KR20170070136A - 만능성 세포를 생성하거나 유지하는 방법 및 조성물 - Google Patents

만능성 세포를 생성하거나 유지하는 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20170070136A
KR20170070136A KR1020177012730A KR20177012730A KR20170070136A KR 20170070136 A KR20170070136 A KR 20170070136A KR 1020177012730 A KR1020177012730 A KR 1020177012730A KR 20177012730 A KR20177012730 A KR 20177012730A KR 20170070136 A KR20170070136 A KR 20170070136A
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준코 쿠노
보이테크 아우어바흐
데이비드 엠. 발렌주엘라
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

배양물에서 인간 iPS 세포를 생성하고 유지하는 방법 및 조성물이 제공된다. 방법은 저삼투압 배지를 사용한 인간 iPS 세포의 제조 또는 저삼투압 배지를 사용한 인간 iPS 세포의 유지를 포함한다. 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포에 표적화된 유전자 변형을 생성하는 방법이 또한 포함된다. 조성물은 본 명세서에서 정의된 저삼투압 배지를 사용하여 배양되고 유지된 인간 iPS 세포를 포함한다.

Description

만능성 세포를 생성하거나 유지하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING OR MAINTAINING PLURIPOTENT CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, 2014년 10월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/064,384호의 이익을 주장한다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록의 참조
본 서열 목록의 공식 사본은 2015년 10월 14일자로 작성된 757 바이트 크기의 파일명 469587SEQLIST.TXT의 ASCII 포맷 서열 목록으로서, EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되며, 본 명세서와 함께 제출된다. 이러한 ASCII 포맷된 문서에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포는 완전(
Figure pct00001
) 만능성 또는 준(primed) 만능성 상태를 보일 수 있다 (문헌[Nichols and Smith, Cell Stem Cell (2009) Vol. 4(6), pp. 487-492]). 준 인간 iPS 세포는 착상 후 배반엽 상피세포의 것과 유사한 특성을 나타내며, 계통 특정화(specification) 및 분화가 결정된다. 대조적으로, 완전 인간 iPS 세포는 착상 전 배아의 내세포괴의 배아줄기 (ES) 세포의 것과 유사한 특성을 나타낸다. 어떤 면에서, 완전 iPS 세포는 계통 특정화가 결정되지 않기 때문에 준 세포보다 더 만능성이다. 다양한 배양 조건을 사용하여 인간 iPS를 완전 상태 또는 준 상태로 유지할 수 있다.
인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 집단을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포의 집단을 세포외 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (glycogen synthase kinase; GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하고, 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 방법은 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포의 집단을 세포외 배양하는 단계를 또한 포함할 수 있으며, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하고, 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다.
생체외 배양물에서, hiPSC의 집단을 유지하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 hiPSC의 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하며, 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 방법은 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서, hiPSC의 집단을 배양하는 단계를 또한 포함할 수 있으며, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하고, 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다.
일부 방법에서, hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는(
Figure pct00002
) hiPSC를 포함한다. 일부 방법에서, hiPSC는 완전-유사(
Figure pct00003
-like) hiPSC를 포함한다.
일부 방법에서, 방법은 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC의 집단을 풍부하게 한다(enrich). 일부 방법에서, 방법은 완전-유사 hiPSC의 집단을 풍부하게 한다.
일부 방법에서, 형질전환된 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, Myc또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍(reprogramming) 유전자를 발현한다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 준 hiPSC를 포함한다.
일부 방법에서, 기본 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏이다. 일부 방법에서, 기본 배지는 NaCl 약 3 mg/ml 및 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 삼투압이 약 200 mOsm/㎏이다.
일부 방법에서, 기본 배지는 글루코스 약 4.5 mg/mL를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다. 일부 방법에서, 저삼투압 배지의 삼투압은 약 233 mOsm/㎏이다.
일부 방법에서, 보충물은 (a) F-12 배지; (b) N2 보충물; (c) 신경기저(NEUROBASAL) 배지; (d) B-27 보충물; (e) L-글루타민; (f) 2-메르캅토에탄올; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합을 포함한다.
일부 방법에서, LIF 폴리펩티드는 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이다. 일부 방법에서, GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함한다. 일부 방법에서, MEK 억제제는 PD0325901을 포함한다. 일부 방법에서, 저삼투압 배지는 GSK3 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지는 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지는 bFGF 보충물, TGF-β1 보충물, JNK 억제제, p38 억제제, ROCK 억제제 및 PKC 억제제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 일부 방법에서, 저삼투압 배지는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함하지 않는다.
일부 방법에서, hiPSC 또는 형질전환된 세포는 매트리겔(MATRIGEL)™, 신생아 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 배양보조세포(feeder cell) 또는 겔트렉스(GELTREX)™ 상에서 배양된다.
일부 방법에서, hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다. 일부 방법에서, 하나 이상의 만능성 마커는 NANOG, 알칼리 포스파타아제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 방법에서, hiPSC는 정상 핵형을 갖는다.
일부 방법에서, hiPSC는 조밀한 돔형(dome-shaped) 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지(morphology)를 나타낸다.
일부 방법에서, hiPSC는 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리시키고, 계대배양될 수 있다. 일부 방법에서, 효소적 해리는 트립신을 사용하여 수행된다. 일부 방법에서, 효소적 해리는 Rho-연관 단백질 키나제(Rho-associated protein kinase; ROCK) 억제제의 부재 하에 수행될 수 있다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 계속해서 발현한다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 정상 핵형을 유지한다.
일부 방법에서, hiPSC는 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있다.
일부 방법에서, hiPSC는 약 16시간 내지 약 24시간의 배가 시간을 갖는다.
일부 방법에서, 형질전환된 세포는 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 먼저 배양된 후, 저삼투압 배지에서 배양된다. 선택적으로, 고삼투압 배지의 삼투압은 약 290 mOsm/㎏ 이상이다.
일부 방법에서, 형질전환된 세포는 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 약 2개월 동안 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 3차원 세포 덩어리(clump)를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낼 때까지 먼저 고삼투압 배지에서 배양된다.
상기 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 hiPSC가 추가로 제공된다.
(a) 표적 게놈 유전자좌에서 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암(arm)에 의해 플랭킹된(flanked) 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 hiPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 삽입 핵산을 이의 게놈에 포함하는 유전자 변형 hiPSC를 동정하는 단계를 포함하는, hiPSC의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법이 추가로 제공하며; 여기서, hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하며, 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 방법은 또한 (a) 표적 게놈 유전자좌에서 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 hiPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 삽입 핵산을 이의 게놈에 포함하는 유전자 변형 hiPSC를 동정하는 단계를 포함할 수 있으며; 여기서, hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하며, 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다. 일부 방법에서, 표적화 벡터는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이며, 5' 및 3' 상동성 암의 총 합은 10 kb 이상이다. 일부 방법에서, 도입 단계 (a)는 표적화 벡터와 hiPSC의 표적 게놈 유전자좌 사이의 상동 재조합을 촉진하는 뉴클레아제 제제를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 방법에서, 표적화된 유전자 변형은 (a) 내인성 인간 핵산 서열의 결실; (b) 외인성 핵산 서열의 삽입; 또는 (c) 내인성 인간 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 치환을 포함한다. 일부 방법에서, 외인성 핵산 서열은 (a) 내인성 인간 핵산 서열에 상동성 또는 이종상동성(orthologous)인 핵산 서열; (b) 키메라 핵산 서열; (c) 부위 특이적 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 조건 대립유전자(conditional allele); 및 (d) hiPSC에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 중 하나 이상을 포함한다.
hiPSC의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 이러한 방법은 (a) 표적 게놈 유전자좌의 인식 부위에서 하나 이상의 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 하나 이상의 뉴클레아제 제제를 hiPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 변형을 이의 게놈에 포함하는 하나 이상의 세포를 동정하는 단계를 또한 포함할 수 있으며; 여기서, hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는 (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (iii) MEK 억제제를 포함하며, 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 방법은 (a) 표적 게놈 유전자좌의 인식 부위에서 하나 이상의 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 하나 이상의 뉴클레아제 제제를 hiPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 변형을 이의 게놈에 포함하는 하나 이상의 세포를 동정하는 단계를 또한 포함할 수 있으며; 여기서, hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는 (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (iii) MEK 억제제를 포함하며, 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다.
hiPSC에서 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 임의의 이러한 방법에서, hiPSC는 단일 세포 현탁액으로 효소에 의해 해리되어, 단계 (a) 전에 계대배양될 수 있다. 선택적으로, 효소적 해리는 트립신을 사용하여 수행된다. 선택적으로, 효소적 해리는 ROCK 억제제의 부재 하에 수행된다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 계속해서 발현한다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다. 일부 방법에서, 계대배양된 hiPSC는 정상 핵형을 유지한다.
일부 방법에서, 뉴클레아제 제제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 포함한다. 일부 방법에서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease; TALEN(탈렌))을 포함한다. 일부 방법에서, 뉴클레아제 제제는 규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 관련 (Cas) 단백질 및 게놈 표적 서열 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인식하는 CRISPR RNA (crRNA)를 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9이다.
일부 방법에서, 표적화된 유전자 변형은 이대립인자성(biallelic)이다.
일부 방법에서, hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC를 포함한다. 일부 방법에서, hiPSC는 완전-유사 hiPSC를 포함한다. 일부 방법에서, hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다. 선택적으로, 만능성 마커는 NANOG, 알칼리 포스파타아제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 방법에서, hiPSC는 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다. 일부 방법에서, hiPSC는 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있다. 일부 방법에서, hiPSC는 약 16시간 내지 약 24시간의 배가 시간을 갖는다. 일부 방법에서, hiPSC는 정상 핵형을 갖는다.
일부 방법에서, hiPSC는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로부터 유래된다. 선택적으로, 형질전환된 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, Myc또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍 유전자를 발현한다. 선택적으로, 형질전환된 세포는 준 hiPSC를 포함한다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 먼저 배양된 후, 저삼투압 배지에서 배양된다. 선택적으로, 고삼투압 배지의 삼투압은 290 mOsm/㎏ 이상이다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 약 2개월 동안 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 방법에서, 형질전환된 세포는 3차원 세포 덩어리를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낼 때까지 먼저 고삼투압 배지에서 배양된다.
일부 방법에서, 기본 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏이다. 일부 방법에서, 기본 배지는 NaCl 약 3 mg/ml 및 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 삼투압이 약 200 mOsm/㎏이다.
일부 방법에서, 기본 배지는 글루코스 약 4.5 mg/mL를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다. 일부 방법에서, 저삼투압 배지의 삼투압은 약 233 mOsm/㎏이다.
일부 방법에서, 보충물은 (i) F-12 배지; (ii) N2 보충물; (iii) 신경기저 배지; (iv) B-27 보충물; (v) L-글루타민; (vi) 2-메르캅토에탄올; 또는 (vii) (i) 내지 (vi)의 임의의 조합을 포함한다. 일부 방법에서, LIF 폴리펩티드는 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이다. 일부 방법에서, GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함한다. 일부 방법에서, MEK 억제제는 PD0325901을 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지는 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지는 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM를 포함한다.
일부 방법에서, 저삼투압 배지는 bFGF 보충물; TGF-β1 보충물; JNK 억제제; p38 억제제; ROCK 억제제 및 PKC 억제제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 일부 방법에서, 저삼투압 배지는 bFGF 보충물을 포함하지 않는다.
일부 방법에서, hiPSC는 매트리겔, NuFF 배양보조세포 또는 겔트렉스 상에서 배양된다.
상기 방법 중 어느 하나에 의해 제조되는 변형 hiPSC가 추가로 제공된다.
(a) hiPSC의 집단; 및 (b) 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지를 포함하는 생체외 배양물이 추가로 제공되며, 여기서, 저삼투압 배지는 (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (iii) MEK 억제제를 포함하고; 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 생체외 배양물은 (a) hiPSC의 집단; 및 (b) 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지를 또한 포함할 수 있으며, 여기서, 저삼투압 배지는 (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (iii) MEK 억제제를 포함하고; 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다.
기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 제조되거나 유지되는 hiPSC의 집단이 추가로 제공되며, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하고; 배지의 삼투압은 약 175 mOsm/㎏ 내지 약 280 mOsm/㎏이다. 이러한 hiPSC의 집단은 또한 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 제조되거나 유지될 수 있으며, 여기서, 저삼투압 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및 (c) MEK 억제제를 포함하고; 기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC를 포함한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 완전-유사 hiPSC를 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로부터 유래된다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, Myc또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍 유전자를 발현한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 준 hiPSC를 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 기본 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏이다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 기본 배지는 NaCl 약 3 mg/ml 및 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 삼투압이 약 200 mOsm/㎏이다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 본 배지는 글루코스 약 4.5 mg/mL를 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지의 삼투압은 약 200 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏이다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 저삼투압 배지의 삼투압은 약 233 mOsm/㎏이다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 보충물은 (a) F-12 배지; (b) N2 보충물; (c) 신경기저 배지; (d) B-27 보충물; (e) L-글루타민; (f) 2-메르캅토에탄올; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합을 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, LIF 폴리펩티드는 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, MEK 억제제는 PD0325901을 포함한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 저삼투압 배지는 GSK3 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 저삼투압 배지는 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM를 포함한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 저삼투압 배지는 bFGF 보충물, TGF-β1 보충물, JNK 억제제, p38 억제제, ROCK 억제제 및 PKC 억제제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 저삼투압 배지는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함하지 않는다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC 또는 형질전환된 세포는 매트리겔™, 신생아 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 배양보조세포 또는 겔트렉스™ 상에서 배양된다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 하나 이상의 만능성 마커는 NANOG, 알칼리 포스파타아제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 정상 핵형을 갖는다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, iPSC는 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 계대배양될 수 있다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 효소적 해리는 트립신을 사용하여 수행된다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 효소적 해리는 Rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제의 부재 하에 수행될 수 있다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 계대배양된 hiPSC는 하나 이상의 만능성 마커를 계속해서 발현한다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 계대배양된 hiPSC는 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 계대배양된 hiPSC는 정상 핵형을 유지한다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, hiPSC는 약 16시간 내지 약 24시간의 배가 시간을 갖는다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 먼저 배양된 후, 저삼투압 배지에서 배양된다. 선택적으로, 고삼투압 배지의 삼투압은 약 290 mOsm/㎏ 이상이다.
일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 약 2개월 동안 고삼투압 배지에서 먼저 배양된다. 일부 집단 또는 생체외 배양물에서, 형질전환된 세포는 3차원 세포 덩어리를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낼 때까지 먼저 고삼투압 배지에서 배양된다.
도 1은 인간 iPS 세포에서 LTVEC 및 가이드 RNA를 사용하여 인간 ADAM6 유전자좌의 일부의 마우스 Adam6a 및 마우스 Adam6b 유전자좌를 포함하는 핵산으로의 치환의 개략도를 도시한다. 가이드 RNA에 대한 표적 부위를 화살표로 나타낸다.
도 2a는 8일 동안 2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타난 모폴로지를 도시한다.
도 2b는 12일 동안 2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타난 모폴로지를 도시한다.
도 3a 내지 도 3d는 6일 동안 mTeSR™-hLIF 배지 또는 저삼투압 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포의 모폴로지를 도시한다. 도 3a 및 도 3b는 6일 동안 mTeSR™-hLIF 배지 (도 3a) 또는 VG2i 배지 (도 3b)에서 배양된 인간 iPS 세포의 모폴로지를 도시한다. 도 3c 및 3d는 6일 동안 mTeSR™-hLIF 배지 (도 3c) 또는r VG2i 배지 (도 3d)에서 신생아 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 배양보조세포 상에서 배양된 인간 iPS 세포의 모폴로지를 도시한다.
도 4a는 알칼리 포스파타아제에 대하여 염색되는 VG2i 배지에서 배양된, 리프로그래밍된 인간 iPS 세포를 도시한다. 도 4b 및 도 4c는 NANOG의 발현에 대하여 면역염색되는 VG2i 배지에서 배양된, 리프로그래밍된 인간 iPS 세포를 도시한다.
도 5a 내지 5c는 VG2i 배지에서 배양된, 리프로그래밍된 인간 iPS 세포의 효소적 해리 및 계대배양을 도시한다. 도 5a는 ROCK 억제제의 부재 하에 트립신을 사용한 효소적 해리 전에 VG2i 배지에서 배양된 리프로그래밍된 인간 iPS 세포를 도시한다. 도 5b는 계대배양 후 1일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 도시한다. 도 5c는 계대배양 후 4일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 트립신을 사용하여 해리한 후, 계대 10에서 2개의 상이한 인간 iPS 세포 클론으로부터의 세포의 핵형을 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호: 1은 ADAM6 gRNA로 이루어진 핵산 서열을 나타낸다.
서열 번호: 2는 CRISPR/Cas 복합체 표적 서열의 핵산 서열을 나타낸다.
정의
본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 암호화 및 비암호화된 아미노산, 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 용어는 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함한다. 이들은 단일 가닥, 이중 가닥 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
"코돈 최적화"는 일반적으로 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 치환함으로써 특정 숙주 세포에서의 발현 향상을 위해 핵산 서열을 변형시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 변형되어 인간 세포에서 사용 빈도가 더 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 코돈 사용 빈도 표는 예를 들어, "코돈 사용 빈도 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 용이하게 이용할 수 있다. 이러한 표는 다양한 방법으로 조정될 수 있다. 문헌[Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292]을 참조한다. 특정 숙주에서의 발현을 위해 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘도 이용가능하다(예를 들어, 문헌[Gene Forge] 참조한다).
"작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 성분 (예를 들어, 프로모터 및 다른 서열 요소)의 병렬(juxtaposition)을 포함하는데, 두 성분이 정상적으로 기능하고, 이들 성분 중에서 적어도 하나가 적어도 하나의 다른 성분에 미치는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 유무에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우에, 암호화 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산의 "상보성"은 하나의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 서열이 이의 핵염기 그룹의 배향으로 인해, 대향하는 핵산 가닥 상의 다른 서열과 수소 결합을 형성한다는 것을 의미한다. DNA에서 상보적 염기는 전형적으로 A와 T, C와 G이다. RNA에서, 이들은 전형적으로 C와 G, U와 A이다. 상보성은 완전하거나 상당하거나/충분할 수 있다. 2개의 핵산 사이의 완전한 상보성은 2개의 핵산이, 이중 나선 구조의 모든 염기가 왓슨-크릭 염기 결합(Watson-Crick pairing)에 의해 상보적 염기에 결합되는 이중 나선 구조를 형성할 수 있음을 의미한다. "상당한" 또는 "충분한" 상보성은 한 가닥의 서열이 대향하는 가닥의 서열에 전적으로 및/또는 완전히 상보적이지 않지만, 일련의 혼성화 조건 (예를 들어, 염 농도 및 온도)에서 안정한 하이브리드 복합체를 형성하도록 두 가닥 상의 염기 사이에 충분한 결합이 일어남을 의미한다. 이러한 조건은 혼성화된 가닥의 Tm을 예측하는 서열 및 표준 수학적 계산을 이용하여 예측될 수 있거나, 일상적인 방법을 이용하여 Tm의 경험적 결정에 의해 예측될 수 있다. Tm은 2개의 핵산 가닥 사이에 형성된 혼성화 복합체 집단이 50% 변성된 온도를 포함한다. Tm보다 낮은 온도에서는 혼성화 복합체의 형성이 촉진되는 반면에, Tm보다 높은 온도에서는 혼성화 복합체의 가닥의 용융 또는 분리가 촉진된다. 다른 알려진 Tm 계산은 핵산의 구조적 특성을 고려하지만, Tm은 예를 들어, Tm=81.5+0.41(% G+C)을 사용하여 1 M NaCl 수용액 중의 알려진 G+C 함량을 갖는 핵산에 대하여 추정될 수 있다.
"혼성화 조건"은 하나의 핵산 가닥이 상보적 가닥 상호작용 및 수소 결합에 의해 제2 핵산 가닥에 결합하여 혼성화 복합체를 생성하는 누적 환경을 포함한다. 이러한 조건은 핵산을 함유하는 수용액 또는 유기 용액의 화학 성분 및 이의 농도 (예를 들어, 염, 킬레이트제, 포름아미드) 및 혼합물의 온도를 포함한다. 다른 인자, 예컨대 배양 기간 또는 반응 챔버 치수가 환경에 기여할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]을 참조한다.
