JP2022520707A - 混合結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
Description
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS(配列番号1)
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと;
かかる動物からの重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸を単離することと;
単離された核酸によってコードされる重鎖又は軽鎖可変領域を、ヒト重鎖又は軽鎖可変領域と対合させることと、を含み、それにより、混合結合ドメインを形成する、方法を提供する。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと;
重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を、抗原に結合することができるかかる動物から単離することと;
重鎖又は軽鎖可変領域が、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる単離された遺伝物質によってコードされる、ディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、該重鎖又は軽鎖可変領域が、混合結合ドメインを形成するヒト同族鎖可変領域と対合する、方法を提供する。
本発明のファージであって、そのゲノム中に、トリの、少なくとも一部、重鎖領域に基づく、重鎖領域に由来する、又は重鎖領域から得られる重鎖可変領域をコードする核酸配列と、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列と、を含む、ファージ;
本発明の複数のファージを含むファージディスプレイライブラリー;
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法;
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することであって、かかる動物は、VH/VL界面においてヒトVL可変領域との5、好ましくは8、より好ましくは10の静電相互作用を含む機能的VH遺伝子セグメントを含む、免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法;
本発明のファージディスプレイライブラリーを使用することによる、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法;
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、2つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸を含む宿主細胞であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、好ましくは、コードされた各重鎖可変領域は、同じ又は異なる標的又は標的上のエピトープに結合することができる、宿主細胞;
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、2つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、発現及び多量体化して、可変結合ドメイン、好ましくは多量体、抗体、又はその変異体、より好ましくは多重特異性多量体、抗体、又はその変異体を形成することができる、核酸;
本発明のいずれか1つによる抗体と、薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤と、を含む、医薬組成物;
治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための本発明の抗体;並びに、
医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、ヒト又は動物に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法、を提供する。
抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
本発明は、結合ドメイン、及び結合ドメインを含む多量体、例えば抗体、又はそのいずれかの変異体に関する。典型的には、本発明の結合ドメインは、ヒトに対して系統発生的に遠位にある生物、例えばトリ、好ましくはニワトリ、アヒル、又はダチョウの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。その可変領域は典型的には、ヒト可変領域と対合する。したがって、本明細書に開示される本発明の結合ドメインは、キメラ、又はヒト化又は混合結合ドメインであり得る。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、キジ目、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス(grouse)、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン(ptarmigan)、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル、又はダチョウを含むトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる、免疫グロブリン可変領域又はその一部分を含む。
本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体は、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、例えば対象となる抗原又はエピトープで免疫化されたトリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。したがって、可変領域は、該抗原又はエピトープに対して特異性を有する。
1.沈殿法:硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール(PEG)、カプリル酸、及びカラギーナンを伴う。
2.クロマトグラフィー法:親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、チオフィリック(thiophylic)相互作用クロマトグラフィー、及びゲル濾過クロマトグラフィー。
