NO332128B1 - Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate for a fremstille et polypeptid og DHA,DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for a modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav - Google Patents

Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate for a fremstille et polypeptid og DHA,DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for a modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO332128B1
NO332128B1 NO20101157A NO20101157A NO332128B1 NO 332128 B1 NO332128 B1 NO 332128B1 NO 20101157 A NO20101157 A NO 20101157A NO 20101157 A NO20101157 A NO 20101157A NO 332128 B1 NO332128 B1 NO 332128B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cell
dha
dpa
epa
nucleic acid
Prior art date
Application number
NO20101157A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20101157L (no
Inventor
Xiao Qiu
Haiping Hong
Original Assignee
Bioriginal Food & Science Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26929655&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO332128(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20101157L publication Critical patent/NO20101157L/no
Application filed by Bioriginal Food & Science Corp filed Critical Bioriginal Food & Science Corp
Publication of NO332128B1 publication Critical patent/NO332128B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Det beskrives isolerte nukleinsyremolekyler som koder for nye fettsyredesaturase-familiemedlemmer. Det beskrives også rekombinante ekspresjonsvektorer inneholdende desaturase-nukleinsyre-molekyler, vertsceller i hvilke ekspresjonsvektorene er blitt innført, samt fremgangsmåter for storskalafremstilling av langkjedede flerumettede fettsyrer (LCPUFA'er), f.eks. DHA.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid og DHA.DPA, EPA eller AA, fremgangsmåte for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmåte for å modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmåte for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav.
Fettsyrer er karboksylsyrer med langkjedede hydrokarbonsidegrupper og spiller en grunnleggende rolle ved mange biologiske prosesser. Fettsyrer er sjeldent frie i naturen, men finnes snarere i forestret form som hovedkomponenten i lipider. Lipider/fettsyrer er kilder til energi (f.eks. b-oksidasjon) og er en integrerende del av cellemembraner som er uunnværlige for bearbeidelse av biologisk eller biokjemisk informasjon.
Fettsyrer kan deles i to grupper: de mettede fettsyrer og de umettede fettsyrer som inneholder én eller flere karbon-dobbeltbindinger i cis-konfigurasjon. Umettede fettsyrer fremstilles ved hjelp av terminale desaturaser som hører til klassen ikke-hemejern-enzymer. Hvert av disse enzymer er en del av et elektrontransport-system som inneholder to andre proteiner, nemlig cytokrom b5og NADH-cytokrom bs-reduktase. Spesifikt katalyserer slike enzymer dannelsen av dobbeltbindinger mellom karbonatomene i et fettsyremolekyl. Mennesker og andre pattedyr har et begrenset spektrum av disse desaturaser som er nødvendige for dannelsen av spesielle dobbeltbindinger i umettede fettsyrer. Følgelig må mennesker ta opp en del fettsyrer gjennom føden. Slike essensielle fettsyrer er for eksempel linolsyre (C18:2), linolensyre (C18:3)og arachidonsyre (C20:4). I motsetning til dette, kan insekter og planter syntetisere en mye større mangfoldighet av umettede fettsyrer og deres derivater.
Langkjedede flerumettede fettsyrer (LCPUFA'er) så som docosaheksaensyre (DHA, 22:6 (4,7,10,13,16,19)) er essensielle komponenter i cellemembraner i forskjellige vev og organeller i pattedyr (nerve-, retina-, hjerne- og immunceller). For eksempel er over 30% av fettsyrene i hjerne-fosfolipid 22:6 (n-3) og 20:4 (n-6).
(M.A. Crawford et al. (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66:1032S-1041S). I retina utgjør DHA mer enn 60% av den totale mengde fettsyrer i det ytre stavsegment, den fotofølsomme del av fotorreseptorcellen (N.M. Giusto et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Kliniske undersøkelser har vist at DHA er essensiell for veksten og
utviklingen av hjernen hos spedbarn, samt for opprettholdelse av normal hjernefunksjon hos voksne (M. Martinetz (1992) J. Pediatr. 120:S129-S138). DHA har også betydelige virkninger på fotoreseptorfunksjonen som inngår ved signaloverføringsprosessen, rhodopsinaktivering og stav- og tapputvikling (N.M. Giusto et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Dessuten ble det også funnet noen positive virkninger av DHA på sykdommer så som hypertensjon, artritt, aterosklerose, depresjon, trombose og kreft (L.A. Horrocks og Y.K. Yeo (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215). Den passende kosttilførsel av fettsyren er derfor viktig for mennesker for å holde seg friske. Det er spesielt viktig for spedbarn, småbarn og eldre å innta tilstrekkelig av disse fettsyrer fra føden, siden de ikke effektivt kan syntetiseres i kroppen hos disse og må suppleres fra mat (A.A. Spector (1999) Lipids 34:S1-S3).
WO 0020603 A1 og J. Biol.Chem, vol. 273, nr. 45, 1998, s. 29360-29366 beskriver isolering av polypeptider med A 5-desaturaseaktivitet fra Mortierella alpina.
DHA er en fettsyre i n-3-serien i henhold til plasseringen av den siste dobbeltbinding i metylenden. Den syntetiseres via avvekslende trinn med desaturasjon og forlengelse. Biosyntese av DHA innbefatter, idet den starter med 18:3 (9,12,15), A6-desaturasjon til 18:4 (6,9,12,15), fulgt av forlengelse til 20:4 (8,11,14,17) og A5-desaturasjon til 20:5 (5,8,11,14,17). Ut over dette punkt er det en del uenighet om biosyntesen. Den vanlige oppfatning er at 20:5 (5,8,11,14,17) forlenges til 22:5 (7,10,13,16,19) og så omdannes til 22:6 (4,7,10,13,16,19) ved den endelige A4-desaturasjon (D.F. Horrobin (1992) Prog. Lipid Res. 31:163-194). Imidlertid foreslo Sprecher et al. nylig en alternativ vei for DHA-biosyntese, som er uavhengig av A4-desaturase, og som innbefatter to på hverandre følgende forlengelser, en A6-desaturasjon og en tokarbon-forkorting via begrenset (5-oksidasjon i peroksisom (H. Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477; H. Sprecher et al. (1999) Lipids 34:S153-S156).
Produksjon av DHA er viktig på grunn av dens fordelaktige virkning på menneskers helse. For tiden er hovedkildene til DHA oljer fra fisk og alger. Fiskeolje er en vesentlig og tradisjonell kilde til denne fettsyre, men den er vanligvis oksidert på salgstidspunktet. Dessuten er tilførselen av oljen meget variabel, og kilden til den er i fare på grunn av de minkende fiskepopulasjoner, mens algekilden er kostbar på grunn av lavt utbytte og de høye ekstraksjons-omkostninger.
EPA og AA er begge essensielle A5-fettsyrer. De utgjør en unik klasse matvare- og forbestanddeler for mennesker og dyr. EPA hører til n-3-serien med fem dobbeltbindinger i acylkjeden, finnes i marine matvarer og er rikelig forekommende i fet fisk fra Nord-Atlanteren. AA hører til n-6-serien med fire dobbeltbindinger. Mangelen av en dobbeltbinding i co-3-stillingen gir AA andre egenskaper enn dem som finnes i EPA. Eicosanoidene som dannes ut fra AA, har sterke inflammatoriske og blodplateaggregerende egenskaper, mens de som stammer fra EPA, har anti-inflammatoriske og anti-blodplateaggregerande egenskaper. AA kan fås fra en del matvarer, så som kjøtt, fisk og egg, men konsentrasjonen er lav.
Gamma-linolensyre (GLA) er en annen essensiell fettsyre som finnes i pattedyr. GLA er det metabolske mellomprodukt for meget langkjedede n-6-fettsyrer og for forskjellige aktive molekyler. I pattedyr er dannelsen av langkjedede flerumettede fettsyrer hastighetsbegrenset ved A6-desaturasjon. Mange fysiologiske og patologiske tilstander, så som aldring, stress, diabetes, eksem og en del infeksjoner er blitt vist å undertrykke A6-desaturasjonstrinnet. I tillegg blir GLA lett katabolisert fra oksidasjonen og den hurtige celledeling som er forbundet med visse forstyrrelser, f.eks. kreft eller inflammasjon. Kostsupplering med GLA kan derfor redusere risikoene ved disse forstyrrelser. Kliniske undersøkelser har vist at kostsupplering med GLA er effektivt ved behandling av en del patologiske tilstander så som atopisk eksem, premenstruelt syndrom, diabetes, hyperkolesterolemi og inflammatoriske og kardiovaskulære forstyrrelser.
De viktigste kilder til GLA er oljer fra planter så som nattlys ( Oenothera biennis), agurkurt ( Borago officinalis L.), solbær ( Ribes nigrum) og fra mikroorganismer så som Mortierella sp., Mucorsp. og Cyanobacteria. Imidlertid er disse GLA-kilder ikke ideelle for kostsupplering på grunn av store svingninger i tilgjengeligheten og omkostninger som er forbundet med ekstraksjonsprosesser.
Biosyntese av fettsyrer er en hovedaktivitet hos planter og mikroorganismer. Imidlertid har mennesker begrenset evne til å syntetisere essensielle fettsyrer, f.eks. langkjedede flerumettede fettsyrer (LCPUFA'er). Bioteknologi har lenge vært ansett som en effektiv måte til manipulering av prosessen for fremstilling av fettsyrer i planter og mikroorganismer. Den er kostnadseffektiv og fornybar med få bivirkninger. Dette har følgelig resultert i en enorm industriell innsats rettet mot fremstilling av forskjelige forbindelser innbefattende spesielle fettsyrer og farmasøytiske polypeptider via manipulering av plante-, dyre- og mikroorganisme-celler. I overensstemmelse med dette er bioteknologi en attraktiv måte til fremstilling av umettede fettsyrer, spesielt LCPUFA'er, på en trygg, kostnadseffektiv måte slik at den maksimale terapeutiske verdi av disse fettsyrer tas vare på.
Foreliggende oppfinnelse er i det minste delvis basert på oppdagelsen av en familie av nukleinsyremolekyler som koder for nye desaturaser. Følgende er identifisert: Fad 4 (A4-desaturase), Fad5 og Fad5-2 (A5-desaturase) og Fad6 (A6-desaturase) som inngår ved biosyntesen av langkjedede flerumettede fettsyrer DHA (docosaheksaensyre, 22:6, n-3) og DPA (docosa-pentaensyre, 22:5, n-6); mer spesifikt Fad4-desaturaser 22:5 (n-3) og 22:4 (n-6), som resulterer i DHA og DPA; Fad5 og Fad5-2-desaturaser 20:4 (n-3) og 20:3 (n-6), som resulterer i EPA og AA; og Fad6-desaturaser 18:2 (n-6) og 18:3 (n-3), som resulterer i GLA (gamma-linolensyre) og SDA (stearidonsyre).
I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl Isolert nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et isolert nukleinsyremolekyl bestående av nukleotidsekvensen angitt i SEKV ID NR: 3 eller et komplement derav; (b) et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid bestående av aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 4 eller et komplement derav; (c) et isolert nukleinsyremolekyl bestående av en nukleotidsekvens som er minst 80% identisk med hele nukleotidsekvensen av SEKV ID NR: 3 eller et komplement derav, hvor nukleinsyremolekylet koder for et polypeptid som har A5 desaturase aktivitet; og (d) et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid bestående av en aminosyresekvens som er minst 50% identisk med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 4 eller et komplement derav, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet.
I et beslektet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en vektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1 og at den er en ekspresjonsvektor. Den tilveiebringer også vertscelle, kjennetegnet ved at den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 3. Vertscellen er videre kjennetegnet ved at cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, en mikrobiell celle og en dyrecelle. Vertscellen er også kjennetegnet ved at plantecellen er en celle oppnådd fra en oljefrødyrkningsplante valgt fra gruppen bestående av lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven (O/ea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.). Den er videre kjennetegnet ved at den mikrobielle cellen er valgt fra gruppen bestående av Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizochytrium og Crythecodinium.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av vertscellen ifølge krav 4 for å produsere polypeptidet.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert polypeptid, kjennetegnet ved at det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et isolert polypeptid bestående av aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 4; (b) et isolert polypeptid kodet for av et nukleinsyremolekyl bestående av nukleotidsekvensen angitt i SEKV ID NR: 3; (c) et isolert polypeptid som er kodet for av et nukleinsyremolekyl bestående av en nukleotidsekvens som er minst 80% identisk med hele nukleotidsekvensen av SEKV ID NR: 3, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet; og (d) et isolert polypeptid bestående av en aminosyresekvens som er minst 50% identisk med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 4, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet.
Desaturase-polypeptid eller fragment derav har desaturaseaktivitet. Det kan ha et N-terminalt hemebindende mønster, f.eks. et cytokrom b5-liknende doméne som finnes i front-("front-end")-desaturaser. Det kan ha minst to, fortrinnsvis ca. 3, konserverende histidinmønstre som finnes i alle mikrosomale desaturaser, og har eventuelt desaturaseaktivitet.
Konstruksjonene inneholdende desaturase-genene kan anvendes i hvilket som helst ekspresjonssystem innbefattende planter, dyr og mikroorganismer for frembringelse av celler som kan produsere LCPUFA'er så som DHA, EPA, AA, SDA og GLA. Eksempler på planter som anvendes for ekspresjon av desaturasene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter blant annet planter og plantefrø fra oljefrø-dyrkningsplanter, f.eks. lin { Linum sp.), raps { Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), saflor ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.).
Ved et beslektet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye og forbedrede metoder for fremstilling av umettede fettsyrer, f.eks. LCPUFA'er, og andre nøkkelforbindelser fra biosynteseveien for umettede fettsyrer, med anvendelse av celler, f.eks. planteceller, dyreceller og/eller mikrobeceller hvor biosynteseveien for de umettede fettsyrer er blitt manipulert slik at LCPUFA'er eller andre ønskede umettede fettsyreforbindelser fremstilles.
De nye og forbedrede metodikker ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter metoder for fremstilling av umettede fettsyrer (f.eks. DHA) i celler hvor minst én fettsyredesaturase i biosynteseveien for umettede fettsyrer er manipulert slik at det produseres umettede fettsyrer (f.eks. produsert i et øket nivå). Oppfinnelsen tilveiebringer for eksempel metoder for fremstilling av en umettet fettsyre (f.eks. DHA) i celler omfattende minst ett isolert desaturase-nukleinsyre molekyl, f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 og/eller Fad6, eller en del derav, som beskrevet ovenfor, slik at det produseres en umettet fettsyre, f.eks. LCPUFA f.eks. DHA. Slike metoder kan videre omfatte det trinn å gjenvinne LCPUFA.
Ved en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å fremstille DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)), kjennetegnet ved at den omfatter transfektering eller transformering av en celle med det isolerte nukleinsyremolekylet ifølge krav 1 og dyrkning eller kultivering av cellen under betingelser slik at DHA, DPA, EPA eller AA blir produsert. Idet cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, en dyrecelle og en mikrobiell celle. Ifølge oppfinnelsen kan plantecellen være en celle fra en oljefrødyrkningsplante. Idet oljefrødyrkningsplanten er valgt fra gruppen bestående av lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.).
