CN114249823A - 混合的结合域 - Google Patents
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Abstract
混合的结合域。本发明涉及一种结合域或多聚体或其变体，以及用于制备此类结合域或多聚体或其变体的方法。本发明公开了一种结合域或多聚体或其变体，包括由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区，该可变区与人类可变区配对。
Description
本申请是申请号为201980086027.8、发明名称为“混合的结合域”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2019年12月27日提交的PCT国际专利申请PCT/NL2019/050877进入中国国家阶段的申请。
本发明涉及一种结合域或多聚体或其变体，以及用于制备此类结合域或多聚体或其变体的方法。该结合域或多聚体或其变体包括基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的可变区，其中此类可变区与同源链的人类可变区配对。本发明还涉及适于肽展示的噬菌体或其他生物体，该噬菌体或其他生物体在其基因组中包括编码结合域或多聚体或其变体的核酸；包括多个此类生物体的展示文库；以及用于制备此类展示文库的方法。另外，本发明涉及产生此类结合域或多聚体或其变体的宿主细胞。另外，本发明涉及包括该结合域或多聚体或其变体的药物组合物；其在通过疗法治疗人类或动物中的用途；以及使用该结合域或多聚体或其变体治疗患有医学适应症的人类或动物的方法。
背景技术
Kohler及Milstein开发的融合瘤技术为使用抗体预防及治疗人类疾病打开了大门，且小鼠变成产生抗体的常见选择。
起初，曾试图使用小鼠抗体直接用于人类疗法。在向人类施用小鼠抗体引起免疫原性反应而经历人类抗小鼠抗体(HAMA)反应，导致疾病且潜在地死亡之后，开发出了具有免疫系统的转基因小鼠，其带有编码人类可变区和/或恒定区的核酸，能够产生抗体，接着可分析此类抗体以开发人类治疗剂。类似地，用编码人类免疫球蛋白的核酸产生噬菌体展示文库。此类人类化小鼠及噬菌体展示文库有利于促成当今市场上的一批成功治疗性抗体，进一步促成临床开发。
人类转基因动物先前还已有描述，此类转基因动物在此类动物的种系中带有核酸，该核酸编码含经重排轻链或重链可变链的人类共同免疫球蛋白链，且编码同源链的未重排的可变区。此类转基因动物能够产生具有多样性的抗体，该多样性是经由免疫球蛋白的二条同源链之一，例如未重排的重链或轻链产生，该二条同源链之一在B细胞发育期间经历体细胞重组且在抗原暴露之后经历亲和力成熟。这些转基因动物，诸如
小鼠(例如WO2009/15771)能够产生针对一系列抗原的不同抗体谱系，其中编码或基于例如针对不同抗原或同一抗原的不同表位的此类谱系的重链可变区的核酸接着可组合于宿主细胞中，此类宿主细胞编码大量双特异性抗体
可容易地筛选出高效产生具有不同且新颖的生物学的双特异性抗体的此类细胞(例如WO2017/069628)。
尽管人类化转基因小鼠引起了医学上的重大突破并为进一步发展提供前景，但考虑到小鼠与人类之间的进化相似性，抗原上可存在对于人类而言属于免疫盲点的表位(例如自体抗原)，此类表位类似地对于在进化上类似于人类的转基因小鼠或其他动物可属于免疫盲点。由于人类及小鼠共有许多针对给定抗原的保守域，故此可能引起在无附加劳力修饰转基因动物或参与可能费力地免疫接种方案情况下，免疫接种此类转基因动物可能以较低电平产生或完全不产生抗体的情形。
类似地，还存在免疫接种转基因生物体产生抗体，但此类抗体在人类及转基因动物中不交叉反应，使得此类抗体的分析及测试不太高效的情形。另外，用相同目标免疫接种野生型动物，诸如啮齿动物或小鼠，及免疫接种具有人类化免疫系统的转基因动物可能产生由结合物种间类似的表位的抗体构成的抗体谱系的情形相当少见。
因此，需要产生识别人类抗原上的新颖表位的治疗性抗体。
发明内容
不受任何理论束缚，本发明人咸信，人类与免疫接种的动物(其中此类动物在进化上接近于人类)之间的进化相似性可在此类动物中引起免疫反应，由此产生靶向与人类谱系产生的抗体相同或类似的表位的抗体，从而可能产生此类转基因动物无法鉴别的新颖或新表位。换句话讲，一般而言，进化相似性产生识别在各物种之间不同的表位的抗体谱系且通常不产生识别在各物种之间相似或一致的表位的抗体。
因此，可能有益的是，获得含有可变区和/或互补决定区(CDR)的结合域或抗体，包括嵌合或人类化结合域或抗体，以及编码此类可变区的核酸，此类核酸是基于、来源于或获自在进化上远离人类的核酸。此可允许产生新颖抗体，包括能够结合具有来自人类及在进化上更接近的物种(例如啮齿动物及其他哺乳动物物种)的可变区的人类、人类化或嵌合抗体无法容易地鉴别的表位的抗体。使用在进化上较远的物种产生带有可变区的结合域或抗体以及基于、来源于或获自此类物种的核酸的编码此类可变区的核酸在产生具有人类、鼠类及食蟹猕猴交叉反应性的抗体的能力方面还提供优势。
此类可变区的一个潜在来源可为能容易地培育且在受控环境中免疫接种的鸟类，例如家养鸟类，诸如鸡、鸭及鸵鸟。在长达3亿年里，鸟类与人类没有共同的祖先，且为主龙类动物中的少数已知存活者。此在进化上远离人类的动物类别的可变区及免疫系统使其呈现适于产生一定力价抗体的免疫反应，此类抗体能够结合在哺乳动物(例如人类、啮齿动物及食蟹猕猴)间保守且对于此类哺乳动物可为免疫盲点或免疫受损的治疗目标。另外，当与经由免疫接种小鼠或在进化上接近于人类的其他物种(例如啮齿动物及食蟹猕猴)产生的抗体相比较时，经由免疫接种鸟类，例如鸡、鸭及鸵鸟产生的抗体谱系可鉴别特有的表位。
不受任何理论束缚，此可归因于人类与诸如鸡的类鸟类之间的进化距离。例如，相较于人类免疫反应或所采用的经典转基因动物，诸如小鼠、大鼠或兔等动物的免疫反应，鸡互补决定区(CDR)中的氨基酸用法不同，如例如鸡HCDR3序列中酪胺酸的表示异常低及半胱胺酸的表示异常高，以及该谱系针对抗原的免疫原性反应不同于人类(及在进化上关系更近的物种)针对同一抗原产生的免疫原性反应使得能够产生独特的抗体。
先前，使用带有基于、来源于或获自与人类高度不相关的动物的核酸的可变区和/或CDR的抗体(例如鸡抗体)的免疫原性风险已被理解为此类抗体的使用的一大障碍，该风险高于利用诸如小鼠的类在进化上更接近的物种的风险。使具有基于、来源于或获自鸟类核酸的序列的抗体多肽人类化，由此使此类抗体的可变区或互补决定区可移植至人类抗体形式上，已被理解为将此类抗体或包括此类可变区的抗体用于人类临床开发或治疗环境的一大障碍。
另外，将鸟类(例如鸡)抗体可变区或抗体域与人类抗体形式组合以产生嵌合鸡/人类抗体的能力已被视为可能使来自此类谱系的此类抗体不稳定和/或损失其亲和力及功效的艰巨且不确定的经历，还限制了利用此类抗体以及利用宿主产生抗体的益处的有用性。
因此，至少出于以上提供的原因，包括基于、来源于或获自在进化上远离人类的动物的核酸的可变区与同源链的人类可变区配对的包括抗体在内的结合域或多聚体，及其变体；以及制备包括抗体在内的此类结合域或多聚体的方法；编码其的核酸；展现此类结合域的可变区的展示文库的制造；包括抗体在内的此类结合域或多聚体的筛选；产生其的宿主细胞的制备；以及包括其的药物是特别合乎需要的且为此项技术中的一大进步，并且此类发明在此处有陈述。
尽管在鸟类与人类之间的进化距离使得许多蛋白质多样化，且尽管事实上，鸟类物种的有限数量的功能性VH基因区段与人类VH基因区段在初级氨基酸序列层面上不共有显著同源性，但本发明人在分析经重排的可变区时已鉴别出，鸡、鸭及鸵鸟VH基因区段与人类VH基因区段共有显著的三级结构相似性。
例如，已基于具有MF3178(PDB登录号5O4O)的人类Fab的晶体结构产生人类/鸡混合Fab的3D同源模型，该人类Fab包括具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的重链可变区并具有SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的轻链可变区，且其结合Her3。MF3178是来源于亲本VH1-02可变基因区段且包括人类共同轻链。在该模型中，人类VH区经模型化VH区置换，该模型化VH区是基于自鸡Fab的结构获取的鸡VH区的氨基酸序列。分析该模型显示，在鸡VH区与人类共同轻链界面之间存在24个非键结静电相互作用，而在MF3178与轻链的完全人类界面中鉴别出20个非键结静电相互作用。由此表明，在鸡VH与人类VL之间的界面是极佳的且该人类/鸡混合Fab在这些相互作用下稳定且稳定性可能高于完全人类Fab。此是特别出乎意料的，因为功能性鸡V基因区段与作为本文举例说明的MF3178的来源的人类VH1-02基因区段之间的初级氨基酸序列同源性电平较低，仅具有43％序列同一性。
因此，本发明人在本文中描述的结合域包括由鸟类产生的经重排VH区，此类经重排VH区与人类VL区直接配对形成一种新颖类型的混合或嵌合结合域。可产生包括此类VH及VL区的Fab，其CH1及CL区可均为人类的或均为在进化上远离人类的动物(诸如鸟类，包括鸡、鸭或鸵鸟)的。另外，可能的情况是，该CH1区属于在进化上较远的动物且该CL区是人类的。该CH1区是人类的且该CL区属于在进化上较远的动物还是可能的。
例如，鸡重链可变区与人类重链可变区在三级结构层面上共有同源性，使得自经免疫接种的鸡分离的鸡经重排VH区可与人类可变轻链(VL)区，且优选地与可充当共同链的VL区直接配对，以产生多种结合域、多聚体、抗体或变体，其中此类域的多样性及结合至感兴趣抗原的能力主要归因于鸡重链可变区。此类混合的结合域可稳定地形成，无需鸟类可变区与人类可变区在B细胞成熟期间共同进化，而实际上，可通过使用例如野生型经重排鸟类重链可变区并使其与人类轻链，优选地与人类共同轻链配对而容易地组合成混合的结合域。此技术允许制造展示文库，此类展示文库允许大规模筛选用于潜在地鉴别已知抗原的新颖结合的此类混合的结合域以及可跨哺乳动物物种交叉反应的混合的结合域。
以此方式，可由人类可变区，诸如人类重链或轻链可变区，优选地人类共同重链或共同轻链可变区与鸟类，诸如鸡、鸭及鸵鸟的经重排可变重链或轻链可变区配对直接地产生嵌合结合域、多聚体及抗体。使用人类轻链可变区，优选地人类共同轻链可变区，而不是同源鸟类轻链可变区是优选的。首先，通过使用人类共同轻链可变区，使该结合域的一半直接地人类化。其次，通过使用人类共同轻链可变区，鉴别出与人类共同轻链可变区配对的野生型鸟类重链可变区，且接着其能够用于高效产生抗体，尤其是双特异性抗体，或多价多聚体。
Fab是由重链及轻链部分构成，该重链及轻链部分应一起形成无法展开的域结构，且出人意料的是，当将来自在进化上较远的物种的重链及轻链组合时，此操作形成稳定结合域。使用呈现技术允许鉴别来自在动植物演化史上与人类关系较远的动物的重链可变区链，在来源于另一抗体/动物/物种的(共同)轻链的情况下，此类重链可变区链能够结合抗原(用于对此类动物免疫接种)。
意外地是，如本文所描述，编码来自与人类关系较远的动物且结合至感兴趣抗原的抗体谱系的重链可变区的核酸能够与人类轻链配对。由此产生能够结合包括天然VH/VL配对的抗体所结合的抗原的稳定VH/VL界面。
编码这些结合域(包括一方面人类可变区与另一方面鸟类可变区配对)的核酸可容易地整合至宿主细胞中。此类宿主细胞接着可表达一个或多个重链可变域以及一个共同人类轻链，由此允许制造大量能够结合一系列不同抗原的多聚体，包括多特异性抗体，包括靶向基于或来源于人类可变基因区段或基于或来源于在进化上更接近于人类的物种，诸如啮齿动物及其他哺乳动物的可变基因区段的多种抗体无法容易地鉴别的表位的抗体。另外，相较于完全人类可变区，或具有基于、来源于或获自经免疫接种的在动植物演化史上更接近于人类的动物的核酸的可变区的抗体，包括与人类可变区配对的来自与人类关系较远的动物的可变区的此类结合域更易于与多种哺乳动物(包括鼠类、人类及食蟹猕猴)中存在的抗原交叉反应。
申请人先前已描述由含有编码两个或更多个不同免疫球蛋白可变链(重链或轻链可变链)及一个共同可变链(重链或轻链共同可变链)的核酸的宿主细胞表达双特异性及多特异性抗体的能力，且以此方式，相对于同二聚体抗体，通过使用Fc区工程改造，包括CH3工程改造以驱使重链异二聚体的形成，此类可变链可经配对以优先产生此类双特异性及多特异性抗体(WO2013/157954)。使不同重链异二聚化的其他方式，包括经由CH3工程改造电荷差异或孔中节(knob-in-hole)进行的异二聚化，同样是此项技术中已知的。
因此，本文所揭露的发明涉及结合域及多聚体，诸如抗体，其包括共同可变区或共同链，通常人类共同可变区或共同链，以及由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的生物体，诸如鸟类的核酸的核酸所编码的同源可变区或同源链。例如，该共同链可为共同轻链(cLC)，诸如人类共同轻链，且该同源可变区可为由基于、来源于或获自包括鸡、鸭及鸵鸟在内的鸟类的核酸的核酸所编码的重链可变区(VH)。
人类轻链可变区，优选地人类共同轻链可变区与由基于、来源于或获自鸟类的核酸的核酸所编码的VH区(或反之亦然)配对有助于制造结合域、多聚体及抗体，其可接近经由传统抗体产生平台，包括使用人类合成噬菌体展示文库及带有人类化免疫系统的转基因生物体不可接近或结合的表位。
此外，包括来自在动植物演化史上远离人类的动物，优选地来自诸如鸡的类鸟类的可变区与人类链、优选地人类共同链的配对的结合域、多聚体及抗体的产生可用于产生双特异性及多特异性多聚体，包括抗体及变体。使用人类链、优选地人类共同链允许使该结合域的一半直接地人类化。在动植物演化史上远离人类的动物在本文中可称为“适用于本发明的动物”。
与所有高等脊椎动物中相同，鸟类(诸如鸡)VH/VL区原有的多样性是由V(D)J重组，随后亲和力成熟产生。
与具有可用于V(D)J重组的多个功能性V、D及J基因区段的人类及诸如小鼠的类哺乳动物相比，多种鸟类，例如鸡、鸭及鸵鸟，仅含有限数量的分别针对VH、JH、VL及JL的功能性基因区段，以及一组功能性D基因区段。实际上，鸡及鸵鸟仅具有一个功能性V基因区段。例如，鸭可具有少至一个或两个功能性重链V基因区段。
由于在基因转化过程中，重组VH及VL区经由与一组包括对应V(D)序列(其一部分)的假基因同源重组而多样化，使得在鸡中产生免疫谱系的附加多样化。这些非功能性假基因缺乏重组信号序列、启动子、信号肽及Kozak转译起始位点。此过程与所产生的VH及VL区的体细胞超突变相结合，产生具有高度多样化的CDR的鸡抗体谱系，而构架(FW)序列仍与原始功能基因极其类似；由于鸡不具有JH/JL假基因，故在FW4中未引入或引入有限的突变。在鸡中，主要抗体同型是IgY，其在结构上及功能上类似于哺乳动物中的IgG，且因此通常被误标记为IgG(Renaud等人，《细胞(Cell)》40，283-291，1985；Renaud等人，Cell，48，379-388，1987；Renaud等人，《细胞》，59，171-183，1989；以及Wu等人，《免疫学杂志(The Journal ofImmunology)》，188，322-333，2012)。
已制造并在本文中揭露基于人类Fab MF3178(PDB登录号5O4O)的晶体结构产生(参见以下实施例)的人类/鸡混合Fab的3D同源模型，该人类Fab MF3178结合Her3且其中VH区是基于具有SEQ ID NO：1中所示序列的氨基酸序列。MF3178是来源于亲本VH1-02可变基因区段且与IgVκ1-39*01/IGJκ1*01共同轻链配对。
在该模型中，人类VH区经模型化VH区置换，该模型化VH区是基于自鸡Fab(PDB4GLR)的结构获取的鸡VH区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(Shih等人，《生物化学杂志(J.Biological Chemistry)》287，44425-44434，2012)。意外地是，分析该模型显示，在鸡VH区与IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链界面之间存在24个非键结静电相互作用，而在MF3178(图4a)与轻链的完全人类界面中鉴别出20个非结的静电相互作用。因此，本文描述一种混合的结合域，其是自与人类同源可变区直接配对的野生型鸡可变区获得，具有大量接触残基及能够形成稳定界面的静电相互作用。
在嵌合鸡VH区/人类cLC界面处，有十(10)个静电相互作用与包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的人类VH及VL的界面一致，且在鸡VH区与人类共同轻链之间的相互作用中有二(2)个是在鸡VH区与人类Fab的人类VH区中的等效位置处发现的同源残基之间形成，该人类Fab包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区。另外，相较于包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的人类VH/VL相互作用，在鸡VH区/人类共同轻链界面中存在较多氢键，十二(12)个对比六(6)个，表明在鸡VH区与人类VL界面之间的稳定性潜力大于包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的完全人类结合域的稳定性。
类似地，已展示，对于具有有限的功能性V基因区段的鸭而言，经重排的重链可变区与人类cLC产生界面，由此产生多个接触点及静电相互作用。人类VH经模型化VH置换，该模型化VH是基于自Genbank登录号A46529的氨基酸1至133的结构获取的鸭VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
意外地是，分析该模型显示，在鸭VH区与人类IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链可变区界面之间存在28个非键结静电相互作用，相比的下，在包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的完全人类界面中鉴别出20个非键结静电相互作用(参见图10a)，且当将鸭重链/人类轻链与在包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的相同位置处发现的人类重链/人类轻链相比较时，此类相互作用中有12个是一致的且有一个是等效的。
进一步展示，对于具有有限的功能性V基因区段的鸵鸟而言，鸵鸟的经重排重链可变区与人类cLC产生界面，由此产生多个接触点及静电相互作用。人类VH经模型化VH区置换，该模型化VH区是基于自Genbank登录号AFN02388.1(SEQ ID NO：4)的结构获取的鸵鸟VH区的氨基酸序列，且在鸵鸟VH区与共同轻链界面之间存在14个非键结静电相互作用。
在嵌合鸵鸟VH区/人类cLC界面处，有七(7)个静电相互作用与包括具有SEQ IDNO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的人类VH及VL一致，且在鸵鸟VH区与人类VL之间有一(1)个相互作用是在包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的人类重链/人类轻链的相同位置处发现的同源残基之间形成。
因此，本发明人确定，鸟类的重组且亲和力成熟的重链可变区，例如鸡重链可变区可与人类轻链可变区，优选地共同轻链可变区或共同轻链，更优选地种系轻链可变区或轻链，例如IgVK1-39*01/IGJK1*01直接地配对，以获得功能性结合域，例如Fab、F(ab′)n或scFv域，包括用于产生二价抗体及多价抗体以及其他多聚体，无需经由在例如转基因生物体中发生的B细胞发育及亲和力成熟，或深入的抗体工程改造实现鸡VH及人类VL的共同进化。
