JP7229153B2 - 改変された重鎖のみの抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents
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Description
本出願には、ASCII形式にて電子的に提出され、かつ全体が援用により本明細書に組み込まれる配列表が含まれている。2017年8月11日に作成された上記のASCIIコピーは、TNO-0001-WO_SL.txtという名前であり、26,401バイトのサイズである。
本発明は、改変された重鎖のみの抗体(HCAb)を産生するトランスジェニック非ヒト動物に関する。特に、本発明は、凝集する傾向が少ない改変されたヒトまたはキメラHCAbを産生するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックラットまたはマウス、そのように調製された抗体、及びそれを作製及び使用する方法に関する。
基本的な4本鎖抗体単位は、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。IgGの場合、4本鎖単位は、一般的に約150,000ダルトンである。各々のL鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によってH鎖に連結され、一方で2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに応じて1つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各々のH鎖及びL鎖はまた、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々のH鎖は、N末端に可変ドメイン(VH)を有し、α及びγ鎖の各々について3つの定常ドメイン(CH)が、ならびにμ及びεアイソタイプについて4つのCHドメインが後に続く。各々のL鎖は、N末端に可変ドメイン(VL)を有し、その他端の定常ドメイン(CL)が後に続く。VLは、VHと並列し、CLは、重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と並列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。VHとVLの対形成は、共に単一の抗原結合部位を形成する。IgM抗体は、J鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドを伴って5つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、したがって、10の抗原結合部位を含むが、一方で分泌されたIgA抗体は、重合してJ鎖と共に2~5個の基本的な4本鎖単位からなる多価集合体を形成することができる。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT,1994の71頁及び6章を参照できる。そのような抗体において、VHとVLのドメインの相互作用は、抗原結合領域を形成するが、結合は、CH1ドメイン及びCLドメインの一部によって促進される。
λ(ラムダ)軽(L)鎖座位及び/またはλ及びカッパ(カッパ)L鎖座位が機能的に沈黙していたマウス及びそのようなマウスから産生される抗体は、米国特許第7,541,513号及び米国特許第8,367,888号に記載される。マウス及びラットにおける重鎖のみの抗体の組換え産生は、例えば、WO2006008548;米国特許出願公開第20100122358号;Nguyen et al.,2003,Immunology;109(1),93-101;Brueggemann et al., Crit. Rev. Immunol.;2006,26(5):377-90;及びZou et al.,2007,J Exp Med;204(13):3271-3283において報告されてきている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションを介したノックアウトラットの産生は、Geurts et al.,2009,Science,325(5939):433に記載されている。免疫グロブリン重鎖ノックアウトラットの分析は、Menoret et al.,2010,European Journal of Immunology,40:2932-2941に報告されている。可溶性の重鎖のみの抗体、及びそのような抗体を産生する異種の重鎖座位を含むトランスジェニックげっ歯動物は、米国特許第8,883,150号に記載されている。結合(標的化)ドメインとして単一ドメイン抗体を含むCAR-T構造は、例えば、Iri-Sofla et al.,2011,Experimental Cell Research 317:2630-2641、及びJamnani et al.,2014,Biochim Biophys Acta,1840:378-386に記載されている。
近年の進歩にもかかわらず、凝集の傾向が少なく、それらの意図された標的に対して高い親和性を保持する重鎖のみの抗体の産生のための改善された方法への必要性が存在する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む重鎖可変(VH)ドメインを含み、抗体の軽鎖の不在下で標的抗原への結合親和性を有する、単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体(HCAb)であって、前記VHドメインにおいて、前記HCAbの第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記重鎖のみの抗体。
(項目2)
ヒト抗体である、項目1に記載の重鎖のみの抗体。
(項目3)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目1に記載の重鎖のみの抗体。
(項目4)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目1に記載の重鎖のみの抗体。
(項目5)
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、項目4に記載の重鎖のみの抗体。
(項目6)
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、項目5に記載の重鎖のみの抗体。
(項目7)
前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、項目6に記載の重鎖のみの抗体。
(項目8)
1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目1~7のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体。
(項目9)
前記FR4の第1のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、項目1~8のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体。
(項目10)
その標的抗原に対して約1pM~約1μMの結合親和性を有する、項目1~9のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体。
(項目11)
抗体の軽鎖の不在下で標的抗原に対する結合親和性を有し、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む重鎖可変(VH)ドメインを含む単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体(HCAb)であって、前記HCAbが、天然のヒトVHアミノ酸配列の第4のFR領域(FR4)における第1位のアミノ酸においてトリプトファン(T)からアルギニン(R)への置換を含む、前記重鎖のみの抗体。
(項目12)
重鎖定常(CH)ドメインをさらに含み、CH1領域を欠く、項目11に記載の重鎖のみの抗体。
(項目13)
IgG1抗体である、項目12に記載の重鎖のみの抗体。
(項目14)
1つ以上のFR領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目11~13のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体。
