et al, Curr . Top. Microbiol. Immunol , 166, 91-96. 1990에 개시된 것)과 같은 항체를 생산하는 다른 방법이 고려된다.
라이브러리-기반 방법
본 발명은 또한 이들의 가변영역을 포함하는 VEGF-B 결합 항체 또는 단백질을 확인하기 위해 이들의 항원 결합 도메인 (즉, 이들의 가변영역)을 포함하는 항체 또는 단백질의 라이브러리 스크리닝을 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 라이브러리의 예는 나이브 라이브러리 (감염되지 않은 개체 유래), 면역화된 라이브러리 (항원으로 면역화된 개체 유래) 또는 합성 라이브러리를 포함한다. 항체 또는 이의 영역 (즉, 가변영역)을 암호화하는 핵산은 종래기술에 의해 클로닝되고 (예를 들어, Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단백질을 표시하고 암호화하는데 사용된다. 단백질의 라이브러리를 생성하기 위한 다른 기술은 US6300064 (즉, HuCAL library of Morphosys AG); US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 개시되어 있다.
본원에 따른 단백질은 수용성 분비 단백질일 수 있으며, 또는 세포의 표면에 융합된 단백질 또는 입자 (즉, 파지 또는 다른 바이러스, 리보솜 또는 포자)일 수 있다. 다양한 디스플레이 라이브러리 포맷이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 라이브러리는 인비트로 디스플레이 라이브러리이다 (예를 들어, US7270969에 개시된 리보솜 디스플레이 라이브러리, 공유결합 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리).
또 다른 예에서, 디스플레이 라이브러리는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 파지에서 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 예를 들어, US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 개시되어 있다. 다른 파지 디스플레이 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에서 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법 (즉, US5516637에 개시된 박테리아 디스플레이 라이브러리; US6423538에 개시된 이스트 디스플레이 라이브러리 또는 포유류 디스플레이 라이브러리)은 본원에서 고려된다.
디스플레이 라이브러리 스크리닝을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 예에서, 본 발명의 디스플레이 라이브러리는 친화성 정제 방법을 사용하여 스크리닝 된다 (Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). 친화성 정제 방법은 일반적으로 표적 항원 (즉, VEGF-B)과 라이브러리에 의해 디스플레이되는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 접촉시키며, 항원과 결합한 상태의 해당 도메인을 세척하고 용출한다.
스크리닝에 의해 식별된 임의의 가변영역 또는 scFvs는 원하는 경우 완전항체로 용이하게 변형된다. 완전항체로의 가변영역 또는 scFvs의 변형 또는 재포맷을 위한 방법은, 예를 들어 Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; or Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004에 개시되어 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 표준 클로닝 방법, 예를 들어, Ausubel et al (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), 및/또는 Sambrook et al (Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에 개시된 방법이 사용된다.
탈면역화 , 키메라 , 인간화, 합성인간화, 영장류화 및 인간 단백질
본 발명의 단백질은 인간화된 단백질일 수 있다.
용어 "인간화된 단백질"은 인간 항체로부터의 FR로 이식되거나 이로 삽입된 비인간 종 (예: 마우스 또는 래트 또는 비인간 영장류)로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는 인간-유사 가변영역을 포함하는 단백질을 지칭하는 것으로 해석될 것이다 (이러한 타입의 항체는 "CDR-이식된 항체"의 부류 내에 속한다). 인간화된 단백질은 또한 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/되거나 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된 단백질을 포함한다. 인간화된 단백질은 또한 인간 항체 또는 비인간 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가의 영역 (예: Fc 영역)은 일반적으로 인간의 것이다. 인간화는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, US5225539, US6054297, US7566771 또는 US5585089에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 용어 "인간화된 단백질"은 또한, 예를 들어, US7732578에 기재되는 바와 같이, 슈퍼-인간화된 단백질을 포함한다.
본원의 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 단백질"은 인간, 예를 들어, 인간 배아 또는 체세포에서 발견되거나 이러한 영역을 이용하여 생성되는 라이브러리로부터의 가변 및, 임의로, 불변 항체 영역을 갖는 단백질을 지칭한다. "인간" 항체는 인간 서열에 의해서는 암호화되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 도입되는 돌연변이 (특히, 단백질의 소수의 잔기에서, 예를 들어, 단백질의 1, 2, 3, 4 또는 5개에서 보존적 치환 또는 돌연변이를 수반하는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이들 "인간 단백질"은 반드시 인간의 면역 반응의 결과로 생성될 필요는 없으며, 재조합 수단 (예: 파아지 디스플레이 라이브러리 스크리닝)을 이용을 이용 및/또는 인간 항체 불변 및/또는 가변영역을 암호화하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)에 의해 및/또는 (예를 들어, US5565332에 기재되는 바와 같은) 가이드 선별을 이용하여 생성될 수 있다. 이 용어는 또한 이러한 항체의 친화도 성숙된 형태를 포함한다. 본원의 목적상, 인간 단백질은 또한 인간 항체로부터의 FR 또는 간 FR의 컨센서스 서열로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하는 단백질을 포함하는 것으로 간주될 것이며, 이때 CDR의 하나 이상은, 예를 들어, US6300064 및/또는 US6248516에 기재되는 바와 같이, 무작위 또는 반-무작위이다.
본원의 단백질은 합성인간화 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "합성인간화 단백질"은 WO2007/019620에 기재된 방법에 의해 제조된 단백질을 의미한다. 합성인간화 단백질은 항체의 가변영역을 포함하며, 상기 가변영역은 뉴 월드 (New World) 영장류 항체 가변영역으로부터의 FR 및 비-뉴 월드 영장류 항체 가변영역으로부터의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 합성인간화된 단백질은 항체의 가변영역을 포함하며, 상기 가변영역은 뉴 월드 영장류 항체 가변영역으로부터의 FR 및 마우스 또는 래트 항체로부터의 CDR을 포함한다.
본원의 단백질은 영장류화 단백질일 수 있다. "영장류화 (primatized) 단백질"은 비-인간 영장류 (예: 시노몰구스 마카크)의 면역화 후 생성되는 항체로부터의 가변영역(들)을 포함한다. 임의로, 비인간 영장류 항체의 가변영역은 인간 불변영역에 연결되어 영장류화 항체를 생성한다. 영장류화 항체를 생성하는 예시적 방법이 US6113898에 기재되어 있다.
일 예에서, 본원의 단백질은 키메라 단백질이다. 용어 "키메라 단백질"은 항원 결합 도메인이 특정 종 (예를 들어, 뮤린, 예를 들면, 마우스 또는 래트)로부터의 것이거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하고, 단백질의 나머지는 또 다른 종 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류)로부터 유도되거나 또 다른 부류 또는 하위부류에 속하는 단백질로부터의 것인 단백질을 지칭한다. 하나의 예에서, 키메라 단백질은 비인간 항체 (예: 뮤린 항체)로부터의 VH 및/또는 VL을 포함하는 키메라 항체이며, 항체의 나머지 영역은 인간 항체로부터의 것이다. 이러한 키메라 단백질의 생성은 당해 분야에 알려져 있으며, 표준 수단에 의해 (예를 들어, US6331415; US5807715; US4816567 및 US4816397에 기재되어 있는 바와 같이) 달성될 수 있다.
본원은 또한, 예를 들어, WO2000/34317 및 WO2004/108158에 기재된 바와 같은 탈면역화된 단백질을 고려한다. 탈면역화된 항체 또는 단백질은 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프가 제거됨으로써 (즉, 돌연변이됨으로써) 개체가 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성을 감소시킨다.
항체 가변영역을 포함하는 다른 단백질
본 발명은 또한 다음과 같은 항체의 가변영역 또는 그의 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 단백질을 고려한다 :
(i) 항체 VH 또는 VL의 전부 또는 부분을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬의 단일 도메인 항체 (US6248516에 기재됨);
(ii) 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디 (US5844094 및/또는 US2008152586에 기재됨);
(iii) scFvs (US5260203에 기재됨);
(iv) 미니바디 (US5837821에 기재됨);
(v) "키홀" 이중 특이적 단백질 (US5731168에 기재됨);
(vi) 이종결합 단백질 (US4676980에 기재됨);
(vii) 화학적 가교-링커를 사용하여 제조된 이종결합 단백질 (US4676980에 기재됨);
(viii) Fab'-SH 단편 (Shalaby et al, J. Exp . Med ., 175: 217-225, 1992에 기재됨); 또는
(ix) Fab3 (EP19930302894에 기재됨).
불변영역 융합
본 발명은 항체의 가변영역 및 불변영역 또는 Fc 또는 이들의 도메인 (즉, CH2 및/또는 CH3 도메인)을 포함하는 단백질을 포함한다. 적합한 불변영역 및/또는 도메인은 당업자에게 자명하거나/또는 폴리펩타이드 서열은 공개된 데이터베이스로부터 쉽게 알수 있다. Kabat et al.에는 일부 적합한 불변영역/도메인에 대한 설명을 제공한다.
불변영역 및/또는 그 도메인은 이합체화, 혈청 반감기 증가, 즉, FcRn (신생아 Fc 수용체)에 결합하여, 항원 의존 세포독성 (ADCC), 보체 의존 세포독성 (CDC, 항원 의존 세포 식균작용 (ADCP))과 같은 생물학적 활성을 제공하는데 유용하다.
본 발명은 또한, 돌연변이 불변영역 또는 도메인을 포함하는 단백질을 고려한다. 예를 들어, US7217797; US7217798; 또는 US20090041770 (증가된 반감기를 가짐) 또는 US2005037000 (증가된 ADCC)에 기재되어 있다.
안정화 단백질
본 발명의 중화 단백질은 IgG4 불변영역 또는 안정화된 IgG4 불변영역을 포함한다. 용어 "안정화된 IgG4 불변영역"은 Fab 팔 (arm) 교환 또는 Fab 팔 (arm) 교환 또는 하프-항체의 형성을 겪는 경향 또는 하프 항체를 형성할 경향을 감소시키도록 변형된 IgG4 불변영역을 의미하는 것으로 해석될 것이다. "Fab 팔 (arm) 교환"은 IgG4 중쇄 및 부착된 경사슬 (하프-분자)가 또 다른 IgG4 분자로부터 중사슬-경사슬 쌍과 교환되는 인간 IgG4에 대한 일 타입의 단백질 변형을 지칭한다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 다른 항원을 인식하는 2개의 상이한 Fab 팔 (arm)을 얻을 수 있다 (이특이적 분자가 생성된다). Fab 팔 (arm) 교환은 생체내에서 자연적으로 일어나며, 정제된 혈액 세포 또는 환원제 예를 들어, 환원된 글루타티온에 의해 시험관내에서 유도될 수 있다. "하프 항체"는 IgG4 항체가 분리되어 각각 단일 중사슬 및 단일 경사슬을 포함하는 2개의 분자를 형성하는 경우에 형성된다.
일 예에서, 안정화된 IgG4 불변영역은 카밧 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 및/또는 1991)에 따라 힌지 영역의 위치 241에서 프롤린을 포함한다. 이 위치는 EU 번호매김 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 및 Edelman et al., Proc . Natl. Acad . USA, 63, 78-85, 1969)에 따라 힌지 영역의 위치 228에 상응한다. 인간 IgG4에서, 이 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린 대신 세린을 치환한 후, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 당업자는 "힌지 영역"이 항체의 2개의 Fab 팔 (arm) 상에 이동성을 부여하는 Fc 및 Fab 영역을 연결하는 항체 중사슬 불변영역의 프롤린-농축부이다. 힌지 영역은 중사슬간 이황화 (S-S) 결합에 수반되는 시스테인 잔기를 포함한다. 이는 일반적으로 카밧의 번호매김 시스템에 따라 인간 IgG1의 Glu226부터 Pro243까지 이어지는 것으로 정의된다. 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 동일한 부분에서 중사슬간 이황화 (S-S) 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다 (예를 들어, WO2010/080538 참조).
기타 단백질-기반 VEGF-B 신호전달 억제제
기타 다른 단백질은 그 수용체와 VEGF-B의 생산적인 상호작용을 방해할 수 있는 돌연변이 VEGF-B 단백질을 포함한다.