3.限外濾過。
IgY調製物の純度は、方法の組み合わせによって高めることができる。例えば、PEG沈殿を親和性クロマトグラフィーと組み合わせたり、硫酸アンモニウム沈殿をイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせたりすることができる。場合によっては、最終的な用途に応じて、IgYの水抽出物で十分な場合がある。好適な方法の任意の組み合わせを使用して、IgY調製物を回収することができる。
本発明の利点は、本発明に好適な免疫化動物の可変領域及び核酸をヒト可変領域と直接対合して、混合結合ドメインを直接形成することができるので、ヒトに対して系統発生的に遠位にあるトランスジェニック動物を生成しないで済むようにしてくれることである。したがって、混合結合ドメインのファージディスプレイライブラリーは、ヒトIg遺伝子座又はDNAを含むかかる動物のトランスジェニック品種を生成する必要なしに、本発明での使用に好適な動物の野生型抗体レパートリーから直接生成され得る。ファージは、免疫化された動物からの可変領域及び同族のヒト可変領域を含む混合結合ドメインを表示する。
本発明は、本発明の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法に関する。該方法は、
本発明での使用に好適な動物を抗原で免疫化することと;
該動物から、抗原に結合する可変領域をコードする核酸を単離することと;
該核酸によってコードされる可変領域を得て、該可変領域を同族のヒト可変領域と対合することと;を含み、
それにより、混合結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体を調製する。
(a)動物のゲノムがその生殖細胞系列において、再構成されていない免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメントと、ヒト再構成共通軽鎖とを含み、抗原に応答して動物が、再構成免疫グロブリン重鎖可変領域によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体を産生する、動物を準備することと;
(b)動物を抗原に曝露することにより、動物の免疫応答を刺激することと;
(c)抗体の重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと;
(d)抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを、細胞内のヒト重鎖定常領域をコードするDNAに操作可能に連結することと;
(e)該ヒト再構成共通軽鎖をコードするDNAを該細胞に組み込むことと;
(f)細胞が、重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域、並びに対合することができるヒト共通軽鎖を含む結合ドメインを発現するような条件下で、細胞を増殖させることと;
(g)結合ドメインを回収することと;を含む。
ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイなどの様々な形態のディスプレイ技術が、当技術分野で知られており、本明細書に記載の結合ドメインを使用するために、本明細書に記載の本発明に包含される。
トリを抗原で免疫化することと;
該動物から、第1の可変領域をコードする核酸を単離することと;
ファージのゲノムに、該核酸と、第1の可変領域と対合することができる第2のヒト可変領域をコードする核酸とを組み込むことと;を含み、
それによって、ファージを調製する。
(a)本明細書に記載されているトリなどの抗原で好適な動物を免疫化することと、
(b)可変領域をコードする1つ以上の核酸を動物から得ることと、
(c)各ファージが、対合することができる2つの可変領域を表示するように、1つ以上の核酸を、同族ヒト可変領域をコードする核酸と共に1つ以上のファージに組み込むことと、
(d)(a)で使用された抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージを選択することと、を含み得る。
トリの動物を抗原で免疫化することと;
複数の可変領域をコードする複数の核酸を、該動物から単離することと;
該核酸によってコードされる可変領域の少なくとも一部分がヒト可変領域と対合する、該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、Fabファージディスプレイライブラリーを調製する。
a)B細胞の集団を準備するステップと、
b)核酸を該B細胞から単離するステップと、
c)該サンプル中の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を増幅するステップと、
d)本質的に全ての増幅産物を少なくとも部分的に配列決定するステップと、
e)ステップd)からの全ての配列の頻度分析を実行するステップと、
f)所望のVH配列を選択するステップと、
g)宿主細胞に、該所望のVH配列の少なくとも1つと、ヒト軽鎖可変領域をコードする少なくとも1つの核酸とを含む少なくとも1つのベクターを提供するステップと、
h)該宿主細胞を培養し、VH及びVLポリペプチドの発現を可能にするステップと、
i)該結合分子を得るステップと、を含む。
a)上記の抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージの重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと;
b)可変領域をコードするDNAを、ヒト重鎖定常領域をコードするDNAに操作可能に連結することと;
c)該可変領域DNA及びヒト共通軽鎖をコードするDNAを、宿主細胞に組み込むことと;
d)細胞が、対合することができる、ヒト共通軽鎖と対合するヒト重鎖定常領域に操作可能に連結された可変領域を含む抗体を発現するような条件下で、細胞を増殖させることと;
e)抗体を回収することと;を含む。
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば抗体が、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、好ましくはトリ、より好ましくはニワトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる一連の重鎖可変領域と結合して、機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖(可変領域)を有することは、本発明の好ましい態様である。(国際公開第2004/009618号、同第2009/157771号)。