(項目15)
前記FR4の第1のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、項目11~14のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体。
(項目16)
項目1~15のいずれか1項に記載の重鎖のみの抗体を含む、キメラ抗原受容体(CAR)。
(項目17)
単一のヒトVHドメインを含む、項目16に記載のキメラ抗原受容体。
(項目18)
相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含み、標的抗原に対する結合親和性を有し、第4のフレームワーク(FR4)領域における第1のアミノ酸残基の天然のアミノ酸残基の、その位置における天然アミノ酸を含むかまたはそれに関連した表面露出疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基の置換を含む、前記単離された自律ヒト抗体重鎖可変(VH)ドメイン。
(項目19)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目18に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目20)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目18に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目21)
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、項目20に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目22)
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、項目21に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目23)
前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、項目22に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目24)
1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目18~23のいずれか1項に記載の単離された自律ヒトVHドメイン。
(項目25)
相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む少なくとも1つの重鎖可変(VH)ドメインを含む、複数の抗原結合ドメインを含み、標的抗原への結合親和性を有する、多価結合タンパク質であって、前記VHドメインにおいて、前記多価結合タンパク質の第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記多価結合タンパク質。
(項目26)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目25に記載の多価結合タンパク質。
(項目27)
前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目26に記載の多価結合タンパク質。
(項目28)
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、項目27に記載の多価結合タンパク質。
(項目29)
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、項目28に記載の多価結合タンパク質。
(項目30)
前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、項目29に記載の多価結合タンパク質。
(項目31)
1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目25~30のいずれか1項に記載の多価結合タンパク質。
(項目32)
非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む重鎖可変(VH)領域をコードする、1つ以上のヒトV遺伝子セグメント、1つ以上のヒトD遺伝子セグメント、及び1つ以上のヒトJ遺伝子セグメントを含む組換え重鎖のみの免疫グロブリン(Ig)座位であって、前記ヒトJセグメントの少なくとも1つが、第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位に、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、前記組換え重鎖のみの免疫グロブリン(Ig)座位。
(項目33)
CH1機能性を欠く免疫グロブリン定常エフェクター領域をコードする定常(C)領域遺伝子セグメントをさらに含む、項目32に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目34)
2~40のD遺伝子セグメント、及び2~20のJ遺伝子セグメントを含む、項目32または33に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目35)
1より多い前記ヒトJセグメントが、前記第4のフレームワーク領域(FR4)の前記第1位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、項目34に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目36)
全ての前記ヒトJセグメントが、前記第4のフレームワーク領域(FR4)の前記第1位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、項目35に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目37)
前記コードされた重鎖VH領域において、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目36に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目38)
前記コードされた重鎖VH領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、項目37に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目39)
前記コードされた重鎖VH領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、項目38に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目40)
前記コードされた重鎖VH領域が、前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、項目39に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目41)
WのコドンがRによって置き換えられているJ4遺伝子セグメントを含む、項目40に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目42)
前記コードされた重鎖VH領域が、1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目32~41のいずれか1項に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目43)
前記VH領域を含むヒトまたはヒト化重鎖のみの抗体をコードする、項目32~42のいずれか1項に記載の組換え重鎖のみのIg座位。
(項目44)
項目32~42のいずれか1項に記載の組換え重鎖のみのIg座位を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
(項目45)
非ヒト哺乳動物である、項目44に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目46)
