KR20230039773A - 변형된 중쇄-단독 항체를 생산하는 형질전환 비-인간 동물 - Google Patents

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Abstract

인간 또는 키메라성 중쇄-단독 항체가 제공되고, 여기서 상기 HCAb의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 천연 아미노산 잔기는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환된다.

Description

변형된 중쇄-단독 항체를 생산하는 형질전환 비-인간 동물{TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS PRODUCING MODIFIED HEAVY CHAIN-ONLY ANTIBODIES}
유전자 서열
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 유전자 서열을 포함하며, 본 명세서에 그 전체가 참고로 편입된다. 2017년 8월 11일에 작성된 상기 ASCII 카피는 TNO-0001-WO_SL.txt로 지칭되고 크기는 26,401 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 변형된 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 생산하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감소된 응집성을 갖는 변형된 인간 또는 키메라성 HCAb를 생산하는 형질전환 비-인간 동물, 예컨대 형질전환 랫트 또는 마우스, 이렇게 제조된 항체 및 이를 제조하는 방법과 사용하는 방법에 관한 것이다.
중쇄-단독 항체
기본적인 4개-사슬 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 헤테로사량체 당단백질이다. IgG의 경우에, 4-사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입에 의존하여 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로에 대해서 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VH) 이어서 각각의 α 및 γ 사슬에 대한 3개의 불변 도메인 (CH) 그리고 μ 및 ε 아이소타입에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VL) 이어서 그것의 다른 말단에서 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄 (CH1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 짝짓기는 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩타이드와 함께 5개의 염기성 헤테로사량체 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하고, 반면에 분비된 IgA 항체는 중합화되어 J 사슬과 함께 염기성 4-사슬 단위를 포함하는 2-5개의 다가 조립체를 형성할 수 있다. 항체의 상이한 부류의 구조 및 특성에 관하여, 예를 들어, 다음 문헌을 참고한다: Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P.Stites, Abba I.Terr and Tristram G.Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71면과 6장. 이러한 항체에서, 비록 결합은 CH1 도메인 및 CL 도메인의 일부에 의해 촉진되지만, VH와 VL 도메인의 상호작용은 항원 결합 영역을 형성한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은, 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다. 그것의 중쇄 (CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 배정될 수 있다. 5개 부류의 면역글로불린이 있다: 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능에서 상대적으로 사소한 차이에 기초하여 서브클래스로 추가로 분할되는데, 예를 들어, 인간은 하기 서브클래스를 발현한다:IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
종래의 IgG 항체에서, 중쇄와 경쇄의 회합은 부분적으로 경쇄 불변 영역과 중쇄의 CH1 불변 도메인 사이의 소수성 상호작용에 기인한다. 중쇄와 경쇄 사이의 이 소수성 상호작용에 또한 기여하는 중쇄 프레임워크 2 (FR2)와 프레임워크 4 (FR4) 영역 내에 추가의 잔기가 있다.
그러나, 낙타과 (낙타, 단봉낙타 및 라마를 포함하는 하위-목인 낙타아목)의 혈청은 쌍으로 된 H-사슬 단독으로 구성된 주요 유형의 항체 (중쇄 단독 항체 또는 HCAb)를 함유한다는 것이 공지되어 있다. 낙타과 (낙타 단봉낙타, 낙타 쌍본낙타, 라마 글라마, 라마 구아나코, 라마 알파카및라마 비쿠냐) 의 HCAb는 단일 가변 도메인 (VHH), 힌지 영역 및 고전적 항체의 CH2 및 CH3 도메인에 매우 상동성인 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)으로 구성된 특유의 구조를 갖는다. 이들 HCAb는 게놈 내에 존재하는 불변 영역의 제1 도메인 (CH1)이 부족하지만, mRNA 과정 동안 스플라이싱된다. CH1 도메인의 부재는 이 도메인이 경쇄의 불변 도메인에 대한 고착 장소이기 때문에 HCAb 내 경쇄의 부재를 설명한다. 이러한 HCAb는 통상적인 항체 또는 이의 단편으로부터 3개의 CDR에 의해 항원-결합 특이성 및 고친화도를 부여하도록 자연적으로 진화하였다 (Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111-124).
연골성 물고기는 또한 가벼운 폴리펩타이드 사슬을 갖지 않고 전적으로 중쇄로 구성된, IgNAR로 지정된 특유의 유형의 면역글로불린을 진화시켰다.
항원에 결합하는 경쇄가 결여된 중쇄-단독 항체의 능력은 1960년대에 확립되었다 (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). 중쇄 면역글로불린은 사량체 항체에 비하여 80%의 항원-결합 활성을 보유한 경쇄로부터 물리적으로 분리되었다.
문헌 [Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790]은 재배열된 마우스 μ 유전자로부터 CH1 도메인의 제거는 포유동물 세포 배양에서 경쇄가 결여된 중쇄-단독 항체의 생산을 초래한다는 것을 실증했다. 본 항체는 유지된 VH 결합 특이성과 효과기 기능을 생성했다.
낙타과 중쇄 항체의 발견은 파아지 디스플레이와 같이 인공 시스템에서 인간 단일 도메인 항체를 개발하는데 있어서의 관심을 자극했다. 이 방식으로 확인된 초기 인간 도메인 항체는 응집되기 쉽고 경쇄 불변 영역과의 계면에 정상적으로 매립되어 있는 프레임워크 영역에서 노출된 소수성 패치에 기인하기 쉬운 용해도 문제를 갖는다. 인간 VH 도메인 항체의 결정 구조를 규명한 후속적인 연구는 인간 도메인 항체의 표면 노출된 잔기를 확인했다. 문헌 [Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654]는 자율적 인간 VH 도메인의 안정성 및 용해도에 기여하는 인자의 포괄적인 분석을 보고한다.
클로닝되고 단리된 VHH 도메인은 최초 HCAb의 전체 항원-결합능을 갖는 안정한 폴리펩타이드이다. 나노바디는 진화된 중쇄 항체의 최초 중쇄의 전체 항원-결합능을 보유한 최소 이용가능한 온전한 항원 결합 단편 (약 12-15 kDa)이고, 경쇄의 부재에서 완전하게 기능적이다. 이들 VHH 도메인은 정맥내 경구 또는 국소 투여에 적합하고, 하나 이상의 표적에 대해 높은 효력 및 결합 친화도를 나타내는 일가 또는 다가 형태로 쉽게 제조될 수 있는, 나노바디로 명명된 치료적 항체의 새로운 세대의 기초를 형성한다.
단일 도메인 VHH 항체는, 그것의 제조 방법을 포함하여, 예를 들어, WO2004062551에 기재되어 있다.
λ (람다) 경쇄 (L) 유전자좌 및/또는 λ 및 κ (카파) L 사슬 유전자좌가 기능적으로 침묵화된 마우스 및 이러한 마우스에 의해 생산된 항체가 하기에서 기재되어 있다: 미국특허 번호 7,541,513 및 8,367,888. 마우스 및 랫트에서 중쇄-단독 항체의 재조합 생산은, 예를 들어, 하기에서 보고되어 있다: WO2006008548; 미국출원 공개 번호 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101; Br
Figure pat00001
ggemann et al., Crit. Rev. Immunol.;2006, 26(5):377-90; 및 Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13):3271-3283. 아연-핑거 뉴클레아제의 배아 미세주입을 통한 녹아웃 랫트의 생산은 문헌 [Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433]에 기재되어 있다. 면역글로불린 중쇄 녹아웃 랫트의 특성규명은 문헌 [M
Figure pat00002
noret et al., 2010, European Journal of Immunology, 40:2932-2941]에 보고되어 있다. 이러한 항체를 생산하는 이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 가용성 중쇄-단독 항체 및 형질전환 설치류는 하기에서 기재되어 있다: U.S.특허번호 8,883,150. 결합 (표적화) 도메인으로서 단일-도메인 항체를 포함하는 CAR-T 구조가, 예를 들어, 문헌 [Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641] 및 [Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386]에 기재되어 있다.
최근의 진보에도 불구하고, 응집에 대한 보다 낮은 경향을 가지고 그것의 의도된 표적에 대해 고친화도를 보유하는 중쇄-단독 항체의 생산을 위한 개선된 방법이 필요하다.
본 발명은 응집에 대한 보다 낮은 경향을 갖는 중쇄-단독 항체 (HCAb)가 HCAb의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기를 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 또 다른 아미노산 잔기로의 대체에 의해 제조될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 이러한 소수성 패치는 항체 경쇄 불변 영역과의 계면에 정상적으로 매립되지만, HCAb에서 노출된 표면이 되고, 적어도 부분적으로, HCAb의 원하지 않는 응집 및 경쇄 회합에 대해 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변성 (VH) 도메인을 포함하고, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함하고, 항체 경쇄의 부재에서 표적 항원에 대해 결합 친화도를 갖는 단리된 인간 또는 키메라성 중쇄-단독 항체 (HCAb)에 관한 것으로, 여기서 상기 VH 도메인에서 상기 HCAb의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된다.
일 구현예에서, HCAb는 인간 항체이다.
또 다른 구현예에서, HCAb에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기에 의해 치환된다.
또 다른 구현예에서, HCAb에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대, 예를 들어, 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H), 바람직하게는 아르기닌 (R)에 의해 치환된다.
특정 구현예에서, HCAb는 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
모든 구현예에서, HCAb는 하나 이상의 프레임워크 영역에서 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.
모든 구현예에서, HCAb는 FR4 내 제1 아미노산 잔기에서 천연 아미노산 잔기를 포함하는 상응하는 항체에 비하여 응집에 대해 감소된 경향을 가질 수 있다.
모든 구현예에서, HCAb는 그것의 표적 항원에 대해 약 1pM 내지 약 1μM의 결합 친화도를 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함한 중쇄 가변성 (VH) 도메인을 포함하는, 항체 경쇄의 부재에서 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는 단리된 인간 또는 키메라성 중쇄-단독 항체 (HCAb)에 관한 것으로, 여기서 상기 HCAb는 천연 인간 VH 아미노산 서열의 제4 FR 영역 (FR4) 내 제1 아미노산 위치에서 트립토판 (T) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
일 구현예에서, HCAb는 CH1 영역을 결하는 중쇄 불변 (CH) 도메인을 추가로 포함하고, IgG 항체, 예컨대 IgG1 항체일 수 있다.
또 다른 구현예에서, HCAb는 하나 이상의 FR 영역 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCAb는 FR4 내 제1 아미노산 잔기에서 천연 아미노산 잔기를 포함하는 상응하는 항체에 비교하여 응집에 대해 감소된 경향을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 중쇄-단독 항체를 포함하는 키메라성 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이다. 일 구현예에서, CAR은 단일 인간 VH 도메인을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상이한 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는, 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 천연 아미노산 잔기에 대해, 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는, 상보적 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 단리된 자율적 인간 항체 중쇄 가변성 (VH) 도메인에 관한 것이다.
일 구현예에서, 단리된 자율적 인간 VH 도메인에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기에 의해 치환된다.
또 다른 구현예에서, FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) 잔기, 바람직하게는 아르기닌 (R) 잔기에 의해 치환된다.
추가 구현예에서, 단리된 자율적 인간 VH 도메인은 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
또 추가의 구현예에서, 단리된 자율적 인간 VH 도메인은 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 표적 항원에 대해 결합 친화도를 갖는, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 적어도 하나의 인간 VH 도메인을 포함하는 다중 항원 결합 도메인을 함유하는 다가 결합 단백질에 관한 것으로,여기서 상기 VH 도메인에서 상기 다가 결합 단백질의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된다.
일 구현예에서, 다가 결합 단백질에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기에 의해 치환된다.
*또 다른 구현예에서, 다가 결합 단백질에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) 잔기, 바람직하게는 아르기닌 (R) 잔기에 의해 치환된다.
추가 구현예에서, 다가 결합 단백질은 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
모든 구현예에서, 다가 결합 단백질은 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 비-인간 동물의 게놈 내에서 서로 재조합되고 친화성성숙이 이어질 때, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 (FR) 영역을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 영역을 인코딩하는 하나 이상의 인간 V 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 J 유전자 분절을 포함하는 재조합 중쇄-단독 면역글로불린 (Ig) 유전자좌에 관한 것으로, 여기서 상기 인간 J 분절 중 적어도 하나는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 비-천연 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈을 포함한다.
일 구현예에서, 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌는 CH1 기능성을 결하는 면역글로불린 불변 효과기 영역을 인코딩하는 불변 (C) 영역 유전자 분절을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌는 2 내지 40개 D 유전자 분절, 및/또는 2 내지 20개 J 유전자 분절을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 1 초과의 인간 J 분절은 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 비-천연 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인간 J 분절의 모두의 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌에는 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 비-천연 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈을 포함한다.
추가 구현예에서, 인코딩된 무거운 VH 영역에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) 잔기, 바람직하게는 아르기닌 (R) 잔기에 의해 치환된다.
또 추가의 구현예에서, 인코딩된 VH 영역은 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌는 W에 대한 코돈이 R에 의해 대체된 J4 유전자 분절을 포함한다.
모든 구현예에서, 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하는 VH 영역을 인코딩한다.
추가 구현예에서, 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌는 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 VH 영역을 포함하는 인간 또는 인간화된 중쇄-단독 항체를 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 중쇄-단독 Ig 유전자좌를 포함하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 형질전환 비-인간 동물은 비-인간 척추동물, 설치류, 마우스, 또는 랫트, 예컨대 UniRat™ 같은 비-인간 포유동물이다.
추가 양태에서, 본 발명은 임의의 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자를 발현하지 않고, 그리고 서로 재조합되고 친화성 성숙이 이어질 때, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 (FR) 영역을 포함하는 VH 도메인을 인코딩하는, 하나 이상의 V 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함하는 이종성 중쇄-단독 Ig 유전자좌를 포함하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것으로, 여기서 상기 VH 도메인의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 상이한 아미노산 잔기, 및 하나 이상의 불변 효과기 영역 유전자 분절에 의해 치환되고, 그 각각은 CH1 기능성을 포함하는 항체 불변 효과기 영역을 인코딩하고, 여기서 유전자 분절은 V, D 및 J 유전자 분절과 불변 영역 유전자 분절이 재조합하여 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 인코딩하는 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 좌위를 생성하도록 배열된다.
일 구현예에서, 상기 형질전환 비-인간 동물의 VH 도메인에서 FR4의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기, 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) 잔기, 바람직하게는 아르기닌 (R) 잔기에 의해 치환된다.
또 다른 구현예에서, 형질전환 비-인간 동물에서 VH 도메인은 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 형질전환 비-인간 동물에서 이종성 중쇄-단독 유전자좌는 W에 대한 코돈이 R에 대한 코돈에 의해 대체된 J4 유전자 분절을 포함한다.
모든 구현예에서, 인코딩된 중쇄-단독 항체는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다.
추가 구현예에서, 형질전환 비-인간 동물은 포유동물, 척추동물, 설치류, 마우스 또는 랫트, 예컨대 UniRat™이다.