혼성화는 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능하지만, 2개의 핵산이 상보성 서열을 포함하는 것을 필요로 한다. 2개의 핵산 간의 혼성화에 적합한 조건은 본 기술 분야에 잘 알려진 변수인 핵산 길이 및 상보성 정도에 따라 다르다. 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 상보성 정도가 클수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 용융 온도(Tm)의 값이 커진다. 짧은 스트레치(stretch)의 상보성 (예를 들어, 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 22개 이하, 20개 이하 또는 18개 이하의 뉴클레오티드에 대한 상보성)을 갖는 핵산 간의 혼성화의 경우, 미스매치 위치가 중요해진다 (문헌[Sambrook et al., supra, 11.7-11.8]을 참조한다). 전형적으로, 혼성화 가능한 핵산 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드로 되어 있다. 혼성화 가능한 핵산의 최소 길이의 예에는 적어도 약 15개의 뉴클레오티드, 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 적어도 약 22개의 뉴클레오티드, 적어도 약 25개의 뉴클레오티드 및 적어도 약 30개의 뉴클레오티드가 포함한다. 게다가, 온도 및 세정액 염 농도는 필요에 따라, 인자, 예컨대 상보성 영역의 길이 및 상보성 정도에 따라 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 서열은 특이적으로 혼성화 가능하게 되는 이의 표적 핵산의 서열에 대하여 100% 상보성을 나타낼 필요는 없다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는 개재 또는 인접 세그먼트가 혼성화 이벤트 (예를 들어, 루프(loop) 구조 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 세그먼트에 대하여 혼성화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, gRNA)는 이들이 표적으로 하는 표적 핵산 서열 내의 표적 부위에 대하여, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개 중 18개의 뉴클레오티드가 표적 부위에 상보적이므로, 특이적으로 혼성화되는 gRNA는 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 나머지 비상보적 뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드와 클러스터를 이루거나 그 사이에 상보적 뉴클레오티드가 배치될 수 있으며, 서로 인접하거나 상보적 뉴클레오티드에 인접할 필요는 없다.
핵산 내의 특정 스트레치의 핵산 서열 간의 상보성 비율(percent complementarity)은 통상, 본 기술 분야에 알려진 BLAST 프로그램 (기본 국소 정렬 검색 도구(basic local alignment search tools)) 및 PowerBLAST 프로그램 (문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656])을 사용하거나, 스미스(Smith) 및 와트만(Waterman)의 알고리즘 (문헌[Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489])을 사용하는 디폴트 설정을 이용한 Gap 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 유니버시티 리서치 파크(University Research Park), 위스콘신주 메디슨 소재)을 사용하여 측정될 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정 비교창 상에서, 최대 일치도로 정렬되는 경우에 동일한 2개의 서열의 잔기를 말한다. 서열 동일성 비율이 단백질과 관련하여 사용되는 경우에, 동일하지 않은 잔기 위치가 종종 보존 아미노산 치환에 따라 다르며, 여기서 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)의 다른 아미노산 잔기 대신에 사용되므로, 분자의 기능 특성을 변경시키지 않음이 인지된다. 서열이 보존적 치환에 있어서 상이한 경우에는, 서열 동일성 비율은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 따라 다른 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조정을 행하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이는 보존적 치환을 완전 미스매치보다는 부분 미스매치로서 스코어링하여(scoring), 서열 동일성 비율을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산은 스코어 1로 주어지고, 비보존적 치환은 스코어 0으로 주어지며, 보존적 치환은 0과 1 사이의 스코어로 주어진다. 보존적 치환의 스코어는 예를 들어, 프로그램 PC/GENE(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics))으로 실행되는 바와 같이 계산된다.
"서열 동일성 비율"은 비교창 상에 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된 값을 포함하며, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 개수를 측정하여 일치하는 위치의 개수를 산출하고, 일치하는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 비율을 산출함으로써 그 비율을 계산한다.
달리 명시되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 하기 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 이용하여 구한 값을 포함한다: GAP 중량(Weight) 50 및 길이 중량(Length Weight) 3, 및 nwsgapdna.cmp 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용한 뉴클레오티드 서열의 % 동일성 및 % 유사성; GAP 중량 8 및 길이 중량 2, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용한 아미노산 서열의 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이의 임의의 등가 프로그램. "등가 프로그램"은 임의의 서열 비교 프로그램을 포함하는데, 당해 임의의 2개의 서열의 경우, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응 정렬과 비교하여, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 % 서열 동일성을 갖는 정렬을 얻는다.
하나 이상의 열거된 요소를 "포함하는(comprising 또는 including)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 조성물은 단백질을 단독으로 포함하거나, 다른 성분과 조합하여 포함할 수 있다.
값의 범위의 지정은 해당 범위 내의 또는 그 범위를 한정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수로 한정되는 모든 부분적인 범위를 포함한다.
용어 "약"은 지정된 값이 일정 비율로 다를 수 있음을 의미한다. 일부 예에서, 비율은 지정된 값의 1, 2, 3, 4, 8 또는 10%일 수 있다.
문맥상 달리 명확히 지시하지 않는 한, 관사의 단수형("a", "an" 및 "the")은 복수형 지시 대상(plural reference)을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포" 또는 "하나 이상의 세포"는 이의 혼합물을 포함하는, 복수의 세포를 포함할 수 있다.
A. 인간 유도 만능 줄기 세포를 제조 및 유지하기 위한 저삼투압 배지.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 일 실시 형태에서, 배지는 인간 iPS 세포의 집단을 제조하는 데 적합하다. 다른 실시 형태에서, 배지는 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는 데 적합하다. 일부 실시 형태에서, 인간 iPS 세포는 완전 또는 완전해 보이는 것이다.
본 명세서에서 제공되는 배지는 적어도 기본 배지, 보충물, 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드, 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 (MEK) 억제제를 포함한다. "기본 배지" 또는 "기본 배지들"은, 예를 들어, 배양물에서 만능성 세포 (예를 들어, iPS 세포)를 성장시키거나 유지하는데 사용하기 적합한 (보충물이 첨가됨), 본 기술 분야에 알려진 기본 배지 (예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM))를 포함한다. 기본 배지는 배양물에서 세포를 유지하는데 사용되는 경우에 전형적으로 본 기술 분야에서 알려진 다수의 보충물로 보충된다.
본 발명의 배지는 저삼투압 배지이다. 일 예에서, 삼투압은 약 175 내지 280 mOsm/㎏이다. 추가의 예에서, 배지의 삼투압은 약 180 내지 270 mOsm/㎏, 약 200 내지 250 mOsm/㎏, 약 220 내지 240 mOsm/㎏ 또는 약 225 내지 235 mOsm이다. 특정 실시 형태에서, 배지의 삼투압은 약 233 mOsm/㎏이다.
본 발명에 제공된 기본 배지는 보충물이 첨가된 저삼투압 기본 배지이다. 본 발명의 기본 배지는 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는 데 전형적으로 사용되는 기본 배지와 상이하며, 이는 다양한 형태의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (예를 들어, 인비트로겐(Invitrogen) DMEM, 카탈로그 번호 1 1971 -025) 및 KO-DMEM™ (인비트로겐 카탈로그 번호 10829-018)으로 시판되는 저염 DMEM을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 기본 배지는 저삼투압 배지이나, 저삼투압에 한정되지 않는 특성을 나타낸다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 DMEM 제형은 염화나트륨 및/또는 중탄산나트륨 농도를 본 명세서에서 제공되는 바와 같이 변경함으로써 본 발명의 목적에 적합하게 만들어질 수 있으며, 표 1에 나타낸 표준 DMEM 기본 배지 또는 저염 DMEM 기본 배지 (KO-DMEM)와 비교하여 상이한 삼투압을 초래할 것이다.
[표 1]
Figure pct00004
본 발명의 기본 배지는 알칼리 금속 및 할로겐화물, 예컨대 염화나트륨 (NaCl)의 염을 포함할 수 있다. 기본 배지 중의 NaCl의 예시적인 농도는 50 ± 5 mM 또는 약 3 mg/mL를 포함한다. 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지 중의 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염의 농도는, 예를 들어, 약 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 mM 이하일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염의 농도를 약 50 내지 110, 60 내지 105, 70 내지 95, 80 내지 90, 90 mM 또는 85 mM을 포함할 수 있다. 대안적으로, 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염의 농도는, 예를 들어, 50 ± 5 mM, 87 ± 5 mM, 110 ± 5 mM, 약 3 mg/mL, 약 5.1 mg/mL 또는 약 6.4 mg/mL일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 기본 배지는 탄산염의 농도를 나타낸다. 탄산염은 나트륨염일 수 있다. 이러한 예에서, 나트륨염은 중탄산나트륨일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 중탄산나트륨은 기본 배지에 약 26 ± 5 mM 또는 약 2.2 mg/mL 농도로 존재한다. 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지 중의 탄산염의 농도는, 예를 들어, 45, 40, 35, 30, 25 또는 20 mM 이하일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 기본 배지에 탄산염을 약 10 내지 40, 18 내지 44, 17 내지 30, 18 내지 26, 13 내지 25, 20 내지 30, 25 내지 26, 18 또는 26 mM 농도로 포함할 수 있다. 대안적으로, 탄산염의 농도는, 예를 들어, 18 ± 5 mM, 26 ± 5 mM, 약 1.5 mg/mL 또는 약 2.2 mg/mL일 수 있다.
기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지 중의, 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염과 탄산염의 농도의 합은, 예를 들어, 140, 130, 120, 110, 100, 90 또는 80 mM 이하일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염과 탄산염의 농도의 합을 약 80 내지 140, 85 내지 130, 90 내지 120, 95 내지 120, 100 내지 120 또는 115 mM 포함할 수 있다.
기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지 중의 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염, 및 탄산염의 몰비는, 예를 들어, 2.5 초과일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염, 및 탄산염의 몰비를 약 2.6 내지 4.0, 2.8 내지 3.8, 3.0 내지 3.6, 3.2 내지 3.4, 3.3 내지 3.5 또는 3.4로 포함할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 기본 배지는 저삼투압 기본 배지이다. 기본 배지의 삼투압은 약 175 내지 280 mOsm/㎏, 약 180 내지 250 mOsm/㎏, 약 190 내지 225 mOsm/㎏ 또는 약 195 내지 205 mOsm/㎏ 범위 내일 수 있다. 기본 배지의 예시적인 삼투압은 200, 214, 216 또는 218 mOsm/㎏일 수 있다. 특정 예에서, 기본 배지의 삼투압은 200 mOsm/㎏이다. 삼투압은 세포가 상이한 농도의 CO2에서 배양되는 경우 측정될 수 있다. 일부 예에서, 세포는 3% CO2 또는 5% CO2에서 배양된다. 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 330, 320, 310, 300, 290, 280, 275, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210 또는 200 mOsm/㎏ 이하일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 약 200 내지 329, 218 내지 322, 240 내지 320, 250 내지 310, 275 내지 295 또는 260 내지 300 mOsm/㎏의 삼투압을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기본 배지, 또는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지는 약 270 mOsm/㎏, 약 261 mOsm/㎏ 또는 약 218 mOsm/㎏의 삼투압을 포함할 수 있다. 대안적으로, 삼투압은 218 ± 22 mOsm/㎏, 261 ± 26 mOsm/㎏, 294 ± 29 mOsm/㎏ 또는 322 ± 32 mOsm/㎏일 수 있다.
기본 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 130 내지 270, 140 내지 260, 150 내지 250, 160 내지 240, 170 내지 230, 180 내지 220, 190 내지 210, 195 내지 205 또는 200 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 200 ± 70, 200 ± 60, 200 ± 50, 200 ± 40, 200 ±35, 200 ± 30, 200 ± 25, 200 ± 20, 200 ± 15, 200 ± 10, 200 ± 5 또는 200 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 130 내지 140, 약 140 내지 150, 약 150 내지 160, 약 160 내지 170, 약 170 내지 180, 약 180 내지 190, 약 190 내지 200, 약 200 내지 210, 약 210 내지 220, 약 220 내지 230, 약 230 내지 240, 약 240 내지 250, 약 250 내지 260, 약 260 내지 270, 약 270 내지 280, 약 280 내지 290, 약 290 내지 300, 약 300 내지 310, 약 310 내지 320 또는 약 320 내지 330 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140 또는 130 mOsm/㎏ 미만일 수 있다.
기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 205 내지 260, 215 내지 250, 225 내지 240, 230 내지 235 또는 233 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 233 ± 27, 233 ± 25, 233 ± 20, 233 ± 15, 233 ± 10, 233 ± 5 또는 233 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 200 내지 205, 205 내지 210, 210 내지 215, 215 내지 220, 220 내지 225, 225 내지 230, 230 내지 235, 235 내지 240, 240 내지 245, 245 내지 250, 250 내지 255 또는 255 내지 260 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충물을 포함하는 배지의 삼투압은, 예를 들어, 260, 255, 250, 245, 240, 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205 또는 200 mOsm/㎏ 미만일 수 있다.
일부 저삼투압 배지에서, 기본 배지는 NaCl 약 87 ± 5 mM 및 탄산염 약 26 ± 5 mM을 포함한다. 예를 들어, 기본 배지는 NaCl 약 5.1 mg/mL, 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함할 수 있으며, 삼투압은 약 275 mOsm/㎏이다.
일부 저삼투압 배지에서, 기본 배지는 NaCl 약 50 ± 5 mM 및 탄산염 약 26 ± 5 mM을 포함한다. 예를 들어, 기본 배지는 NaCl 약 3.0 mg/mL, 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함할 수 있으며, 삼투압은 약 200 mOsm/㎏이다. 바람직한 실시 형태에서, 기본 배지는 3.0 mg/mL 농도의 NaCl, 약 2.2 mg/mL 농도의 중탄산나트륨을 포함하며, 삼투압은 200 mOsm/㎏이다.
저삼투압 배지의 다른 예가 각각 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2011/156723, US 2011/0307968 및 US 2015/0067901에 기재되어 있다.
본 발명의 기본 배지와 제형화된 보충물은 본 명세서에 개시된 인간 iPS 세포의 집단을 제조하거나, 유지하거나, 풍부하게 하는 데 적합하다. 이러한 보충물은 본 명세서에서 "보충물" 또는 "+ 보충물"로 표시된다. 용어 "보충물" 또는 어구 "+ 보충물"은 표 1에 기재된 기본 배지의 성분에 첨가된 하나 이상의 추가의 요소를 포함한다. 예를 들어, 보충물은 F-12® 배지 (깁코(Gibco)), N2® 보충물 (깁코; 100X 용액), 신경기저(NEUROBASAL)® 배지 (깁코), B-27® 보충물 (깁코; 50X 용액), L-글루타민, 글루코스, 2-메르캅토에탄올, 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드, 글리코겐 합성효소 키나제 3 억제제, MEK 억제제 또는 이들의 임의의 조합을 제한없이 포함할 수 있다. 보충물은, 예를 들어, 소 태아 혈청 (FBS), 항생제(들), 페니실린 및 스트렙토마이신 (즉, 펜스트렙(penstrep)), 피루브산염 (예를 들어, 피르부산나트륨) 및 비필수 아미노산 (예를 들어, MEM NEAA)을 또한 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, LIF 폴리펩티드는 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이다. 일부 예에서, hLIF 폴리펩티드는 약 1 내지 1000 단위/mL, 약 20 내지 800 단위/mL, 약 50 내지 500 단위/mL, 약 75 내지 250 단위/mL 또는 약 100 단위/mL의 농도로 사용된다.
배지는, 예를 들어, GSK3 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 배지는 GSK3 억제제 및 MEK 억제제로 이루어진 억제제를 포함할 수 있다.
다른 특정 실시 형태에서, GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함한다. 일부 예에서, CHIR99021은 약 0.1 내지 10 μM, 약 1 내지 5 μM, 약 2 내지 4 μM 또는 약 3 μM의 농도로 사용된다.
다른 특정 실시 형태에서, MEK 억제제는 PD0325901을 포함한다. 일부 예에서, PD0325901은 약 0.1 내지 5 μM, 약 0.2 내지 1 μM, 약 0.3 내지 0.7 μM 또는 약 0.5 μM의 농도로 사용된다.
예시적인 배지는 본 명세서에 기재된 저삼투압 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM을 포함한다.
다른 특정 실시 형태에서, 배지는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FGF2 또는 FGF-β로도 알려진 bFGF)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 배지는 bFGF를 포함하지 않는다.
배지는 하나 이상의 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGF-β1) 보충물, bFGF 보충물, c-Jun N-말단 키나제 (JNK) 억제제 (예를 들어, SP600125), p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (p38) 억제제 (예를 들어, SB203580), rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 (예를 들어, Y-27632) 및 단백질 키나제 C (PKC) 억제제 (예를 들어, Go6983)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 배지는 포스콜린을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 배지는 하나 이상의 TGF-β1 보충물, bFGF 보충물, JNK 억제제 (예를 들어, SP600125), p38 억제제 (예를 들어, SB203580), ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632) 및 PKC 억제제 (예를 들어, Go6983)를 포함하지 않는다. 일부 배지는 하나 이상의 p38 억제제 및 JNK 억제제를 포함하지 않는다. 일부 배지는 bFGF 보충물 또는 TGF-β1 보충물을 포함하지 않는다. 일부 배지는 TGF-β1 보충물을 포함하지 않는다. 일부 배지는 TGF-β1 보충물, bFGF 보충물, JNK 억제제 (예를 들어, SP600125), p38 억제제 (예를 들어, SB203580), ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632) 및 PKC 억제제 (예를 들어, Go6983) 중 어느 것도 포함하지 않는다. 일부 배지는 포스콜린을 포함하지 않는다.
B. 인간 유도 만능 줄기 세포
인간 iPS 세포의 집단을 제조하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는 방법 및 조성물이 추가로 제공된다. 배양물에서 생성되거나 유지되는 인간 iPS 세포가 또한 제공된다.
용어 "만능성 세포" 또는 "만능 줄기 세포"는 1개 초과의 분화된 세포 유형으로 발현하는 능력을 갖는 미분화 세포를 포함한다. 이러한 만능성 세포는, 예를 들어, 포유류 배아줄기 (ES 세포) 세포 또는 포유류 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포)일 수 있다. 만능성 세포의 예는 인간 iPS 세포를 포함한다.
용어 "배아줄기 세포" 또는 "ES 세포"는 배반포의 내세포괴로부터 유래된, 적합한 조건 하에 생체외 배양물에서 유지될 수 있는 배아-유래 전능 또는 만능 줄기 세포를 의미한다. ES 세포는 척추동물의 삼배엽층, 예를 들어, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있다. ES 세포는 또한 적합한 생체외 배양 조건 하에 무기한으로 증식시키는 그들의 능력을 특징으로 한다. 예를 들어, 문헌[Thomson et al. (Science (1998) Vol. 282(5391), pp. 1145-1147)]을 참조한다.
용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 분화된 성인 세포로부터 직접 유래될 수 있는 만능 줄기 세포를 포함한다. 인간 iPS 세포는 리프로그래밍 인자의 특정 세트를 비만능성 세포로 도입함으로써 생성될 수 있으며, 이는 예를 들어, Oct3/4, Sox 패밀리 전사 인자 (예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15), Myc 패밀리 전사 인자 (예를 들어, c-Myc, l-Myc, n-Myc),
Figure pct00005
-유사 패밀리 (KLF) 전사 인자 (예를 들어, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5) 및/또는 관련 전사 인자, 예컨대 NANOG, LIN28 및/또는 Glis1을 포함할 수 있다. 또한, 인간 iPS 세포는 예를 들어, 전사 인자의 작용을 모방하는 소분자인 miRNA 또는 계통 지정자(specifier)를 사용하여 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 척추동물의 삼배엽층, 예를 들어, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있는 이들의 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는 또한 적합한 생체외 배양 조건 하에 무기한으로 증식시키는 그들의 능력을 특징으로 한다. 예를 들어, 문헌[Takahashi and Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676)]을 참조한다.