げっ歯動物である、項目45に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目47)
ラットまたはマウスである、項目46に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目48)
ラットである、項目47に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目49)
UniRat(商標)である、項目48に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目50)
いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含むVHドメインをコードする、1つ以上のV遺伝子セグメント、1つ以上のD遺伝子セグメント、及び1つ以上のJ遺伝子セグメント、ならびにその各々がCH1機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする1つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのIg座位を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記VHドメインの第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位の天然のアミノ酸残基が、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、前記遺伝子セグメントが、V、D、及びJ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体(HCAb)をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される、前記トランスジェニック非ヒト動物。
(項目51)
前記VHドメインにおいて、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目50に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目52)
前記VHドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、項目51に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目53)
前記VHドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、項目52に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目54)
前記VHドメインが、前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、項目53に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目55)
前記異種の重鎖のみの座位が、WのコドンがRのコドンと置き換えられているJ4セグメントを含む、項目54に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目56)
前記コードされた重鎖のみの抗体が、1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、項目50~55のいずれか1項に記載の異種の重鎖のみの座位。
(項目57)
哺乳動物である、項目50~56のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目58)
げっ歯動物である、項目57に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目59)
ラットまたはマウスである、項目58に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目60)
ラットである、項目59に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
(項目61)
UniRat(商標)である、項目60に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
本明細書において使用されるとき、本明細書において定義されるような「トランスジェニック非ヒト動物」は、第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位のアミノ酸残基が、そのような残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別の残基と置き換えられているヒトまたはヒト化の重鎖のみの抗体を産生することのできる非ヒト動物である。一実施形態において、天然のアミノ酸残基は、正に荷電したアミノ酸残基のような荷電したアミノ酸残基によって置き換えられている。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、非限定的に、ラット、マウス、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどを含む。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、げっ歯動物、好ましくはラットまたはマウス、最も好ましくは、UniRat(商標)である。トランスジェニック動物の選択は、本明細書において記載されるFR4変異を有するヒトまたはキメラの重鎖のみのヒトまたはキメラの抗体を産生する能力によってのみ制限される。
本発明のHCAbは、FR4領域の第1位(Kabatナンバリングシステムに従ったアミノ酸位置101)の天然のアミノ酸残基を、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別のアミノ酸残基によって置換したヒトまたはキメラである。そのような疎水性パッチは、通常は、抗体の軽鎖定常領域との界面に埋もれているが、HCAbにおいては表面露出するようになり、少なくとも部分的には、望まれない凝集及びHCAbの軽鎖結合に向かう。置換されたアミノ酸残基は、好ましくは荷電し、より好ましくは正に荷電している。生じるHCAbは、好ましくは高い抗原結合親和性、及び凝集が不在の生理的条件下の高い溶解度を有する。
BAC バクテリア人工染色体
YAC 酵母人工染色体
ZFN ジンクフィンガーヌクレアーゼ
H 重鎖
C 定常領域
V 可変領域
D 多様性セグメント
J 結合セグメント
予め同定され、分析され、部分的に改変されたBAC及びYACは、ヒト重鎖可変領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子を提供する(Osborn et al.,2013,J. Immunol.190:1481-1490;Ma et al.,2013,J. Immunol. Methods 400-401:78-86)。重鎖抗体の発現を可能にするために、ラットの定常領域BACは、Cμの除去、及び全てのCγにおけるCH1エクソンの欠失によって改変された。重鎖のみの発現は、内在性の重鎖及び軽鎖(カッパ及びラムダ)座位の沈黙によって強化した。
「ヒト-ラット」IgH座位が構築され、いくつかの部分で組み立てられた。これは、ヒトJH下流でのラットC領域遺伝子の改変及び結合、そしてその後の、ヒトVH6-Dセグメント領域の上流での付加を含んだ。次いで、ヒトVH遺伝子の別個のクラスターを有する2つのBAC[BAC6及びBAC3]は、ヒトVH6-全てのD-全てのJH-ラットCγ2a/1/2b(ΔCH1)を含む、組み立てられ、改変された領域をコードするGeorgと呼ばれるBACと共に共注入された。
で示された後者のプライマーを介して導入された点変異)までを覆う約4.3kbのフラグメント、プライマーHC27-3及び-4を用いて増幅された、変異したJH4(
で示される)からμスイッチ領域の上流までを覆う約3.4kbのフラグメント、pBelo+SacII37kbから切り出された、μスイッチ領域と隣接配列を包含する約5.2kbのAflIIフラグメント、長いプライマーHC27-5及び-6を用いて増幅された、ラットCμに隣接する配列に融合されたCH1を欠くラットCγ2a、ならびに、プライマーHC27-7及び-8を用いたpCAUベクターの増幅。これは、pCAU+HuJ-ラットCγ2a(-CH1)を生じた。全ての改変領域は、正確さを確認するために、シーケンシングによって調べた。