일 예에서, 억제제는 VEGF-B (예를 들어, 실질적으로 VEGF-A에 결합하지 않음)에 결합하는 VEGF-R1의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함하는 수용성 단백질이다. 일 예에서, 수용성 단백질은 IgG1과 같은 항체의 불변영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 수용성 단백질은 추가로 Fc 영역 및 항체의 힌지 영역을 포함한다 (예로 IgG1 항체).
일 예에서, 단백질 억제제는 항체 유사체 (예를 들어, 항체와 유사한 방식으로 표적 단백질에 결합하는 가변영역을 포함하는 단백질 골격)이다. 구체적인 항체 유사체에 대한 설명은 다음과 같다.
면역글로불린 및 면역글로불린 단편
본 발명의 화합물의 예는 T 세포 수용체 또는 중사슬 면역글로불린 (예를 들어, IgNAR, 낙타 항체)과 같은 면역글로불린의 가변영역을 포함하는 단백질이다.
중사슬 면역글로불린
중사슬 면역글로불린은 경사슬을 포함하지 않으며, 지금까지의 면역글로불린의 여러 다른 형태 (즉, 항체)와 구조적으로 상이하다. 따라서, 이러한 면역글로불린은 또한 "중사슬만의 항체"라고 불린다. 중사슬 면역글로불린은 예를 들어, 낙타 및 연골 어류 (IgNAR라고도 함)에서 발견된다.
천연 발생 중사슬 항체에 존재하는 가변영역은, 통상의 4-사슬 항체 ("VH 도메인"으로 지칭됨)에 존재하는 중사슬 가변 항체 및 통상의 4-사슬 항체 ("VL 도메인"으로 지칭됨)에 존재하는 경사슬 가변영역으로부터 이들을 구별하기 위해, 일반적으로 낙타 항체에서 "VHH 도메인" 및 IgNAR에서 V-NAR로 지칭된다.
중사슬 면역글로불린은 연관된 항원에 높은 친화도 및 높은 특이도로 결합하는 경사슬의 존재를 필요로 하지 않는다. 이는 단일 도메인 결합 단편이 발현하기 쉽고 일반적으로 안정하고 수용성인 중사슬 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음을 의미한다.
낙타 유래의 중사슬 면역글로불린 및 이의 가변영역 및 이들의 제조 및/또는 분리 및/또는 사용 방법에 대한 일반적인 기재는 특히 문헌 WO94/04678, WO97/49805 및 WO97/49805에서 발견된다.
연골 어류 유래의 중사슬 면역글로불린 및 이의 가변영역 및 이들의 제조 및/또는 분리 및/또는 사용에 대한 일반적인 기재는 특히 WO2005/118629에서 발견된다.
V-형 단백질
본 발명의 화합물의 예는 T 세포 수용체이다. T 세포 수용체는 항체의 Fv 모듈과 유사한 구조로 결합하는 2개의 V-도메인을 갖는다. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991에는 T 세포 수용체 (알파 및 베타)의 V-도메인 2개가 융합하고 단일 폴리텝타이드로 발현하는 방법, 및 추가로 항체 scFv에 직접 유사한 소수성을 감소시키는 표면 잔기를 변경하는 방법을 설명한다.
2개의 V-알파 및 V-베타 도메인을 포함하는 단일 사슬 T 세포 수용체 또는 다량체 T 세포 수용체의 제조를 설명하는 다른 문헌은 WO1999/045110 또는 WO2011/107595이다.
항원 결합 도메인을 포함하는 기타 비 항체 단백질은 일반적으로 단량체의 V-형 도메인의 단백질을 포함한다. 이러한 V-형 도메인을 포함하는 단백질의 예는 CTLA-4, CD28 및 ICOS을 포함한다. 이러한 V-형 도메인을 포함하는 단백질의 추가 설명은 WO1999/045110에 포함되어 있다.
애드넥틴 (Adnectins)
일 예에서, 본 발명의 화합물은 애드넥틴 (Adnectins)이다. 애드넥틴은 루프 영역이 항원 결합을 할 수 있도록 변경된 인간 피브로넥틴의 10번째 피브로넥틴 타입3 (10Fn3) 도메인을 기반으로 한다. 예를 들어, 10Fn3 도메인의 베타-샌드위치 한쪽 끝의 3개의 루프는 특이적으로 항원을 인식하는 애드넥틴이 가능하도록 조작될 수 있다. 자세한 내용은 US20080139791 또는 WO2005/056764을 참조하라.
안티칼린 (Anticalins)
또 다른 예에서, 본 발명의 화합물은 안티칼린 ( Anticalins )이다. 안티칼린은 스테로이드, 빌린 ( bilins ), 레티노이드 및 지질과 같은 작은 소수성 분자를 수송하는 세포외 단백질 패밀리인 리포칼린 ( lipocalins ) 유래이다. 리포칼린은 항원에 결합하도록 조작될 수 있어, 원뿔형 구조체의 개방 말단에서 복수의 루프로 강성 베타 시트 이차 구조를 갖는다. 이러한 조작된 리포칼린은 안티칼린으로 알려져 있다 . 안티칼린의 자세한 설명은 US7250297B1 또는 US20070224633을 참조하라.
어피바디 (Affibodies)
또 다른 예에서, 본 발명의 화합물은 어피바디 (Affibodies)이다. 어피바디는 항원에 결합하도록 조작된 Staphylococcus aureus의 단백질 A의 Z 도메인 (항원 결합 도메인) 유래 구조체이다. Z 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선 번들로 구성된다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위에 의해 제조된다. 자세한 내용은 EP1641818를 참조하라.
아비머 (Avimers)
또 다른 예에서, 본 발명의 화합물은 아비머 ( Avimers )이다. 아비머는 A-도메인 구조체 패밀리 유래의 멀티도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 고유 도메인은 이황화 결합 구조로 되어 있다. 다양성은 A-도메인 패밀리에 의해 나타나는 자연 변화의 셔플에 의해 생성된다. 자세한 내용은 WO2002088171를 참조하라.
DARPins
또 다른 예에서, 본 발명의 화합물은 Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin)이다. DARPin은 세포골격에 막관통 단백질의 부착을 매개하는 단백질 패밀리인 안키린 (Ankyrin) 유래이다. 단일 아키린 반복은 2개의 알파-나선 및 베타-굽힘 구조로 구성된 33개 잔기 모티프이다. 그들은 첫번째 알파-나선 및 각 반복의 베타-굽힘 구조에서 무작위 잔기에 의해 다른 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 잇다. 이들 결합 인터페이스는 모듈 (친화도 성숙 방법)의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 자세한 내용은 US20040132028를 참조하라.
단백질의 제조 방법
재조합 발현
재조합 단백질의 경우, 이를 암호화하는 핵산은 발현 작제물 또는 벡터에 클로닝된 후, 숙주 세포, 예를 들어, E. coli 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 또는 달리 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포로 트랜스펙션될 수있다. 단백질을 발현하는데 사용되는 예시적 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 이들 목적을 달성하기 위한 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재되어 있다. 다양한 클로닝 및 인비트로 증폭 방법이 재조합 핵산의 작제에 적합하다. 재조합 항체를 생성하는 방법도 당해 분야에 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, US4816567 또는 US5530101).
분리 후, 핵산은 추가의 클로닝 (DNA 증폭)을 위해 또는 세포-비함유 시스템 또는 세포에서 발현하기 위해 발현 작제물 또는 발현 벡터 내의 프로모터에 작동적으로 연결 삽입된다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 광의로 해석되며, 예를 들어, 발달 및/또는 외부 자극에 반응하거나 조직 특이적 방식으로 핵산의 발현을 변화시키는 추가의 조절 요소 (예: 상부 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일런서)와 함께 또는 없이, 정확한 전사 개시에 필요한, TATA 박스 또는 개시자 요소를 포함한, 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "프로모터"는 또한 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 증진시키는 재조합, 합성 또는 융합 핵산 또는 유도체를 기재하는데 사용된다. 예시적 프로모터는 추가로 발현을 증진시키고/시키거나 상기 핵산의 공간 발현 및/또는 일시적 발현을 변화시키기 위한 하나 이상의 특정한 조절 요소의 추가의 카피를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절되도록 핵산과 관련하여 프로모터를 위치시키는 것을 의미한다.
세포에서의 발현을 위한 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 이로 제한됨이 없이, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 시그널 서열, (예를 들어, 본원에서 제공되는 정보로부터 유도되는) 단백질을 암호화하는 서열, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 당업자는 단백질의 발현을 위한 적합한 서열을 알 수 있을 것이다. 예시적 시그널 서열은 원핵생물 분비 시그널 (예: pelB, 알칼리 포스파타제, 페닐실리나제, Ipp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II), 효모 분지 시그널 (예: 인버타제 리더, α 인자 리더 또는 포스파타제 리더) 또는 포유동물 분비 시그널 (예: 단순 포진 gD 시그널)을 포함한다.
포유동물 세포에서 활성인 예시적 프로모터는 사이토메갈로 바이러스 즉시 초기 프로모터 (CMV-IE), 인간 신장 인자 1-α 프로모터 (EF1), 작은 핵 RNA 프로모터 (U1a 및 U1b), α-미오신 중쇄 프로모터, 시미안 바이러스 40 프로모터 (SV40), 로우스 사코마 바이러스 프로모터 (RSV), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, β-락틴 프로모터; CMV 인해서/β-락틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 조절 요소 또는 면역글로불린 프로모터 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)이다.
효모 세포, 예를 들어, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 에스. 폼베 (S. pombe)를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 효모 세포에서의 발현에 적합한 전형의 프로모터는, 이로 제한됨이 없이, ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터, 또는 TEF1 프로모터를 포함한다.
분리된 핵산 또는 이를 포함하는 발현 작제물을 발현을 위한 세포에 도입하는 수단은 당업자에게 알려져 있다. 소정의 세포를 위해 이용되는 기술은 공지된 성공적 기술에 의존적이다. 재조합 DNA를 세포에 도입하는 수단은 마이크로주입, DEAE-덱스트란에 의해 매개되는 트랜스펙션, 리포솜에 의해, 예를 들어, 리포펙타민 (Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴 (Gibco, MD, USA)을 사용하여 매개되는 트랜스펙션, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공 및, 예를 들어, 특히, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자 (Agracetus Inc., WI, USA)를 이용한 마이크로입자 충격을 포함한다.
단백질을 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는, 사용되는 세포 타입에 따라, 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어, 햄 (Ham) Fl0 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMl-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)가 포유동물 세포를 배양하는데 적합하다. 본원에서 언급되는 다른 세포 타입을 배양하기 위한 배지는 당해 분야에 알려져 있다.
단백질 정제
제조/발현에 따른, 본 발명의 단백질은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 정제한다. 이러한 정제는 비특이적 단백질, 아미노산, 지질, 탄수화물, 및 이와 유사한 것들이 거의 없는 본 발명의 단백질을 제공한다. 일 예에서, 본 발명의 단백질은 약 90% 이상 (즉, 95%, 98% 또는 99%)으로 준비될 것이다.
본 발명의 분리된 단백질은 얻기 위한 펩타이드 정제의 표준 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 상 분리 방법, 전기영동 분리, 침전법, 염의 인/아웃 방법, 면역 크로마토그래피, 및/또는 다른 방법과 같은 다양한 고압 (또는 성능) 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 비-HPLC 폴리펩타이드 분리 방법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예에서, 친화성 정제는 표지를 포함하는 융합 단백질의 분리에 유용하다. 친화성 정제를 사용한 단백질의 분리 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 (Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)에 기재되어 있다. 예를 들어, 표지 (폴리히스티딘 태그의 경우, 예를 들어, 니켈-NTA이 될 수 있음)에 결합하는 항체 또는 화합물은 고체 지지체에 부착된다. 단백질을 포함하는 샘플은 결합이 발생할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에서 고정된 항체 또는 화합물과 접촉시킨다. 모든 비결합 또는 비특이적 결합 단백질을 제거하기 위해 세척한 다음, 단백질을 용출한다.
항체의 Fc 영역, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 이의 변형 형태를 포함하는 단백질의 경우에는 친화성 정제에 사용할 수 있다. 단백질 A는 인간 γl, γ2, 또는 γ4 중사슬 Fc 영역을 포함하는 정제된 단백질을 분리하는데 유용하다. 단백질 G는 모든 마우스 Fc 이소타입 및 인간 γ3에 권장한다.