용어 "완전" 및 "준"은 인간 iPS 세포의 상이한 만능성 상태를 식별한다. 용어 "완전해 보이는"은 하나 이상의 완전 만능성 세포의 특성을 나타내는, 만능 상태를 발현하는 세포를 식별한다. 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 "완전-유사" 인간 iPS 세포로도 불릴 수 있다. 용어 "완전해 보이는" 및 "완전-유사"는 등가물로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 완전 인간 iPS 세포의 하나 이상의 모폴로지 특성, 예컨대 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 완전 인간 iPS 세포이다. 다른 실시 형태에서, 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 완전해 보이는 iPS 세포이다.
완전 및 준 iPS 세포의 특성이 본 기술 분야에 기재되어 있다. 예를 들어,문헌[Nichols and Smith (Cell Stem Cell (2009) Vol. 4(6), pp. 487-492)]을 참조한다. 완전 인간 iPS 세포는 착상 전 배아의 내세포괴의 ES 세포와 유사한 만능성 상태를 보인다. 이러한 완전 세포는 계통 특정화 및 결정에 대해 프라이밍(primed)되지 않는다. 암컷 완전 iPS 세포는 2개의 활성 X 염색체를 특징으로 한다. 배양 중, 완전 인간 iPS 세포의 자가 재생은 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 다른 억제제에 따라 다르다. 배양된 완전 인간 iPS 세포는 둥근 돔형 콜로니 및 정단-기저(apico-basal) 극성의 결여를 특징으로 하는 클론 모폴로지를 나타낸다. 배양된 완전 세포는 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같은 하나 이상의 만능성 마커를 추가로 나타낼 수 있다. 적절한 조건 하에서, 배양 중인 완전 인간 iPS 세포의 배가 시간은 16 내지 24시간일 수 있다.
준 인간 iPS 세포는 착상 후 배반엽 상피세포와 유사한 만능성 상태를 발현한다. 이러한 세포는 계통 특정화 및 결정에 대해 프라이밍된다. 암컷 준 iPS 세포는 하나의 활성 X 염색체와 하나의 비활성 X 염색체를 특징으로 한다. 배양 중, 준 인간 iPS 세포의 자가 재생은 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 및 액티빈에 따라 다르다. 배양된 준 인간 iPS 세포는 상피 단층을 특징으로 하는 클론 모폴로지를 나타내며, 정단-기저 극성을 나타낸다. 적절한 조건 하에서, 배양 중인 준 인간 iPS 세포의 배가 시간은 24시간 이상일 수 있다.
일 실시 형태에서, 인간 iPS 세포는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 형질전환된 세포는, 예를 들어, 만능성을 유도하는 리프로그래밍 유전자를 발현하도록 형질전환되는 세포를 포함한다. 만능 상태는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 만능성 마커의 발현을 포함할 수 있다. 이러한 세포 (예를 들어, 인간 포피 섬유아세포)는 리프로그래밍 유전자 또는 임의의 추가의 목적 유전자를 발현하도록 본 기술 분야에서 알려진 임의의 수단에 의해 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Takahashi and Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676)]을 참조한다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 플라스미드, 렌티바이러스 벡터 또는 베트로바이러스 벡터를 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 게놈으로 통합되고, 리프로그래밍이 완료된 후 제거될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 비만능성 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, Myc 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍 유전자로 형질전환된다. 일부 예에서, 형질전환된 세포는 준 인간 iPS 세포를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 완전 상태의 하나 이상의 표현형, 유전자 발현 프로파일 또는 마커 특성을 발현한다. 일 예에서, 인간 iPS 세포는 하나 이상의 만능성 마커를 발현하며, 이의 발현은 완전 상태를 나타낸다. 이러한 만능성 마커에는 알칼리 포스파타아제, NANOG, 5T4, ABCG2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, E-카데린, Cbx2, CD9, CD30/TNFRSF8, CD117/c-키트, CDX2, CHD1, 크립토(Cripto), DNMT3B, DPPA2, DPPA4, DPPA5/ESG1, EpCAM/TROP1, ERR 베타/NR3B2, ESGP, F-박스 단백질 15/FBXO15, FGF-4, FGF-5, FoxD3, GBX2, GCNF/NR6A1, GDF-3, Gi24/VISTA/B7-H5, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 알파 6 베타 1, 인테그린 알파 6 베타 4, 인테그린 베타 1/CD29, KLF4, KLF5, L1TD1, 레프티, 레프티-1, 레프티-A, LIN-28A, LIN-28B, LIN-41, cMaf, cMyc, Oct-3/4, Oct-4A, 포도칼릭신(Podocalyxin), Rex-1/ZFP42, Smad2, Smad2/3, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, 스텔라/Dppa3, SUZ12, TBX2, TBX3, TBX5, TERT, TEX19, TEX19.1, THAP11, TRA-1-60(R), TROP-2, UTF1 및/또는 ZIC3이 포함될 수 있다. 특정 예에서, 발현된 만능성 마커는 알칼리 포스파타아제, NANOG 또는 둘 모두이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 완전 상태를 나타내는 모폴로지 특성을 나타낸다. 예시적인 모폴로지는 배양물에서 조밀한 돔형 콜로니를 갖는 세포를 특징으로 한다.
본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 정상 핵형을 가질 수 있다. 정상 핵형은 통상 종의 특성인 모든 염색체가 존재하며, 현저하게 변형되지 않은 핵형, 또는 염색체 밴딩 분석으로 검출가능한 임의의 가시적인 수치적 또는 구조적 염색체 이상이 결여된 세포의 상태를 포함된다. 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 계대 후에 정상 핵형을 가질 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 일 수 있다 기계적으로 또는 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리, 계대 및/또는 계대배양될 수 있다. 이러한 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 정상 핵형을 가질 수 있고, 기계적으로 또는 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리, 계대 및/또는 계대배양된 후 정상 핵형을 유지할 수 있다. 예를 들어, 이러한 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포는 정상 핵형을 가질 수 있고, 기계적으로 또는 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 방법을 사용하여 표적 게놈 유전자좌에서 변형되며, 계대배양된 후 정상 핵형을 유지할 수 있다. 일 예에서, 효소적 해리는 트립신을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된 경우, 인간 iPS 세포는 단일 세포 현탁액으로의 해리 개선으로 인해 더 큰 형질전환 효율을 제공할 수 있다. 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는 데 전형적으로 사용되는 다른 유형의 배지 (예를 들어, mTeSR™ 배지 또는 2i 배지)를 사용하는 경우, 인간 iPS 세포의 해리는 기계적으로 또는 트립신보다 덜 강한(harsh) 콜라게나제와 같은 효소에 의해 수행되어야 한다. 인간 iPS 세포를 단일 세포로 계대하는 것이 세포 집단에, 예를 들어, 배양 중 유전자 이상을 일으킬 수 있는 원하지 않는 선택적 압력(selective pressure)을 가하는 것으로 입증되어, 일반적으로 권장되지 않는다. 인간 iPS 세포는 세포 분리 및 해리시 세포자멸(apoptosis)에 취약하며, 전형적으로 해리가 완료된 후 대규모 세포 사멸을 경험한다. 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌[Watanabe et al. (2007) Nature 25(6):681-686]을 참조한다. 따라서, 인간 iPS 세포의 해리는 전형적으로 계대시 콜로니의 분열을 최소화하고 단일 세포 현탁액을 생성하지 않는 시약 또는 방법으로 수행된다. 결과적으로, 세포는 효과적으로 또는 완전하게 해리되지 않는다. 그러나, 완전한 해리는 유전자 전이 후 클론 단리 또는 표적화된 유전자 변형의 생성과 같은 절차에 중요할 수 있는데, 특히 상동 재조합을 수행하여 원하는 표적화된 변형을 생성하는 것들과 같은 상대적으로 희귀한(rare) 클론을 단리하려 하는 경우 그러하다. 대조적으로, 본 발명의 저삼투압 배지의 경우, 트립신을 사용하여 세포를 해리할 수 있으며, 개선된 해리는 형질전환 효율을 증가시킨다. 예를 들어, 이러한 해리는 예를 들어, 전기천공을 통해 또는 본 명세서의 다른 부분에 기재된 표적화된 유전자 변형의 제조 방법을 사용하여 표적화하는 경우, 더 큰 표적 효율을 초래하는 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다. 또한, 배양물에서 인간 iPS 세포 (예를 들어, mTeSR™ 배지 또는 2i 배지)를 유지하는 데 전형적으로 사용되는 다른 유형의 배지와 다르게, 본 발명의 저삼투압 배지 (바람직하게는 bFGF를 포함하지 않는 저삼투압 배지)로 배양된 인간 iPS 세포의 효소적 해리는 일반적으로 이러한 세포의 계대에 필요한 하나 이상의 억제제의 부재 하에 수행될 수 있다. 제거될 수 있는 예시적인 억제제는 Rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 억제제이다. ROCK 억제제는 일반적으로 인간 iPS 세포를 계대하여 세포자멸-촉진(pro-apoptotic) 경로의 활성화를 억제하는 경우 필요하다. 특히, 세포 생존을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문에, 인간 iPS 세포의 단일 세포 현탁액을 도말하는 경우 ROCK 억제제의 첨가가 일반적으로 권장된다. 문헌[Watanabe et al. (2007) Nature 25(6):681-686]을 참조한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 저삼투압 배지를 사용하는 경우, 심지어 단일 세포 현탁액으로서 계대하는 경우에도 이러한 ROCK 억제제가 필요하지 않다. 본 명세서에 개시된 저삼투압 배지를 사용하는 경우, 이러한 단일 세포 현탁액은 트립신처리 및 재도말 후 만능성 및 정상 핵형을 유지할 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양되는, 계대배양된 인간 iPS 세포는 효소적 해리 및 계대배양 후, 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지할 수 있다. 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지에서 배양되는, 계대배양된 인간 iPS 세포는 단일 세포 현탁액으로 계대되는 경우 및/또는 표적 게놈 유전자좌에서 본 명세서의 다른 부분에 기재된 방법을 사용하여 변형되는 경우에도 효소적 해리 및 계대배양 후에 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지할 수 있다. 일부 예에서, 계대배양된 인간 iPS 세포는 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 계속해서 나타낼 수 있다. 계대배양된 인간 iPS 세포는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 만능성 마커를 계속해서 발현할 수 있다.
C. 인간 유도 만능 줄기 세포의 집단을 제조하는 방법 및 유지하는 방법
생체외 배양물에서 인간 iPS 세포를 제조하는 방법 및 조성물이 제공된다. 생체외 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는 방법 및 조성물이 추가로 제공된다.
용어 "제조"는 세포 표현형, 유전자 발현 또는 둘 모두에 변화를 유도하기에 적합한 조건 하에서 세포가 완전 또는 완전해 보이는 상태를 나타내도록, 즉, 완전 인간 iPS 세포의 하나 이상의 특성을 발현하도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 리프로그래밍 인자를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 완전 또는 완전해 보이는 상태는 특정 배양 조건, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 저삼투압 배지에서의 배양에 반응하여 발현될 수 있다. 일부 예에서, 완전 또는 완전해 보이는 상태를 발현하는 세포의 비율은 배양 중인 세포의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 및 100% 이하이다.
일 실시 형태에서, 방법은 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포의 집단을 위한 생체외 배양을 풍부하게 한다. 이러한 실시 형태에서, 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 배양물에서 완전 또는 완전해 보이는 상태를 발현하지 않는 세포에 비해 우선적으로 증식될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포는 배양물로부터 선택되어, 효소에 의해 해리되고, 계대배양하여, 완전 또는 완전해 보이는 인간 iPS 세포의 농축된 집단을 생성한다.
일 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포는 적어도 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21 또는 28일의 기간 동안 또는 배양물에서 완전 또는 완전해 보이는 상태의 발현을 유도하기에 충분한 임의의 기간 동안 완전 또는 완전해 보이는 상태의 발현을 유도하기에 적합한 본 명세서에서 제공되는 배지에서 생체외 배양된다. 형질전환된 세포는 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 본 발명의 배지에서 배양될 수 있다. 때때로 형질전환된 세포는 1 내지 4주 동안 배양된다. 완전 또는 완전해 보이는 상태의 발현은 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성인, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 모폴로지 특성 또는 만능성 마커의 발현을 관찰함으로써 결정될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포는 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 발현할 때까지 본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된다. 이어서, 세포는 본 발명의 배지에서 배양되어, 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포는 먼저 고삼투압 배지에서 배양된 후 본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된다. 이러한 고삼투압 배지의 삼투압은 본 발명의 저삼투압 배지보다 크며, bFGF를 포함할 수 있다. 고삼투압 배지의 삼투압은, 예를 들어, 약 300 내지 380, 310 내지 370, 320 내지 360, 330 내지 350 또는 340 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 고삼투압 배지의 삼투압은, 예를 들어, 340 ± 70, 340 ± 60, 340 ± 50, 340 ± 40, 340 ± 30, 340 ± 20 또는 340 ± 10 mOsm/㎏일 수 있다. 예를 들어, 고삼투압 배지의 삼투압은 약 270 내지 280, 280 내지 290, 290 내지 300, 300 내지 310, 310 내지 320, 320 내지 330, 330 내지 340, 340 내지 350, 350 내지 360, 360 내지 370, 370 내지 380, 380 내지 390, 390 내지 400 또는 400 내지 410 mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 고삼투압 배지의 삼투압은 약 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 또는 410 mOsm/㎏ 이상일 수 있다. 일부 고삼투압 배지는 소 혈청 알부민, bFGF, 형질전환 성장 인자 β (TGFβ), 염화리튬, 피페콜산 및 감마-아미노부티르산 (GABA) 중 하나 이상을 포함한다. 고삼투압 배지의 예에는 mTeSR™ 배지 (스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies))가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포는 먼저 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 배양될 수 있으며, 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 발현하기 시작할 때 세포가 본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된다. 일 예에서, 세포는 적어도 1, 2, 5, 10, 30, 60 또는 90일의 기간, 1, 2, 4, 8 또는 12주의 기간 또는 1일 내지 3개월의 기간 동안 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 배양될 수 있다. bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 배양을 위한 예시적인 기간은 2개월이다.
다른 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포는, 먼저 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 배양될 수 있으며, 3차원 세포 덩어리을 특징으로 하는 모폴로지를 나타내기 시작할 때 세포가 본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된다. 이러한 실시 형태에서, 3차원 덩어리를 나타내는 세포를 선택하고, 해리시켜 (예를 들어, 트립신으로), 본 명세서에 기재된 저삼투압 배지의 새로운 배양물로 옮길 수 있다.
용어 "유지하다," "유지하는" 및 "유지"는 본 명세서에 기재된 인간 iPS 세포의 적어도 하나 이상의 특성 또는 표현형의 보존을 포함한다. 이러한 특성은 완전 세포의 만능성, 세포 모폴로지, 유전자 발현 프로파일 및/또는 다른 기능 특성을 유지하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "유지하다," "유지하는" 및 "유지"는 또한 세포의 증식 및/또는 배양되는 완전 세포수의 증가를 포함할 수 있다. 용어는 세포의 준 만능 상태 또는 비만능 상태로의 전환을 방지하는 배양 조건을 포함한다. 용어는 세포가 계속 만능성 및/또는 완전성을 유지할 수 있는 배양 조건을 추가로 포함하며, 그 동안에 세포가 계속해서 분열하여 세포수가 증가할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
일 실시 형태에서, 인간 iPS 세포는 이러한 세포를 완전 또는 완전해 보이는 상태로 유지하기에 적합한, 본 명세서에서 제공되는 배지에서 생체외 배양된다. 특정 예에서, 배양된 세포가 완전 또는 완전해 보이는 상태로 유지되는 한, 인간 iPS 세포는 적합한 배지에서 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21 또는 28일의 기간 동안 또는 약 2주, 약 3주, 약 4주 또는 그 이상의 기간 동안 배양될 수 있다. 세포는 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 배양될 수 있다. 때때로 세포는 1 내지 4주 동안 배양된다. 인간 iPS 세포는, 예를 들어, 배양물에서 세포의 증식, 세포의 유전자 변형 및/또는 세포의 계대배양을 위해 충분한 임의의 기간 동안 유지될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 인간 iPS 세포 또는 비만능성 세포는 생체외 배양에 적합한 기질 또는 배양보조세포 층 상에서 배양될 수 있다. 특정 예에서, 세포는 매트리겔™ (BD 바이오사이언시스(Biosciences)) 상에서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 신생아 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 배양보조세포 상에서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 겔트렉스™ (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 상에서 배양된다. 다른 예에서, 세포는 비트로넥틴(vitronectin) (예를 들어, 비트로넥틴 XF™ (스템셀 테크놀로지스) 상에서 배양된다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명의 저삼투압 배지에서 배양된 인간 iPS 세포의 배가 시간은 준 인간 iPS 세포 또는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에 비하여 감소된다. 특정 예에서, 본 발명의 인간 iPS 세포의 배가 시간은 약 16 내지 24시간이다.
D. 유전자 변형 및 표적화된 유전자 변형을 일으키기 위한 방법
일부 실시 형태에서, 인간 iPS 세포를 제조하고 유지하는 방법은 유전자 변형을 인간 iPS 세포로 도입하는 단계를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 유전자 변형을 포함하는 인간 iPS 세포를 제공한다.
특정 실시 형태에서, 유전자 변형은 하나 이상의 내인성 핵산의 변형, 하나 이상의 내인성 핵산의 치환, 내인성 핵산의 이종성 핵산으로의 치환, 녹아웃 또는 녹인(knock-in)을 포함한다. 특정 예에서, 유전자 변형은 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 인간 iPS 세포 또는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로 도입함으로써 도입된다. 이러한 예에서, LTVEC는 세포의 게놈으로 삽입될 DNA를 포함할 수 있다.
인간 iPS 세포에서 표적화된 유전자 변형을 일으키는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 iPS 세포에서 단백질의 수준 및/또는 활성을 변형시키는 표적화된 유전자 변형을 일으키는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는, 표적화된 유전자 변형은 상동 재조합 (HR) 이벤트를 통해 표적화된 유전자 변형을 일으킬 시스템을 사용한다. 상동성-지정 수복(Homology-directed repair; HDR) 또는 HR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 할 수 있는 핵산 수복의 형태를 포함하며, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 경험하는 것)의 수복을 위한 주형으로 "공여자" 분자를 사용하고, 공여자로부터 표적으로 유전 정보를 전달한다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 이러한 전달은 절단된 표적과 공여자 사이에 형성되는 이형이중가닥(heteroduplex) DNA의 미스매치 교정 및/또는 공여자가 표적의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 데 사용되는 합성-의존성 가닥 어닐링 및/또는 관련 공정을 수반할 수 있다 일부 경우에, 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부, 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부의 카피는 표적 DNA로 통합된다. 다른 경우에는, 세포는 표적화된 게놈 위치에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 일으키는 뉴클레아제 제제를 사용하여 변형될 수 있다. 이어서, 단일 또는 이중 가닥 절단은 비상동 말단 결합 경로(NHEJ)에 의해 수복된다. NHEJ는 상동성 주형을 필요로 하지 않고, 절단 말단을 서로 직접 라이게이션하여 핵산의 이중 가닥 절단을 수복하는 것을 포함한다. NHEJ에 의한 비인접 서열의 라이게이션은 종종 이중 가닥 절단 부위 근처에 결실, 삽입 또는 전좌를 일으킬 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어, 표적화된 기능 상실 유전자 변형을 일으키는데 사용된다. 예를 들어, 표적화 플라스미드 또는 큰 표적화 벡터의 사용을 포함하는 이러한 표적화된 유전자 변형을 일으키기 위한 비제한적인 방법은 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 논의된다. 또한, 각각, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918], 문헌[Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9] 및 문헌[Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532]을 참조한다.
특정 실시 형태에서, 만능성 세포 (즉, 인간 iPS 세포)가 본 명세서에 기재된 배양 배지에서 유지되는 동안 임의의 목적 폴리뉴클레오티드의 표적화된 유전자 변형이 일어날 수 있는 것으로 확인된다. 대안적으로, 만능성 세포 (즉, 인간 iPS 세포)가 상이한 배양 배지에 유지되고, 이어서 본 명세서에 개시된 저삼투압 배양 배지로 옮겨지는 동안에 임의의 목적 폴리뉴클레오티드의 표적화된 유전자 변형이 일어날 수 있다.