HC27-1:GTATTACACACAAAATGGGAAAAGCTG(配列番号1)
HC27-2:
(配列番号2)
HC27-3:
(配列番号3)
HC27-4:GAATCCTAGGATTGCCTTCTTAGCCTG(配列番号4)
HC27-5:CCATAGACCAAACTTACCTACTATCTAGTCCTGCCAACCTTAAGAGCAGCAACATGGAGACAGCAGAGTGTAGAGAGATCTCCTGACTGGCAGGAGGCAAGAAGATGGATTCTTACTCGTCCATTTCTCTTTTATCCCTCTCTGGTCCTAGAGAACAACCAGGGGATGAGGGGCTC(配列番号5)
HC27-6:GCACAAGTGGACAAAGTCTTTGGCCAGTCTAGAAAGAAGCCCGTCTCAGAGATCAAAGCTGGAGGGCAACACAGGAAAGATGTGGGAATAAGTTTACTAGTCATACAGGCAGGAACCCCAGGCCCAGAGGTAGTGTCCCTGTGGGAGGGTCTCTTGCTCTCTGATGTCCTTCCATGCTGAGAGTTAGGGCCCTTGTCCAATCATGTTC(配列番号6)
HC27-7:GAATTTTGCCCAAGTTTTTTCAGCTTTTCCCATTTTGTGTGTAATACGTACACACCGCAGGGTAATAACTG(配列番号7)
HC27-8:GACGGGCTTCTTTCTAGACTGGCCAAAGACTTTGTCCACTTGTGCGCAGTTATCTATGCTGTCTCACCATAGAG(配列番号8)
HC27-9:GGAGGTCTAGGCTGGAGCTGATCCAG(配列番号9)
HC27-10:CCTCGTCCCCTGGTTGTTCTCTCAAGAAAAAGTATGCGTGATCATTTTGTC(配列番号10)
HC27-11:AGAGAACAACCAGGGGACGAGG(配列番号11)
HC27-12:GTCCACATAGTCCTCCAGAGAGAGAAG(配列番号12)
HC27-13:GACCCAAGTCCAGTTCCCAACAACCAC(配列番号13)
HC27-14:CCTCGTCCCCTGGTTGTCCTCTCAAGAGAGGAGGGAGTGTGAGCTTTTCC(配列番号14)
HC27-15:AGAGGACAACCAGGGGACGAGGGGCTC(配列番号16)
HC27-16:GCATGGGGAAGGGGCATTGTATGTAGG(配列番号17)
HC27-17:CAGATCACACTGTCTGCTCACTTCAC(配列番号18)
HC27-18:AAGGCAGCAGGATGGAAGCTGATGTCG(配列番号19)
HC27-19:GCTGGAGGGCAACACAGGAAAGATGTGGGAATAAGTTTACTAGTCATACAGGCAGGAACCCCAGGCCCAGAGGTAGTGTCCCTGTGGGAGGGTCTCTTGCGCACACACCGCAGGGTAATAACTG(配列番号20)
HC27-20:GATTTAAATGTCAATTGGTGAGTCTTCTGGGGCTTCCTACATACAATGCCCCTTCCCCATGCGCAGTTATCTATGCTGTCTCACCATAGAG(配列番号21)
「ヒト-ラット」IgH座位が構築され、いくつかの部分で組み立てられた。これは、各々がW→Rをコードする点変異を含む変異したヒトJH1-JH6の下流でのラットC領域遺伝子の改変及び結合、そしてその後の、ヒトVH6-1-Dセグメント領域の上流での付加を含んだ。このBACはGeorg IIと名付けられた。
BAC6は、VH4-39からVH3-23までのヒトゲノム領域を含み、一方でBAC3は、VH3-11からVH6-1(最もDに近接したVH遺伝子)までの下流領域を含む。BAC6とBAC3の間の重なりを提供するために、以前に記載されたように(Osborn et al.2013,J. Immunol.190:1481-1490)、BAC3中のヒトVH座位の5’末端に位置する10.6kbのフラグメントが、BAC6中のVH3-23の下流に組み込まれた。BAC6中のヒトVH遺伝子は、約182-kbのAsiSI-AscIフラグメントとして切り出された。BAC3は改変されず、BAC中のヒトVH遺伝子は約173kbのNotIフラグメントとして切り出された。両方のフラグメントは精製され、Georg IIからの約201kbのNotIフラグメントと共にラット胚へと共注入され、HC32を構築した。
直線状のYAC、環状のYAC及び消化後のBACフラグメントは、標準的に泳動した0.8%アガロースゲルまたはパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)から切り出されたストリップから、Elutrap(商標)(Schleicher and Schuell)を用いる電気抽出によって精製された(Gu et al.,J. Biochem. Biophys Methods.,1992,24:45-50)。DNA濃度は通常、約100μlの容量中で数ng/μlであった。約200kbまでのフラグメントについて、DNAは沈殿され、マイクロインジェクション緩衝液(10mMのTris-HCl、pH7.5、100mMのEDTA、pH8及び100mMのNaClであるが、スペルミン/スペルミジンを含まない)中に所望の濃度で再溶解された。
精製したYAC及びBACのDNAは、制限消化、及び標準的な0.7%アガロースゲル上での分離によって解析された(Sambrook and Russell,2001)。より大きなフラグメント、50~200kbは、PFGE(Biorad Chef Mapper(商標))によって、8℃で、0.5%のTBE中0.8%のPFCアガロースを用いて、2~20秒のスイッチ時間で16時間、6V/cm、10mAで分離された。精製は、配列解析より得られる予測されたサイズを有する生じるフラグメントの直接的な比較を可能にした。改変はPCR及びシーケンシングによって解析した。
非近交系SD/Hsd系統動物は、実験動物ケア評価認証協会(AAALAC)によって認可された動物施設において承認された動物ケアプロトコールの下で標準的なマイクロアイソレーターケージに収容された。ラットは14~10時間の明/暗周期で飼料及び水を自由に摂取させながら維持した。4~5週齢のSD/Hsdメスラットに20~25IUのPMSG(Sigma-Aldrich)を注射し、続いて48時間後に20~25IUのhCG(Sigma-Aldrich)を注射し、近交系SD/Hsdオスと交配させた。その後のマイクロインジェクションのために受精した1細胞期胚を採取した。操作された胚を偽妊娠SD/Hsdメスラットに移し、分娩に至らせた。
ラット免疫グロブリン遺伝子に対して特異的なZFNが生成された。
ラットCカッパに特異的なZFNは以下の結合部位を有した:ATGAGCAGCACCCTCtcgttgACCAAGGCTGACTATGAA(配列番号22)
ラットJ-座位配列に特異的なZFNは以下の結合部位を有した:
CAGGTGTGCCCATCCagctgaGTTAAGGTGGAG(配列番号23)
及び
CAGGACCAGGACACCTGCAgcagcTGGCAGGAAGCAGGT(配列番号24)
ラットCγ-座位配列に特異的なZFNは以下の結合部位を有した:
AACAGCCATTTGcagaccAAAGGGAAGGAAAGA(配列番号25)
及び
TTCTACCCTGGTGTTATGacagtgGTCTGGAAGGCAGATGGT(配列番号26)
未再構成の構成にある人工重鎖免疫グロブリン座位を担持するトランスジェニックラットを作製した。トランスジェニックラットのRT-PCR及び血清解析(ELISA)は、トランスジェニック免疫グロブリン座位の生産的な再構成及び血清中の様々なアイソタイプの重鎖のみの抗体の発現を明らかにした。トランスジェニックラットの免疫は、高親和性抗原特異的重鎖のみの抗体の産生をもたらした。
トランスジェニックラットにおける重鎖のみの抗体産生のさらなる最適化のために、不活性化した内在性ラット免疫グロブリン座位を有するノックアウトラットを作製した。
ラットにおける抗原特異的重鎖のみの抗体の生成のために、実施例1に記載されたもののような重鎖のみの抗体を発現する遺伝子改変ラットが様々な方法で免疫される。