原则上，遵循此处所陈述的技术及教示，可获取任何在进化上较远的动物，例如鸟类，诸如鸡的抗体，且用人类轻链或轻链可变区，特别是人类共同轻链或人类共同轻链可变区置换同源鸡轻链或轻链可变区。
鸟类的重组且亲和力成熟的重链可变区与人类轻链可变区，特别是共同轻链之间的结构同源性由此允许产生嵌合文库，自此类嵌合文库可选出鸟类的重链可变区主导亲和力及特异性的抗体。产生包括人类共同链且与野生型鸟类经重排链配对的文库允许鉴别能够在不与其野生型同源链配对存在下特异性结合感兴趣抗原的此类鸟类经重排链。因此，此文库允许鉴别此类重链及编码其的核酸以高效产生双特异性抗体或多价多聚体。
换句话讲，本文所揭露的发明包括新颖混合的结合域，例如该混合的结合域可呈多聚体或抗体形式，其包括与人类VL区配对的由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，诸如鸟类的核酸的核酸所编码的VH区。通常，此类动物是仅具有有限的V基因区段谱系，例如具有一、二、三或四个重链V基因区段的动物。其也可例如为V区与人类V区具有结构相似性的动物。
优选地，此类结合域包括人类轻链，例如人类共同轻链，更优选地种系轻链可变区或轻链，例如IgVK1-39*01/IGJK1*01。此类结合域，或并入此类结合域的抗体、多聚体或变体可直接适用作治疗剂，或经历进一步人类化，包括CDR移植及其他修饰。
根据本发明，由此提供一种结合域、多聚体、抗体或其变体，其包括由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物(“适用于本发明的动物”)的核酸的核酸编码的可变区，该可变区与人类可变区配对。在此类结合域中，适用于本发明的动物的VH区与人类VL之间接触点的数量可实质上类似于和/或优选地至少多达在人类VH区与人类VL结合域，诸如本文关于包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab举例说明的人类VH区与人类VL结合域之间存在的数量。
此类结合域、多聚体、抗体或变体谱系可制备成例如文库形式。此类结合域、多聚体、抗体或变体谱系也可例如通过用人类轻链或轻链可变区，特别是人类共同轻链或人类共同轻链可变区置换适用于本发明的动物的抗体的同源轻链或轻链可变区制备。可选择具有所希望的特异性的结合域、多聚体、抗体或变体。
根据本文所揭露的发明，由此提供一种结合域、多聚体、抗体或其变体，其包括由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸的核酸编码的可变区，该可变区与人类可变区配对。本发明还包括此类结合域、多聚体、抗体或变体谱系。
根据本文所揭露的发明，由此提供一种结合域、多聚体、抗体或其变体，其包括与人类可变区配对的由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区，其中此类结合域包括4个、优选地5个、优选地8个且更优选地10个或更多个静电相互作用，此类静电相互作用与在结合域的人类重链/人类轻链可变区界面诸如本文关于包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab所举例说明的人类重链/人类轻链可变区界面中存在的静电相互作用一致或等效。
该在动植物演化史上远离人类的动物可为如上文所描述的鸟类，优选地为鸡、鸭及鸵鸟。
本发明还提供一种用于制备混合的结合域的方法，该方法包括：
-使在动植物演化史上远离人类的动物，诸如鸟类暴露于抗原；
-自该动物分离出编码重链或轻链可变区的核酸；以及使由经分离的核酸编码的重链或轻链可变区与人类重链或轻链可变区配对，由此形成混合的结合域。
该混合的结合域可用于制备抗体或其变体，特别是多特异性抗体，诸如双特异性或三特异性抗体。
本发明还提供一种用于制备抗体或其变体的方法，该方法包括：
-使在动植物演化史上远离人类的动物，诸如鸟类暴露于抗原；
-自该动物分离出编码重链或轻链可变区的核酸序列，此类重链或轻链可变区能够结合该抗原；以及
制备展示文库，其中此类重链或轻链可变区是是由分离自、基于、来源于或获自该鸟类的核酸的遗传物质编码，且其中此类重链或轻链可变区与人类同源链可变区配对形成混合的结合域。
所述文库可包括噬菌体、酵母、核糖体或此项技术中已知的用于肽呈现的其他容器。
可使用本发明的文库，例如噬菌体展示文库，鉴别或选择来自鸟类的能够与同源链可变区结合的重链或轻链可变区。进行选择以确定该文库内当与人类(共同)轻链或重链组合时能够结合该抗原以最终用于对该鸟类免疫接种的来自鸟类的重链或轻链。
本发明还提供：
-本发明的噬菌体，该噬菌体在其基因组中包括：编码至少部分地基于、来源于或获自鸟类重链区的重链可变区的核酸序列；以及编码人类轻链可变区的核酸序列；
-噬菌体展示文库，其包括多个本发明的噬菌体；
-一种用于制备噬菌体展示文库的方法，该方法包括：
用抗原对鸟类免疫接种；
自该动物分离出编码重链可变区的多个核酸序列，此类重链可变区能够结合该抗原；以及
使用此类核酸序列制备噬菌体展示文库，
由此制备出噬菌体展示文库；
-一种用于制备噬菌体展示文库的方法，该方法包括：
用抗原对鸟类免疫接种，其中该动物包括功能性VH基因区段，其包括与人类VL可变区在VH/VL界面处的5个、优选地8个且更优选地10个静电相互作用；
自该动物分离出编码重链可变区的多个核酸序列，此类重链可变区能够结合该抗原；以及
使用此类核酸序列制备噬菌体展示文库，
由此制备出噬菌体展示文库；
-一种通过使用本发明的噬菌体展示文库鉴别结合域或多聚体或其变体的方法；
-一种宿主细胞，其包括至少部分地基于、来源于或获自鸟类核酸的编码两个或更多个的重链可变区的核酸，该两个或更多个重链可变区能够结合表位且与人类轻链配对，优选地其中每个编码的重链可变区能够结合相同或不同的目标或一个目标上的不同表位；
-一种至少部分地基于、来源于或获自鸟类核酸的编码两个或更多个的重链可变区的核酸，该两个或更多个重链可变区能够结合表位且与人类轻链配对，能够表达及多聚化形成可变结合域，优选地多聚体、抗体或其变体，且更优选地多特异性多聚体、抗体或其变体；
-一种药物组合物，其包括根据本发明中的任一个的抗体及药学上可接受的载剂和/或稀释剂；
-本发明的抗体，其通过疗法而用于治疗人类或动物身体；以及
-一种用于治疗患有医学适应症的人类或动物的方法，该方法包括向该人类或动物施用治疗有效量的本发明的抗体。
附图说明
图1示出经由AlignX获得的由一个功能性鸡VH基因区段(VH1)与47个人类种系VH基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对，该47个人类种系VH基因区段表示7个VH家族中的每一个。每个人类VH基因区段的一致性百分比是在括号间给出。AlignX是VectorNTI Advance 11.5.2软件的一个组件，且比对是使用预设设置获得。
图2示出由鸡VH1基因区段与人类VH1-02基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对。根据Kabat编号的CDR残基以虚线显示。
图3示出由仅一个功能性鸡JH与六(6)个人类JH基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对。根据Kabat编号的CDR残基以虚线显示。
图4提供对鸡VH区与人类共同轻链区之间的界面的模型的结构分析。
4A)提供对靶向Her3且包括重链可变区(SEQ ID NO：1)及IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区(SEQ ID NO：7)的人类Fab MF3178(PDB 5O4O)中非共价静电相互作用的分析并将其与混合同源模型相比较，在该模型中，MF3178的人类VH的氨基酸序列经鸡VH区的相应序列(SEQ ID NO：2；PDB 4GLR)置换。星号指示人类Fab界面中氨基酸之间的相互作用与嵌合Fab中鸡VH区的氨基酸(SEQ ID NO：2)与IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO：7)之间的相互作用是一致抑或等效。相较于在人类VH/人类cLC界面中的二十(20)个相互作用，在鸡VH区与人类共同轻链可变区之间观察到二十四(24)个静电相互作用，其中鸡VH/人类cLC界面之间的相互作用中有十三(13)个与MF3178的人类VH/人类cLC等效或一致。上表显示混合模型(鸡VH-人类VL)及人类Fab(人类VH-人类VL)中VH与VL之间的总非键结相互作用(氢键、盐桥及疏水性相互作用)。该表列出一致的相互作用(所涉及的完全相同的残基)及等效的相互作用(相同位置具有不同残基)。链A是轻链。链B是重链。使用Kabat编号。
4B)左图：提供MF3178的人类VH/人类cLC界面的三级结构(PDB 5O4O；浅灰色)且覆盖于鸡VH区/人类VL界面的混合同源模型(深灰色)上的结构比对，证实高度的结构相似性。来自VH区及VL的残基之间的非键结相互作用于虚线显示(MF3178以黑色显示，同源模型以灰色显示)。
4B)右图：提供在该同源模型中Thr110与Gln12之间形成的氢键的描绘，比较覆盖于鸡VH区/人类cLC界面的混合同源模型(深灰色)上的MF3178的人类VH/人类cLC界面的三级结构(PDB 5O4O；浅灰色)。鸡Fab(PDB 4GLR)的VH的模型经调整以反映I110T位置变化，进行该调整以反映在核酸层面上BstEII选殖位点的引入。I110T位置变化的引入保持与在相对β股上的Gln12形成的氢键。
4C)提供了呈浅灰色的人类Fab MF3178(PDB 5O4O)与呈深灰色的鸡Fab(PDB4GLR)的VL-VH区的结构比对，证实在MF3178的人类VH/VL与嵌合鸡VH(SEQ ID NO：2)及Vk1-39cLC的轻链可变区(SEQ ID NO：7)界面之间存在类似的构形相互作用。
图5示出经由AlignX获得的由一个推定的功能性鸵鸟VH基因区段(XP_009669322.1-SEQ ID NO：13)与47个人类种系VH基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对，该47个人类种系VH基因区段表示7个VH家族中的每一个。每个人类VH基因区段的一致性百分比系在括号间给出。AlignX是Vector NTI Advance 11.5.2软件的一个组件，且比对是使用预设设置获得。
图6示出由鸵鸟VH基因区段(XP_009669322.1-SEQ ID NO：13)与人类VH3-23及人类VH3-74基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对。根据Kabat编号的CDR残基加下划线。
图7A提供对靶向Her3且包括重链可变区(SEQ ID NO：1)及IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区(SEQ ID NO：7)的人类Fab MF3178(PDB 5O4O)中非共价静电相互作用的分析并将其与混合同源模型相比较，在该模型中，MF3178的人类VH区的氨基酸序列经鸵鸟VH区的相应序列(SEQ ID NO：4)置换。星号指示在MF3178界面中氨基酸之间的相互作用与在鸵鸟VH区的氨基酸(SEQ ID NO：4)与IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO：7)之间的相互作用是一致抑或等效。相较于在人类VH/人类cLC界面中的二十(20)个相互作用，在鸵鸟VH区与人类共同轻链区之间观察到十四(14)个静电相互作用，其中鸵鸟VH/人类cLC界面之间的相互作用中有八(8)个与MF3178的人类VH/人类cLC等效或一致。上表显示混合模型(鸡VH-人类VL)及人类Fab(人类VH-人类VL)中VH与VL之间的总非键结相互作用(氢键、盐桥及疏水相互作用)。该表列出一致的相互作用(所涉及的完全相同的残基)及等效的相互作用(相同位置具有不同残基)。链A是轻链。链B是重链。使用Kabat编号。
7B)示出嵌合结合域，其包括鸵鸟重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的可变区(SEQ ID NO：5，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
7C)示出在鸵鸟重链可变区与人类共同轻链区界面处的静电相互作用且显示图7a中所示相互作用的图形表示。
图8示出经由AlignX获得的由一个推定的功能性鸭VH基因区段(XP_021132877.1-SEQ ID NO：12)与47个人类种系VH基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对，该47个人类种系VH基因区段表示7个VH家族中的每一个。每个人类VH基因区段的一致性百分比是在括号间给出。AlignX是Vector NTI Advance 11.5.2软件的一个组件，且比对是使用预设设置获得。
图9示出由鸭VH基因区段(XP_021132877.1-SEQ ID NO：12)以及人类VH4-59、VH4-61、VH4-39及VH4-31基因区段编码的氨基酸序列的蛋白质序列比对。根据Kabat编号的CDR残基加下划线。
图10A提供对靶向Her3且包括重链可变区(SEQ ID NO：1)及IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区(SEQ ID NO：7)的人类Fab MF3178(PDB 5O4O)中非共价静电相互作用的分析并将其与混合同源模型相比较，在该模型中，MF3178的人类VH区的氨基酸序列经鸭VH区的相应序列(SEQ ID NO：3)置换。星号指示在MF3178界面中氨基酸之间的相互作用与在鸭VH区的氨基酸(SEQ ID NO：3)与IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO：7)之间的相互作用是一致抑或等效。相较于在人类VH/人类cLC界面中的二十(20)个相互作用，在鸭VH区与人类共同轻链可变区处观察到二十八(28)个静电相互作用，其中鸭VH/人类cLC界面之间的相互作用中有十三(13)个与MF3178的人类VH/人类cLC等效或一致。上表显示混合模型(鸭VH-人类VL)及人类Fab(人类VH-人类VL)中VH与VL之间的总非键结的相互作用(氢键、盐桥及疏水相互作用)。该表列出一致的相互作用(所涉及的完全相同的残基)及等效的相互作用(相同位置具有不同残基)。链A是轻链。链B是重链。使用Kabat编号。
图10B)示出混合的结合域，其包括鸭重链可变区、及人类CH1，与人类共同轻链，包括可变区IgVK1-39*01/IGJK1*01(SEQ ID NO：5)配对。
图10C示出在鸭重链可变区与人类共同轻链可变区界面处的静电相互作用，且显示图10a中所示相互作用的图形表示。
图11示出构成单个功能性鸡VH基因区段的基因组DNA序列(NCBI登录号M30319)。编码VH前导序列的DNA以浅灰色突出显示；编码成熟VH的DNA以深灰色突出显示。成熟序列是VH基因区段减去前导序列的氨基酸序列。在突出显示的区域上游及下游的序列表示基因间序列。
图12示出构成功能性鸡JH基因区段的基因组DNA序列(NCBI登录号M30320)。编码JH的DNA加下划线指示。应注意，JH区段的DNA大于氨基酸转译序列，因为其包括在起点及终点处的部分密码子。
图13示出自cDNA扩增此VH基因所使用的正向引物chVH-FW的注释序列。编码成熟VH的起点的DNA以灰色突出显示。
图14示出正向引物chVH-FW(SEQ ID NO：15)、功能性鸡VH的一部分及载体MV1511的一部分的DNA比对。指出SfiI位点选殖位点。成熟VH的第一个密码子加下划线。
图15示出自cDNA扩增此VH基因所使用的反向引物chVH-RV(SEQ ID NO：16)的注释的反向补体序列。编码JH终点的DNA(实际上为完整引物序列)以浅灰色突出显示。远离鸡JH基因区段的突变加下划线。
图16示出反向引物chVH-RV的反向补体(rc)、功能性鸡JH的一部分及载体MV1511的一部分的DNA比对。指出BstEII位点选殖位点。
图17A：人类共同轻链IGKV1-39/jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图17B：共同轻链可变域DNA序列(SEQ ID NO：6)及人类共同轻链IGKV1-39/jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图17C：轻链恒定区DNA序列(SEQ ID NO：8)及人类共同轻链IGKV1-39/jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
图17D：人类共同轻链可变域IGKV1-39/jk5的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图17E：IGKV1-39的V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。
图18示出噬菌体展示载体MV1511的示意图。
图19A：人类共同轻链IGKV3-15/jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)。
图19B：人类共同轻链IGKV3-20/jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：88)。
图19C：人类共同轻链IGLV3-21/jl3的氨基酸序列(SEQ ID NO：89)。
图19D：IGKV3-15的V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)。
图19E：IGKV3-20的V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)。
图19F：4GLR的鸡可变重链区及人类CH1区的氨基酸序列(SEQ ID NO：92)。
图19G：人类共同轻链IGKV1-39/jk5及κ恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)。
图19H：人类共同轻链IGKV3-15/jk1及κ恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：94)。
图19I：人类共同轻链IGKV3-20/jk1及κ恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：95)。
图19J：人类共同轻链IgVλ3-21/IGJλ3及λ恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：96)。
图19K：IGLV3-21的V区的氨基酸序列(SEQ ID NO：97)。
图20提供对人类Fab中的非共价静电相互作用的分析，该人类Fab包括含靶向Her3的MF3178(PDB 5O4O)(SEQ ID NO：1)及人类CH1区的重链，以及人类IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链(SEQ ID NO：5)(以人类VH-人类VL指示的一行)。在人类VH-人类CH1与人类IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链之间观察到三十五(35)个静电相互作用，其中24个存在于VH-VL界面中。将其与以下相比较：