핵산-기반 VEGF-B 신호전달 억제제
본 명세서에 기재된 발명의 실시예에 있어서, 치료 및/또는 예방 방법은 VEGF-B 발현 감소를 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법은 핵산의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 예에서, 화합물은 핵산, 즉, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 라이보자임, PNA, 간섭 RNA, siRNA, 마이크로 RNA이다.
안티센스 핵산
용어 "안티센스 핵산"은 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 또는 그의 유도체 (즉, LNA 또는 PNA), 또는 그들의 조합을 의미하는 것으로 고려되어야 하며, 이러한 mRNA의 번역으로 전사-후에 간섭이 일어날 수 있다. 안테센스 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999) 참조).
본 발명의 안티센스 핵산은 생리적 조건하에서 표적 핵산과 혼성화 될 수 있다. 안티센스 핵산은 유전자 발현 또는 스플라이싱을 통해 효과를 조절하는 서열 또는 구조 유전자 또는 코딩 영역에 해당하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 핵산은 VEGF-B 암호화 핵산의 표적 코딩 영역, 또는 5'-비번역 영역 (UTR) 또는 3-UTR 또는 이들의 조합에 대응할 수 있다. 전사 도중 또는 후에 스플라이스 될 수 있는 인트론 서열에 상보적인 부분, 예를 들어 단지 표적 유전자의 엑손 서열일 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 예를 들면, VEGF-B를 암호화하는 핵산의 적어도 100, 200, 500 또는 1000 뉴클레오티드와 같이 적어도 50 뉴클레오티드, 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자의 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100-2000 뉴클레오티드일 수 있다. 표적 전사체에 대한 안티센스 서열의 유사 정도는 적어도 90%, 예를 들면 95-100% 이어야 한다.
VEGF-B에 대한 예시적인 안티센스 핵산은 WO2003/105754에 개시되어 있다.
촉매 핵산
용어 "촉매 핵산"은 구별되는 기질을 특이적으로 인식하고 이 기질의 화학적 변형을 촉매하는 DNA 분자 또는 DNA 함유 분자 ("데옥시라이보자임" 또는 "DNAzyme"으로도 알려져 있음) 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자 ("라이보자임" 또는 "RNAzyme"으로도 알려져 있음)를 말한다. 촉매 핵산의 핵산 염기는 A, C, G, T (RNA에서는 U)일 수 있다.
일반적으로, 촉매 핵산은 표적 핵산의 특정 인식을 위한 안티센스 서열 및 효소 활성을 절단하는 핵산은 (또한 "촉매 도메인"으로 지칭)을 포함한다. 본원의 해머헤드 라이보자임 및 헤어핀 라이보자임의 라이보자임 유형은 유용하다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNAi)는 특정 단백질의 생산을 특이적으로 억제하는데 유용하다. 이론에 한정되지 않지만, 이 기술은 관심 또는 그 일부 유전자의 mRNA와 본질적으로 동일한 서열을 포함하는 dsRNA 분자의 존재에 의존하며, 이 경우에 mRNA는 VEGF-B를 암호화한다. 편리하게는, dsRNA는 센스 및 안티센스 서열과 연관성 없는 서열이 옆에 있는 재조합 벡터의 숙주 세포에서 단일 프로모터에 의해 제조할 수 있으며, 상기 센스 및 안티센스 서열은 루프 구조를 형성하는 연관성 없는 서열과 dsRNA 분자를 형성하도록 혼성화 가능하다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 제작은 특히 WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029, 및 WO01/34815을 고려하여 당업자에게 잘 알려져 있다.
센스 및 안티센스 서열의 길이는 적어도 30 또는 50 뉴클레오티드와 같이 각각 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 100, 200, 500 또는 1000 뉴클레오티드이어야 혼성화 될 수 있다. 전체 유전자 전사체에 대응하는 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100-2000 뉴클레오티드 일 수 있다. 표적 전사체의 센스 및 안티센스 서열의 유사 정도는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%와 같이, 95-100%이어야 한다.
예로 작은 간섭 RNA (“siRNA”) 분자는 표적 mRNA의 약 19-21개의 연속적인 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작되며 약 30-70%의 GC 함량을 포함 (예를 들어, 30-60%, 즉 40-60%, 예를 들어 약 45-55%)하고, 이 서열이 도입되어야 하는 포유 동물의 게놈에서 표적 이외의 염기 서열에 높은 비율의 상동성 (예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정되는)을 가지지 않는다. VEGF-B의 발현을 감소시키는 대표적인 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology 또는 Novus Biologicals로부터 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있다.
VEGF-B의 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를)도 공지되어 있으며, Santa Cruz Biotechnology에서 시판된다.
스크리닝 분석
아래 기술하는 바와 같이, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 마찬가지로, 아래 기술하는 바와 같이, 본원의 방법에 사용하기에 적합한 VEGF-B 신호전달 억제제의 양은 공지의 기술을 사용하여 결정 및 추정된다.
중화 분석
VEGF-B에 결합하고 신호전달을 억제하는 화합물의 경우, 중화 분석법을 이용할 수 있다.
일 예에서, 중화 분석은 검출 가능하게 표지된 수용성 VEGF-R1의 존재 또는 부재하에서 화합물과 VEGF-B의 접촉, 또는 검출 가능하게 표지된 VEGF-B와 VEGF-R1 또는 수용성 VEGF-R1을 발현하는 세포의 존재 또는 부재하에 화합물과의 접촉을 포함한다. VEGF-B가 VEGF-R1에 결합하는 수준이 평가된다. 화합물의 부재에 비해, 화합물의 존재하에 결합된 VEGF-B의 감소된 수준은 VEGF-B 신호전달의 결과로서, 화합물은 VEGF-B가 VEGF-R1에 결합하는 것을 억제하는 것을 나타낸다.
다른 중화 분석은 WO2006/012688에 기재되어 있고, 화합물과 미리 반응된 재조합 VEGF-B의 반포화 농도를 갖는 고체 지지체 상에 고정화된 2차 IG-유사 도메인을 포함하는 VEGF-R1의 단편과 접촉하는 것을 포함한다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척한 다음, 고정된 단백질은 항-VEGF-B 항체와 접촉하고 결합된 항체 (고정된 VEGF-B를 나타내는)의 양을 측정한다. 화합물의 부재에서 결합된 항체의 수준을 비교하여 감소시키는 화합물은 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
다른 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 증식을 위해 VEGF-B 신호전달에 의존하는 세포를 사용하여 확인한다. 예를 들어, WO2006/012688에 기재된 것과 같이 인간 에리스로포이에틴 (erythropoietin) 수용체의 세포내 도메인 및 VEGF-R1의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 발현하기 위해 BaF3 세포는 변형되었다. 세포 증식은 표준 방법, 예를 들면 콜로니 형성 어세이, 티미딘이입반응 (thymidine incorporation ) 또는 다른 적합한 세포 증식의 마커 (즉, MTS 색소 환원 분석)를 사용하여 평가한다. VEGF-B의 존재하에서 증식의 수준을 감소시키는 화합물은 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
화합물은 또한 표준 방법을 이용하여 VEGF-B에 결합하는 능력에 대해 평가할 수있다. 단백질에 결합을 평가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). 이러한 방법은 일반적으로 표지된 화합물을 고정된 VEGF-B와 접촉시키는 것을 포함한다. 비결합 화합물의 제거를 위해 세척한 다음, 결과적으로 표지된 양과 결합한 화합물이 검출된다. 물론, 상기 화합물은 고정화 및 VEGF-B 표지될 수 있다. 패닝-타입 분석 또한 사용된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용할 수 있다.
발현 분석
VEGF-B의 발현을 감소 또는 방지하는 화합물은 화합물과 세포를 접촉시키고 VEGF-B의 발현 수준을 결정하는 단계에 의해 식별된다. 핵산 수준에서 유전자 발현을 결정하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 또는 마이크로 어레이 분석을 포함한다. 또한, 당해 분야에 공지되어 있는 단백질의 발현 수준을 결정하는 적합한 방법은, 예를 들어 효소 면역 분석법 (ELISA), 형광 면역 분석법 (FLISA), 면역 형광 또는 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
인비보 분석
본원의 화합물은 동물 모델에서 활성을 시험할 수 있다. 제2형 당뇨 및 비만의 동물 모델의 예로는: Ob/Ob 마우스 (비만의 단일 유전자 모델, 렙틴 결핍), db/db 마우스 (비만의 단일 유전자 모델, 렙틴 저항성), Zucker (fa/fa) 랫트 (비만의 단일 유전자 모델, 렙틴 저항성), Goto-Kakizaki 랫트, KK 마우스, OLETF 랫트, 이스라엘 모래 랫트, 지방-식이 스트렙토조토신 처리된 랫트, CBA/Ca 마우스, 뉴질랜드 비만 마우스 (Rees 및 Alcolado Diabet. Med. 22, 359-370, 2005 참조)를 포함한다.
알려진 자연 발생의 제2형 당뇨성 신장병증의 동물 모델은: 자연 발생 고혈압/NIH-비만 (SHR/N-cp) 랫트 (비만의 모델, 제2형 당뇨 및 신장병증), 마른 SHR/N-cp 랫트 및 Wistar-Kyoto/NIH-비만 (WKY/N-cp) 랫트를 포함한다. 이 두 모델은 당뇨성 신장병증의 발병에서 고혈압 및 비만의 역할을 평가할 수 있다: SHR/N-cp 랫트는 비정상적인 포도당 내성, 고혈압 및 인간의 당뇨성 신장병증을 연상시키는 신장질환이 발생하며, WKY/N-cp 랫트는 역시 비만이고 고지혈증을 가지고 있지만, 자신의 혈당 조절이 SHR/N-cp 랫트보다 제어되지 않는다. 또 다른 모델은 LA/N-cp 랫트 (역시 비만 유전자를 가지고, 고지혈증을 나타냄) (Kimmel et al. Acta Diabetologica , 29, 142-148, 1992 참조)이다. 본원에 예시된 바와 같이, db/db 마우스 또한 당뇨성 신장병증의 효과적인 모델이다.
약학 조성물 및 치료 방법
VEGF-B 신호전달 억제 화합물 (활성 성분과 함께)은 예방 또는 치료를 위한 비경구, 국소 경구, 또는 국소 투여, 에어로졸 투여 또는 경피 투여에 유용하다. 일예에서, 화합물은 피하 또는 정맥 주사와 같이 비경구 투여된다.
화합물의 제형은 투여 경로 및 제형(예를 들어, 용액, 에멀젼, 캡슐) 선택에 따라 다르게 투여한다. 투여 될 수 있는 적합한 약제학적 조성물을 포함하는 화합물은 생리학적으로 허용 가능한 담체로 제조 할 수 있다. 용액 또는 에멀젼은, 생리식염수 및 완충 배지를 포함하여 적합한 담체, 예를 들어 수성 또는 수성/알코올성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비클 (vehicles)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose ), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 불휘발성유(fixed oil)를 포함할 수 있다. 적합한 수성 담체의 다양함은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 물, 버퍼, 완충 식염수, 폴리올 (즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로스 용액 및 글리신을 포함한다. 정맥주사의 비틀은 각종 첨가제, 방부제, 또는 플루이드, 영양제 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다 (일반적으로, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980를 참조). 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 pH 조정 및 완충제 및 독성 조절제, 예를 들어 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 젖산 나트륨과 같은 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조 물질을 함유 할 수 있다. 화합물은 이전에 공지된 동결 건조 및 재구성 기술에 따라 저장을 위해 동결 및 적당한 담체에 재구성 될 수 있다.