Fremgangsmåten ifølge krav 10, er videre kjennetegnet ved at den omfatter det trinnet å gjenvinne DHA, DPA, EPA eller AA.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for å fremstille DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)), kjennetegnet ved at den omfatter kontakting av et preparat omfattende minst et desaturase målmolekyl med minst et isolert polypeptid ifølge krav 9 under betingelser slik at DHA, DPA, EPA eller AA blir produsert. Idet denne fremgangsmåten videre omfatter det trinnet å gjenvinne DHA, DPA, EPA eller AA.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for frembringelse av en celle som er i stand til å produsere DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)) eller AA (20:4 (5,8,11,14)), kjennetegnet ved at den omfatter innføring inn i nevnte celle nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, hvor cellen inkorporerer fettsyremolekylet 22:5 (7,10,13,16,19), 22:4 (7,10,13,16), 20:4 (8, 11,14, 17) eller 20:3 (8, 11, 14).
idet cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, et dyrecelle og en mikrobiell celle. Nevnte plantecelle er en celle fra en oljefrøplante. Idet oljefrøplanten er lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.).
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for å modulere fremstillingen av DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4.7.10.13.16) ), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)), kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av cellen ifølge krav 4, slik at modulering av fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA forekommer. Idet fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA er forbedret. Denne fremgangsmåten er videre kjennetegnet ved at den videre omfatter gjenvinning av DHA, DPA, EPA eller AA.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for stor-skala fremstilling av DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5.8.11.14.17) ) eller AA (20:4 (5,8,11,14)), kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av cellen ifølge krav 4, slik at DHA , DPA, EPA eller AA blir produsert. Idet fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA er forbedret. Videre idet den videre omfatter gjenvinning av det fremstilte DHA, DPA, EPA eller AA.
Nukleinsyrene, proteinene og vektorene beskrevet ovenfor er spesielt anvendelige ved metodikkene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat, kjennetegnet ved at det omfatter polypeptidet ifølge krav 9.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat, kjennetegnet ved at det omfatter DHA, DPA, EPA eller AA fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 10.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat, kjennetegnet ved at det omfatter DHA, DPA, EPA eller AA produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 15.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat, kjennetegnet ved at det omfatter cellen produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 17.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat ifølge krav 27, kjennetegnet ved at preparatet blir anvendt i dyrefor.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat ifølge krav 28, kjennetegnet ved at preparatet blir anvendt i dyrefor.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre preparat ifølge krav 28, kjennetegnet ved at preparatet blir anvendt som et kosttilskudd.
Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av preparatet ifølge krav 27 for supplering av dietten til et menneske eller et dyr.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av preparatet ifølge krav 27 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en lidelse valgt fra gruppen bestående av stress, diabetes, kreft, inflammatoriske lidelser og kardiovaskulære lidelser.
Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av følgende detaljerte beskrivelse og krav.
Det vises nå til tegningene.
Fig. 1 viser DNA- og proteinsekvensen i Fad4 fra Thraustochytrium sp. ; (A) cDNA-sekvensen i den åpne leseramme (SEKV ID NR: 1); og (B) den translaterte proteinsekvens (SEKV ID NR: 2). Fig. 2 viser DNA- og proteinsekvensen for Fad5 fra Thraustochytrium sp. ; (A) cDNA-sekvensen i den åpne leseramme (SEKV ID NR: 4); og (B) den translaterte proteinsekvens (SEKV ID NR: 5). Fig. 3 viser en sammenlikning mellom Fad4- og Fad5-proteinsekvenser fra Thraustochytrium sp. (henholdsvis SEKV ID NR: 2 og 5). Den vertikale strek angir aminosyreidentitet. De konserverte mønstre så som cytokrom b5-hemebindings-og de histidinrike mønstre er fremhevet. De to pilene angir bindingsstedene for de to degenererte primere. Fig. 4 viser DNA- og proteinsekvensen for Fad5-2 fra Pythium irregulare; (A) cDNA-sekvensen i den åpne leseramme (SEKV ID NR: 7); og (B) den translaterte proteinsekvens (SEKV ID NR: 8). Fig. 5 viser DNA- og proteinsekvensen for Fad6-2 fra Pythium irregulare; (A) cDNA-sekvensen i den åpne leseramme (SEKV ID NR: 10); og (B) den translaterte proteinsekvens (SEKV ID NR: 11). Fig. 6 viser en sammenlikning mellom Fad5-2- og Fad6-proteinsekvenser fra Pythium irregulare (henholdsvis SEKV ID NR: 8 og 11). Den vertikale strek angir aminosyreidentitet. De konserverte mønstre så som cytokrom b5-hemebindings- og de histidinrike mønstre er fremhevet. De to pilene viser bindingsstedene for de to degenererte primere. Fig. 7 er en gasskromatografi-(GC)-analyse av fettsyremetylestere (FAMEY) fra gjærsoppstammen Invsc2, som uttrykker Fad4 med eksogent substrat 22:5 (n-3). Fig. 8 er en gasskromatografi/massespektroskopi-(MS)-analyse av FAMEY i den nye topp på fig. 7; (A) Fad4-produktet; (B) DHA-(22:6, n-3)-standarden. Fig. 9 er en GC-analyse av FAMEY fra gjærsoppstammen Invsc2 som uttrykker Fad4 med eksogent substrat 22:4 (n-6). Fig. 10 er en GC/MS-analyse av FAMEY i den nye topp på fig. 9; (A) Fad4-produktet; (B) DPA-(22:5, n-6)-standarden. Fig. 11 er en GC-analyse av FAMEY fra gjærsoppstamme Invsc2 som uttrykker Fad5 med eksogent substrat 20:3 (n-6). Fig. 12 er en GC/MS-analyse av FAMEY i den nye topp på fig. 11; (A) Fad4-produktet; (B) AA-(20:4-5,8,11,14)-standarden. Fig. 13 er en GC-analyse av FAMEY fra gjærsoppstamme AMY2a, som uttrykker Fad5-2 med henholdsvis eksogent substrat 18:1-9 (det øvre felt) og 18:1-11 (det nedre felt). Fig. 14 er en GC-analyse av FAMEY fra gjærsoppstamme Invsc2 som uttrykker Fad6 med eksogent substrat 18:2 (9,12). Fig. 15 er en MS-analyse av derivatet av den nye topp fra fig. 14. Strukturen av dietylamidet av den nye fettsyre er vist med m/z-verdier for ioner som innbefatter amid-delen. De tre par ioner ved m/z 156/168, 196/208 og 236/248 er diagnostiske for dobbeltbindinger i henholdsvis A6-, A9- og A12-stillingen. Fig. 16 er en GC-analyse av FAMEY fra bladene av Brassica juncea som uttrykker Fad4 under kontroll av 35S-promoter med eksogent tilført substrat 22:5 (n-3). Fig. 17 viser fettsyresammensetningen av vegetative vev (blader, stengler og røtter) fra én transgen T1-linje med Fad5-2 under kontroll av 35S-promoteren. Fettsyrenivåene er vist som vektprosentandelen av total mengde fettsyrer i B. juncea. Fig. 18 er en GC-analyse av rot-FAMEY av B. juncea som uttrykker Fad5-2 med eksogent substrat homo-y-linolensyre (HGLA, 20:3-8,11,14). Fig. 19 er en GC-analyse av FAMEY fremstilt ut fra frø av B. juncea som uttrykker Fad5-2 under kontroll av napin-promotoren. Fig. 20 er en GC-analyse avfrø-FAMEYfra B. juncea som uttrykker Fad6. Tre nye topper angir tre A6-desaturerte fettsyrer i transgene frø. Fig. 21 viser vektprosentandelen av GLA (y-linolensyre) og SDA (stearidonsyre) som opphopes i Fad6-transgene frø av B. juncea. Fig. 22 viser fettsyresammensetningene i frølipidene fra fem transgene linjer som uttrykker Fad6; SA=stearinsyre; OA=oljesyre; LA=linolsyre; GLA=y-linolensyre; ALA=o>linolensyre; SDA=stearidonsyre.
Fig. 23 er en tabell som viser fettsyreprofilen for Thraustochytrium sp.
Fig. 24 er en tabell som viser fettsyreprofilen for Pythium irregulare.
Fig. 25 er en tabell som viser omdannelsen av eksogene fettsyrer i gjærsopp AMY-2a/pFad5-2. Fig. 26 er en tabell som viser opphopningen av A5-umettede polymetylen-avbrutte fettsyrer (A5-UPIFA'er) i transgene linfrø som uttrykker Fad5-2 under kontroll av napin-(Napin)-promoteren og den linfrø-spesifikke (Cln) promoter. Fettsyrenivåene er vist som vektprosentandelen av den totale mengde fettsyrer.
Fig. 27 er en tabell som viser opphopning av A6-desaturerte fettsyrer i transgene linfrø (Solin og Normandy) som uttrykker Fad6 under kontroll av napin-promoteren. Fettsyrenivåene er vist som vektprosentandelen av den totale mengde fettsyrer.
Foreliggende oppfinnelse er i det minste delvis basert på oppdagelsen av nye fettsyredesaturase-familiemedlemmer, i det foreliggende omtalt om hverandre som "desaturaser" eller "desaturase"-nukleinsyre- og -proteinmolekyler (f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 og Fad-6). Disse nye molekyler er medlemmer av fettsyredesaturasefamilien og uttrykkes i LCPUFA-produserende organismer, f.eks. Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizichytrium og Crythecodinium.
Anvendt i det foreliggende er betegnelsen "fettsyrer" kjent på området og innbefatter en langkjedet hydrokarbon-basert karboksylsyre. Fettsyrer er komponenter i mange lipider innbefattende glycerider. De mest vanlige naturlig forekommende fettsyrer er monokarboksylsyrer som har et liketall av karbonatomer (16 eller 18) og som kan være mettede eller umettede. "Umettede" fettsyrer inneholder c/s-dobbeltbindinger mellom karbonatomene "Flerumettede" fettsyrer inneholder mer enn én dobbeltbinding, og dobbeltbindingene er anordnet i et metylen-avbrutt system
(-CH=CH-CH2-CH=CH-).
Fettsyrer er beskrevet i det foreliggende ved hjelp av et nummererings-system hvor tallet før kolon angir antallet karbonatomer i fettsyren, mens tallet etter kolon er antallet dobbeltbindinger som er til stede. Når det gjelder umettede fettsyrer, er dette fulgt av et tall i parentes, som angir dobbeltbindingenes stilling. Hvert tall i parentes er det lavest nummererte karbonatom av de to som er sammenknyttet ved hjelp av dobbeltbindingen. For eksempel kan oljesyre beskrives som 18:1(9), og linolsyren kan beskrives som 18:2(9,12), som angir 18 karbonatomer, henholdsvis én dobbeltbinding ved karbon 9 og to dobbeltbindinger ved henholdsvis karbonatomer 9 og 12.
Reguleringstrinnene ved fremstilling av umettede fettsyrer, dvs. biosynteseveien for umettede fettsyrer, katalyseres ved membrantilknyttede fettsyredesaturaser, f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 og/eller Fad6. Spesifikt katalyserer slike enzymer dannelsen av dobbeltbindinger mellom karbonatomene i et fettsyremolekyl. Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "biosyntesevei for umettede fettsyrer" en serie av kjemiske reaksjoner som fører til syntese av en umettet fettsyre enten in vivo eller in vitro. En slik vei innbefatter en serie desaturasjons- og forlengelsestrinn som frembringer umettede fettsyrer, og til slutt langkjedede flerumettede fettsyrer. Slike umettede fettsyrer kan innbefatte GLA 18:3 (6,9,12), SDA18:4 (6,9,12,15), AA20:4 (5,8,11,14), EPA20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4,7,10,13,16) og DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
Desaturaser kan inneholde et hemebindende mønster og/eller ca. 3 konserverende histidinmønstre, skjønt ytterligere doméner kan være til stede. Medlemmer i fettsyredesaturasefamilien omdanner mettede fettsyrer til umettede fettsyrer, f.eks. langkjedede flerumettede fettsyrer (LCPUFA'er), som er komponenter i cellemembraner i forskjellige vev og organeller i pattedyr (nerve-, retina-, hjerne- og immunceller). Eksempler på LCPUFA innbefatter blant annet docosaheksaensyre (DHA, 22:6(4,7,10,13,16,19)). Kliniske studier har vist at DHA er essensiell for vekst og utvikling av hjernen hos spedbarn, og for opprettholdelse av normal hjernefunksjon hos voksne (M. Martinetz (1992) J. Pediatr. 120:S129-S138). DHA har også virkninger på fotoreseptorfunksjon som inngår i signaloverføringsprosessen, rhodopsinaktivering samt stav- og tapputvikling (N.M. Giusto et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Dessuten ble positive virkninger av DHA også funnet ved behandlingen av sykdommer så som hypertensjon, artritt, aterosklerose, depresjon, trombose og kreft (L.A. Horrocks og Y.K. Yeo (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215). Desaturasemolekylene kan følgelig anvendes til fremstilling av LCPUFA'ene som er anvendelige ved behandling av sykdommer som er kjennetegnet ved avvikende regulert vekst, proliferasjon eller differensiering. Slike sykdommer innbefatter kreft, f.eks. karsinom, sarkom eller leukemi; tumorangiogenese og -metastase; skjelett-dysplasi; leversykdommer; myelodysplastiske syndromer; og hematopoietiske og/eller myeloproliferative sykdommer. Andre sykdommer som er knyttet til angiogenese, og som derfor er desaturase-tilknyttede sykdommer, innbefatter arvelig hemoragisk telangiektasi type 1, fibrodysplasia ossificans progressiva, idiopatisk pulmonalfibrose og Klippel-Trenaunay-Weber-syndromet.
Betegnelsen "familie" er, ved henvisning til protein- og nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, påtenkt å angi to eller flere proteiner eller nukleinsyremolekyler med et felles strukturelt doméne eller mønster, og med tilstrekkelig aminosyre- eller nukleotidsekvenshomologi som definert i det foreliggende. Slike familiemedlemmer kan være naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende og kan enten være fra samme eller forskjellige arter. For eksempel kan en familie inneholde et første protein av human opprinnelse samt forskjellige andre proteiner av human opprinnelse, eller den kan alternativt inneholde homologer av ikke-human opprinnelse, f.eks. rotte- eller museproteiner. Medlemmer av en familie kan også ha felles funksjonelle egenskaper.
Familien av desaturaseproteiner omfatter for eksempel ett cytokrom b5-hemebindende mønster. Anvendt i det foreliggende er betegnelsen "hemebindende mønster" en N-terminal forlengelse av det cytokrom b5-liknende doméne som finnes i front-desaturaser.