1)Fab的同源模型，其包括含具有如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的鸡VH区(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类CH1区的重链，以及同源鸡VL(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类κ恒定区(以鸡VH-鸡VL指示的一行)。在鸡VH-人类CH1与鸡VL-人类κ恒定区之间观察到五十(50)个静电相互作用，其中29个存在于VH-VL界面中。
2)Fab的混合同源模型，其包括含具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的VH区(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类CH1的重链，以及含共同轻链Vk3-15/JK1的氨基酸序列(SEQID NO：94)的轻链(以Vk3-15/JK1/Cκ指示的一行)。在鸡VH-人类CH1与人类共同轻链Vk3-15/JK1之间观察到三十一(31)个静电相互作用，其中19个存在于VH-VL界面中；
3)Fab的混合同源模型，其包括含具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的VH区(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类CH1的重链，以及含共同轻链Vk3-20/JK1的氨基酸序列(SEQID NO：95)的轻链(以VK3-20/JK1/Cκ指示的一行)。在鸡VH-人类CH1与人类共同轻链Vk3-20/JK1之间观察到四十七(47)个静电相互作用，其中25个存在于VH-VL界面中；
4)Fab的混合同源模型，其包括含且具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的VH区(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类CH1的重链，以及含共同轻链Vk1-39/JK5的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)的轻链(以VK1-39/JK5/Cκ指示的一行)。在鸡VH-人类CH1与人类共同轻链Vk1-39/JK5之间观察到四十五(45)个静电相互作用，其中21个存在于VH-VL界面中；
5)Fab的混合同源模型，其包括含具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的VH区(来自鸡Fab PDB 4GLR)及人类CH1的重链，以及含共同轻链Vl3-21/Jl3的氨基酸序列(SEQID NO：96)的轻链(以VL3-21/JL3/Cλ指示的一行)。在鸡VH-人类CH1与人类共同轻链Vl3-21/Jl3之间观察到四十四(44)个静电相互作用，其中23个存在于VH-VL界面中。
链A是轻链。链B是重链。使用Kabat编号。VH与VL之间的相互作用于斜体指示。
图21显示在还原(R)及非还原(N)条件下的SDS-PAGE墨点。嵌合Fab以1、4及6指示；人类Fab以10指示。C是人类Fab，充当Fab存在的阳性对照。
图22提供人类对照Fab中的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：98)。
图23A显示在还原(R)及非还原(N)条件下的西方墨点(Western blot)。嵌合Fab装载于泳道3及4(经纯化)，以及泳道7及8(未经纯化)中。人类Fab装载于泳道1及2(经纯化)以及泳道5及6(未经纯化)中。Fab是使用ProtL-HRP鉴别。
图23B显示在还原(R)及非还原(N)条件下的西方墨点。嵌合Fab装载于泳道3及4(经纯化)，以及泳道7及8(未经纯化)中。人类Fab装载于泳道1及2(经纯化)以及泳道5及6(未经纯化)中。Fab是使用α-myc-HRP鉴别。
图24提供小鼠CXCR4的野生型氨基酸全长序列。
图25A及25B分别显示小鼠CXCR4阳性对照及人类CXCR4阳性对照。图25C-E显示三种不同鸡VH-人类VLFab与小鼠及人类CXCR4的结合的流动式细胞测量结果。
图26A提供第一种嵌合Fab的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：100)，该第一种嵌合Fab包括与人类VL配对的鸡VH且结合至小鼠及人类CXCR4。
图26B提供第二种嵌合Fab的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)，该第二种嵌合Fab包括与人类VL配对的鸡VH且结合至小鼠及人类CXCR4。
图26C提供第三种嵌合Fab的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)，该第三种嵌合Fab包括与人类VL配对的鸡VH且结合至小鼠及人类CXCR4。
图27A示出结合域，其包括PDB 5O4O的人类重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVK1-39/IGJK1共同轻链的可变区(SEQ ID NO：5，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
图27B示出结合域，其包括PDB 4GLR的鸡重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVK3-15/IGJK1共同轻链的可变区(SEQ ID NO：26，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
图27C示出结合域，其包括PDB 4GLR的鸡重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVK3-20/IGJK1共同轻链的可变区(SEQ ID NO：95，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
图27D示出结合域，其包括PDB 4GLR的鸡重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVK1-39/IGJK5共同轻链的可变区(SEQ ID NO：93，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
图27E示出结合域，其包括PDB 4GLR的鸡重链可变区，及人类CH1，与共同轻链，包括IgVL3-21/IGJl3共同轻链的可变区(SEQ ID NO：96，包括CL区的全长共同轻链序列)配对。
具体实施方式
“抗体”是属于免疫球蛋白类蛋白质的蛋白质分子，其含有结合抗原上的表位的一个或多个域，其中此类域是来源于抗体可变区或与抗体可变区共有序列同源性。
抗体结合具有不同质量，包括特异性及亲和力。特异性决定该结合域特异性结合的抗原或其表位。亲和力是对于与特定抗原或表位结合的量值的量度。此处应注意，抗体的“特异性”是指抗体对特定抗原的选择性，而“亲和力”是指抗体的抗原结合位点与其所结合的表位之间相互作用的量值。
因此，如本文所使用，“结合特异性”是指个别抗体结合位点与抗原决定子反应的能力。通常，本发明抗体的结合位点是位于Fab部分中且由重链及轻链的高变区构筑。
“亲和力”是单一抗原结合位点与其抗原之间相互作用的量值。本发明抗体针对抗原的单一抗原结合位点可以解离常数(Kd)表示。通常，用于治疗应用的抗体可具有Kd低至1×10-10M的亲和力或甚至更高的亲和力(即，甚至更低的Kd)。
“抗原”是能够在宿主生物体中诱导免疫反应(以产生抗体)和/或作为抗体目标的分子。在分子层面上，抗原是以其被抗体的抗原结合位点结合的能力为特征。抗原的混合物也可视为“抗原”，即，熟习此项技术者应了解，有时肿瘤细胞的溶解物或病毒粒子可指示为“抗原”，而此类肿瘤细胞溶解产物或病毒粒子制剂存在多个抗原决定子。抗原包括至少一个，但通常更多个表位。
“表位”或“抗原决定子”是抗原上由免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可由连续氨基酸或因蛋白质的三级折迭而相邻的非连续氨基酸形成(分别为所谓的线性及构形表位)。由连续、线性氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折迭形成的构形表位通常在变性溶剂处理后消失。表位可通常包括呈特有空间构形的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列，且除非另外说明，否则还包括重链可变域(VH)。除非另外说明，否则术语重链可变域包括三个重链CDR及四个构架(FR)区。重链的片段包括CDR及FR，及其组合。典型重链在可变域之后(自N末端至C末端)具有CH1域、铰链、CH2域及CH3域。重链的功能片段包括能够特异性识别抗原且包括至少一个CDR的片段。
术语“轻链”包括免疫球蛋白轻链可变域或VL(或其功能片段)；以及来自任何生物体的免疫球蛋白恒定域，或CL(或其功能片段)序列。除非另外说明，否则术语轻链可包括选自人类κ、λ及其组合的轻链。除非另外说明，否则轻链可变(VL)域通常包括三个轻链CDR及四个FR区。一般而言，全长轻链自N末端至C末端包括VL域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；以及轻链恒定域。可用于本发明的轻链包括例如不选择性结合重链所选择性结合的表位的轻链。
适合用于本发明抗体的轻链包括共同轻链(cLC)，诸如可通过筛选现有抗体文库(湿式文库或计算器模拟)中最常采用的轻链鉴别的轻链，其中此类轻链不会实质上干扰重链的表位结合域的亲和力和/或选择性，而且还适合与一系列重链配对。例如，适合轻链包括来自转基因动物的轻链，该转基因动物诸如具有共同轻链整合至其基因组中的
且其可用于产生具有重链多样性且当暴露于抗原时能够特异性结合该抗原的众多共同轻链抗体。
根据本发明，术语“共同轻链”是指可能一致或具有一些氨基酸序列差异，但不影响本发明抗体的结合特异性，即，此类差异不会实质上影响功能结合区的形成的轻链。
例如，通过例如引入并测试保守氨基酸变化、当与同源链配对时不会促成或仅部分地促成结合特异性的区域中的氨基酸变化、及类似变化来制备或发现不一致但仍在功能上等效的可变链可在如本文所使用的共同链的定义的范围内。因此，此类变体还能够结合不同的同源链且形成功能性抗原结合域。因此，如本文所使用，术语“共同轻链”是指可一致或具有一些氨基酸序列差异，但在与重链配对之后保持所得抗体的结合特异性的轻链。某共同轻链及此类功能等效变体的组合涵盖在术语“共同轻链”内。关于共同轻链使用的详细描述，参见WO 2004/009618及WO2009/157771。
“Fab”意谓包括可变区的结合域，通常为包括配对的重链可变区及轻链可变区的结合域。Fab可包括与恒定轻链域(CL)及VL域配对的包括CH1在内的恒定区域及VH域。此类配对可例如经由在CH1及CL域处的二硫桥键以共价键联进行。
“单链可变片段”(scFv)意谓包括VH域及VL域的结合域，该VH域及VL域经由连接子，例如肽连接子，例如约10至约25个氨基酸长度的肽连接子连接。
在本文中，术语“连接”是指各域藉助于其初级氨基酸序列彼此接合。例如，基础抗体部分可经由连接子连接至附加结合域(或附加结合域连接至附加结合域)。类似地，CH1域可连接至可变重链区且CL域可连接至可变轻链区。
“配对”则是指本发明的多肽之间的相互作用，由此使其可多聚化。抗体链或多肽的域，诸如混合的结合域可经由共价或非共价相互作用，例如经由凡得瓦尔力(Van derWaals force)、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳族侧链之间的吸引相互作用、形成二硫键或熟习此项技术者已知的其他力相互作用并配对形成界面。
当在本文中提及核酸或氨基酸序列时，“一致性百分比(％)”定义为在对准序列达到最佳比较目的之后，候选序列中与选定序列中的残基一致的残基的百分比。比较核酸序列的序列同一性百分比是使用Vector NTI Program Advance 10.5.2软件的AlignX应用程序，使用默认设置测定，此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.及Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22：4673-4680)、swgapdnarnt分数矩阵、空位开放罚分15及空位延伸罚分6.66。氨基酸序列是利用Vector NTI Program Advance 11.5.2软件的AlignX应用程序，使用默认设置比对，此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.及Gibson T.J.，1994)、blosum62mt2分数矩阵、空位开放罚分10及空位延伸罚分0.1。
“多个(种)”意谓两个(种)或多于两个(种)。
本文所描述的抗体的“变体”可包括抗体的功能性部分、衍生物和/或类似物。此包括抗体仿真物、单功能抗体及适体。
变体通常保持抗体的结合特异性，例如双特异性抗体的特异性。变体可为如本文所描述的结合域、多聚体或抗体的功能性部分或衍生物。
本文所描述的结合域、多聚体或抗体的功能性部分是包括结合与该结合域、多聚体或抗体所结合相同的目标的可变域的部分。
本文所描述的抗体的功能性衍生物是包括结合一个目标的可变域及结合第二目标的可变域的蛋白质，此类可变域是通过连接区连接。此类可变域可为如此可变域，或Fab片段或可变域样分子，诸如单链Fv(scFv)片段，其包括经由连接子连接在一起的VH及VL。可变域样分子的其他实施例是所谓的单域抗体片段。单域抗体片段(sdAb)是具有单一单体可变抗体区的抗体片段。与完整抗体相同，其能够选择性结合至特定抗原。单域抗体片段的分子量仅为12-15kDa，比由两个重链蛋白质链及两个轻链构成的共同抗体(150-160kDa)要小得多，且甚至小于Fab片段(约50kDa，具有一个轻链及半个重链)及单链可变片段(约25kDa，具有两个可变区，一个来自轻链且一个来自重链)。单域抗体本身不小于正常抗体(通常为90-100kDa)。单域抗体片段主要由骆驼中发现的重链抗体工程改造得到；这些片段称为VHH片段
一些鱼还具有仅含重链的抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，由此类抗体可获得称为VNAR片段的单域抗体片段。一种替代方法是将来自人类或小鼠的共同免疫球蛋白G(IgG)的二聚体可变域分裂成单体。尽管当前针对单域抗体的大多数研究是基于重链可变域，但经显示，来源于轻链的纳米抗体还特异性结合至目标表位。可变域样分子的其他非限制性实施例是VHH、人类域抗体(dAb)及单抗体(Unibody)。优选的功能性部分是包括含重链可变区及轻链可变区的可变域的部分。此类可变域的非限制性实施例是F(ab)片段及单链Fv片段。可变域(可变域样)键联的双特异性形式是例如结合至两个不同scFv的人类血清白蛋白(HSA)；双特异性微型抗体，其包括两个不同scFv经由二聚化基元或自缔合二级结构诸如螺旋束或卷曲螺旋结合在一起，引起此类scFv片段的二聚化(Morrison(2007)Nat.Biotechnol.25：1233-34)。适合HSA连接子及用于将scFv偶合至连接子的方法的实施例描述于WO2009/126920中。
功能性衍生物可为抗体模拟物、多肽、适体或其组合。这些蛋白质或适体通常结合至一个目标。本发明的蛋白质结合至两个或更多个目标。应理解，这些抗体、抗体模拟物、多肽及适体的任何组合可通过此项技术中已知的方法连接在一起。例如，在一些实施方案中，本发明的结合分子是缀合物或融合蛋白。
抗体模拟物是这样一种多肽，该多肽与抗体相同，能特异性结合抗原，但在结构上与抗体无关。抗体模拟物通常是摩尔质量为约3至20kDa的人工肽或蛋白质。相对于抗体，其常见的优势有优选的溶解度、组织渗透、对热及酶的稳定性、以及相当低的制造成本。抗体仿真物的非限制性实施例是亲和抗体分子(通常基于蛋白质A的Z域)；阿非林(affilin)(通常基于γ-B结晶或泛素)；亲和体(affimer)(通常基于胱抑素(Cystatin))；阿非汀(affitin)(通常基于来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7d)；α抗体(alphabody)(基于三螺旋卷曲螺旋)；抗运载蛋白(通常基于脂质运载蛋白)；高亲合性多聚体(avimer)(通常基于各种膜受体的A域)；达尔潘蛋白(DARPin)(通常基于锚蛋白重复基元)；非诺莫(fynomer)(通常基于Fyn 7的SH3域)；孔尼兹域肽(kunitz domain peptide)(通常基于各种蛋白酶抑制剂的孔尼兹域)；以及单功能抗体(通常基于纤维结合蛋白的第III型域)。
单功能抗体是使用纤维结合蛋白第III型域(FN3)作为分子骨架构筑的合成结合蛋白。单功能抗体是用于产生目标结合蛋白的抗体的简单且稳固的替代物。术语“单功能抗体”是在1998年由Koide团队创造，该团队发表的第一篇论文展示了使用人类纤维结合蛋白的第十个FN3域的单功能抗体概念。
单功能抗体及其他抗体仿真物通常是由组合文库产生，在此类组合文库中，使用分子呈现及定向进化技术，诸如噬菌体展示、mRNA展示及酵母表面展示使骨架的各部分多样化。大量抗体仿真物对其相应目标具有高亲和力及高特异性。
适体是结合至特定目标分子的寡核苷酸或肽分子。适体通常是通过自大型随机序列池选择此类适体而产生，但在核糖开关中还存在天然适体。适体可作为大分子用于基础研究及临床目的。
“非键结相互作用”是并非通过共价键连接的原子之间的作用。因此，这些相互作用是不涉及共享电子，而是涉及分子间或分子内的电磁相互作用的更分散的变化形式的键。非键结相互作用包括静电相互作用，诸如氢键结、离子相互作用及卤素键结。凡得瓦尔力是涉及永久或感应偶极(或多极)的一小类静电相互作用。这些相互作用包括以下：永久偶极-偶极相互作用、偶极-感应偶极相互作用及感应相互作用-感应偶极相互作用。盐桥是两种非共价相互作用的组合，即氢键结与离子键结的组合。疏水相互作用是非极性(不可离子化)烃分子因较强水-水相互作用而强制结合在一起的相互作用。
在本说明书及所附权利要求书通篇，词语“包括(comprise)”、“包括(include)”及“具有(having)”，以及变化形式，诸如“包括(comprises/comprising)”即“包括(includes/including)”应解释为包容性的。即，在上下文允许的情况下，这些词语意欲表示可能包括未具体叙述的其他要素或整数。
冠词“一个(种)(a/an)”在本文中用于指该冠词的语法制品中的一个(种)或多于一个(种)(即，一个(种)或至少一个(种))。例如，“一种要素”可意谓一种要素或多于一种元素。
可变区、结合域、多聚体及抗体
本发明涉及结合域及包括该结合域的多聚体，诸如抗体，或其中任一种的变体。通常，本发明的结合域包括由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的生物体，例如鸟类，优选地鸡、鸭或鸵鸟的核酸的核酸编码的可变区。该可变区通常与人类可变区配对。因此，本文所揭露的发明的结合域可为嵌合、或人类化、或混合的结合域。
通常，该可变区是是由基于、来源于或获自鸟类、优选地鸡、鸭或鸵鸟的核酸的核酸编码，其中编码的可变区是重链可变区，其能够与人类可变区稳定地配对，该人类可变区是轻链可变区。或者，由基于、来源于或获自鸟类、优选地鸡的核酸的核酸编码的可变区可为轻链可变区，其能够与人类可变区配对，该人类可变区可为重链可变区。
关于核酸的“基于”意思指，考虑到遗传密码的冗余性使得提供替代密码子编码相同残基，核酸序列编码与其所基于的核酸所编码相同的氨基酸，不管特定密码子与所基于的核酸序列或源匹配与否。“来源于”意谓核酸可自感兴趣生物体的核酸选殖，或合成地制造以匹配该来源的序列信息。