선택된 배지에서 활성 성분의 최적 농도는 당업자에게 공지된 방법에 따라 경험적으로 결정될 수 있으며, 원하는 궁극적인 약제학적 제형에 따라 달라진다. 본원의 화합물의 투여를 위한 용량의 범위는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 크다. 예를 들어, 조성물은 화합물의 치료적 또는 예방적 유효량을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 개체에서 VEGF-B의 신호전달을 억제/감소/방지하는 화합물의 충분한 양을 의미하는 것으로 고려되어야 한다. 당업자는 치료는 이러한 양이, 예를 들어 화합물 및/또는 특정 개체 및/또는 유형 및/또는 신장병증의 정도에 따라 달라질 수 있음을 인식할 수 있다. 따라서, 이 용어는 특정 양, 즉 화합물의 중량 및 수의 개시로 제한되는 것으로 해석되어사는 아니된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 신장병증의 하나 또는 그이상의 증상을 감소 또는 억제하는 화합물의 충분한 양을 의미하는 것으로 고려되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방적 유효량"은 신장병증의 하나 또는 그 이상의 검출 가능한 증상의 예방 또는 억제 또는 시작을 지연시키는 화합물의 충분한 양을 의미하는 것으로 고려되어야 한다.
일 예에서, 화합물은 하나 또는 그 이상의 다음의 효과를 갖는 유효한 양으로 투여된다:
a) 고혈압의 강하 또는 예방;
b) 사구체 및/또는 세관 경화증의 감소 또는 예방;
c) 사구체간질 세포외 기질 (mesangial extracellular matrix) 증착 및/또는 사구체 기저막 이상 비대의 감소 또는 예방;
d) 사구체간질 확장의 감소 또는 예방;
e) 사구체 혈관 재배열의 감소 또는 예방;
f) 신장 지질 축적의 감소 또는 예방;
g) 사구체 지질 축적의 감소 또는 예방;
h) 사구체 콜라겐 증착 및/또는 세동맥 유리질증 (arteriolar hyaliosis)의 감소 또는 예방; 및/또는
i) 다량알부민뇨 (macroalbuminuria)의 감소 또는 예방.
투여 용량은 과다 점성 증후군, 폐부종, 울혈성 신부전증과 같은 부작용을 유발할 정도로 그다지 크지 않다. 일반적으로, 투여 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 달라지며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 합병증이 발병할 경우, 투여 용량은 개인의 의사에 의해 조정될 수 있다.
투여 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg으로 다양할 수 있으며, 예를 들어, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 즉 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 하루에 한번 또는 그 이상으로, 하루 또는 수일 동안 투여된다.
일 실시예에서, 화합물은 초기 (또는 로딩) 투여가 이후 (유지 용량)보다 높은 양으로 투여된다. 예를 들어, 화합물은 약 1mg/kg 내지 약 30mg/kg 사이의 초기 용량으로 투여된다. 화합물은 그 다음 약 0.0001mg/kg 내지 약 1mg/kg의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 7-35일 마다, 즉 14일 또는 21일 또는 28일 마다 투여될 수 있다.
일부 예에서, 용량의 단계적 증가 체계는, 화합물이 이후에 사용된 용량에 비해 초기 투여 용량이 낮은 양으로 사용된다. 이러한 투여 체계는 개체의 초기 부작용 반응이 있는 경우 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 환자의 경우, 주당 다중 투여할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 투여량을 증가시킬 수 있다. 개체는 화합물에 적어도 약 2회 노출, 예를 들어 2 내지 60회 노출, 및 더욱 구체적으로는 약 2 내지 40회 노출, 가장 구체적으로는 2 내지 20회 노출과 같이, 화합물로 적어도 한번 이상의 노출 또는 투여량 설정에 의해 재치료될 수 있다.
일 예에서, 질병이 재발한 사인 또는 증상이 있을 때, 즉 미세알부민뇨가 진행될 때 임의의 재치료가 제공될 수 있다.
다른 예에서, 재치료는 정의된 간격으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 후속 노출은 약 24-28주 또는 48-56주 또는 그 이상과 같이 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 노출은 간격이 각각 약 24-26주 또는 약 38-42주 또는 약 50-54주에 투여된다.
본 발명의 방법은 또한 신장질환 또는 합병증, 신장병증 (즉, 당뇨성 신장병증), 당뇨병, 이상지질혈증, 고혈압 및/또는 비만의 예방 또는 치료를 위한 또 다른 치료학적으로 유효한 제제와 함께 본 발명에 따른 적어도 하나 이상의 화합물의 병용투여를 포함한다.
일 예에서, 본원의 화합물은 현재 당뇨병의 예방 또는 치료를 위해 개발되고 있거나 사용 중인 적어도 하나 이상의 추가적인 공지의 화합물과 병용하여 사용된다. 예를 들어, 이러한 공지의 화합물은 설포닐우레아 (즉, 글리클라지드, 글리피자이드), 메트포민, 글리타존 (즉, 로시글리타존, 피오글리타존), 식후 혈당 방출제 (즉, 레파글리니드, 나테글리니드), 아카보스 및 인슐린 (인간, 소 또는 돼지 유래의 인슐린; 예를 들어 이소판 또는 아연의 인슐린 및 인슐린 글루리신, 인슐린 리스프로, 인슐린 리스프로 프로타민, 인슐린 글라진, 인슐린 디터머 또는 인슐린 아스파트과 같은 모든 자연 발생, 합성 및 변형된 형태의 인슐린을 포함)과 같은 일반적인 항 당뇨성 약제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일 예에서, 본원의 화합물은 신장병증, 또는 질환 또는 합병증과 연관된 신장질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 개발되고 있거나 사용 중인 적어도 하나 이상의 추가적인 공지의 화합물과 병용하여 사용된다. 이러한 공지의 화합물의 예는 다음을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: ACE 억제제 약물 (예를 들어, 캡토프릴 (Capoten ™),에날라프릴 (Innovace ™), 포시노프릴 (Staril ™), 리시노 프릴 (Zestril ™), 페린도프릴 (Coversyl ™), 퀴나프릴 (Accupro ™), 트란돌라프릴 (Gopten ™), 로텐신, 모엑시프릴, 라미프릴); RAS 차단제; 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB 제제) (예를 들어, 올메사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 칸데사르탄, 에프로사르탄, 텔미사르탄 등); 단백질 키나제 C (PKC) 억제제 (예컨대 루복시스타우린); AGE 의존 경로 억제제 (예를 들어, 아미노구아니딘, ALT-946, pyrodoxamine (pyrododorin), OPB-9295, 알라게브리움); 항 염증제 (예를 들어 시클로옥시게나아제-2 억제제, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조리빈, 펜톡시필린), GAG (예컨대 술로덱시드 (미국특허 제 5,496,807호)); 피리독사민 (미국특허 제 7,030,146호); 엔도텔린 길항제 (예, SPP 301), COX-2 억제제, PPAR-γ 길항제 및 아미포스틴 (시스플라틴 신장병증에 사용됨), 캡토프릴 (당뇨성 신장병증에 사용됨), 시클로포스파미드 (특발성 막성 신장병증에 사용됨), 티오 황산나트륨 (시스플라틴 신장병증에 사용됨)과 같은 다른 화합물.
또한, 본원의 방법은 당뇨 및/또는 신장병증과 직접 또는 간접적으로 연관된 다른 질환의 치료를 위한 적어도 하나 이상의 다른 치료제의 병용 투여를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 고지혈증, 고혈압, 비만, 신경병증, 및/또는 망막증 등. 본 발명에 따른 화합물과 병용 투여할 수 있는 제제의 추가 예는 코르티코스테로이드; 면역 억제 약물; 항생제; 항 고혈압제와 이뇨제 약물 (예: ACE 억제제); 담즙 제거 레진과 같은 지질 저하제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산, 및 보다 상세하게는 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키기 위해 사용하는 약물 및 치료제 (예를 들면 피브레이트 (예: 겜피브로질 ™) 및 로바스타틴 ™, 아토르바스타틴 ™, 플루바스타틴 ™, 레스콜 ™와 같은 HMG-CoA 억제제), 리피토 ™, 메바코 ™), 프라바콜 ™, 프라바스타틴 ™, 심바스타틴 ™, 조코 ™, 세리바스타틴 ™) 등); 지질의 장내 흡수를 억제하는 화합물 (예: 에제티미브); 니코틴산; 및 비타민 D 이다.
상기로부터 알 수 있듯이, 본 발명은 제1 화합물 및 제2 화합물의 유효량을 필요로하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체의 치료를 수반하는 방법을 제공하며, 상기 본원의 제1 제제는 화합물 (즉, VEGF-B 신호전달 억제제)이며, 제2 제제는 신장병증, 당뇨성 신장병증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 또는 비만의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
본원에 사용되는 용어 "병용 치료"에서 "병용" 제2 제제의 존재하에 제1 제제을 투여하는 것을 포함한다. 병용 치료 방법은 제1, 제2, 제3 또는 추가적인 제제를 공동 투여하는 방법을 포함한다. 병용 치료 방법은 또한 제1 또는 부가의 제제가 제2 또는 부가의 제제 존재하에 투여하는 방법을 포함하며, 상기 제2 또는 부가의 제제는 예를 들어, 이전에 투여되었을 수 있다. 병용 치료 방법은 다른 주체에 의해 단계적으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 하나의 주체가 제1 제제를 개체에 투여할 수 있고, 두번째 주체가 제2 제제를 개체에 투여할 수 있으며, 상기 투여 단계는 제2 제제 (및/또는 부가의 제제)의 존재하에 제1 제제 (및/또는 부가의 제제)의 투여를 하는 동안 동시 또는 거의 동시, 또는 떨어진 시간에 수행될 수 있다. 주체 및 개체는 동일한 실체 (즉, 인간)일 수 있다.
일 예에서, 본원은 또한 개체에서 신장병증의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에 적어도 하나 이상의 본 발명의 화합물을 포함하는 제1 약학적 조성물 및 하나 또는 그 이상의 추가적인 화합물을 포함하는 제2 약학적 조성물의 투여를 포함한다.
일 예에서, 본원의 방법은 신장병증 (즉, 당뇨성 신장병증)을 앓고 있는 개체에 VEGF-B 신호전달 억제제의 투여 및 다른 치료 (즉, 당뇨병)를 받는 것을 포함한다.
키트
본 발명의 또 다른 예에서는 전술한 바와 같이 신방병증의 치료에 유용한 화합물을 포함하는 키트를 제공한다.
일 예에서, 키트는 (a) 본원에 기재된 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 용기, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체, 또는 희석제; 및 (b) 개체에서 신장병증의 치료를 위한 지침과 포장 삽입물를 포함한다.
본원의 실시예에 따르면, 포장 삽입물은 용기와 관련되어 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재질로부터 형성될 수 있다. 용기는 신장병증의 지료에 효과적인 조성물을 보유 또는 함유하며, 멸균된 접속 포트를 가진다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 가지는 정맥주사 용액의 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적에도 하나의 활성화제는 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 투여량과 화합물 및 다른 약제의 투여 간격에 대한 구체적인 안내가 제공되며, 조성물이 치료받을 개체 (즉, 신장병증을 가지고 있거나 걸리기 쉬운)의 치료에 사용되는 것을 나타낸다. 키트는 또한 예를 들어, 정균 주사액 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액, 및/또는 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용 가능한 희석제 완충액을 포함하는 추가의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 두 번째 약제를 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있으며, 첫 번째 약제는 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이고, 제품은 두 번째 약제의 유효량으로 개체를 치료하기 위한 포장 삽입물에 대한 지시를 추가로 포함한다. 두 번째 약제는 상기 기술된 임의의 것일 수 있다.
본 명세서는 다음의 비제한적 실시예를 포함한다.
실시예 1: VEGF -B의 결핍 마우스는 당뇨성 신장병증에 잘 견딤
VEGF -B 결핍 당뇨병 마우스는 신장 기능을 개선하고 고혈압을 감소시킴
C57BKS/Leprdb (db/db// BKS) 마우스는 잭슨 실험실로부터 얻고 (당뇨병 및 당뇨성 신장병증의 모델로) C57BL/6-Vegfb -/- 마우스와 교배시켰다. Db/db// Vegfb -/- 마우스는 이형의 db/ + // Vegfb +/- 마우스와 서로 교배시켜, db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db//Vegfb -/- 마우스를 생산하였다. 42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db//Vegfb -/-를 본 연구에 사용하였다. 소변은 하나의 동물/유전자형에 대해 케이지를 촬영하여 측정하였다. 계량봉 (dipsticks) 분석으로 당뇨와 단백뇨를 측정하기 위해, 마우스를 1시간 동안 굶기고 소변을 수집한 다음, 글루코스 및 단백질의 농도를 제조사 (Uristix, Siemens)의 시약 스트립을 사용하여 바로 측정하였다. ACR 검출을 위해 20-μl 내지 200-μl 부피의 소변을 각 마우스로부터 수집하였다. 소변내 알부민은 Albuwell M 키트를 사용하여 검출하고, 소변내 크레아티닌은 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, Philadelphia, PA)를 사용하여 측정하였다. 수축기 및 이완기 혈압은 CODA 설정 (Kent Scientific)을 사용하여 꼬리 커프 (tail-cuff) 방법으로 측정하였다. 모든 동물은 2주 동안 혈압 측정 장치에 적응시켰다. 그들 모두 최소 3일 동안 하루에 재배열 20회 측정의 1-2 주기를 받았다.