모든 양태에서, 특정 구현예에서, 본 명세서에서 중쇄-단독 항체는 FR1, FR2, 및 FR3 영역을 포함한, 다른 프레임워크 영역 내에 돌연변이를 함유하지 않는다.
모든 양태에서, 특정 구현예에서, 본 명세서에서 중쇄-단독 항체는 낙타과, 예컨대 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 또는 구아노코라마에 전형적으로 존재하는 추가의 프레임워크 돌연변이를 함유하지 않는다.
모든 양태에서, 특정 구현예에서, 본 명세서에서 중쇄-단독 항체는, 예를 들어, FR2 영역에서 또는 FR2 및 FR4 영역에서와 같이, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 영역을 포함하는, 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다.
모든 양태 및 구현예에서, 본 발명의 HCAb가 결합 친화도를 갖는 표적 항원은, 비제한적으로, 세포 표면 수용체 및 종양 항원, 예컨대, 예를 들어, EGFR, ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), ErbB4 (HER4), CTLA-4/CD152, RANKL, TNF-α, CD20, IL-12/IL-23, IL1-β, IL-17A, IL-17F, CD38, NGF, IGF-1, IL-12, CD20, CD30, CD39, CD73, CD40, PD-1, PDL-1, PD-L2, BCMA, BTLA, 흉선 기질 림포포이에틴 (TSP), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기세포 항원 (PSCA), CD137, OX-40, 및 IL-33을 포함한다.
모든 양태 및 구현예에서, HCAb 결합 도메인은 동일한 표적 항원의 다중 상이한 에피토프 또는 1 초과 표적 항원 상의 다중 상이한 에피토프에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질 중 일부일 수 있다. 예를 들어, 하기 결합 친화성을 갖는 이중특이적 HCAb 구조를 포함한, 다중-특이적, 예컨대 이중특이적 HCAb가 구체적으로 포함된다: 상피성 세포 유착 분자 (EpCam) × CD3; CD19 × CD3; EpCam × CD3; TNF-α x IL-17; IL-1α × IL-1β; CD30 × CD16A; 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) × HER3; IL-4 × IL-13; 안지오포이에틴 2 (Ang-2) × 혈관 내피 성장 인자 a (VEGF-A); 인자 IXa × 인자 X; 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) × HER3; IL-17A × IL-17F; HER2 × HER3; 암종배아 항원 × CD3; CD20 × CD3; CD123 × CD3; BCMA ×CD3, PSMA × PSCA × CD3, PSMA × CD3, PSCA × CD3, CD19 × CD22 × CD3, CD22 × CD3, CD38 × PD1, CD38 × PD-L1, CD38 × CD73, CD38 × CD39, PD1 × CD39 × CD73, 및 PD1 × CD73.
도 1은 실시예에 기재된 바와 같이, 중쇄-단독 항체를 발현하는 (서열번호:41) UniRat™ 내 위치 101에서 R을 발현하는 J4 유전자 분절 (서열번호:40)을 갖는 인간 형질전환의 다이어그램이다.
도 2는 실시예에 기재된 바와 같이, 중쇄-단독 항체를 발현하는 UniRat™ 내 위치 101에서 R들을 발현하는 모든 J 분절 (각각 나타난 순서로, 서열번호 42-47)을 갖는 인간 형질전환의 다이어그램이다.
도 3은 UniRat™ 및 OmniFlic™에서 J 유전자 용법을 도시하고, 여기서 후자는 UniRat™과 동일한 인간 V 유전자 클러스터를 갖는 형질전환 랫트이지만 고정된 카파 경쇄를 발현한다.
도 4는 중쇄-단독 인간 항체 내 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 아미노산 잔기에서 W→R 돌연변이가 람다 경쇄와 회합을 억제한다는 것을 설명한다.
도 5a 및 도 5b는 동일한 CDR3 계열 내 중쇄 항체와 유리 람다 단백질 회합.본 도면은 동일한 CDR3 계열 내 중쇄 항체로부터 11 VH 서열의 다중 서열 정렬을 도시한다 (각각 나타난 순서로, 서열번호 48-58). 이들 서열 모두는 위치 101에서 W를 함유한다.
도 6은 본 발명의 인간 중쇄-단독 항체를 사용하여 scFv CAR-T 구조 (패널 A) 및 CAR-T 구조 (패널 B)를 비교하여, 인간 VH 세포외 결합 도메인을 사용하는 키메라성 항원 수용체의 2개의 구조를 설명한다.
도 7은 인간 VH 결합 도메인을 포함하는 다양한 다중-특이적 HCAb 작제물을 도시한다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한 당해 분야의 기술범위 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은, 예컨대, 하기 문헌에 완전하게 설명되어 있다: "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", 제2 판 (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I.Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.);"Current Protocols in Molecular Biology" (F.M.Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적 업데이트); "PCR:The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display:A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).
특허 출원 및 공보를 포함하여, 본 명세서에서 인용된 모든 참고자료는 전체적으로 참고로 편입된다.
I.정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "형질전환 비-인간 동물"은 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 아미노산 잔기가 이러한 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 또 다른 잔기에 의해 대체된 인간 또는 인간화된 중쇄-단독 항체를 생산할 수 있는 비-인간 동물이다. 일 구현예에서, 천연 아미노산 잔기는 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 양으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 형질전환 비-인간 동물은 바람직하게는, 비제한적으로, 랫트, 마우스, 소과, 원숭이, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 기니아 피그, 햄스터 및 기타 동종의 것을 포함하는 포유동물이다. 바람직하게는, 형질전환 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게는 랫트 또는 마우스, 가장 바람직하게는 UniRat™이다. 형질전환 동물의 선택은 단지 본 명세서에서 기재된 FR4 돌연변이를 갖는 인간 또는 키메라성 중쇄-단독 인간 또는 키메라성 항체를 생산하는 능력에 의해서만 제한된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유전자 변형"은 비-인간 동물의 유전자 서열에서의 하나 이상의 변경이다. 비-제한적인 예는 형질전환 동물의 게놈 안으로 형질전환의 삽입이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은 발현을 증진시키기 위해 프로모터, 리포터 유전자, 폴리 아데닐화 신호 및 다른 요소 (절연체, 인트론)를 함유하는 외인성 DNA를 지칭한다. 이 외인성 DNA는 형질전환 동물이 발생하는 일-세포 배아의 게놈 안으로 통합되고 형질전환은 성숙한 동물의 게놈에 남아 있다. 통합된 형질전환 DNA는 에그 또는 마우스의 게놈에서 단일 또는 여려 장소에서 발생할 수 있으며, 또한 단일 내지 다수 (수백)의 형질전환의 탠덤 카피가 각각의 게놈 위치에 통합될 수 있다.
"통상적인 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 디설파이드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 중에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 일 말단에서 수 많은 불변 도메인에 따르는 가변 도메인 (VH)을 갖는다. 각각의 경쇄는 일 말단에서 가변 도메인 (VL)을 가지고 그것의 다른 말단에서 불변 도메인을 가지고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 그리고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다 (예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). 이 넘버링에 따르면, FR4 영역의 제1 아미노산 잔기는 아미노산 위치 101에 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고 그것의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변성 영역으로 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분이 프레임워크 (FR)로 지칭된다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 β-시트 배치형태를 채택하는, 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 내 CDR들은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 사슬로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (다음 문헌 참고: Kabat et al., NIH Publ.No. 91-3242, Vol. 1, 647-669 페이지 (1991)). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여되지는 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대해 지향된다. 게다가, 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다클론성) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지향된다.
용어들 "중쇄-단독 항체," "중쇄 항체" 및 "HCAb"는 상호교환적으로 사용되고, 가장 넓은 의미에서 통상적인 항체의 경쇄를 결하는 항체를 지칭한다. 동종이량체성 HCAb가 경쇄를 결하고 따라서 VL 도메인을 결하기 때문에, 항원은 하나의 단일 도메인, 즉, 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인 (낙타과의 중쇄 가변 도메인에 대해 언급될 때 VH 또는 VHH)에 의해 인식된다. 본 용어는 구체적으로, 비제한적으로, VHH 항원-결합 도메인 및 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 동종이량체성 항체 또는 CH1 도메인의 부재에서 낙타과 항체; 이러한 항체의 기능적 (항원-결합) 변이체, 가용성 VH 변이체, 하나의 가변도메인 (V-NAR)과 5개 C-유사 불변 도메인 (C-NAR)의 동종이량체 및 이들의 기능적 단편을 포함하는 Ig-NAR; 및 가용성 단일 도메인 항체 (sdAbs) 또는 나노바디를 포함한다. 본 발명의 중쇄-단독 항체는 FR4의 제1 위치에서 아미노산 잔기 (Kabat 넘버링에 따른 아미노산 잔기 101)가 이러한 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 또 다른 잔기에 의해 대체된 적어도 하나의 중쇄 가변성 (VH) 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 천연 아미노산 잔기는 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 양으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 바람직하게는 본 발명의 중쇄-단독 항체는, 바람직하게는 아미노산 위치 101에서 Trp (W) 대 Arg (R) 돌연변이 (W101R 돌연변이)를 포함하는, 인간 또는 키메라성 항체이다. 일 구현예에서, 본 명세서에서의 중쇄-단독 항체는 키메라성 항원 수용체 (CAR)의 결합 (표적화) 도메인으로 사용된다.
용어 "가용성 단일 도메인 항체 (sdAb)"는 가장 넓은 의미에서, 불변 도메인의 부재에서 중쇄 항체 또는 통상적인 IgG의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다. 기본적인 sdAb 구조는 일반적으로 3개의 상보적 결정 영역 (CDR1-CDR3)에 의해 차단된 4개의 프레임워크 영역 (FR1-FR4)으로 구성된다. 따라서, sdAb는 하기 구조에 의해 표시될 수 있다:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 추가의 검토를 위해, 예를 들어, 다음을 참고한다: Holt et al, "Domain antibodies:proteins for therapy" Trends in Biotechnology (2003):Vol. 21, No. 11:484-490.
본 발명의 항체는 다중-특이적 항체를 포함한다. 다중-특이적 항체는 1 초과의 결합 특이성을 가진다. 용어 "다중-특이적"은 구체적으로 "이중특이적" 및 "삼중특이적," 뿐만 아니라 고차 독립적인 특이적 결합 친화성, 예컨대 고차 폴리에피토프 특이성뿐만 아니라 4가 항체 및 항체 단편을 포함한다. 용어들 "다중-특이적 항체", 다중-특이적 단일 사슬-단독 항체" 및 "다중-특이적 HCAb"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되고 1 초과 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "가"는 항체 분자에서 결합 부위의 지정된 수를 지칭한다.
"다가" 항체는 2개 또는 그 초과의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 용어들 "2가", "3가", 및 "4가"는 각각 2개 결합 부위, 3개 결합 부위, 및 4개 결합 부위의 존재를 지칭한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 2가이고 3가, 4가, 또는 달리는 다가일 수 있다. 본 발명의 다중-특이적 단일 사슬-단독 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체는 다가 단일 사슬-단독 항체를 포함한다.
용어 "키메라성 항원 수용체" 또는 "CAR"는 막-스패닝 및 세포내-신호전달 도메인에 원하는 결합 특이성 (예를 들어 단클론성 항체 또는 다른 리간드의 항원-결합 영역)을 이식하는 조작된 수용체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용된다. 전형적으로, 수용체는 T 세포 상에 단클론성 항체의 특이성을 이식하기 위해 사용되어 하기 문헌을 창작한다: J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; 및 Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383. 인간 VH 세포외 결합 도메인을 포함하는 대표적인 CAR-T 작제물이 도 6에 도시되어 있다.
"재조합 면역글로불린 (Ig) 유전자좌"는 내인성 Ig 유전자좌의 일부를 결하고 및/또는 대상체 포유동물 내 Ig 유전자좌에 내인성이 아닌 적어도 하나의 단편을 포함하는 Ig 유전자좌를 의미한다. 그와 같은 단편은 인간 또는 비-인간일 수 있고, 그리고 임의의 Ig 유전자 분절 또는 이들의 일부분을 포함할 수 있거나, 또는 전체 Ig 유전자좌를 구성할 수 있다. 재조합 Ig 유자좌는 바람직하게는 유전자 재배열을 당할 수 있고 형질전환 동물에서 면역글로불린의 레퍼토리를 생산할 수 있는 기능적 유전자좌이다. 재조합 Ig 유전자좌는 재조합 Ig 경쇄 유전자좌 및 재조합 Ig 중쇄 유전자좌를 포함한다. 일단 숙주의 게놈 안으로 편입되면, 인공 Ig 유전자좌는 재조합 Ig 유전자좌로 지칭될 수 있다.
"형질전환 항체"는 재조합 Ig 유전자좌에 의해 인코딩되고, 그리고 본 발명에 따른 재조합 Ig 유전자좌를 포함하는 형질전환 비-인간 포유동물에 의해 생산되거나 그렇지 않으면 이로부터 유래된 항체를 의미한다. 대상체 형질전환 포유동물로부터 유래된 형질전환 항체는 대상체 형질전환 동물로부터 수득된 단리된 세포 또는 핵산을 사용하거나, 또는 대상체 형질전환 동물로부터 수득된 단리된 세포 또는 핵산으로부터 유래된 세포 또는 핵산을 사용하여 생산된 전형질전환 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 형질전환 항체는 통합된 공여체 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 일부분에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "Ig 유전자 분절"은 비-인간 동물 및 인간의 생식계열에 존재하고, B 세포에서 함께 되어 재배열된 Ig 유전자를 형성하는 Ig 분자의 다양한 부분을 인코딩하는 DNA의 분절을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Ig 유전자 분절"은 하기를 지칭할 수 있다: V 유전자 분절, D 유전자 분절. J 유전자 분절 및 C 영역 유전자뿐만 아니라 이들의 일부분.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "인간 Ig 유전자 분절"은 인간 Ig 유전자 분절의 자연 발생 서열, 인간 Ig 유전자 분절의 자연 발생 서열의 퇴화한 형태 둘 모두뿐만 아니라 인간 Ig 유전자 분절의 자연 발생 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 실질적으로 동일한 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 합성 서열을 포함한다. "실질적으로"는 아미노산 서열 동일성의 정도가 적어도 약 85%-95%인 것을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 동일성의 정도는 90% 초과, 더 바람직하게는 95% 초과이다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이 용어 "중쇄-단독 유전자좌"는 항체 FR4 영역의 제1 아미노산 잔기가 하나 이상의 V 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 및 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함하여 양으로 하전되고, 그 각각이 CH1 도메인 기능성을 결하는 항체 불변 효과기 영역을 인코딩하는 하나 이상의 중쇄 효과기 영역 유전자 분절에 선택적으로 연결된, VH 도메인을 인코딩하는 유전자좌를 지칭한다. 바람직하게는, 중쇄-단독 유전자좌는 약 5개 내지 약 20개 V 유전자 단편, 약 2개 내지 약 40개 D 유전자 단편, 및 약 2개 내지 약 20개 J 유전자 단편을 포함하고, 여기서 V/D/J 단편은 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 용어들 "D 유전자 분절" 및 "J 유전자 분절"은 또한 수득한 분절이 본 명세서에서 기재된 바와 같은 중쇄 항체 유전자좌의 나머지 성분과 재조합되어 중쇄-단독 항체를 발생할 수 있는 한 유도체, 동족체 및 이의 단편을 그것의 범위 내에 포함한다. D 및 J 유전자 분절은 자연발생 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 이들은 당해 분야의 숙련가에게 정통하고 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구현예에서, J4 유전자 분절에서 W (TGG)에 대한 코돈은 R (CGG)에 대한 코돈에 의해 대체되어 FR4의 제1 아미노산 위치 (Kabat 넘버링에 따른 중쇄-단독 항체의 위치 101)에서 W 대신에 R을 인코딩한다. D 및 J 유전자 분절은 정의된 추가의 아미노산 잔기 또는 정의된 아미노산 치환 또는 결실을 위한 코돈을 합체하여 CDR3 다양성을 증가시킬 수 있다. 용어 "V 유전자 분절"은 FR4 영역의 제1 잔기에 양으로 하전된 아미노산 잔기를 도입하기 위해 조작된 비-인간 동물, 예컨대 비-인간 포유동물, 예를 들어 설치류로부터 유래된 자연발생 V 유전자 분절을 포괄한다. "V 유전자 분절"은 핵산이 발현될 때 본 명세서에서의 중쇄-단독 항체를 생성하도록, CH1 엑손을 배제한 D 유전자 분절, J 유전자 분절 및 중쇄 불변 영역과 재조합할 수 있어야 한다.