结合域可包括可变区、Fv域、Fab域、经修饰的Fab域或scFv、或其中任一种的功能片段。
鸟类
本文所描述的发明的结合域包括由基于、来源于或获自鸟类的核酸的核酸编码的免疫球蛋白可变区或其部分，该鸟类包括鸡形目，例如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
本文所描述的发明的结合域包括由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸的核酸编码的可变区，优选地重链可变区，其中此类可变区包括与在人类VH与VL界面之间，诸如在包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab(参见图4a)的人类VH与VL界面之间所存在实质上相同的数量的非键结静电相互作用，且优选地更多此类相互作用。
本文所描述的发明的结合域优选地是混合的结合域，其包括与人类链、优选地人类VL配对的由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸的核酸编码的可变区，优选地重链可变区，其中VH/VL界面在该VH/VL界面处具有至少5个、且优选地10个或更多个同源相互作用，且优选地与在包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ IDNO：7的轻链可变区的人类Fab的人类VH及共同VL的相同位置处所发现的相互作用一致。
本文所描述的发明的结合域包括由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的核酸的核酸编码的可变区且该核酸编码人类可变区。
本文所描述的发明的结合域可包括由基于、来源于或获自鸟类的核酸的核酸编码的VH区，该VH区与人类轻链区形成界面，其中该结合域的VH/VL界面在VH区与人类VL区之间包括至少4个、优选地5个、优选地8个、且更优选地10个静电接触点，此类静电接触点与人类VH区/人类VL区结合域界面的静电接触点一致或等效，优选地其中该人类VL是以下的VL：IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链(SEQ ID NO：7)；IgVK1-39/IGJK5共同轻链(SEQ ID NO：10)；IgVK3-15/IGJK1共同轻链(SEQ ID NO：87)；IgVK3-20/IGJK1共同轻链(SEQ ID NO：88)；或IgVλ3-21/IGJλ3共同轻链(SEQ ID NO：89)，最佳地其中人类VL是IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的VL(SEQ ID NO：7)，且优选地其中比较性人类结合域是包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab。
或者，本文所描述的发明的结合域包括由基于、来源于或获自鸟类的核酸的核酸编码的VH区，该VH区与人类轻链区形成界面，其中该结合域的VH/VL界面在该VH区人类VL区之间包括至少十四(14)个且更优选地二十四(24)个静电接触点，且更优选地二十八(28)个静电接触点，优选地其中该人类VL是以下的VL：IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链(SEQ IDNO：7)；IgVK1-39/IGJK5共同轻链(SEQ ID NO：10)；IgVK3-15/IGJK1共同轻链(SEQ ID NO：87)；IgVK3-20/IGJK1共同轻链(SEQ ID NO：88)；或IgVλ3-21/IGJλ3共同轻链(SEQ ID NO：89)，最佳地其中该人类VL是IgVK1-39*01/IGJK1*01共同轻链的VL(SEQ ID NO：7)。
根据本文所揭露的发明，存在一种结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体，其包括由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸的核酸编码的可变区，其中此类可变区当与人类可变区配对时，在可变区界面处包括与人类VH与人类VL界面，优选地如包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7轻链可变区的人类Fab中的人类VH与人类VL界面所存在实质上相同的静电接触点，其与人类VL可变区在VH与VL界面处包括4个、优选地5个、优选地8个且更优选地10个静电相互作用，该人类VL可变区优选地为IgVK1-39*01/IGJK1*01轻链、IgVK1-39/IGJK5轻链、IgVK3-15/IGJK1轻链、IgVK3-20/IGJK1轻链、或IgVλ3-21/IGJλ3共同轻链，最佳地为IgVK1-39*01/IGJK1*01或IgVK1-39*01/IGJK1*05轻链，其中此类动物是鸡、鸵鸟或鸭。
本发明的结合域、多聚体或抗体的恒定区通常是人类恒定因例如CH1、CH2、CH3及CL)，但也可包括啮齿动物或来自与由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸的核酸编码的可变区相同的生物体或来源的其他嵌合恒定区或恒定区。
本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或变体可为可变区是是由至少部分地基于、来源于或获自鸟类核酸的核酸编码者，该可变区已经历V(D)J重组，包括经由B细胞发育和/或响应于此类动物的抗原暴露进行。该结合域可为可变区是与人类轻链可变区配对的重链可变区的结合域，该人类轻链可变区优选地为共同轻链，更优选地包括IgVK1-39*01/IGJK1*01轻链(SEQ ID NO：5)、IgVK1-39/IGJK5轻链(SEQ ID NO：93)、IgVK3-15/IGJK1轻链(SEQ IDNO：94)、IgVK3-20/IGJK1轻链(SEQ ID NO：95)或IgVλ3-21/IGJλ3共同轻链(SEQ ID NO：96)，最佳地为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01共同轻链(SEQ ID NO：5)。
本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体可为可变区是是由至少部分地基于、来源于或获自鸟类核酸的核酸编码者，该可变区已经历V(D)J重组，包括响应于此类动物的抗原暴露。该结合域可为该可变区是与人类重链可变区，优选地共同重链配对的轻链可变区的结合域。
本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体可为可变区经人类化，使得CDR是由至少部分地基于、来源于或获自鸟类核酸的核酸编码者，该可变区已经历V(D)J重组，包括经由B细胞发育和/或响应于此类动物的抗原暴露进行。
根据本发明的多聚体包括至少一个如本文所描述的结合域。根据本发明的多聚体可为单价、二价或多价多聚体或抗体。
本文所揭露的发明的二价或多价抗体或多聚体能够结合一个、两个或优选地超过两个目标，其中目标可为抗原或给定抗原的表位。
动物的免疫接种
本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体包括由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物例如鸟类的核酸的核酸编码的可变区，该动物已用感兴趣的抗原或表位免疫接种。因此，该可变区对该抗原或表位具有特异性。
对包括鸟类，例如鸡、鸭或鸵鸟的一系列不同动物免疫接种的方法是一般熟习此项技术者熟知的。适合免疫接种方案通常是引起B细胞的选择性扩增的方案，意味着初次及追加免疫接种是设计成用于引起B细胞的选择性扩增，以产生结合至感兴趣的抗原或表位的抗体。免疫接种方案可例如在初次免疫接种及每次后续追加免疫接种期间使用该抗原的不同形式或片段。例如，该抗原可在细胞膜上表达，呈重组蛋白、与另一种蛋白质融合的重组蛋白、蛋白质的域或蛋白质的肽的形式。免疫接种方案可包括在初次和/或追加免疫接种期间使用佐剂。
佐剂在初次免疫接种期间可仅用于限制旁观者B细胞的非特异性扩增程度。旁观者B细胞系无需抗原结合至B细胞表面上表达的抗体受体的步骤而活化的细胞。此项技术中已知，用例如Fc融合蛋白免疫接种通常引起稳固的抗Fc反应，在此情况下，所有B细胞中最多约70％与融合蛋白的Fc部分反应，而非与感兴趣的抗原反应。免疫接种方案可在无佐剂存在下使用，以优先扩增经用于免疫接种的抗原活化的B细胞。
编码适用于本发明结合域中的可变区的核酸可自任何适合组织，例如自蛋、自淋巴组织或自骨髓(即，自产生B细胞的组织)回收。
因此，用于制造本发明的结合域或多聚体或其变体的方法可至少包括自例如B细胞群，或自获自鸟类的蛋或血清分离编码抗体可变区的核酸，其中该鸟类已用抗原免疫接种，由此优先诱导与感兴趣的抗原或表位反应的B细胞的选择性纯系扩增。适合动物，诸如鸟类可用呈蛋白质形式或呈核酸序列形式的抗原免疫接种，当鸟类用该核酸序列免疫接种时，该核酸序列能够表达该抗原。
鸟类可藉助于例如肌肉内疫苗接种，或藉助于基因枪质体免疫接种，或通过此项技术中已知的任何其他方式免疫接种。诱导B细胞选择性纯系扩增的优选方式是DNA刺纹疫苗接种(DNA tattoo vaccination)。术语“DNA刺纹疫苗接种”是指一种侵入性程序，该程序涉及用装载有质体DNA的固体振动针反复地刺破皮肤，损伤表皮及真皮上部并引起皮肤炎症，随后愈合(Bins等人，《自然-医学(Nat Med)》，11：899-904，2005；Pokorna等人，《基因疫苗与治疗(Genet.Vaccines Ther.)》，6：4，2008)。该DNA可针对在鸟类中表达进行密码子优化，且可包括设计成用于防止基因沉默的序列。
用于鸡的免疫接种方案是此项技术中已知的。例如，参见Schade等人，《实验室动物的替代物(ATLA Altern.Lab.Anim.)》，24(1996)925-934。还参见http：//gallusimmunotech.com/igy-polyclonal-antibodies-immunization-protocol及https：//www.thermofisher.com/nl/en/home/life-science/antibodies/custom-antibodies/custom-antibody-production/custom-polyclonal-antibody-production/custom-chicken-polyclonal-antibody-production-protocols.html。执行鸡免疫接种的市售公司包括例如Aves Labs Inc.、Davids Bio、Creative Biolabs、Lampire BiologicalLaboraties、Integral Molecular、Aldevron、Innovagen及Capralogics。
鸭及鸵鸟也可以类似方式免疫接种。简言的，鸭及鸵鸟可接受皮下或肌肉内注射的含有抗原及弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)的混合物。接着，可使用抗原与弗氏不完全佐剂的混合物施用追加注射。
在第一次鸭免疫接种之后一周，可开始收集鸭蛋并在4℃下储存。可每四周重复追加注射，且可在每次追加注射后7天分析血清。后续程序涉及一个短暂方案，即用水自蛋黄提取IgY，随后进行脱脂、盐析、脱盐及浓缩。抗体溶液中的蛋白质浓度可通过在280nm下的吸光度测定。
第一次鸵鸟免疫接种之后一周，可测量获自颈静脉的血液样品中的血清抗体电平。可每隔一周施用追加剂。在四周时，可通过在琼脂糖凝胶中进行的沉淀反应来测量蛋黄抗体电平。鸭的免疫接种及抗体描述于例如US6680376B2及AU784900，以及Chiou等人，《临床毒理学(Clinical Toxicology.)》，2008，46：539-544中，且鸵鸟的免疫接种及抗体分离描述于例如Adachi等人，《实验与治疗医学(Exp Ther Med.)》，2011，2：41-45及WO2007026689中。
代表性免疫接种方案可包括在免疫接种之前收集至少一个蛋或血清的步骤。自这些蛋回收的IgY可用作对照。在第0天，将例如0.02至0.5mg抗原(例如利用弗氏完全佐剂Specol、脂肽(Pam3-Cys-Ser-[Lys]4，例如其量为250μg)皮下和/或肌肉内注射至鸡乳房组织中的多个部位。抗原/佐剂的总体积可为约1ml，且该佐剂构成在二分之一与三分之二之间的体积。当用于对兔免疫接种时，使用相当量的抗原。取决于抗原的免疫原性，在仅一次、或2次、或3次、或4次或更多次追加免疫接种之后可实现高抗体力价(至多到1∶100,000-1∶1,000,000)。因此，可在第10天、第20天际第30天，使用不完全弗氏佐剂与约一半量的抗原(相较于初次免疫接种)进行追加免疫接种。到第30天，应检测蛋或血清中的特异性抗体。对于长期抗体产生，鸡可例如接受附加追加免疫接种。在鸟类，诸如鸡的情况下，母鸡通常持续地下蛋约72周，且之后，产蛋能力下降。视需要，可收集蛋或血清，且接着可自此类蛋，通常自蛋黄回收抗体。
各种IgY提取方法详细地评述于例如De Meulenaer及Huyghebaert(《食品与农业免疫(Food Agricult.Immunol.)》，2001；13：275-288；关于评述，还参见Schade等人，《实验室动物的替代物》2005；33：129-154)。一般而言，这些方法可分成三个主要组：
1.沉淀方法：涉及硫酸铵或硫酸钠、聚乙二醇(PEG)、辛酸及角叉菜胶。
2.层析方法：亲和层析法、离子交换层析法、疏水相互作用层析法、亲硫相互作用层析法及凝胶过滤层析法。
3.超过滤。
利用方法组合可增加IgY制剂的纯度；例如，PEG沉淀可与亲和层析法组合或硫酸铵沉淀可与离子交换层析法组合。在一些情况下，取决于最终应用，用水提取IgY足以。适合方法的任何组合均可用于回收IgY制剂。
转基因动物
本发明的益处在于，它避免了对产生在动植物演化史上远离人类的转基因动物的需求，因为适用于本发明的经免疫接种的动物的可变区及核酸可与人类可变区直接配对以直接形成混合的结合域。因此，可由适用于本发明中的动物的野生型抗体谱系直接产生混合的结合域的噬菌体展示文库，无需产生包括人类Ig基因座或DNA的此类动物的转基因品种。噬菌体展示混合的结合域，该混合的结合域包括来自经免疫接种的动物的可变区及同源人类可变区。
任选地，经历免疫接种以便能产生本发明的结合域或多聚体或其变体的在动植物演化史上远离人类的动物可为转基因动物，例如通过如本文所描述产生的转基因鸟类。此类转基因动物可至少在其B细胞谱系中包括编码免疫球蛋白轻链或重链的核酸。
转基因鸟类可为这样一种转基因鸟类，其中重链或轻链编码序列是以使其对DNA重排和/或体细胞超突变展示抗性的方式提供。
核酸优选地编码人类、人类样或人类化免疫球蛋白链。优选地，该转基因动物可为这样一种转基因动物，其中核酸序列编码轻链编码序列，该轻链编码序列是人类序列或人类Vλ序列。优选地，轻链是人类共同轻链，例如本文所描述。
例如，鸡具有重链基因座及λ轻链基因座，但没有κ轻链基因座。人类共同轻链例如可并入鸡的重链基因座或λ轻链基因座中。
先前在WO2009/15771中已描述用于制备非人类动物诸如鸟类的方法，该案以引用的方式并入本文中。该产生转基因鸡的方法可见于Ching等人，MABS 2018，10(1)，71-80中。
用于制备本发明的结合域、多聚体，诸如抗体，或其变体的方法
本发明涉及一种用于制备本发明的结合域或多聚体或其变体的方法，该方法包括：
-用抗原对适用于本发明的动物免疫接种；
-自该动物分离出编码结合该抗原的可变区的核酸；以及
-获得由该核酸编码的可变区并使该可变区与同源人类可变区配对，由此制备混合的结合域、多聚体、抗体或其变体。
此类配对可通过以下方式进行：表达来自动物、或基于、来源于或获自该动物的核酸的编码可变区的核酸，以及编码该同源人类可变区的核酸，由此使编码的可变区可配对并因此产生结合域。
此可通过在适合细胞中表达编码结合域的两个可变区的两个核酸来进行，该适合细胞表达该结合域。
本发明涉及一种用于制备展示多种本发明的混合的结合域的展示文库的方法，该方法包括将核酸整合至诸如噬菌体或酵母的类生物体，或用于肽展示的其他容器中，该核酸编码本发明的混合的结合域，其中该生物体表达该结合域并将其展示于该生物体或容器的表面上。多个结合域，通常多个不同的结合域可通过使用噬菌体展示文库展示于多种生物体，诸如噬菌体(每个噬菌体展示一个结合域)的表面上。
因此，在展示文库中，由基于、来源于或获自经免疫接种的动物的核酸的核酸编码的多个可变区与多个人类可变区配对或与人类共同链可变区配对。该展示文库可例如为Fab噬菌体展示文库。
噬菌体展示文库中的噬菌体展示混合的结合域，该混合的结合域包括来自经免疫接种的动物的可变区及同源人类可变区。
噬菌体展示允许自经免疫接种的动物选择可与来自人类的同源可变区配对的可变区。因此，结合域在此方法中经半人类化。可例如该抗原选择结合域，在该结合域中，来自经免疫接种的动物的可变区引起与该抗原的结合。
细胞中及噬菌体展示文库中结合域的表达在下文中更详细地描述。
本发明还提供一种用于制造抗体或其片段的混合的结合域的方法，该方法包括将人类轻链可变区，特别是人类共同轻链可变区与由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，诸如鸟类的核酸编码的重链可变区组合。或者，该方法可包括将人类重链可变区，特别是人类共同重链可变区与由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，诸如鸟类的核酸编码的轻链可变区组合。
本发明还提供一种通过使用转基因动物产生编码嵌合免疫球蛋白结合域的核酸的方法，该方法包括：
(a)提供动物，该动物在其种系基因组中包括未经重排的免疫球蛋白重链V、D及J基因区段，以及人类经重排的共同轻链，其中该动物响应于抗原而产生抗体，该抗体包括由经重排的免疫球蛋白重链可变区编码的重链可变区；
(b)通过使该动物暴露于抗原，刺激该动物中的免疫反应；
(c)分离出编码该抗体的重链可变区的核酸；
(d)在细胞中将编码该抗体的重链可变区的DNA可操作地连接至编码人类重链恒定区的DNA；
(e)将编码该人类经重排的共同轻链的DNA整合至该细胞中；
(f)使该细胞在使该细胞表达结合域的条件下生长，该结合域包括重链可变区及人类重链恒定区，及人类共同轻链，该重链可变区及人类重链恒定区与该人类共同轻链能够配对；以及
(g)回收该结合域。
此类方法可包括鉴别适合使用经重排的可变区产生本发明的结合域的动物，包括测定在由该动物的核酸编码的经重排的可变区与人类VL区界面之间接触点的数量的步骤。优选地，选择的核酸编码可变区，该可变区包括在人类/动物可变区界面处的静电接触点与人类VH与人类VL界面，优选地与包括具有SEQ ID NO：1的重链可变区并具有SEQ ID NO：7的轻链可变区的人类Fab的界面存在的静电接触点实质上相同，包括与人类VL区在该界面处的4个、优选地5个、优选地8个且更优选地10个静电相互作用。
展示文库技术
此项技术中已知使用本文所描述的结合域的各种形式的展示技术，包括噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示等，且此类展示技术涵盖于本文所描述的本发明中。
以下论述集中在噬菌体展示，但该描述不具限制性且基于本文所提供的描述，可容易地应用于其他形式展示技术。