本発明の多量体、例えば抗体は、上記ものなどの多量体を形成する2つ以上、例えば3つのタンパク質を一緒にコードする1つ以上の遺伝子構築物による個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。例えば、本発明に好適な免疫化動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、又は上記の方法によるディスプレイライブラリーからの1つ以上の重鎖可変領域と、抗体を産生するための共通軽鎖可変領域と、をコードする核酸配列で、宿主細胞は共トランスフェクトされ得る。あるいは、本発明の抗体は、1つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする1つ以上の遺伝子構築物を用いた個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。多重特異性多量体、例えば二重特異性抗体が望まれる場合に、複数の重鎖可変領域又は複数の軽鎖領域を細胞から発現させることができる。
本発明は更に、本発明の抗体などの多量体の組み立てにおいて使用され得るポリペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、本発明の抗体などの多量体を産生できる細胞、及びかかる細胞を使用して抗体を含むかかる多量体を調製するための方法を提供する。
本発明の抗体などの多量体に組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを抗体などの多量体に提供する条件下で、培養することと、を含む。
組換え宿主細胞における結合ドメイン、多量体、例えば抗体、又はその変異体の発現については、当該技術分野において記載されている。本発明の抗体の結合ドメイン及び軽鎖及び重鎖の場合の可変領域をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び/又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましいが、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くことが知られている遺伝子座を標的とし得る。
また、本発明によって提供されるのは、本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体、並びに薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤を含む医薬組成物である。
1.ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、該可変領域がヒト可変領域と対合する、結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする核酸配列を該動物から単離することと、
可変領域を該単離された核酸配列から得ることと、
該動物からの可変領域をヒト可変領域と対合することと、を含み、
それにより、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製する、方法。
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と;
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、ファージ。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法。
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と;
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、態様35~38のいずれか1つに記載の方法。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、
抗原に結合することができるファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、を含み、
それによって、抗原に結合することができる結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定する、方法。
ファージディスプレイライブラリーを産生するために、これは、免疫化されたトリ、好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるVH領域から構成される結合ドメインを表示し、かかるVH領域は、ヒト軽鎖可変領域、好ましくはcLCを有する多量体を形成し、VH領域はVL領域と対合できる必要がある。
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTLSSYQMMWVRQAPGKGLEWVAGITSRGGVTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKPALDSDQCGFPEAGCIDAWGHGTEVTVSS(配列番号2)
ニワトリ重鎖可変領域をヒト共通軽鎖と直接対合する性質、及びヒトVH-VL界面と比較して、混合VH-VL界面で更に多数の安定した相互作用を生成するその性質を実証するとき、更にトリの種であるAnas platyrynchos(マガモ)を、上記のニワトリVHについて説明したようにモデル化した。
AETLDESGGGLVSPGGSLTLVCKGSGFTFSSNEMYWVRQAPGKGLEWVAGITTGGYTGYAPAVKGRFTISRNNGQSTLTLQMNSLKAEDTATYYCAKITGYANCAGYGCAADIDLWGHGTEVTVSS(配列番号3)
ニワトリ及びアヒルは、生物学的種類の家禽(系統群、Galloanserae)、すなわちキジ目及びガンカモ目を代表している。したがって、ヒト軽鎖可変領域(多価多量体フォーマットで共通軽鎖として使用され得る)と直接対合する、(アヒル及びニワトリに対してより遠位に関連する)非家禽のトリ種、すなわちダチョウ(Struthio camelus)の重鎖可変領域の能力を、上記の実施例1のニワトリVHについて記載したようにモデル化した。
AVQLVESGGGLQQPGGSLRLSCKGTGFTLSSFGMSWIRQAPGKGLEPVAGISSSGSDTYYADAVQGRFTISRDNGQSTLYLQMNGLKAEDTATYYCAKCATDWGSCGPWNLDAWGRGASVTVSS(配列番号4)