Medlemmer av desaturase-proteinfamilien kan omfatte et "histidinmønster" i proteinet, fortrinnsvis ca. tre eller fire histidinmønstre. Anvendt i det foreliggende innbefatter betegnelsen "histidinmønster" et proteindoméne med minst ca. to histidin-aminosyrerester, fortrinnsvis ca. tre eller fire histidin-aminosyrerester, og finnes typisk i alle mikrosomale desaturaser som det tredje konserverende histidinmønster.
Eksempler på cytokrom b5-hemebindende mønstre og histidinmønstre innbefatter aminosyrerestene 41-44, 182-186, 216-223 og 453-462 av SEKV ID NR: 2, aminosyrerestene 40-43, 171-175, 207-213 og 375-384 av SEKV ID NR: 5, aminosyrerestene 40-45, 171-176, 208-213 og 395-400 av SEKV ID NR: 8 og aminosyrerestene 42-47, 178-183, 215-220 og 400-405 av SEKV ID NR: 11, som vist på fig. 3 og 6.
Isolerte desaturaseproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse har en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som er tilstrekkelig homolog med SEKV ID NR: 3 eller 4. Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "tilstrekkelig homolog" en første aminosyre- eller nukleotidsekvens som inneholder et tilstrekkelig eller minimalt antall identiske eller ekvivalente (f.eks. en aminosyrerest som har en liknende sidekjede) aminosyre-rester eller nukleotider med en andre aminosyre- eller nukleotidsekvens slik at den første og andre aminosyre- eller nukleotidsekvens har felles strukturelle doméner eller mønstre og/eller en felles funksjonell aktivitet. Anvendt om hverandre i det foreliggende innbefatter en "desaturase-aktivitet", "biologisk aktivitet av en desaturase" eller "funksjonell aktivitet av en desaturase" en aktivitet som utøves eller formidles av et desaturaseprotein, -polypeptid- eller -nukleinsyremolekyl på en desaturase-responderende celle eller på et desaturasesubstrat, ifølge bestemmelse in vivo eller in vitro, i henhold til standardteknikker. En desaturaseaktivitet kan være en direkte aktivitet så som en forbindelse med et desaturase-målmolekyl. Anvendt i det foreliggende er et "målmolekyl" eller en "bindingspartner" et molekyl, f.eks. et molekyl som inngår ved syntese av umettede fettsyrer, f.eks. en middels fettsyre, som et desaturaseprotein bindes til eller interagerer med i naturen slik at det oppnås en desaturase-mediert funksjon. En direkte desaturaseaktivitet innbefatter også dannelse av en dobbeltbinding mellom karbonatomene i et fettsyremolekyl under dannelse av et umettet fettsyremolekyl.
Nukleotidsekvensen for den isolerte Thraustochytrium sp.-A4-desaturase, Fad4, cDNA og den forutsette aminosyresekvens som kodes av Fad4-cDNA, er vist henholdsvis på fig. 1 og i SEKV ID NR: 1 og 2. Thraustochytrium sp.-Fad4-genet (den åpne leseramme), som har en lengde på ca. 1560 nukleotider, koder for et protein med en molekylvekt på ca. 59,1 kD og som har en lengde på ca. 519 aminosyrerester.
Nukleotidsekvensen for Thraustochytrium sp.-A5-desaturasen, Fad5, cDNA og den forutsette aminosyresekvens som kodes av Fad5-cDNA, er vist henholdsvis på fig. 2 og i SEKV ID NR: 3 og 4. Thraustochytrium sp.-Fad5-genet (den åpne leseramme), som har en lengde på ca. 1320 nukleotider, koder for et protein med en molekylvekt på ca. 49,8 kD og som har en lengde på ca. 439 aminosyrerester.
Nukleotidsekvensen for Pythium irregulare-A5-desaturasen, Fad5-2, cDNA og den forutsette aminosyresekvens som kodes for av Fad5-2-cDNA, er vist henholdsvis på fig. 4 og i SEKV ID NR: 5 og 6. Pythium/'rregw/are-Fad5-2-genet, som har en lengde på ca. 1371 nukleotider, koder for et protein med en lengde på ca. 456 aminosyrerester.
Nukleotidsekvensen for Pythium /'rregu/are-A6-desaturase, Fad6, cDNA og den forutsette aminosyresekvens kodet av Fad6-cDNA er vist henholdsvis på fig. 5 og i SEKV ID NR: 7 og 8. Pythium irregulare- Fad6-genet, som har en lengde på ca. 1383 nukleotider, koder for et protein med en lengde på ca. 460 aminosyre-rester.
Forskjellige aspekter ved oppfinnelsen er beskrevet mer detaljert i følgende avsnitt:
I. Isolerte nukleins<y>remolek<y>ler
Det er beskrevet isolerte nukleinsyremolekyler som koder for desaturaseproteiner eller biologisk aktive deler derav, samt nukleinsyre-fragmenter som er tilstrekkelige for anvendelse som hybridiseringsprober til identifisering av desaturase-kodende nukleinsyremolekyler (f.eks. desaturase-mRNA) og fragmener for anvendelse som PCR-primere for amplifikasjon eller mutasjon av desaturase-nukleinsyremolekyler. Anvendt i det foreliggende skal betegnelsen "nukleinsyremolekyl" innbefatte DNA-molekyler (f.eks. cDNA eller genom-DNA) og RNA-molekyler (f.eks. mRNA) og analoger av DNA eller RNA frembrakt under anvendelse av nukleotidanaloger. Nukleinsyremolekylet kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget, men er fortrinnsvis dobbeltstrenget DNA.
Betegnelsen "isolert nukleinsyremolekyl" innbefatter nukleinsyremolekyler som er skilt fra andre nukleinsyremolekyler som finnes i den naturlige kilde til nukleinsyren. Når det for eksempel gjelder genom-DNA, innbefatter betegnelsen "isolert" nukleinsyremolekyler som er skilt fra kromosomet som genom-DNA er naturlig knyttet til. En "isolert" nukleinsyre er fortrinnsvis fri for sekvenser som naturlig flankerer nukleinsyrem (dvs. sekvenser som befinner seg i 5'- og 3'-endene av nukleinsyren) i genom-DNA hos organismen som nukleinsyren stammer fra. Ved forskjellige utførelsesformer kan det isolerte desaturase-nukleinsyremolekyl for eksempel inneholde mindre enn ca. 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb eller 0,1 kb nukleotidsekvenser som naturlig flankerer nukleinsyremolekylet i genom-DNA hos cellen som nukleinsyren stammer fra. Videre kan et "isolert" nukleinsyremolekyl, så som et cDNA-molekyl, være hovedsakelig fritt for annet cellemateriale eller dyrkningsmedium når det er fremstilt ved rekombinante teknikker, eller hovedsakelig fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier når det er kjemisk syntetisert.
Et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres under anvendelse av standard-molekylbiologiteknikker og sekvensinformasjonen tilveiebrakt i det foreliggende. Ved anvendelse av hele eller en del av nukleinsyresekvensene heri som hybridiseringsprober, kan desaturase-nukleinsyremolekyler isoleres under anvendelse av standard-hybridiserings- og - kloningsteknikker (f.eks. som beskrevet i J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Videre kan et nukleinsyremolekyl isoleres ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) under anvendelse av syntetiske oligonukleotidprimere utformet på basis av sekvensene heri.
En nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan amplifiseres under anvendelse av cDNA, mRNA eller alternativt genom-DNA som templat og passende oligonukleotidprimere i henhold til standard-PCR-amplifikasjonsteknikker. Den således amplifiserte nukleinsyre kan klones i en passende vektor og karakteriseres ved DNA-sekvensanalyse. Videre kan oligonukleotider svarende til desaturase-nukleotidsekvenser fremstilles ved hjelp av standard-synteseteknikker, f.eks. under anvendelse av et automatisert DNA-syntetiseringsapparat.
Et isolert nukleinsyremolekyl heri har en nukleotidsekvens som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% eller mer identisk med nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 3 (f.eks. med hele lengden av nukleotidsekvensen) eller en del av eller et komplement til hvilken som helst av disse nukleotidsekvensen Nukleinsyremolekylet kan ha en nukleotidsekvens som har en lengde på minst (eller ikke mer enn) 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 eller flere nukleotider og under stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer til et komplement av et nukleinsyremolekyl ifølge SEKV ID NR: 3.
Videre kan nukleinsyremolekylet heri omfatte bare en del av nukleinsyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 3, for eksempel et fragment som kan anvendes som probe eller primer, eller et fragment som koder for en del av et desaturaseprotein, f.eks. en biologisk aktiv del av et desaturaseprotein. Nukleotidsekvensen som bestemmes ved kloningen av desaturase-genet, muliggjør frembringelse av prober og primere utformet for anvendelse til identifisering og/eller kloning av andre desaturase-familiemedlemmer, samt desaturase-homologer fra andre arter. Proben/primeren (f.eks. oligonukleotid) omfatter typisk hovedsakelig renset oligonukleotid. Oligonukleotidet omfatter typisk en region av en nukleotidsekvens som under stringente betingelser hybridiserer til minst ca. 12 eller 15, fortrinnsvis ca. 20 eller 25, mer foretrukket ca. 30, 35,40, 45,
50, 55, 60, 65 eller 75 etter hverandre følgende nukleotider av en sensesekvens av SEKV ID NR: 3 en antisensesekvens av SEKV ID NR: 3, eller av en naturlig forekommende allel variant eller mutant av SEKV ID NR: 3.
Eksempler på prober eller primere har en lengde på minst (eller ikke mer enn) 12 eller 15, 20 eller 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 eller flere nukleotider og/eller omfatter etter hverandre følgende nukleotider av et isolert nukleinsyremolekyl beskrevet i det foreliggende. Heri inngår også prober eller primere omfattende sammenhengende eller etter hverandre følgende nukleotider av et isolert nukleinsyremolekyl beskrevet i det foreliggende, men for forskjellen på 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 baser i probe- eller primersekvensen. Prober basert på desaturase-nukleotidsekvensene kan anvendes til påvisning (f.eks. spesifikk påvisning) av transkripter eller genomsekvenser som koder for de samme eller homologe proteiner. Ved foretrukne utførelsesformer omfatter proben videre en tilknyttet merkegruppe; f.eks. kan merkegruppen være en radioisotop, en fluorescerende forbindelse, et enzym eller en enzym-kofaktor. Ved en annen utførelsesform er det tilveiebrakt et sett av primere, f.eks. primere egnet for anvendelse ved en PCR, som kan anvendes til amplifikasjon av en selektert region av en desaturasesekvens, f.eks. et doméne, en region, et sete eller annen sekvens beskrevet i det foreliggende. Primerne bør ha en lengde på minst 5,10 eller 50 basepar, og mindre enn 100 eller mindre enn 200 basepar. Primerne bør være identiske eller være forskjellige ved ikke mer enn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 baser sammenliknet med en sekvens beskrevet i det foreliggende eller med sekvensen i en naturlig forekommende kommende variant. Slike prober kan anvendes som en del av et diagnostisk testsett for identifisering av celler eller vev som feiluttrykker et desaturaseprotein, så som ved måling av et nivå av en desaturase-kodende nukleinsyre i en prøve av celler fra et individ, f.eks. påvisning av desaturase-mRNA-nivåer eller bestemmelse av om hvorvidt et genom-desaturasegen er blitt mutert eller utelukket.
Et nukleinsyrefragment som koder for en "biologisk aktiv del av et desaturaseprotein" kan fremstilles ved isolering av en del av nukleotidsekvensen ifølge SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7, som koder for et polypeptid med en biologisk desaturaseaktivitet (de biologiske aktiviteter av desaturaseproteinene er beskrevet i det foreliggende), ekspresjon av den kodede del av desturaseproteinet (f.eks. ved rekombinant ekspresjon in vitro) og vurdering av aktiviteten av den kodede del av desaturaseproteinet. Ved et eksempel har nukleinsyremolekylet en lengde på minst 50-100, 100-250, 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 eller flere nukleotider og koder for et protein med desaturase-aktivitet (som beskrevet i det foreliggende).
Nukleinsyremolekyler kan være forskjellige fra nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7 på grunn av degenerering av den genetiske kode, og som således koder for de samme desaturaseproteiner som dem som kodes for av nukleotidsekvensen vist i SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7. Et isolert nukleinsyremolekyl kan ha en nukleotidsekvens som koder for et protein med en aminosyresekvens som er forskjellig ved minst 1, men ikke mer enn 5,10, 20, 50 eller 100 aminosyrerester i forhold til aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8. Nukleinsyremolekylet kan kode for aminosyresekvensen i human desaturase. Hvis det trenges en innretting for denne sammenlikning, bør sekvensene innrettes for maksimal homologi.
Nukleinsyrevarianter kan være naturlig forekommende, så som allele varianter (samme locus), homologer (forskjellig locus) eller ortologer (forskjellige organismer), eller de kan være ikke naturlig forekommende. Ikke naturlig forekommende varianter kan lages ved mutageneseteknikker, innbefattende slike som anvendes for polynukleotider, celler eller organismer. Variantene kan inneholde nukleotidsubstitusjoner, -delesjoner, -inversjoner og -innskudd. Variasjon kan forekomme i én av eller begge de kodende og ikke-kodende regioner. Variasjonene kan gi både konserverende og ikke-konserverende aminosyresubstitusjoner (sammenliknet i det kodede produkt).
Allele varianter fremkommer for eksempel ved DNA-sekvenspolymorfismer i en populasjon (f.eks. den humane populasjon) som fører til forandringer i aminosyresekvensene i desaturaseproteinene. Slik genetisk polymorfisme i desaturasegenene kan finnes blant individer i en populasjon på grunn av naturlig allel variasjon.
Anvendt i det foreliggende angir betegnelsene "gen" og "rekombinant gen" nukleinsyremolekyler som innbefatter en åpen leseramme som koder for et desaturaseprotein, f.eks. oljefrø-desaturaseprotein, og kan videre innbefatte ikke-kodende regulatorsekvenser, samt introner.
Isolerte nukleinsyremolekyler som koder for en naturlig forekommende allel variant av et polypeptid omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8, hvor nukleinsyremolekylet for eksempel hybridiserer til et komplement av et nukleinsyremolekyl omfattende SEKV ID NR: 1,3,5 eller 7, under stringente hybridiseringsbetingelser er mulige.
Allele varianter av desaturase, f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6, innbefatter både funksjonelle og ikke-funksjonelle desaturaseproteiner. Funksjonelle allele varianter er naturlig forekommende aminosyresekvens-varianter av desaturaseproteinet som opprettholder evnen til f.eks. (i) å interagere med et desaturasesubstrat eller -målmolekyl (f.eks. en fettsyre, f.eks. DHA); og/eller (ii) å danne en dobbeltbinding mellom karbonatomer i et desaturasesubstrat eller -målmolekyl. Fettsyrene dannet av nukleinsyre- og proteinmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendelige ved behandling av forstyrrelser så som aldring, stress, diabetes, kreft, inflammatoriske forstyrrelser (f.eks. artritt, eksem) og kardiovaskulære forstyrrelser. Funksjonelle allele varianter vil typisk inneholde bare en konserverende substitusjon av én eller flere aminosyrer ifølge SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8 eller en substitusjon, en delesjon eller et innskudd av ikke-kritiske rester i ikke-kritiske regioner av proteinet.