噬菌体展示是使用噬菌体的一项重要技术，包括用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽及蛋白质-DNA相互作用，此类噬菌体是感染细菌的病毒。本文所描述的方案中有许多是用于构筑噬菌体展示文库并淘选结合至感兴趣抗原的噬菌体的标准方案且描述于《抗体噬菌体展示方法及方案(Antibody Phage Display：Methods and Protocols)》(编辑：Philippa M.O′Brien，Robert Aitken)中。可根因此项技术中已知的程序，例如Kramer等人，2003(Kramer等人，2003，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》31(11)：e59)所描述，使用VCSM13(Stratagene)作为辅助噬菌体菌株生长并收集文库。可根因此项技术中已知的程序，例如Kramer等人，2003(Kramer等人，2003，《核酸研究》31(11)：e59)所描述，使用VCSM13作为辅助噬菌体菌株生长并处理噬菌体。
在示例性技术中，将编码感兴趣蛋白质的核酸，例如编码可变区的核酸整合至噬菌体外壳蛋白基因中，使得噬菌体将该蛋白质“展示”于其外部上，同时在其内部含有编码蛋白质的核酸。以此方式，建立基因型与表型之间的联系。
关于抗体发现，在噬菌体展示中，VH和/或VL区的较大集合(文库)可在丝状噬菌体粒子的表面上表达，由此使其配对形成结合域。可经由与抗原的结合相互作用及所展示的结合域自这些文库选出噬菌体。
因此，可针对其他蛋白质、肽或DNA序列、或目标部分的其他形式筛选展示噬菌体，以检测展示的VH、VL或结合域与此类其他部分之间的相互作用。以此方式，可通过称为活体外选择的方法筛选并扩增较大的VH、VL或结合域文库，该活体外选择类似于天然选择。
因此，本发明的结合域可展示于噬菌体上。通常，此类结合域中的一个可变区是至少部分地基于、获自或来源于如本文所描述的经免疫接种的动物的核酸，且还包括人类可变区，优选地共同链，更优选地共同轻链。因此，可使用对动物免疫接种的抗原选择展示结合域的噬菌体。
由此，本发明提供一种噬菌体，该噬菌体在其基因组中包括：编码第可变区的核酸序列，该第可变区是是由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，优选地鸟类，更优选地鸡、鸭或鸵鸟的核酸的核酸编码；以及编码第二人类可变区的核酸序列。优选地，该第二可变区能够与该第可变区配对。
本发明还提供一种用于制备噬菌体的方法，该噬菌体在其基因组中包括：由至少部分地基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，优选地鸟类，更优选地鸡、鸭或鸵鸟的核酸的核酸编码的第可变区；以及编码第二人类可变区的核酸序列，该第二人类可变区能够与该第可变区配对。此类方法包括：
-用抗原对鸟类免疫接种；
-自该动物分离出编码第可变区的核酸；以及
-将该核酸及编码第二人类可变区的核酸并入噬菌体的基因组中，由此制备出噬菌体，该第二人类可变区能够与该第可变区配对。
更一般而言，根据本发明，提供一种使用噬菌体展示产生结合域的方法。此类方法可包括：
(a)用抗原对适合动物，诸如本文所描述的鸟类免疫接种，
(b)自该动物获得编码可变区的一个或多个核酸，
(c)将该一个或多个核酸与编码同源人类可变区的核酸一起并入一个或多个噬菌体中，由此使每个噬菌体展示两个可变区，该两个可变区能够配对；
(d)选择展示结合域的噬菌体，该结合域能够结合至(a)中使用的抗原。
以下更详细地描述在噬菌体展示后的步骤，即，筛选以鉴别以高亲和力结合至所希望的目标蛋白质或DNA序列的多肽，在此情况下为包括配对的可变域的结合域。该方法可模拟免疫选择，且使用此方法分离出具有许多不同结合特异性的抗体(Hoogenboom，H.R.等人(2005)《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》，23，1105)。
1.目标蛋白(即，用于对动物免疫接种的抗原)通常固定于例如微量滴定盘各孔中。
在此步骤中，目标蛋白可为用于对动物免疫接种并期望由此产生抗体的任何抗原。可用于本发明中的动物的类型及用于对其免疫接种的方法描述于本文中。
2.自已用目标蛋白免疫接种的动物分离出编码可变序列的一个或多个核酸。
通常，然而，自该动物分离出编码能够结合感兴趣抗原的不同可变区的大量核酸序列。通常，分离出的核酸是编码VH序列的核酸。
自动物分离出核酸通常以自该动物回收适当组织，例如脾、骨髓或淋巴结组织，即包括B细胞的组织开始。可由此类组织制备细胞悬浮液，且接着可自此类细胞悬浮液分离出编码可变序列的核酸。使用例如Trisol制备适合细胞悬浮液的方法是此项技术中熟知的。必要时，可通过例如基于CD19选择的阳性选择纯化出脾B细胞部分脾B细胞。接着，可由此类细胞制备RNA，并根因此项技术中熟知的方法，由该RNA合成cDNA。
接着，使用PCR引物集，此类引物集由eDNA特异性扩增可变区编码序列(通常，扩增VH编码序列)。此方法描述于De Haard等人(《生物化学杂志(J Biol Chem.)》，1999年6月25日；274(26)：18218-30)中，用于鸡的特定引物集描述于实施例中。通常，引物是设计成用于在扩增的编码VH的核酸的5″及3′端处引入独特限制性酶位点，以便于将核酸选殖至适合噬菌体展示载体，例如噬菌粒中。
3.可使用获自该动物的编码可变区，诸如VH区的核酸产生噬菌体展示文库。
可使用噬菌粒载体在细菌细胞中或在噬菌体的表面直接表达本发明的结合域。噬菌粒是含有来自f1噬菌体的f1复制起点的质体。其可作为一种类型的选殖载体与丝状噬菌体M13组合使用。噬菌粒可以质体形式复制且以单股DNA形式包装于病毒粒子中。噬菌粒含有用于双股复制的复制起点(ori)，以及允许单股复制并包装于噬菌体粒子中的f1 ori。
因此，可使用噬菌粒选殖DNA片段并通过多种技术，诸如转型及电穿孔将该DNA片段引入细菌宿主中。用“辅助”噬菌体感染含有噬菌粒的细菌宿主将提供所需的病毒组分以允许单股DNA复制及噬菌粒DNA包装于噬菌体粒子中。“辅助”噬菌体通过先附着至宿主细胞的菌毛，且接着在附着之后，将噬菌体基因组转运至宿主细胞的细胞质中来感染细菌宿主。噬菌体基因组在细胞内部引起单股噬菌粒DNA在细胞质中的制造。接着，将此噬菌粒DNA包装于噬菌体粒子中。含有ssDNA的噬菌体粒子自细菌宿主细胞释放至细胞外环境中。
因此，可将自适用于本发明的经免疫接种的动物分离(或基于、来源于或获自此类动物的核酸)的编码可变区的核酸与编码同源可变区的核酸一起选殖至噬菌粒载体中。换句话讲，每个噬菌粒包括自该动物分离的编码可变区的核酸及编码其同源可变区，例如cLC的可变区的核酸。可能优选的是，还存在恒定区以使得在噬菌粒包装于噬菌体中时能展示Fab片段。
可将多个噬菌粒转型或转染至适合细菌细胞中以便产生文库。为了自该文库营救出噬菌体，将辅助噬菌体，例如VCSM13添加至细菌细胞中，且随后，使用熟习此项技术者熟知的技术回收噬菌体。
4.接着，可将所得噬菌体展示文库添加至含有感兴趣目标，即抗原的微量滴定盘中，且在使噬菌体结合至该目标的时间后，可洗涤该盘。
5.与目标分子相互作用的噬菌体展示蛋白质保持附着至该盘，而所有其他蛋白质被洗掉。
6.附着的噬菌体可经洗脱并用于产生更多噬菌体感染适合细菌宿主。新噬菌体构成富集的混合物，其含有的不相关噬菌体(即，非结合噬菌体)明显少于初始混合物中存在的噬菌体。
7.步骤4至6可任选地重复一次或多次，使噬菌体文库进一步富集结合蛋白。
8.可对相互作用的噬菌体内的核酸(基于、来源于或获自适用于本发明的动物的核酸的编码可变区的核酸)进行测序以鉴别相互作用蛋白质或蛋白质片段。
因此，确切地说，一种用于制备噬菌体展示文库的方法，该方法包括：
-用抗原对鸟类动物免疫接种；
-自该动物分离出编码多个可变区的多个核酸；以及
-使用此类核酸制备噬菌体展示文库，其中由此类核酸编码的可变区的至少一部分与人类可变区配对，由此制备出Fab噬菌体展示文库。
因此，本发明的一方面提供一种用于制造一组结合域的方法，该方法包括至少以下步骤：
a)提供一组B细胞，
b)自此类B细胞分离出核酸，
c)使该样品中编码免疫球蛋白重链可变区的核酸序列扩增，
d)对基本上所有扩增产物至少部分地测序，
e)对来自步骤d)的所有序列执行频率分析，
f)选出所希望的VH序列，
g)将至少一种载体提供于宿主细胞中，该至少一种载体包括此类所希望的VH序列中的至少一个以及至少一个编码人类轻链可变区的核酸；
h)培养此类宿主细胞并允许VH及VL多肽表达，
i)获得此类结合分子。
或者，步骤c)及d)可经替代步骤c′及d′置换：c′)构筑cDNA文库，通过用对VH区序列具有特异性的核酸探针探测来筛选该文库中的VH区特异性DNA序列；d′)对含有VH插入序列的纯系至少部分地测序。
本发明进一步包括在产生噬菌体展示文库后，制造抗体，并进行筛选以鉴别结合感兴趣目标的可变区。该方法包括：
a)分离出编码噬菌体的重链可变区的核酸，该噬菌体将能够结合至该抗原的结合域展示于其上；
b)将编码该可变区的DNA可操作地连接至编码人类重链恒定区的DNA；
c)将该可变区DNA及编码人类共同轻链的DNA整合至宿主细胞中；
d)使该细胞在使得该细胞表达抗体的条件下生长，该抗体包括与人类共同轻链配对的可操作地连接至人类重链恒定区的可变区，该可变区与该人类共同轻链能够配对；以及
e)回收该抗体。
通常，获自噬菌体展示文库的抗体经历活体外亲和力成熟，由此获得高亲和力抗体(Hoogenboom，H.R.等人(2005)，《自然-生物技术》23，1105)。
本发明的噬菌体，例如通过以上陈述的程序鉴别的噬菌体，通常将能够展示由至少部分地基于、来源于或获自鸟类的核酸的核酸编码的可变区及人类可变区，其中此类可变区彼此配对。
根据本发明的噬菌体展示文库包括多个噬菌粒或噬菌体。本发明的噬菌体展示文库可包括至多1010个来自鸟类的分别编码不同可变区的核酸例如至多109或至多108个来自鸟类的分别编码不同可变区的核酸。在本发明的噬菌体展示文库中，实质上全部噬菌体展示本发明的结合域，例如呈Fab形式的结合域。
可根据熟习此项技术者熟知的方法，例如通过使用FACS分析对噬菌体文库筛选以鉴别能够结合至用于免疫接种的抗原的结合域。因此，可通过筛选使用对用于动物免疫接种的抗原进行筛选，来鉴别对该抗原具有亲和力及特异性的结合区。文库中展示的一部分结合区可实际上结合用于免疫接种的抗原。来源于经免疫接种的动物的一些可变区可能无法结合抗原(即，具有不同特异性)且对于其他可变区，可形成VH/VL配对，其中该结合区因替代性VH-VL CDR配对而丧失亲和力或特异性。
共同链
本发明的一个优选方面是本发明的结合域或其多聚体，诸如抗体具有共同轻链(可变区)，其可与由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，优选地鸟类，更优选地鸡的核酸的核酸编码的一系列重链可变区组合，以形成具有功能性抗原结合域的抗体(WO2004/009618、WO2009/157771)。
用于本发明的多价抗体中的共同轻链(可变区)优选地为人类轻链(可变区)。共同轻链(可变区)优选地具有种系序列。优选的种系序列是常用于人类谱系中的轻链可变区且具有良好的热力学稳定性、产率及溶解度。优选的种系轻链是经重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(图17A；SEQ ID NO：5)。共同轻链可变区优选地为经重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的可变区(图17B；SEQ ID NO：6及7)。共同轻链优选地包括具有0-5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合的如图17B或17D中所描绘的轻链可变区(分别为SEQ ID NO：7或10)。
另一优选的共同轻链是人类κ轻链IgVκ1-39/IGJκ5(图19G；SEQ ID NO：25)。优选地，本发明的抗体包括人类κ轻链IgVκ1-39/IGJκ5的可变区。
另一优选的共同轻链是人类κ轻链IgVκ3-15/IGJκ1(图19H；SEQ ID NO：94)。优选地，本发明的抗体包括人类κ轻链IgVκ3-15/IGJκ1的可变区。
另一优选的共同轻链是人类κ轻链IgVκ3-20/IGJκ1(图19I；SEQ ID NO：95)。优选地，本发明的抗体包括人类κ轻链IgVκ3-20/IGJκ1的可变区。
另一优选的共同轻链是人类λ轻链IgVλ3-21/IGJλ3(图19J；SEQ ID NO：96)。优选地，本发明的抗体包括人类κ轻链IgVλ3-21/IGJλ3的可变区。
共同轻链优选地进一步包括轻链恒定区，优选地包括κ轻链恒定区。编码共同轻链的核酸可针对用于表达共同轻链蛋白质的细胞系统进行密码子优化。该编码核酸可来源于种系核酸序列。
用于本发明的结合域或其多聚体，诸如多价抗体的共同轻链(可变区)可为λ轻链，诸如人类λ轻链IgVλ3-21/IGJλ3(图19J)，且因此，其还提供于本发明之上下文中。本发明的共同轻链可包括κ或λ轻链的恒定区。其优选地为κ轻链的恒定区，优选地其中该共同轻链系种是轻链，优选地为包括IgVK1-39基因区段的经重排的种系人类κ轻链，例如经重排的种系人类κ轻链IgVK1-39*01/IGJK1*01(图17A)；人类κ轻链IgVκ1-39/IGJκ5(图19G)；人类κ轻链IgVK3-15/IGJκ1(图19H)；或人类κ轻链IgVκ3-20/IGJκ1(图19I)。熟习此项技术者应认识到，“共同”还指氨基酸序列不一致的轻链的功能等效物。该轻链存在许多变体，其中存在不会显著地影响功能结合区的形成的突变(缺失、取代、添加)。
IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简写。该基因又称为免疫球蛋白κ可变1-39；IGKV139；IGKV1-39。该基因的外部Id是HGNC：5740；Entrez基因：28930；Ensembl：ENSG00000242371。IgVκ1-39的优选氨基酸序列提供于图17中。其中列出V区的序列。该V区可与五个J区之一组合。图17描述IgVκ1-39与J区的组合的两个优选序列。接合的序列表示为IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据IMGT数据库万维网imgt.org命名)。这些名称是示例性的且涵盖基因区段的对偶基因变体。
IgVκ3-15是免疫球蛋白可变κ3-15基因的简写。该基因又称为免疫球蛋白κ可变3-15；IGKV315；IGKV3-15。该基因的外部Id是HGNC：5816；Entrez基因：28913；Ensembl：ENSG00000244437。IgVκ3-15的优选氨基酸序列提供于图19D(SEQ ID NO：90)中。其中列出V区的序列。该V区可与五个J区之一组合。该V区可与五个J区之一组合。图19A描述IgVκ3-15与J区的组合的优选序列。接合的序列表示为IGKV3-15/jk1；替代名称是IgVκ3-15*01/IGJκ1*01(根据IMGT数据库万维网imgt.org命名)。此名称是示例性的且涵盖基因区段的对偶基因变体。
IgVκ3-20是免疫球蛋白可变κ3-20基因的简写。该基因又称为免疫球蛋白κ可变3-20；IGKV320；IGKV3-20。该基因的外部Id是HGNC：5817；Entrez基因：28912；Ensembl：ENSG00000239951。IgVκ3-20的优选氨基酸序列提供于图19E(SEQ ID NO：91)中。其中列出V区的序列。该V区可与五个J区之一组合。图19B描述IgVκ3-20与J区的组合的优选序列。接合的序列表示为IGKV3-20/jk1；替代名称是IgVκ3-20*01/IGJκ1*01(根据IMGT数据库万维网imgt.org命名)。此名称是示例性的且涵盖基因区段的对偶基因变体。
IgVλ3-21是免疫球蛋白可变λ3-21基因的简写。该基因又称为免疫球蛋白λ可变3-21；IGLV320；IGLV3-21。该基因的外部Id是HGNC：5905；Entrez基因：28796；Ensembl：ENSG00000211662.2。IgVλ3-21的优选氨基酸序列提供于图19K(SEQ ID NO：97)中。其中列出V区的序列。该V区可与五个J区之一组合。图19J描述IgVλ3-21与J区的组合的优选序列。接合的序列表示为IGλV3-21/jk3；替代名称是IgVλ3-21/IGJκ3(根据IMGT数据库万维网imgt.org命名)。此名称是示例性的且涵盖基因区段的对偶基因变体。
产生共同轻链的细胞可产生例如经重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包括所述轻链的可变区与λ恒定区的融合物的轻链。在本文提及种系序列情况下，该可变区优选地为种系序列。
用于本发明的结合域或其多聚体，诸如抗体的优选共同轻链是包括SEQ ID NO：5中所示的序列的共同轻链。
用于本发明的结合域或其多聚体，诸如抗体的共同链也可为重链且因此，其还提供于本发明之上下文中。共同重链在此项技术中用于制备双特异性抗体，且在此处可用于制备包括三个或多于三个结合域的多价抗体，此类结合域中的两个或更多个包括此项技术中已知的共同重链。例如，在例如分别以全文引用的方式并入本文中的PCT/US2010/035619及PCT/US2010/057780中描述了抗体文库的使用，在此类抗体文库中，重链可变域对于所有文库成员是相同的且因此，多样性是基于轻链可变域。产生具有共同重链的结合域的这些及其他技术可由熟练技术人员产生，且可用于本发明中。
本发明的多聚体的制造
本发明的多聚体，例如抗体，可通过用一个或多个基因构筑体共转染个别细胞来产生，该一个或多个基因构筑体一起编码两种或更多种，例如三种蛋白质，此类蛋白质形成多聚体，诸如以上描述的多聚体。例如，可用编码一个或多个重链可变区及一个共同轻链可变区的核酸序列共转染宿主细胞以产生抗体，此类核酸序列是基于、来源于或获自适用于本发明的经免疫接种的动物，或根据以上所描述的方法，基于、来源于或获自展示文库的核酸。或者，可通过用一个或多个基因构筑体共转染个别细胞来产生本发明的抗体，该一个或多个基因构筑体一起编码一个或多个轻链可变区及一个共同重链。在需要多特异性多聚体，例如双特异性抗体的情况下，可由细胞表达多个重链可变区或多个轻链区。
在需要多特异性抗体，诸如双特异性抗体的情况下，已公开有利于产生呈异二聚体形式的抗体的如果干方法。在本发明中，相对于产生相应同二聚体，该细胞有利于产生异二聚体。此通常通过修饰重链的恒定区，使得相对于同二聚化，其有利于异二聚化(即，具有一个重链与另一个重链的组合的二聚化)来达成。在一个优选实施方案中，本发明的抗体包括具有兼容性异二聚化域的两个不同的免疫球蛋白重链。
兼容的异二聚化域优选为兼容性免疫球蛋白重链CH3异二聚化域。当使用野生型CH3域时，共表达两个不同重链(A及B)及一个共同轻链将产生三个不同的抗体种类，即AA、AB及BB。AA及BB是两种同二聚体抗体的名称且AB是异二聚体抗体的名称。为增加所需异二聚体产物(AB)的百分比，可采用CH3工程改造，或换句话讲，可使用具有兼容的异二聚化域的重链。此项技术描述了能实现重链的此类异二聚化的各种方式。
如本文所使用，术语“兼容的异二聚化域”是指经工程改造以使经工程改造的域A′优先与经工程改造的域B′形成异二聚体且反之亦然的蛋白质域，使得A′-A′及B′-B′之间的同二聚化减少。