"인간 개체특이형"은 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 내 인간 항체 상에 존재하는 폴리펩타이드 서열 에피토프를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "인간 개체특이형"은 인간 항체의 자연발생 서열뿐만 아니라 자연발생 인간 항체에서 발견된 폴리펩타이드에 실질적으로 동일한 합성 서열 둘 모두를 포함한다. "실질적으로"는 아미노산 서열 동일성의 정도가 적어도 약 85%-95%인 것을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 동일성의 정도는 90% 초과, 더 바람직하게는 95% 초과이다.
"키메라성 항체" 또는 "키메라성 면역글로불린"은 적어도 2개의 상이한 Ig 유전자좌로부터의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 분자, 예를 들어, 인간 Ig 유전자좌에 의해 인코딩된 부분 및 랫트 Ig 유전자좌에 의해 인코딩된 부분을 포함하는 형질전환 항체를 의미한다. 키메라성 항체는 비-인간 Fc-영역 또는 인공 Fc-영역, 및 인간 개체특이형을 갖는 형질전환 항체를 포함한다. 이러한 면역글로불린은 이러한 키메라성 항체를 생산하도록 조작된 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
"결합 친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그것의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 표시될 수 있다. 본 발명의 HCAb의 Kd는 전형적으로 약 1 pm 내지 약 1 μm 사이이다 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 그보다 더 강할 수 있다. 친화성은 당해 분야에서 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면에 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 유지하는 경향이 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "Kd" 또는 "Kd 값"은 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함에 의해, 예를 들어, .약.10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., 뉴저지 주 피스카타웨이 소재)을 사용함에 의해 측정된 해리 상수를 지칭한다. 추가의 세부사항에 대해서는 하기를 참고한다: 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위이다. 일반적으로 항원은 몇 개의 또는 많은 상이한 에피토프를 가지고 많은 상이한 항체와 반응한다. 본 용어는 구체적으로 선형 에피토프 및 형태적 에피토프를 포함한다.
"폴리에피토프 특이성"은 동일 또는 상이한 표적(들) 상에 2개 또는 그 초과의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
항체는, 2개의 항체가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프를 인지할 때 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 에피토프가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체 중 어느 하나를 사용하여, 모든 수의 상이한 포맷에서 구성될 수 있는 경쟁 검정이다. 일반적으로, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되고, 그리고 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 라벨을 사용하여 측정된다.
"에피토프 맵핑"은 항체의 표적 항원 상의 항체의 결합부위, 또는 에피토프를 동정하는 공정이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 형태적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 연속적 서열에 의해 형성된다. 형태적 에피토프는 단백질 서열에서 불연속이지만, 단백질의 폴딩시에 함께 그것의 3차원 구조로 되는 아미노산으로 형성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "종양"은 악성이든 또는 양성이든 모든 신생물성 세포 성장과 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포와 조직을 지칭한다. 용어 "종양"은 고형 종양 및 혈액성 암 둘 모두를 포함한다.
용어들 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장에 의해 전형적으로 특징되는 포유동물에서의 생리적 병태를 지칭하거나 또는 기술한다. 암의 예는, 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함한다. 암의 보다 특정한 예는 유방암, 위암, 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액샘암종, 신장암, 신우암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 두경부암, 직장암, 결장직장암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피암종을 포함한 폐암, 편평상피세포암 (예를 들어 상피성 편평상피세포암), 전립선암, 복막의 암, 간세포암, 위장암을 포함한 위의 암 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 난포막종, 남성배세포종, 간종양, 비-호지킨림프종 (NHL)을 포함한 혈액성 악성종양, 다발성골수종 및 급성 혈액성 악성종양, 자궁내막 또는 자궁암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 타액샘암종, 외음부암, 갑상선암, 식도암종, 간암종, 항문암종, 음경암종, 비인두암종, 후두암종, 카포시육종, 흑색종, 피부암종, 신경집종, 희소돌기아교세포종, 신경교세포종, 횡문근육종, 골원성육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 윌름스종양, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/여포성비-호지킨림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중간등급/여포성 NHL; 중간등급확산 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 거대질환 NHL; 외투세포 림프종; AIDS-관련된 림프종; 및 발덴스트롬 거대 글로불린혈증을 포함함); 만성림프구성 백혈병 (CLL); 급성림프아구성백혈병 (ALL); 모발세포 백혈병; 만성골수아세포 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상 혈관증식, 및 메이그스 증후군을 포함한다.
II. 상세한 설명
본 발명의 HCAb는 FR4 영역의 제1 위치 (Kabat 넘버링 시스템에 따른 아미노산 위치 101)에서의 천연 아미노산 잔기가, 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 인간 또는 키메라성의 것이다. 이러한 소수성 패치는 항체 경쇄 불변 영역과의 계면에 정상적으로 매립되지만, HCAb에서 노출된 표면이 되고, 적어도 부분적으로, HCAb의 원하지 않는 응집 및 경쇄 회합에 대해 존재한다. 치환된 아미노산 잔기는 바람직하게는 하전되고, 그리고 더 바람직하게는 양으로 하전된다. 수득한 HCAb는 바람직하게는 응집의 부재에서 생리적 조건하에서 높은 항원-결합 친화도 및 용해도를 갖는다.
구체적으로 낙타과 VHH 프레임워크 및 돌연변이를 결하는 중쇄 단독 항체, 및 그것의 기능적 VH 영역이 포함된다. 이러한 중쇄 단독 항체는, 예를 들어, 다른 형질전환 포유동물, 예컨대 토끼, 기니아 피그, 랫트가 또한 사용될 수 있지만, 예를 들어 WO2006/008548에서 기재된 바와 같이 완전하게 인간 중쇄-단독 유전자좌를 포함하는 형질전환 랫트 또는 마우스에서 생산될 수 있고, 랫트 및 마우스가 바람직하다. 중쇄 단독 항체는, 또한 그것의 VHH 또는 VH 기능적 단편을 포함하여, E. 콜리 또는 효모를 포함한 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에서 인코딩하는 핵산의 발현에 의해, 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다.
중쇄 단독 항체의 도메인은 항체와 소분자 약물의 이점을 조합하고: 일가 또는 다가일 수 있고; 낮은 독성을 가지고; 제조에 대해 비용-효율적이다. 그것의 작은 크기에 기인하여, 이들 도메인은 경구 또는 국소 투여를 포함하여 투여하기가 용이하고, 위장 안정성을 비롯하여 높은 안정성으로 특징되고; 그리고 그것의 반감기는 원하는 사용 또는 적응증에 맞추어 질 수 있다. 또한, HCAb의 VH 및 VHH 도메인은 비용 효과적인 방식으로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, HCAb의 도메인은 위에서 정의된 바와 같이 나노바디이다.
일 구현예에서, HCAb 결합 도메인은 동일한 표적 항원의 다중 상이한 에피토프 또는 1 초과 표적 항원 상에 다중 상이한 에피토프에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질의 일부이다. 일 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 인간 VH 결합 도메인을 포함하는 다양한 다중-특이적 구조가 도 7에 설명되어 있다. 다중-특이적, 또는 이중특이적인 본 발명의 HCAb는, 예를 들어, 동일한 가용성 표적 상의 2개 또는 그 초과 부위, 또는 동일한 세포 표면 (수용체) 표적 상에 2개 또는 그 초과 부위, 예컨대 종양 항원, 또는 하나 이상의 가용성 표적 및 하나 이상의 세포 표면 수용체 표적에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서의 이중특이적 HCAb 구조는 하기의 결합 친화성을 가진다: 상피성 세포 유착 분자 (EpCam) × CD3; CD19 × CD3; EpCam × CD3; TNF-α x IL-17; IL-1α × IL-1β; CD30 × CD16A; 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) × HER3; IL-4 × IL-13; 안지오포이에틴 2 (Ang-2) × 혈관 내피 성장 인자 a (VEGF-A); 인자 IXa × 인자 X; 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) × HER3; IL-17A × IL-17F; HER2 × HER3; 암종배아 항원 × CD3; CD20 × CD3; CD123 × CD3; BCMA ×CD3, PSMA × PSCA × CD3, PSMA × CD3, PSCA × CD3, CD19 × CD22 × CD3, CD22 × CD3, CD38 × PD1, CD38 × PD-L1, CD38 × CD73, CD38 × CD39, PD1 × CD39 × CD73, 및 PD1 × CD73.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에서의 HCAb는 내인성 면역글로불린 유전자가 녹아웃되거나 또는 고장난, 형질전환 마우스 및 랫트, 바람직하게는 랫트를 포함한 형질전환 동물에 의해 생산된다. 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서의 HCAb는 UniRat™에서 생산된다. UniRat™은 그것의 내인성 면역글로불린 유전자를 침묵화시키고 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스유전자좌를 사용하여 완전 인간 HCAb의 다양한, 자연적으로 최적화된 레퍼토리를 발현한다. 랫트 내 내인성 면역글로불린 유전자좌는 다양한 기술을 사용하여 녹아웃되거나 침묵화될 수 있지만, UniRat™에서는 아연-핑거 (엔도)뉴클레아제 (ZNF) 기술이 사용되어 내인성 랫트 중쇄 J-유전자좌, 경쇄 Cκ 유전자좌 및 경쇄 Cλ 유전자좌를 비활성화시켰다. 난모세포 안으로 미세주입을 위한 ZNF 작제물은 IgH 및 IgL 녹아웃 (KO) 라인을 생산할 수 있다. 세부사항에 대해서는 하기 문헌을 참고한다: 예를 들어 Geurts et al., 2009, Science 325:433 Ig 중쇄 녹아웃 랫트의 특성규명은 하기 문헌에 의해 보고되었다: Menoret et al., 2010, Eur.J. Immunol. 40:2932-2941. ZNF 기술의 이점은 최대 몇 개의 kb 결실을 통한 유전자 또는 유전자좌를 침묵화시키기 위해 연결하는 비-상동성 말단이 상동성 통합을 위한 표적 부위를 제공할 수 있다는 것이다 (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67.UniRat™ HCAb는 통상적인 항체로 침범될 수 없는 에피토프를 결합한다. 그것의 높은 특이성, 친화성, 및 작은 크기는 이들을 단일- 및 다중-특이적 적용에 대해 이성적으로 한다.
본 발명의 중쇄-단독 항체에서 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서의 천연 아미노산 잔기는 그 위치에서 천연 아미노산 잔기와 관련되거나 또는 이를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 상이한 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 일 구현예에서, 치환된 아미노산 잔기는 하전된다. 또 다른 구현예에서, 치환된 아미노산 잔기는 라이신 (Lys, K), 아르기닌 (Arg, R) 또는 히스티딘 (His, H), 바람직하게는 아르기닌 (R)과 같이 양으로 하전된다. 도 5의 정렬에서 나타낸 바와 같이 동일한 CDR3 계열 내 중쇄 항체로부터의 VH 서열 모두는 위치 101에 Trp (W)을 함유하고, 따라서 바람직한 구현예에서 본 발명의 형질전환 동물로부터 유래된 중쇄-단독 항체는 위치 101에 Trp 대 Arg 돌연변이를 함유한다.
본 발명의 인간 또는 키메라성 중쇄-단독 항체는 임의의 원하는 표적 항원에 대해서 생성될 수 있고 다양한 임상적용에 대해 큰 가능성을 가진다. 치료적 적용을 위한 표적 항원은, 비제한적으로, EGFR, ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), ErbB4 (HER4), CTLA-4/CD152, RANKL, TNF-α, CD20, IL-12/IL-23, IL1-β, IL-17A, IL-17F, CD38, NGF, IGF-1, IL-12, CD20, CD30, CD39, CD73, CD40, PD-1, PDL-1, PD-L2, BCMA, BTLA, 흉선기질 림포포이에틴 (TSP), 여포자극 호르몬 수용체 (FSHR), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), CD137, OX-40, 및 IL-33을 포함한다. 치료적 징후는, 비제한적으로, 고형 종양, 혈액성 종양, 염증성 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 대사 장애, 심혈관 질환, 호흡계, 피부과, 중추신경계, 혈액성, 눈/귀, 간 질환의 치료를 포함한다.
표적 종양은, 예를 들어, 유방암, 위암, 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액샘암종, 신장암, 신우암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 두경부암, 직장암, 결장직장암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피암종을 포함한 폐암, 편평상피세포암 (예를 들어 상피성 편평상피세포암), 전립선암, 복막의 암, 간세포암, 위장암을 포함한 위의 암 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 난포막종, 남성배세포종, 간종양, 비-호지킨림프종 (NHL)을 포함한 혈액성 악성종양, 다발성 골수종(MM) 및 급성 혈액성 악성종양, 자궁내막 또는 자궁암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 타액샘암종, 외음부암, 갑상선암, 식도암종, 간암종, 항문암종, 음경암종, 비인두암종, 후두암종, 카포시육종, 흑색종, 피부암종, 신경집종, 희소돌기아교세포종, 신경교세포종, 횡문근육종, 골원성육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 윌름스종양, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/여포성비-호지킨림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중간등급/여포성 NHL; 중간등급확산 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 거대질환 NHL; 외투세포 림프종; AIDS-관련된 림프종; 및 발덴스트롬 거대 글로불린혈증을 포함함); 만성림프구성 백혈병 (CLL); 급성림프아구성백혈병 (ALL); 모발세포 백혈병; 만성골수아세포 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상 혈관증식, 및 메이그스 증후군을 포함한다.