Ikke-funksjonelle allele varianter er naturlig forekommende aminosyresekvens-varianter av desaturaseproteinet, f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6, som ikke har evne til f.eks. (i) å interagere med et desaturasesubstrat eller-målmolekyl (f.eks. en middels fettsyre, så som 18:4 (6,9,12,15)); og/eller (ii) å danne en dobbeltbinding mellom karbonatomer i et desaturasesubstrat eller -målmolekyl. Ikke-funksjonelle allele varianter vil typisk inneholde en ikke-konserverende substitusjon, en delesjon eller et innskudd, eller prematur avkutting av aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8, eller en substitusjon, et innskudd eller en delesjon i avgjørende rester eller avgjørende regioner av proteinet.
Ortologer (f.eks. humane ortologer til desaturaseproteinene) er beskrevet. Ortologer til Thraustochytrium sp.- og Pythium/'rregu/are-desaturaseproteinene er proteiner som er isolert fra andre organismer og har de samme desaturasesubstrat- eller -målmolekyl-bindende mekanismer, dobbeltbindingdannelsesmekanismer, moduleringsmekanismer for vekst og utvikling av hjernen hos spedbarn, opprettholdelsesmekanismer for normal hjernefunksjon hos voksne, evne til å påvirke fotoreseptorfunksjon som inngår ved signaltransduksjonsprosessen, evne til å påvirke rhodopsinaktivering, utviklingsmekanismer for staver og/eller tapper, og/eller moduleringsmekanismer for cellevekst- og/eller -proliferasjon som for de ikke-humane desaturaseproteiner. Ortologer til Thraustochytrium sp.- og Pythium /rregu/are-desaturaseproteinene kan lett identifiseres som å omfatte en aminosyresekvens som er hovedsakelig homolog med SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8.
For eksempel kan en annen desaturase-cDNA identifiseres basert på nukleotidsekvensen for Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6 For eksempel kan Schizochytrium eller Cortfrecoc//M/m-desaturase-cDNA identifiseres basert på nukleotidsekvensen for Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6.
Nukleinsyremolekyler svarende til naturlige allele varianter og homologer til desaturase-cDNA'er kan isoleres basert på sin homologi med desaturase-nukleinsyrene beskrevet i det foreliggende under anvendelse av cDNA'ene beskrevet i det foreliggende, eller en del derav, som hybridiserings-probe i henhold til standard-hybridiseringsteknikker under stringente hybridiseringsbetingelser.
Ortologe, homologe og allele varianter kan identifiseres ved anvendelse av metoder kjent på området (f.eks. hybridisering til et isolert nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel under stringente hybridiseringsbetingelser). Et isolert nukleinsyremolekyl kan ha en lengde på minst 15, 20, 25, 30 eller flere nukleotider, og hybridiserer under stringente betingelser til nukleinsyremolekylet omfattende nukleotidsekvensen ifølge SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7. Nukleinsyren kan ha en lengde på minst 50-100, 100-250, 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 eller flere nukleotider.
Anvendt i det foreliggende skal betegnelsen "hybridiserer under stringente betingelser" beskrive betingelser for hybridisering og vasking under hvilke nukleotidsekvenser som i det vesentlige er identiske eller homologe med hverandre, forblir hybridisert til hverandre. Fortrinnsvis er betingelsene slik at sekvenser som er minst ca. 70%, mer foretrukket minst ca. 80%, enda mer foretrukket minst ca. 85% eller 90% identiske med hverandre, forblir hybridisert til hverandre. Slike stringente betingelser er kjent for fagfolk på området og kan finnes i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., red., John Wiley & Sons, Inc. (1995), avsnitt 2, 4 og 5. Ytterligere stringente betingelser kan finnes i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), kapitler 7, 9 og 11. Et foretrukket, ikke-begrensende eksempel på meget stringente hybridiseringsbetingelser innbefatter hybridisering i 4X natriumklorid/natriumcitrat (SSC), ved ca. 65-70X (eller alternativt hybridisering i 4X SSC pluss 50% formamid ved ca. 42-50X), fulgt av én eller flere vaskinger i 1X SSC ved ca. 65-70X. Et foretrukket, ikke-begrensende eksempel på meget stringente hybridiseringsbetingelser innbefatter hybridisering i 1X SSC ved ca. 65-70°C (eller alternativt hybridisering i 1X SSC pluss 50% formamid ved ca. 42-50°), fulgt av én eller flere vaskinger i 0,3X SSC ved ca. 65-70X. Et foretrukket, ikke-begrensende eksempel på hybridiseringsbetingelser med redusert stringens innbefatter hybridisering i 4X SSC ved ca. 50-60X (eller alternativt hybridisering i 6X SSC pluss 50% formamid ved ca. 40-45X), fulgt av én eller flere vaskinger i 2X SSC ved ca. 50-60X. Områder som er mellomliggende i forhold til de ovenfor angitte verdier, f.eks. ved ca. 65-70X eller ved 42-50X, er også påtenkt å omfattes av foreliggende oppfinnelse. SSPE (1xSSPEerO,15 M NaCI, 10 mM NaH2P04og 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kan erstatte SSC (1X SSC i 0,15 M NaCI og 15 mM natriumcitrat) i hybridiserings- og vaskebufferne; vaskingene utføres i 15 minutter hver etter at hybridiseringen er fullført. Hybridiseringstempereaturen for hybrider som er antatt å ha en lengde på færre enn 50 basepar, bør være 5-10X mindre enn smeltetemperaturen (Tm) for hybridet, hvor Tm bestemmes i henhold til følgende likninger. For hybrider som har en lengde på mindre enn 18 basepar, er Tm(X) = 2(antall av A + T baser) + 4(antall av G + C baser). For hybrider med en lengde på mellom 18 og 49 basepar er Tm(X) = 81,5 + 16,6(logi0[Na<+>]) + 0,41 (%G+C) - (600/N), hvor N er antallet baser i hybridet og [Na<+>] er konsentrasjonen av natriumioner i hybridiserings-bufferen ([Na<+>] for 1X SSC = 0,165 M). En fagperson på området vil også være klar over at ytterligere reagenser kan tilsettes til hybridiserings- og/eller vaskebuffere for reduksjon av ikke-spesifikk hybridisering av nukleinsyremolekyler til membraner, for eksempel nitrocellulose- eller nylonmembraner, innbefattende, men ikke begrenset til, blokkeringsmidler (f.eks. BSA eller lakse- eller sildespermie-bærer-DNA), detergenter (f.eks. SDS), chelateringsmidler (f.eks. EDTA), Ficoll, PVP og liknende. Ved anvendelse av nylonmembraner spesielt, er et ytterligere foretrukket, ikke-begrensende eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser hybridisering i 0,25-0,5 M NaH2P04, 7% SDS ved ca. 65°C, fulgt av én eller flere vaskinger ved 0,02 M NaH2P04,1% SDS ved 65°C (se f.eks. Church og Gilbert (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1991-1995) eller alternativt 0,2X SSC, 1% SDS.
Fortrinnsvis svarer et isolert nukleinsyremolekyl heri som under stringente betingelser hybridiserer til sekvensen ifølge SEKV ID NR: 1,3,5 eller 7, til et naturlig forekommende nukleinsyremolekyl. Anvendt i det foreliggende angir et "naturlig forekommende" nukleinsyremolekyl et RNA- eller DNA-molekyl med en nukleotidsekvens som forekommer i naturen (f.eks. koder for et naturlig protein).
I tillegg til naturlig forekommende allele varianter av desaturasesekvensene som kan finnes i populasjonen, vil en fagperson på området videre forstå at det kan innføres forandringer ved mutasjon i nukleotidsekvensene ifølge SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7, noe som fører til forandringer i aminosyresekvensen hos de kodede desaturaseproteiner, uten at desaturaseproteinenes funksjonelle evne forandres. For eksempel kan det utføres nukleotidsubstitusjoner som fører til aminosyresubstitusjoner ved "ikke-essensielle" aminosyrerester i sekvensen ifølge SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7. En "ikke-essensiell" aminosyrerest er en rest som kan være forandret fra villtypesekvensen av Fad4, Fad5, Fad5-2 og/eller Fad6 (f.eks. sekvensen ifølge SEKV ID NR: 2, 5, 8 eller 11) uten at den biologiske aktivitet forandres, mens en "essensiell" aminosyrerest er nødvendig for biologisk aktivitet. For eksempel er aminosyrerester som er konservert blant desaturaseproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. slike som finnes i et hemebindende mønster eller et histidinmønster, forutsett å være spesielt umottakelige for forandring. Videre er det ikke sannsynlig at ytterligere aminosyrerester som er konservert mellom desaturaseproteinene heri og andre medlemmer av
fettsyredesaturasefamilien er mottakelige for forandring.
Nukleinsyremolekyler som koder for desaturaseproteiner inneholdende forandringer i aminosyrerester som ikke er essensielle for aktiviteten kan forekomme. Slike desaturaseproteiner har en annen aminosyresekvens enn SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8, og bibeholder likevel biologisk aktivitet. Det isolerte nukleinsyremolekyl er en nukleotidsekvens som koder for et protein, hvor proteinet omfatter en aminosyresekvens som er minst ca. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% eller mer homolog med SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8, f.eks. med hele lengden av SEKV ID NR: 2, 5, 8 eller 11.
Et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et desaturaseprotein som er homologt til proteinet ifølge SEKV ID NR: 2, 4, 6 eller 8, kan frembringes ved innføring av én eller flere nukleotidsubstitusjoner, -addisjoner eller -delesjoner i nukleotidsekvensen ifølge SEKV ID NR: 1, 3, 5 eller 7, slik at det innføres én eller flere aminosyresubstitusjoner, -addisjoner eller -delesjoner i det kodede protein. Mutasjoner kan innføres i SEKV ID NR: 1,3,5 eller 7 ved hjelp av standardteknikker, så som seterettet mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Det utføres fortrinnsvis konserverende aminosyresubstitusjoner ved én eller flere forutsette ikke-essensielle aminosyrerester. En "konserverende aminosyre-substitusjon" er en substitusjon hvor aminosyreresten erstattes med en aminosyrerest med liknende sidekjede. Familier av aminosyrerester med liknende sidekjeder er blitt definert på området. Disse familier innbefatter aminosyrer med basiske sidekjeder (f.eks. lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (f.eks. asparaginsyre, glutaminsyre), uladde polare sidekjeder (f.eks. glycin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein, tryptofan), ikke-polare sidekjeder (f.eks. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin), beta-forgrenede sidekjeder (f.eks. treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (f.eks. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Følgelig blir en forutsett ikke-essensiell aminosyrerest i et desaturaseprotein fortrinnsvis erstattet med en annen aminosyrerest fra den samme sidekjedefamilie. Alternativt kan det ved en annen utførelsesform innføres mutasjoner vilkårlig langs hele eller en del av en desaturase-kodingssekvens, så som ved metningsmutagenese, og de resulterende mutanter kan screenes med henblikk på biologisk desaturaseaktivitet for identifisering av mutanter som bibeholder aktivitet. Etter mutagenese av SEKV ID NR: 1,3,5 eller 7, kan det kodede protein uttrykkes rekombinant og aktiviteten av proteinet bestemmes.
Et mutant desaturaseprotein kan analyseres med henblikk på sin evne til (i) å interagere med et desaturasesubstrat eller -målmolekyl (f.eks. en middels fettsyre); og/eller (ii) å danne en dobbeltbinding mellom karbonatomer i et desaturasesubstrat eller -målmolekyl.
II. Isolerte desaturaseproteiner
Det er beskrevet isolerte eller rekombinante desaturase-proteiner og - polypeptider, og biologisk aktive deler derav. Native desaturaseproteiner kan isoleres fra celler eller vevskilder ved en passende renseplan under anvendelse av standard-proteinrenseteknikker. Desaturaseproteiner kan fremstilles ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Alternativt til rekombinant ekspresjon kan et desaturaseprotein eller -polypeptid syntetiseres kjemisk under anvendelse av standard-peptidsynteseteknikker.
Et "isolert" eller "renset" protein eller biologisk aktiv del derav er hovedsakelig fritt for cellemateriale eller andre forurensende proteiner fra celle-eller vevskilden som desaturaseproteinet stammer fra, eller hovedsakelig fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier ved kjemisk syntetisering. Uttrykket "hovedsakelig fritt for cellemateriale" innbefatter preparater av desaturaseprotein hvor proteinet er skilt fra cellekomponenter fra cellene som det er isolert fra eller rekombinant fremstilt ut fra. Uttrykket "hovedsakelig fritt for cellemateriale" innbefatter preparater av desaturaseprotein med mindre enn ca. 80%, 70%, 60%, 50%, 40% eller 30% (på tørrvektbasis) av ikke-desaturase-protein (også omtalt i det foreliggende som et "forurensende protein"), mer foretrukket mindre enn ca. 20% ikke-desaturase-protein, enda mer foretrukket mindre enn ca. 10% ikke-desaturase-protein og mest foretrukket mindre enn ca. 5% ikke-desaturase-protein. Når desaturaseproteinet eller en biologisk aktiv del derav er rekombinant fremstilt, er det også fortrinnsvis hovedsakelig fritt for dyrkningsmedium, dvs. at dyrkningsmedium representerer mindre enn ca. 20%, mer foretrukket mindre enn ca. 10%, og mest foretrukket mindre enn ca. 5% av volumet av proteinpreparatet.
Uttrykket "hovedsakelig fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier" innbefatter preparater av desaturaseprotein hvor proteinet er skilt fra kjemiske forløpere eller andre kjemikalier som inngår ved syntesen av proteinet. Uttrykket "hovedsakelig fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier" omfatter preparater av desaturaseprotein med mindre enn ca. 30% (på tørrvektbasis) av kjemiske forløpere eller ikke-desaturase-kjemikalier, mer foretrukket mindre enn ca. 20% kjemiske forløpere eller ikke-desaturase-kjemikalier, enda mer foretrukket mindre enn ca. 10% kjemiske forløpere eller ikke-desaturase-kjemikalier, og mest foretrukket mindre enn ca. 5% kjemiske forløpere eller ikke-desaturase-kjemikalier. Det må være klart at proteinene ifølge denne oppfinnelse også kan være i en form som er forskjellig fra deres tilsvarende naturlig forekommende proteiner, og/eller som fremdeles er i forbindelse med i det minste en del cellekomponenter. Proteinet kan for eksempel være knyttet til en cellemembran.