이러한 분석은 당뇨병의 db/db BKS 마우스에서 Vegfb의 결실이 신장 생리기능을 개선하고 고혈압을 감소시킬 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, db/db//Vegfb -/- 동물은 db/db, 및 db/db// Vegfb +/- 동물보다 적은 소변을 생산했다. db/db//Vegfb -/- 동물은 또한 db/db, 및 db/db// Vegfb +/- 동물보다 소변내 글루코스 및 단백질이 적었다.
도 1a는 ELISA로 측정한 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스 (n=5 그룹, 왼쪽 그래프) 및 마른 야생형 (wt)과 마른 Vegfb -/- 마우스 (n=4-6/group, 오른쪽 그래프)의 소변내 알부민/크레아티닌 비를 보여준다. 이 결과는 db/db//Vegfb +/- 동물과 비교하여 db/db// Vegfb -/-동물이 개선된 소변내 알부민/크레아티닌 비를 갖는다는 것을 보여준다. 마른 야생형 동물과 비교하여 Vegfb가 결핍된 마른 동물에서 유사한 효과가 관찰되었다.
도 1b는 db/db 및 db/db// Vegfb +/- 마우스 (그룹당 n=5)의 꼬리 (tail-cuff) 혈압 (수축기 및 이완기 혈압)을 보여주는 것이다. 이 결과는 db/db 동물과 비교하여 db/db// Vegfb -/- 동물이 수축기 및 이완기 혈압이 감소된 것을 보여준다.
이러한 결과는 소변내 알부민의 농도 및 소변내 알부민/크레아티닌 비의 감소를 측정하여, 당뇨병 db/db 마우스 및 VEGF-B 발현이 감소된 마른 마우스가 더 나은 여과 용량의 개선된 신장기능을 갖는 것을 보여준다. VEGF-B의 발현 감소는 또한 db/db 마우스에서 수축기 및 이완기 혈압을 모두 저하시킨다.
db/db BKS 마우스에서 Vegfb 결실은 사구체 및 세관 경화증을 감소시킴
42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스를 희생시켜, 신장을 분리하고, 고정, 포매, 섹션 및 Periodic acid-Schiff (PAS)로 염색하여 제조사의 지침 (Sigma)에 따라 사구체간질 확장 및 세관 경화증을 평가하였다. 동물당 적어도 10군데 사구체 또는 세관을 각 절편 내에서 PAS 염색하여 20x 배율의 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체 PAS 염색 (pixel2/mm2) ii) 프레임 당 세포사멸 사구체의 수를 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다. 사구체는 강한 PAS 염색 및 직경이 25 μm보다 작으면 세포사멸로 지정하였다. 세관은 i) 세관기저막의 두께 (μm2)를 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, db/db 마우스는 세관 경화증이 진행한 반면 db/db//Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스에서는 이러한 결함이 관찰되지 않았다. 또한, db/db 마우스는 사구체 경화증이 발생하였으나 db/db// Vegfb +/- 및 db/db//Vegfb -/- 마우스는 관찰되지 않았다 (도 2b). db/db 마우스에서의 이러한 변화는 db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스에 비해 세포사멸 사구체의 증가와 관련이 있다 (도 2c).
이러한 결과는 사구체 및 세관 경화증이 db/db 동물에 비해 VEGF-B의 발현이 감소한 당뇨병 db/db 동물의 신장에서 감소하는 것을 보여준다.
사구체간질 세포외 기질 침착 및 사구체 기저막 ( GBM )의 이상비대는 Vegfb -결핍 db/db BKS 마우스에서 감소함
42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장 생검을 사용하여 표준절차에 따라 투과형 전자현미경 (TEM) 분석을 하였다. 요약하면, 조직을 1시간 동안 상온에서 카코딜염산 버퍼의 2% OsO4로 염색전에, 고정 버퍼 (2% 글루타르알데히드, 0.5% 파라포름알데히드, 0.1M 카코딜염산, 0.1M 수크로스, 3mM CaCl2)로 고정 및 0.1M 카코딜염산 버퍼 pH7.4로 세척하였다. 샘플은 탈수하고, 일괄 염색은 2% 우라닐아세테이트의 무수 에탄올에 1시간 동안 상온에서 수행하였다. 그 다음 샘플은 에폰 812/아세톤 시리즈를 통해 수행하고, 순수한 에폰 812로 60℃에서 포매하였다. 라이카 EM UC6 ultratome으로 70nm 두께의 얇은 섹션으로 절단하고, 포름바 코팅된 구리 슬롯 그리드에 고정하였다. pH 3.5의 2% 수성 아세트산 및 Venable과 Cogglesall의 시트르산납으로 후 염색을 하였다. 그리드는 FEI TECNAI 전자현미경으로 분석하였다.
고배율 TEM 분석은 db/db 마우스와 비교하여 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 당뇨성 신장병증과 연관된 사구체간질 확장 및 GBM의 두께의 감소와 같은 신장 이상을 보여준다 (도 3a). GBM의 비대는 당뇨성 신장병증의 일반적인 특징이다. 도 3b는 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 슬릿 형성을 보여준다. VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 족세포 형성은 또한 보존된 것으로 밝혀졌다.
db/db BKS 마우스에서 Vegfb 의 결실은 신장 지질 축적을 감소시킴
42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/-, db/db// Vegfb -/- 및 마른 야생형 마우스의 신장을 사용하여 오일 레드 O (ORO) 분석을 수행하였다. 요약하면, 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 20x 배율로 조사하고, 절편당 최소 10개 프레임을 캡쳐하였다. 지질 방울 정량화를 위해, 각 프레임에서 총 ORO 염색 (pixel, a.u)에 대한 레드 픽셀의 양을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
신장 지질 방울 축적 및 구조는 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 개산된다 (도 4a). 특히, Vegfb 결핍 db/db 마우스의 신장 절편에서 지질 방울은 더 적고 작다.
Vegfb 결핍 db/db BKS 마우스에서 사구체 재배열이 방지됨
42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장에서 사구체 형태를 평가하였다. 요약하면, 동물을 희생시킨 후 신장을 수집하여 4% PFA로 48시간 동안 고정 및 포매하여 준비한 3μm 절편은 시냅토포딘 (synaptopodin) 및/또는 pecam으로 면역염색하였다. 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 토끼 항-시냅토포딘, 염소 항-pecam (Abcam)의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 시냅토포딘 (synaptopodin) 및/또는 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체의 시냅토포딘 염색 (pixel2/㎛2) 및 ii) 사구체의 pecam 염색을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 5a 및 5b는 db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 사구체에서 시냅토포딘 및 pecam의 발현 증가를 보여준다. 이러한 사구체 염색 분석 결과는 Vegfb 결핍 db/db 마우스에서 전반적인 사구체 형태의 개선을 나타낸다. 족세포 및 혈관내피세포, 즉 여과 과정에서 중요한 세포 유형의 구조 및 발현은 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 유지된다.
Vegfb 결핍 db/db BKS 마우스에서 사구체 콜라겐 증착 및 세동맥 유리질증 (arteriolar hyalinosis)은 감소됨
42주령의 암컷 db/db, db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스의 신장에서 사구체 콜라겐 증착 및 세동맥 유리질증을 평가하였다. 요약하면, 동물을 희생시킨 후 신장을 수집하여 4% PFA로 48시간 동안 고정 및 포매하여 준비한 3μm 절편은 콜라겐 IV, pecam 및/또는 α-SMA로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-콜라겐 IV 일차 항체 (abcam), 염소 항-pecam (Abcam) 또는 α-SMA (Sigma)로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 콜라겐 IV, pecam 또는 α-SMA으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체의 콜라겐 IV 염색 (pixel2/㎛2), ii) 사구체의 α-SMA 염색 (pixel2/㎛2), iii) 사구체 세동맥의 두께 (μm2)를 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 6은 db/db 마우스와 비교하여 db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스에서 콜라겐 IV (도 6a) 및 α-SMA (도 6b) 수준의 감소를 보여준다. 또한, db/db 마우스와 비교하여 db/db// Vegfb +/- 및 db/db// Vegfb -/- 마우스에서 세동맥의 두께가 감소하였다 (도 6c). 이러한 결과는 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 병에 의한 사구체 내 콜라겐 증착 (사구체 세포외 기질 (ECM) 증착이라고도 함) 및 세동맥 유리질화가 감소된 것을 나타낸다. 이러한 결과는 사구체 ECM 증착 및 세동맥 유리질화와 같은 당뇨성 신장병증의 일반적인 조직병리학적 특징이 VEGF-B 발현이 감소된 db/db 마우스에서 감소된 것을 보여준다.
db/db BKS 마우스에서 당뇨성 신장병증이 진행되는 동안 신장 사구체에 우선적으로 지질이 축적됨
마른 db + , 6주령 db/db 및 21주령 db/db// BKS 마우스를 사용하여 오일 레드 O (ORO) 분석을 하였다. 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 20x 배율로 조사하고, 절편당 최소 10개 프레임을 캡쳐하였다. 지질 방울 정량화를 위해, 각 프레임에서 총 ORO 염색 (pixel, a.u)에 대한 레드 픽셀의 양을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
도 7은 db/db BKS 마우스에서 대량알부민뇨의 발생, 사구체에 우선적으로 지질 축적을 보여준다.
db/db BKS 마우스에서 당뇨성 신장병증의 진행에 사구체 지질 축적은 족세포 손실과 관련 있음
마른 db + , 6주령 db/db 및 21주령 db/db// BKS 마우스를 사용하여 분석하였다. 신장을 절개하여 4% PFA로 48시간 동안 고정한 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀 포매하였다. 포매 후, 준비한 3μm 절편은 시냅토포딘 및/또는 pecam으로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 항-아디포필린 (Fitzgerald) 및 기니피그 항-시냅토포딘 일차 항체 (Santa Cruz)로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 아디포필린 및 시냅토포딘으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체 아디포필린 염색 (pixel2/mm2) 및 ii) 시냅토포딘 염색 (pixel2/mm2)을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 8은 당뇨성 신장병증이 진행되는 동안, 병렬적으로 사구체에 지질 축적 및 족세포 수의 감소를 보여준다.
당뇨성 신장병증이 진행되는 동안 Vegfb 신호전달 경로는 상향 조절됨
마른 db + , 6주령 db/db 및 21주령 db/db// BKS 마우스의 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정하였다. RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 신장에서 총 RNA를 추출하고, 정제하였다. iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 0.5-1μg의 총 RNA로부터 첫번째 가닥의 cDNA를 합성하였다. 실시간 정량 PCR은 제조사의 지시에 따라, Rotor-Gene Q (Qiagen)의 KAPA SYBR FAST qPCR 키트 마스너 믹스 (2x) 범용 (KAPA Biosystems)을 사용하여 Real-Time PCR thermal cycler로 수행하였다. 발현 수준은 L19 및 β-2 마이크로글로불린의 발현으로 정규화하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 당뇨성 신장병증에서 Vegfb의 신장 발현은 VEGF-B, Fatp3 및 Fatp4의 하위표적 및 주요 VEGF-B 수용체, Vegfr1이 상향 조절된다. 이러한 결과는 신장 VEGF-B 신호전달 경로가 당뇨성 신장병증의 치료에 적합한 표적임을 나타낸다.