본 발명의 추가 세부사항은, 하기 약어를 사용하는, 하기 비-제한적인 실시예에 의해 설명된다:
BAC 박테리아 인공 염색체
YAC 효모 인공 염색체
ZFN 아연-파인더 뉴클레아제
H 중쇄
C 불변 영역
V 가변 영역
D 다양성 분절
J 연결 분절
실시예
실시예 1 : 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 발현하는 유전자적으로 조작된 랫트의 생성
이전에 확인된, 특성규명되고, 그리고 부분적으로, 변형된 BAC 및 YAC는 인간 중쇄 가변 영역 유전자 및 랫트 불변 영역 유전자를 수용한다 (Osborn et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-1490; Ma et al., 2013, J. Immunol. Methods 400-401:78-86). 중쇄 항체 발현을 가능하게 하기 위해, 랫트 불변 영역 BAC는 모든 Cγs에서 Cμ의 제거 및 CH1 엑손의 결실에 의해 변형되었다. 중쇄-단독 발현은 그런 다음 내인성 중쇄 및 경쇄 (카파 및 람다) 유전자좌의 침묵화에 의해 시행되었다.
YAC 및 BAC 상에 변형된 인간 IgH 유전자좌의 구축.
'인간 - 랫트' IgH 유전자좌를 몇 개의 부분으로 구축하고 조립하였다. 이것은 인간 JHs의 랫트 C 영역 유전자 다운스트림의 변형 및 연결과, 후속적으로 인간 VH6 -D-분절 영역의 업스트림 첨가를 포함했다. 인간 VH 유전자의 별개의 클러스터를 갖는 2개의 BAC [BAC6 및 BAC3]는 그런 다음 인간 VH6 - 모든 Ds - 모든 JHs - 랫트 Cγ2a/1/2b (△CH1)를 포함하는 조립되고 변형된 영역을 인코딩하는, Georg로 명명된 BAC와 함께 주입되었다.
DNA 서열 내 정확한 위치에 변형의 도입을 위해 그리고 다수의 큰 DNA 영역을 동시에 연결하기 위해 원형 YAC (cYAC)로 S. 세레비지애 내에 중첩 단부를 갖는 서열을 조립하고 후속적으로 이러한 cYAC를 BAC 안으로 전환시키기 위한 기술들이 개발되었다. YAC의 이점은 큰 DNA 삽입물을 보유하는 그것의 수용력, 효모 숙주 내 상동성 변경의 용이성 및 특히 고도로 반복적인 영역 (예를 들어 스위치 영역, 증진제)에서 서열 안정성의 유지를 포함한다. 다른 한편으로 E. 콜리에서 번식된 BAC는 용이한 제조와 큰 수율의 이점을 제공한다. 또한, 상세한 제한 맵핑 및 서열 분석은 YAC보다 BAC로부터 더 잘 달성될 수 있다. 2개의 자가-복제 S. 세레비지애/E.콜리 셔틀 벡터인, pBelo-CEN-URA 및 pCAU가 구축되었다. 간단히, S. 세레비지애 CEN4는 pYAC-RC로부터 AvrII 단편으로 절단되었고 (Marchuk and Collins, 1988; Nucleic Acids Res.16(15):7743) SpeI-선형화된 pAP599에 결찰되었다 (Ma et al. Mol Microbiol.2007; 66(1):14-25). 수득한 플라스미드는 URA3의 CEN4 클로닝된 다운스트림을 함유한다. 이것으로부터, ApaLI-BamHI URA3 - CEN4 단편이 절단되고 ApaLI 및 BamHI 소화된 pBACBelo11 (New England Biolabs)에 결찰되어 pBelo-CEN-URA를 생성하였다. 서열 ARS209를 자율적으로 복제하는 S. 세레비지애가 합성되고 pBelo-CEN-URA 내 특유의 SexAI 부위 안으로 클로닝되어 pCAU를 생성하였다.
인간 JH4의 변형을 촉진하기 위해, 인간 JHs의 ~ 2.2 kb 업스트림으로부터 랫트 Cγ1 코딩 영역의 ~ 5.5 kb 다운스트림에 이르는 ~ 37 kb SacII-단편인 랫트 Cμ 및 Cγ1 영역을 BAC 작제물 Annabel (Osborn et al., 2013; J. Immunol. 190:1481-1490)로부터 절단하고 pBelo-CEN-URA 내 특유의 SacII 부위 [pBelo + SacII, 37 kb] 안으로 클로닝하였다. 또한, 랫트 Cγ2b 영역을 변형하기 위해, γ2b 스위치 영역의 ~ 6.9 kb 업스트림으로부터 Cγ2b 코딩 영역의 ~ 2.0 kb 다운스트림에 이르는 Annabel로부터의 ~ 19 kb SacII - SwaI 단편을 SacII 및 HpaI - 이중 소화된 pBelo-CEN-URA 안으로 클로닝하였다 [pBelo + SacII - SwaI, 19 kb].플라스미드 둘 모두는 다양한 인간 및 랫트 게놈 영역을 증폭하고 요구된 제한 단편을 확립하기 위한 템플레이트로 사용되었다.
인간 JHs의 ~ 3.1 kb 업스트림에 이르고 일부 3' 영역으로 랫트 Cμ를 포함하는 DNA 영역이 변형되고 그리고 16.7 kb SnaBI - FspI 단편으로 pCAU에 조립되었다. 변형된 영역은 JHs로부터, Cμ 코딩 영역 의 나머지와 함께 삭제되고 CH1를 결하는 랫트 Cγ2a 서열 (힌지의 인트론 즉시 업스트림으로부터 시작하여 막 엑손의 3' 말단까지)에 의해 정확하게 대체된, μCH1까지 랫트 유전자간 영역이 따르는 (W → R 아미노산 변화를 초래하는) JH4 안으로 도입되는 T → C 점 돌연변이를 제외하고는 모든 확실한 인간 JHs를 포함한다. 이 작제물은 cYAC로서 효모에서 하기 5 중첩 단편의 어셈블리에 의해 유래되고 그 다음 하기의 BAC로 전환된다: 돌연변이된 JH4로 인간 JH의 영역 업스트림을 전환시키는 프라이머 HC27 - 1 및 - 2를 사용하여 증폭된 ~ 4.3 kb 단편 (
Figure pat00003
로 표시된 후자 프라이머를 통해 도입된 점 돌연변이), 돌연변이된 JH4 (
Figure pat00004
에 의해 표시됨)로부터 μ 스위치 영역의 업스트림에 이르는 프라이머 HC27 - 3 및 - 4를 사용하여 증폭된 ~3.4 kb 단편, pBelo + SacII 37 kb로부터 절단된 μ 스위치 영역 및 측접 서열을 포괄하는 ~5.2 kb AflII - 단편, 긴 프라이머 HC27 - 5 및 - 6을 사용하여 랫트 Cμ에 측접하는 서열에 융합된 CH1을 결하는 증폭된 랫트 Cγ2a, 및 프라이머 HC27 - 7 및 - 8을 사용한 pCAU 벡터의 증폭. 이것은 pCAU + HuJ -랫트 Cγ2a(-CH1)를 초래했다. 모든 변형된 영역은 정확도를 확인하기 위해 서열분석에 의해 검사되었다.
CH1을 결하는 랫트 Cγ1 및 CH1을 결하는 Cγ2b가 PCR을 통해 개별적으로 생성되었다. CH1과 힌지 사이 인트론의 5' 말단을 3' 꼬리와 일치시킨 Cγ1 코딩 영역의 바로 업스트림에 위치한 ~1.7 kb 단편을 프라이머 HC27 - 9 및 - 10을 사용하여 증폭시켰다. Cγ1은 CH1과 힌지 사이의 인트론으로부터 프라이머 HC27 - 11 및 - 12를 사용한 코딩 영역의 3' 말단까지 ~ 3.9 kb 단편으로 증폭되었다. 후속적으로, ~ 1.7 kb 및 ~ 3.9 kb 단편은 둘 모두 겔 정제되고 그리고 프라이머 HC27 - 9 및 - 12를 사용한 중첩 PCR을 통해 연결되어 ~ 5.6 kb 단편을 생성했다. 유사하게, CH1이 없는 Cγ2b에 대해서는, Cγ2b 코딩 영역의 ~ 0.3 kb 단편 업스트림이 프라이머 HC27 - 13 및 - 14를 사용하여 증폭되었고, 그리고 ~ 5.4 kb 단편, 즉 - CH1과 힌지 사이 인트론으로부터 코딩 영역의 3' 말단까지에 이르는 것 - 은 프라이머 HC27 - 15 및 - 16을 사용하여 증폭되었고, 그리고 후속적으로, 이들 2개의 단편은 프라이머 HC27 - 13 및 - 16을 사용한 중첩 PCR을 통해 연결되어 ~ 5.7 kb 단편을 생성했다. pCAU + 랫트Cγ1, 2b(-CH1s)는 하기를 함유하도록 구축되었다:랫트 Cμ의 3' 말단이 일치하는 100 bp 상동성 영역, 이어서 Cγ1 및 Cγ2b 둘 모두는 CH1s를 제외하고 게놈 배치형태 내에서 삭제되었다. 다음 6개의 중첩 단편이 사용되어 pCAU + 랫트 Cγ1, 2b(-CH1s)를 구축하였다: 3' Cμ 상동성 영역으로부터 pBelo + SacII, 37 kb로부터 절단된 γ1 스위치 영역에 이어지는 ~ 10.2 kb SpeI - NarI 단편, 상기에 기재된 바와 같이 CH1이 없는 Cγ1을 함유하는 ~5.6 kb PCR 단편, 프라이머 HC27 - 17 및 - 18을 사용하여 Cγ1과 Cγ2b 사이의 유전자간 영역을 포함하는 증폭된 ~ 7.4 kb 단편, pBelo + SacII - SwaI 19 kb로부터 절단된 랫트 Cγ2b 스위치 영역을 망라한 ~ 11.3 kb XhoI 단편, CH1 없이 Cγ2b를 함유하는 ~ 5.7 kb PCR 단편, 및 프라이머 HC27 - 19 및 - 20을 사용한 증폭된 pCAU 벡터. pCAU + 랫트Cγ1, 2b(-CH1s) 내 랫트 게놈 영역은 단일 ~ 40 kb FspI 단편으로 절단될 수 있다.
마지막으로, 변형 모두를 갖는 인간 VH6 -Ds - JHs-랫트 C 영역을 인코딩하는 BAC (Georg)은 하기 4개의 중첩 단편을 사용하여 조립되었다: BAC10 (CTD-3216M13, Invitrogen)으로부터 절단된 인간 VH6 -Ds 영역을 포괄하는 정제된 ~ 78.2 kb FspAI - MluI 단편, 상기에 기재된 바와 같이 pCAU + HuJ -랫트 Cγ2a(-CH1)로부터 절단된 16.7 kb SnaBI - FspI 단편, pCAU + 랫트 Cγ1, 2b(-CH1s)로부터 절단된 ~ 40 kb FspI 단편, 및 Cγ2b와 Cε 사이의 유전자간 영역 이어서 Cε, Cα, 3' 증진제 영역, pBelo-CEN-URA 벡터, 및 인간 VH6의 5' 영역 업스트림을 포함하는 작제물 Annabel로부터 절단된 정제된 ~ 77.2 kb SwaI - SacII 단편.이 최종 작제물은 제한 맵핑 및 부분적인 서열분석을 통해 광범위하게 검사되었다. (인간 VH6 -Ds - JHs-랫트 C) 영역이 ~ 201 kb NotI 단편으로 절단되고 정제될 수 있다.
BAC6은 VH4-39로부터 VH3-23까지의 인간 게놈 영역을 함유하는 반면 BAC3은 VH3-11로부터 VH6-1까지의 다운스트림 영역 (가장 D 근위 VH 유전자)을 함유한다. BAC6과 BAC3 사이의 중첩을 제공하기 위해, BAC3 내 인간 VH 유전자좌의 5' 말단에 위치한 10.6 kb 단편은 이전에 기재된 바와 같이 (Osborn et al. 2013(상동)) BAC6 내 VH3-23의 다운스트림에 통합되었다. BAC6 내 인간 VH 유전자는 ~182-kb AsiSI -AscI 단편으로 절단되었다. BAC3은 비변형되고 그리고 이 BAC 내 인간 VH 유전자는 ~ 173 kb NotI - 단편으로 절단되었다.
올리고뉴클레오타이드:
HC27 - 1:GTATTACACACAAAATGGGAAAAGCTG (서열번호:1)
HC27 - 2:CC
Figure pat00005
GGTAGTCAAAGTAGTCACATTGTGGGAGGC (서열번호:2)
HC27 - 3:CCTTAATGGGGCCTCCCACAATGTGACTACTTTGACTAC
Figure pat00006
CGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG (서열번호:3)
HC27 - 4:GAATCCTAGGATTGCCTTCTTAGCCTG (서열번호:4)
HC27 - 5:CCATAGACCAAACTTACCTACTATCTAGTCCTGCCAACCTTAAGAGCAGCAACATGGAGACAGCAGAGTGTAGAGAGATCTCCTGACTGGCAGGAGGCAAGAAGATGGATTCTTACTCGTCCATTTCTCTTTTATCCCTCTCTGGTCCTAGAGAACAACCAGGGGATGAGGGGCTC (서열번호:5)
HC27 - 6:GCACAAGTGGACAAAGTCTTTGGCCAGTCTAGAAAGAAGCCCGTCTCAGAGATCAAAGCTGGAGGGCAACACAGGAAAGATGTGGGAATAAGTTTACTAGTCATACAGGCAGGAACCCCAGGCCCAGAGGTAGTGTCCCTGTGGGAGGGTCTCTTGCTCTCTGATGTCCTTCCATGCTGAGAGTTAGGGCCCTTGTCCAATCATGTTC (서열번호:6)
HC27 - 7:GAATTTTGCCCAAGTTTTTTCAGCTTTTCCCATTTTGTGTGTAATACGTACACACCGCAGGGTAATAACTG (서열번호:7)
HC27 - 8:GACGGGCTTCTTTCTAGACTGGCCAAAGACTTTGTCCACTTGTGCGCAGTTATCTATGCTGTCTCACCATAGAG (서열번호:8)
HC27 - 9:GGAGGTCTAGGCTGGAGCTGATCCAG (서열번호:9)
HC27 - 10:CCTCGTCCCCTGGTTGTTCTCTCAAGAAAAAGTATGCGTGATCATTTTGTC (서열번호:10)
HC27 - 11:AGAGAACAACCAGGGGACGAGG (서열번호:11)
HC27 - 12:GTCCACATAGTCCTCCAGAGAGAGAAG (서열번호:12)
HC27 - 13:GACCCAAGTCCAGTTCCCAACAACCAC (서열번호:13)
HC27 - 14:CCTCGTCCCCTGGTTGTCCTCTCAAGAGAGGAGGGAGTGTGAGCTTTTCC (서열번호:14)
HC27 - 15:AGAGGACAACCAGGGGACGAGGGGCTC (서열번호:16)
HC27 - 16:GCATGGGGAAGGGGCATTGTATGTAGG (서열번호:17)
HC27 - 17:CAGATCACACTGTCTGCTCACTTCAC (서열번호:18)
HC27 - 18:AAGGCAGCAGGATGGAAGCTGATGTCG (서열번호:19)
*HC27 - 19:GCTGGAGGGCAACACAGGAAAGATGTGGGAATAAGTTTACTAGTCATACAGGCAGGAACCCCAGGCCCAGAGGTAGTGTCCCTGTGGGAGGGTCTCTTGCGCACACACCGCAGGGTAATAACTG (서열번호:20)
HC27 - 20:GATTTAAATGTCAATTGGTGAGTCTTCTGGGGCTTCCTACATACAATGCCCCTTCCCCATGCGCAGTTATCTATGCTGTCTCACCATAGAG (서열번호:21)
Georg II의 구축
'인간 - 랫트' IgH 유전자좌를 몇 개의 부분으로 구축하고 조립하였다. 이것은 각각이 W → R로 인코딩하는 점 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 인간 JH1 - JH6 의 랫트 C 영역 유전자 다운스트림의 변형 및 연결과 후속적으로, 인간 VH6-1 -D-분절 영역의 업스트림 첨가를 포함하였다. 이 BAC은 Georg II로 명명된다.