市販のブロイラー(CB)近交系のゲノムニワトリ重鎖遺伝子座配列が公開されており(Reynaud et al.,Cell 59,171-183,1989)、アクセッション番号M30319(図11を参照)でNCBIデータベースに保存されている単一の機能的VH遺伝子セグメント(VH1)を含有する断片と、単一の機能的JH遺伝子セグメント(アクセッション番号M30320;図12を参照)を含有する断片と、が含まれている。
●プライマーchVH-FWの最初の33塩基(GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC)は、ヒト、マウス、又はラットのVH配列を増幅することが知られているフォワードプライマーの最初の33塩基と同一である(de Haard et al.,Journal of Biological Chemistry 274,18218-18230,1999)。この領域はリーダーペプチドの一部をコードし、ファージディスプレイに使用されるベクターに存在するSfiIクローニング部位を含有する。
●プライマーchVH-FWの最後の21塩基(GCCGTGACGTTGGACGAGTCC)は、単一の機能的ニワトリVH遺伝子セグメントの最初の21塩基と同一である。ニワトリから単離されたmRNA由来のVH配列には、通常、この領域には変異が全くないか、又はほとんど含まれない(Reynaud et al.,1989,supra)。このことは、この領域において、VH偽遺伝子(VH多様化においてドナー配列として機能する)は、アクセプターとして機能する機能的VH遺伝子セグメントと完全に又はほぼ同一であるという事実による。全く同じ21塩基が、他者(Andris-Widhopf et al.,Journal of Immunological Methods 242,159-181,2000)によって記述された同様のニワトリVH増幅フォワードプライマーに使用されている。
●SfiI部位に下線が引かれたプライマーchVH-FWの合計54塩基配列は、以下のとおりである。
●図14のDNAアラインメントは、プライマーchVH-FWである機能的ニワトリVHの一部と、特定のファージディスプレイベクターMV1511の一部との間の相同性を示す。
●ベクターMV1511のリーダーをニワトリVH配列と組み合わせて、処理を補正することをin silicoで確認するために、SignalPツール(http://cbs.dtu.dk/services/SignalP)を使用して、MV1511リーダー及びニワトリVH1を含むタンパク質配列を分析した。結果は、予想される位置での予測される切断を示した。
●ファージディスプレイベクターMV1511(図18を参照)には、ヒト、マウス、ラットのJHの対応する配列と高度に相同なJHの末端をコードする配列の一部として、BstEII及びXhoIクローニング部位が含まれている。機能的ニワトリVHには内部XhoIサイトが含まれているため(FW3-図11を参照)、XhoIを使用してニワトリVHのクローニングすることはできない。BstEII部位はニワトリVHには存在しないため、この部位は、JH配列の末端をコードするリバースプライマーに組み込まれている。これは、サイレント変異だけでは不可能である。BstEII部位を組み込むことで、単一のイソロイシンからスレオニンへの変異がもたらされ、これによりJH配列をVIVSSからVTVSSに変更する。VH結晶構造の分析(上記を参照)に基づいて、この変異体は抗体の構造及び結合特性に大きな影響を与えないと予測される。これは、クローニング目的、並びにヒト化目的のためのニワトリVH配列の変異体の例であるが、当業者は、ニワトリVH/ヒトVLドメインの結合の構造に大きな影響を及ぼさない追加の又は異なる変異体も組み込むことができることを理解している。
●ニワトリJH遺伝子セグメントから離れた変異に下線が引かれ、BstEII部位は太字のイタリック体である、24塩基プライマーchVH-RVの配列は、以下のとおりである。
●図16のDNAアラインメントは、chVH-RVの逆相補体であるニワトリJHの一部と、ベクターMV1511の一部との間の相同性を示す。プライマー全体は、対応するニワトリJH配列と92%同一(24塩基中22塩基)であり、最初の10塩基(5’側)及び最後の8塩基(3’側)は100%同一である。
ニワトリのDNA免疫化を実施し得るようにするために、ヒトPD-1(huPD-1)の少なくとも一部分をコードする核酸を組み込んだ好適な発現ベクターを生成することができる。
配列番号17
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCACGAGGGACAATAGGAGCCAGGCGCACCGGCCAGCCCCTGAAGGAGGACCCCTCAGCCGTGCCTGTGTTCTCTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCAGTGGCGAGAGAAGACCCCGGAGCCCCCCGTGCCCTGTGTCCCTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTGTCTTTCCTAGCGGAATGGGCACCTCATCCCCCGCCCGCAGGGGCTCAGCTGACGGCCCTCGGAGTGCCCAGCCACTGAGGCCTGAGGATGGACACTGCTCTTGGCCCCTCTGATGA
ニワトリVH領域とヒトVL領域とのファージディスプレイライブラリーを生成するために、例えば実施例5に記載のプロトコルに従って産生されたhuPD-1免疫化ニワトリの脾臓細胞及び骨髄細胞からのTRIzolサンプルを使用して、個々のライブラリーを生成した。サンプルを使用してRNAを単離し、次いでオリゴ(dT)プライマーを使用してcDNAを合成した。複数の反応を実行して、後続のPCR反応に十分な材料を生成することができる。
生成される全てのライブラリーについて、多数のランダムなクローンを採取及び使用して、基本的にJ.Mol.Bio.222(3),581-97,1991 and J.Biol.Chem.274(26),18218-30,1999に従って、可溶性Fabを調製した。完全にヒトのクローンが参照として含まれる。この手順により、可溶性Fabを含有する未精製のペリプラズム抽出物が得られる。
ファージディスプレイライブラリーのレスキュー
上記の実施例6で生成された全てのライブラリーは、この実施例におけるファージディスプレイの選択中に別々に使用される。