일반적으로, 단백질 수준 및/또는 단백질의 활성 수준이 단백질의 발현 및/또는 활성을 변경하도록 유전자 변형되거나 돌연변이화되지 않은 적절한 대조군 세포의 단백질 수준보다 통계적으로 높거나 낮은 경우, 단백질의 수준 및/또는 활성은 변형된다. 구체적인 실시 형태에서, 단백질의 농도 및/또는 활성은 변형된 단백질의 수준 및/또는 활성을 갖도록 변형되지 않은 대조군 세포에 비하여 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 변경된다.
"대상 세포"는 유전자 변경, 예컨대 본 명세서에 개시된 유전자 변형을 일으킨 것이거나, 이렇게 변경된 세포로부터 유래하고 변경를 포함하는 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상 세포의 표현형 변화를 측정하는 기준점을 제공한다. 일 실시 형태에서, 대조군 세포는 유전자 변형 또는 돌연변이에 의한 활성 변경을 일으키지 않는 것을 제외하고는 단백질 활성이 저하된 세포와 가능한 한 밀접하게 매칭된다 (예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주로부터 유래할 수 있음). 다른 경우에는, 대조군 세포는 예를 들어, (a) 야생형 세포, 즉, 대상 세포를 형성하는 유전자 변경을 위한 출발 물질로서의 동일한 유전자형의 야생형 세포; (b) 출발 물질로서 동일한 유전자형이나, 널(null) 구축물 (즉, 목적 형질에 대한 효과가 알려져 있지 않은 구축물, 예컨대 마커 유전자를 포함하는 구축물)로 유전자 변형된 세포; (c) 대상 세포의 유전적으로 변형되지 않은 자손인 세포 (즉, 대조군 세포와 대상 세포는 동일한 세포주로부터 유래함); (d) 대상 세포와 유전적으로 동일하나, 목적 유전자의 발현을 유도하는 조건 또는 자극에 노출되지 않는 세포; 또는 (e) 유전자 변형이 목적 폴리뉴클레오티드의 발현 변경을 일으키지 않는 조건 하의 대상 세포 자체를 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 발현 레벨은 직접적으로 예를 들어, 세포 또는 유기체의 폴리펩티드의 수준을 분석하거나, 간접적으로 예를 들어, 폴리펩티드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다.
다른 경우에는, 표적화된 유전자 변형을 갖는 세포는 서던 블롯 분석, DNA 염기 서열 결정(sequencing), PCR 분석 또는 표현형 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법을 이용하여 선택된다. 이어서, 이러한 세포는 본 명세서에 기재된 다양한 방법 및 조성물에서 사용된다.
표적화된 유전자 변형은 목적 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 표적화된 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹아웃, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 100, 500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 적어도 10 kb 내지 500 kb 또는 그 이상이 변화되어 표적화된 게놈 변형을 형성한다.
다른 실시 형태에서, 폴리펩티드의 활성 및/또는 수준은 폴리펩티드의 수준 또는 활성을 변경하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입함으로써 변형된다. 폴리뉴클레오티드는 직접적으로 메신저 RNA의 번역을 변경하거나, 간접적으로 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 또는 번역을 변경하는 폴리펩티드를 암호화함으로써 폴리펩티드의 발현을 변경시킬 수 있다. 다른 실시 형태에서, 폴리펩티드의 활성은 표적 폴리펩티드의 활성을 변경하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 세포로 도입함으로써 변형된다.
일 실시 형태에서, 인간 iPS 세포는 단백질의 활성 및/또는 수준을 변형하는 조건 대립유전자를 포함할 수 있다. "조건 대립유전자"는 원하는 발생 시기에 및/또는 원하는 목적 조직 내에서 단백질의 수준 및/또는 활성이 변형되도록 설계된 변형 유전자를 포함한다. 변형된 수준 및/또는 활성은 조건 대립유전자를 발생시키는 변형을 갖지 않는 대조군 세포와 비교되거나, 원하는 발생 시기에서의 변형된 활성의 경우 선행 및/또는 후속 시기와 비교되거나, 원하는 조직의 경우 모든 조직의 평균 활성과 비교될 수 있다. 일 실시 형태에서, 조건 대립유전자는 원하는 발생 시점에서 및/또는 특정 조직에서 스위치를 끄거나 켤 수 있는(off or on) 조건 널 대립유전자를 포함한다.
비제한적인 실시 형태에서, 조건 대립유전자는 그 전체 내용이 참조로 포함되는 US 2011/0104799에 기재된 다기능 대립유전자이다. 구체적인 실시 형태에서, 조건 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사에 대하여 센스 방향으로의 작동 서열(actuating sequence) 및 센스 또는 안티센스 방향으로의 약물 선택 카세트(DSC); (b) 안티센스 방향으로의 목적 뉴클레오티드 서열(NSI) 및 COIN(조건적 역위 모듈; 엑손-분할 인트론 및 가역적 유전자 트랩 유사 모듈(invertible genetrapsequence module)을 이용함; 예를 들어, 그 전체 내용이 참조로 포함되는 US 2011/0104799를 참조함); 및 (c) 제1 재조합효소에 노출 시에 재조합하여, (i) 작동 서열 및 DSC를 포함하지 않고, (ii) 센스 방향으로의 NSI 및 안티센스 방향으로의 COIN을 포함하는 조건 대립유전자를 생성하는 재조합가능한 단위를 포함한다.
본 발명은 세포의 염색체 상에서 표적 게놈 유전자좌의 변형을 가능하게 한다. 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 의해, 뉴클레아제 제제의 부재 하에 또는 뉴클레아제 제제와 조합하여 표적화 벡터를 사용함으로써 염색체 상의 게놈 유전자좌의 표적화를 행할 수 있다.
표적화된 유전자 변형을 일으키는 방법은, 예를 들어, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 하나 이상의 뉴클레아제와 조합한 표적화 벡터 (예를 들어, LTVEC)의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 US 2015/0159175, US 2015/0159174, US 2014/0310828, US 2014/0309487 및 US 2013/0309670을 참조한다. 마찬가지로, 표적화된 유전자 변형을 일으키는 방법은 단독으로 또는 표적화 벡터와 조합한 하나 이상의 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다.
예를 들어, (a) 표적 게놈 유전자좌의 인식 부위 또는 부근에서 하나 이상의 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 하나 이상의 뉴클레아제 제제를 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 변형을 이의 게놈에 포함하는 하나 이상의 세포를 동정하는 단계를 포함하는, 인간 iPSC 세포의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 표적 게놈 유전자좌의 파괴(disruption)를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제에 의해 생성된 이중 가닥 절단이, 핵산 서열의 삽입 또는 결실을 포함하는 돌연변이 대립유전자를 생성함으로써 그 게놈 유전자좌의 파괴를 야기하는 비-상동성 말단 결합 (NHEJ)-매개 DNA 수복에 의해 수복되는 경우, 내인성 핵산 서열의 파괴가 발생할 수 있다. 파괴의 예에는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)의 변경, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이, 절단(truncation) 돌연변이, 널 돌연변이 또는 적은 수의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실 (예를 들어, 프레임시프트 돌연변이를 일으킴)이 포함된다. 파괴는 불활성화 (기능 상실) 또는 대립유전자의 상실을 일으킬 수 있다.
인간 iPSC 세포의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 다른 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 삽입 핵산을 이의 게놈에 포함하는 적어도 하나의 세포를 동정하는 단계.
인간 iPSC 세포의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 다른 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) (i) 표적 게놈 유전자좌 내의 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 뉴클레아제 제제; 및 (ii) 인식 부위에 충분히 근접하여 위치하고 있는 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 표적 게놈 유전자좌에서 변형 (예를 들어, 삽입 핵산의 통합)을 포함하는 하나 이상의 세포를 동정하는 단계. 이러한 방법은 다양한 유형의 표적화된 유전자 변형을 야기할 수 있다. 이러한 표적화된 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 점 돌연변이, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹아웃, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종성, 외인성 또는 이종상동성 핵산 서열로의 치환, 도메인 교체(swap), 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화되어 표적화된 게놈 변형을 형성할 수 있다. 결실, 삽입 또는 치환은 본 명세서의 다른 부분에서 개시된 바와 같이 임의의 크기의 것일 수 있다.
a. 뉴클레아제 제제 및 뉴클레아제 제제에 대한 인식 부위
용어 "뉴클레아제 제제에 대한 인식 부위"는 닉 또는 이중 가닥 절단이 뉴클레아제 제제에 의해 유도되는 DNA 서열을 포함한다. 뉴클레아제 제제에 대한 인식 부위는 세포에 내인성 (또는 고유한 것)일 수 있거나, 인식 부위는 세포에 외인성일 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 인식 부위는 세포에 외인성이므로, 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않는다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 인식 부위는 세포 및 목적 폴리뉴클레오티드에 외인성이며, 표적 유전자좌에 위치되고자 한다. 추가의 실시 형태에서, 외인성 또는 내인성 인식 부위는 숙주 세포의 게놈에 단 한 번만 존재한다. 구체적인 실시 형태에서, 게놈 내에 단 한 번만 발생하는 내인성 또는 고유 부위가 확인된다. 이어서, 이러한 부위는 내인성 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 일으킬 뉴클레아제 제제를 설계하는데 사용될 수 있다.
인식 부위의 길이는 달라질 수 있으며, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 쌍에 대하여 약 30 내지 36 bp (즉, 각 ZFN에 대하여 약 15 내지 18 bp), 전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (탈렌)에 대하여 약 36 bp 또는 CRISPR/Cas9 가이드 RNA에 대하여 약 20 bp인 인식 부위를 포함한다.
일 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제의 각 단량체는 적어도 9개의 뉴클레오티드의 인식 부위를 인식한다. 다른 실시 형태에서, 인식 부위는 길이가 약 9 내지 약 12개의 뉴클레오티드, 길이가 약 12 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 길이가 약 15 내지 약 18개의 뉴클레오티드 또는 길이가 약 18 내지 약 21개의 뉴클레오티드, 및 이러한 하위범위 (예를 들어, 9 내지 18개의 뉴클레오티드)의 임의의 조합이다. 주어진 뉴클레아제 제제가 인식 부위에 결합하여, 그 결합 부위를 절단하거나, 뉴클레아제 제제가 인식 부위와 상이한 서열에 결합할 수 있는 것으로 인식된다. 게다가, 용어 "인식 부위"는 닉/절단 부위가 뉴클레아제 제제 결합 부위 내에 존재하는지 외측에 존재하는지 여부에 관계없이, 뉴클레아제 제제 결합 부위 및 닉/절단 부위를 포함한다. 또 하나의 변형예에서, 뉴클레아제 제제에 의한 절단은 서로 바로 마주보는 뉴클레오티드 위치에서 일어나서, 평활 말단(blunt end) 절단부를 형성할 수 있거나, 다른 경우에는 절개부가 스태거(stagger)되어, 5' 돌출부(overhang) 또는 3' 돌출부일 수 있는, "점착 말단(sticky end)"으로도 불리우는 단일 가닥 돌출부를 형성할 수 있다.
닉 또는 이중 가닥 절단을 원하는 인식 부위로 유도하는 임의의 뉴클레아제 제제가 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 자연 발생 또는 천연 뉴클레아제 제제가 원하는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 한 상기 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있다. 대안적으로, 변형되거나 유전자 조작된 뉴클레아제 제제가 사용될 수 있다. "유전자 조작된 뉴클레아제 제제"는 원하는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 특이적으로 인식하고 유도하도록 이의 천연 형태로부터 유전자 조작된 (변형되거나 유래된) 뉴클레아제를 포함한다. 따라서, 유전자 조작된 뉴클레아제 제제는 천연의 자연 발생 뉴클레아제 제제로부터 유래될 수 있거나, 인공적으로 생성되거나 합성될 수 있다. 뉴클레아제 제제의 변형은 단지 단백질 절단제의 하나의 아미노산 또는 핵산 절단제의 하나의 뉴클레오티드에서 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유전자 조작된 뉴클레아제는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하며, 여기서 인식 부위는 천연 (유전자 조작되지 않거나 변형되지 않은) 뉴클레아제 제제에 의해 인식되는 서열이 아니었다. 인식 부위 또는 다른 DNA에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 형성하는 것은 본 명세서에서 인식 부위 또는 다른 DNA의 "절단(cutting 또는 cleaving)"으로 명명될 수 있다.
예시된 인식 부위의 활성 변이체 및 단편도 제공된다. 이러한 활성 변이체는 주어진 인식 부위에 대하여, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유하므로, 서열 특이적 방법으로 뉴클레아제 제제에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 뉴클레아제 제제에 의한 인식 부위의 이중 가닥 절단을 측정하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 택맨(TaqMan)® qPCR 분석, 이의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Frendewey D. et al., Methods in Enzymology, 2010, 476:295-307]).
뉴클레아제 제제의 인식 부위는 표적 유전자좌 내에 또는 그 부근 어디에나 위치할 수 있다. 인식 부위는 유전자의 암호화 영역 내에 또는 유전자의 발현에 영향을 주는 조절 영역 내에 위치할 수 있다. 뉴클레아제 제제의 인식 부위는 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 조절 영역 또는 임의의 비단백질 암호화 영역에 위치할 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 인식 부위는 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 위치된다. 이러한 위치는 선택 마커의 암호화 영역 내에 또는 선택 마커의 발현에 영향을 주는 조절 영역 내에 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레아제 제제의 인식 부위는 선택 마커의 인트론, 프로모터, 인핸서, 조절 영역 또는 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 비단백질 암호화 영역에 위치할 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 인식 부위에서의 닉 또는 이중 가닥 절단은 선택 마커의 활성을 파괴한다. 기능적 선택 마커의 존재 또는 부재에 대한 분석 방법이 알려져 있다.
일 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (탈렌)이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈의 특정 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 형성하는 데 사용될 수 있는 서열 특이적 뉴클레아제의 부류이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 천연 또는 유전자 조작된 전사 활성 인자-유사 (TAL) 이펙터 또는 이의 기능적 부분을 엔도뉴클레아제, 예를 들어 FokI의 촉매 도메인에 융합시킴으로써 생성된다. 고유의 모듈러 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 잠재적으로 주어진 임의의 DNA 인식 특이성을 가진 단백질의 설계를 가능하게 한다. 따라서, TAL 이펙터 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특정 DNA 표적 부위를 인식하도록 유전자 조작될 수 있으므로, 원하는 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 형성하는 데 사용될 수 있다. 모두 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, WO 2010/079430; 문헌[Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pNA.1013133107]; 문헌[Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432]; 문헌[Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761]; 문헌[Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704]; 및 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143―148]을 참조한다.
적합한 TAL 뉴클레아제의 예, 및 적합한 TAL 뉴클레아제를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2011/0239315 A1호, 제2011/0269234 A1호, 제2011/0145940 A1호, 제2003/0232410 A1호, 제2005/0208489 A1호, 제2005/0026157 A1호, 제2005/0064474 A1호, 제2006/0188987 A1호, 및 제2006/0063231 A1호에 개시되어 있다 (각각은 본 명세서에 참조로 포함됨). 다양한 실시 형태에서, TAL 이펙터 뉴클레아제는 예를 들어, 목적 유전자좌 또는 목적 게놈 유전자좌의 표적 핵산 서열이나 그 부근에서 절단되도록 유전자 조작되며, 여기서 표적 핵산 서열은 표적화 벡터에 의해 변형되는 서열 또는 그 부근에 존재한다. 본 명세서에 제공된 다양한 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 TAL 뉴클레아제는 본 명세서에 기재된 표적화 벡터에 의해 변형되는 표적 핵산 서열 또는 그 부근에서 결합하도록 특별히 설계된 것들을 포함한다.
일 실시 형태에서, 탈렌의 각 단량체는 12 내지 25개의 TAL 반복체를 포함하며, 여기서 각각의 TAL 반복체는 1 bp 서브사이트(subsite)에 결합한다. 일부 탈렌에서, 탈렌의 각 단량체는 2개의 초가변 잔기(hypervariable residue)를 통해 단일 염기쌍을 인식하는 33 내지 35개의 TAL 반복체를 포함한다. 일 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제는 독립(independent) 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 일 실시 형태에서, 독립 뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 일 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제는 제1 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인은 각각, FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 제1 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인은 약 6 bp 내지 약 40 bp의 절단 부위에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하고, FokI 뉴클레아제는 이량체화되어 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 형성한다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인은 각각, FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 제1 및 제2 TAL 반복체 기반 DNA 결합 도메인은 가변 길이 (12 내지 20 bp)의 스페이서 서열에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하며, FokI 뉴클레아제 서브유닛은 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 형성하는 활성 뉴클레아제를 생성하도록 이량체화된다.
본 명세서에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 사용되는 뉴클레아제 제제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, ZFN의 각 단량체는 3개 이상의 징크 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각 징크 핑거 기반 DNA 결합 도메인은 3 bp 서브사이트에 결합한다. 다른 실시 형태에서, ZFN은 독립 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 징크 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 일 실시 형태에서, 독립 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 일 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함하며, 여기서 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 각각, FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 제1 및 제2 ZFN은 약 6 bp 내지 40 bp 절단 부위에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하며, FokI 뉴클레아제는 이량체화되어 이중 가닥 절단을 형성한다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 각각, FokI 뉴클레아제 서브유닛에 작동가능하게 연결되고, 제1 및 제2 ZFN은 약 5 내지 7 bp 스페이서에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하며, FokI 뉴클레아제 서브유닛은 이중 가닥 절단을 형성하는 활성 뉴클레아제를 생성하도록 이량체화된다. 예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함되는, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; 및 WO/2011/017293A2를 참조한다.
또 다른 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제는 메가뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제는 보존 서열 모티프에 기초하여 4개의 패밀리로 분류되어 왔는데, 이러한 패밀리는 LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H 및 His-Cys 박스 패밀리이다. 이러한 모티프는 금속 이온의 배위 및 인산다이에스테르 결합의 가수분해에 관여한다. 메가뉴클레아제는 이들의 긴 인식 부위 및 이들의 DNA 기질에서의 일부 서열 다형성을 용인한다는 점이 주목할 만하다. 메가뉴클레아제 도메인, 구조 및 기능은 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248]; 문헌[Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9]; 문헌[Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26]; 문헌[Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95]; 및 문헌[Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764]을 참조한다. 일부 예에서, 자연 발생 변이체 및/또는 유전자 조작된 유도체 메가뉴클레아제가 사용된다. 동력학, 보조 인자 상호 작용, 발현, 최적 조건 및/또는 인식부위 특이성을 변형시키고 활성을 스크리닝하는 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62]; 문헌[Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905]; 문헌[Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008]; 문헌[Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9]; 문헌[Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41]; 문헌[Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800]; 문헌[Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178]; 문헌[Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149]; 문헌[Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29]; 문헌[Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154]; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; 및 WO2004031346을 참조한다.
I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII 또는 이들의 임의의 활성 변이체 또는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 메가뉴클레아제가 본 명세서에 사용될 수 있다
일 실시 형태에서, 메가뉴클레아제는 12 내지 40개의 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열을 인식한다. 일 실시 형태에서, 메가뉴클레아제는 게놈의 하나의 완전하게 매칭되는 표적 서열을 인식한다. 일 실시 형태에서, 메가뉴클레아제는 호밍(homing) 뉴클레아제이다. 일 실시 형태에서, 호밍 뉴클레아제는 LAGLIDADG 패밀리의 호밍 뉴클레아제이다. 일 실시 형태에서, LAGLIDADG 패밀리의 호밍 뉴클레아제는 I-SceI, I-CreI 및 I-Dmol로부터 선택된다.