먼저, 돌연변이된 인간 JH1 - JH6 이 2.3 kb ScaI 단편에 합성된다 (Thermo Fisher Scientific, 하기 참고).
두 번째로, 돌연변이된 인간 JH1 - JH6 은 인간 JHs의 ~ 3.1 kb DNA 영역 업스트림 및 JHs 의 랫트 서열 즉시 다운스트림으로부터 그의 코딩 영역이 랫트 Cγ2a 코딩 영역에 의해 대체되었지만 BAC 내 CH1을 결하는 랫트 Cμ로 일명 pCAU + HuJ(W-R)-Rat Cγ2a(-CH1)에 이르는 ~ 11.4 kb 영역과 연결된다. 이 BAC 내 전체 변형된 영역은 16.7 kb SnaBI - FspI 단편으로 절단될 수 있다. 이 BAC은 cYAC로 효모에서 하기 4개의 중첩 단편의 어셈블리에 의해 유래되고 그 다음 BAC로 전환된다: 인간 JHs의 영역 업스트림을 커버하는 프라이머 HC32 - 1 및 - 2를 사용하여 증폭된 ~ 2.7 kb 단편, 2.3 kb 돌연변이된 인간 JH1 - JH6 - ScaI 단편, JHs, 의 랫트 영역 즉시 다운스트림을 커버하는 프라이머 HC32 - 3 및 - 4를 사용하여 증폭된 ~2.1 kb 단편 및 ('HC27 구축 방법'에 기재된, CH1 및 pCAU 벡터를 결하는 랫트 Cγ2a 코딩 영역에 의해 대체된 코딩 영역을 갖는 랫트 Cμ 유전자좌를 함유하는) pCAU + HuJ - 랫트 Cγ2a(-CH1)로부터 절단된 ~ 18.4 kb MluI - HpaI 단편. 모든 변형된 영역은 서열분석에 의해 검사되어 정확도를 확인하였다.
마지막으로, 인간 VH6-1 -Ds - 돌연변이된 JHs - 변형된 랫트 C 영역을 인코딩하는 Georg II는 하기 4개의 중첩 단편을 사용하여 조립되었다: BAC10 (CTD-3216M13, Invitrogen)으로부터 절단된 인간 VH6-1 -Ds 영역을 포괄하는 정제된 ~ 78.2 kb FspAI - MluI 단편, 상기에 기재된 바와 같이 pCAU + HuJ(W-R)-Rat Cγ2a(-CH1)로부터 절단된 16.7 kb SnaBI - FspI 단편, ('HC27 구축 방법'에 기재된) pCAU + 랫트 Cγ1, 2b(-CH1s)로부터 절단된 ~ 40 kb FspI 단편, 및 Cγ2b와 Cε 사이의 유전자간 영역 이어서 Cε, Cα, the 3' 증진제 영역, pBelo-CEN-URA 벡터, 및 인간 VH6-1의 5' 영역 업스트림을 포함하는 작제물 Annabel로부터 절단된 정제된 ~ 77.2 kb SwaI - SacII 단편.이 최종 작제물은 제한 맵핑 및 부분적인 서열분석을 통해 광범위하게 검사되었다. (인간 VH6-1 -Ds - 돌연변이된 JHs- 변형된 랫트 C) 영역은 ~ 201 kb NotI 단편으로 절단되고 정제될 수 있다.
HC32 및 HC33 형질전환 랫트를 생성하기 위한 미세주입
BAC6은 VH4-39로부터 VH3-23까지의 인간 게놈 영역을 함유하는 반면 BAC3은 VH3-11로부터 VH6-1까지의 다운스트림 영역 (가장 D 근위 VH 유전자)을 함유한다. BAC6과 BAC3 사이의 중첩을 제공하기 위해, BAC3 내 인간 VH 유전자좌의 5' 말단에 위치한 10.6 kb 단편은 이전에 기재된 바와 같이 (Osborn et al. 2013, J. Immunol. 190:1481-1490) BAC6 내 VH3-23의 다운스트림에 통합되었다. BAC6 내 인간 VH 유전자는 ~182-kb AsiSI -AscI 단편으로 절단되었다. BAC3은 비변형되고 그리고 이 BAC 내 인간 VH 유전자는 ~ 173 kb NotI - 단편으로 절단되었다. 단편 둘 모두는 정제되고 랫트 배아 안으로 Georg II로부터의 ~ 201 kb NotI 단편과 함께-주사되어 HC32를 구축하였다.
BAC9는 VH3-74로부터 VH3-53까지의 인간 게놈 영역을 함유한다. BAC(14+5)는 VH3-53으로부터 VH3-13까지의 다운스트림 영역을 함유하고, VH6-1의 6.1 kb 영역 즉시 업스트림은 그것의 3'에 첨가되어 Georg II에 중첩을 제공한다. BAC9 내 인간 VH 영역은 ~185 kb NotI 단편으로 절단되었고, 그리고 BAC(14+5)로부터의 것은 ~ 209 kb BsiwI 단편으로 절단되었다. 단편 둘 모두는 정제되고 랫트 배아 안으로 Georg II로부터의 ~ 201 kb NotI 단편과 함께-주사되어 HC33을 구축하였다.
DNA 정제
단리 후 선형 YAC, 원형 YAC 및 BAC 단편을 하기로부터 ElutrapTM (Schleicher 및 Schuell)을 사용하여 전기-용출에 의해 정제하였다 (Gu et al., J. Biochem.Biophys Methods.,1992, 24:45-50): 통상적으로 주행하는 0.8% 아가로스 겔 또는 펄스-필드-겔 전기영동 (PFGE)으로부터 절단된 스트립. DNA 농도는 ~100μl의 용적에서 일반적으로 수 ng/μl였다. 최대 ~ 200 kb까지의 단편에 대해 DNA를 침전시키고 원하는 농도로 마이크로-주입 완충액 (10 mM 트리스-HCl pH 7.5, 100 mM EDTA pH 8 및 100 mM NaCl, 그러나 스페르민/스페르미딘 없음)에 재용해시켰다.
효모로부터 원형 YAC의 정제는 Nucleobond AX 실리카-계 음이온-교환 수지 (Macherey-Nagel, 독일)를 사용하여 수행되었다. 간단히, 스페로플라스트는 자이모리아제 또는 라이티카제를 사용하여 제작되었고 펠릿화되었다 (Davies et al., 1996, Human antibody repertoires in transgenic mice: manipulation of transfer of YACs.In Antibody Engineering:A Practical Approach.J. McCafferty, H.R.Hoogenboom, and D.J. Chiswell eds. IRL, Oxford, U.K., p. 59-76). 세포는 그런 다음 알칼리성 용해를 당하고, 저-복사 플라스미드에 대한 Nucleobond 방법에 기재된 바와 같이 AX100 칼럼 및 용출에 결합한다. 오염 효모 염색체 DNA는 플라스미드 - Safe™ ATP-의존적 DNase (Epicentre Biotechnologies)를 사용하여 가수분해되고 이어서 SureClean (Bioline)을 사용한 최종 세정 단계를 거친다. DH10 전기반응능 세포 (Invitrogen)의 분취액은 그런 다음 원형 YAC로 형질전환되어 BAC 콜로니를 수득하였다. BAC 벡터 DNA, ~10 kb로부터 미세주입을 위한 삽입 DNA, 150-200 kb의 분리를 위해, 세파로스 4B-CL로 여과 단계를 사용하였다 (Yang et al., 1997, Nat. Biotechnol.1997, 15;859-865).
겔 분석
정제된 YAC 및 BAC DNA는 통상적인 0.7% 아가로스 겔 상에서 제한 단리 및 분리에 의해 분석되었다 (Sambrook and Russell, 2001). 보다 큰 단편인, 50-200 kb는 16 시간 동안 2-20 초 스위치 시간, 6V/cm, 10mA에서 0.5% TBE 내 0.8% PFC 아가로스를 사용하여, 8℃에서 PFGE (Biorad Chef MapperTM)에 의해 분리되었다. 정제는 서열 분석으로부터 얻어진 예상된 크기와 수득한 단편의 직접적인 비교를 허용하였다. 변경은 PCR 및 서열분석에 의해 분석되었다.
미세주입
비근교계 SD/Hsd 균주 동물은 실험실 동물 관리 평가 및 신임 협회 (AAALAC)에 의해 인정된 동물 설비에서 승인된 동물 관리 프로토콜에 따라 표준 미세분리기 우리에 수용했다. 랫트는 음식 및 물에 접근을 선택적으로 하게 하면서 14-10시간의 명암 주기를 유지하였다. 4 내지 5 주령 SD/Hsd 암컷 랫트에 20-25 IU PMSG (Sigma-Aldrich)를 주입하고 이어서 48시간 후 비근교계 SD/Hsd 수컷에 교배 전에 20-25 IU hCG (Sigma-Aldrich)를 주입하였다. 수정된 1-세포기 배아를 후속적인 미세주입을 위해 수집하였다. 조작된 배아는 가성 임신한 SD/Hsd 암컷 랫트로 옮겨 분만되도록 하였다.
재조합 면역글로불린 유전자좌를 인코딩하는 정제된 DNA를 10 mM 스페르민 및 10 mM 스페미딘을 갖는 미세주입 완충액에 재현탁시켰다. 본 DNA는 0.5 내지 3 ng/μl의 다양한 농도로 수정된 난모세포 안으로 주입하였다.
랫트 면역글로불린 유전자에 특이적인 ZFN을 인코딩하는 플라스미드 DNA 또는 mRNA는 0.5 내지 10 ng/ul의 다양한 농도로 수정된 난모세포 안으로 주입하였다.
아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)
랫트 면역글로불린 유전자에 특이적인 ZFN을 생성하였다.
랫트 C카파에 특이적인 ZFN은 하기 결합 부위를 가졌다: ATGAGCAGCACCCTCtcgttgACCAAGGCTGACTATGAA (서열번호:22)
랫트J-유전자좌 서열에 특이적인 ZFN은 하기 결합 부위를 가졌다:
CAGGTGTGCCCATCCagctgaGTTAAGGTGGAG (서열번호:23)
및
CAGGACCAGGACACCTGCAgcagcTGGCAGGAAGCAGGT (서열번호:24)
랫트 Cγ유전자좌 서열에 특이적인 ZFN은 하기 결합 부위를 가졌다:
AACAGCCATTTGcagaccAAAGGGAAGGAAAGA (서열번호:25)
및
TTCTACCCTGGTGTTATGacagtgGTCTGGAAGGCAGATGGT (서열번호:26)
트랜스 유전자좌를 갖는 랫트.
재배열되지 않은 배치형태에 인공 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 수반하는 형질전환 랫트가 생성되었다. 형질전환 랫트의 RT-PCR 및 혈청 분석 (ELISA)은 형질전환 면역글로불린 유전자좌의 생산적인 재배열과 혈청 내 다양한 아이소타입의 중쇄 단독 항체의 발현을 밝혔다. 형질전환 랫트의 면역화는 고친화도 항원-특이적 중쇄 단독 항체의 생성을 초래했다.
신규한 아연-핑거-뉴클레아제 녹-아웃 기술.
형질전환 랫트에서 중쇄-단독 항체 생성의 추가의 최적화를 위해, 불활성화된 내인성 랫트 면역글로불린 유전자좌를 갖는 녹아웃 랫트를 생성시켰다.
랫트 중 면역글로불린 중쇄 발현 및 랫트 λ 경쇄 발현의 불활성화를 위해, ZFN을 단일 세포 랫트 배아 안으로 미세주입하였다. 후속적으로, 배아를 가성 임신한 암컷 랫트로 옮기고 분만을 수행하였다. 돌연변이된 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 갖는 동물은 PCR에 의해 확인되었다. 이러한 동물의 분석은 돌연변이체 동물에서 랫트 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 발현의 불활성화를 실증하였다.
실시예 2 : 랫트에서 항원-특이적 중쇄-단독 항체 (HCAb)의 생성
랫트에서 항원-특이적 중쇄-단독 항체의 생성을 위해, 중쇄 단독 항체를 발현하는 유전자적으로 조작된 랫트, 예컨대 실시예 1에 기재된 것들이 다양한 방식으로 면역화된다.
불활성화된 바이러스로 면역화
다양한 상이한 혈구응집소 및 뉴라미니다제 유전자를 갖는 인플루엔자 바이러스가 조지아주 애틀랜타 소재의 Immunology and Pathogenesis Branch의 인플루엔자 분과, CDC에 의해 제공되었다. 바이러스 스톡은 10-일령의 배아를 가진 계란의 요막 공동에서 번식되고 초원심 분리 수단에 의해 10%-50% 수크로스 구배를 통해 정제되었다. 바이러스는 포스페이트-완충 식염수에서 재현탁되고 그리고 2주 동안 4℃에서 0.05% 포르말린으로 처리에 의해 불활성화된다. 불활성화된 바이러스 및 알럼 용액 (Pierce)은 3:1 비로 혼합되고 면역화 1시간 전에 실온에서 인큐베이션된다. 중쇄-단독 항체를 발현하는 유전자적으로 조작된 랫트는 전체 불활성으로 면역화된다.