様々な異なる赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ遺伝子を有するインフルエンザウイルスは、Immunology and Pathogenesis Branch, Influenza Division, CDC, Atlanta, GAにより提供される。ウイルスストックを10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内で増殖させ、超遠心分離により10%~50%スクロース勾配により精製する。ウイルスをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、4℃で2週間、0.05%ホルマリンで処理することにより不活性化する。不活性化ウイルスとアラム溶液(Pierce)を3:1の比率で混合し、免疫の前に室温で1時間インキュベートする。重鎖のみの抗体を発現する遺伝子改変ラットは全ての不活性物で免疫される。
典型的には免疫原(ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖、ヒトIgMまたはIgG重鎖、ヒト血清アルブミン、タンパク質-ペプチドコンジュゲートのようなタンパク質またはペプチド)を滅菌生理食塩水で0.05~0.15mlに希釈し、アジュバントと組み合わせて0.1~0.3mlの最終容量とする。多くの適切なアジュバントが利用可能である(すなわち、熱不活性化Bordetella pertussis、水酸化アルミニウムゲル、Quil Aまたはサポニン、細菌リポ多糖または抗CD40)が、いずれも完全フロインドアジュバント(CFA)及び不完全フロインドアジュバント(IFA)の活性を有さない。タンパク質及びペプチドなどの可溶性免疫原の濃度は、最終調製物中で5μg~5mgの間で変動し得る。CFA中の免疫原による初回免疫(プライミング)は、腹腔内及び/または皮下及び/または筋肉内に投与される。無傷の細胞が免疫原として使用される場合、それらは最良では、腹腔内及び/または静脈内に注射される。細胞を生理食塩水で希釈し、1回の注入につき100万~2000万個の細胞を投与する。ラット中で生き延びる細胞は、最良の免疫結果をもたらす。CFA中の免疫原による初回免疫の後、IFA(追加免疫)中の2回目の免疫が通常4週間後に送達される。この一連のものは、高親和性抗体を産生するB細胞の発生をもたらす。免疫原が弱い場合、強い体液性応答が達成されるまで追加免疫を2週間ごとに投与する。免疫原濃度は、追加免疫においてより低くなり得、そして静脈内経路が使用され得る。体液性応答を測定するために、2週間毎にラットから血清を採取する。
ポリ-N-アセチル-β-(1-6)-グルコサミン(PNAG)及び他の炭水化物ポリマーによる免疫
精製されたdPNAG、PNAG、または他の炭水化物ポリマーは、還元的アミノ化によってジフテリア毒素、アルブミンまたは他の担体タンパク質にコンジュゲートされる。アルデヒド基は最初にグルタルアルデヒドで処理することにより担体タンパク質の表面に導入される。続いて、活性化担体タンパク質を、還元剤ナトリウムNaCNBH3の存在下でその遊離アミノ基を介してdPNAG(または他の炭水化物ポリマー)と反応させる。動物を0日目に皮下または足蹠でPNAG及びdPNAG-DTコンジュゲートで免疫し、その後の週に完全フロインドアジュバントまたは他のアジュバント中の0.15~100μgの用量のコンジュゲートされたPNAGまたはdPNAGで追加免疫する。ブースト免疫は、好ましくは不完全フロインド中である。血液を毎週採取し、特異的抗体価をELISAにより決定する。B細胞は排出リンパ節または脾臓から回収され、そして標準的な方法を用いてハイブリドーマを生成する。代替的に、酵母細胞を用いて抗原結合抗体またはフラグメントを選択する。
C55以下の脂質尾部を有する精製脂質IIをTitermax、リポソーム、Ribiアジュバントまたは他のアジュバントと混合する。さらに、KLHまたはオボアルブミンなどのタンパク質、及び脂質Aまたは完全フロインドアジュバントなどの免疫刺激化合物を混合物に添加する。初回免疫は、0日目に足蹠または皮下で0.1~1mgの脂質IIで実施し、その後の週に完全フロインドアジュバントまたは他のアジュバント中の0.15~100μgの用量のコンジュゲートされたPNAGまたはdPNAGで追加免疫する。追加免疫は、好ましくは不完全フロインド中である。血液を毎週採取し、特異的抗体価をELISAにより決定する。B細胞は排出リンパ節または脾臓から回収され、そして標準的な方法を用いてハイブリドーマを生成する。代替的に、酵母細胞を用いて抗原結合抗体またはフラグメントを選択する。
コア-脂質Aは、Bogard et al.,1987,Infection and Immunity,55:4,899-908の方法に従って調製する。Acinetobacter baumannii ATCC19606または他のグラム陰性細菌がLuriaブロス中で培養され、遠心分離により回収され、凍結乾燥培地に109CFU/mLの細胞密度になるように懸濁し、予め秤量したアンプルまたはガラスバイアルに入れて1/3を超えない容量で充填する。滅菌の綿またはグラスウールをアンプルの首に挿入するか、栓をバイアルに挿入する。試料を超低温冷凍庫でゆっくり凍結させ、次いで一次乾燥のために一晩真空を適用した。二次乾燥は、数時間温度を20℃まで上げることによって実施した。凍結乾燥サンプルを4℃で保存する。10mgの凍結乾燥細胞を400μLのイソ酪酸及び1Mの水酸化アンモニウム(5:3、v/v)に懸濁し、スターラーバーを含むスクリューキャップ試験管において100℃で2時間インキュベートする。試料を氷水中で冷却し、そして2000×gで15分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、等量の水で希釈し、凍結乾燥した。試料を400μLのメタノールで2回洗浄し、2000×gで15分間遠心分離し、底部有機層とそれらの界面を保存し、窒素流下で乾燥させる。次いで、5ミリグラムの脂質Aを5mlの0.5%(wt/vol)トリエチルアミド(Sigma, St. Louis, Mo.)中に懸濁し、その後、5mgの酸処理細菌を添加する。混合物を室温でゆっくり30分間撹拌し、Speed Vac遠心分離機を用いて真空乾燥した。
抗菌剤に対する細菌のインビトロ感受性を測定するために様々な実験室的方法を使用することができる。所与の細菌分離株に対する抗菌剤のインビトロ活性を定量的に測定するために、ブロス希釈法または寒天希釈法のいずれを使用してもよい。試験を実施するために、一連のチューブまたはプレートを、様々な濃度の抗菌剤を添加したブロスまたは寒天培地を用いて調製する。次いで、試験生物の標準化された懸濁液をチューブまたはプレートに接種する。35±2℃での一晩のインキュベーションの後、試験を実施して最低阻止濃度(MIC)を決定する。最終的な結果は方法論に大幅に影響され、再現性のある結果(実験室内及び実験室間)を達成するべき場合には、それを慎重に管理する必要がある。希釈試験を用いて得られたMICは、感染生物を阻害するのに必要とされる抗菌剤の濃度を示す。しかしながら、MICは絶対値を表さない。「真の」MICは、生物の増殖を阻害する最低試験濃度(すなわち、MIC測定値)と次に低い試験濃度との間のいずこかにある。例えば、2倍希釈が使用され、MICが16μg/mLである場合、「真の」MICは、16~8μg/mLの間であろう。管理された最善の条件下であっても、希釈試験を実行する各々の時に同一の終点が得られない場合がある。一般に、試験の許容可能な再現性は、実際の終点の2倍希釈以内である。
1. 細菌接種材料の調製。新鮮なプレート(1週未満)から各系統のシングルコロニーを選び、5mlの陽イオンを調整したMuller-Hinton Broth(CAMHB)に移す。37℃の撹拌機で一晩インキュベートする。
2. 次の日の朝、一晩培養の1:100希釈を実施する(50ulを5mlに入れる)。37℃の撹拌機で2~4時間インキュベートする。
3. 2~4時間後(600nmでの吸光度約0.3~0.5)、細菌を遠心分離(5000rpm、5分)し、PBSに再懸濁し、培養物をMacFarland0.5に調整し、50ulの調整培養物を9950ulのCAMHBに移し、ボルテックスすることにより混合する。
4. 2~4時間後(600nmでの吸光度約0.3~0.5)、細菌を遠心分離(5000rpm、5分)し、PBSに再懸濁し、培養物をMacFarland0.5に調整し、50ulの調整培養物を9950ulの1.1×CAMHB(陽イオンを調整したMuller-Hinton Broth)に移し、ボルテックスすることにより混合する。