Anvendt i det foreliggende innbefatter en "biologisk aktiv del" av et desaturaseprotein et fragment av et desaturaseprotein som deltar i en interaksjon mellom et desaturasemolekyl og et ikke-desaturase-molekyl (f.eks. et desaturasesubstrat så som fettsyre). Biologisk aktive deler av et desaturaseprotein innbefatter peptider omfattende aminosyresekvenser som er tilstrekkelig homologe til eller avledet fra desaturase-aminosyresekvensene, f.eks. aminosyresekvensene vist i SEKV ID NR: 2, 5, 8 eller 11, som innbefatter tilstrekkelige aminosyrerester til å oppvise minst én aktivitet som hos et desaturaseprotein. Biologisk aktive deler omfatter typisk et doméne eller mønster med minst én aktivitet som hos desaturaseproteinet; evnen til (i) å interagere med et desaturasesubstrat eller -målmolekyl (f.eks. en middels fettsyre); og/eller (ii) å danne en dobbeltbinding mellom karbonatomer i et desaturasesubstrat eller -målmolekyl. En biologisk aktiv del av et desaturaseprotein kan være et polypeptid som for eksempel har en lengde på 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 eller flere aminosyrer.
En biologisk aktiv del av et desaturase-protein kan omfatte et hemebindende mønster og/eller minst ett histidinmønster, fortrinnsvis ca. tre histidinmønstre. Videre kan andre biologisk aktive deler hvor andre regioner av proteinet er utelukket, fremstilles ved rekombinante teknikker og evalueres med henblikk på én eller flere av de funksjonelle aktiviteter av det native desaturase-protein.
For bestemmelse av den prosentvise identitet av to aminosyresekvenser eller to nukleinsyresekvenser blir sekvensene innrettet på linje for optimale sammenlikningsformål (f.eks. kan det innføres "gap" i én eller begge av en første og en andre aminosyre- eller nukleinsyresekvens for optimal innrettning, og ikke-homologe sekvenser kan ignoreres for sammenlikningsformål). Lengden av en referansesekvens som er innrettet for sammenlikningsformål er minst 30%, fortrinnsvis minst 40%, mer foretrukket minst 50%, enda mer foretrukket minst 60% og enda mer foretrukket minst 70%, 80% eller 90% av lengden av referansesekvensen (f.eks. ved innrettning av en andre sekvens med Fad4-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 2 med 519 aminosyrerester, er minst 156, fortrinnsvis minst 208, mer foretrukket minst 260, enda mer foretrukket minst 311 og enda mer foretrukket minst 363, 415 eller 467 aminosyrerester innrettet på linje; ved innretting av en andre sekvens med Fad5-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 4 med 439 aminosyrerester, er minst 132, fortrinnsvis minst 176, mer foretrukket minst 220, enda mer foretrukket minst 263, og enda mer foretrukket minst 307, 351 eller 395 aminosyrerester innrettet; ved innrettning av en andre sekvens med Fad5-2-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 6 med 456 aminosyrerester er minst 137, fortrinnsvis minst 182, mer foretrukket minst 228, enda mer foretrukket minst 273, og enda mer foretrukket minst 319, 365 eller 419 aminosyrerester innrettet på linje; ved innretting av en andre sekvens med Fad6-aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 8 med 460 aminosyrerester, er minst 138, fortrinnsvis minst 184, mer foretrukket minst 230, enda mer foretrukket minst 276, og enda mer foretrukket minst 322, 368 eller 414 aminosyrerester innrettet). Aminosyrerestene eller nukleotidene ved tilsvarende aminosyrestillinger eller nukleotidstillinger blir så sammenliknet. Når en stilling i den første sekvens er opptatt av den samme aminosyrerest eller nukleotid som den tilsvarende stilling i den andre sekvens, er molekylene identiske i denne stilling (anvendt i det foreliggende er aminosyre- eller nukleinsyre-"identitet" ekvivalent med aminosyre-eller nukleinsyre-"homologi"). Den prosentvise identitet mellom de to sekvenser er en funksjon av antallet identiske stillinger som deles av sekvensene, idet man tar hensyn til antallet "gap", og lengden av hvert "gap", som må innføres for optimal innretting av de to sekvenser.
Sammenlikningen av sekvenser og bestemmelse av prosentvis identitet mellom to sekvenser kan utføres under anvendelse av en matematisk algoritme. Den prosentvise identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved anvendelse av Needleman og Wunsch- (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))-algoritmen som er blitt innlemmet i GAP-programmet i GCG-programvarepakken (tilgjengelig på http:// www. gcg. com) under anvendelse av enten en Blossum 62-matrise eller en PAM250-matrise, og en gapvekt på 16, 14, 12, 10, 8, 6 eller 4 og en lengdevekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6. Den prosentvise identitet mellom to nukleotidsekvenser bestemmes ved anvendelse av GAP-programmet i GCG-programvare-pakken (tilgjengelig på på http:// www. qcq. com) under anvendelse av en NWSgapdna.CMP-matriks og en gapvekt på 40, 50, 60, 70 eller 80 og en lengdevekt på 1, 2, 3, 4, 5 eller 6. Et foretrukket, ikke-begrensende eksempel på parametere for anvendelse i forbindelse med GAP-programmet innbefatter en Blosum 62-bedømmelsesmatriks med en gap-"straff" ("penalty") på 12, en gapforlengelses-straff på 4, og en rammeskift-gap-straff på 5.
Den prosentvise identitet mellom to aminosyre- eller nukleotidsekvenser bestemmes ved anvendelse av algoritmen ifølge Meyers og Miller ( Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) som er blitt innlemmet i ALIGN-programmet (versjon 2.0 eller versjon 2.0U) under anvendelse av en PAM120-vektrest-tabell, en gaplengde-straff på 12 og en gap-straff på 4.
Nukleinsyre- og proteinsekvensene heri kan videre anvendes som en "spørresekvens" for utførelse av et søk mot offentlige databaser for eksempel for identifisering av andre familiemedlemmer eller beslektede sekvenser. Slike søk kan utføres under anvendelse av NBLAST- og XBLAST-programmene (versjon
2.0) ifølge Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST-nukleotidsøk kan utføres med NBLAST-programmet, poeng = 100, ordlengde = 12, for oppnåelse av nukleotidsekvenser som er homologe med desaturase-nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen. BLAST-proteinsøk kan utføres med XBLAST-programmet, poeng = 50, ordlengde = 3, for oppnåelse av aminosyresekvenser som er homologe med desaturaseproteinmolekyler ifølge oppfinnelsen. For oppnåelse av innretninger med gap for sammenlikningsformål kan BLAST med mellomrom ("Gapped BLAST") anvendes som beskrevet i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ved anvendelse av BLAST- og "Gapped BLAST"-programmer kan default-parameterne for de respektive programmer (f.eks. XBLAST og NBLAST) anvendes. Se http:// www. ncbi. nlm. nih. gov.
III. Metoder for fremstilling av umettede fettsyrer
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye og forbedrede metoder for fremstilling av umettede fettsyrer, f.eks. LCPUFA'er, så som DHA (docosaheksaensyre, 22:6 (n-6)), DPA (docosapentaensyre, 22:5 (n-6)), AA (Arakidonsyre, 20:4 (n-6)) og EPA (eicosapentaensyre, 20:5 (n-3)).
A. Rekombinante celler og metoder for dyrkning av celler
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre rekombinante vektorer som innbefatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
Betegnelsen rekombinant vektor innbefatter en vektor (f.eks. et plasmid) som er blitt forandret, modifisert eller konstruert slik at den inneholder større, færre eller andre nukleinsyresekvenser enn dem som inngår i den native vektor eller plasmid. Ved én utførelsesform innbefatter en rekombinant vektor nukleinsyresekvensen som koder for minst ett fettsyredesaturaseenzym operabelt knyttet til regulatorsekvenser. Uttrykket "operabelt knyttet til regulatorsekvens(er)" betyr at den aktuelle nukleotidsekvens er knyttet til regulatorsekvensen(e) på en måte som muliggjør ekspresjon (f.eks. forsterket, øket, konstitutiv, basal, svekket, redusert eller undertrykket ekspresjon) av nukleotidsekvensen, fortrinnsvis ekspresjon av et genprodukt som kodes for av nukleotidsekvensen (f.eks. når den rekombinante vektor innføres i en celle). Eksempler på vektorer er beskrevet mer detaljert i det foreliggende samt for eksempel i Frascotti et al., US-patent nr. 5 721 137.
Betegnelsen "regulatorsekvens" innbefatter nukleinsyresekvenser som påvirker (f.eks. modulerer eller regulerer) ekspresjon av andre (ikke-regulerende) nukleinsyresekvenser. Ved én utførelsesform inngår en regulatorsekvens i en rekombinant vektor i en liknende eller identisk stilling og/eller orientering i forhold til et spesielt aktuelt gen, som observert for den aktuelle regulatorsekvens og gen slik det finnes i naturen, f.eks. i nativ stilling og/eller orientering. For eksempel kan et aktuelt gen (f.eks. et Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-gen) innlemmes i en rekombinant vektor operabelt knyttet til en regulatorsekvens som ledsager eller er i nabostilling til genet i den naturlige organisme (f.eks. operabelt knyttet til "nativ" Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-regulatorsekvens (f.eks. til den "native" Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-promoter). Alternativt kan et aktuelt gen (f.eks. et Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-gen) innlemmes i en rekombinant vektor operabelt knyttet til en regulatorsekvens som ledsager eller er i nabostilling til et annet (f.eks. et annerledes) gen i den naturlige organisme. For eksempel kan et Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-gen innlemmes i en vektor operabelt knyttet til ikke-Fad4-, - Fad5-,-Fad5-2- eller -Fad6-regulatorsekvenser. Alternativt kan et aktuelt gen (f.eks. et Fad4-, Fad5-, Fad5-2- eller Fad6-gen) innlemmes i en vektor operabelt knyttet til en regulatorsekvens fra en annen organisme. For eksempel kan regulatorsekvenser fra andre mikrober (f.eks. andre bakterie-regulator-sekvenser, bakteriofag-regulatorsekvenser og liknende) være operabelt knyttet til et spesielt aktuelt gen.
Foretrukne regulatorsekvenser innbefatter promotere, forsterkere, termineringssignaler og andre ekspresjonskontrollelementer (f.eks. bindingsseter for transkripsjonene og/eller translasjonene regulatorproteiner, for eksempel i den transkriberte mRNA). Slike regulatorsekvenser er for eksempel beskrevet i J. Sambrook, E.F. Fritsh og T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Regulatorsekvenser innbefatter slike som styrer konstitutiv ekspresjon av en nukleotidsekvens i en celle (f.eks. konstitutive promotere og sterke konstitutive promotere), slike som styrer induserbar ekspresjon av en nukleotidsekvens i en celle (f.eks. induserbare promotere, for eksempel xylose-induserbare promotere) og slike som svekker eller undertrykker ekspresjon av en nukleotidsekvens i en celle (f.eks. svekkingssignaler eller repressorsekvenser). Det er også innenfor foreliggende oppfinnelses ramme å regulere ekspresjonen av et aktuelt gen ved fjerning eller utelukkelse av regulatorsekvenser. For eksempel kan sekvenser som inngår ved negativ regulering av transkripsjon, fjernes slik at ekspresjon av et aktuelt gen forsterkes.
En rekombinant vektor kan inneholde en terminatorsekvens eller terminatorsekvenser (f.eks. transkripsjonsterminatorsekvenser). Betegnelsen "terminatorsekvenser" innbefatter regulatorsekvenser som tjener til terminering av transkripsjon av mRNA. Terminatorsekvenser (eller tandem-transkripsjonsterminatorer) kan videre tjene til stabilisering av mRNA (f.eks. ved tilføying av struktur til mRNA), for eksempel overfor nukleaser.
Vektoren kan inneholde antibiotikaresistens-sekvenser. Betegnelsen "antibiotikaresistens-sekvenser" innbefatter sekvenser som understøtter eller gir resistens til antistoffer på vertsorganismen. Ved én utførelsesform er antibiotikaresistens-sekvensene valgt fra gruppen bestående av cat-(kloramfenikolresistens), tet- (tetracyklinresistens)-sekvenser, erm-(erytromycin-resistens)-sekvenser, neo-(neomycinresistens)-sekvenser og spec-(spectinomycinresistens)-sekvenser. Rekombinante vektorer kan videre innbefatte homologe rekombinasjonssekvenser (f.eks. sekvenser som er utformet til å muliggjøre rekombinasjon av det aktuelle gen i kromosomet hos vertsorganismen). For eksempel kan amy£-sekvenser anvendes som homologi-mål for rekombinasjon i vertskromosomet.
Betegnelsen "manipulert celle" innbefatter en celle som er blitt konstruert (f.eks. ved genteknologi) eller modifisert slik at cellen har minst én fettsyredesaturase, f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 og/eller Fad6, slik at det produseres en umettet fettsyre. Modifisering eller konstruering av slike mikroorganismer kan skje i henhold til hvilken som helst metodikk beskrevet i det foreliggende, innbefattende, men ikke begrenset til, deregulering av en biosyntesevei og/eller overekspresjon av minst ett biosyntese-enzym. Et "manipulert" enzym (f.eks. et "manipulert" biosynteseenzym) innbefatter et enzym hvis ekspresjon eller produksjon er blitt forandret eller modifisert slik at minst én oppstrøms eller nedstrøms forløper, substrat eller produkt av enzymet er forandret eller modifisert, for eksempel sammenliknet med et tilsvarende villtype- eller naturlig forekommende enzym.
Betegnelsen "overuttrykt" eller "overekspresjon" innbefatter ekspresjon av et genprodukt (f.eks. en fettsyredesaturase) i et større nivå enn det som uttrykkes før manipulering av cellen eller i en sammenliknbar celle som ikke er blitt manipulert. Cellen kan manipuleres genetisk (f.eks. konstrueres genetisk) til å overuttrykke et nivå av genprodukt større enn det som uttrykkes før manipulering av cellen, eller i en sammenliknbar celle som ikke er blitt manipulert. Genmanipulasjon kan innbefatte, men er ikke begrenset til, forandring eller modifisering av regulatorsekvenser eller seter som er forbundet med ekspresjon av et spesielt gen (f.eks. ved tilsetting av sterke promotere, induserbare promotere eller multiple promotere eller ved fjerning av regulatorsekvenser slik at ekspresjonen er konstitutiv), modifisering av kromosomlokasjonen for et spesielt gen, forandring av nukleinsyresekvenser i nabostilling til et spesielt gen så som et ribosombindende sete eller transkripsjonsterminator, øking av kopiantallet av et spesielt gen, modifisering av proteiner (f.eks. regulatorproteiner, undertrykkere, forsterkere, transkripsjonsaktivatorer og liknende) som inngår ved transkripsjon av et spesielt gen og/eller translasjon av et spesielt genprodukt, eller hvilken som helst annen vanlig metode til deregulering av ekspresjonen av et spesielt gen som er rutine på området (innbefattende, men ikke begrenset til, anvendelse for eksempel av antisense-nukleinsyremolekyler til blokkering av ekspresjon av repressorproteiner).
Cellen kan manipuleres fysisk eller miljømessig til å overuttrykke et genproduktnivå som er større enn det som ble uttrykt før manipulering av cellen eller i en sammenliknbar celle som ikke er blitt manipulert. En celle kan for eksempel behandles med, eller dyrkes i nærvær av, et middel som er kjent for eller som man har mistanke om øker transkripsjonen av et spesielt gen og/eller translasjonen av et spesielt genprodukt slik at transkripsjonen og/eller translasjonen forsterkes eller økes. Alternativt kan en celle dyrkes ved en temperatur som er valgt for å øke transkripsjon av et spesielt gen og/eller translasjon av et spesielt genprodukt slik at transkripsjon og/eller translasjon forsterkes eller økes.