단백질 또는 펩타이드로 면역화
전형적으로 면역원 (인간 면역글로불린 카파 경쇄, 인간 IgM 또는 IgG 중쇄, 인간 혈청 알부민, 단백질-펩타이드 콘주게이트 같은 단백질 또는 펩타이드)은 멸균 염수로 0.05-0.15 ml로 희석되고 0.1-0.3ml의 최종 용적으로 아쥬반트와 조합된다. 많은 적절한 아쥬반트가 이용가능하지만 (즉 열 불활성화된 보데텔라 페르투스시스, 수산화알루미늄 겔, Quil A 또는 사포닌, 박테리아 리포폴리사카라이드 또는 항-CD40) 어느 것도 완전한 프로인트 아쥬반트 (CFA) 및 불완전한 프로인트 아쥬반트 (IFA)의 활성을 갖지 않는다. 가용성 면역원 예컨대 단백질 및 펩타이드의 농도는 최종 제제에서 5 μg과 5mg 사이에서 다양할 수 있다. CFA에서 면역원으로 1차 면역화 (프라이밍)는 복강내로 및/또는 피하로 및/또는 근육내로 투여된다. 만일 무손상 세포가 면역원으로 사용되면 이들은 최상으로는 복강내로 및/또는 정맥내로 주입된다. 세포는 염수에서 희석되고 1 내지 20 백만 개의 세포가 주입당 투여된다. 랫트 내에 생존한 세포는 최상의 면역화 결과를 얻을 것이다. CFA에서 면역원으로 1차 면역화 후, IFA에서 2차 면역화 (부스터)는 일반적으로 4주 후에 전달된다. 이 서열은 고친화도 항체를 생산하는 B 세포의 발달을 유발시킨다. 만일 면역원이 약하면 부스터 면역화는 강한 체액성 반응이 달성될 때까지 매2 주마다 투여된다. 면역원 농도는 부스터 면역화에서 낮을 수 있고 정맥내 경로가 사용될 수 있다. 혈청은 체액성 반응을 측정하기 위해 매 2주마다 랫트로부터 수집된다.
원핵생물의 지질 II 펜타펩타이드, 페니실린 결합 단백질, 베타-락타마제, 소르타제, 및 다른 막 단백질로의 면역화가 상기에 설명된 바와 같이 수행된다.
지질, 당지질, 및 탄수화물 폴리머로 면역화
폴리-N-아세틸-β-(1-6)-글루코사민 (PNAG) 및 다른 탄수화물 폴리머로 면역화
정제된 dPNAG, PNAG 또는 다른 탄수화물 폴리머가 환원성 아미노화에 의해 디프테리아 독소, 알부민 또는 다른 운반 단백질에 접합된다. 글루타르알데하이드로 처리에 의해 운반 단백질의 표면 상에 알데하이드 기가 먼저 도입된다. 활성화된 운반 단백질은 후속적으로 환원제 나트륨 NaCNBH3의 존재에서 그것의 유리 아미노기를 통해 dPNAG (또는 다른 탄수화물 폴리머)와 반응된다. 동물은 0일째에 PNAG 및 dPNAG-DT 콘주게이트로 피하로 또는 발바닥으로 면역화되고 그리고 완전한 프러운드 아쥬반트 또는 다른 아쥬반트에서 접합된 PNAG 또는 dPNAG의 0.15-100-μg 용량으로 후속적인 주에서 부스팅된다. 부스트 면역화는 바람직하게는 불완전한 프러운드에서 된다. 혈액은 매주 회수되고 특정 항체 역가가 ELISA에 의해 결정된다. B 세포는 표준 방법을 사용하여 생성된 배수 림프절 또는 비장 및 하이브리도마로부터 회수된다. 대안적으로, 효모 세포가 항원-결합 항체 또는 단편을 선택하기 위해 사용된다.
지질 II로 면역화
C55 또는 더 짧은 지질꼬리를 갖는 정제된 지질 II가 Titermax, 리포좀, Ribi 아쥬반트 또는 다른 아쥬반트와 혼합된다. 또한, 단백질, 예컨대 KLH 또는 난백알부민, 및 면역자극성 화합물, 예컨대 지질 A 또는 완전한 프러운드 아쥬반트가 혼합물에 첨가된다. 일차 면역화는 0일째에 발바닥에 또는 피하로 0.1-1mg의 지질 II로 수행되고, 완전한 프러운드 아쥬반트 또는 다른 아쥬반트에서 접합된 PNAG 또는 dPNAG의 0.15-100-μg 용량으로 후속적인 주에서 부스팅된다. 부스트 면역화는 바람직하게는 불완전한 프러운드에서 된다. 혈액은 매주 회수되고 특정 항체 역가가 ELISA에 의해 결정된다. B 세포는 표준 방법을 사용하여 생성된 배수 림프절 또는 비장 및 하이브리도마로부터 회수된다. 대안적으로, 효모 세포가 항원-결합 항체 또는 단편을 선택하기 위해 사용된다.
지질 A로 면역화
코어-지질 A가 Bogard et al., 1987, Infection and Immunity, 55:4, 899-908의 방법에 따라 제조된다. 아시네토박터 바우마니 ATCC 19606 또는 다른 그램-음성 박테리아가 Luria 액체배지에서 배양되고, 원심분리에 의해 수집되고, 109 CFU/mL의 세포 밀도로 냉동-건조 배지에 현탁되고, 그리고 사전-중량 앰풀 또는 유리 바이알 안에 용적의 1/3 미만을 채우도록 배치된다. 멸균 면 또는 유리 솜이 앰풀의 목안으로 삽입되거나 마개가 바이알에 삽입된다. 샘플은 초저 냉동실에서 서서히 냉동되고 그 다음 진공이 1차 건조를 위해 밤새 적용된다. 2차 건조는 몇 시간 동안 20 ℃로 온도를 증가시킴에 의해 수행된다. 동결건조된 샘플은 4 ℃에서 저장된다. 10 mg의 동결건조된 세포는 400μL의 이소부티르산 및 1M 수산화 암모늄에 현탁되고 (5:3, v/v) 100 ℃에서 2시간 동안 교반 막대가 있는 스크류-캡 시험관에서 인큐베이션된다. 샘플은 빙수에서 냉각되고 2000 x g에서 15분 동안 원심분리된다. 상청액은 새로운 튜브로 옮겨지고 동등한 부의 물로 희석되고 동결건조된다. 샘플은 400 μL의 메탄올로 2회 세정되고 2000 x g에서 15분간 원심분리되고 바닥 유기층 플러스 그것의 계면은 저장되고 질소 흐름 하에서 건조된다. .5 밀리그램의 지질 A가 그런 다음 5 mL의 0.5% (wt/vol) 트리에틸아미드에 현탁된다. (Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재) 그 후 5 mg의 산-처리된 박테리아를 첨가했다.
혼합물은 실온에서 30분 동안 느리게 교반되고 Speed Vac 원심분리기로 진공에서 건조된다.
동물을 복강내로 또는 발바닥으로 면역화시키기 위해 지질 A-코팅된 세포가 사용된다. 주입당 50 μl의 코어 LPS-코팅된 세포 현탁액의 용량을 프로인트 불완전한 아주반트 (Difco)와 1:1 혼합물로 사용하였다 (De Kievit & Lam, Journal of Bacteriology, Dec. 1994, p.7129-7139). 동물은 0, 4, 9, 14, 및 28일째에 면역화된다. 하이브리도마 세포주는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 및 상이한 공급원 (Avanti Polar Lipids, 앨라배마주 앨러배스터 소재)으로부터 정제된 LPS에 의해 항-LPS 항체의 생산에 대해 선별된다. 상청액은 또한 열-사멸 또는 생 그램-음성 박테리아 예컨대 클렙시엘라., E. 콜리, 슈도모나스 에어루기노사, 아시테노박터 바우마니이, 및살모넬라에 대해 시험된다. 광범위하게 반응성 항체가 선택되고 폴리믹신 B로의 경쟁 검정이 수행된다.
HCAb의 최소 억제성 농도 (MIC)
항미생물제에 대한 박테리아의 시험관내 감수성을 측정하기 위한 다양한 실험실 방법이 사용될 수 있다. 주어진 박테리아 분리물에 대한 항미생물제의 시험관내 활성을 정량적으로 측정하기 위해 액체배지 또는 한천 희석 방법 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 시험을 수행하기 위해, 다양한 농도의 항미생물제가 첨가된 액체배지 또는 한천 배지를 갖는 일련의 튜브 또는 플레이트가 제조된다. 본 튜브 또는 플레이트에는 그런 다음 시험 유기체의 표준화된 현탁액이 접종된다. 35 ± 2 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 시험물이 검사되고 최소 억제성 농도 (MIC)가 결정된다. 최종 결과는, 재현성 있는 결과 (실험실 내 및 실험실 간)가 달성되는지를 주의하여 제어해야 하는, 방법론에 의해 상당히 영향을 받는다. 희석 테스트를 사용하여 얻은 MIC는 감염 유기체를 억제하는 데 요구된 항미생물제의 농도를 나타낸다. 그러나, MIC는 절대적인 값을 나타내지는 않는다. "진성" MIC는 유기체의 성장을 억제하는 최저 테스트 농도 (즉, MIC 판독)와 다음의 낮은 테스트 농도 사이의 어딘가에 있다. 예를 들어, 2배 희석물이 사용되고 MIC가 16 μg/mL이면, "진성" MIC는 16과 8 μg/mL 사이일 것이다. 최상의 제어된 조건 하에서도 희석 테스트는 수행될 때마다 동일한 종점을 산출하지 못할 수 있다. 일반적으로, 테스트의 허용가능한 재현성은 하나의 실제 종점의 2배 희석 이내에 있다.
항체 또는 이의 단편 및 비교기 항생제 (반코마이신, 폴리믹신, 세팔로스포린, 또는 다른 베타-락탐)의 시험관내 활성은 표준 CLSI 방법론에 따른 액체배지 미량희석 MIC 검정에 의해 시험될 것이다 (Clinical and Laboratory Standards Institute.2003.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically.Approved standard M7-A7).
항체 또는 이의 단편의 활성은 스타필로코쿠스 아우레스 ATCC 29213, 그램-양성 및 그램-음성 박테리아에 대해 시험된다. MIC는 아래와 같이 결정된다:
1. 박테리아 접종물 조제. 새로운 플레이트 (1주령 미만)로부터 각 균주의 단일 콜로니를 5 mL의 양이온 조정된 Muller - Hinton 액체배지 (CAMHB)로 옮긴다. 37 ℃ 진탕기에서 밤새 인큐베이션한다.
2. 다음날 아침, 밤새 배양물의 1:100 희석 (5 ml 안으로 50 ul)을 수행한다. 37 ℃ 진탕기에서 2-4시간 인큐베이션한다.
3. 2-4시간 후 (흡광도 대략 0.3 - 0.5, 600 nm에서) 박테리아를 원심분리하고 (5000 rpm, 5분), PBS에 재현탁하고, 배양물을 MacFarland 0.5로 조정하고 50 ul의 조정된 배양물을 9950 ul CAMHB로 옮기고, 와동으로 혼합한다.
4. 2-4시간 후 (흡광도 대략 0.3 - 0.5, 600 nm에서) 박테리아를 원심분리하고 (5000 rpm, 5분), PBS에 재현탁하고, 배양물을 MacFarland 0.5로 조정하고 50 ul의 조정된 배양물을 9950 ul의 1.1x CAMHB (양이온 조정된 Muller - Hinton 액체배지)로 옮기고, 와동으로 혼합한다.
5. 모 플레이트 조제 [10개의 딸 플레이트에 대해 하나의 모 플레이트, 균주 당 하나의 딸 플레이트]: (박테리아가 성장하는 동안 조제한다, 단계 5):200 ul의 화합물 스톡을 깊은 웰 플레이트의 제1 웰들에 부가하고 100 ul DMSO를 모든 다른 웰들에 부가한다. 웰들 2-11에서 화합물의 2-배로 일련의 희석을 수행한다 (100 ul를 1에서 2로 옮기고, 피펫팅에 의해 4회 혼합하고, 100 ul를 2에서 3으로 옮기고, 혼합하고 등, 월 11로부터 100 ul를 버린다). 웰 12는 DMSO만 갖는 대조군이다.
900 ul의 멸균된 증류수를 각 웰에 부가하고, 피펫팅에 의해 혼합한다.
6. MIC 플레이트 조제: 모 플레이트의 각각의 웰로부터 10ul를 딸 플레이트의 상응하는 웰들로 옮긴다. 90 ul의 박테리아 접종물을 각 웰에 부가하고, 피펫팅에 의해 혼합한다.
7. 37 ℃에서 24시간 인큐베이션하고 성장에 대해 채점한다. 성장은 탁한 웰, 명백한 펠렛 또는 웰에 존재하는 박테리아의 >3 핀포인트 중 어느 하나로 간주된다. 성장을 나타내지 않는 화합물의 최저 농도가 MIC로 채점된다.
표준 액체배지 미량희석 MIC 검정을 사용한 스타필로코쿠스 아우레스에 대한 반코마이신 MIC는 0.1ug/ml 내지 10 ug/ml 사이로 다양하다. 하기에 대한 온전한 HCAb의 MIC는 다음과 같다: Staph.아우레스, 0.025ug/ml 내지 25ug/ml 사이에서 다양하다. 가변 영역 단편 또는 나노바디가 사용되는 경우, Staph. 아우레스에 대한 MIC는 0.008ug/ml 내지 8ug/ml 사이로 다양하다.
(하기의 반코마이신 MIC: Staph.아우레스:0.25-4 ug/ml, MRSA의 반코마이신 MIC:1-138 ug/ml, 반코마이신 몰 중량은 1450 달톤이고, HCAb의 몰 중량은 80,000 달톤이고, HCAb는 반코마이신보다 ~50X 더 무겁고, 지질 II에 대한 반코마이신의 친화성은 50nM이고, HCAb의 친화성은 0.5 내지 10 nM 사이일 것이다. HCAb는 0.025와 25 ug/ml 사이의 MIC를 가질 것이다).
(J. Clin.Microbiol.2006, 44(11):3883.DOI:A.Bruckner Guiqing Wang, Janet F.Hindler, Kevin W.Ward and David.Increased Vancomycin MICs for Staphylococcus aureus Clinical Isolates from a University Hospital during a 5-Year Period)
면역글로불린, 보체 및 식균 세포의 존재에서 HCAb의 MIC
옵소닌화 식세포 검정 (OPA)이 하기에 기재된 바와 같이 수행된다: U.S.특허 번호 8,410,249.OPA는 항체, 보체, 및 식균 세포의 존재에서 박테리아의 사멸을 측정한다. 인간의 보체 및 세포가 통상적으로 사용된다. HCAb 또는 단편은 0.01ug/ml 내지 10μg/ml 사이의 농도로 시험된다. 박테리아의 사멸은 모든 성분으로 인큐베이션 전후 콜로니 형성 단위를 결정함에 의해 측정된다. 옵소닌화는 또한 현미경 하에서 시각화된다. 인간 다형핵 백혈구 (PMN) 또는 분화된 HL60 전골수구성 백혈병 (HL60) 세포 중 어느 하나가 효과기 세포로 사용된다. 인간 혈청 또는 베이비 토끼 혈청 내 보체가 보체에 대한 공급원으로 사용된다. 간단히 말해서, HCAb 또는 다른 시료는 Hanks 평형 염류액을 갖는 96-웰 미세적정 플레이트에서 2배 단계로 연속으로 희석되고 그런 다음 회전식 진탕기 상에서 37 ℃에서 30분 동안 박테리아 (~2,000 CFU /웰) 및 보체로 인큐베이션된다. 비특이적 사멸 또는 과성장을 최소화하기 위해 각각의 세균 균주에 대한 최적의 진탕 속도가 결정된다. 새롭게 단리된 인간 PMN 또는 분화된 HL60 세포 (효과기 세포)가 박테리아 (표적)-보체-혈청 혼합물에 400:1 비로 첨가되고 그리고 혼합물은 37 ℃에서 45분 동안 인큐베이션된다. OPA 역가는 HCAb 또는 이의 단편을 제외한 모든 시약을 함유하는 대조군 웰들로부터의 CFU와 비교하여 CFU (사멸)의 50% 감소를 야기하는 혈청 희석이다. HCAb는 10ng/ml 내지 10μg/ml 사이에서 박테리아를 사멸한다.