뉴클레아제 제제는 타입 I, 타입 II, 타입 III 및 타입 IV 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다. 타입 I 및 타입 III 제한 엔도뉴클레아제는 특이적 인식 부위를 인식하지만, 전형적으로 절단 부위 (인식 부위)로부터 떨어져 있는 수백 개의 염기쌍일 수 있는 뉴클레아제 결합 부위에서 떨어진 가변 위치에서 절단한다. 타입 II 시스템에서, 제한 활성은 임의의 메틸라아제 활성과 무관하며, 절단은 전형적으로 결합 부위 내 또는 그 부근의 특정 부위에서 일어난다. 대부분의 타입 II 효소는 회문 서열을 절단하지만, 타입 IIa 효소는 비회문 인식 부위를 인식하고, 인식 부위의 외측을 절단하며, 타입 IIb 효소는 인식 부위 외측의 양측 부위에서 서열을 2회 절단하고, 타입 IIs 효소는 비대칭 인식 부위를 인식하며, 한쪽에서 인식 부위로부터 약 1 내지 20개의 뉴클레오티드의 일정한 거리에서 절단한다. 타입 IV 제한효소는 메틸화 DNA를 표적으로 한다. 제한효소는 추가로, 예를 들어, 리베이스(REBASE) 데이터베이스에 기재되어 분류되어 있다 (문헌[webpage at rebase.neb.com]; 문헌[Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20], 문헌[Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12] 및 문헌[Belfort et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC)].
다양한 방법 및 조성물에서 사용되는 뉴클레아제 제제는 또한 CRISPR/CRISPR-관련 (Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위-지정 절단을 위해 CRISPR 복합체 (Cas 단백질과 복합체를 형성한 가이드 RNA(gRNA)를 포함함)를 이용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 일부 CRISPR/Cas 시스템은 자연 발생적이지 않다. "자연적으로 발생하지 않는" 시스템은 인간의 손의 관여를 나타내는 모든 것, 예를 들어, 이들의 자연 발생 상태로부터 변경되거나 돌연변이되거나, 이들이 실제로는 자연적으로 결합하여 있는 적어도 하나의 다른 성분을 적어도 실질적으로 함유하지 않거나, 이들이 자연적으로 결합하여 있지 않은 적어도 하나의 다른 구성 요소와 결합된 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로는 함께 발생하지 않는 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하는 자연적으로 발생하지 않는 CRISPR 복합체를 사용한다.
Cas 단백질은 일반적으로 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 가이드 RNA (gRNA, 이하에 더욱 상세히 기술됨)와 상호작용할 수 있다. Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, DNAe 또는 RNAe 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인 및 기타 도메인을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 절단을 위한 촉매 활성을 갖는다. 절단은 핵산 분자의 공유 결합의 파괴를 포함한다. 절단은 평활 말단 또는 스태거된 말단을 생성할 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 될 수 있다.
Cas 단백질의 예에는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 및 Cu1966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전(modified version)이 포함된다.
일부 경우에, Cas 단백질은 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 예를 들어, Cas 단백질은 Cas9 단백질이거나 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. Cas9 단백질은 전형적으로 보존 구조를 갖는 4개의 주요 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2 및 4는 RuvC 유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. Cas9 단백질은 예를 들어, 화농연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(PolaromoNA naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(PseudoalteromoNA haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아 속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 단백질은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래일 수 있다. Cas9 패밀리 구성원의 추가의 예는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, WO 2014/131833에 기재된 것들을 포함한다. 특정 예에서, Cas9 단백질은 화농연쇄구균 유래 Cas9 단백질 또는 이의 유도체이다. 화농연쇄구균 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어, 등록 번호 Q99ZW2 하에 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
Cas 단백질은 야생형 단백질 (즉, 천연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질 (즉, Cas 단백질 변이체) 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분에 대하여, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 분석이 알려져 있고, 일반적으로 절단 부위를 포함하는 DNA 기질에 대한 Cas 단백질의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성 및/또는 효소 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 임의의 다른 활성이나 특성, 예를 들어 안정성을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형되거나, 결실되거나, 비활성화될 수 있거나, 또는 Cas 단백질은 단백질의 기능에 본질적이지 않은 도메인을 제거하거나 Cas 단백질의 활성을 최적화 (예를 들어, 향상 또는 감소)시키기 위해 절단될 수 있다.
일부 Cas 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC 및 HNH 도메인은 각각, DNA의 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 상이한 가닥의 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337:816-821]을 참조한다.
뉴클레아제 도메인들 중 하나 또는 둘 다는 더 이상 기능적이지 않거나 뉴클레아제 활성이 감소되도록 결실되거나 돌연변이될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중 하나가 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)은 닉카아제(nickase)로 지칭될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 표적 서열에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있지만, 이중 가닥 절단을 생성할 수 없다 (즉, 상보적 가닥 또는 비상보적 가닥 중 어느 한쪽만 절단할 수 있음). 뉴클레아제 도메인 둘 다가 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 저하될 것이다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 예로는 화농연쇄구균 유래의 Cas9의 RuvC 도메인에서의 D10A (Cas9의 위치 10에서 아스파르테이트가 알라닌으로 치환됨) 돌연변이가 있다. 마찬가지로, 화농연쇄구균 유래의 Cas9의 HNH 도메인에서의 H939A (아미노산 위치 839에서 히스티딘이 알라닌으로 치환됨) 또는 H840A (아미노산 위치 840에서 히스티딘이 알라닌으로 치환됨)는 Cas9를 닉카아제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 다른 예는 S. 써모필러스 유래의 Cas9에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Research 39:9275-9282] 및 WO 2013/141680을 참조한다. 이러한 돌연변이는 부위-지정 돌연변이생성, PCR-매개 돌연변이생성 또는 전체 유전자 합성과 같은 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 닉카아제를 생성하는 다른 돌연변이의 예는 예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함되는, WO/2013/176772A1 및 WO/2013/142578A1에서 찾을 수 있다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. 전체적으로 본 명세서 참조로 포함되는 WO 2014/089290을 참조한다. Cas 단백질은 또한 안정성 향상 또는 저하를 제공하는 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리펩티드는 N 말단, C 말단 또는 Cas 단백질 내부에 위치할 수 있다.
Cas 융합 단백질의 일 예는 세포 내 국재화(subcellular localization)를 제공하는 이종 폴리펩티드에 융합된 Cas 단백질이다. 이러한 서열은, 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 SV40 NLS와 같은 핵 국재화 신호 (NLS), 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국재화 신호, ER 잔류 신호(retention signal) 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105]을 참조한다. 이러한 세포 내 국재화 신호는 N-말단, C-말단 또는 Cas 단백질 내의 어디에도 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 스트레치를 포함할 수 있고, 단립형(monopartite) 서열 또는 양립형(bipartite) 서열일 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포 투과성 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과성 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스 유래의 TLM 세포 투과성 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 헤르페스 바이러스 유래의 세포 투과성 펩티드 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/089290을 참조한다. 세포 투과성 도메인은 N 말단, C 말단 또는 Cas 단백질 내의 어디에도 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위한 이종 폴리펩티드, 예를 들어 형광 단백질, 정제 태그 또는 에피토프 태그를 포함할 수 있다. 형광 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, 태그GFP(tagGFP), 터보GFP(turboGFP), eGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체성(Monomeric) 아자미 그린, 콥GFP(CopGFP), 에이스GFP(AceGFP), Zs그린1(Zs녹색1)), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, eYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), Y펫(YPet), 파이YFP(PhiYFP), Zs옐로우1(ZsYellow1)), 청색 형광 단백질 (예를 들어, eBFP, eBFP2, 아주라이트(Azurite), m칼라말(mKalamal), GFPuv, 사파이어(Sapphire), T-사파이어), 시안 형광 단백질 (예를 들어 eCFP, 세룰리안(Cerulean), 사이펫(CyPet), 에이엠시안1(AmCyan1), 미도리시-시안 (Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질 (m케이트(mKate), m케이트2, m플럼(mPlum), Ds레드(DsRed) 단량체, m체리(mCherry), mRFP1, Ds레드-익스프레스(DsRed-Express), Ds레드2, Ds레드-단량체, Hc레드-탠덤(HcRed-Tandem), Hc레드1(HcRed1), As레드2(AsRed2), eqFP611, m라즈베리(mRaspberry), m스트로베리(mStrawberry), J레드(Jred)), 오렌지색 형광 단백질 (m오렌지(mOrange), mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체성 쿠사비라-오렌지, m탠저린(mTangerine), td토마토(tdTomato)) 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다. 태그의 예로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification; TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 혈구응집소 (HA), nus, 소프태그(Softag) 1, 소프태그 3, 스트렙(Strep), SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘 (His), 비오틴 카르복실 캐리어 단백질 (BCCP) 및 칼모듈린을 들 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질의 형태, 예컨대 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 RNA (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA와 같은, Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체 (즉, 인간 세포)에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. Cas 단백질을 암호화하는 핵산이 세포로 도입되는 경우, Cas 단백질은 세포 내에서 일시적으로, 조건부로 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 구축물은 목적 유전자 또는 다른 핵산 서열 (예를 들어, Cas 유전자)의 발현을 유도할 수 있으며, 이러한 목적 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구축물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은, 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터 및/또는 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이것은 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터와 별개이고/이거나 gRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드에 존재할 수 있다. 발현 구축물에서 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 인간 iPS 세포 또는 완전 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다.
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질에 결합하고, 표적 DNA 내의 특정 위치의 Cas 단백질을 표적으로 하는 RNA 분자를 포함한다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트, 즉, "DNA 표적화 세그먼트"와 "단백질 결합 세그먼트"를 포함할 수 있다. "세그먼트"는 RNA의 뉴클레오티드의 연속 스트레치와 같은, 분자의 세그먼트, 섹션 또는 영역을 포함한다. 일부 gRNA는 2개의 분리된 RNA 분자, 즉, "활성 인자-RNA"와 "표적 인자(targeter)-RNA"를 포함한다. 다른 gRNA는 "단일 분자 gRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로도 지칭될 수 있는 단일 RNA 분자 (단일 RNA 폴리뉴클레오티드)이다. 예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함되는, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, WO/2013142578A1 및 WO 2014/131833A1을 참조한다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중 분자 gRNA 및 단일 분자 gRNA를 포함한다.
예시적인 2분자 gRNA는 crRNA 유사 ("CRISPR RNA" 또는 "표적 인자-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복체") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사 ("트랜스-활성화 CRISPR RNA" 또는 "활성 인자-RNA" 또는 "tracrRNA" 또는 "스캐폴드") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트 (단일 가닥), 및 gRNA의 단백질 결합 세그먼트의 dsRNA 이중 가닥의 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다.
상응하는 tracrRNA(활성 인자-RNA)는 gRNA의 단백질 결합 세그먼트의 dsRNA 이중 가닥의 다른 절반을 형성하는 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. crRNA의 뉴클레오티드의 스트레치는 tracrRNA의 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적이며, 이와 혼성화되어, gRNA의 단백질 결합 도메인의 dsRNA 이중 가닥을 형성한다. 이와 같이, 각 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖는다고 할 수 있다.
crRNA와 상응하는 tracrRNA는 혼성화되어, gRNA를 형성한다. crRNA는 표적 서열에 혼성화되는 단일 가닥 DNA-표적화 세그먼트를 추가로 제공한다 세포 내에서의 변형에 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은 RNA 분자가 사용될 종류에 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌[Mali et al. (2013) Science 339:823-826]; 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337:816-821]; 문헌[Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229]; 문헌[Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:233-239]; 및 문헌[Cong et al. (2013) Science 339:819-823]을 참조한다.
주어진 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트 (crRNA)는 표적 DNA의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 세그먼트는 혼성화 (즉, 염기쌍 형성)을 통해 서열 특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 이와 같이, DNA-표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 다양할 수 있고, gRNA 및 표적 DNA와 상호작용할 표적 DNA 내의 위치를 결정한다. 대상 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트는 표적 DNA 내의 임의의 원하는 서열에 혼성화되도록 변형될 수 있다. 자연 발생적인 crRNA는 Cas9 시스템 및 유기체에 따라 다르지만, 종종 21 내지 46개의 뉴클레오티드 길이의 2개의 직접 반복체(DR)에 의해 플랭킹된 21 내지 72개의 뉴클레오티드 길이의 표적화 세그먼트를 함유한다 (예를 들어, WO2014/131833을 참조함). 화농연쇄구균의 경우, DR은 36개의 뉴클레오티드 길이이고, 표적화 세그먼트는 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 3'에 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보적이고 이와 혼성화되어, 결과적으로 Cas9 단백질에 결합한다.
DNA-표적화 세그먼트의 길이는 약 12개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, DNA-표적화 세그먼트의 길이는 약 12개의 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 80 nt, 약 12 nt 내지 약 50 nt, 약 12 nt 내지 약 40 nt, 약 12 nt 내지 약 30 nt, 약 12 nt 내지 약 25 nt, 약 12 nt 내지 약 20 nt 또는 약 12 nt 내지 약 19 nt일 수 있다. 대안적으로, DNA-표적화 세그먼트의 길이는 약 19 nt 내지 약 20 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 19 nt 내지 약 70 nt, 약 19 nt 내지 약 80 nt, 약 19 nt 내지 약 90 nt, 약 19 nt 내지 약 100 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt, 약 20 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 70 nt, 약 20 nt 내지 약 80 nt, 약 20 nt 내지 약 90 nt 또는 약 20 nt 내지 약 100 nt일 수 있다.
표적 DNA의 뉴클레오티드 서열 (표적 서열)에 상보적인 DNA-표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 약 12 nt일 수 있다. 예를 들어, DNA-표적화 서열 (즉, 표적 DNA 내의 표적 서열에 상보적인 DNA-표적화 세그먼트 내의 서열)의 길이는 약 12 nt 이상, 약 15 nt 이상, 약 18 nt 이상, 약 19 nt 이상, 약 20 nt 이상, 약 25 nt 이상, 약 30 nt 이상, 약 35 nt 이상 또는 약 40 nt 이상일 수 있다. 대안적으로, DNA-표적화 서열의 길이는 약 12 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 80 nt, 약 12 nt 내지 약 50 nt, 약 12 nt 내지 약 45 nt, 약 12 nt 내지 약 40 nt, 약 12 nt 내지 약 35 nt, 약 12 nt 내지 약 30 nt, 약 12 nt 내지 약 25 nt, 약 12 nt 내지 약 20 nt, 약 12 nt 내지 약 19 nt, 약 19 nt 내지 약 20 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt 또는 약 20 nt 내지 약 60 nt일 수 있다. 일부 경우에, DNA 표적화 서열의 길이는 약 20 nt일 수 있다.
TracrRNA는 임의의 형태 (예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성의 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이일 수 있다. 이는 일차 전사물 또는 가공된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA (단일 가이드 RNA의 일부로서 또는 2분자 gRNA의 일부로서 분리된 분자로서)는 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracrRNA 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 화농연쇄구균 유래의 야생형 tracrRNA 서열의 예에는 171-뉴클레오티드, 89-뉴클레오티드, 75-뉴클레오티드 및 65-뉴클레오티드 버전이 포함된다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌[Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607]; WO 2014/093661을 참조한다. 단일 가이드 RNA (sgRNA) 내의 tracrRNA의 예에는 sgRNA의 +48, +54, +67 및 +85 버전 내에서 발견되는 tracrRNA 세그먼트가 포함되며, 여기서 "+n"은 야생형 tracrRNA의 +n 이하의 뉴클레오티드가 sgRNA 내에 포함된다는 것을 나타낸다. 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호를 참조한다.
표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 표적 서열 사이의 상보성 비율은 60% 이상 (예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)일 수 있다. 일부 경우에, 표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 표적 서열 사이의 상보성 비율은 약 20개의 인접 뉴클레오티드에 대해 60% 이상일 수 있다. 일 예에서, 표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 표적 서열 사이의 상보성 비율은 표적 DNA의 상보적 가닥 내의 표적 서열의 5' 말단에 있는 14개의 인접 뉴클레오티드에 대해 100%이고, 나머지 부분에 대해서는 0%만큼 낮다. 이러한 경우에, DNA 표적화 서열의 길이가 14개의 뉴클레오티드인 것으로 간주될 수 있다. 다른 예에서, 표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 표적 서열 사이의 상보성 비율은 표적 DNA의 상보적 가닥 내의 표적 서열의 5' 말단에 있는 7개의 인접 뉴클레오티드에 대해 100%이고, 나머지 부분에 대해서는 0%만큼 낮다. 이러한 경우에, DNA 표적화 서열의 길이가 7개의 뉴클레오티드인 것으로 간주될 수 있다.
gRNA의 단백질 결합 세그먼트는 서로 상보적인 2개의 뉴클레오티드 스트레치를 포함할 수 있다. 단백질 결합 세그먼트의 상보적 뉴클레오티드는 혼성화되어, 이중 가닥 RNA 나선 구조 (dsRNA)를 형성한다. 대상 gRNA의 단백질 결합 세그먼트는 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을 DNA 표적화 세그먼트를 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열로 유도한다.
가이드 RNA는 추가의 바람직한 특징 (예를 들어, 변형되거나 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지를 이용한 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예로는 예를 들어, 5' 캡 (예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화된 테일(즉, 3' 폴리(A) 테일); 리보스위치(riboswitch) 서열 (예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 고려함); 안정성 제어 서열; dsRNA 이중 나선 구조 (즉, 헤어핀)를 형성하는 서열; 세포내 부위 (예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)의 RNA를 표적으로 하는 변형 또는 서열; 추적 (예를 들어, 형광 분자에 대한 직접 접합, 형광 검출을 용이하게 하는 부분에 대한 접합, 형광 검출을 가능하게 하는 서열 등)을 제공하는 변형 또는 서열; 단백질 (예를 들어, 전사 활성 인자, 전사 억제인자, DNA 메틸트랜스페라아제, DNA 데메틸라아제, 히스톤 아세틸트랜스페라아제, 히스톤 데아세틸라아제 등을 비롯한, DNA에 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열; 및 이들의 조합을 들 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자 (별개의 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자 (sgRNA)로서의 RNA 형태 및 임의로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자 (sgRNA) 또는 별개의 RNA 분자 (예를 들어, 별개의 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다. 후자의 경우, gRNA를 암호화하는 DNA는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 암호화하는 별개의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA를 암호화하는 DNA가 세포로 도입되는 경우, gRNA는 세포 내에서 일시적으로, 조건부로 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 암호화하는 DNA는, 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터 및/또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이것은 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터와 별개이고/이거나 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드에 존재할 수 있다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 인간 iPS 세포 또는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에서 활성일 수 있다. 이러한 프로모터는, 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터이다.
대안적으로, gRNA는 다양한 다른 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여, 생체외 전사에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, WO 2014/089290 및 WO 2014/065596을 참조함). 가이드 RNA는 화학 합성에 의해 제조되는 합성적으로 생산된 분자일 수도 있다.
CRISPR/Cas 시스템에 대한 표적 서열은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 표적 서열은 가이드 RNA가 상보성을 갖도록 설계된 서열을 포함하며, 여기서 표적 서열과 DNA 표적화 서열 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 일으켜 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 또한 Cas 단백질에 대한 절단 부위를 포함하며, 이는 아래에 더욱 상세하게 설명되어 있다. 표적 서열은 예를 들어, 세포핵 또는 세포질에, 또는 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 세포 소기관 내에 위치할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
표적 DNA 내의 표적 서열은 Cas 단백질 또는 gRNA에 의해 표적화될 수 있다 (즉, 이에 의해 결합되거나, 이와 혼성화되거나, 이에 상보적일 수 있다). 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 통상 세포에 존재하는 생리적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건 (예를 들어, 무세포계에서의 조건)이 본 기술 분야에 알려져 있다 (예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)]을 참조함). Cas 단백질 또는 gRNA에 상보적이고, 이와 혼성화되는 표적 DNA의 가닥은 "상보적 가닥"으로 불릴 수 있고, "상보적 가닥"에 상보적인 (따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보적이지 않은) 표적 DNA의 가닥은 "비상보적 가닥" 또는 "주형 가닥"으로 불릴 수 있다.