Betegnelsen "deregulert" eller "deregulering" innbefatter forandring eller modifikasjon av minst ett gen i en celle som koder for et enzym i en biosyntesevei, slik at nivået eller aktiviteten av biosyntese-enzymet i cellen forandres eller modifiseres. Fortrinnsvis blir minst ett gen som koder for et enzym i en biosyntesevei, forandret eller modifisert slik at genproduktet forsterkes eller økes. Uttrykket "deregulert vei" kan også innbefatte en biosyntesevei hvor mer enn ett gen som koder for et enzym i en biosyntesevei, blir forandret eller modifisert slik at aktivitetsnivået for mer enn ett biosyntese-enzym forandres eller modifiseres. Evnen til å "deregulere" en vei (f.eks. til samtidig å deregulere mer enn ett gen i en gitt biosyntesevei) i en celle fremkommer ved det spesielle fenomen hos celler hvor mer enn ett enzym (f.eks. to eller tre biosyntese-enzymer) kodes for av gener som finnes i nabostilling til hverandre på et tilstøtende stykke genmateriale betegnet et "operon".
Betegnelsen "operon" innbefatter en koordinert enhet av genekspresjon som inneholder en promoter og eventuelt et regulatorelement forbundet med ett eller flere, fortrinnsvis minst to, strukturelle gener (f.eks. gener som koder for enzymer, for eksempel biosyntese-enzymer). Ekspresjon av de strukturelle gener kan reguleres koordinert, for eksempel ved regulatorproteiner som bindes til regulatorelementet, eller ved anti-terminering av transkripsjon. De strukturelle gener kan transkriberes slik at det fås en enkelt-mRNA som koder for alle de strukturelle proteiner. På grunn av den koordinerte regulering av gener som inngår i et operon, kan forandring eller modifikasjon av enkelt-promoter- og/eller regulatorelementet resultere i forandring eller modifikasjon av hvert genprodukt som kodes for av operonet. Forandring eller modifikasjon av regulatorelementet kan innbefatte, men er ikke begrenset til, fjerning av det (de) endogene promoter-og/eller regulatorelement(er), tilsetting av sterke promotere, induserbare promotere eller multiple promotere, eller fjerning av regulatorsekvenser slik at ekspresjon av genproduktene modifiseres, under modifisering av operonets kromosomale lokasjon, forandring av nukleinsyresekvenser i nabostilling til operonet eller i operonet, så som et ribosombindende sete, øking av operonets kopiantall, modifisering av proteiner (f.eks. regulatorproteiner, undertrykkere, forsterkere, tanskripsjonsaktivatorer og liknende) som inngår ved transkripsjon av operonet og/eller translasjon av operonets genprodukter, eller hvilken som helst annen konvensjonell metode for deregulering av ekspresjon av gener, som er rutine på området (innbefattende, men ikke begrenset til, anvendelse av antisense-nukleinsyremolekyler, for eksempel til blokkering av repressorproteiner). Deregulering kan også innbefatte forandring av kodingsregionen av ett eller flere gener, hvorved det for eksempel fås et enzym som er feedback-resistent eller har høyere eller lavere spesifikk aktivitet.
En spesielt foretrukket "rekombinant" celle er blitt genteknologisk fremstilt til å overuttrykke et planteavledet gen eller genprodukt eller et mikroorganisme-avledet gen eller genprodukt. For eksempel innbefatter betegnelsen "planteavledet", "mikroorganisme-avledet" eller "avledet fra" et gen som finnes naturlig i en mikroorganisme eller en plante, f.eks. en oljefrøplante, eller et genprodukt (f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6) som kodes for av et plantegen eller et gen fra en mikroorganisme (f.eks. kodet SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5 eller SEKV ID NR: 7).
Metodikkene heri tilveiebringer rekombinante celler som overuttrykker minst én fettsyredesaturase. En rekombinant celle er blitt genteknologisk fremstilt til å overuttrykke en Thraustochytrium sp.-fettsyredesaturase (f.eks. er blitt genteknologisk fremstilt til å overuttrykke minst én Thraustochytrium sp. A4- eller A5-desaturase (Fad4- eller Fad5-genproduktet) (f.eks. en fettsyredesaturase med aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 2 eller 4 eller som kodes for av nukleinsyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 1 eller 3).
En rekombinant celle er blitt genteknologisk fremstilt til å overuttrykke en Pythium irregulare A5- eller A6-desaturase (Fad5-2- eller Fad6-genproduktet)
(f.eks. en fettsyredesaturase med aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 6 eller 8, eller som kodes for av et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEKV ID NR: 5 eller 5).
Det er mulig å modulere fremstillingen av fettsyrer, omfattende dyrking av celler transformert ved hjelp av nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. en desaturase) slik at modulering av fettsyreproduksjonen finner sted (f.eks. blir produksjonen av umettede fettsyrer forsterket). Metoden for dyrking av celler som er transformert ved nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. Fad4, Fad5, Fad5-2 og Fad6) under modulering av produksjonen av fettsyrer omtales i det foreliggende som "biotransformasjon". Biotransformasjonsprosessene kan anvende rekombinante celler og/eller desaturaser beskrevet i det foreliggende. Betegnelsen "biotransformasjonsprosess", også omtalt i det foreliggende som "bioomdannelsesprosesser", innbefatter biologiske prosesser som resulterer i dannelse (f.eks. transformasjon eller omdannelse) av hvilken som helst forbindelse (f.eks. substrat, mellomprodukt eller produkt) som er oppstrøms for en fettsyredesaturase, til en forbindelse (f.eks. substrat, mellomprodukt eller produkt) som er nedstrøms for en fettsyredesaturase, spesielt en umettet fettsyre. En biotransformasjonsprosess for fremstilling av en umettet fettsyre kan omfatte at en celle som overuttrykker minst én fettsyredesaturase, bringes i kontakt med minst ett passende substrat under slike betingelser at det dannes en umettet fettsyre, og eventuelt gjenvinnes fettsyren. En biotransformasjonsprosess for fremstilling av umettede fettsyrer kan utføres, som omfatter at en celle som overuttrykker Fad4, Fad5, Fad5-2 eller Fad6, bringes i kontakt med et passende substrat (f.eks. en middels fettsyre) under slike betingelser at det dannes en umettet fettsyre (f.eks. DHA, SDA eller GLA), og eventuelt gjenvinnes den umettede fettsyre. Betingelser under hvilke det dannes en umettet fettsyre kan innbefatte hvilke som helst betingelser som resulterer i den ønskede dannelse av en umettet fettsyre.
Cellen(e) og/eller enzymene som anvendes ved biotransformasjons-reaksjonene, er i en form som muliggjør at de kan utføre sin påtenkte funksjon (f.eks. produsere en ønsket fettsyre). Cellene kan være hele celler, eller de kan være bare de deler av cellene som er nødvendige for oppnåelse av det ønskede sluttresultat. Cellene kan oppslemmes (f.eks. i en passende oppløsning så som bufrede oppløsninger eller medier), skylles (f.eks. skylles fri for medium fra dyrkingen av cellen), acetontørkes, immobiliseres (f.eks. med polyakrylamid-gel eller k-karragenan eller på syntetiske bærere, for eksempel kuler, matrikser og liknende), fikseres, kryssbindes eller permeabiliseres (f.eks. ha permeabiliserte membraner og/eller vegger slik at forbindelser, f.eks. substrater, mellomprodukter eller produkter lettere kan passere gjennom membranen eller veggen). Celletypen kan være hvilken som helst celle som kan anvendes ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, f.eks. plante- dyre- eller mikrobeceller.
Dyrking av den rekombinante plante eller dyrking av de rekombinante mikroorganismer beskrevet i det foreliggende kan utføres, slik at det dannes en ønsket forbindelse (f.eks. en ønsket umettet fettsyre). Betegnelsen "dyrking" innbefatter opprettholdelse og/eller dyrking av en levende mikroorganisme ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. opprettholdelse og/eller dyrking av en kultur eller stamme). En mikroorganisme kan dyrkes i flytende medium eller i fast medium eller halvfast medium. En mikroorganisme blir dyrket i medium (f.eks. et sterilt, flytende medium) omfattende næringsstoffer som er essensielle eller fordelaktige for opprettholdelse og/eller vekst av mikroorganismen (f.eks. karbonkilder eller karbonsubstrat, for eksempel komplekse karbohydrater så som bønne- eller kornmel, stivelsestyper, sukkerarter, sukkeralkoholer, hydrokarboner, oljer, fett, fettsyrer, organiske syrer og alkoholer; nitrogen kilder, for eksempel vegetabilske proteiner, peptoner, peptider og aminosyrer som stammer fra korn, bønner og knoller, proteiner, peptider og aminosyrer som stammer fra animalske kilder så som kjøtt, melk og animalske biprodukter så som peptoner, kjøttekstrakter og kaseinhydrolysater; uorganiske nitrogenkilder så som urea, ammoniumsulfat, ammoniumklorid, ammoniumnitrat og ammoniumfosfat; fosforkilder, for eksempel fosforsyre, natrium- og kaliumsalter derav; sporelementer, for eksempel magnesium, jern, mangan, kalsium, kobber, sink, bor, molybden og/eller koboltsalter; samt vekstfaktorer så som aminosyrer, vitaminer, vekstpromotere og liknende).
Fortrinnsvis dyrkes mikroorganismer under regulert pH. Betegnelsen "regulert pH" innbefatter hvilken som helst pH-verdi som resulterer i dannelse av det ønskede produkt (f.eks. en umettet fettsyre). Ved én utførelsesform dyrkes mikroorganismer ved en pH på ca. 7. Ved en annen utførelsesform dyrkes mikroorganismer ved en pH på mellom 6,0 og 8,5. Den ønskede pH kan opprettholdes ved hjelp av en rekke metoder kjent for fagfolk på området.
Det er også foretrukket at mikroorganismene dyrkes under kontrollert lufttilførsel. Betegnelsen "kontrollert lufttilførsel" innbefatter tilstrekkelig lufttilførsel (f.eks. oksygen) til at det fås produksjon av det ønskede produkt (f.eks. en umettet fettsyre). Ved én utførelsesform blir lufttilførselen kontrollert ved regulering av oksygennivåene i kulturen, for eksempel ved regulering av mengden oksygen oppløst i dyrkningsmediet. Fortrinnsvis reguleres lufttilførselen til kulturen ved agitering av kulturen. Agitering kan tilveiebringes ved hjelp av en propell eller liknende mekanisk agitasjonsutstyr, ved rotasjon eller risting av vekstbeholderen (f.eks. fermenteringsinnretningen) eller ved hjelp av forskjellig pumpeutstyr. Lufttilførselen kan videre reguleres ved leding av steril luft eller oksygen gjennom mediet (f.eks. gjennom fermenteringsblandingen). Det er også foretrukket at mikroorganismene dyrkes uten alt for mye skumming (f.eks. ved tilsetting av antiskummidler).
Dessuten kan planter eller mikroorganismer dyrkes under regulerte temperaturer. Betegnelsen "regulert temperatur" innbefatter hvilken som helst temperatur som resulterer i dannelse av det ønskede produkt (f.eks. en umettet fettsyre). Ved én utførelsesform innbefatter regulerte temperaturer temperaturer på mellom 15 og 95°C. Ved en annen utførelsesform innbefatter regulerte temperaturer temperaturer på mellom 15 og 70°C. Foretrukne temperaturer er mellom 20 og 55°C, mer foretrukket mellom 30 og 45°C eller mellom 30 og 50°C.
Mikroorganismer kan dyrkes (f.eks. opprettholdes og/eller få utvikles) i flytende medier og blir fortrinnsvis dyrket, enten kontinuerlig eller intermittent, ved konvensjonelle dyrkningsmetoder så som fast kultur, testrørkultur, ristekultur (f.eks. roterende ristekultur, ristekolbekultur osv.), lufttilførsels-spinnerkultur, eller fermentering. Ved en foretrukket utførelsesform blir mikroorganismene dyrket i ristekolber. Ved en mer foretrukket utførelsesform blir mikroorganismene dyrket i en fermenteringsinnretning (f.eks. en fermenteringsprosess). Fermenterings-fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, sats-, tilførselssats- og kontinuerlige fermenteringsmetoder. Betegnelsen "satsprosess" eller "satsfermentering" angir et lukket system hvor sammensetningen av medier, næringsstoffer, supplerende additiver og liknende fastsettes ved begynnelsen av fermenteringen og ikke er underkastet forandring under fermenteringen; men det kan gjøres forsøk på å regulere faktorer som pH og oksygenkonsentrasjon for forhindring av for sterk surgjøring av mediet og/eller mikroorganisme-død. Betegnelsen "tilførselssats-prosess" eller "tilførselssats-fermentering" angir en satsfermentering med det unntak at det tilsettes ett eller flere substrater eller supplementer (f.eks. tilsettes i inkrementer eller kontinuerlig) etter hvert som fermenteringen skrider frem. Uttrykket "kontinuerlig prosess" eller "kontinuerlig fermentering" angir et system hvor et definert fermenteringsmedium tilsettes kontinuerlig til en fermenteringsinnretning, og en lik mengde av anvendt eller "kondisjonert" medium blir samtidig fjernet, fortrinnsvis for gjenvinning av det
ønskede produkt (f.eks. en umettet fettsyre). Forskjellige typer av slike prosesser er blitt utviklet og er velkjente på området.
Uttrykket "dyrking under slike betingelser at det dannes en ønsket forbindelse (f.eks. en umettet fettsyre, for eksempel DHA)" innbefatter opprettholdelse og/eller dyrking av planter eller mikroorganismer under betingelser (f.eks. temperatur, trykk, pH, varighet osv.) som er passende eller tilstrekkelige til at det oppnås produksjon av den ønskede forbindelse eller ønskede utbytter av den spesielle forbindelse som produseres. For eksempel fortsettes dyrkningen i et tidsrom som er tilstrekkelig til produksjon av den ønskede mengde av en umettet fettsyre (f.eks. DHA). Fortrinnsvis fortsettes dyrkningen i et tidsrom som er tilstrekkelig til at man i det vesentlige når maksimal produksjon av den umettede fettsyre. Ved én utførelsesform fortsettes dyrkningen i ca. 12-24 timer. Ved en annen utførelsesform fortsettes dyrkningen i ca. 24-36 timer, 36-48 timer, 48-72 timer, 72-96 timer, 96-120 timer, 120-144 timer eller mer enn 144 timer. Ved en annen utførelsesform fortsettes dyrkningen i et tidsrom som er tilstrekkelig til å nå produksjonsutbytter av umettede fettsyrer, for eksempel blir cellene dyrket slik at det frembringes minst ca. 15-20 g/l umettede fettsyrer, minst ca. 20-25 g/l umettede fettsyrer, minst ca. 25-30 g/l umettede fettsyrer, minst ca. 30-35 g/l umettede fettsyrer, minst ca. 35-40 g/l umettede fettsyrer (f.eks. minst ca. 37 g/l umettede fettsyrer) eller minst ca. 40-50 g/l umettede fettsyrer. Ved enda en annen utførelsesform blir mikroorganismene dyrket under slike betingelser at et foretrukket utbytte av umettede fettsyrer, for eksempel et utbytte i et område angitt ovenfor, frembringes innen ca. 24 timer, innen ca. 36 timer, innen ca. 48 timer, innen ca. 72 timer eller innen ca. 96 timer.