5. マザープレートの調製[1枚のマザープレートを10枚のドータープレートとし、1系統あたり1枚のドータープレート]:(細菌が増殖している間に準備する、ステップ5):ディープウェルプレートの最初のウェルに200ulの化合物ストックを添加し、他のすべてのウェルに100ulのDMSOを添加する。ウェル2~11で化合物の2倍連続希釈を行う(1から2に100ulを移し、ピペッティングにより4回混合し、2から3に100ulを移し、混合するなどをし、ウェル11から100ulを廃棄する)。ウェル12はDMSOのみの対照である。
900ulの滅菌蒸留水を各ウェルに添加し、ピペッティングにより混合する。
6. MICプレート調製:マザープレートの各ウェルから10ulを、ドータープレートの対応するウェルに移す。90ulの細菌接種材料を各ウェルに加え、ピペッティングにより混合する。
7. 37℃で24時間インキュベートし、そして増殖について採点する。増殖は、濁ったウェル、明らかなペレット、またはウェル内に存在する細菌の>3のピンポイントのいずれかと見なされる。増殖を示さない化合物の最低濃度をMICとして採点する。
(Staph. AureusのバンコマイシンのMIC:0.25~4ug/ml、MRSAのバンコマイシンのMIC:1~138ug/ml、バンコマイシン分子量は1450ダルトン、HCAbの分子量は80,000ダルトン、HCAbはバンコマイシンより約50倍重い、脂質IIに対するバンコマイシンの親和性は50nM、HCAbの親和性は、0.5~10nMであろう。HCAbは、0.025~25ug/mlのMICを有するであろう)。
(J. Clin. Microbiol.2006,44(11):3883. DOI:A. Bruckner Guiqing Wang, Janet F. Hindler, Kevin W. Ward and David. Increased Vancomycin MICs for Staphylococcus aureus Clinical Isolates from a University Hospital during a 5-Year Period)
オプソニン化食作用アッセイ(OPA)は、米国特許第8,410,249号に記載されるように実施された。OPAは、抗体、補体、及び食細胞の存在下での細菌の殺傷を測定する。ヒトの補体及び細胞が一般的に使用される。HCAbまたはフラグメントは、0.01ug/ml~10μg/mlの濃度で試験された。細菌の殺傷は、全ての成分とのインキュベーションの前後にコロニー形成単位を決定することによって測定される。オプソニン化も顕微鏡下で可視化される。ヒト多形核白血球(PMN)または分化したHL60前骨髄球性白血病(HL60)細胞のいずれかがエフェクター細胞として使用される。ヒト血清または子ウサギ血清中の補体が補体の供給源として使用される。簡潔に、HCAbまたは他の標本をハンクス平衡塩類溶液で、96ウェルマイクロタイタープレート中で2倍の段階で連続希釈し、次いで細菌(ウェル当たり約2,000CFU)及び補体と共に、軌道式振盪機上において37℃で30分間インキュベートする。非特異的な殺傷または過剰増殖を最小限に抑えるために、最適な振盪速度が各細菌系統に対して決定される。新たに単離したヒトPMNまたは分化したHL60細胞(エフェクター細胞)を細菌(標的)-補体-血清混合物に400:1の比率で添加し、混合物を37℃で45分間インキュベートする。OPA力価は、HCAbまたはそのフラグメントを除くすべての試薬を含む対照ウェルからのCFUと比較して、CFUの50%減少(殺傷)を引き起こす血清希釈度である。HCAbは10ng/ml~10μg/mlでバクテリアを殺傷する。
細胞で免疫する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗CD3e抗体の発現のために、ヒトJurkat細胞を組織培養中で増殖させる。所望のヒト抗体の発現は、Jurkat細胞とモノクローナル抗体OKT3とのインキュベーションによって分析される。続いて、細胞の洗浄により未結合のOKT3を除去し、そして結合したOKT3をフルオレセインとコンジュゲートした抗マウスIgG及びフローサイトメトリー分析により検出する。
遺伝子ワクチン、または免疫するための抗原をコードするDNAの使用は、ラットにおける強い抗体応答の発生に対する代替的アプローチを表す。
抗体を精製するために、免疫したラットから血液を採取し、遠心分離によって血清または血漿を得て、それによって凝固した細胞ペレットを、血清抗体を含む液体上相から分離する。血漿の血清からの抗体は標準的な手順により精製される。そのような手順には、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、及び/またはアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。IgGの精製のためにプロテインAまたはプロテインBを使用できる(Brueggemann et al.,JI,142,3145,1989)。
脾臓、リンパ節、または末梢血からのB細胞の単離
単一細胞懸濁液は、免疫ラットの脾臓またはリンパ節から調製される。赤血球を除去した後、またはB細胞、メモリーB細胞、抗原特異的B細胞、または形質細胞を単離した後、細胞をさらに濃縮することなく使用することができる。濃縮するとより良い結果が得られる可能性があり、最小限の赤血球除去が推奨される。メモリーB細胞は、不要な細胞の枯渇とそれに続くポジティブセレクションによって単離される。不要な細胞、例えばT細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、血小板、及び赤血球細胞は、CD2、CD14、CD16、CD23、CD36、CD43、及びCD235a(グリコホリンA)に対する抗体のカクテルを使用して除去される。IgGまたはCD19に特異的な抗体を用いたポジティブセレクションにより、高度に濃縮されたB細胞をもたらす(50%~95%)。抗原特異的B細胞は、蛍光マーカー及び/または磁気ビーズで標識された抗原(複数可)に対して細胞を曝露することによって取得される。続いて、蛍光色素及び/または磁気ビーズでタグ付けされた細胞を、(フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器[FACS])FACS分取器及び/または磁石を用いて分離する。形質細胞はほとんど表面Igを発現し得ないので、細胞内染色が適用され得る。
FACSに基づく方法はそれらの個々の特性によって細胞を分離するために使用される。細胞が単一細胞懸濁液中にあることが重要である。免疫化ラットの末梢血、脾臓、または他の免疫器官から調製された単一細胞懸濁液を、CD19、CD138、CD27、またはIgGなどのB細胞マーカーに特異的な蛍光色素標識抗体と混合する。代替的に、細胞を蛍光色素タグ付き抗原と共にインキュベートする。細胞濃度は、PBSなどの適切な緩衝液中で100万~2000万細胞/mlである。例えば、メモリーB細胞は、CD27陽性及びCD45R陰性の細胞を選択することによって単離することができる。形質細胞は、CD138陽性及びCD45R陰性の細胞を選択することによって単離することができる。細胞をFACS装置に載せ、ゲートされた細胞を、培地を含む96ウェルプレートまたはチューブに入れる。必要に応じて、各蛍光色素に対する陽性対照を実験に使用し、これによりバックグラウンドを差し引いて補正を計算することが可能になる。
骨髄形質細胞(BMPC)は、記載(Reddy et al.,2010,Nature Biotechnology 28,965-969)のように免疫動物から単離される。筋肉と脂肪組織は採取した脛骨と大腿骨から除去される。脛骨と大腿骨の両方の端を外科用ハサミで切り、骨髄を26ゲージのインスリン注射器(Becton Dickinson, BD)で洗い流す。骨髄を滅菌ろ過した緩衝液第1番(PBS、0.1%のBSA、2mMのEDTA)中に回収する。骨髄細胞を、細胞こし器(BD)を通して機械的に破砕しながらろ過することによって回収し、20mlのPBSで洗浄し、50mlのチューブ(Falcon, BD)に回収する。骨髄細胞を、4℃において、335gで10分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを3mlの赤血球溶解緩衝液(eBioscience)に再懸濁し、25℃で5分間穏やかに振とうする。細胞懸濁液を20mlのPBSで希釈し、そして4℃において335gで10分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを1mlの緩衝液第1番で再懸濁する。