Cas 단백질은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열의 내부 또는 외부의 위치에서 핵산을 절단할 수 있다. "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 일으키는 핵산 위치를 포함한다. 예를 들어, CRISPR 복합체 (표적 서열에 혼성화되어, Cas 단백질과 복합체를 형성한 gRNA를 포함함)의 형성은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합될 표적 DNA 내에 존재하는 핵산 서열 또는 그 부근에 (예를 들어, 상기 핵산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내에) 한 가닥 또는 두 가닥의 절단을 일으킬 수 있다. 절단 부위가 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA 내의 핵산 서열의 외부에 존재한다면, 절단 부위는 여전히 "표적 서열" 내에 있는 것으로 간주된다. 절단 부위는 핵산의 한 가닥에만 또는 두 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 핵산의 두 가닥에서 동일한 위치에 있을 수 있거나 (평활 말단을 생성함), 각 가닥에 상이한 부위에 있을 수 있다 (스태거된 말단을 생성함). 스태거된 말단은 예를 들어, 각 가닥 상의 상이한 절단 부위에서 단일 가닥 절단을 생성하는 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 제1 닉카아제는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 제1 가닥에 단일 가닥 절단을 일으킬 수 있고, 제2 닉카아제는 돌출 서열이 생성되도록 dsDNA의 제2 가닥에 단일 가닥 절단을 일으킬 수 있다. 일부 경우에, 제1 가닥의 닉카아제의 표적 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 1,000개 이상의 염기쌍에 의해 제2 가닥의 닉카아제의 표적 서열로부터 분리되어 있다.
Cas9에 의한 표적 DNA의 부위 특이적 절단은 표적 DNA에서, (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 형성 상보성과 (ii) 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 지칭되는 짧은 모티프에 의해 결정되는 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 표적 서열을 플랭킹할 수 있다. 선택적으로, 표적 서열은 PAM에 의해 3' 말단 상에서 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, Cas9의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류에 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개의 염기쌍 (예를 들어, 3개의 염기쌍)일 수 있다. 일부 경우에 (예를 들어, 화농연쇄구균 유래의 Cas9 또는 근연종의(closely related) Cas9가 사용된 경우 비상보적 가닥의 PAM 서열은 5'-XGG-3'일 수 있으며, 여기서 X는 임의의 DNA 뉴클레오티드이고, X는 표적 DNA의 비상보적 가닥의 표적 서열의 3' 부근(immediately 3')에 있다. 이와 같이, 상보적 가닥의 PAM 서열은 5'-CCY-3'일 것이며, 여기서 Y는 임의의 DNA 뉴클레오티드이고 Y는 표적 DNA의 상보적 가닥의 표적 서열의 5' 부근에 있다. 이러한 일부 경우에, X와 Y는 상보성일 수 있고, X-Y 염기쌍은 임의의 염기쌍일 수 있다 (예를 들어, X=C 및 Y=G; X=G 및 Y=C; X=A 및 Y=T, X=T 및 Y=A).
표적 서열의 예에는 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트에 상보적인 DNA 서열, 또는 PAM 서열 이외의 이러한 DNA 서열을 포함한다. 표적 서열의 일 예는 GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20 GG; 서열 번호: 2)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 표적 서열은 5' G 및 3' GG를 포함하는 서열 번호: 2의 길이가 4 내지 22개인 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 또 다른 표적 서열은 서열 번호: 2의 길이가 14 내지 20개인 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
표적 서열은 세포에 대하여 내인성이거나 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 표적 서열은 유전자 산물 (예를 들어, 단백질)을 암호화하는 서열 또는 비암호화 서열 (예를 들어, 조절 서열 또는 정크(junk) DNA)일 수 있거나, 둘 모두를 포함할 수 있다.
뉴클레아제 제제의 활성 변이체 및 단편 (즉, 유전자 조작된 뉴클레아제 제제)도 제공된다. 이러한 활성 변이체는 천연 뉴클레아제 제제에 대하여, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 인식 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성을 보유한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레아제 제제는 천연 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형될 수 있고, 천연 뉴클레아제 제제에 의해 인식되지 않은 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 인식하여 유도하도록 설계될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 유전자 조작된 뉴클레아제는 상응하는 천연 뉴클레아제 제제의 인식 부위와 상이한 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 특이성을 갖는다. 닉 또는 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 분석이 알려져 있고, 일반적으로 인식 부위를 포함하는 DNA 기질 상의 엔도뉴클레아제의 전반적인 활성 및 특이성을 측정한다.
뉴클레아제 제제는 본 기술 분야에 알려진 임의의 수단에 의해 만능성 세포 내로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리펩티드는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되는 경우에, 뉴클레아제 제제는 세포 내에서 일시적으로, 조건부로 또는 구성적으로 발현될 수 있다. 따라서, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 포함될 수 있고, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 mRNA로서 세포 내로 도입된다.
구체적인 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 만능성 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 삽입 핵산을 포함하는 동일한 표적화 벡터에 존재하지만, 다른 경우에는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적화 벡터와는 별개인 벡터 또는 플라스미드에 존재한다.
뉴클레아제 제제가 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입을 통해 만능성 세포에 제공되는 경우, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제 제제를 암호화하는 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 목적 세포에서의 사용 빈도가 높은 코돈으로 치환되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 인간 세포에서의 사용 빈도가 높은 코돈으로 치환되도록 변형될 수 있다.
b. 선택 마커
다양한 선택 마커가 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 마커는 본 명세서의 다른 곳에 개시되어 있으며, G418, 하이그로마이신, 블라스티사이딘, 네오마이신 또는 퓨로마이신과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 선택 마커를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 iPS 세포 또는 완전 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
c. 표적 게놈 유전자좌
염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 적어도 하나의 핵산 삽입물의 통합을 가능하게 하는 다양한 방법 및 조성물이 제공된다. "염색체 상의 표적 게놈 유전자좌"는 핵산 삽입물을 통합하고자 하는 염색체 상의 DNA의 임의의 세그먼트 또는 영역을 포함한다. 표적화되는 염색체 상의 게놈 유전자좌는 인간 iPS 세포 또는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에 고유할 수 있거나, 대안적으로 세포의 염색체로 통합되는 DNA의 이종성 또는 외인성 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 DNA의 이종성 또는 외인성 세그먼트는 도입유전자, 발현 카세트, 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 게놈 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함할 수 있다. 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌는 예를 들어, 인식 부위, 선택 마커, 사전에 통합된 핵산 삽입물, 뉴클레아제 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터 등을 포함하는 표적 게놈 통합 시스템 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌는 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체, 또는 적절한 숙주 세포에 함유된 임의의 다른 유전자 조작된 게놈 영역 내에 위치할 수 있다. 따라서, 구체적인 실시 형태에서, 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌는 인간 세포 유래의 천연 게놈 서열, 또는 비인간 포유류, 비인간 세포, 설치류, 인간, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류 (예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이), 가축 포유류(domesticated mammal) 또는 농업 포유류(farm mammal) 또는 임의의 다른 목적 유기체, 또는 이들의 조합으로부터 유래되는 이종성 또는 외인성 게놈 핵산 서열을 포함할 수 있다.
d. 표적화 벡터 및 핵산 삽입물
상술한 바와 같이, 본 명세서에 제공되는 방법 및 조성물은 표적화 벡터를 단독으로 또는 뉴클레아제 제제와 조합하여 사용한다. "상동 재조합"은 통상적으로 상동 영역 내의 교차 부위에서 2개의 DNA 분자 사이의 DNA 단편의 교환을 지칭하는데 사용된다.
i. 핵산 삽입물
하나 이상의 별개의 핵산 삽입물이 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있으며, 이들은 별개의 표적화 벡터를 통해 또는 동일한 표적화 벡터 상에서 세포로 도입될 수 있다. 핵산 삽입물은 게놈 표적 유전자좌로 통합되는 DNA의 세그먼트를 포함한다. 표적 유전자좌에서 핵산 삽입물의 통합은 표적 유전자좌로의 목적 핵산 서열의 첨가, 표적 유전자에서의 목적 핵산 서열의 결실 및/또는 표적 유전자에서의 목적 핵산 서열의 치환을 야기한다.
표적 유전자좌에서 치환되는 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 암호화 영역, 인트론, 엑손, 비번역 영역, 조절 영역, 프로모터, 인핸서 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 게다가, 표적 유전자좌에서 치환되는 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 예를 들어, 길이가 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 길이가 100 내지 500개의 뉴클레오티드, 길이가 500개의 뉴클레오티드 내지 1 kb, 길이가 1 kb 내지 1.5 kb 뉴클레오티드, 길이가 1.5 kb 내지 2 kb 뉴클레오티드, 길이가 2 kb 내지 2.5 kb 뉴클레오티드, 길이가 2.5 kb 내지 3 kb 뉴클레오티드, 길이가 3 kb 내지 5 kb 뉴클레오티드, 길이가 5 kb 내지 8 kb 뉴클레오티드, 길이가 8 kb 내지 10 kb 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함하는, 임의의 원하는 길이의 것일 수 있다. 다른 경우에, 길이는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb, 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb일 수 있다. 또 다른 경우에, 길이는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개 이상의 뉴클레오티드, 또는 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb 또는 그 이상일 수 있다.
일부 표적화 벡터에서, 핵산 삽입물은 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb일 수 있다. 대안적으로, 핵산 삽입물은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb일 수 있다.
일부 경우에, 표적 유전자좌에서 핵산의 치환은 약 1 kb 내지 약 200 kb, 약 2 kb 내지 약 20 kb 또는 약 0.5 kb 내지 약 3 Mb의 범위의 표적 서열의 결실을 일으킨다. 일부 경우에, 결실의 정도는 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암의 총 길이보다 크다.
일부 경우에, 표적 서열의 결실의 정도는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb, 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb의 범위이다.
다른 경우에, 표적 유전자좌에서 치환되는 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 10 kb 이상, 20 kb 이상, 30 kb 이상, 40 kb 이상, 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 150 kb 이상, 200 kb 이상, 250 kb 이상, 300 kb 이상, 350 kb 이상, 400 kb 이상, 450 kb 이상 또는 500 kb 이상 또는 그 이상일 수 있다.
핵산 삽입물은 게놈 DNA 또는 임의의 다른 유형의 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입물은 원핵생물, 진핵생물, 효모, 조류 (예를 들어, 닭), 비인간 포유류, 설치류, 인간, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류 (예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이), 가축 포유류 또는 농업 포유류 또는 임의의 다른 관심 유기체 유래일 수 있다. 일 예에서, 삽입 폴리뉴클레오티드는 임의의 인간 또는 비인간 게놈 유전자좌를 포함할 수 있다.
표적 유전자좌에서의 핵산 삽입물 및/또는 핵산은 암호화 서열 또는 비암호화 서열, 예컨대 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 전사 억제인자-결합 요소)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입물은 내인성 유전자의 하나 이상 엑손의 녹인 대립유전자 또는 전체 내인성 유전자의 녹인 대립유전자 (즉, "유전자-교체 녹인")를 포함할 수 있다.
핵산 삽입물은 또한 조건 대립유전자를 포함할 수 있다. 조건 대립유전자는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, US 2011/0104799에 기재된 다기능 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 조건 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사에 대하여 센스 방향으로의 작동 서열; (b) 센스 또는 안티센스 방향으로의 약물 선택 카세트 (DSC); (c) 안티센스 방향으로의 목적 뉴클레오티드 서열 (NSI); 및 (d) 역 방향으로의 조건적 역위 모듈 (엑손-분할 인트론 및 가역적 유전자 트랩 유사 모듈을 사용하는 COIN)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 US 2011/0104799를 참조한다. 조건 대립유전자는 제1 재조합효소에 노출 시에 재조합하여, (i) 작동 서열 및 DSC를 포함하지 않고, (ii) 센스 방향으로의 NSI 및 안티센스 방향으로의 COIN을 포함하는 조건 대립유전자를 형성하는 재조합가능한 단위를 추가로 포함할 수 있다. US 2011/0104799를 참조한다.
일부 핵산 삽입물은 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 선택 마커는 선택 카세트에 포함될 수 있다. 이러한 선택 마커는 네오마이신 포스포트랜스페라아제 (neor), 하이그로마이신 B 포스포트랜스페라아제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라아제 (puror), 블라스티사이딘 S 데아미나아제 (bsrr), 잔틴/구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제 (gpt), 또는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-k), 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표적화된 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 표적화 벡터에서, 핵산 삽입물은 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 루시페라제, β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 고감도 녹색 형광 단백질 (eGFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 고감도 황색 형광 단백질 (eYFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 고감도 청색 형광 단백질 (eBFP), Ds레드, Zs녹색, MmGFP, m플럼, m체리, td토마토, m스트로베리, J-레드, m오렌지, mKO, m시트린, 비너스, Y펫, 에메랄드, 사이펫, 세룰리안, T-사파이어, 알칼리 포스파타아제 및 이들의 조합을 암호화하는 유전자이다. 이러한 리포터 유전자는 표적화된 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 표적화 벡터에서, 핵산 삽입물은 하나 이상의 발현 카세트 또는 결실 카세트를 포함한다. 주어진 카세트는 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 성분과 함께 목적 뉴클레오티드 서열, 선택 마커를 암호화하는 핵산 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택가능한 마커 및 리포터 유전자의 예는 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 논의된다.
일부 표적화 벡터에서, 삽입 핵산은 부위 특이적 재조합 표적 서열이 플랭킹된 핵산을 포함한다. 전체 삽입 핵산이 이러한 부위 특이적 재조합 표적 서열에 의해 플랭킹될 수 있지만, 삽입 핵산 내의 임의의 영역 또는 개별 목적 폴리뉴클레오티드도 이러한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 삽입 핵산 또는 삽입 핵산 내의 임의의 목적 폴리뉴클레오티드를 플랭킹할 수 있는 부위 특이적 재조합 표적 서열은, 예를 들어, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 예에서, 부위 특이적 재조합 부위는 삽입 핵산 내에 포함되는, 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 유전자를 플랭킹한다. 표적화된 유전자좌에서의 삽입 핵산의 통합 후에, 부위 특이적 재조합 부위 사이의 서열은 제거될 수 있다.
ii. 표적화 벡터
표적화 벡터는 핵산 삽입물을 표적 게놈 유전자좌로 도입하는 데 사용될 수 있으며, 핵산 삽입물 및 핵산 삽입물을 플랭킹하는 상동성 암을 포함한다. 표적화 벡터는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 참조하기 쉽게, 상동성 암은 본 명세서에서 5' 및 3' (즉, 상류 및 하류) 상동성 암으로서 지칭된다. 이 용어는 표적화 벡터 내에서 핵산 삽입물에 대한 상동성 암의 상대적인 위치에 관한 것이다. 5' 및 3' 상동성 암은 표적화된 유전자좌 내의 영역에 상응하며, 본 명세서에서 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로 지칭된다.
상동성 암 및 표적 서열이 상동성 재조합 반응에 대한 기질로서 작용하기 위해 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때, 두 영역은 서로에게 "상응하거나" 또는 "상응하고 있다". 용어 "상동성"은 상응하는 서열과 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 주어진 표적 서열과, 표적화 벡터에 발견되는 상응하는 상동성 암 사이의 서열 동일성은 상동 재조합이 일어날 수 있는 임의의 정도의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터 (또는 이의 단편)의 상동성 암과 표적 서열 (또는 이의 단편)이 공유하는 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있으므로, 서열은 상동 재조합을 일으킨다. 게다가, 상동성 암과 상응하는 표적 서열 사이의 상응하는 상동성 영역은 절단된 인식 부위에서 상동 재조합을 촉진시키기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 주어진 상동성 암 및/또는 상응하는 표적 서열은 (본 명세서의 다른 부분에 기재된 LTVEC 벡터에서 기재된 바와 같이) 길이가 적어도 약 5 내지 10 kb, 5 내지 15 kb, 5 내지 20 kb, 5 내지 25 kb, 5 내지 30 kb, 5 내지 35 kb, 5 내지 40 kb, 5 내지 45 kb, 5 내지 50 kb, 5 내지 55 kb, 5 내지 60 kb, 5 내지 65 kb, 5 내지 70 kb, 5 내지 75 kb, 5 내지 80 kb, 5 내지 85 kb, 5 내지 90 kb, 5 내지 95 kb, 5 내지 100 kb, 100 내지 200 kb 또는 200 내지 300 kb 또는 그 이상의 상응하는 상동성 영역을 포함할 수 있어서, 상동성 암이 세포의 게놈 내의 상응하는 표적 서열과의 상동 재조합을 일으키기 충분한 상동성을 갖게 된다.
상동성 암은 세포에 고유한 유전자좌 (즉, 표적화된 유전자좌)에 상응할 수 있거나, 예를 들어 도입유전자, 발현 카세트, 또는 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함하는 세포의 게놈 내로 통합되는 DNA의 이종성 또는 외인성 세그먼트의 영역에 상응할 수 있다. 대안적으로, 표적화 벡터의 상동성 암은 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체의 영역, 또는 적절한 숙주 세포에 포함되는 임의의 다른 유전자 조작된 영역에 상응할 수 있다. 또한 추가로, 표적화 벡터의 상동성 암은 BAC 라이브러리, 코스미드(cosmid) 라이브러리 또는 P1 파지 라이브러리의 영역에 상응하거나 이로부터 유래될 수 있다. 소정 경우에, 표적화 벡터의 상동성 암은 인간 iPS 세포 또는 완전 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포에 천연, 이종성 또는 외인성인 유전자좌에 상응한다. 일부 경우에, 상동성 암은 통상적인 방법을 사용하여 표적화할 수 없거나, 뉴클레아제 제제 (예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도되는 닉 또는 이중 가닥 절단의 부재 하에 단지 부정확하게 또는 단지 상당히 낮은 효율로 표적화될 수 있는 세포의 유전자좌에 상응한다. 일부 경우에, 상동성 암은 합성 DNA로부터 유래된다.
일부 표적화 벡터에서, 5' 및 3' 상동성 암은 세이프 하버(safe harbor) 유전자좌에 상응한다. 통합된 외인성 DNA와 호스트 게놈 사이의 상호작용은 통합의 신뢰성과 안정성을 제한할 수 있고, 표적화된 유전자 변형으로 인한 것이 아니라 대신에 주위 내인성 유전자에 대한 통합의 의도하지 않은 효과로 인한 명백한 표현형 효과를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 랜덤하게 삽입된 도입유전자는 위치 효과 및 침묵(silencing)을 거쳐, 이들의 발현을 신뢰할 수 없고 예측할 수 없게 만들 수 있다. 마찬가지로, 염색체 유전자좌로의 외인성 DNA의 통합은 주변 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 주어, 세포 행동 및 표현형을 변경할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 세포 행동 또는 표현형을 명백하게 변경하지 않고, 도입유전자 또는 다른 외인성 핵산 삽입물이 모든 목적 조직에서 안정적이고 신뢰성 있게 발현될 수 있는 염색체 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sadelain et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58]을 참조한다. 예를 들어, 세이프 하버 유전자좌는 외인성 DNA가 내인성 유전자 구조 또는 발현에 악영향을 미치지 않으면서 예측가능한 방식으로 통합되고 기능할 수 있는 염색체 유전자좌를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 유전자외 영역 또는 유전자내 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 필수적이지 않거나, 분배가능하거나, 명백한 표현형 결과 없이 파괴될 수 있는 유전자 내의 유전자좌와 같은 것이다.
예를 들어, 인간의 Rosa26 유전자좌 및 이의 등가물은 모든 조직에서 개방 염색질 배열을 제공하며, 배아 발생 동안 및 성인에서 편재적으로 발현된다. 문헌[Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3789-3794]을 참조한다. 또한, Rosa26 유전자좌는 고효율로 표적화될 수 있고, Rosa26 유전자의 파괴는 명확한 표현형을 생성하지 않는다. 적합한 유전자좌의 다른 예는 Ch25h 유전자좌이다.
표적화 벡터의 상동성 암은, 예를 들어 길이가 적어도 5 내지 10 kb, 5 내지 15 kb, 5 내지 20 kb, 5 내지 25 kb, 5 내지 30 kb, 5 내지 35 kb, 5 내지 40 kb, 5 내지 45 kb, 5 내지 50 kb, 5 내지 55 kb, 5 내지 60 kb, 5 내지 65 kb, 5 내지 70 kb, 5 내지 75 kb, 5 내지 80 kb, 5 내지 85 kb, 5 내지 90 kb, 5 내지 95 kb, 5 내지 100 kb, 100 내지 200 kb 또는 200 내지 300 kb 또는 그 이상을 포함하는, 상응하는 표적 서열과의 상동 재조합 이벤트를 촉진하기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 더욱 상세히 후술하는 바와 같이, 큰 표적화 벡터는 보다 길이가 긴 표적화 암을 사용할 수 있다.