Ved produksjon av umettede fettsyrer kan det videre være ønskelig å dyrke celler ifølge foreliggende oppfinnelse i nærvær av supplerende fettsyrebiosyntesesubstrater. Betegnelsen "supplerende fettsyrebiosyntesesubstrat" innbefatter et middel eller en forbindelse som, når det bringes i kontakt med en celle eller innlemmes i dyrkningsmediet for en celle, tjener til å forsterke eller øke biosyntesen av umettede fettsyrer. Supplerende fettsyrebiosyntesesubstrater ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilsettes i form av en konsentrert oppløsning eller suspensjon (f.eks. i et egnet løsningsmiddel så som vann eller buffer) eller i form av et faststoff (f.eks. i form av et pulver). Videre kan supplerende fettsyrebiosyntesesubstrater ifølge foreliggende oppfinnelse tilsettes som en enkelt porsjon, kontinuerlig eller intermittent i løpet av et gitt tidsrom.
Metodikken ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre innbefatte et trinn for gjenvinning av en ønsket forbindelse (f.eks. en umettet fettsyre). Betegnelsen "gjenvinning" av en ønsket forbindelse innbefatter ekstrahering, høsting, isolering eller rensing av forbindelsen fra dyrkningsmedium. Gjenvinning av forbindelsen kan utføres i henhold til hvilken som helst konvensjonell isolasjons- eller rensemetodikk kjent på området, innbefattende, men ikke begrenset til, behandling med en konvensjonell harpiks (f.eks. anion- eller kationbytterharpiks, ikke-ionisk adsorpsjonsharpiks osv.), behandling med et konvensjonelt adsorpsjonsmiddel (f.eks. aktivert trekull, kiselsyre, silikagel, cellulose, aluminiumoksid osv.), forandring av pH, løsningsmiddelekstraksjon (f.eks. med et konvensjonelt løsningsmiddel så som en alkohol, etylacetat, heksan og liknende), dialyse, filtrering, konsentrering, krystallisering, omkrystallisering, pH-justering, lyofilisering og liknende. For eksempel kan en forbindelse gjenvinnes fra dyrkningsmedium ved at mikroorganismene først fjernes fra kulturen. Medium blir så ledet gjennom eller over en kationbytterharpiks for fjerning av uønskede kationer, og så gjennom eller over en anionbytterharpiks for fjerning av uønskede uorganiske anioner og organiske syrer med sterkere surheter enn den aktuelle umettede fettsyre (f.eks.
DHA).
En ønskelig forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis "ekstrahert", "isolert" eller "renset" slik at det resulterende preparat er hovedsakelig fritt for andre komponenter (f.eks. fritt for mediekomponenter og/eller fermenterings-biprodukter). Uttrykket "hovedsakelig fritt for andre komponenter" innbefatter preparater av ønsket forbindelse hvor forbindelsen er skilt (f.eks. renset eller delvis renset) fra mediekomponenter eller fermenterings-biprodukter fra kulturen som den er fremstilt ut fra. Ved én utførelsesform inneholder preparatet mer enn ca. 80% (på tørrvektbasis) av den ønskede forbindelse (f.eks. mindre enn ca. 20% av andre mediekomponenter eller fermenterings-biprodukter), mer foretrukket mer enn ca. 90% av den ønskede forbindelse (f.eks. mindre enn ca. 10% av andre mediekomponenter eller fermenterings-biprodukter), enda mer foretrukket mer enn ca. 95% av den ønskede forbindelse (f.eks. mindre enn ca. 5% av andre mediekomponenter eller fermenterings-biprodukter), og mest foretrukket mer enn ca. 98-99% ønsket forbindelse (f.eks. mindre enn ca. 1-2% av andre mediekomponenter eller fermenterings-biprodukter). Når den ønskede forbindelse er en umettet fettsyre som er blitt derivatisert til et salt, er forbindelsen fortrinnsvis videre fri (f.eks. hovedsakelig fri) for kjemiske forurensninger forbundet med dannelsen av saltet. Når den ønskede forbindelse er en umettet fettsyre som er blitt derivatisert til en alkohol, er forbindelsen fortrinnsvis videre fri (f.eks. hovedsakelig fri) for kjemiske forurensninger som er forbundet med dannelsen av alkoholen.
Ved en alternativ utførelsesform blir den ønskede umettede fettsyre ikke renset fra planten eller mikroorganismen, for eksempel når planten eller mikroorganismen er biologisk urisikabel (f.eks. trygg). For eksempel kan hele planten eller kulturen (eller dyrkningssypernatanten) anvendes som kilde til produkt (f.eks. råprodukt). Ved én utførelsesform anvendes planten eller kulturen (eller dyrkningssupernatanten) uten modifikasjon. Ved en annen utførelsesform blir planten eller kulturen (eller dyrkningssupernatanten) konsentrert. Ved enda en annen utførelsesform blir planten eller kulturen (eller dyrkningssupernatenten) pulverisert, tørket eller lyofilisert.
B. Fremstillingsmetodikker med høyt utbytte
En spesielt foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer, f.eks. DHA, som omfatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at den umettede fettsyre fremstilles med et signifikant høyt utbytte. Uttrykket "fremstillingsmetode med høyt utbytte", for eksempel en fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av en ønsket forbindelse (f.eks. for fremstilling av en umettet fettsyre) innbefatter en metode som resulterer i fremstilling av den ønskede forbindelse ved et nivå som er forhøyet eller over det som er vanlig for sammenliknbare fremstillingsmetoder. En fremstillingsmetode med høyt utbytte resulterer fortrinnsvis i fremstilling av den ønskede forbindelse i et signifikant høyt utbytte. Uttrykket "signifikant høyt utbytte" innbefatter et nivå av fremstilling eller utbytte som er tilstrekkelig forhøyet eller over det som er vanlig for sammenliknbare fremstillingsmetoder, for eksempel som er forhøyet til et nivå som er tilstrekkelig for kommersiell fremstilling av det ønskede produkt (f.eks. fremstilling av produktet til en kommersielt mulig kostnad). En fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre i et nivå på mer enn 2 g/l. En fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 10 g/l. En fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 20 g/l. En annen fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 30 g/l. En ytterlige annen fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 40 g/l.
En fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av en ønsket forbindelse (f.eks. for fremstilling av en umettet fettsyre) innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det frembringes et tilstrekkelig forhøyet nivå av forbindelse innenfor et kommersielt ønskelig tidsrom. En utførelsesform for en fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer kan innbefatte dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 15-20 g/l innen 36 timer. En fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer kan innbefatte dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 25-30 g/l innen 48 timer. En annen fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer kan innbefatte dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 35-40 g/l innen 72 timer, for eksempel mer enn 37 g/l innen 72 timer. En ytterligere annen fremstillingsmetode med høyt utbytte for fremstilling av umettede fettsyrer innbefatter dyrking av en manipulert plante eller mikroorganisme under slike betingelser at det fremstilles en umettet fettsyre ved et nivå på mer enn 30-40 g/l innen 60 timer, for eksempel mer enn 30, 35 eller 40 g/l innen 60 timer. For eksempel er fremstilling av umettede fettsyrer ved nivåer på minst 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 og 39 g/l innen 60 timer ment å være innenfor området 30-40 g/l innen 60 timer. Ved et annet eksempel er områder på 30-35 g/l eller 35-40 g/l ment å være innbefattet innenfor området 30-40 g/l innen 60 timer. Videre vil en fagperson på området forstå at dyrking av en manipulert mikroorganisme for oppnåelse av et produksjonsnivå på for eksempel "30-40 g/l innen 60 timer" innbefatter dyrking av mikroorganismen i ytterligere tidsrom (f.eks. tidsrom lengre enn 60 timer), som eventuelt resulterer i enda høyere utbytter av en umettet fettsyre som fremstilles.
IV. Preparater
Desaturase-nukleinsyremolekylene, -proteinene og fragmentene derav ifølge oppfinnelsen kan anvendes til fremstilling av umettede fettsyrer som kan innlemmes i preparater. Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter f.eks. preparater for anvendelse som dyrefor, preparater for anvendelse som nutraceutika (f.eks. kostsupplementer) og farmasøytiske preparater egnet for administrering.
Slike farmasøytiske preparater omfatter typisk en umettet fettsyre og en farmasøytisk akseptabel bærer. Anvendt i det foreliggende er uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" ment å innbefatte hvilket som helst og alle løsningsmidler, dispergeringsmedier, belegg, antibakterielle og antisoppmidler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og liknende, som er kompatible med administrering av farmasøytiske preparater. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent på området. Bortsett fra for så vidt som et konvensjonelt medium eller middel er inkompatibelt med den aktive forbindelse, er anvendelse av det i preparatene påtenkt. Supplerende aktive forbindelser kan også innlemmes i preparatene.
Et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen er utformet til å være kompatibelt med dets påtenkte administreringsmåte. Eksempler på administreringsmåter innbefatter parenteral, f.eks. intravenøs, intradermal, subkutan, oral (f.eks. inhalering), transdermal (topisk), transmukosal og rektal administrering. Oppløsninger eller suspensjoner som anvendes for parenteral, intradermal eller subkutan tilføring kan innbefatte følgende komponenter: et sterilt fortynningsmiddel så som vann for injeksjon, saltoppløsning, ikke-flyktige oljer, polyetylenglykoler, glycerol, propylenglykol eller andre syntetiske løsningsmidler; antibakterielle midler så som benzylalkohol eller metylparabener; antioksidanter så som askorbinsyre eller natriumbisulfitt; chelateringsmidler så som etylendiamin-tetraeddiksyre; buffere så som acetater, citrater eller fosfater, og midler for justering av tonisitet, så som natriumklorid eller dekstrose. pH kan justeres med syrer eller baser, så som saltsyre eller natriumhydroksid. Parenteralpreparatet kan være innelukket i ampuller, engangssprøyter eller multippeldose-småflasker laget av glass eller plast.
Farmasøytiske preparater egnet for injiserbar anvendelse innbefatter sterile vandige oppløsninger (hvor vannløselige) eller dispersjoner og sterile pulver for improvisert fremstilling av sterile injiserbare oppløsninger eller dispersjoner. For intravenøs administrering innbefatter egnede bærere fysiologisk saltoppløsning, bakteriostatisk vann, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) eller fosfatbufret saltoppløsning (PBS). I alle tilfeller må preparatet være sterilt, og det bør være fluid i et slikt omfang at det fås lett sprøytbarhet. Det må være stabilt under betingelsene for fremstilling og lagring og må være konservert overfor den forurensende påvirkning av mikroorganismer så som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispergeringsmedium inneholdende for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylenglykol, samt flytende polyetylenglykol og liknende), og egnede blandinger derav. Den passende fluiditet kan opprettholdes for eksempel ved anvendelse av et belegg så som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse når det gjelder en dispersjon, samt ved anvendelse av overflateaktive midler. Forebygging av virkningen av mikroorganismer kan oppnås ved hjelp av forskjellige antibakterielle og antisoppmidler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, thimerosal og liknende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å innlemme isotoniske midler, for eksempel sukkerarter, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol eller natriumklorid, i preparatet. Langvarig absorpsjon av de injiserbare preparater kan frembringes ved at det i preparatet innlemmes et middel som forsinker absorpsjonen, for eksempel aluminium-monostearat og gelatin.
Sterile injiserbare oppløsninger kan fremstilles ved innlemming av den aktive forbindelse (f.eks. en LCPUFA eller et fragment derav, fremstilt ved hjelp av nukleinsyre- og proteinmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse) i den fordrede mengde i et passende løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av bestanddeler oppregnet ovenfor, etter behov, fulgt av sterilfiltrering. Vanligvis fremstilles dispersjoner ved innlemming av den aktive forbindelse i et sterilt bærermateriale som inneholder et basis-dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddeler blant dem som er oppregnet ovenfor. Når det gjelder sterile pulver for fremstilling av sterile injiserbare oppløsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive bestanddel pluss hvilken som helst ytterligere ønsket bestanddel, ut fra en på forhånd sterilfiltrert oppløsning derav.
Oralpreparater innbefatter vanligvis et inert fortynningsmiddel eller en spiselig bærer. De kan innelukkes i gelatinkapsler eller komprimeres til tabletter. For oral terapeutisk administrering kan den aktive forbindelse innlemmes med tilsetningsstoffer og anvendes i form av tabletter, pastiller eller kapsler. Oralpreparater kan også fremstilles under anvendelse av en fluid bærer for anvendelse som munnskyllemiddel, hvor forbindelsen i den fluide bærer tilføres oralt og blir "swished" og utspyttes eller svelges. Farmasøytisk kompatible bindemidler og/eller adjuvansmaterialer kan innlemmes som en del av preparatet. Tablettene, pillene, kapslene, pastillene og liknende kan inneholde hvilke som helst av følgende bestanddeler, eller forbindelser med liknende beskaffenhet: et bindemiddel så som mikrokrystallinsk cellulose, tragantgummi eller gelatin; et tilsetningsstoff så som stivelse eller laktose, et oppløsingsmiddel så som alginsyre, Primogel eller maisstivelse; et smøremiddel så som magnesiumstearat eller Sterotes; et glidemiddel så som kolloidalt silisiumdioksid; et søtningsstoff så som sakkarose eller sakkarin; eller et smaksstoff så som peppermynte, metylsalicylat eller appelsinsmaksstoff.
For administrering ved inhalering avgis forbindelsene i form av en aerosolspray fra trykkbeholder eller dispenser som inneholder et egnet drivmiddel, f.eks. en gass så som karbondioksid, eller et forstøvningsmiddel.
Systemisk administrering kan også skje transmukosalt eller transdermalt. For transmukosal eller transdermal administrering anvendes gjennomtrengningsmidler som er passende for barrieren som skal gjennomtrenges, i utformningen. Slike gjennomtrengningsmidler er generelt kjent på området og innbefatter, for eksempel for transmukosal administrering, detergenter, gallesalter og fusidinsyrederivater. Transmukosal administrering kan utføres ved anvendelse av nesesprayer eller stikkpiller. For transdermal administrering blir de aktive forbindelser utformet til salver, balsam, geler eller kremer som generelt kjent på området.
Forbindelsene kan også fremstilles i form av stikkpiller (f.eks. med konvensjonelle stikkpillebasiser så som kakaosmør og andre glycerider) eller retensjonsklyster for rektal tilføring.