세포로 면역화
세포로 면역화의 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 항-CD3e 항체의 발현을 위해, 인간 Jurkat 세포가 조직 배양에서 성장된다. 원하는 인간 항체의 발현은 단클론성 항체 OKT3으로 Jurkat 세포의 인큐베이션에 의해 분석된다. 후속적으로, 미결합된 OKT3은 세포를 수세함에 의해 제거되고 결합된 OKT3은 플루오레세인 및 유세포측정 분석으로 접합된 항-마우스 IgG로 검출된다.
랫트 T 세포 하이브리도마 세포는 기재된 바와 같이 인간 CD3을 인코딩하는 진핵 발현 플라스미드로 전기천공함에 의해 형질감염된다 (Transy et al., 1989, Eur J Immunol 19(5):947-50). 인간 CD3을 발현하는 형질감염체는 FACS에 의해 강화되고 조직 배양에서 증식된다.
중쇄 단독 (HCO) 항체를 발현하는 유전자적으로 조작된 랫트는 복강내로 30x10(6) Jurkat 세포의 주입에 의해 면역화된다. 일차 면역화 4 및 8주 후 랫트는 인간 CD3를 발현하는 랫트 T 세포로 면역화된다. 항-인간 CD3e 중쇄 단독 항체를 발현하는 동물은 단클론성 중쇄 단독 항-CD3e 항체의 단리를 위해 사용된다
DNA-기반 면역화 프로토콜
면역화시키기 위한 유전자 백신, 또는 항원-인코딩 DNA의 사용은 랫트에서 강한 항체 반응의 전개에 대한 대안적인 접근법을 나타낸다.
DNA 접종의 경로는 일반적으로 피부, 근육 그리고 항원의 형질감염 및 발현을 지지하는 임의의 다른 경로이다. 항원 예컨대 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 당단백질 또는 다른 인간 또는 바이러스 항원을 발현하도록 설계된 정제된 플라스미드 DNA가 사용된다. DNA 접종의 경로는 하기를 포함한다: 정맥내 (꼬리 정맥), 복강내; 근육내 (양 사두근), 비강내, 진피내 (예컨대 평평한 발), 및 피하 (예컨대 목의 뒷덜미). 일반적으로, 10-100 μg의 DNA가 접종부위 당 100 μl의 염수로 투여되거나 또는 DNA는 세포의 흡수 및 형질감염을 촉진하는 적절한 비히클 예컨대 금 입자 또는 특정 제형 (http://www.incellart.com/index.php?page=genetic-immunization&menu=3.3)으로 투여된다. 면역화 반응식은 상기에 기재된 프로토콜; 일차 면역화 이어서 부스터 면역화에 유사하다.
중쇄 단독 항체의 정제
항체의 정제를 위해, 혈액이 면역화된 랫트로부터 수집되고 혈청 또는 혈장은 응고된 세포 펠릿을 혈청 항체를 함유하는 액체 최상부 상으로부터 분리하는, 원심분리에 의해 수득된다. 혈장의 혈청으로부터의 항체는 표준 절차에 의해 정제된다. 이러한 절차는 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. IgG의 정제를 위해 단백질 A 또는 포틴 G가 사용될 수 있다 (Br
Figure pat00007
ggemann et al., JI, 142, 3145, 1989).
실시예 3 : 랫트로부터 B 세포를 발현하는 항체의 단리 .
비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 B 세포의 단리
단일-세포 현탁액은 면역화된 랫트의 비장 또는 림프절로부터 준비된다. 세포는 적혈구의 제거 후 또는 B 세포, 메모리 B 세포, 항원-특이적 B 세포 또는 형질 세포의 단리 후 추가의 강화 없이 사용될 수 있다. 강화는 더 나은 결과로 이어질 수 있고 그래서 적혈구의 최소 제거가 권고된다. 메모리 B 세포는 원치 않는 세포의 고갈과 후속적인 양성 선택에 의해 단리된다. 원치 않는 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 과립구, 혈소판, 및 적혈구 세포는 CD2, CD14, CD16, CD23, CD36, CD43, 및 CD235a (Glycophorin A)에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 감손된다. IgG 또는 CD19에 대해 특이적인 항체를 갖는 양성 선택은 고도로 강화된 B 세포 (50%-95% 사이)를 초래한다. 항원-특이적 B 세포는 형광 마커 및/또는 자기 비드로 태깅된 항원(들)에 세포를 노출시킴에 의해 수득된다. 후속적으로, 형광색소 및/또는 자기 비드로 태깅된 세포는 (유세포측정 또는 형광활성화된 세포 정렬기 [FACS]) FACS 정렬기 및/또는 자석을 사용하여 분리된다. 형질 세포는 표면 Ig를 적게 발현할 수 있기 때문에, 세포내 염색이 적용될 수 있다.
형광 활성화된 세포 분류에 의한 B 세포의 단리
세포를 그것의 개별 특성에 의해 분리하기 위해 FACS-기반 방법이 사용된다. 세포를 단일-세포 현탁액 내에 두는 것이 중요하다. 면역화된 랫트의 말초 혈액, 비장 또는 다른 면역기관으로부터 제조된 단일 세포 현탁액은 CD19, CD138, CD27 또는 IgG와 같은 B 세포 마커에 대해 특이적인 형광색소-태깅된 항체와 혼합된다. 대안적으로, 세포는 형광색소-태깅된 항원으로 인큐베이션된다. 세포 농도는 적절한 완충액 예컨대 PBS 내에 1-20 백만 개의 세포/ml 사이이다. 예를 들어, 메모리 B 세포는 CD27에 대해 양성이고 CD45R에 대해 음성인 세포를 선택함에 의해 단리될 수 있다. 형질 세포는 CD138에 대해 양성이고 CD45R에 대해 음성인 세포를 선택함에 의해 단리될 수 있다. 세포는 FACS 기계 상에 장입되고 게이팅된 세포는 배지를 함유하는 96 웰 플레이트 또는 튜브 안에 침착된다. 필요하면 각각의 형광색소에 대한 양성 대조군이, 배경차 공제가 보상을 계산하도록 하는, 실험에 사용된다.
골수로부터 B 세포의 단리
골수 형질 세포 (BMPC)는 기재된 바와 같이 면역화된 동물로부터 단리된다 (Reddy et al., 2010, Nature Biotechnology 28, 965-969). 근육 및 지방조직은 수확된 정강 뼈 및 대퇴골로부터 제거된다. 정강 뼈 및 대퇴골 둘 모두의 단부를 외과적 가위로 자르고 26-게이지 인슐린 주사기 (Becton Dickinson, BD)로 골수를 씻어낸다. 골수는 멸균-여과된 완충액 1번 (PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA)에 수집된다. 골수 세포는 기계적 파괴와 함께 세포 여과기 (BD)를 통해 여과로 수집되고 20 ml PBS로 세정되고 그리고 50ml 튜브 (Falcon, BD)에 수집된다. 골수 세포는 335g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리된다. 상청액은 경사 분리되고 그리고 세포 펠릿은 3 mL의 적혈구 용해 완충액 (eBioscience)에서 재현탁되고 25℃에서 5분 동안 온화하게 진탕된다. 세포 현탁액은 20 mL의 PBS로 희석되고 그리고 335g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리된다. 상청액은 경사 분리되고 세포 펠릿은 1 mL의 완충액 1번에서 재현탁된다.
골수 세포 현탁액은 바이오티닐화된 항-CD45R 및 항-CD49b 항체로 인큐베이션된다. 세포 현탁액은 그런 다음 4℃에서 20분 동안 회전된다. 이것은 이어서 930g에서 6분 동안 4℃에서 원심분리, 상청액의 제거 그리고 1.5 mL의 완충액 1번에 세포 펠릿의 재-현탁이 따른다. 스트렙타비딘 접합된 M28 자기 비드 (Invitrogen)가 세정되고 그리고 제조자의 프로토콜에 따라 재현탁된다. 자기 비드 (50 ul)는 각각의 세포 현탁액에 첨가되고 그리고 혼합물은 4℃에서 20분 동안 회전된다. 세포 현탁액은 그런 다음 Dynabead 자석 (Invitrogen) 상에 배치되고 상청액 (음성 분획, 비드에 비접합된 세포)은 수집되고 비드에 결합된 세포는 폐기된다.
예비세정된 스트렙타비딘 M280 자기 비드는 25ul의 자기 비드 혼합물당 0.75 ug 항체를 갖는 바이오티닐화된 항-CD138로 4℃에서 30분 동안 인큐베이션된다. 비드는 그런 다음 제조자의 프로토콜에 따라 세정되고 완충액 1번에 재현탁된다. 상기와 같이 수집된 음성 세포 분획 (CD45R+ 및 CD49b+ 세포 고갈)은 50 ul의 CD138-접합된 자기 비드로 인큐베이션되고 현탁액은 4℃에서 30분 동안 회전된다. CD138+ 결합된 세포를 갖는 비드는 자석에 의해 단리되고 완충액 1번으로 3회 세정되고 그리고 비드에 미결합된 음성 (CD138-) 세포는 폐기된다. 양성 CD138+ 비드-결합된 세포는 수집되고 추가 가공될 때까지 4℃에서 저장된다.
대안적으로, Ouisse et al., BMC Biotechnology, 2017, 17:3, 1-17에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
실시예 4 : 하이브리도마의 생성
단리된 B 세포는 기재된 바와 같이 골수종 세포 예컨대 X63 또는 YB2/0 세포와의 융합에 의해 불멸화된다 (K
Figure pat00008
hler and Milstein, Nature, 256, 495, 1975) . 하이브리도마 세포는 선택적 배지에서 배양되고 하이브리도마 세포를 생산하는 항체는 희석 또는 단일 세포 분류를 제한함에 의해 생성된다.
실시예 5 : 중쇄 단독 항체를 인코딩하는 cDNA의 단리
단리된 세포로부터 cDNA 서열의 생성
단리된 세포는 930g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리된다. 세포는 TRI 시약으로 용해되고 총 RNA는 Ribopure RNA 단리 키트 (Ambion)에서 제조자의 프로토콜에 따라 단리된다. mRNA는 제조자의 프로토콜에 따라 올리고 dT 수지 및 폴리(A) 순수 키트 (Ambion)로 총 RNA로부터 단리된다. mRNA 농도는 ND-1000 분광측정기 (Nanodrop)로 측정된다.
단리된 mRNA는 Maloney 쥣과 백혈병 바이러스 역 전사효소 (MMLV-RT, Ambion)로 역 전사에 의해 제1-가닥 cDNA 합성을 위해 사용된다. cDNA 합성은 Retroscript (Ambion)의 제조자의 프로토콜에 따라 50ng의 mRNA 템플레이트 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여 RT-PCR 프라이밍에 의해 수행된다. cDNA 구축 후, 중쇄 단독 항체를 증폭하기 위해 PCR 증폭이 수행된다. 프라이머의 목록은 표 1에 도시되어 있다:
표 1: 나타난 순서로 각각 서열번호 27-39를 개시
Figure pat00009
50μl PCR 반응은 0.2 mM 정방향 및 역방향 프라이머 혼합물, 5 ul의 Thermopol 완충액 (NEB), 2 ul의 미정제된 cDNA, 1 ul의 Taq DNA 중합효소 (NEB) 및 39 ul의 이중-증류된 H2O로 구성된다. PCR 열순환 프로그램은 3분 동안 92℃; 4 사이클(1분 동안 92℃, 1분 동안 50℃, 1분 동안 72℃); 4 사이클 (1분 동안 92℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 72℃), 20 사이클 (1분 동안 92℃, 1분 동안 63℃, 1분 동안 72℃); 7분 동안 72℃, 4℃ 저장이다. PCR 유전자 산물은 겔 정제되고 DNA 서열분석된다.
실시예 6 : 재조합 중쇄-단독 항체의 클로닝 및 발현
PCR 생성물은 플라스미드 벡터 안으로 아클론된다. 진핵 세포에서의 발현을 위해 중쇄 단독 항체를 인코딩하는 cDNA는 기재된 바와 같이 발현 벡터 안으로 클로닝된다 (Tiller et al., 2008; 329(1-2):112-124).
대안적으로, 중쇄 단독 항체를 인코딩하는 유전자는 기재된 바와 같이 플라스미드를 생성하는 미니서클 안으로 클로닝된다 (Kay et al., 2010; Nature Biotechnology 28.12 (2010):1287-1289).
대안적으로, 중쇄 단독 항체를 인코딩하는 유전자는 변형된 열역학적으로 균형을 이룬 역재 핵생성 PCR을 사용하여 중첩 올리고뉴클레오타이드로부터 합성되고 (Gao at al., 2003; Nucleic Acids Research.;31(22):e143) 그리고 진핵 발현 벡터 안으로 클로닝된다.
대안적으로, 중쇄-단독 항체를 인코딩하는 유전자가 합성되고 플라스미드 안으로 클로닝된다.
인공 염색체에 다양한 중쇄 단독 항체를 인코딩하는 다중 발현 카세트의 어셈블리를 위해, 다중 발현 카세트는 서로 결찰되고 그리고 후속적으로 박테리아에서 번식된 BAC 벡터 안으로 클로닝된다. 형질감염을 위해 Invitrogen으로부터의 ElectroMAXTM DH10BTM 세포가 사용된다 ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/18290015.pdf ). 대안적으로, 결찰된 발현 카세트는 효모 세포에서 번식된 효모 인공 염색체 아암으로 추가로 결찰된다 (Davies et al., 1996, 상동).
플라스미드 정제
Sigma-Aldrich로부터의 GenEluteTM 플라스미드 미니예비 키트가 밤새 박테리아 배양물 ~5ml (또는 그 초과)로부터 플라스미드 단리를 위해 사용된다 (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/plasmid-miniprep-kit.html). 이것은 원심분리와 이어서 알칼리성 용해에 의해 박테리아 세포를 수확하는 단계를 포함한다. DNA는 그런 다음 칼럼-결합되고, 세정되고 용출되고 단리 또는 서열분석을 위해 준비된다.
BAC 정제
Clontech으로부터의 NucleoBondR BAC100은 BAC 정제를 위해 설계된키트이다 (http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&product_id=186802). 이를 위해 박테리아는 200 ml 배양물로부터 수확되고 변형된 알칼리성/SDS 절차를 사용함에 의해 용해된다. 박테리아 용해물은 여과에 의해 깨끗하게 되고, 플라스미드 DNA가 음이온 교환수지에 부착하는 평형화된 칼럼 상에 장입된다. 후속적인 세척 단계 후, 정제된 플라스미드 DNA는 고-염 완충액에서 용출되고 이소프로판올로 침전된다. 플라스미드 DNA는 추가의 사용을 위해 TE 완충액에 재구성된다.