뉴클레아제 제제 (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)가 표적화 벡터와 함께 사용되어, 표적 유전자좌의 변형을 도울 수 있다. 이러한 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터와 표적 유전자좌 사이의 상동 재조합을 촉진할 수 있다. 뉴클레아제 제제를 표적화 벡터와 함께 사용하는 경우, 표적화 벡터는 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하여 위치하는 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암을 포함하여, 뉴클레아제 절단 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단시 표적 서열과 상동성 암 사이의 상동 재조합 이벤트의 발생을 촉진시킬 수 있다. 용어 "뉴클레아제 절단 부위"는 닉 또는 이중 가닥 절단이 뉴클레아제 제제에 의해 생성되는 DNA 서열을 포함한다 (예를 들어, Cas9 절단 부위). 거리가 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단시 5' 및 3' 표적 서열과 상동성 암 사이의 상동 재조합 이벤트의 발생을 촉진시키는 경우, 표적화 벡터의 5' 및 3' 상동성 암에 상응하는 표적화된 유전자좌 내의 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 "충분히 근접하게 위치한다." 따라서, 구체적인 경우에, 표적화 벡터의 5' 및/또는 3' 상동성 암에 상응하는 표적 서열은 주어진 인식 부위의 1개 이상의 뉴클레오티드 내에 또는 주어진 인식 부위의 10개 이상의 뉴클레오티드 내지 약 14 kb 내에 존재한다. 일부 경우에, 뉴클레아제 절단 부위는 표적 서열의 적어도 하나 또는 둘 다에 바로 인접한다.
표적화 벡터의 상동성 암에 상응하는 표적 서열과 뉴클레아제 절단 부위의 공간적 관계는 다양할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위의 5'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 인식 부위의 3'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위를 플랭킹할 수 있다.
표적화 벡터 (예를 들어, 큰 표적화 벡터 포함)와 뉴클레아제 제제의 병용은 표적화 벡터 단독 사용과 비교하여, 표적화 효율 증가를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터를 뉴클레아제 제제와 함께 사용하는 경우, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터를 단독으로 사용하는 것과 비교하여, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 10배로 증가될 수 있다.
iii. 큰 표적화 벡터
일부 표적화 벡터는 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열에 대응하고 이로부터 유래되는 상동성 암을 포함하는 표적화 벡터를 포함하는 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"이다. LTVEC를 사용하여 표적화된 유전자 변형을 일으키는 방법의 예는, 예를 들어, 각각 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2015/088643, US 2015/0159175, US 2015/0159174, US 2014/0310828, US 2014/0309487 및 US 2013-0309670에 개시되어 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것들보다 큰 핵산 서열을 갖는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC는 이들의 크기 제한 때문에 전통적인 플라스미드-기반 표적화 벡터로 수용될 수 없는 큰 유전자좌의 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 통상적인 방법을 사용하여 표적화할 수 없거나, 뉴클레아제 제제 (예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도되는 닉 또는 이중 가닥 절단의 부재 하에 단지 부정확하게 또는 단지 상당히 낮은 효율로 표적화될 수 있는 세포의 유전자좌일 수 있다 (즉, 5' 및 3' 상동성 암은 이에 상응할 수 있음).
LTVEC의 예에는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체 (YAC)로부터 유래된 벡터가 포함된다. LTVEC의 비제한적인 예 및 이들을 제조하는 방법은 예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함되는, 미국 특허 제6,586,251호; 미국 특허 제6,596,541호; 미국 특허 제7,105,348호; 및 WO 2002/036789 (PCT/US01/45375)에 기재되어 있다. LTVEC는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있다.
LTVEC는 예를 들어, 약 50 kb 내지 약 300 kb, 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 75 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 125 kb, 약 125 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 175 kb, 약 175 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 225 kb, 약 225 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 275 kb 또는 약 275 kb 내지 약 300 kb를 포함하는 임의의 길이의 것일 수 있다. 대안적으로, LTVEC는 10 kb 이상, 15 kb 이상, 20 kb 이상, 30 kb 이상, 40 kb 이상, 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 150 kb 이상, 200 kb 이상, 250 kb 이상, 300 kb 이상, 350 kb 이상, 400 kb 이상, 450 kb 이상 또는 500 kb 이상 또는 그 이상일 수 있다. LTVEC의 크기는 너무 커서 종래의 분석, 예를 들어, 서던 블롯팅 및 장거리 (예를 들면, 1 kb 내지 5 kb) PCR에 의한 표적화 이벤트의 스크리닝을 가능하게 할 수 없다.
일부 경우에, LTVEC는 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb의 범위의 핵산 삽입물을 포함한다. 다른 경우에, 삽입 핵산은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb의 범위일 수 있다.
일부 LTVEC에서, 상류 상동성 암 및 하류 상동성 암의 총 합은 10 kb 이상이다. 다른 LTVEC에서, 상류 상동성 암은 약 5 kb 내지 약 100 kb의 범위이고/이거나 하류 상동성 암은 약 5 kb 내지 약 100 kb의 범위이다. 상류 및 하류 상동성 암의 총 합은, 예를 들어, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb일 수 있다.
일부 경우에, LTVEC 및 핵산 삽입물은 표적 유전자좌에서 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb의 결실이 가능하도록 설계된다. 대안적으로, 결실은 10 kb 이상, 20 kb 이상, 30 kb 이상, 40 kb 이상, 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 150 kb 이상, 200 kb 이상, 250 kb 이상, 300 kb 이상, 350 kb 이상, 400 kb 이상, 450 kb 이상 또는 500 kb 이상 또는 그 이상일 수 있다.
다른 경우에, LTVEC 및 핵산 삽입물은 표적 유전자좌로, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb의 범위의 외인성 핵산 서열의 삽입이 가능하도록 설계된다. 대안적으로, 삽입은 10 kb 이상, 20 kb 이상, 30 kb 이상, 40 kb 이상, 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 150 kb 이상, 200 kb 이상, 250 kb 이상, 300 kb 이상, 350 kb 이상, 400 kb 이상, 450 kb 이상 또는 500 kb 이상 또는 그 이상일 수 있다.
또 다른 경우에, 핵산 삽입물 및/또는 결실되는 내인성 유전자좌의 영역은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개 이상의 뉴클레오티드 또는 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb 이상 또는 그 이상이다.
iv. 상동 재조합에 의해 염색체 상의 인식 부위 부근에 핵산 삽입물을 통합하는 방법
일부 예에서, 만능성 세포에서 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법은 (a) 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포를 제공하는 단계, (b) 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된 제1 핵산 삽입물을 포함하는 제1 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 제1 핵산 삽입물을 이의 게놈에 포함하는 적어도 하나의 세포를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 논의되는 바와 같이, 구체적인 실시 형태에서, 표적화 벡터의 제1 상동성 암 및 제2 상동성 암의 총 합은 약 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 8 kb 내지 약 9 kb 또는 10 kb 이상 또는 10 kb 이상 내지 150 kb 미만이다. 구체적인 실시 형태에서, LTVEC가 사용된다. 하나의 비제한적인 실시 형태에서, 이러한 방법이 본 명세서에서 제공되는 배양 배지를 사용하여 수행된다.
다른 예에서, 만능성 세포에서 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법은 (a) 뉴클레아제 제제에 대한 인식 부위를 포함하는 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포를 제공하는 단계, (b) (i) 제1 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 뉴클레아제 제제; 및 (ii) 제1 인식 부위에 충분히 근접하여 위치하는 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된 제1 핵산 삽입물을 포함하는 제1 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 제1 핵산 삽입물을 이의 게놈에 포함하는 적어도 하나의 세포를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 논의되는 바와 같이, 구체적인 실시 형태에서, 표적화 벡터의 제1 상동성 암 및 제2 상동성 암의 총 합은 약 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 8 kb 내지 약 9 kb 또는 10 kb 이상 또는 10 kb 이상 내지 150 kb 미만이다. 구체적인 실시 형태에서, LTVEC가 사용된다. 하나의 비제한적인 실시 형태에서, 이러한 방법이 본 명세서에서 제공되는 배양 배지를 사용하여 수행된다.
다양한 방법이 또한 게놈 표적 유전자좌에서 통합된 핵산 삽입물을 갖는 만능성 세포를 동정하는 데 사용될 수 있다. 게놈 표적 유전자좌에서의 핵산 삽입물의 삽입은 "대립유전자의 변형"을 일으킨다. 용어 "대립유전자의 변형" 또는 "MOA"는 게놈에서 유전자(들) 또는 염색체 유전자좌(들)의 하나의 대립유전자의 정확한 DNA 서열의 변형을 포함한다. "대립유전자의 변형 (MOA)"의 예에는 단일 뉴클레오티드만큼 적은 결실, 치환 또는 삽입, 또는 목적 유전자(들) 또는 염색체 유전자좌(들)에 걸친 많은 킬로베이스의 결실뿐만 아니라, 이들 양극단 사이의 임의의 그리고 모든 가능한 변형이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 실시 형태에서, 표적화된 변형의 확인을 용이하게 하기 위해, 고 처리량 정량 분석, 즉, 대립유전자의 변형(MOA) 분석이 이용된다. 본 명세서에 기재된 MOA 분석에 의해, 유전자 변형 후에 부모 염색체에서 변형된 대립유전자(들)의 대규모의 스크리닝을 행할 수 있다. MOA 분석은 정량적 PCR, 예를 들어, 실시간 PCR (qPCR)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는, 다양한 분석 기술을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머-프로브 세트 및 비표적화된 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머-프로브 세트를 포함한다. 또한, 프라이머-프로브 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함한다. 정량 분석은 또한 형광-매개 원위치(in situ) 혼성화 (FISH), 비교 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정화 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, 인베이더 프로브(Invader Probes)®, MMP 어세이즈(assays)®, 택맨® 몰레큘러 비콘(Molecular Beacon) 및 이클립스(Eclipse)™ 프로브 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 분석 기술을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, US2005/0144655를 참조한다.
다양한 실시 형태에서, 닉 또는 이중 가닥 절단의 존재 하에서의 표적 게놈 유전자좌에서의 표적화 벡터 (예를 들어, LTVEC)의 표적화 효율은 닉 또는 이중 가닥 절단의 부재 시 (예를 들어, 목적 게놈 유전자좌에서 동일한 표적화 벡터 및 동일한 상동성 암, 및 상응하는 표적 부위를 사용하지만, 닉 또는 이중 가닥 절단을 생성시키는 뉴클레아제 제제가 첨가되지 않는 경우)보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배 더 높다.
상술한 다양한 방법은 임의의 수의 핵산 삽입물을 염색체 상의 주어진 표적화된 게놈 유전자좌로 표적화된 통합을 할 수 있도록 순차적으로 반복될 수 있다. 따라서, 다양한 방법은 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상 또는 그 이상의 핵산 삽입물의 삽입을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 이러한 순차적 타일링(tiling) 방법은 동물 세포 또는 포유류 세포 (즉, 인간, 비인간, 설치류, 마우스, 원숭이, 래트, 햄스터, 가축 포유류 또는 농업 동물)로부터 유래된 큰 게놈 영역을 염색체 상의 표적화된 게놈 유전자좌로 재구성할 수 있다. 이러한 경우에, 암호화 및 비암호화 영역을 포함하는 게놈 영역의 이동 및 재구성은 고유 게놈 영역 내에 발견된 암호화 영역, 비암호화 영역 및 카피수 다양성을 적어도 부분적으로 보유함으로써 주어진 영역의 복잡성을 보존하게 한다. 따라서, 다양한 방법은 예를 들어, 인간 iPS 세포 또는 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포 내의 "이종성" 또는 "외인성" 게놈 영역을 생성시키는 방법을 제공한다.
v. 목적 폴리뉴클레오티드
임의의 목적 폴리뉴클레오티드는 다양한 핵산 삽입물에 포함될 수 있으며, 이에 의해 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 표적화된 게놈 유전자좌에 통합될 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 목적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 경우, 핵산 삽입물 내의 목적 폴리뉴클레오티드는 만능성 세포에 하나 이상의 유전자 변형을 도입할 수 있다. 유전자 변형은 내인성 핵산 서열의 결실 및/또는 외인성 또는 이종성 또는 이종상동성 폴리뉴클레오티드의 표적 게놈 유전자좌로의 첨가를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 핵산 서열을 목적 외인성 폴리뉴클레오티드로 치환하는 것을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공되는 방법은 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서의 녹아웃, 결실, 삽입, 치환 ("녹인"), 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 이들의 조합을 포함하는 유전자 변형의 생성을 가능하게 한다. 이러한 변형은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 임의의 후속 핵산 삽입물을 표적 게놈 유전자좌로의 통합 시에 발생할 수 있다.
핵산 삽입물 내에 있고/있거나 표적 게놈 유전자좌에서 통합된 목적 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 만능성 세포에 고유하거나 상동성인 서열을 포함할 수 있거나; 목적 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 이종성일 수 있거나; 목적 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 외인성일 수 있거나; 목적 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 이종상동성일 수 있거나; 목적 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포와 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 서열과 관련하여 "상동성"은 세포에 고유한 서열을 포함한다. 서열과 관련하여 "이종성"은 외래종으로부터 유래된 서열이거나, 동일한 종으로부터 유래되는 것이라면, 의도적인 인간 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 유전자좌에서 이의 고유 형태로부터 실질적으로 변형된 서열을 포함한다. 서열과 관련하여 "외인성"은 외래종으로부터 유래된 서열을 포함한다. "이종상동성"은 다른 종 (즉, 종 변이체)의 알려진 참조 서열과 기능적으로 동등한 하나의 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 목적 폴리뉴클레오티드는 비인간, 설치류, 햄스터, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 조류, 농업 포유류 또는 비농업 포유류를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 목적 유기체로부터 유래될 수 있다. 목적 폴리뉴클레오티드는 암호화 영역, 비암호화 영역, 조절 영역 또는 게놈 DNA를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및/또는 임의의 후속 핵산 삽입물은 이러한 서열을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 인간 핵산에 상동성이다. 또 다른 실시 형태에서, 표적 유전자좌에서 통합된 목적 폴리뉴클레오티드는 게놈 핵산의 단편이다. 일 실시 형태에서, 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 인간 게놈 핵산, 비인간 핵산, 설치류 핵산, 래트 핵산, 햄스터 핵산, 원숭이 핵산, 농업 포유류 핵산 또는 비농업 포유류 핵산 또는 이들의 조합이다.
일 실시 형태에서, 상술한 바와 같이, 목적 폴리뉴클레오티드는 약 500개의 뉴클레오티드 내지 약 200kb의 범위일 수 있다. 목적 폴리뉴클레오티드는 약 500개의 뉴클레오티드 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb일 수 있다.
핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 삽입되는 목적 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화할 수 있거나, miRNA를 암호화할 수 있거나, 긴 비암호화 RNA를 암호화할 수 있거나, 예를 들어, 조절 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 억제인자 결합 서열 또는 비단백질 암호화 서열의 결실을 포함하나, 단백질 암호화 서열의 결실을 포함하지 않는 임의의 목적 조절 영역 또는 비암호화 영역을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 삽입되는 목적 폴리뉴클레오티드는 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨기계, 생식기계 또는 이들의 조합에서 발현되는 단백질을 암호화할 수 있다.
핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 암호화 서열에서의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 이러한 유전자 변형은 암호화 서열의 결실 돌연변이 또는 2개의 암호화 서열의 융합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 단백질은 결합 특성 변화, 국소성 변화, 발현 변화 및/또는 발현 패턴 변화를 특징으로 한다. 일 실시 형태에서, 핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 질환 대립유전자를 포함한다. 이러한 경우에, 질환 대립유전자는 우성 대립유전자일 수 있거나, 질환 대립유전자는 열성 대립유전자이다. 또한, 질환 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 대립유전자를 포함할 수 있다. 돌연변이 단백질을 암호화하는 목적 폴리뉴클레오티드는 포유류, 비인간 포유류, 설치류, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 농업 포유류 또는 가축 포유류를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있는, 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 억제인자 결합 서열 또는 전사 종결 서열을 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 핵산 삽입물 내에 있고/있거나 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 목적 폴리뉴클레오티드는 비단백질 암호화 서열의 결실을 포함하지만, 단백질 암호화 서열의 결실을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비단백질 암호화 서열의 결실은 조절 서열의 결실을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 조절 요소의 결실은 프로모터 서열의 결실을 포함한다. 일 실시 형태에서, 조절 요소의 결실은 인핸서 서열의 결실을 포함한다. 이러한 목적 폴리뉴클레오티드는 포유류, 비인간 포유류, 설치류, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 농업 포유류 또는 가축 포유류를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있는, 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 그렇게 참고로 포함되도록 지시되어 있는 것처럼 그와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다. 다양한 버전의 서열이 다양한 시점에서 수탁 번호와 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에서 수탁 번호와 관련된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선 출원의 출원일 중 더 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로 다양한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 지시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전이 의도된다. 본 발명의 임의의 특징부, 단계, 요소, 실시 형태, 또는 태양은 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 또 다른 실시 형태가 이러한 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 숙련가에게 상술한 상세한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시내용의 이점을 가지면서 구상될 수 있을 것이다. 따라서, 상기 방법 및 조성물은 개시된 구체적인 실시 형태에 한정되지 않으며, 변형 및 기타 실시 형태는 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 특정 용어가 사용되지만, 이들은 제한하기 위한 것이 아니고, 일반적이고 기술적인 의미로만 사용된다.
개시된 발명은 이들의 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어남이 없이 다른 구체적인 실시 형태로 구현될 수 있으므로, 본 발명의 범주를 나타내면서, 전술한 상세한 설명보다는 첨부된 청구항을 참조해야 할 것이다.
하기 실시예는 제한하는 것이 아니라, 예시할 목적으로 제공된다.
실시예
실시예 1. 인간 iPS 세포의 생성.
본 실시예는 비만능성 인간 세포로부터의 인간 iPS 세포의 생성을 설명한다. 샘플 프로토콜을 표 2에 나타낸다. CM7 프로모터에 작동가능하게 연결된 4개의 리프로그래밍 인자 (hOct4, hSox2, hKLF-4, hMYC)를 암호화하는 유전자를 포함하는 피기(Piggy)Bac (시스템 바이오사이언시스) 벡터 (PB-600A_CAGGGS Bst XI (0.64 ㎍/μL) 및 PB-200 (0.99 ㎍/μL)을 신생아 인간 포피 섬유아세포로 레드 및 블루 진인(GeneIn)™ 트랜스펙션 시약 (글로벌스템(GlobalStem))을 사용하여 도입하였다. 트렉스펙션된 세포를 E7 배지 (라이프 테크놀로지스)의 NuFF1 배양보조세포 상에 인큐베이션하여, 벡터의 혼입 및 리프로그래밍 인자의 발현을 가능하게 하였다. E7 배지는 DMEM/F-12, NaHCO3, L-아스코르브산, 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 및 FGF-2를 포함하였다.
퓨로마이신 선별을 E7 배지에서 2 ㎍/mL 퓨로마이신을 사용하여 트랜스펙션 10일 후에 시작하였다. 21일째에, 콜로니를 선별하고, DMEM/F-12, NaHCO3, L-아스코르브산, 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄, FGF-2, TGF-β1, 글루타티온, L-글루타민, 한정된 지질, 티아민, 미량 원소 B 및 C, β-메르캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 피페콜산, 염화리튬 및 GABA를 포함하는 mTeSR™ 배지 (스템셀 테크놀로지스의 mTeSR™1 배지)에서 배양하였다. mTeSR™ 배지 및 E7 배지 성분의 비교를 표 3 에 나타낸다. 29일째부터 57일째까지, 세포를 증식시키고, 6 웰 플레이트에서 ~50% 컨플루언트(confluent)에 도달할 때까지 mTeSR™ 배지에서 계대하였다. 65일째부터 73일째까지, mTeSR™ 배지 및 젠틀(Gentle) 세포 해리 시약 (스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies))를 사용하여 증식 및 계대를 계속하였다. 76일째에, 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC를 포함하는 세포의 추가 증식, 계대 및 유지를 위해 배지를 저삼투압 VG2i 배지로 변경하였다. 상기 방법에서 계대 시기를 세포 모폴로지에 의해 결정하였다.