在US13/866,747(现以US 9,248,181颁布)、US14/081,848(现以US 9,358,286颁布)、WO2013/157953及WO2013/157954中，揭露使用兼容的异二聚化域制造多价抗体的方法及方式。这些方式及方法也可有利地用于本发明中。确切地说，本发明的抗体优选地包括用于基本上仅产生双特异性全长IgG分子的突变。优选的突变是在第一CH3域中或在与其对应的位置处的氨基酸取代L351K及T366K(EU编号)(“KK变体”重链)以及在第二域中或在与其对应的位置处的氨基酸取代L351D及L368E(“DE变体”重链)，或反之亦然。先前在US 9,248,181及US 9,358,286专利以及WO2013/157954 PCT申请案中展示，该DE变体及KK变体优先配对形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。DE变体重链(DEDE同二聚体)或KK变体重链(KKKK同二聚体)的同二聚化由于在一致重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间的斥力而几乎不会发生。
在WO2019/190327中，描述一种用于制造多价抗体，例如三特异性或多特异性抗体的方法。描述了包括三个或多于三个结合域的多价抗体的模块形式：在这些形式中，至少一个结合域连接至基础抗体部分，该基础抗体部分包括两个结合域。附加结合域可包括可变区、Fv域、Fab域或经修饰的Fab域、或其中任一种的功能片段。基础抗体部分可例如为全长抗体或其片段，但在每种情况下包括两个结合域。一个或多个附加结合域经由连接子连接至基础抗体部分，由此除该基础抗体部分的结合域外，还提供一个或多个结合部分。连接子用于将一个或多个附加结合域连接至基础抗体部分。连接子包括肽区，例如一个或多个铰链区和/或来源于铰链区的一个或多个区。本发明的结合域或多聚体可并入此类多价抗体中。
核酸序列、多肽、载体及细胞
本发明进一步提供编码可用于组装本发明的多聚体，诸如抗体的多肽的核酸序列；包括此类核酸序列的载体；能够产生本发明的多聚体诸如抗体的细胞；以及使用此类细胞制备包括抗体在内的此类多聚体的方法。
根据本发明的多聚体，诸如抗体通常是由表达编码多肽的核酸序列的细胞产生，此类多肽一起组装形成本发明的多聚体，诸如抗体。
用于制备本发明的多聚体诸如抗体的多肽的核酸序列可放入任何适合的表达载体且在适当情况下，可将两个或更多个载体放入单一宿主细胞中。
一般而言，选殖具有适当连接子和/或恒定区的编码可变域的核酸序列并将此类序列放入适合表达构筑体中与启动子可操作地连接，以在适合细胞株中表达。
因此，本发明还提供一种用于制备多聚体，诸如抗体的方法，该方法包括：
提供细胞，该细胞包括编码多肽的一个或多个核酸序列，此类多肽能够组装成本发明的多聚体，诸如抗体；以及
在允许该多肽表达及其组装成多聚体诸如抗体的条件下，培养该细胞。
具体地讲，向该细胞提供一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，且此类核酸序列编码免疫球蛋白重链或轻链可变区。如果向该细胞提供一个或多个编码免疫球蛋白重链可变区的核酸序列，则该细胞还包括编码免疫球蛋白轻链可变区，优选地共同轻链可变区，诸如本文所描述的共同轻链可变区的核酸。如果向该细胞提供一个或多个编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸序列，则该细胞还包括编码免疫球蛋白重链可变区，优选地共同重链可变区的核酸。该细胞进一步包括一个或多个编码重链和/或轻链恒定区的核酸。
本发明的宿主细胞能够产生本发明的多聚体，诸如抗体，基于总所表达的免疫球蛋白计，该多聚体的纯度是至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％本发明的多聚体，诸如抗体。
本发明的宿主细胞能够产生本发明的多聚体，诸如抗体，其中对于所有结合位点，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％的所产生的多价抗体包括与同源共同链配对的经重排的可变区。
本发明的宿主细胞能够产生抗体，其中至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％的所表达的共同链与多价抗体配对且不为游离的未缔合的蛋白质。
结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体的表达
此项技术中已描述结合域、多聚体，诸如抗体、或其变体在重组宿主细胞中的表达。在结合域情况下编码可变区的核酸分子以及本发明抗体的轻链及重链可以染色体外复本形式存在和/或稳定地整合至宿主细胞的染色体中。在基因座可作为已知缺乏基因沉默的目标的情况下，后一种情形是优选的。
为实现编码组装成本发明多聚体诸如抗体的多肽的核酸序列的表达，熟习此项技术者熟知，能够驱动此类表达的序列可功能性连接至编码此类多肽的核酸序列。功能性连接意图描述编码此类多肽或其前驱体的核酸序列连接至能够驱动表达的序列，由此使这些序列能够驱动此类多肽或其前驱体的表达。有用表达载体是此项技术中可获得的，例如Invitrogen的pcDNA载体系列。当关于控制经编码多肽的转录及转译的序列正确地插入编码感兴趣的多肽的序列时，由此得到的表达卡匣可用于产生感兴趣的多肽，称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、强化子及类似组件，及其组合。这些序列应能够在宿主细胞中起作用，由此驱动与其功能性连接的核酸序列的表达。启动子可为组成性的或受调控，且可获自各种来源，包括病毒、原核来源或真核来源，或为人工设计的。
本发明的核酸序列可由天然启动子或其衍生物，或由完全异源的启动子表达。一些众所周知且常用的在真核细胞中表达的启动子包括来源于病毒，诸如腺病毒的启动子，例如E1A启动子；来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子，诸如CMV立即早期(IE)启动子；来源于猴病毒40(SV40)的启动子，及类似启动子。适合启动子也可来源于真核细胞，诸如金属硫蛋白(MT)启动子、延伸因子1a(EF-la)启动子、肌蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子及类似启动子。能够驱动本发明的核酸序列在宿主细胞中的表达的任何启动子或强化子/启动子适用于本发明中。在一个实施方案中，能够驱动表达的序列包括来自CMV启动子的区域，优选地包括CMV立即早期基因强化子/启动子的核苷酸-735至+95的区域。技术人员将意识到，用于本发明中的表达序列可适当地与可使表达稳定或增强的组件，诸如绝缘子、基质附接区、STAR组件及类似组件组合。由此可增强表达的稳定性和/或电平。
适于表达重组核酸序列的任何细胞均可用于产生本发明的多聚体，诸如抗体。优选地，该细胞适合悬浮生长。
本发明的多聚体，诸如抗体可在宿主细胞中表达，通常通过培养适合的本发明细胞并自该培养物收集该多聚体，诸如抗体实现。优选地，该细胞系在无血清培养基中培养。本发明的多聚体，诸如抗体可通过熟习此项技术者一般已知的方法自此类细胞或优选地自细胞培养基回收。
进一步提供可通过用于制造根据本发明的多聚体诸如抗体的方法获得的多聚体，诸如抗体。该多聚体，诸如抗体，优选是自培养物的培养基纯化得到。
在回收之后，可通过使用此项技术中已知的方法自培养物纯化出多聚体，诸如抗体。此类方法可包括沉淀、离心、过滤、尺寸排阻层析法、亲和层析法、阳离子和/或阴离子交换层析法、疏水相互作用层析法及类似方法。可使用亲和层析法，包括基于连接子序列的亲和层析法作为分离本发明的多聚体，诸如抗体的一种方式。
药物组合物及使用方法
本发明还提供一种药物组合物，其包括本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体，及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
因此，本发明提供如本文所描述的本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体，其通过疗法治疗人类或动物身体。
本发明进一步提供一种用于治疗患有医学病况的人类或动物的方法，该方法包括向人类或动物施用治疗有效量的如本文所描述的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体。
拟施用患者的根据本发明的结合域或多聚体，诸如抗体，或其变体的量通常在治疗窗中，意味着使用足够数量以获得治疗作用，同时该量不超过阈值，以免产生不可接受程度的副作用。
本文中引用的作为现有技术给出的专利文献或其他主题不应视为承认该文件或主题是已知的或其所含信息是任一权利要求书的优先权日期的公共常识的一部分。
本文阐述的每一参考文献的揭露内容以全文引用的方式并入本文中。
本发明的方面：
1.一种结合域或多聚体或其变体，其包括由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区，该可变区与人类可变区配对。
2.根据方面1所述的结合域或多聚体或其变体，其中该在动植物演化史上远离人类的动物是鸟类。
3.根据方面1或2所述的结合域或多聚体或其变体，其中该多聚体是抗体。
4.根据方面3所述的结合域或多聚体或其变体，其中该抗体的恒定区是人类恒定区。
5.根据方面1至4中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是是由基于、来源于或获自该动物的核酸编码的经重排的VDJ区且该人类可变区轻链可变区。
6.根据方面5所述的结合域或多聚体或其变体，其包括共同轻链，诸如人类共同轻链。
7.根据方面1至6中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是是由基于、来源于或获自该动物的核酸编码的经重排的VJ区且该人类可变区是重链可变区。
8.根据方面7所述的结合域或多聚体或其变体，其包括共同重链。
9.根据方面1至8中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该鸟类包括编码VH区的功能性VH基因区段，该VH区包括与人类VL区在VH/VL界面处的至少5个、优选地至少8个且更优选地至少10个静电相互作用。
10.根据方面2至9中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该鸟类是鸡形目，诸如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
11.根据方面1至10中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该结合域或多聚体或其变体结合至小鼠和/或人类CXCR4，优选地结合至人类CXCR4。
12.根据方面11所述的结合域或多聚体或其变体，其中该由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是重链可变区，其包括含SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：102或与其具有至少80％、85％、优选地至少90％、95％、更优选地至少97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据方面1至12中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中该由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区经人类化。
14.根据方面3至13中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其是双特异性抗体。
15.根据方面3至14中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其是多特异性抗体，例如三特异性抗体。
16.一种用于制备结合域或多聚体或其变体的方法，该方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自该动物分离出编码可变区的核酸序列；
-自该经分离的核酸序列获得可变区；以及
-使来自该动物的可变区与人类可变区配对，
由此制备出结合域或多聚体或其变体。
17.根据方面16所述的方法，其中该在动植物演化史上远离人类的动物包括功能性VH基因区段，其包括与人类VL可变区在VH/VL界面处的5个、优选地8个且更优选地10个静电相互作用。
18.根据方面16或17所述的方法，其中来自该动物的该编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列且该人类可变区是轻链可变区。
19.根据方面16至18中任一项所述的方法，其中由经分离的来自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸序列编码的可变区是经重排的VDJ区且该人类可变区是轻链可变区。
20.根据方面18或19所述的方法，其包括共同轻链。
21.根据方面1至18中任一项所述的方法，其中由经分离的来自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸序列编码的可变区是经重排的VJ区且该人类可变区是重链可变区。
22.根据方面21所述的方法，其包括共同重链。
23.根据方面16至22中任一项所述的方法，其中该在动植物演化史上远离人类的动物是鸟类，诸如鸡形目，诸如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
24.根据方面16至23中任一项所述的方法，其中该多聚体是抗体，该抗体是双特异性抗体。
25.根据方面16至24中任一项所述的方法，其中该多聚体是多特异性抗体，例如三特异性抗体。
26.根据方面16至25中任一项所述的方法，其中该在动植物演化史上远离人类的动物是转基因鸡，其至少在其B细胞谱系中包括编码免疫球蛋白轻链或重链的核酸。
27.根据方面26所述的方法，其中该编码重链或轻链的核酸是以使其对DNA重排和/或体细胞超突变具有抗性的方式提供。
28.根据方面27所述的方法，其中该编码轻链的核酸的序列是人类VK序列。
29.一种噬菌体，该噬菌体在其基因组中包括：
编码可变区的核酸，该核酸是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及
编码人类可变区的核酸。
30.根据方面29所述的噬菌体，其中来自该动物的该编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列且该人类可变区是轻链可变区。
31.根据方面29或30所述噬菌体，其中该噬菌体能够展示由此类核酸编码的可变区，其中此类可变区彼此配对。
32.根据方面29至31中任一项所述的噬菌体，其中此类可变区彼此配对形成结合域。
33.根据方面29至32中任一项所述的噬菌体，其中该结合域呈Fab形式。
34.一种噬菌体展示文库，其包括根据方面29至33中任一项所述的噬菌体，该文库包括至少约106个噬菌体。
35.一种用于制备噬菌体展示文库的方法，该方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自该动物分离出多个编码可变区的核酸；以及
-使用编码所述可变区的所述核酸制备噬菌体展示文库，
由此制备出噬菌体展示文库。
36.根据方面35所述的方法，其中来自该动物的该多个编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列。
37.根据方面35或36所述的方法，其中该噬菌体展示文库中的噬菌体包括编码人类轻链可变区的核酸序列。
38.根据方面35至37中任一项所述的方法，其中使用来自该动物的该多个编码可变区的核酸制备多个噬菌体，其各自包括该核酸。
39.根据方面35至38中任一项所述的方法，其中该噬菌体展示文库包括至少一个噬菌体，该至少一个噬菌体在其基因组中包括：
编码可变区的核酸，该核酸是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及
编码人类可变区的核酸。
40.根据方面39所述的方法，其中此类可变区彼此配对形成结合域。
41.根据方面40所述的方法，其中该结合域呈Fab形式。
42.一种用于鉴别能够结合至抗原的根据方面1至15中任一项所述的结合域或多聚体或其变体的方法，该方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自该动物分离出多个编码可变区的核酸；以及
-使用编码所述可变区的所述核酸制备噬菌体展示文库；以及
-鉴别该噬菌体展示文库中能够结合至该抗原的噬菌体，
由此鉴别出能够结合至该抗原的结合域或多聚体或其变体。
43.根据方面42所述的方法，其中该结合域或多聚体或其变体结合至该抗原。
44.根据方面42或43所述的方法，其中来自该动物的该多个编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列。
45.根据方面42至44中任一项所述的方法，其中该噬菌体展示文库中的噬菌体包括编码人类轻链可变区的核酸序列。
46.一种或多种核酸，其编码：包括重链可变区的多肽，该一种或多种核酸是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及包括人类轻链可变区的多肽。
47.根据方面46所述的一种或多种核酸，其中此类多肽能够配对形成结合域或多聚体或其变体。
48.根据方面46或47所述的一种或多种核酸，其中该一种或多种核酸编码：构成重链可变区的至少两个多肽，此类多肽中的至少一个是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及一个构成人类轻链可变区的多肽。
49.根据方面48所述的一种或多种核酸，其中该构成重链可变区的至少两个多肽及该构成人类轻链可变区的多肽能够组装成多聚体。
50.根据方面49所述的一种或多种核酸，其中该多聚体是抗体，例如双特异性抗体或多特异性抗体。
51.一种宿主细胞，其包括根据方面46至50中任一项所述的一种或多种核酸。
52.根据方面29至33中任一项所述的噬菌体、根据方面34所述的噬菌体展示文库、根据方面35至41中任一项所述的用于制备噬菌体展示文库的方法、根据方面42至45中任一项所述的用于鉴别结合域或多聚体或其变体、或根据方面46至50中任一项所述的一种或多种核酸、或根据方面51所述的宿主细胞，其中该在动植物演化史上远离人类的动物是鸟类，诸如鸡形目，诸如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
53.一种药物组合物，其包括根据方面1至15中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
54.一种药物组合物，其包括根据方面1至15中任一项所述的抗体及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
55.根据方面1至15中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其通过疗法而用于治疗人类或动物身体。
56.一种用于治疗患有医学适应症的人类或动物的方法，该方法包括向该人类或动物施用治疗有效量的根据方面1至15中任一项所述的结合域或多聚体或其变体。
57.一种在动植物演化史上远离人类的动物，该动物是转基因动物，该转基因动物至少在其B细胞谱系中包括编码人类免疫球蛋白轻链或重链的核酸。
58.根据方面57所述的动物，该动物是鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、鹅雁、鸭或鸵鸟。
以下实施例说明本发明但不意欲以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：嵌合鸡VH-人类VL抗体