記載(Koehler and Milstein, Nature,256,495,1975)されているように、単離されたB細胞をX63またはYB2/0細胞のような骨髄腫細胞との融合により不死化する。ハイブリドーマ細胞を選択培地中で培養し、抗体産生ハイブリドーマ細胞を限界希釈法または単一細胞選別法により作製する。
単離した細胞からのcDNA配列の生成
単離された細胞を4℃において930gで5分間遠心分離する。細胞をTRI試薬で溶解し、Ribopure RNA分離キット(Ambion)の製造元のプロトコールに従って全RNAを単離する。製造元のプロトコールに従って、オリゴdT樹脂とPoly(A)puristキット(Ambion)を用いてmRNAを全RNAから単離する。mRNA濃度はND-1000分光光度計(Nanodrop)で測定される。
PCR産物をプラスミドベクターにサブクローニングする。真核細胞における発現のために、重鎖のみの抗体をコードするcDNAを記載(Tiller et al.,2008;329(1-2):112-124)のように発現ベクターにクローニングする。
約5ml(またはより多くの)一晩の細菌培養からのプラスミド単離のために、Sigma-AldrichのGenElute(商標)プラスミドミニプレップキットが使用される(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/plasmid-miniprep-kit.html)。これは遠心分離とそれに続くアルカリ溶解によるバクテリア細胞の収穫を含む。次いで、DNAをカラムに結合させ、洗浄して溶出し、消化またはシークエンシングをする準備を整える。
ClontechのNucleoBond(登録商標)BAC100は、BAC精製のために設計されたキットである(http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&product_id=186802)。このために、細菌は200mlの培養から回収され、改良アルカリ/SDS手順を使用することによって溶解する。細菌溶解物を濾過により清澄化し、そして平衡化カラムにロードし、そこでプラスミドDNAは陰イオン交換樹脂に結合する。続く洗浄ステップの後、精製されたプラスミドDNAを高塩濃度緩衝液中に溶離し、そしてイソプロパノールで沈殿させる。プラスミドDNAをさらなる使用のためにTE緩衝液中で再構成する。
直線状のYAC、環状のYAC及び消化後のBACフラグメントは、標準的に泳動した0.8%アガロースゲルまたはパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)から切り出されたストリップから、Elutrap(商標)(Schleicher and Schuell)を用いる電気抽出によって精製される(Gu et al.,1992、上述)。精製したDNAを沈殿させ、そして緩衝液に所望の濃度に再溶解する。
組換え重鎖のみの抗体の発現のために、真核生物細胞を記載(Andreason and Evans,1989,Anal. Biochem.180(2):269-75;Baker and Cotten,1997,Nucleic Acid Res.,25(10):1950-6;http://www.millipore.com/cellbiology/cb3/mammaliancell)されるようにトランスフェクトする。重鎖のみの抗体を発現する細胞は、様々な選択方法を用いて単離される。単一細胞の単離には限界希釈法または細胞選別法が使用される。クローンを重鎖のみの抗体発現について分析する。
図1は、重鎖のみの抗体を発現するためにUniRat(商標)において使用されるヒト導入遺伝子を示す。OmniFlic(商標)は、UniRatと同一のヒトV遺伝子クラスターを使用するが、固定されたκ軽鎖を発現しない。
1058の重鎖抗体の大きなコレクションに対するラムダ結合を標準的なELISAによって測定した。1058の全重鎖抗体のうち、859が第101位にRを含み、199が第101位にWを含んだ。図4は、R101重鎖抗体の2.7%のみが、バックグラウンドシグナルの10倍以上のELISAシグナルとして決定される、遊離ラムダタンパク質との顕著な結合を示したことを示す。対照的に、W101重鎖抗体の31.2%が、同様の基準を用いて遊離ラムダタンパク質との顕著な結合を示した。これらの結果は、W101R変異がラムダ結合に対して高度に防御的であり、W101重鎖抗体は、R101よりもはるかに高いラムダとの結合する可能性を有することを示す。
図5は、同一のCDR3ファミリーにおける重鎖抗体由来の11のVH配列多重配列アラインメントを示す。これらの配列の全ては第101位にWを含む。アラインメントにおける上部の7の配列は全て、ELISAによって測定されるラムダ結合について陽性であった。アラインメントにおける下部の4の配列は全て、同様にELISAによって測定されるラムダ結合について陰性であった。このVH配列のファミリーは、ラムダポジティブ配列とラムダネガティブ配列とを区別する位置a及びbにさらなる変異を示す。位置aまたはbのいずれかにあるSerまたはGluは、ラムダ結合を排除する。しかしながら、他のCDR3ファミリー中のこれらの位置におけるSerまたはGluは、ラムダ結合による同一の結合を有さない。このファミリーからの結果は、ラムダ結合を妨げるW101のVH配列に代償性変異があることを示唆しているが、これらの代償性変異はCDR3ファミリーに特異的であることを示唆している。
実施例6で示されるように、UniRat(商標)と比べてOmniFlic(商標)において、IGHJ6が3倍以上高い頻度で使用される。さらに、図3に示されるように、IGHJ6がUniRat(商標)で使用されるとき、生殖細胞系列のIGHJ6において見られる5つのTyr残基のストレッチは、最も高頻度で、1つのTyrに短くなっている。対照的にIGHJ6が使用されるとき、4つのTyr残基のストレッチが、OmniFlic(商標)中で最も一般的な長さである。これは、IGHJ6が使用されるとき、W101を含む重鎖抗体において生殖細胞系列のIGHJ6配列中に存在する5つのTyr残基のストレッチを短くするための選択的圧力が存在することを示唆する。
初代培養T細胞でのキメラ抗原受容体の発現は、細胞外抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一のキメラタンパク質の発現を必要とする。単一鎖Fvフラグメントは、典型的に抗原結合ドメインとして使用される。scFvキメラ抗原受容体の例は、図6のパネルAに示される。代替的に、単一のヒトVH結合ドメインが、細胞外結合ドメインとして使用される(パネルBまたは図6)。単一のヒトVHを使用することは、発現するためのより小さくより複雑でないタンパク質であるという利点を有し、そして免疫原性がより低い。
Claims (31)
- 組換え重鎖のみの免疫グロブリン(Ig)をコードする核酸であって、前記組換え重鎖のみの免疫グロブリン(Ig)は、以下:
(i)1つ以上のヒトV遺伝子セグメント、1つ以上のヒトD遺伝子セグメント、及び1つ以上のヒトJ遺伝子セグメントであって、非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、前記核酸は、前記非ヒト動物の中で再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子フラグメントを生成することが可能であり、ここで、前記再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子フラグメントは、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む重鎖可変(VH)領域を含む重鎖のみの抗体(HCAb)をコードし、ここで、前記ヒトJセグメントの少なくとも1つが、第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位に、その位置における天然のアミノ酸残基を含む表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、前記1つ以上のヒトV遺伝子セグメント、1つ以上のヒトD遺伝子セグメント、及び1つ以上のヒトJ遺伝子セグメント;ならびに、