[표 2]
Figure pct00006
[표 3]
Figure pct00007
실시예 2. 인간 iPS 세포에서의 LTVEC 표적화.
본 실시예는 인간 iPS 세포에서의 LTVEC 표적화의 사용을 설명한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는 다음의 핵산 분자를 VG2i 배지에서 증식시킨 인간 iPS 세포로 전기천공에 의해 도입하였다: (1) LTVEC (0.67 ㎍); (2) Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드 (5 ㎍); 및 (3) CRISPR 단일 가이드 RNA (gRNA)를 암호화하는 플라스미드 (10 ㎍). 한 세트의 샘플에서, Cas9 및 gRNA를 배제하였다. 구체적으로, 3 × 106개의 세포를 700V의 전압, 25 uF의 커패시턴스 및 400 ohm의 저항에서 전기천공하였다. LTVEC는 결실시키고자 하는 4.1 kb 서열의 인간 ADAM6 유전자좌를 플랭킹하는 게놈 영역으로부터 유래된 34 kb 및 105 kb의 게놈 DNA를 함유하는 상동성 암에 의해 플랭킹된 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 16.7 kb의 핵산을 포함하였다. LTVEC는 또한 항생제 (하이그로마이신)에 내성을 부여하는 효소의 발현을 유도하는 약물 선택 카세트를 보유하였다. 사용된 인간 ADAM6 gRNA는 다음의 서열을 가졌다: GTATAGCCCTGTTACACATT (서열 번호: 1).
LTVEC를 선택하여 게놈으로 통합시키는 세포는 항생제를 함유한 성장 배지에서 겔트렉스™-코팅된 조직 배양 접시에서 성장하여 콜로니를 형성할 수 있었다. 본 발명자가 LTVEC 분자보다 CRISPR/Cas9-암호화 핵산 분자를 500 내지 1,000배 더 도입하였기 때문에, 대부분의 LTVEC-함유 약물 내성 콜로니는 적어도 일시적으로 CRISPR/Cas9 성분을 또한 함유하였다. 본 발명자는 약물 내성 콜로니를 선별하고, 대립유전자 결실 방법(loss-of-allele method) (문헌[Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotech. 21:652-660]; 문헌[Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307]; 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨)으로 스크리닝하여, 정확하게 표적화된 대립유전자를 포함하는 클론을 확인하였다.
ADAM6 유전자좌의 CRISPR/Cas9-에 의한 LTVEC 표적화의 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00008
인간 iPS 세포로 LTVEC만을 도입하는 경우, 3.1%의 표적화 효율이 관찰되었다. 대조적으로, ADAM6 gRNA에 의해 유도된 Cas9와 LTVEC의 조합하는 경우 표적화 효율은 7.3%이었다.
실시예 3. 인간 iPS 세포 모폴로지에 대한 저삼투압 배지의 영향.
본 실시예는 배양 중인 인간 iPS 세포의 만능성 상태에 대한 염 농도, 이온 강도 및/또는 삼투압의 영향을 설명한다. 인간 iPS 세포를 표 5에 기재된 배지 (최종 hLIF 농도 100 U/mL; 최종 CHIR99021 농도 3 μM 및 최종 PD0325901 농도 0.5 μM) 또는 mTeSR™-hLIF 배지의 매트리겔™ 또는 겔트렉스™ 기질 상에서 배양하였다
[표 5]
Figure pct00009
[표 6]
Figure pct00010
사용되는 기본 배지가 DMEM인 경우, 이러한 배지는 2i 배지로 지칭된다. 사용되는 기본 배지가 VG-DMEM인 경우, 이러한 저삼투압 배지는 VG2i 배지로 지칭된다. VG2i 배지의 삼투압 (233 mOsm/㎏)은 종래의 2i 배지의 삼투압 (261 mOsm/㎏)보다 낮다. 표 6은 이러한 배지의 삼투압뿐만 아니라 상이한 기본 배지 및 배지 성분의 삼투압을 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 8일 (도 2a) 또는 12일 (도 2b) 동안 2i 배지에서 매트리겔™ 상에서 배양된 인간 iPS 세포는 준 상태의 iPS 세포의 모폴로지 특성, 특히 상피 단층으로 성장 및 정단-기저 극성의 출현을 나타내었다.
mTeSR™-hLIF 배지 및 VG2i 배지를 인간 iPS 세포의 모폴로지 및 만능성 상태에 대한 그들의 영향에 대해 추가로 평가하였다. 이러한 연구에서, 인간 iPS 세포를 6일 동안 mTeSR™-hLIF 배지 (도 3a 및 도 3c) 또는 VG2i 배지 (도 3b 및 도 3d)에서 매트리겔™ 또는 NuFF 배양보조세포 상에서 배양하였다. mTeSR™-hLIF 배지에서 매트리겔™ 또는 NuFF 배양보조세포 상에서 배양된 경우, 인간 iPS 세포는 준 만능성 상태의 모폴로지 특성, 특히 상피 단층으로 성장 및 정단-기저 극성의 출현을 나타내었다. mTeSR™-hLIF 배지에서 배양된 일부 세포는 3차원 응집을 특징으로 하는 모폴로지를 나타내기 시작하였다. 대조적으로, VG2i 배지에서 매트리겔™ 또는 NuFF 배양보조세포 상에서 배양된 경우, 인간 iPS 세포는 완전 만능성 상태의 모폴로지 특성, 특히 둥근 돔형 콜로니로 성장 및 정단-기저 극성의 결여를 나타내었다.
실시예 4. 인간 iPS 세포에서 만능성 마커의 발현에 대한 저삼투압 배지의 영향.
본 실시예는 준 상태에서 완전 상태로 리프로그래밍된 인간 iPS 세포에서 만능성 마커의 발현에 대한 염 농도, 이온 강도 및/또는 삼투압의 영향을 설명한다. VG2i 배지에서 매트리겔™ 기질 상에서 24일간 배양한 후, 리프로그래밍된 완전 인간 iPS 세포를 알칼리 포스파타아제 또는 NANOG의 발현에 대하여 염색하였다. 리프로그래밍된 세포가 알칼리 포스파타아제 (도 4a) 및 NANOG (도 4b 및 도 4c)를 강하게 발현하는 것으로 관찰되었으며, 이는 완전 만능성 상태를 나타낸다.
실시예 5. 인간 iPS 세포의 효소적 해리 및 계대배양에 대한 저삼투압 배지의 영향.
본 실시예에서, 저삼투압 VG2i 배지를 사용하여 완전 상태로 리프로그래밍된 인간 iPS 세포를 트립신을 사용하여 효소에 의해 해리시켜, 단일 세포 현탁액 (도 5a)을 생성하였다. 세포 현탁액을 VG2i 배지에서 계대배양을 위한 새로운 겔트렉스™-코팅된 플레이트 상으로 계대하였다. 1일 (도 5b) 및 4일 (도 5c) 후, 계대배양된 세포가 완전 만능성 상태의 세포의 모폴로지 특성을 계속해서 나타내는 것이 관찰되었다. 특히, 세포는 둥근 돔형 콜로니로 성장하였고, 정단-기저 극성을 보이지 않았다. 세포자멸-촉진 경로의 활성화를 방지하기 위해 전형적으로 필요한 ROCK 억제제의 부재 하에 효소적 해리가 수행될 수 있다는 것이 주목할 만하였다. 이는 세포자멸-촉진 경로가 본 명세서에서 확인된 조건 하에 배양된 완전 인간 iPS 세포에서 효소적 해리 및 계대배양 동안 강하게 활성화되지 않음을 시사한다. 또한, VG2i에서 배양되고 트립신을 사용한 효소적 해리에 이어서 단일 세포로 계대된 인간 iPS 세포는 정상 핵형을 유지한다. 상이한 클론으로부터 유래되고, 단일 세포 현탁액을 생성하도록 트립신을 사용한 해리 후 생성된, 2개의 계대 10 인간 iPS 세포를 핵형분석하였더니, 둘 모두 정상 46 XY 핵형을 나타내었다 (도 6a 및 도 6b).
SEQUENCE LISTING <110> Kuno, Junko Auerbach, Wojtek Valenzuela, David M. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING OR MAINTAINING PLURIPOTENT CELLS <130> 57766/469587 <150> US 62/064,384 <151> 2014-10-15 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 1 gtatagccct gttacacatt 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <220> <221> misc_feature <222> (2)...(21) <223> n = A,T,C or G <400> 2 gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

Claims (66)

  1. (a) hiPSC의 집단; 및
    (b) 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지를 포함하는 생체외(in vitro) 배양물로서, 여기서 저삼투압 배지는
    (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (iii) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 생체외 배양물.
  2. 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 제조되거나 유지되는 hiPSC의 집단으로서, 여기서 저삼투압 배지는
    (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (c) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압이 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 집단.
  3. 제1항의 생체외 배양물 또는 제2항의 집단으로서, hiPSC가
    (a) 완전(
    Figure pct00011
    ) 또는 완전해 보이는(
    Figure pct00012
    ) hiPSC를 포함하거나;
    (b) 하나 이상의 만능성 마커를 발현하거나;
    (c) 조밀한 돔형(dome-shaped) 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지(morphology)를 나타내거나;
    (d) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있거나;
    (e) 약 16시간 내지 약 24시간의 배가 시간을 가지거나;
    (f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합인, 생체외 배양물 또는 집단.
  4. 제1항 또는 제3항의 생체외 배양물 또는 제2항 또는 제3항의 집단으로서, hiPSC가 정상 핵형을 갖는, 생체외 배양물 또는 집단.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 만능성 마커가 NANOG, 알칼리 포스파타아제 또는 이들의 조합을 포함하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 집단으로서, hiPSC가 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로부터 유래되는, 생체외 배양물 또는 집단.
  7. 제6항에 있어서, 형질전환된 세포가 Oct4, Sox2, Klf4, Myc 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍(reprogramming) 유전자를 발현하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 형질전환된 세포가 준(primed) hiPSC를 포함하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 세포가 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 먼저 배양된 후, 저삼투압 배지에서 배양되는, 생체외 배양물 또는 집단.
  10. 제9항에 있어서, 고삼투압 배지의 삼투압이 약 290 mOsm/㎏ 이상인, 생체외 배양물 또는 집단.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    (a) 형질전환된 세포가 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (b) 형질전환된 세포가 약 2개월 동안 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (c) 형질전환된 세포가 3차원 세포 덩어리(clump)를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (d) 이들의 조합인, 생체외 배양물 또는 집단.
  12. 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항의 집단으로서, 기본 배지가 NaCl 약 3 mg/ml 및 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 이의 삼투압이 약 200 mOsm/㎏인, 생체외 배양물 또는 집단.
  13. 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 집단으로서, 기본 배지가 글루코스 약 4.5 mg/mL를 포함하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  14. 제1항 및 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지의 삼투압이 약 200 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 생체외 배양물 또는 집단.
  15. 제1항 및 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지의 삼투압이 약 233 mOsm/㎏인, 생체외 배양물 또는 집단.
  16. 제1항 및 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항의 집단으로서,
    (a) 보충물이
    (i) F-12 배지;
    (ii) N2 보충물;
    (iii) 신경기저(NEUROBASAL) 배지;
    (iv) B-27 보충물;
    (v) L-글루타민;
    (vi) 2-메르캅토에탄올; 또는
    (vii) (i) 내지 (vi)의 임의의 조합을 포함하거나;
    (b) LIF 폴리펩티드가 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이거나;
    (c) GSK3 억제제가 CHIR99021을 포함하거나;
    (d) MEK 억제제가 PD0325901을 포함하거나;
    (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합인, 생체외 배양물 또는 집단.
  17. 제1항 및 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지가 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  18. 제1항 및 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지가 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM을 포함하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  19. 제1항 및 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지가 bFGF 보충물; TGF-β1 보충물; JNK 억제제; p38 억제제; ROCK 억제제 및 PKC 억제제 중 하나 이상을 포함하지 않는, 생체외 배양물 또는 집단.
  20. 제1항 및 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항의 집단으로서, 저삼투압 배지가 bFGF 보충물을 포함하지 않는, 생체외 배양물 또는 집단.
  21. 제1항 및 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항의 집단으로서, hiPSC가 매트리겔(MATRIGEL), NuFF 배양보조세포(feeder cell) 또는 겔트렉스(GELTREX) 상에서 배양되는, 생체외 배양물 또는 집단.
  22. 제1항 및 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항의 생체외 배양물 또는 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항의 집단으로서, hiPSC가 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 계대배양될 수 있는, 생체외 배양물 또는 집단.
  23. 제22항에 있어서, 효소적 해리가
    (a) 트립신을 사용하여 수행되거나;
    (b) ROCK 억제제의 부재 하에 수행되거나;
    (c) 이들의 조합인, 생체외 배양물 또는 집단.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가
    (a) 계속해서 하나 이상의 만능성 마커를 발현하거나;
    (b) 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타내거나;
    (c) 이들의 조합인, 생체외 배양물 또는 집단.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가 정상 핵형을 유지하는, 생체외 배양물 또는 집단.
  26. 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포의 집단을 세포외 배양하는 단계를 포함하는, 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 집단을 제조하는 방법으로서, 여기서 저삼투압 배지는
    (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (c) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압이 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 방법이 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC의 집단을 풍부하게 하는(enrich), 방법.
  28. 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서, hiPSC의 집단을 배양하는 단계를 포함하는, hiPSC의 집단을 생체외 배양물에서 유지하는 방법으로서, 여기서 저삼투압 배지는
    (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (b) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (c) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 계대배양될 수 있는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 효소적 해리가
    (a) 트립신을 사용하여 수행되거나;
    (b) ROCK 억제제의 부재 하에 수행되거나;
    (c) 이들의 조합인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가
    (a) 계속해서 하나 이상의 만능성 마커를 발현하거나;
    (b) 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타내거나;
    (c) 이들의 조합인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가 정상 핵형을 유지하는, 방법.
  33. (a) 표적 게놈 유전자좌에서 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암에 의해 플랭킹된(flanked) 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 hiPSC로 도입하는 단계; 및
    (b) 표적 게놈 유전자좌에서 통합되는 삽입 핵산을 이의 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 hiPSC를 동정하는 단계를 포함하는, hiPSC의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법으로서,
    여기서 hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는
    (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (iii) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 표적화 벡터가 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이며, 5' 및 3' 상동성 암의 총 합이 10 kb 이상인, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 도입 단계 (a)는 표적화 벡터와 hiPSC의 표적 게놈 유전자좌 사이의 상동 재조합을 촉진하는 뉴클레아제 제제를 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 유전자 변형이
    (a) 내인성 인간 핵산 서열의 결실;
    (b) 외인성 핵산 서열의 삽입; 또는
    (c) 내인성 인간 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 치환을 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 외인성 핵산 서열이
    (a) 내인성 인간 핵산 서열에 상동성 또는 이종상동성(orthologous)인 핵산 서열;
    (b) 키메라 핵산 서열;
    (c) 부위 특이적 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 조건 대립유전자(conditional allele); 및
    (d) hiPSC에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  38. (a) 표적 게놈 유전자좌의 인식 부위에서 하나 이상의 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 하나 이상의 뉴클레아제 제제를 hiPSC로 도입하는 단계; 및
    (b) 표적 게놈 유전자좌에서 변형을 이의 게놈에 포함하는 하나 이상의 세포를 동정하는 단계를 포함하는, hiPSC의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법으로서,
    여기서 hiPSC는 기본 배지 및 보충물을 포함하는 저삼투압 배지에서 배양되고, 저삼투압 배지는
    (i) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
    (ii) 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제; 및
    (iii) MEK 억제제를 포함하며,
    기본 배지의 삼투압은 약 180 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 방법.
  39. 제33항 내지 제38 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가 단계 (a) 전에 효소에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 계대배양되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 효소적 해리가
    (a) 트립신을 사용하여 수행되거나;
    (b) ROCK 억제제의 부재 하에 수행되거나;
    (c) 이들의 조합인, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가
    (a) 계속해서 하나 이상의 만능성 마커를 발현하거나;
    (b) 완전 또는 완전해 보이는 상태를 유지하고, 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타내거나;
    (c) 이들의 조합인, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 계대배양된 hiPSC가 정상 핵형을 유지하는, 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 제제가
    (a) 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN);
    (b) 전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease; 탈렌(TALEN));
    (c) 메가뉴클레아제; 또는
    (d) 규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 관련 (Cas) 단백질 및 게놈 표적 서열 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인식하는 CRISPR RNA (crRNA)를 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, Cas 단백질이 Cas9인, 방법.
  45. 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 유전자 변형이 이대립인자성(biallelic)인, 방법.
  46. 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가
    (a) 완전 또는 완전해 보이는 hiPSC를 포함하거나;
    (b) 하나 이상의 만능성 마커를 발현하거나;
    (c) 조밀한 돔형 콜로니를 특징으로 하는 모폴로지를 나타내거나;
    (d) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있거나;
    (e) 약 16시간 내지 약 24시간의 배가 시간을 가지거나;
    (f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합인, 방법.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가 정상 핵형을 갖는, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 만능성 마커가 NANOG, 알칼리 포스파타아제 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  49. 제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가 만능 상태를 발현하도록 형질전환된 비만능성 세포로부터 유래되는, 방법.
  50. 제26항, 제27항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 세포가 Oct4, Sox2, Klf4, Myc 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리프로그래밍 유전자를 발현하는, 방법.
  51. 제26항, 제27항, 제49항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 세포가 준 hiPSC를 포함하는, 방법.
  52. 제26항, 제27항 및 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 세포가 bFGF를 포함하는 고삼투압 배지에서 먼저 배양된 후, 저삼투압 배지에서 배양되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 고삼투압 배지의 삼투압이 약 290 mOsm/㎏ 이상인, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    (a) 형질전환된 세포가 완전 또는 완전해 보이는 상태의 특성을 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (b) 형질전환된 세포가 약 2개월 동안 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (c) 형질전환된 세포가 3차원 세포 덩어리를 특징으로 하는 모폴로지를 나타낼 때까지 고삼투압 배지에서 먼저 배양되거나;
    (d) 이들의 조합인, 방법.
  55. 제26항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 기본 배지가 NaCl 약 3 mg/ml 및 중탄산나트륨 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 이의 삼투압이 약 200 mOsm/㎏인, 방법.
  56. 제26항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 기본 배지가 글루코스 약 4.5 mg/mL를 포함하는, 방법.
  57. 제26항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지의 삼투압이 약 200 mOsm/㎏ 내지 약 250 mOsm/㎏인, 방법.
  58. 제26항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지의 삼투압이 약 233 mOsm/㎏인, 방법.
  59. 제26항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 보충물이
    (i) F-12 배지;
    (ii) N2 보충물;
    (iii) 신경기저 배지;
    (iv) B-27 보충물;
    (v) L-글루타민;
    (vi) 2-메르캅토에탄올; 또는
    (vii) (i) 내지 (vi)의 임의의 조합을 포함하거나;
    (b) LIF 폴리펩티드가 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드이거나;
    (c) GSK3 억제제가 CHIR99021을 포함하거나;
    (d) MEK 억제제가 PD0325901을 포함하거나;
    (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합인, 방법.
  60. 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지가 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제 및 MEK 억제제로 본질적으로 이루어지는 억제제를 포함하는, 방법.
  61. 제26항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지가 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), 신경기저 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-메르캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 단위/mL, CHIR99021 약 3 μM 및 PD0325901 약 0.5 μM을 포함하는, 방법.
  62. 제26항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지가 bFGF 보충물; TGF-β1 보충물; JNK 억제제; p38 억제제; ROCK 억제제 및 PKC 억제제 중 하나 이상을 포함하지 않는, 방법.
  63. 제26항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 저삼투압 배지가 bFGF 보충물을 포함하지 않는, 방법.
  64. 제26항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, hiPSC가 매트리겔, NuFF 배양보조세포 또는 겔트렉스 상에서 배양되는, 방법.
  65. 제26항, 제27항, 제29항 내지 제32항, 제46항 내지 제48항 및 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 hiPSC.
  66. 제33항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 변형된 hiPSC.
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