为了制造展示包括VH区的结合域的噬菌体展示文库，此类VH区是由基于、来源于或获自经免疫接种的鸟类，优选地鸡、鸭或鸵鸟的核酸的核酸编码，其中此类VH区与人类轻链可变区，优选地cLC形成多聚体，此类区必须能够与该VL区配对。
本文中已展示，基于、来源于或获自经免疫接种的鸟类，优选地鸡的核酸的VH区谱系能够与人类VL稳定地配对。本文中举例说明的人类VL包括SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：87；SEQ ID NO：88；或SEQ ID NO 89中所示的氨基酸序列。
抗体的Fab包括重链及轻链部分，该重链与轻链部分当配对时一起形成不会展开的结合域结构。本文中已展示，此类结构可经组装，即使在组合来自不同物种的轻链重链可变区时，甚至是在此类可变区源自在初级氨基酸层面上具有低同源性的V基因区段情况下也可组装。
在这些实施例中，所有序列同一性均使用Vector NTI Advance 11.5.2软件(ThermoFisher Scientific)的AlignX组件，使用默认设置测定。两个核酸序列之间的序列同一性百分比是使用Vector NTI Program Advance 11.5.2软件的AlignX应用程序，使用默认设置测定，此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.及Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22：4673-4680)、swgapdnarnt分数矩阵、空位开放罚分15及空位延伸罚分6.66。氨基酸序列是利用Vector NTI Program Advance 11.5.2软件的AlignX应用程序，使用默认设置比对，此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.及Gibson T.J.，1994)、blosum62mt2分数矩阵、空位开放罚分10及空位延伸罚分0.1。
1.如图1中所示蛋白质比对中所陈述，SEQ ID NO：14的单一功能性鸡VH1基因区段与人类VH基因区段同源。由此可见，功能性鸡VH1基因区段与人类基因区段仅具有低同源性。如图2中所示蛋白质比对中所陈述，鸡基因区段与作为人类Fab3178中具有SEQ ID NO：1的重链可变区的来源的人类VH1-02基因区段仅具有43％氨基酸一致性。所有序列比较均使用Vector NTI Advance 11.5.2软件的AlignX组件，使用默认设置进行。
2.如图3中所示蛋白质比对中所陈述，功能性鸡JH基因区段的FW4区与人类JH基因区段中的对应区域同源，且具有总体73％氨基酸一致性。
3.基于包括具有SEQ ID NO：1的MF3178(PDB登录号5O4O；含有VH1-02源性基因[Geuijen等人，2018])并具有SEQ ID NO：7的VL的人类Fab的晶体结构，产生人类/鸡混合Fab的3D同源模型(参见图4)。用于同源建模的算法是MODELLER(https：//salilab.org/modeller/)。所有结构分析(包括建模)均使用Biovia Discovery Studio软件，使用默认设置进行(http：//accelrys.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio/)。
在该模型中，人类VH区经模型化VH区置换，该模型化VH区是基于自鸡Fab(PDB4GLR)的结构获取的鸡VH区的氨基酸序列(Shih等人，《生物化学杂志》287，44425-44434，2012)。鸡Fab PDB 4GLR的重链可变区序列如下：
分析该模型显示，在鸡VH与人类VL之间存在24个非键结静电相互作用，而在完全人类模板中仅鉴别出20个(参见图4a)。在这些相互作用中，有10个在该两种结构之间是一致的且有2个是在相同位置处发现的等效或同源残基之间形成。值得关注的是，相较于人类VH-人类VL界面，在鸡VH-人类VL界面中发现较多氢键(12个对比6个)，指示在鸡VH-cLC界面中存在稳定相互作用。关于此类相互作用的详情显示于图4a中。
另外，在鸡VH序列中引入I338T变化(SEQ ID NO：2)。如以下更详细地说明，此变化的添加可解释在核酸层面上BstEII选殖位点的引入，由此有助于使用野生型经免疫接种的鸡重链谱系并将编码此类重链可变区的核酸直接引入噬菌体展示文库中。I110T变体以及核酸中BstEII选殖位点的引入保持与Q12形成的氢键(参见图4b)。值得注意的是，在同源模型中，位置12及110分别在FW1及FW4中。人类Fab及鸡Fab(PDB 5O4O及4GLR)的VL-VH区的覆盖图显示于图4c中。原子位置的均方根偏差(RMSD)为
的结构是类似的，且较少差异主要位于CDR及环中。总体而言，同源模型及结构分析指示，混合Fab的折迭类似于人类Fab的折迭，且证明鸡VH域与人类VL域之间的稳定相互作用，尽管事实上，人类VH基因区段与鸡VH基因区段之间的同源性在初级氨基酸层面上较低。
在基于包括MF3178 PDB登录号5O4O的人类Fab的能量最低且侧链最少的晶体结构的另一个模型中，针对具有SEQ ID NO：94；SEQ ID NO：95；SEQ ID NO：93；或SEQ ID NO：96的人类轻链区，建立具有SEQ ID NO：92的鸡Fab PDB 4GLR的重链区的模型(Shih等人，《生物化学杂志(J.Biological Chemistry)》287，44425-44434，2012)。结果示于图20中。
分析此类模型显示，在鸡VH-人类CH1与具有SEQ ID NO：94的人类VL-CL之间存在31个非键结静电相互作用，其中在完全鸡模板中鉴别出50个相互作用且在完全人类模板中鉴别出35个相互作用。鸡VH-人类CH1进一步与具有SEQ ID NO：95的人类VL-CL具有47个非键结静电相互作用；与具有SEQ ID NO：93的人类VL-CL具有45个键结静电相互作用；且与具有SEQ ID NO：96的人类VL-CL具有44个非键结静电相互作用。
此数据指示，鸡VH区能够与如果干不同的人类VL区配对。
实施例2：嵌合鸭VH-人类VL抗体
在展示鸡重链可变区与人类共同轻链直接配对的能力，以及相较于人类VH-VL界面，其在混合的VH-VL界面处产生甚至更大数量的稳定相互作用的能力之后，如以上关于鸡VH所描述，建立另一鸟类物种绿头鸭(Anas platyrynchos/mallard duck)的模型。
如图8中所示的蛋白质比对中所陈述，由鸭VH基因区段XP_021132877.1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)与由人类VH基因区段编码的氨基酸序列同源。如图9中所示的蛋白质比对中所陈述，编码的氨基酸序列与由推定的鸭功能性VH基因区段编码的氨基酸序列具有最高同源性的人类VH基因区段是人类VH4-59、VH4-61、VH4-39及VH4-31，其具有41％氨基酸一致性。所有序列比较均使用Vector NTI Advance 11.5.2软件的AlignX组件，使用默认设置进行。
如以上实施例1中所描述，基于包括具有SEQ ID NO：1的MF3178(PDB登录号5O4O；含有VH1-02源性基因[Geuijen等人，2018])的人类Fab的晶体结构，产生人类/鸭混合Fab的3D同源模型(参见图10)。
在该模型中，人类VH经模型化VH置换，该模型化VH是基于自Genbank登录号A46529获取的鸭VH的氨基酸序列。重链可变区序列如下：AETLDESGGGLVSPGGSLTLVCKGSGFTFSSNEMYWVRQAPGKGLEWVAGITTGGYTGYAPAVKGRFTISRNNGQSTLTLQMNSLKAEDTATYYCAKITGYANCAGYGCAADIDLWGHGTEVTVSS(SEQ ID NO：3)
分析该模型显示，在鸭VH与人类VL界面之间存在28个非键结相互作用，而在完全人类模板该仅鉴别出20个相互作用(参见图10a)。在这些相互作用中，有12个在该两种结构之间一致且有1个是在混合的VH-VL界面与人类VH-VL界面之间的相同位置处发现的等效或同源残基之间形成。相较于人类VH-人类VL界面，在鸭VH-人类VL界面中发现较多氢键(12个对比7个)，指示在鸭VH-cLC界面中存在稳定相互作用。关于此类相互作用的详情显示于图10a中。
人类Fab与鸭Fab的VL-VH区的覆盖图显示于图10b中。原子位置的均方根偏差(RMSD)为
的结构是类似的，且较少差异主要位于CDR及环中。总体而言，同源模型及结构分析指示，混合Fab的折迭类似于人类MF3178模板的重链，且证明鸭VH域与人类VL域之间的稳定相互作用。
实施例3：嵌合鸵鸟VH-人类VL抗体
鸡及鸭表示生物分类家禽类(分枝是鸡雁小纲(Galloanserae))，即鸡形目及雁形目(Anseriformes)。因此，如以上在实施例1中关于鸡VH所描述，建立非家禽鸟类物种(与鸭及鸡的关系更远)，即鸵鸟(非洲鸵鸟(Struthio camelus))的重链可变区与人类轻链可变区(可以多价多聚体形式使用，作为共同轻链)的能力的模型。
如图5中所示的蛋白质比对中所陈述，由鸵鸟VH基因区段XP_009669322.1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)与由人类VH基因区段编码的氨基酸序列同源。如图6中所示蛋白质比对中所陈述，编码的氨基酸与鸵鸟VH基因区段编码的氨基酸具有最高同源性的人类VH基因区段是人类VH3-73及VH3-23，其具有76.5％氨基酸一致性。所有序列比较均使用Vector NTI Advance 11.5.2软件的AlignX组件，使用默认设置进行。
如以上实施例1中所描述，基于包括具有SEQ ID NO：1的MF3178(PDB登录号5O4O；含有VH1-02源性基因[Geuijen等人，2018])的人类Fab的晶体结构，产生人类/鸵鸟混合Fab的3D同源模型(参见图7)。
在该模型中，人类VH经模型化VH置换，该模型化VH是基于自Genbank登录号AFN02388获取的鸵鸟VH的氨基酸序列。重链可变区序列如下：
分析模型显示，在鸵鸟VH与人类VL界面之间存在14个非键结相互作用(参见图7a)。在这些相互作用中，有7个在该两种结构之间一致且有1个是在人类VH与VL界面中相同位置处发现的等效或同源残基之间形成。在鸵鸟VH-人类VL界面中发现相较于人类VH-人类VL界面大致相同数量的氢键(6个对比7个)，指示在鸵鸟VH-cLC界面中的稳定相互作用。关于此类相互作用的详情显示于图7a中。
人类Fab与鸵鸟Fab的VL-VH区的覆盖图显示于图7b中。原子位置的均方根偏差(RMSD)为
的结构是类似的，且较少差异主要位于CDR及环中。总体而言，同源模型及结构分析指示，混合Fab的折迭类似于人类Fab的折迭，且证明鸵鸟VH域与人类VL域之间的稳定相互作用，尽管事实上，人类VH基因片段与鸵鸟VH基因片段之间的同源性在初级氨基酸层面上较低。
总体而言，实施例1至3展示，在三级结构层面上，在鸡与人类可变区之间、在鸭与人类可变区之间以及在鸵鸟与人类可变区之间存在大量同源性，即使在初级氨基酸层面上，来自鸡、鸭及鸵鸟的V基因区段与人类V基因区段共有相对较低的同源性。实际上，在初级氨基酸层面上，相较于鸡，鸭与人类V基因区段具有较低同源性，但与人类cLC(相较于鸡)具有甚至更多的模型化接触点，指示较高程度的三级结构同源性。另一方面，在初级氨基酸层面上，相较于鸡，鸵鸟人类V基因区段具有较高同源性，但与人类cLC具有较少模型化接触点(相较于鸡)。因此，可在经重排的可变区之间形成稳定结合域。
实施例4：产生引物用于将鸡VH区引入载体中以产生噬菌体展示文库或用于引入
宿主细胞中
商品肉鸡(CB)近亲系的基因组鸡重链基因座序列已公布(Reynaud等人，《细胞(Cell)》59，171-183，1989)，此类序列包括含以登录号M30319储存于NCBI数据库中的单一功能性VH基因区段(VH1)的片段(参见图11)，及含单一功能性JH基因区段的片段(登录号M30320；参见图12)。
由于鸡仅含有一个功能性VH基因区段及一个功能性JH基因区段，故单一正向引物及单一反向引物足以扩增来自经免疫接种的鸡的VH区序列。
名为chVH-FW的正向引物设计如下：
●引物chVH-FW的前33个碱基(GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC)与正向引物的前33个碱基一致，已知此类正向引物可扩增人类、小鼠或大鼠VH序列(de Haard等人，《生物化学杂志》274，18218-18230，1999)。该区域编码前导肽的一部分且含有SfiI选殖位点，如用于噬菌体展示的载体中存在的选殖位点。
●引物chVH-FW的最后21个碱基(GCCGTGACGTTGGACGAGTCC)与该单一功能性鸡VH基因区段的前21个碱基一致。自鸡分离的mRNA源性VH序列通常在此区域中不含或含有极少突变(参见例如Reynaud等人，1989，前述)，因为在该区域中，VH假基因(其用作VH多样化中的供体序列)与充当受体的功能性VH基因区段完全一致或大体上一致。在由其他文献(Andris-Widhopf等人，《免疫方法杂志(Journal of Immunological Methods)》242，159-181，2000)描述的类似鸡VH扩增正向引物中使用了刚好相同的21个碱基。
●引物chVH-FW的总计54个碱基的序列如下，其中SfiI位点加下划线：
5′GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCC-3′(SEQ IDNO：15)。
●引物chVH-FW的注释序列提供于图13中。
●图14中的DNA比对显示引物chVH-FW、功能性鸡VH的一部分与特定噬菌体展示载体MV1511的一部分之间的同源性。
●为经由计算器检查载体MV1511的前导序列与鸡VH序列的组合引起正确加工，使用SignalP工具(http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析包括MV1511前导序列及鸡VH1的蛋白质序列。结果指示在预期位置处发生预测的裂解。
名为chVH-RV的反向引物设计如下：
●噬菌体展示载体MV1511(参见图18)含有BstEII及XhoI选殖位点作为编码JH中与人类、小鼠及大鼠JH中相应序列高度同源的一端的序列的一部分。功能性鸡VH含有内部XhoI位点(在FW3中，参见图11)，因此XhoI无法用于选殖鸡VH。在鸡VH中不存在BstEII位点且因此，将此位点并入反向引物中，其编码JH序列的一端。此不可能仅经由沉默突变实现；并入BstEII位点使单一异白胺酸突变为苏胺酸，由此使JH序列自VIVSS变为VTVSS。基于对VH晶体结构的分析(参见上文)，预测此变化不会显著地影响抗体的结构及结合特性。此是出于选殖目的以及出于人类化目的而变化鸡VH序列的实施例，然而，一般熟习此项技术者应了解，也可并入不会显著地影响鸡VH/人类VL域的结合结构的附加或不同变化。
●具有24个碱基的引物chVH-RV序列如下，其中明显不同于鸡JH基因区段的突变加下划线，且BstEII位点以粗体斜体显示：5′-GGAGGAGACGGTGACCTCGGTCCC-3′(SEQ ID NO：16)
●引物chVH-RV的反向补体的注释序列提供于图15中。
●图16中的DNA比对显示chVH-RV的反向补体、鸡JH的一部分与载体MV1511的一部分之间的同源性。完整引物与相应鸡序列92％一致(24个碱基中的22个一致)；前10个碱基(在5′侧上)及后8个碱基(在3′侧上)是100％一致。
如实施例6中所详述，使用引物chVH-FW及chVH-RV扩增了来自用huPD-1免疫接种的鸡的VH区，随后经由将扩增的VH区选殖至载体MV1511中来制备Fab噬菌体展示文库，该载体含有人类CH1基因及人类cLC。如实施例6中所陈述，使用这些文库产生抗huPD-1 Fab组。
实施例5：用人类PD-1对野生型鸡免疫接种
可产生适合表达载体，该表达载体并入编码人类PD-1(huPD-1)的至少一部分的核酸以便能进行鸡的DNA免疫接种。
编码huPD-1的核酸陈述于以下SEQ ID NO：17中。然而，此序列可针对在鸡中表达进行密码子优化且可仅使用该序列的一部分，以便仅表达huPD-1的胞外域。适用于表达该胞外域的适合经密码子优化的核酸序列陈述于SEQ ID NO：18中。
表达载体可包括适当控制组件，诸如启动子，此类控制组件适于在免疫接种之后驱动huPD-1多肽于鸡中的表达。
huPD-1表达载体可例如通过附接至适合佐剂来制备用于免疫接种。接着，用huPD-1 DNA对鸡，通常白来亨鸡(white leghorn chicken)免疫接种。连续4周，每周(第0天、第7天、第14天及第21天)可使用基因枪经肌肉内或经皮内(无佐剂)进行免疫接种。可在每个免疫接种点施加适量的DNA，例如120μg DNA。因此，初次免疫接种可结合二次、三次、四次或四次以上追加免疫接种进行。通过基因枪对鸡免疫接种描述于例如Witkowski等人，《免疫学方法杂志》2009；341：146-153中。
在第0天，收集每只经免疫接种的鸡的一个蛋或血清作为免疫前样品。在第三次或第四次追加免疫接种后，例如，可收集每天每只鸡一个蛋或血清，持续如果干天。必要/希望时，可在8次免疫接种之后或甚至在12次免疫接种之后收集蛋/血清。
可使用熟习此项技术者熟知的方法，自收集的蛋的蛋黄或血清分离出IgY抗体。
对于根据例如FACS分析，IgY显示出明显huPD-1反应性的鸡，可分离出脾细胞及骨髓细胞，即，自鸡取出脾及骨髓，观察其针对目标蛋白的显著体液反应。接着，由脾及骨髓细胞产生细胞悬浮液，且随后，将这些细胞溶解于Trizol LS试剂(Thermo Scientific c#10296028)中并在-80℃下储存待用，使存在的蛋白质变性，同时允许提取编码鸡VH或VL区的谱系的核酸。
可使用FACS及ELISA分析IgY与huPD-1的反应性。FACS可包括作为目标细胞的用编码huPD-1的表达载体短暂转染的适合细胞、作为阴性对照细胞的未经转染的细胞、作为阳性对照抗体的抗PD-1抗体及作为阴性对照的抗破伤风类毒素(TT)抗体。可使用PE缀合的山羊抗人类IgG(Invitrogen，目录号H10104)作为二次抗体以检测人类IgG。可使用PE缀合的山羊抗鸡IgY(Jackson ImmunoResearch，目录号103-117-008)作为二次抗体以检测鸡IgY。
实施例6：由脾及骨髓(BM)产生文库
为了产生鸡VH区及人类VL区的噬菌体展示文库，使用遵循例如实施例5中所述方案制造的来自huPD-1免疫接种的鸡的脾及骨髓细胞的TRIzol样品产生各个文库。使用此类样品分离出RNA，且接着使用oligo(dT)引物合成cDNA。可进行多个反应以产生足够材料用于随后的PCR反应。
接着，基本上如Marks等人(《分子生物学杂志》222(3)，581-97，1999)中所描述，使用所产生的cDNA样品作为模板，使用两种鸡特异性引物chVH-FW及chVH-RV(参见图13至16及SEQ ID NO：)扩增VH基因且随后进行消化。
对于各cDNA样品，可并行地执行多次PCR(全部使用chVH-FW及chVH-RV)以便产生足够的PCR产物用于后续步骤。可能需要超过10次或甚至超过20次PCR。
该程序意图用3ng/μl最小浓度的各cDNA样品产生至少20ng纯化的经消化VH插入物。
噬菌体展示文库是根据基于盘的方案制备。总体而言：
基本上如de Haard等人(《生物化学杂志》1999年6月25日；274(26)：18218-30)中所描述，将PCR产物选殖于噬菌粒载体中以将Fab片段展示于噬菌体上，不同的处在于，用于每个Fab的SEQ ID NO：5的轻链是由该载体编码。
将编码VH区的核酸连接至SfiI/BstEII消化的载体并将所得经连接的载体转型至TG1细胞中，此举应当得到每个文库＞1E6 cfu(菌落形成单位)。