고지방식이 Vegf-b +/ - 마우스 및 Vegf-b -/ - 마우스에서 신장 기능의 개선
수컷 야생형, Vegf +/- 및 Vegfb -/- 마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 이 연구는 물론 마른 야생형 대조군 동물은 포함한다. ACR 검출을 위해 각 마우스로부터 20μl 내지 200μl 부피의 소변을 수집하였다. Albuwell M 키트를 이용하여 소변내 알부민을 검출하고, 크레아티닌 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, Philadelphia, PA)를 이용하여 소변내 크레아티닌을 측정하였다.
도 10은 VEGF-B 발현이 감소된 HFD 마우스에서 HFD-매개로 소변내 단백질의 누출이 감소된 것을 보여준다. 알부민 배출 (도 10b) 및 ACR (도 10a)의 측정에 따라 신장 여과 능력은 증가되었다.
고지방식이 Vegf -b +/ - and Vegf -b -/ - 마우스에서 사구체간질 확장 및 비대는 감소됨
수컷 야생형, Vegf +/- 및 Vegfb -/- 마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 이 연구는 물론 마른 야생형 대조군 동물은 포함한다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하여 4% PFA로 48시간 동안 고정한 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀 포매하였다. 포매 후, 준비한 3μm 절편은 제조사에 따라 PAS (Sigma)으로 면역염색하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 PAS으로 염색하여 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 PAS 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 11은 HFD에 의해 유도되는 사구체간질 확장 (도 11a) 및 비대 (도 11b)가 VEGF-B 발현이 감소된 HFD 마우스에서 예방되는 것을 보여준다.
고지방식이 Vegf-b +/ - and Vegf-b -/ - 마우스에서 사구체 지질 축적이 감소됨
수컷 야생형, Vegf +/- 및 Vegfb -/- 마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 이 연구는 물론 마른 야생형 대조군 동물은 포함한다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 그 후, 절편을 3초간 헤막톡실인 용액에 담그고, 고정 전에 수돗물에 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경으로 조사하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 ORO 및 헤마톡실린으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 ORO 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 12 및 신장 절편 염색 분석은 HFD이 사구체에 주로 신장 지질 축적을 증가시킨다는 것을 보여준다. 그러나, 이러한 이소성 지질 축적은 VEGF-B의 발현이 감소된 HFD 마우스에서 감소된다. 지질 방울은 수와 크기가 모두 감소하였다.
고지방식이 Vegf -b +/ - and Vegf -b -/ - 마우스에서 사구체 지질 축적은 감소되고 , 족세포는 온전히 보존됨
수컷 야생형, Vegf +/- 및 Vegfb -/- 마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 이 연구는 물론 마른 야생형 대조군 동물은 포함한다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하여 4% PFA로 48시간 동안 고정한 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀 포매하였다. 포매 후, 준비한 3μm 절편은 제조사에 따라 시냅토포딘 및/또는 pecam으로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 기니피그 항-아디포필린 (Fitzgerald) 및 토끼 항-포도신 (Sigma) 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 아디포필린 및 시냅토포딘으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체 아디포필린 염색 (pixel2/mm2) 및 ii) 포도신 염색 (pixel2/mm2)을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 13 및 신장 절편 염색 분석은 HFD에 의해 유도된 이소성 신장 지질 축적이 VEGF-B의 발현이 감소된 HFD 마우스에서 감소된 것을 보여준다. 병행하여, 족세포 구조의 온전함과 수가 증가하였다.
고지방식이 Vegf -b +/ - and Vegf -b -/ - 마우스에서 사구체 ECM 증착 및 세동맥 유리질화가 감소함
수컷 야생형, Vegf +/- 및 Vegfb -/- 마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 이 연구는 물론 마른 야생형 대조군 동물은 포함한다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하여 4% PFA로 48시간 동안 고정한 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀 포매하였다. 포매 후, 준비한 3μm 절편은 콜라겐 IV, pecam 및/또는 α-SMA로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-콜라겐 IV 일차 항체 (abcam), 염소 항-pecam (Abcam) 또는 α-SMA (Sigma)로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 콜라겐 IV, pecam 또는 α-SMA으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체의 콜라겐 IV 염색 (pixel2/㎛2), 및 ii) 사구체 세동맥의 두께 (μm2)를 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 14 및 신장 절편 염색 분석은 사구체 ECM 증착 증가 (도 14a) 및 세동맥 유리질화 (도 14b)와 같은 당뇨성 신장병증의 주요 조직학적 병리가 VEGF-B의 발현이 감소된 HFD 마우스에서 감소되는 것을 보여준다.
실시예 2: 중화 항- VEGF -B 항체는 당뇨성 신장병증의 진행을 치료 또는 예방함
당뇨병 db/db// BKS 마우스에서 항체-매개 VEGF -B 억제는 혈당 수준에 완만한 영향을 미침
잭슨 실험실에서 구입한 C57BKS/Leprdb (db/db// BKS) 마우스는 생후 6주 (예방 시험) 또는 12주 (치료 시험)부터 시작하여 8주 동안 지속적으로 2H10 (중화 항-VEGF-B 항체) 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 주당 2번 복강주사 하였다. 예방 시험에서, ACR 및 혈당의 시작 값은 각각 < 50 μg//mg의 알부민/크레아티닌 및 < 15 mM이다. 치료 시험에서, ACR 및 혈당의 시작 값은 각각 < 150 μg//mg의 알부민/크레아티닌 및 >15 mM이다. 마우스의 식후 혈당 수준은 음식을 제거한 후 2시간 동안 격주로 모니터링 하였다. 혈당 측정은 바이엘 컨투어 혈당 측정기를 사용하여 정맥 꼬리 채혈을 실시하였다. ACR 검출을 위해 각 마우스로부터 20-μl 내지 200-μl 부피의 소변을 수집하였다. 소변내 알부민은 Albuwell M 키트를 사용하여 측정하고, 소변내 크레아티닌은 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, 필라델피아, PA)를 사용하여 측정하였다.
도 15a 및 c-f는 예방적 또는 치료적으로 항체 2H10를 처리한 db/db/ BKS 마우스의 혈당 수치를 보여준다. 본원에 기재된 실험을 진행한 (본원에 사용된 당뇨의 공격적 모델에서와 같은) 당뇨 후에 항체 투여는 실질적으로 혈당 수준을 감소시키지 않았다.
도 15b는 예방적 또는 치료적으로 항체 2H10를 처리한 db/db/ BKS 마우스의 ACR 수준을 보여준다.
이러한 결과는 db/db/ BKS 마우스에서 생후 6주에 미세알부민뇨가 나타나고, 12주에 대량알부민뇨가 확실해진 것을 보여준다. db/db/ BKS 마우스에 예방적 또는 치료적인 항-VEGF-B 항체의 투여 시도는 둘다 검출 가능한 혈당 수준을 낮춘다.
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 및 세관의 경화증을 감소시킴
6-8주령의 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하고, 제조사의 지침에 따라 PAS (Sigma)로 염색하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 PAS으로 염색하여 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 PAS 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 16a 및 16b에 도시된 바와 같이 2H10 처리된 마우스는 사구체 경화증 및 세관 경화증의 수준을 감소시키는 것을 보여준다. 이러한 결과는 db/db// BKS 마우스에 항-VEGF-B 항체의 처리는 혈당 수준에서 탐지 가능하지 않은 차이에도 불구하고, 사구체 경화증 및 세관 경화증 모두를 감소시키는 것을 나타낸다.
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈관 재배열을 방해함
6-8주령의 db/db// BKS 마우스 또는 연령과 성별이 일치하는 마른 db/+ 동물에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하고, pecam 또는 포도신으로 염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 염소 항-pecam (Abcam) 또는 토끼 항-포도신 (Sigma)의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체 pecam (pixel2/mm2) 및 ii) 포도신 염색 (pixel2/mm2)을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 17에 도시된 바와 같이, 포도신 염색 수준은 2H10 처리된 마우스에서 유지된다. pecam 염색 수준은 2H10 처리된 마우스에서 증가하였다 (도 17b). 염색된 절편의 결과 및 분석은 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db// BKS 마우스의 사구체에서 혈관의 형태가 개선된 것을 나타내며, VEGF-B의 억제는 혈관의 밀도 및 구조를 유지한다. 이러한 결과는 또한 VEGF-B의 억제는 혈관의 밀도 및 구조를 유지하는 것을 보여준다. 따라서, 사구체 여과 장벽을 구성하는 세포 유형인 족세포 및 혈관내피 세포의 구조 및 밀도 모두는 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db// BKS 마우스에서 유지된다.
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 족세포 구조를 유지시킴
6-8주령의 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하고, 시냅토포딘 및/또는 pecam으로 염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-시냅토포딘 (Santa Cruz)의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체의 아디포필린 염색 (pixel2/㎛2) 및 ii) 사구체의 시냅토포딘 염색을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, 아디포필린 염색 수준은 2H10 처리된 마우스에서 감소되었다. 도 18b에는 시냅토포딘 염색 수준이 2H10 처리된 마우스에서 증가한 것을 보여준다. 이러한 결과 및 분석은 사구체 여과 장벽을 구성하는 세포 유형인 족세포 및 혈관내피 세포의 구조 및 밀도 모두는 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db//BKS 마우스에서 유지되는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 항-VEGF-B 항체 처리에 의한 이소성 사구체 지질 축적의 대폭 감소 및 족세포의 발현 및 형태 유지를 보여준다.
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 콜라겐 증착 (세포외 기질 침착)을 감소시킴
6-8주령의 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하고, 사구체 콜라겐 IV를 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-시냅토포딘 (Santa Cruz)의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 콜라겐 IV 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 19에 도시된 바와 같이, 사구체 콜라겐 IV 염색 수준은 2H10 처리된 마우스에서 증가되었다. 이러한 결과 및 분석은 항체-매개 VEGF-B 억제가 db/db// BKS 마우스에서 당뇨성 신장병증의 조직학적 특징인 사구체 내 병리적 콜라겐 증착 (세포외 기질 축적)을 감소시키는 것을 나타낸다.
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈장 지질 프로파일을 개선시킴
6-8주령 암컷 db/db// BKS 마우스 및 연령 및 성별이 일치하는 마른 db/+에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 다음, 심장천자에 의해 혈액을 수집하였다. 혈액은 14000rpm, 4℃로 10분간 원심분리하고, 혈장을 분리하여 -80℃에 분취 냉동하였다. 상업적으로 시판되는 키트를 사용하여 NEFAs (Wako Chemicals, Neuss, Germany), 베타-하이드록시부티레이트 (Stanbio Laboratories, Boerne, TX, USA) 및 HDL-c 및 LDL-c (BioVision, Mountain View, CA, USA)를 측정하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, 2H10의 투여는 제2형 당뇨의 주요 특징인 케톤의 증가된 수준에 대해 db/db// BKS 마우스를 보호한다. 항-VEGF-B 처리는 일반적으로 알려진 "좋은" 콜레스테롤로 알려진 혈장 HDL-c 수준을 증가시킨다. 2H10에 의한 VEGF-B 신호전달의 감소는 혈장 LDL-c 수준 및 NEFA에는 전혀 영향을 미치지 않는다.
예방적 항-VEGF-B 처리 (2H10의 사용)는 GBM 비대 및 족세포 이상을 방지함
6-8주령 암컷 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 다음, 투과형 전자 현미경 (TEM) 분석에 사용하였다. TEM을 위한 신장 생검의 준비는 표준 절차에 따라 수행하였다. 조직을 1시간 동안 상온에서 카코딜염산 버퍼의 2% OsO4로 염색 전에, 고정 버퍼 (2% 글루타르알데히드, 0.5% 파라포름알데히드, 0.1M 카코딜염산, 0.1M 수크로스, 3mM CaCl2)로 고정 및 0.1M 카코딜염산 버퍼 pH7.4로 세척하였다. 샘플은 탈수하고, 일괄 염색은 2% 우라닐아세테이트의 무수 에탄올에 1시간 동안 상온에서 수행하였다. 그 다음 샘플은 에폰 812/아세톤 시리즈를 통해 수행하고, 순수한 에폰 812로 60℃에서 포매하였다. 라이카 EM UC6 ultratome으로 70nm 두께의 얇은 섹션으로 절단하고, 포름바 코팅된 구리 슬롯 그리드에 고정하였다. pH 3.5의 2% 수성 아세트산 및 Venable과 Cogglesall의 시트르산납으로 후 염색을 하였다. 그리드는 FEI TECNAI 전자현미경으로 분석하였다.