(ii)Cμコード領域を欠き、各々がCH1エクソンを欠く複数のCγコード領域を含み、そして、CH1エクソンを含むCεコード領域またはCαコード領域をさらに含む、C領域遺伝子セグメント
を含む、核酸。 - 2~40のD遺伝子セグメント、及び2~20のJ遺伝子セグメントを含む、請求項1に記載の核酸。
- 1より多い前記ヒトJ遺伝子セグメントが、前記第4のフレームワーク領域(FR4)の前記第1位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含む表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項2に記載の核酸。
- 全ての前記ヒトJ遺伝子セグメントが、前記第4のフレームワーク領域(FR4)の前記第1位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含む表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項3に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域において、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項4に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域において、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項4に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、請求項6に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、請求項7に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域が、前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、請求項8に記載の核酸。
- WのコドンがRによって置き換えられているJ4遺伝子セグメントを含む、請求項9に記載の核酸。
- 前記コードされたVH領域が、1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記VH領域を含むヒトまたはヒト化重鎖のみの抗体をコードする、請求項1~11のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
- 非ヒト哺乳動物である、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- げっ歯動物である、請求項14に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ラットまたはマウスである、請求項15に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ラットである、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラットはヒトの重鎖のみの抗体またはキメラの重鎖のみの抗体を生成することが可能である、請求項17に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、そして、1つ以上のV遺伝子セグメント、1つ以上のD遺伝子セグメント、及び1つ以上のJ遺伝子セグメント、ならびに1つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのIgをコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、
前記1つ以上のV遺伝子セグメント、1つ以上のD遺伝子セグメント、及び1つ以上のJ遺伝子セグメントは、互いに組み換えられるとき、前記核酸は、前記非ヒト動物の中で再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子フラグメントを生成することが可能であり、ここで、前記再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子フラグメントは、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含むVHドメインを含む重鎖のみの抗体(HCAb)をコードし、前記VHドメインの第4のフレームワーク領域(FR4)の第1位の天然のアミノ酸残基が、その位置における天然のアミノ酸残基を含む表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、
前記1つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントの各々は、Cμコード領域を欠き、各々がCH1エクソンを欠く複数のCγコード領域を含み、そして、CH1エクソンを含むCεコード領域またはCαコード領域をさらに含む、抗体の定常エフェクター領域をコードし、
前記遺伝子セグメントが、V、D、及びJ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて前記重鎖のみの抗体(HCAb)をコードする前記再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子フラグメントを生じるように配置される、前記トランスジェニック非ヒト動物。 - 前記VHドメインにおいて、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記VHドメインにおいて、前記FR4の第1位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記VHドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン(K)、アルギニン(R)、及びヒスチジン(H)からなる群から選択される、請求項21に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記VHドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン(R)である、請求項22に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記VHドメインが、前記第4のフレームワーク(FR4)領域中の前記第1のアミノ酸残基において、トリプトファン(W)からアルギニン(R)への置換を含む、請求項23に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記異種の重鎖のみのIgをコードする前記核酸が、WのコドンがRのコドンと置き換えられているJ4セグメントを含む、請求項24に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記コードされた重鎖のみの抗体が、1つ以上のフレームワーク領域において、1つ以上のさらなる変異を含む、請求項19~25のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 哺乳動物である、請求項19~26のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- げっ歯動物である、請求項27に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ラットまたはマウスである、請求項28に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ラットである、請求項29に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラットはヒトの重鎖のみの抗体またはキメラの重鎖のみの抗体を生成することが可能である、請求項30に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
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