例えばこの実施例に記載されるように、いくつかの異なる選択ストラテジー(各々、huPD-1及びmoPD-1に対する組換えタンパク質及び細胞選択)を実施して、ファージを選択することができる。
いくつかの種のPD-1に融合したhuFcからなる組換えタンパク質、並びにビオチン化PD-1融合タンパク質を、選択に使用するために表1に示す。パニングの選択は、KingFisher Flexを使用して実行される。
細胞の選択は、KingFisherを使用して、基本的に製造元の説明書に従い、以下の備考/変更を伴って実行される。
●選択は、huPD-1又はmoPD-1をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたFreeStyle293-F細胞を使用して行うことができる。
●市販の抗体を使用してPD-1の発現を確認するための対照FACS(表2を参照)を実行した後、以下に説明するビオチン化を開始することができる。
○huPD-1を検出するために、huPD-1を認識するマウス抗体(Abcam、カタログ番号ab52587)を一次抗体として、PEコンジュゲートヤギ抗moIgG(Invitrogen、カタログ番号M30004-4)を二次抗体として使用できる。
○moPD-1を検出するために、PEコンジュゲートラット抗moPD-1抗体(ITK-Diagnostics、カタログ番号109103;Merus Ab0285)を使用できる。
●細胞は、EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-Biotinキット(ThermoFisherカタログ番号21217)を使用してビオチン化できる。これには、ストレプトアビジン-PE(Caltag、カタログ番号SA1004-4)を検出試薬として用いて、FACSを使用したビオチン化効率を確認することが含まれる。同時に、上記のFACSを再度実行して、細胞上のPD-1が、ビオチン化後に依然として認識され得ることを確認することができる。
●結合したファージを、1mg/mlトリプシンを使用して溶出する。
●その後、KingFisherからの溶出サンプルを、5μLの4mg/mlのAEBSF(Sigma-Aldrich、カタログ番号A8456)を含有する丸底96ウェルプレートの列に移して、トリプシンを不活性化する。
●上記のスポット法によるファージ滴定を使用して、選択の濃縮/出力力価を決定することができる。
クローンをランダムに採取し、ファージとしてスクリーニングする。スクリーニングは、細胞発現huPD-1又はmoPD-1でFACSによって行われる。理由としては、これらが最も関連性の高い抗原フォーマットであるためである(組換えPD-1タンパク質でのELISAによるスクリーニングは、細胞発現PD-1に結合しないクローンをもたらし得る)。
●各選択ストラテジーから、24又は48クローン(選択中に観察された濃縮に応じて)が、96ウェルマスタープレート(MP)に採取される。
○陰性対照として、MF1025(抗サイログロブリンFabドメインを含有するファージ)を各プレートの1つのウェルに接種することができる。
○各MPの1つのウェルはブランク(細菌なし)のままにする。これは、以下に説明するように、FACSスクリーニング中に陽性対照抗体を添加するために使用される。
ファージFACSは、huPD-1又はmoPD-1をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたFreeStyle293-F細胞を使用して実行される。1つのウェルを市販の陽性対照抗体(表2)に使用して、PD-1発現を確認する。huPD-1を検出するには、huPD-1を認識するマウス抗体(Abcam、カタログ番号ab52587)を一次抗体として使用でき、PEコンジュゲートヤギ抗moIgG(Invitrogen、カタログ番号M30004-4)を二次抗体として使用できる。また、moPD-1を検出するには、PEコンジュゲートラット抗moPD-1抗体(ITK-Diagnostics、カタログ番号109103)を使用できる。
FACSにおいてhuPD-1及び/又はmoPD-1に特異的に結合する全てのクローンのVH遺伝子を配列決定する。それらのCDR3配列に従って、配列を分析及びグループ化する。
少なくとも1つのキメラニワトリVH-ヒトVLによる二重特異性抗体は、軽鎖をコードする1つ又は複数のプラスミドと、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするようにCH3遺伝子操作された2つの異なる重鎖との(一過性)トランスフェクションによって生成することができる。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成よりも優先する、二重特異性抗体の形成をもたらす。
CXCR4は、GPCRクラスA、サブファミリーA1のケモカイン受容体である。それは、細胞外N末端及び細胞内C末端を有する7つの膜貫通螺旋を有する。このトポロジーにより、4つの細胞外ドメインをもたらす。マウス相同体は、ヒトCXCR4と91%の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと67%の相同性を共有する。ニワトリ相同体は、ヒトCXCR4と82%の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと48%を共有する。
Claims (29)
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、前記可変領域がヒト可変領域と対合する、結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒトから系統発生的に遠位にある前記動物がトリである、請求項1に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記多量体が抗体である、請求項1又は2に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記抗体の定常領域がヒト定常領域である、請求項3に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる前記可変領域が、前記動物に基づく、前記動物に由来する、又は前記動物から得られる核酸によってコードされる再構成VDJ領域であり、前記ヒト可変領域が、軽鎖可変領域である、請求項1~4のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒト共通軽鎖などの共通軽鎖を含む、請求項5に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる前記可変領域が、前記動物に基づく、前記動物に由来する、又は前記動物から得られる核酸によってコードされる再構成VJ領域であり、前記ヒト可変領域が、重鎖可変領域である、請求項1~6のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 