YAC 정제
단리 후의 선형 YAC, 원형 YAC 및 BAC 단편을 통상적으로 주행하는 0.8% 아가로스 겔 또는 펄스-필드-겔 전기영동 (PFGE)으로부터 절단된 스트립으로부터 ElutrapTM (Schleicher and Schuell)을 사용하여 전기-용출에 의해 정제하였다 (Gu et al., 1992, 상동). 정제된 DNA는 침전되고 원하는 농도로 완충액에 재-용해된다.
효모로부터 원형 YAC의 정제는 Nucleobond AX 실리카-계 음이온-교환수지 (Macherey-Nagel, 독일 소재)를 사용하여 수행된다. 간단히, 스페로플라스트는 자이모리아제 또는 라이티카제를 사용하여 제작되었고 펠릿화된다 (Davies et al., 1996, 상동). 세포는 그런 다음 저-복사 플라스미드에 대한 Nucleobond 방법에서 기재된 바와 같이 알칼리성 용해, AX100 칼럼에 결합 및 용출을 당한다. 오염 효모 염색체 DNA는 플라스미드 - Safe™ ATP-의존적 DNase (Epicentre Biotechnologies)를 사용하여 가수분해되고 이어서 SureClean (Bioline)을 사용한 최종 세정 단계를 거친다. DH10 전기반응능 세포 (Invitrogen)의 분취액은 그런 다음 원형 YAC로 형질전환되어 BAC 콜로니를 수득한다 (상기 참고). BAC 벡터 DNA, ~10 kb로부터 삽입 DNA, 150-200 kb의 분리를 위해, 세파로스 4B-CL로 여과 단계가 사용된다 (Yang et al., 상동).
플라스미드 또는 BAC DNA로 세포의 형질감염
*재조합 중쇄 단독 항체의 발현을 위해, 진핵 세포가 기재된 바와 같이 형질감염된다 (Andreason and Evans, 1989, Anal.Biochem.180(2):269-75; Baker and Cotten, 1997, Nucleic Acid Res., 25(10):1950-6; http://www.millipore.com/cellbiology/cb3/mammaliancell). 중쇄 단독 항체를 발현하는 세포는 다양한 선택 방법을 사용하여 단리된다. 단일 세포의 단리를 위해 희석 또는 세포 분류를 제한하는 것이 사용된다. 클론은 중쇄 단독 항체 발현에 대해 분석된다.
실시예 7: UniRat™ 및 OmniFlic™에서 J 유전자 용법
도1은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 중쇄-단독 항체를 발현하기 위해 UniRat™에서 사용된 인간 형질전환을 도시한다. OmniFlic™은 UniRat와 동일한 인간 V 유전자 클러스터를 사용하지만 고정된 κ 경쇄를 발현한다.
도 2는 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이, 위치 101에서 아르기닌을 발현하는 모든 J 유전자를 갖는 중쇄-단독 항체를 발현하기 위해 UniRat™에서 사용된 인간 형질전환을 도시한다.
UniRat™ 및 OmniFlic™의 발현된 항체 레퍼토리는 면역화된 동물로부터의 림프절 유래된 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 전체 VH 영역의 다음-생성 서열분석에 의해 결정되었다. 발현된 항체로부터의 전체 VH 서열은 인간 IGHV 및 IGHJ 생식계열 서열에 대해 정렬되었다. J 유전자 사용의 빈도는 적어도 6개의 독립적인 UniRat™ 및 OmniFlic™ 동물로부터 계산되었다. 도 3은 UniRat™이 야생형 IGHJ4 서열을 갖는 OmniFlic™보다 더 높은 빈도로 W101R 돌연변이를 함유하는 IGHJ4를 사용한다는 것을 도시한다. OmniFlic™은 또한 UniRat™보다 훨씬 높은 빈도로 IGHJ6을 사용한다.
실시예 8 : W101 돌연변이는 λ 회합을 억제한다
1058 중쇄 항체의 큰 집합체에 대한 람다 회합은 표준 ELISA에 의해 측정되었다. 1058개 총 중쇄 항체 중에서, 859개는 위치 101에 R을 함유했고, 199개는 위치 101에 W를 함유했다. 도 4는 배경 신호에 비해 10-배 또는 그 초과의 ELISA 신호로 결정될 때, R101 중쇄 항체 중 단지 2.7%만 유리 람다 단백질과 상당한 회합을 나타냈다는 것을 도시한다. 그에 반해서, W101 중쇄 항체 중 31.2%는 동일한 기준을 사용하여 유리 람다 단백질과 상당한 회합을 나타냈다. 이들 결과는 W101R 돌연변이가 람다 회합에 대해 고도로 보호성이다는 것과 W101 중쇄 항체는 R101보다 람다와 훨씬 높은 회합 가능성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 9 : 동일한 CDR3 계열에서 중쇄-단독 항체와 유리 λ 단백질 회합
도 5는 동일한 CDR3 계열에서 중쇄 항체로부터의 11개 VH 서열의 다중 서열 정렬을 도시한다. 이들 서열 모두는 위치 101에서 W를 함유한다. 정렬에서 최상부 7개 서열은 ELISA에 의해 측정된 람다 회합에 대해 모두 양성이었다. 정렬에서 바닥 4개 서열은 ELISA에 의해 또한 측정된 람다 회합에 대해 모두 음성이었다. 이 VH 서열의 계열은 람다 양성과 음성 서열 간을 구별하는 위치 a 및 b에 추가의 돌연변이를 나타낸다. 위치 a 또는 b 중 어느 하나에서 Ser 또는 Glu는 람다 회합을 제거한다. 그러나, 다른 CDR3 계열에서의 이들 위치에서 Ser 또는 Glu는 람다 결합과 동일한 회합을 갖지 않는다. 이 계열로부터의 결과는 람다 회합을 방지하는 W101 VH 서열 내 보상성 돌연변이가 있지만, 이들 보상성 돌연변이는 CDR3 계열에 특이적이다는 것을 시사한다.
실시예 10 : D-J 접합 다양성은 IGHJ6이 사용될 때 UniRat™과 OmniFlic™ 간에 상이하다.
실시예 6에서 나타낸 바와 같이, IGHJ6은 UniRat™에 비교하여 OmniFlic™에서 3배 더 자주 사용된다. 게다가, 도 3에서 나타낸 바와 같이, IGHJ6이 UniRat™에서 사용될 때, 생식계열 IGHJ6 서열에서 나타난 5 Tyr 잔기의 신장은 가장 빈번하게1 Tyr으로 단축된다. 그에 반해서, 4 Tyr 잔기의 신장은 IGHJ6이 사용될 때 OmniFlic™에서 가장 흔한 길이이다. 이것은 IGHJ6이 사용될 때 W101을 함유하는 중쇄 항체 내 생식계열 IGHJ6 서열에 존재하는 5 Tyr 잔기의 신장을 짧게 하는 선택적 압력이 있다는 것을 시사한다.
실시예 11 : 인간 VH 세포외 결합 도메인을 사용한 키메라성 항원 수용체
일차 T 세포 상에 키메라성 항원 수용체를 발현하는 것은 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 단일 키메라성 단백질을 발현하는 것을 필요로 한다. 단일 사슬 Fv 단편이 항원 결합 도메인으로 전형적으로 사용된다. scFv 키메라성 항원 수용체의 예는 도 6의 패널 A에 도시되어 있다. 대안적으로, 단일 인간 VH 결합 도메인이 세포외 결합 도메인으로 사용된다 (패널 B 또는 도 6). 단일 인간 VH를 사용하는 것은 발현되는 단백질이 더 작고 덜 복합하게 되는 것과 면역원성이 적다는 이점을 가진다.
비록 본 발명의 바람직한 구현예가 본 명세서에서 도시되고 기재되어 있지만, 이러한 구현예는 단지 예로써 제공된다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이제 수 많은 변형, 변경, 및 치환이 본 발명을 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에게 이루어질 것이다. 본 명세서에서 기재된 본 발명의 구현예들에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 정의하고, 이들 청구항의 범위 내에 있는 방법 및 구조 그리고 그것의 균등물은 그렇게 함으로써 커버되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TENEOBIO, INC. <120> TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS PRODUCING MODIFIED HEAVY CHAIN-ONLY ANTIBODIES <130> TNO-0001-WO <140> PCT/US17/47928 <141> 2017-08-22 <150> 62/379,075 <151> 2016-08-24 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 gtattacaca caaaatggga aaagctg 27 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 ccggtagtca aagtagtcac attgtgggag gc 32 <210> 3 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 ccttaatggg gcctcccaca atgtgactac tttgactacc ggggccaggg aaccctggtc 60 accg 64 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims (30)

  1. 재조합 중쇄-단독 면역글로불린 (Ig) 유전자좌를 인코딩하는 핵산으로서,
    i) 비-인간 동물의 게놈 내에서 서로 재조합될 때, 상기 핵산이 상기 비-인간 동물에서 복수의 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 단편들을 생성할 수 있고, 상기 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 단편들이 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 (FR) 영역을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 영역을 포함하는 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 인코딩하는, 하나 이상의 인간 V 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 J 유전자 분절; 및
    ii) Cμ 코딩 영역을 포함하지 않고, 각각이 CH1 엑손을 포함하지 않는 복수의 Cγ 코딩 영역을 포함하며, CH1 엑손을 포함하는 Cε 또는 Cα 코딩 영역을 더 포함하는 (C) 영역 유전자 분절을 포함하되,
    상기 인간 J 유전자 분절 중 적어도 하나는, 그 위치에서 천연 아미노산 잔기를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기를 상기 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 인코딩하는 코돈을 포함하는 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 2개 내지 40개의 D 유전자 분절, 및 2개 내지 20개의 J 유전자 분절을 포함하는 핵산.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 인간 J 유전자 분절의 1 초과는 그 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기를 상기 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 상기 제1 위치에서 인코딩하는 코돈을 포함하는 핵산.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 인간 J 유전자 분절의 모두는 그 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기를 상기 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 상기 제1 위치에서 인코딩하는 코돈을 포함하는 핵산.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 인코딩된 VH 영역에서 상기 FR4의 상기 제1 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기에 의해 치환된 핵산.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 인코딩된 VH 영역에서 상기 FR4의 상기 제1 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 치환된 핵산.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 인코딩된 VH 영역에서 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기는 라이신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H)으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 인코딩된 VH 영역에서 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기는 아르기닌 (R)인 핵산.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 인코딩된 VH 영역은 상기 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함하는 핵산.
  10. 청구항 9에 있어서, W에 대한 코돈이 R로 대체된 J4 유전자 분절을 포함하는 핵산.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역을 포함하는 인간 또는 인간화된 중쇄-단독 항체를 인코딩하는 핵산.
  12. 청구항 1의 핵산을 포함하는 형질전환 비-인간 동물.
  13. 청구항 12에 있어서, 비-인간 포유동물인, 형질전환 비-인간 동물.
  14. 청구항 13에 있어서, 설치류인, 형질전환 비-인간 동물.
  15. 청구항 14에 있어서, 랫트 또는 마우스인, 형질전환 비-인간 동물.
  16. 청구항 15에 있어서, 랫트인, 형질전환 비-인간 동물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 랫트는 인간 또는 키메라성 중쇄-단독 항체를 생성할 수 있는, 형질전환 비-인간 동물.
  18. 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자를 발현하지 않으며 이종성 중쇄-단독 Ig를 인코딩하는 핵산을 포함하며,
    상기 핵산은, 하나 이상의 V 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 J 유전자 분절, 그리고 하나 이상의 불변 효과기 영역 유전자 분절을 포함하고,
    상기 하나 이상의 V 유전자 분절, 상기 하나 이상의 D 유전자 분절, 및 상기 하나 이상의 J 유전자 분절이 서로 재조합될 때, 상기 핵산이 비-인간 동물에서 복수의 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 단편들을 생성할 수 있으며, 상기 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 단편들이 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 (FR) 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 인코딩하고,
    상기 VH 도메인의 제4 프레임워크 영역 (FR4)의 제1 위치에서 천연 아미노산 잔기는, 그 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기를 포함하는 표면-노출된 소수성 패치를 교란할 수 있는 다른 아미노산 잔기에 의하여 치환되고,
    상기 하나 이상의 불변 효과기 영역 유전자 분절 각각은 Cμ 코딩 영역을 포함하지 않는 항체 불변 효과기 영역을 인코딩하며, 각각이 CH1 엑손을 포함하지 않는 복수의 Cγ 코딩 영역을 포함하며, CH1 엑손을 포함하는 Cε 또는 Cα 코딩 영역을 더 포함하고,
    상기 V, D 및 J 유전자 분절과 상기 불변 효과기 영역 유전자 분절이 재조합하여 상기 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 인코딩하는 상기 재배열된 친화성 성숙된 중쇄-단독 유전자 단편들을 생성하도록 배열된, 형질전환 비-인간 동물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 VH 도메인에서 FR4의 상기 제1 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기는 극성 아미노산 잔기에 의해 치환된, 형질전환 비-인간 동물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 VH 도메인에서 FR4의 상기 제1 위치에서 상기 천연 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 치환된, 형질전환 비-인간 동물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 VH 도메인에서 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기는 라이신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H)으로 구성된 군으로부터 선택된, 형질전환 비-인간 동물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 VH 도메인에서 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기는 아르기닌 (R)인, 형질전환 비-인간 동물.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 VH 도메인은 상기 제4 프레임워크 (FR4) 영역 내 제1 아미노산 잔기에서 트립토판 (W) 대 아르기닌 (R) 치환을 포함하는, 형질전환 비-인간 동물.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 이종성 중쇄-단독 Ig를 인코딩하는 상기 핵산은 W에 대한 코돈이 R에 대한 코돈으로 대체된 J4 분절을 포함하는, 형질전환 비-인간 동물.
  25. 청구항 18에 있어서, 포유동물인, 형질전환 비-인간 동물.
  26. 청구항 25에 있어서, 설치류인, 형질전환 비-인간 동물.
  27. 청구항 26에 있어서, 랫트 또는 마우스인, 형질전환 비-인간 동물.
  28. 청구항 27에 있어서, 랫트인, 형질전환 비-인간 동물.
  29. 청구항 12 내지 28 중 어느 한 항의 형질전환 비-인간 동물에 의해 생성되는 중쇄-단독 항체 (HCAb).
  30. 청구항 1 내지 10의 어느 한 항의 재조합 중쇄-단독 유전자좌를 포함하는 중쇄-단독 항체 (HCAb)로서, 상기 중쇄-단독 항체 (HCAb)는 청구항 12 내지 청구항 28 중 어느 한 항의 형질질전환 동물에 의해 생성되는, 중쇄-단독 항체 (HCAb).
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