고배율의 TEM 분석은 2H10를 처리하였을 때, db/db 마우스에서 일차 신장 병변인 GBM 비대가 감소하는 것을 보여준다 (도 21a). 또한, db/db// BKS 마우스에 항-VEGF-B 처리는 슬릿 형성의 수를 측정하여 족세포 형태를 유지한다 (도 21b).
db/db// BKS 마우스에서 예방적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 지질 축적을 감소시킴
6-8주령 db/db// BKS 마우스 또는 마른 db/+ 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리한 다음, 혈액 및 신장을 수집하였다. 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 그 후, 절편을 3초간 헤막톡실인 용액에 담그고, 고정 전에 수돗물에 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경으로 조사하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 ORO 및 헤마톡실린으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 ORO 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
마른 비-당뇨 동물에 비해 당뇨병 동물의 사구체에서 지질 축적의 특정 증가가 검출되었다 (도 22). db/db// BKS에서 VEGF-B의 억제는 이런 이소성 사구체 지질 축적을 대폭 감소시킨다. 지질 방울은 수와 크기가 모두 감소하였다. 분석은 방울은 주로 혈관내피 세로 및 족세포에 축적되는 것을 나타낸다.
심한 당뇨의 db/db// BK S 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 및 세관의 경화증을 감소시킴
12주령의 수컷 및 암컷 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리하여 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하고, 제조사의 지침에 따라 PAS (Sigma)로 염색하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 PAS으로 염색하여 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 PAS 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 23a 및 23b 및 절편 염색의 분석의 결과는, db/db// BKS 마우스에서 치료적 VEGF-B의 억제가 사구체 경화증 및 세관 경화증의 수준을 감소시키는 것을 보여준다. 이러한 질환은 수컷 db/db// BKS 마우스에 더욱 공격적 (일반적으로 관찰된 효과)이므로, 이러한 효과는 대부분 암컷 동물에서만 검출된다.
심한 당뇨의 db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 지질 축적을 감소시킴
12주령의 수컷 및 암컷 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리하여 신장을 수집하고, 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 20x 배율로로 조사하고, 절편당 최소 10개 프레임을 캡쳐하였다. 지질 방울 정량화를 위해, 각 프레임에서 총 ORO 염색 (pixel, a.u)에 대한 레드 픽셀의 양을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
도 24에 도시된 바와 같이, 항체 치료를 받은 암컷 db/db// BKS 마우스에서 ORO 염색 양이 감소된다. 이러한 결과 및 염색된 절편의 분석은 항-VEGF-B 항체 처리된 암컷 db/db// BKS 마우스에서 지질 방울의 수와 크기가 감소한 것을 나타낸다. 숫컷 동물에서 질환의 더욱 공격적인 발전의 결과로 대부분의 수컷 db/db// BKS 마우스에서는 항-VEGF-B 항체 처리가 신장 지질 축적을 감소시키지 않았다.
심한 당뇨의 db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 재배열을 방지함
12주령의 수컷 및 암컷 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리하여 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하여 시냅토포딘 (synaptopodin) 또는 pecam으로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-시냅토포딘의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 시냅토포딘 또는 pecam 염색 (pixel2/㎛2)을 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 25a 및 25b는 치료적으로 항-VEGF-B 항체 처리된 마우스의 사구체에서 pecam 및 시냅토포딘의 수준이 증가한 것을 보여준다. 이러한 결과 및 염색된 절편의 분석은 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db// BKS 마우스에서 사구체 형태가 개선된 것을 나타낸다. 사구체 여과 과정에서 중요한 세포 유형인 족세포 및 혈관내피 세포의 구조 및 발현은 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db// BKS 마우스에서 유지된다. 따라서, 이러한 결과는 항-VEGF-B 항체에 의한 치료적 처리가 또한 db/db// BKS 마우스의 혈관 및 족세포 손실을 방지한다는 것을 나타낸다.
심한 당뇨의 db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 콜라겐 증착 및 세동맥 유리질증을 감소시킴
12주령의 수컷 및 암컷 db/db// BKS 마우스에 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 8주 동안 처리하여 신장을 수집하고, 4% PFA로 48시간 동안 고정하여 포매한 3μm 절편을 준비하여 콜라겐 IV, pecam 및/또는 α-SMA로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-시냅토포딘 (Santa Cruz)의 일차 항체로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 pecam으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 콜라겐 IV, pecam, 및/또는 α-SMA 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 26a-c는 2H10 처리된 db/db// BKS 마우스에서 콜라겐 IV, α-SMA 및 세동맥 두께의 감소를 보여준다. 이러한 결과 및 염색된 절편의 분석은 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db// BKS 마우스에서 병리적 사구체 내 콜라겐 증착 (세포외 기질 축적) 및 세동백 유리질화가 감소한 것을 보여준다.
미세알부민뇨가 확실한 당뇨병 db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 대량알부민뇨로의 발전을 예방함
db/db// BKS 마우스는 생후 6-8주부터 시작하여 8주 동안 지속적으로 400 μg의 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 주당 2번 복강주사 하였다. ACR 검출을 위해 각 마우스로부터 20-μl 내지 200-μl 부피의 소변을 수집하였다. 소변내 알부민은 Albuwell M 키트를 사용하여 측정하고, 소변내 크레아티닌은 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, 필라델피아, PA)를 사용하여 측정하였다. 수축기 및 이완기 혈압은 CODA 설정 (Kent Scientific)을 사용하여 꼬리 커프 (tail-cuff) 방법으로 측정하였다. 모든 동물은 2주 동안 혈압 측정 장치에 적응시켰다. 그들 모두 최소 3일 동안 하루에 재배열 20회 측정의 1-2 주기를 받았다. 마우스 신장기능 연구을 위해, 각각의 마우스를 대사 케이지에 수용하였다. 24시간 동안의 체중 및 소변양을 2일 연속 모니터링하였다. 24시간 후의 소변 샘플은 소녑내 크레아티닌을 측정하기 위해 사용하였다. 동물을 대사 케이지에 수용한 후 이소플루오란으로 마취하여 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하여 혈장 커레아티닌 측정에 사용하였다. 신장을 절개하여 마이크로 스케일의 무게를 측정하였다. (소변[Cr]x소변의 부피)/(혈장[Cr]x24시간)에 의해 크레아티닌 클리어런스를 계산하였다.
도 27a는 2H10 처리된 db/db// BKS 마우스에서 미세알부민뇨가 대량알부민뇨로 진행하는 것에 대한 예방을 보여주며, 특히, 연구기간 전반에 걸쳐 처리된 마우스에서 ACR은 현저히 변하지 않는다. 도 27b는 2H10 처리된 db/db// BKS 마우스에서 사구체 여과율 (크레아티닌 클리어런스 측정에 의한) 또한 감소하는 것을 보여준다. 도 27c는 VEGF-B 억제에 의해 고혈압의 진행이 예방되는 것을 보여준다. 도 27d는 VEGF-B 발현 감소가 체중 또는 신장의 무게에 영향을 미치지 않는 것을 보여준다. 이러한 결과는 항-VEGF-B 항체 처리된 db/db 마우스에서 소변내 알부민, 소변내 알부민/크레아티닌 비 및 크레아티닌 클리어런스의 감소에 의해 보다 나은 여과 용량 측정으로 신장기능이 개선된 것을 나타낸다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈당 수준에 크지 않은 영향을 미침
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 마우스의 식후 BG 수준은 음식을 제거한 후 2시간 동안 시작과 끝에 기록하였다. 혈당 측정은 바이엘 컨투어 혈당 측정기를 사용하여 정맥 꼬리 채혈을 실시하였다.
도 28은 HFD이 혈당 수준을 증가시키며, 항-VEGF-B 항체 처리는 고혈당으로의 진행을 예방하지 못하는 것을 보여준다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈당 수준의 감소 없이 신장기능을 개선함
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 물론 마른 야생형 대조군 동물을 포함하여 연구하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 알부민 및 ACR 검출을 위해 각 시험의 마지막에 20-μl 내지 200-μl 부피의 소변을 각 마우스로부터 수집하였다. 소변내 알부민은 Albuwell M 키트를 사용하여 검출하고, 소변내 크레아티닌은 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, Philadelphia, PA)를 사용하여 측정하였다.
항-VEGF-B 항체 처리한 HFD 마우스는 혈당 수준이 낮지 않지만, 이러한 처리가 당뇨성 신장 생리학에는 큰 영향을 미친다 (도 29). 신장 여과 용량은 감소된 알부민 배출 (도 29a), ACR (도 29b) 및 GFR 측정으로 개선되었다. HFD 마우스에 항-VEGF-B 처리는 대조군 처리된 마우스에 비해 체중 또는 신장의 무게에 영향을 미치지 않는다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈장 지질 프로파일을 개선시킴
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 물론 마른 야생형 대조군 동물을 포함하여 연구하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 혈액은 14000rpm, 4℃로 10분간 원심분리하고, 혈장을 분리하여 -80℃에 분취 냉동하였다. 상업적으로 시판되는 키트를 사용하여 NEFAs (Wako Chemicals, Neuss, Germany), 베타-하이드록시부티레이트 (Stanbio Laboratories, Boerne, TX, USA) 및 HDL-c 및 LDL-c (BioVision, Mountain View, CA, USA)를 측정하였다.
도 30은 2H10가 투여된 HFD 마우스는 T2D와 관련된 지질종의 수준을 증가시키는 것에 대해 보호되는 것을 보여준다. 예를 들어, 항-VEGF-B 항체 처리는 혈장 중성지방 (도 30a), NEFA (도 30b) 및 케톤 (도 30c)의 수준을 감소시킨다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체간질의 확장 및 경화증을 예방함
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 물론 마른 야생형 대조군 동물을 포함하여 연구하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하고, 4% PFA로 48시간 동안 후고정에 이어 표준 절차에 따라 파라핀 임베딩을 진행하였다. 포매 후, 포매한 3μm 절편을 준비하고, 제조사의 지침에 따라 PAS (Sigma)로 염색하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 PAS으로 염색하여 명시야 현미경 (Axio Vision microscope, Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 PAS 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 31에 나타난 결과 및 절편 염색의 분석에서 2H10가 투여된 HFD 마우스는 사구체간질 확장 (도 31a) 및 사구체 비대 (도 31b)에 대해 보호되는 것을 보여준다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 지질 축적을 예방함
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 물론 마른 야생형 대조군 동물을 포함하여 연구하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하여 드라이아이스 위에 고정시키고 저온유지장치 틀에서 바로 Tissue-Tek® (Sakura)에 포매하였다. 동결절편 (12μm)은 ORO 워킹 용액 (2.5g oil red O (Sigma-Aldrich)에 5-15분간 침지시키고, 400ml 99% 이소프로판올에 용해시켜 H2O에서 6:10으로 희석하였으며, 22㎛의 필터 (코닝)를 통해 여과시키고 고정 전에 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 그 후, 절편을 3초간 헤막톡실인 용액에 담그고, 고정 전에 수돗물에 세척하였다. 염색한 절편은 명시야 현미경으로 조사하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 ORO 및 헤마톡실린으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 사구체 ORO 염색 (pixel2/㎛2)을 정량화하였다.
도 32의 결과 및 절편 염색의 분석에서 2H10가 투여된 HFD 마우스는 이소성 신장 지질 축적을 방지한다. 지질 방울은 수와 크기 모두 감소하였다.