共通重鎖を含む、請求項7に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記トリが、VH領域をコードする機能的VH遺伝子セグメントを含み、前記VH領域が、前記VH/VL界面においてヒトVL領域との少なくとも5、好ましくは少なくとも8、より好ましくは少なくとも10の静電相互作用を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウなどのキジ目である、請求項2~9のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- マウス及び/又はヒトCXCR4に、好ましくはヒトCXCR4に結合する、請求項1~10のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる前記可変領域が、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり、前記アミノ酸配列が、配列番号100、配列番号101若しくは配列番号102を含む、又はそれに対して少なくとも80%、85%、好ましくは少なくとも90%、95%、より好ましくは少なくとも97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する、請求項11に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる前記可変領域が、ヒト化されている、請求項1~12のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 二重特異性抗体である、請求項3~13のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体である、請求項3~14のいずれか一項に記載の結合ドメイン又はその変異体の多量体。
- 結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする核酸配列を前記動物から単離することと、
可変領域を前記単離された核酸配列から得ることと、
前記動物からの前記可変領域をヒト可変領域と対合することと、を含み、
それにより、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製する、方法。 - 前記動物からの可変領域をコードする前記核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、前記ヒト可変領域が、軽鎖可変領域である、請求項16に記載の方法。
- ヒトから系統発生的に遠位にある動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウをはじめとするキジ目などのトリである、請求項16又は17に記載の方法。
- ファージであって、そのゲノム中に:
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と;
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、ファージ。 - 前記動物からの可変領域をコードする前記核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、前記ヒト可変領域が、軽鎖可変領域である、請求項19に記載のファージ。
- 請求項19又は20に記載のファージを含む、ファージディスプレイライブラリーであって、前記ライブラリーが少なくとも約106個のファージを含む、ファージディスプレイライブラリー。
- ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を前記動物から単離することと、
前記可変領域をコードする前記核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法。 - 前記動物からの可変領域をコードする前記複数の核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列である、請求項22に記載の方法。
- 前記ファージディスプレイライブラリー内の前記ファージが、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項22又は23に記載の方法。
- 抗原に対する結合特異性を有する、請求項1~15のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を前記動物から単離することと、
前記可変領域をコードする前記核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、
前記抗原に結合するファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、を含み、
それにより、前記抗原に対する結合特異性を有する結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定する、方法。 - 前記結合ドメイン又は多量体又はその変異体が、前記抗原に結合する、請求項25に記載の方法。
- 前記動物からの可変領域をコードする前記複数の核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列である、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記ファージディスプレイライブラリー内の前記ファージが、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項25~27のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸又は複数の核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる重鎖可変領域を含むポリペプチドと;ヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとをコードする、核酸又は複数の核酸。
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