可对每个文库的一小组纯系执行集落PCR以测定VH插入物频率。也可对每个文库的一小组纯系执行DNA测序以测定VH序列多样性。
实施例7：Fab验证
对于欲产生的所有文库，拣选多个随机纯系并基本上根据《分子生物学杂志》222(3)，581-97，1991及《生物化学杂志》274(26)，18218-30，1999，使用此类纯系制备可溶性Fab。包括完全人类纯系作为参考物。此程序得到含有可溶性Fab的未纯化的周质提取物。
为了检查已优选地制造出Fab且其可被蛋白质L结合，可使用FortéBIO Octet-QKe系统，该系统包括Octet仪器，该仪器受附接至该仪器的独立计算器上的Octet软件控制。该系统基于生物层干涉测量术(BLI)，允许对生物分子相互作用进行实时定量及动力学表征，且该系统实质上是根据制造商的说明书使用(有关详情，参见www.fortebio.com)。Fab的定量是使用蛋白质L生物传感器(FortéBIO，部件编号18-5085)执行。
使用NAbTM蛋白质L.离心套组(Protein L.Spin Kit)自上清液中纯化出Fab，以允许直接在SDS-PAGE凝胶上分析Fab。测量上清液及蛋白质L纯化的样品的浓度。
未纯化的Fab的浓度在常见范围内，为约50μg/ml。由此指示，包括鸡VH及人类VL的Fab产生正常表达电平。
为检查蛋白质完整性，使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶对Fab进行SDS-PAGE及西方墨点法(Western blotting)。使用识别人类IgG的CH1域的HRP标记的小鼠抗体(BectonDickinson，目录号555788)作为检测抗体。在非还原条件下，预期在约50kD的单一谱带是展示鸡重链与人类共同轻链的正确配对的完整Fab，而预期在还原条件下，在约25kD的谱带是该Fab的重链片段。
图21显示，纯化的嵌合Fab并具有SEQ ID NO：98的人类对照Fab得到类似结果，表明嵌合Fab的正确重链-轻链配对。这些Fab的非还原性样品除含有完整Fab在50kD处的谱带外，还含有在25kD的谱带。25kD大小与由蛋白质L纯化得到的未配对的轻链相符。蛋白质L纯化可改变完整Fab与未配对的轻链的比率。因此，通过西方墨点法，使用ProtL-HRP(Ab108)及α-myc(Ab217)进行检测，进一步证实这些结果。结果显示于图23中。嵌合Fab产生与SEQID NO：98的人类对照类似的结果，由此证实此类嵌合Fab的重链与轻链的正确配对。预期对于所有Fab皆存在指示完整Fab的50kD谱带。
实施例8：自经免疫接种的鸡的文库选择PD-1 Fab
噬菌体展示文库营救(rescue)
在本实施例中的噬菌体展示选择期间，分别使用于上实施例6中产生的所有文库。
本实施例中使用的文库均可通过在过夜生长之后收集细菌来营救，且接着，可根据确定的方案(de Haard等人，《生物化学杂志》，274(26)，18218-30，1999)制备噬菌体。
噬菌体展示选择
例如，如本实施例中所描述，可实施如果干不同的选择策略(重组蛋白及细胞选择，分别针对huPD-1及moPD-1)以选择噬菌体。
对于所有选择策略，可执行一轮选择。如果未观察到富集，或如果在筛选期间的命中率＜20％，则可进行第二轮选择。该第二轮选择可使用与第一轮相同的选择策略或使用不同形式进行。例如，在对huPD-1重组蛋白执行第一轮选择后，可再对huPD-1重组蛋白，或对moPD-1重组蛋白，或甚至对细胞表达的huPD-1或moPD-1进行第二轮选择。
重组蛋白淘选选择
表1中列出由huFc与来自如果干物种的PD-1的融合物组成的重组蛋白，以及生物素化PD-1融合蛋白以用于选择。用KingFisher Flex执行淘选选择。
KingFisher Flex磁粒处理器是设计用于自动转移及加工呈微板格式的磁粒。KingFisher Flex系统的技术是基于使用覆盖有抛弃式、专门设计的尖尾梳的磁性杆及板(参见Kontermann R.及Dubel S.(2010)《抗体工程改造(Antibody Engineering)》第1卷，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第270页)。
噬菌体展示选择是基本上根据制造商的说明书，使用KingFisher Flex以半自动形式执行。此处描述两种不同的选择形式：1)“溶液中”选择，即，针对可溶性重组蛋白进行选择；以及2)生物素化细胞选择。抗原通常被生物素化且捕捉于涂有抗生蛋白链菌素的磁珠或涂有抗生物素抗体的磁珠上。
可使用5、0.5及0μg/ml(0μg/ml作为阴性对照)的重组生物素化huPD-1及moPD-1，例如可商购的huPD-1-huFc-生物素及moPD-1-moFc-生物素(参见表1)。
为避免选择对重组蛋白的huFc域具有特异性的结合物，在文库培育期间，添加呈溶液形式的100μg/ml hulgG(Sigma，目录号4506)。
使用1mg/ml胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。
之后，将来自KingFisher的洗脱样品转移至圆底96孔盘中含有5μl的4mg/mlAEBSF(Sigma-Aldrich，目录号A8456)的数列中以使胰蛋白酶失活。
可使用点滴法进行噬菌体滴定以测定此类选择的富集/输出力价。简言的，用洗脱的噬菌体的稀释液系列感染细菌，随后将这些细菌的液滴点滴于含有适当抗生素的琼脂板上，并在过夜培育之后，对集落数量计数，集落数量代表输出力价。
表1：可用于选择及ELISA的重组PD-1蛋白质
细胞选择
细胞选择是基本上根据制造商的说明书，在以下批注/变化下，用KingFisher执行：
●选择可使用FreeStyle 293-F细胞进行，此类细胞用编码huPD-1或moPD-1的表达载体短暂转染。
●在如下所述开始生物素标记之前，可使用市售抗体执行对照FACS以确定PD-1的表达(参见表2)。
○为检测huPD-1，可使用识别huPD-1的小鼠抗体(Abcam，目录号ab52587)作为一次抗体，且使用PE缀合的山羊抗moIgG(Invitrogen，目录号M30004-4)作为二次抗体。
○为检测moPD-1，可使用PE缀合的大鼠抗moPD-1抗体(ITK-Diagnostics，目录号109103；Merus Ab0285)。
●细胞可使用EZ-LinkTM磺基-NHS-生物素套组(ThermoFisher目录号21217)生物素化。此包括使用FACS，用抗生蛋白链菌素-PE(Caltag，目录号SA1004-4)作为检测试剂检查生物素化效率。同时，可再执行以上描述的FACS，以证实此类细胞上的PD-1在生物素化之后仍可被识别。
●使用1mg/ml胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。
●之后，将来自KingFisher的洗脱样品转移至圆底96孔盘中含有5μl的4mg/mlAEBSF(Sigma-Aldrich，目录号A8456)的数列中以使胰蛋白酶失活。
●如上文所描述，可使用点滴法进行噬菌体滴定以测定此类选择的富集/输出力价。
表2：市售抗体
| 描述 | 缀合物 | 供货商 | 目录号 | FACS/ELISA浓度 |
| 山羊抗moIgG | PE | Invitrogen | M30004-4 | 1∶100 |
| 小鼠抗huIgG | HRP | Becton Dickinson | 555788 | 1∶2000 |
| 小鼠抗M13 | HRP | Bioconnect | 11973-MM05T-H | 1∶5000 |
| 小鼠抗huPD-1 | - | Abcam | ab52587 | 1∶200 |
| 大鼠抗moPD-1 | PE | ITK-Diagnostics | 109103 | 1∶200 |
筛选
随机地拣选纯系并加以筛选以作为噬菌体。通过FACS对细胞表达的huPD-1或moPD-1进行筛选，因为这些huPD-1或moPD-1是最相关的抗原形式(通过ELISA筛选重组PD-1蛋白质可得到不结合细胞表达的PD-1的纯系)。
主盘拣选及噬菌体制造
●自每个选择策略拣选24或48个纯系(取决于在选择期间观察到的富集物)放入96孔主盘(MP)中。
○可在每个盘的一个孔中接种MF1025(含有抗甲状腺球蛋白Fab域的噬菌体)作为阴性对照。
○每个MP的一个孔保持空白(无细菌)，如下所述，在FACS筛选期间用于添加阳性对照抗体。
使用FACS的噬菌体筛选
噬菌体FACS是使用FreeStyle 293-F细胞进行，此类细胞用编码huPD-1或moPD-1的表达载体短暂转染。一个孔用于市售阳性对照抗体(表2)以确定PD-1表达：为检测huPD-1，可使用识别huPD-1的小鼠抗体(Abcam，目录号ab52587)作为一次抗体，用PE缀合的山羊抗moIgG(Invitrogen，目录号M30004-4)作为二次抗体；且为检测moPD-1，可使用PE缀合的大鼠抗moPD-1抗体(ITK-Diagnostics，目录号109103)。
测序
对在FACS中特异性结合至huPD-1和/或moPD-1的所有纯系的VH基因进行测序。分析序列并根据其CDR3序列进行分组。
实施例9：产生表达双特异性嵌合鸡VH/人类VL抗体的宿主细胞
可通过用编码轻链及两个不同重链的一个或多个质体(短暂)转染来产生具有至少一个嵌合鸡VH-人类VL的双特异性抗体，该两个不同重链经CH3工程改造以确保高效异二聚化及该双特异性抗体的形成。单细胞中这些链的产生使得相对于形成单特异性抗体，有利于形成双特异性抗体。
因此，可将编码两个不同VH的核酸连同经重排的huVK1-39轻链选殖至适合表达载体中，以便能在单细胞中表现双特异性抗体。VH区的核酸中的一个或两个可属于鸡起源的且其余是人类起源的，例如一个臂是鸡VH-人类VL且其余部分是人类的，或两个臂是鸡VH-人类VL或任何其他排列。
在以引用的方式并入本文中的US13/866,747(现以US 9,248,181颁布)、US14/081,848(现以US 9,358,286颁布)及PCT/NL2013/050294(以WO2013/157954公布)中，揭露使用兼容的异二聚化域制造双特异性抗体的方法及方式。这些方式及方法也可有利地用于本发明中。确切地说，本发明的双特异性抗体优选地包括用于基本上仅产生双特异性全长IgG分子的突变。优选的突变是在第一CH3域(“KK变体”重链)中的氨基酸取代L351K及T366K(EU编号)以及在第二域(“DE变体”重链)中的氨基酸取代L351D及L368E，或反之亦然。先前在US 9,248,181及US 9,358,286专利以及WO2013/157954 PCT申请案中展示，该DE变体及KK变体优先配对形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。由于在一致重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间存在斥力，几乎不会发生DE变体重链的同二聚化(DEDE同二聚体)。
此类方法可应用于适用于本发明中的如本文所描述的任何动物。
实施例10：用小鼠CXCR4对野生型鸡免疫接种
CXCR4是GPCR种类A，A1亚家族的趋化因子受体。其具有7个跨膜螺旋且具有细胞外N末端及细胞内C末端。此拓朴结构产生4个胞外域。小鼠同源物与人类CXCR4共有91％总体同源性，且与胞外域具有67％同源性。鸡同源物与人类CXCR4共有82％总体同源性，且与胞外域具有48％同源性。
使用DNA与脂质纳米粒免疫接种(lipoparticle immunization)，用小鼠CXCR4对五只鸡免疫接种。野生型全长序列小鼠CXCR4(SEQ ID NO：99)是由Integral Molecular合成及选殖。通过对短暂转染的HEK293及QT6细胞进行流动式细胞测量术来验证质体，其中使用Mab21651(R&D Systems)进行检测。
自具有最高抗体反应的鸡的血液、骨髓及脾分离出B细胞。自白血球提取RNA，合成DNA并通过PCR扩增编码重链及轻链可变区的DNA。将扩增的VH及VL产物选殖至MV1511载体中(图18)并制造Fab噬菌粒。将DNA转型至细菌中以产生噬菌体文库，其中此类噬菌体表达具有SEQ ID NO：5的人类轻链。
针对小鼠CXCR4脂质纳米粒淘选Fab噬菌体文库。通过脂质纳米粒ELISA筛选纯系。对结合物测序并基于CDR3同源性将其分成数组。通过流动式细胞测量术，使用天然地表达折迭的小鼠CXCR4的HEK293细胞验证来自三个VHCDR3组的Fab。随后，通过流动式细胞测量术测试这些组与人类CXCR4的结合。根据标准方法，将阳性纯系再选殖至IgG形式中。鉴别与人类及小鼠CXCR4交叉反应的三个VHCDR3组。结果显示于图25中。小鼠及人类CXCR4结合抗体的重链可变区的氨基酸序列陈述于SEQ No：31、32及33中。
用功能上配对的重链及轻链产生包括鸡VH及人类VL的抗原特异性嵌合抗体。
表3：序列的描述
Claims (29)
1.一种结合域或多聚体或其变体，包括由核酸编码的可变区，所述核酸基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物，所述可变区与人类可变区配对。
2.根据权利要求1所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述在动植物演化史上远离人类的动物是鸟类。
3.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述多聚体是抗体。
4.根据权利要求3所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述抗体的恒定区是人类恒定区。
5.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是由基于、来源于或获自所述动物的核酸编码的经重排的VDJ区并且所述人类可变区是轻链可变区。
6.根据权利要求5所述的结合域或多聚体或其变体，其包括共同轻链，诸如人类共同轻链。
7.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是是由基于、来源于或获自所述动物的核酸编码的经重排的VJ区并且所述人类可变区是重链可变区。
8.根据权利要求7所述的结合域或多聚体或其变体，其包括共同重链。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述鸟类包括编码VH区的功能性VH基因区段，所述VH区包括与人类VL区在VH/VL界面处的至少5个、优选地至少8个且更优选地至少10个静电相互作用。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述鸟类是鸡形目，诸如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
11.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述结合域或多聚体或其变体结合至小鼠和/或人类CXCR4，优选地结合至人类CXCR4。
12.根据权利要求11所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区是重链可变区，其包括含SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：102，或与其具有至少80％、85％、优选地至少90％、95％、更优选地至少97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其中所述由基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物的核酸编码的可变区经人类化。
14.根据权利要求3至13中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其是双特异性抗体。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的结合域或多聚体或其变体，其是多特异性抗体，例如三特异性抗体。
16.一种用于制备结合域或多聚体或其变体的方法，所述方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自所述动物分离出编码可变区的核酸序列；
-自所述经分离的核酸序列获得可变区；以及
-使来自所述动物的可变区与人类可变区配对，
由此制备出结合域或多聚体或其变体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中来自所述动物的所述编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列并且所述人类可变区是轻链可变区。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述在动植物演化史上远离人类的动物是鸟类，诸如鸡形目，诸如鸡、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、雷鸟、鹧鸪、野鸡、原鸡、凤冠雉科鸟类、鹅雁、鸭或鸵鸟。
19.一种噬菌体，所述噬菌体在其基因组中包括：
编码可变区的核酸，所述核酸是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及
编码人类可变区的核酸。
20.根据权利要求19所述的噬菌体，其中来自所述动物的所述编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列并且所述人类可变区是轻链可变区。
21.一种噬菌体展示文库，其包括根据权利要求19或20所述的噬菌体，所述文库包括至少约106个噬菌体。
22.一种用于制备噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自所述动物分离出多个编码可变区的核酸；以及
-使用编码所述可变区的所述核酸制备噬菌体展示文库，
由此制备出噬菌体展示文库。
23.根据权利要求22所述的方法，其中来自所述动物的所述多个编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述噬菌体展示文库中的噬菌体包括编码人类轻链可变区的核酸序列。
25.一种用于鉴别对抗原具有结合特异性的根据权利要求1至15中任一项所述的结合域或多聚体或其变体的方法，所述方法包括：
-用抗原对在动植物演化史上远离人类的动物免疫接种；
-自所述动物分离出多个编码可变区的核酸；
-使用编码所述可变区的所述核酸制备噬菌体展示文库；以及
-鉴别所述噬菌体展示文库中结合至所述抗原的噬菌体，
由此鉴别出对所述抗原具有结合特异性的结合域或多聚体或其变体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述结合域或多聚体或其变体结合至所述抗原。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中来自所述动物的所述多个编码可变区的核酸序列是编码重链可变区的核酸序列。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述噬菌体展示文库中的噬菌体包括编码人类轻链可变区的核酸序列。
29.一种或多种核酸，其编码：包括重链可变区的多肽，所述一种或多种核酸是基于、来源于或获自在动植物演化史上远离人类的动物；以及包括人类轻链可变区的多肽。
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