HFD db/db// BKS 마우스에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 사구체 지질 축적을 방지하고, 족세포의 온전함을 유지함
마우스를 생후 5주부터 시작하여 30주 동안 60% 고지방식이 (HFD) (Research Diets, USA)를 공급하였다. 물론 마른 야생형 대조군 동물을 포함하여 연구하였다. 항체 처리는 11주부터 시작하여 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 20주 동안 처리하였다. 동물을 이소플루오란 마취에 의해 희생시키고, 심장천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 신장을 절개하고, 4% PFA로 48시간 동안 후고정에 이어 표준 절차에 따라 파라핀 임베딩을 진행하였다. 포매 후, 포매한 3μm 절편을 준비하고, 콜라겐 IV, pecam 및/또는 α-SMA로 면역염색하였다. 요약하면, 항원 복구는 3μm 절편을 항원 복구 용액 Ph6 (Dako #S2367)을 사용하여 98℃로 10분간 가열하여 수행하였다. 절편은 토끼 항-콜라겐 IV 일차 항체 (abcam), 염소 항-pecam (Abcam) 또는 α-SMA (Sigma)로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 절편을 현미경으로 관찰하기 위해, 적절한 형광 표지된 이차 항체 (Invitrogen, Alexa fluor)로 상온에서 1시간 추가 반응시켜 준비하였다. 동물당 최소 10개 사구체를 각 절편 내에서 콜라겐 IV, pecam 또는 α-SMA으로 염색하여 Axio Vision 현미경 (Carl Zeiss) 40x 배율로 촬영하였다. 사구체는 i) 사구체의 콜라겐 IV 염색 (pixel2/㎛2) 및 ii) 사구체 세동맥의 두께 (μm2)를 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량화하였다.
도 33의 결과 및 절편 염색의 분석는 2H10가 투여된 HFD 마우스에서 사구체 ECM 축적 (도 33a) 및 세동맥 유리질증 (도 33b)와 같은 조직학적으로 당뇨성 신장병증과 관련된 병리가 보호되는 것을 보여준다.
STZ가 주사된 동물에서 치료적 항- VEGF -B 처리 ( 2H10의 사용)는 혈당 수준에 영향을 주지 못함
제1형 당뇨병을 유도하기 위해, 스트렙토조토신 (STZ) 모델을 사용하였다. 찰스 리버 (Charles River)의 수컷 Bl/6 마우스를 사용하여 실험하였다. 마우스는 STZ 주사 전에 4시간 동안 굶기고, 50mg/kg 체중으로 50mM 구연산 나트륨 (pH4.5)의 스트렙토조토신 (Sigma-Aldrich) 또는 구연산 나트륨 버퍼를 1, 2, 3, 4 및 5일에 복강주사 하였다. 마우스의 BG 수준은 STZ 주사 전 및 주사 후 1주일에 기록하였다. 동물의 혈당 수준이 12 mmol/l을 넘으면 고혈당으로 간주하였다. 동물을 두 그룹으로 무작위로 나누고, 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 주 2회 처리하였다. 항-VEGF-B (2H10) 또는 대조군 항체가 처리된 마우스 및 마른 대조군 동물의 식후 BG 수준은 음식을 제거한 후 2시간 동안 격주로 기록하였다. 혈당 측정은 바이엘 컨투어 혈당 측정기를 사용하여 정맥 꼬리 채혈을 실시하였다.
도 34a에 도시된 바와 같이, 수컷 마우스에서 STZ 주사는 고혈당을 유도한다. 그러나, STZ 주사 후 항-VEGF-B 처리는 혈당 수준에 큰 영향을 미치지 않는다 (도 34b).
STZ가 주사된 동물에서 2H10을 사용한 치료적 항- VEGF -B 처리는 신장기능을 향상시킴
제1형 당뇨병을 유도하기 위해, 스트렙토조토신 (STZ) 모델을 사용하였다. Scanbur의 수컷 Bl/6 마우스를 사용하여 실험하였다. 마우스는 STZ 주사 전에 4시간 동안 굶기고, 50mg/kg 체중으로 50mM 구연산 나트륨 (pH4.5)의 스트렙토조토신 (Sigma-Aldrich) 또는 구연산 나트륨 버퍼를 1-5일에 복강주사 하였다. 마우스의 BG 수준은 STZ 주사 전 및 주사 후 1주일에 기록하였다. 동물의 혈당 수준이 12 mmol/l을 넘으면 고혈당으로 간주하였다. 동물을 두 그룹으로 무작위로 나누고, 2H10 또는 아이소타입이 일치하는 대조군 항체를 주 2회 처리하였다. 알부민 및 ACR 검출을 위해 각 시험의 마지막 (진행중인 실험에서 1주 처리를 보고)에 20-μl 내지 200-μl 부피의 소변을 각 마우스로부터 수집하였다. 소변내 알부민은 Albuwell M 키트를 사용하여 검출하고, 소변내 크레아티닌은 크레아티닌 컴패니언 뮤린 ELISA 키트 (Exocell, Philadelphia, PA)를 사용하여 측정하였다.
STZ 주사 후에 항-VEGF-B 항체 2H10를 투여한 마우스에서 혈당 수준에 대한 경미한 효과에도 불구하고, 당뇨병 마우스의 신장기능은 항체 처리에 의해 현저히 향상되었다. 알부민 배출 (도 35a) 및 ACR (도 35b)의 감소에 의해 신장 여과능력은 향상된 것으로 측정되었다.
<110> CSL Limited B Creative Sweden AB <120> Method of treating nephropathy <130> PI16-B147 <150> AU 2013904595 <151> 2013-11-28 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 25 30 Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln 35 40 45 Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60 Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 90 95 Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 110 Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125 Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg 130 135 140 Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr 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<211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR3 <400> 22 Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 23 aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta gcc 33 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 24 tgggcatcca cccggcacac t 21 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 25 caacaatata gcagctctct cacg 24 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 26 ggctacacct tcacaacctt ctatatacac 30 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 27 tggttttatc ctggaaatgt taataccaac tacaatgaga agctcaaggg c 51 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 28 tccccttact acggctacgt ttttgactac 30 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 29 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 30 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 31 Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 32 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr Ile His 1 5 10 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 33 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 34 Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 35 aaggccagtc agaatgtgaa cactaatgta gcc 33 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 36 tcggcatcct cccggtgcag t 21 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 37 cagcaatatc acagctttcc gctcacg 27 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 38 ggcgacacct tcaccaactc ctggataggc 30 <210> 39 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 39 gatatttttc ctgggagtgg tcatactaac tacaatgaga agttcaagaa c 51 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 40 gagaattatg cctggtttgc ttat 24 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 41 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 42 Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 43 Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 44 Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 45 Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 46 Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5

Claims (13)

  1. VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 당뇨성 신장병증을 앓고 있는 개체의 당뇨성 신장병증 치료용 약학 조성물로서, 상기 화합물은 VEGF-B에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질인 약학 조성물.
  2. VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 당뇨병 및 미세알부민뇨 (microalbuminuria) 또는 다량알부민뇨 (macroalbuminuria) 증상을 앓고 있는 개체의 당뇨성 신장병증 예방용 약학 조성물로서, 상기 화합물은 VEGF-B에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질인 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 하기 효과 중 하나 이상을 나타내는 유효한 양인 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    a) 고혈압의 강하 또는 예방;
    b) 사구체 또는 세관 경화증의 감소 또는 예방;
    c) 사구체간질 세포외 기질 (mesangial extracellular matrix) 증착 또는 사구체 기저막 이상비대의 감소 또는 예방;
    d) 사구체간질 확장의 감소 또는 예방;
    e) 사구체 혈관 재배열의 감소 또는 예방;
    f) 신장 지질 축적의 감소 또는 예방;
    g) 사구체 지질 축적의 감소 또는 예방;
    h) 사구체 콜라겐 증착 또는 세동맥 유리질증 (arteriolar hyaliosis)의 감소 또는 예방; 또는
    i) 다량알부민뇨 (macroalbuminuria)의 감소 또는 예방.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 Fv를 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단백질은 하기 (i) 내지 (x)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (i) 단일 사슬 Fv 단편 (scFv);
    (ii) 이량체 scFv (di-scFv);
    (iii) 디아바디 (diabody);
    (iv) 트리아바디 (triabody);
    (v) 테트라바디 (tetrabody);
    (vi) Fab;
    (vii) F(ab')2;
    (viii) Fv;
    (ix) 항체의 불변영역에 연결된 (i) 내지 (viii)중 하나, Fc 또는 중사슬 (heavy chain) 불변 도메인 (CH)2 또는 CH3; 또는
    (x) 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 VEGF-B에 2H10 항체(서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 중사슬 가변영역 (VH)를 포함하고, 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 경사슬 가변영역 (VL)를 포함함)의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화합물은 2H10 항체 가변영역의 인간화된 형태를 포함하는 단백질 또는 인간화 2H10 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단백질은 2H10 항체의 VH 또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (i) 다음을 포함하는 VH:
    (a) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 25-34번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 49-65번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 3으로 표시되는 서열의 98-108번째 아미노산을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 다음을 포함하는 VL:
    (a) 서열번호 4로 표시되는 서열의 23-33번째 아미노산을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 4로 표시되는 서열의 49-55번째 아미노산을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 4로 표시되는 서열의 88-96번째 아미노산을 포함하는 CDR3.
  12. 제9항에 있어서, 상기 화합물은 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신장병증의 치료 또는 예방 또는 당뇨병의 치료, 예방 또는 진행의 지연용 추가 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3074038T3 (en) 2013-11-28 2019-03-11 Csl Ltd METHOD OF TREATING DIABETIC NEPHROPATHY
PL3220952T3 (pl) 2014-11-17 2022-01-31 Csl Limited Sposób leczenia lub zapobiegania udarowi
RU2651895C2 (ru) * 2015-12-01 2018-04-24 Алексей Николаевич Вачёв Способ прогнозирования клинического эффекта после операции реваскуляризации почек у больных с ишемической нефропатией
JP7065786B2 (ja) * 2016-04-21 2022-05-12 シーエスエル リミティド 肝病態を治療又は予防する方法
RU2754509C1 (ru) * 2020-12-21 2021-09-02 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения первичной мембранозной нефропатии с нефротическим синдромом и повышенным уровнем анти-plar2

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0569141A3 (en) 1992-04-14 1994-10-26 Hybritech Inc Method for inhibiting the growth of multidrug-resistant tumors by antibodies.
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
US7030146B2 (en) 1996-09-10 2006-04-18 University Of South Carolina Methods for treating diabetic neuropathy
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
KR101085210B1 (ko) 1998-03-20 2011-11-21 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 유전자 발현 조절방법
JP5015373B2 (ja) 1998-04-08 2012-08-29 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 改良表現型を得るための方法及び手段
US6219158B1 (en) 1998-07-31 2001-04-17 Hewlett-Packard Company Method and apparatus for a dynamically variable scanner, copier or facsimile secondary reflective surface
ATE352559T1 (de) 1998-12-08 2007-02-15 Biovation Ltd Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7270969B2 (en) 1999-05-05 2007-09-18 Phylogica Limited Methods of constructing and screening diverse expression libraries
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
GB0001930D0 (en) * 2000-01-27 2000-03-22 Novartis Ag Organic compounds
AU2002256371B2 (en) 2001-04-26 2008-01-10 Amgen Mountain View Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2006526414A (ja) 2003-06-02 2006-11-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 脱免疫化抗ｃｄ３抗体
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
WO2005037867A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
AU2005212371B2 (en) * 2004-02-11 2010-05-13 Fibrogen, Inc. CTGF as target for the therapy of diabetic nephropathy
CN1929861B (zh) * 2004-02-11 2010-12-29 法布罗根股份有限公司 Ctgf作为糖尿病肾病的治疗靶点
CA2567655C (en) 2004-06-02 2015-06-30 Diatech Pty Ltd Binding moieties based on shark ignar domains
CA2575901C (en) 2004-08-02 2015-01-27 Amrad Operations Pty. Ltd. A method of treating cancer comprising a vegf-b antagonist
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2619244A1 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Arana Therapeutics Limited Engineered antibodies with new world primate framework regions
EP2003960B1 (en) 2006-03-31 2015-06-10 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
WO2010080238A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 3M Innovative Properties Company Telechelic hybrid aerogels
EP2367000A1 (en) 2010-03-04 2011-09-21 Charité Universitätsmedizin Berlin High throughput analysis of T-cell receptor repertoires
WO2013101954A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Allergan, Inc. 3-phenyl-5-ureidoisothiazole-4-carboximide and 3-amino-5-phenylisothiazole derivatives as kinase inhibitors
WO2014045266A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Ulf Eriksson Treatment of type 2 diabetes and related conditions
DK3074038T3 (en) 2013-11-28 2019-03-11 Csl Ltd METHOD OF TREATING DIABETIC NEPHROPATHY

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Am Soc Nephrol, 2006년, Vol.17 p.3093-3104*

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Publication number Publication date
KR20160083121A (ko) 2016-07-11
RU2718054C2 (ru) 2020-03-30
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