Ved én utførelsesform fremstilles de aktive forbindelser med bærere som vil beskytte forbindelsen mot hurtig eliminering fra kroppen, så som en utformning med regulert frigjøring, innbefattende implantater og mikroinnkapslede avgivelses-systemer. Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, så som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Metoder for fremstilling av slike utformninger vil være åpenbare for fagfolk på området. Materialene kan også fås kommersielt fra Alza Corporation og Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomale suspensjoner (innbefattende liposomer innsiktet mot infiserte celler med monoklonale antistoffer mot virusantigener) kan også anvendes som farmasøytisk akseptable bærere. Disse kan fremstilles i henhold til metoder kjent for fagfolk på området, for eksempel som beskrevet i US-patentnr.4 522 811.
Det er spesielt fordelaktig å utforme oral- eller parenteralpreparater i doseringsenhetsform for lettvint administrering og doserings-ensartethet. Doseringsenhetsform anvendt i det foreliggende angir fysisk atskilte enheter egnet som enhetsdoseringer for individet som skal behandles; hver enhet inneholder en for-bestemt mengde aktiv forbindelse beregnet til å frembringe den ønskede terapeutiske effekt i forbindelse med den fordrede farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen for doseringsenhetsformene dikteres av og er direkte avhengig av de unike egenskaper hos den aktive forbindelse og den spesielle terapeutiske effekt som vil oppnås, samt begrensningene som hører til fagområdet for kompoundering av en slik aktiv forbindelse for behandling av individer.
Toksisitet og terapeutisk effektivitet av slike forbindelser kan bestemmes ved farmasøytiske standardmetoder i cellekulturer eller forsøksdyr, f.eks. for bestemmelse av LD50 (dosen som er dødelig for 50% av populasjonen) og ED50 (dosen som er terapeutisk effektiv for 50% av populasjonen). Doseforholdet mellom toksiske og terapeutiske virkninger er den terapeutiske indeks, og den kan uttrykkes som forholdet LD50/ED50. Forbindelser som oppviser store terapeutiske indekser, er foretrukket. Skjønt forbindelser som oppviser toksiske bivirkninger, kan anvendes, må man passe på å utforme et avgivelsessystem som sikter inn slike forbindelser mot stedet for angrepet vev, for å minimalisere potensiell ødeleggelse av uinfiserte celler og derved redusere bivirkningene.
Dataene oppnådd ut fra cellekulturanalysene og dyreundersøkelsene kan anvendes til utforming av et doseringsområde for anvendelse på mennesker. Doseringen av slike forbindelser ligger fortrinnsvis innenfor et område av sirkulerende konsentrasjoner som innbefatter ED50 med liten eller ingen toksisitet. Doseringen kan variere innenfor dette område, avhengig av den anvendte doseringsform og den anvendte administreringsmåte. For en hver forbindelse som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan den terapeutisk effektive dose beregnes innledningsvis ut fra cellekulturanalyser. En dose kan utformes i dyremodeller for oppnåelse av et konsentrasjonsområde i sirkulerende plasma som innbefatter IC50 (dvs. konsentrasjonen av testforbindelsen som oppnår en halv-maksimal inhibering av symptomer) bestemt i cellekultur. Slik informasjon kan anvendes for mer nøyaktig å bestemme anvendelige doser hos mennesker. Nivåer i plasma kan for eksempel måles ved hjelp av høyytelses-væske kromatog raf i.
Som definert i det foreliggende, er en terapeutisk effektiv mengde protein eller polypeptid (dvs. en effektiv dose) i området ca. 0,001-30 mg pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis ca. 0,01-25 mg pr. kg kroppsvekt, mer foretrukket ca. 0,1-20 mg pr. kg kroppsvekt, og enda mer foretrukket ca. 1-10, 2-9, 3-8, 4-7 eller 5-6 mg pr. kg kroppsvekt. En fagperson på området vil forstå at visse faktorer kan innvirke på doseringen som trenges for effektiv behandling av et individ, innbefattende, men ikke begrenset til, graden av sykdommen eller forstyrrelsen, tidligere behandlinger, individets generelle helse og/eller alder, samt andre sykdommer hos individet. Videre kan behandling av et individ med en terapeutisk effektiv mengde av et protein, polypeptid eller antistoff innbefatte en enkelt behandling, eller den kan fortrinnsvis innbefatte en serie av behandlinger.
Ved et foretrukket eksempel blir et individ behandlet med en LCPUFA i området ca. 0,1-20 mg pr. kg kroppsvekt, én gang pr. uke i ca. 1-10 uker,
fortrinnsvis 2-8 uker, mer foretrukket ca. 3-7 uker, og enda mer foretrukket i ca. 4, 5 eller 6 uker. Det vil også være klart at den effektive dosering av antistoff, protein eller polypeptid som anvendes for behandling, kan økes eller reduseres i løpet av en spesiell behandling. Forandringer i dosering kan være resultatet og bli
åpenbare ved resultatene av diagnostiske analyser som beskrevet i det foreliggende.
De farmasøytiske preparater kan innelukkes i en beholder, pakke eller dispenser sammen med administreringsinstruksjoner.
EKSEMPLER
Materialer: Thraustochytrium sp. ATCC 21685 og Pythium irregulare ble anskaffet fra American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 USA) og dyrket i et medium (J.D. Weete et al. (1997) Lipids 32:839-845) ved 24°C i 7 dager. Deretter ble biomasse høstet ved sentrifugering og anvendt for RNA-isolasjon.
EKSEMPEL 1: KONSTRUKSJON OG SCREENING AV cDNA-BIBLIOTEK
Total-RNA ble isolert fra ovennevnte materialer i henhold til Qiu og Erickson (X. Qiu og L. Erickson (1994) Plant Mol. Biol. Repr. 12:209-214). cDNA-biblioteket ble konstruert ut fra total-RNA. Den første cDNA-streng ble syntetisert ved superscript II revers transkriptase fra Gibco-BRL. Den andre cDNA-streng ble syntetisert ved DNA-polymerase I fra Stratagene. Etter størrelsesfraksjonering ble større cDNA-innskudd enn 1 kb ligert i X Uni-Zap XR-vektor (Stratagene). De rekombinante~DNA'er ble så pakket med Gigapack III Gold-innpakkingsekstrakt (Stratagene) og utplatet på NZY-plater. Det resulterende bibliotek representerte med enn 5 x 106 uavhengige kloner. Screening av cDNA-biblioteket ble utført i henhold til standardmetoder (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989) Molecular doning - A laboratory manual (Cold Spring Harbor, New York, USA).
EKSEMPEL 2: RT-PCR
Enkeltstreng-cDNA ble syntetisert ved hjelp av superscript II revers transkriptase (Gibco-BRL) ut fra total-RNA og ble så anvendt som templat for PCR-reaksjon med to degenererte primere (Fremover-primeren:
sykluser med 1 min ved 94°C, 1,5 min ved 55°C og 2 min ved 72°C, fulgt av et forlengelsestrinn ved 72°C i 10 min. De amplifiserte produkter fra 800 bp til 1000
bp ble isolert fra agarosegel og renset ved hjelp av et utstyrssett (Qiaex II-gelrensing, Qiagen) og deretter klonet i TA-kloningsvektoren pCR<®>2.1 (Invitrogen). De klonede innskudd ble så sekvensert ved PRISM DyeDeoxy Terminator Cycle-sekvenseringssystem (Perkin Eimer/Applied Biosystems).
EKSEMPEL 3: EKSPRESJON AV FAD4, FAD5, FAD5-2 OG FAD6 I
GJÆRSOPP
De åpne leserammer av Fad4, Fad5, Fad5-2 og Fad6 ble amplifisert ved PCR under anvendelse av Precision Plus-enzymet (Stratagene) og klonet i en TA-kloningsvektor (pCR<®>2.1, Invitrogen). Etter at det var bekreftet at PCR-produktene var identiske med de opprinnelige cDNA'er ved sekvensering, ble fragmentene frigjort ved en BamHI-EcoRI-dobbeltnedbrytning og innført i gjærekspresjons-vektoren pYES2 (Invitrogen) under kontroll av den induserbare promoter GAL1.
Gjærsoppstammene lnvSc2 (Invitrogen) ble transformert med ekspresjons-konstruksjonene under anvendelse av litiumacetatmetoden, og transformanter ble selektert på plater med minimalt medium som manglet uracil (D. Gietz et al. (1992) Nucleis Acids Res. 20:1425; P.S. Covello og D.W. Reed (1996) Plant Physiol. 111:223-226).
Transformantene ble først dyrket i et minimalt medium som manglet uracil og inneholdt glukose, ved 28°C. Etter dyrkning natten over, ble cellene spunnet ned, vasket og gjenoppslemmet i destillert vann. Minimalt medium inneholdende 2% galaktose, med eller uten 0,3 mM substrat-fettsyrer i nærvær av 0,1% tergitol, ble inokulert med gjærtransformantcellesuspensjon og inkubert ved 20°C i tre dager, og deretter ved 15°C i ytterligere tre dager.
EKSEMPEL 4: FETTSYREANALYSE
Thraustochytrium, Pythium irregulare og gjærceller ble høstet og vasket to ganger med destillert vann. Deretter ble 2 ml metanolisk KOH (7,5% [på vekt/volum-basis] KOH i 95% metanol) tilsatt til materialene og blandingen forseglet i et 12 ml glasskulturrør ble oppvarmet til 80°C i 2 timer. 0,5 ml vann ble tilsatt, og prøven ble ekstrahert to ganger med 2 ml heksan for fjerning av ikke-forsåpbare lipider. Den gjenværende vannfase ble så surgjort ved tilsetting av 1 ml 6 N HCI og ekstrahert to ganger med 2 ml heksan. Heksanfasene ble kombinert og tørket under en strøm av nitrogen. 2 ml 3 N metanolisk HCI (SUPELCO, Supelco Park, Bellefonte, PA 16823-0048) ble tilsatt, og blandingen ble oppvarmet ved 80°C i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur, ble det tilsatt 1 ml 0,9% NaCI, og blandingen ble ekstrahert to ganger med 2 x 2 ml heksan. Den kombinerte heksan ble inndampet under nitrogen. De resulterende fettsyremetylestere (FAMEY) ble analysert ved hjelp av GC og GC-MS i henhold til Covello & Reed (P.S. Covello og D.W. Reed (1996) Ploant Physiol. 111:223-226).
GC/MS-analyse ble utført i standard-EI-modus under anvendelse av et massespektrometer av typen Fisons VG TRIO 2000 (VG Analytical, UK), kontrollert av Masslynx version 2.0-programvare, koplet til en gasskromatograf av typen GC 8000-serien. En DB-23-kolonne (30M x 0,25 mm i.d., 0,25 Nm filmtykkelse, J&W Scientific, Folsom, CA) som var temperatur-programmert til 180°C i 1 min, deretter 4°C/min til 240°C og holdt i 15 minutter, ble anvendt for FAME-analyse.
EKSEMPEL 5: TRANSFORMASJON AV BRASSICA JUNCEA OG LIN
(LINUM USITATISSIMUM) OG EKSOGEN FETTSYRE-BEHANDLING
Hypokotylene fra 5-6 dagers frøplanter av B. juncea og lin ble anvendt som eksplantater for inokulering med Agrobacterium tumefaciens som huser binære vektorer med cDNA'ene i hel lengde under kontroll av de forskjellige promotere. De 20 dager gamle transgene frøplanter ble anvendt for eksogen fettsyre-behandling. Frøplanten ble delt i tre deler: blader, stengler og røtter. Hver av dem ble kuttet i små stykker og anbrakt i en 24-brønns titerplate. I hver brønn ble det tilsatt 2 ml 0,05% natriumsalt av substrater (NuCheck Prep Inc., Elysian, MN). Platen ble så inkubert ved 24°C i 41 med forsiktig risting. Etter inkubering ble plantevevene vasket tre ganger med vann og så anvendt for fettsyreanalyse.
EKSEMPEL 6: FETTSYREPROFIL AV TH RA USCHYTRIUM SP.
Thraustochytrium og Pythium irregulare har i det siste tiltrukket seg vitenskapelig oppmerksomhet på grunn av sin evne til produksjon av LCPUFA'er så som DHA, AA, EPA og DPA. Fig. 15 og 16 viser fettsyresammensetningen av lipidene isolert fra 7 dagers kulturer av henholdsvis Thraustochytrium sp. og Pythium irregulare. Som vist i tabellene, inneholder mikroorganismene et vidt område av flerumettede fettsyrer, fra både n-3- og n-6-familiene, fra 18-karbon A6- fettsyrer (gamma-linolensyre og steardonsyre) til 22-karbon A4-fettsyrer (DHA og DPA). Organismene, spesielt Thraustochytrium sp., ser ut til å inneholde et fullstendig sett av desaturasjons- og forlengelsesenzymer som er nødvendige for DHA- og DPA-biosyntesen. Stammen mangler flerumettede 24-karbon-fettsyrer, de foreslåtte forløpere for DHA- og DPA-syntese ved Prerchers vei (A. Voss et al.
(1991) J. Biol. Chem. 266:19995-20000; B.S. Mohammed et al. (1997) Biochem. J. 326:425-430). 24-Karbon-fettsyren inngår kanskje ikke i in vivo-syntese av 22-karbon A4-fettsyrer så som DHA og DPA i Thraustochytrium sp.
EKSEMPEL 7: IDENTIFIKASJON AV cDNA'er SOM KODER FOR
"FRONT"-DESATURASEN
For identifisering av gener som koder for desaturaser som inngår ved biosyntese av LCFUFA'er i Thraustochytrium sp. og Pythium irregulare adopterte man en PCR-basert kloningsstrategi. To degenererte primere utformes for innsikting av det hemebindende mønster av N-terminal forlengelse av cyt b5-liknende doméne i henholdsvis front-desaturaser og det tredje konserverende histidinmønster i alle mikrosomale desaturaser. Resonnementet bak utformingen er at desaturasene som inngår ved EPA- og DHA-biosyntese i Thraustochytrium sp. og Pythium irregulare, bør ha liknende primærstruktur som andre front-desaturaser, dvs. N-terminal ekstensjon av cyt b5-liknende doméne i desaturasen. Det ble identifisert fire cDNA-fragmenter fra Thraustochytrium sp. og Pythium irregulare som koder for fusjonsproteiner inneholdende cyt b5-liknende doméne i den N-terminale ende.
For isolering av cDNA-kloner i hel lengde ble de fire innskudd anvendt som prober til screening av cDNA-biblioteker av Thraustochytrium sp. og Pythium irregulare, noe som resulterte i identifikasjon av flere cDNA-kloner i hver gruppe. Sekvensering av alle disse kloner identifiserte fire cDNA-molekyler i hel lengde, som ble kalt Fad4, Fad5, Fad5-2 og Fad6. Den åpne leseramme av Fad4 er 1560 bp og koder for 519 aminosyrer med molekylvekt 59,1 kDa (fig. 1). Fad5 har en lengde på 1230 bp og koder for 439 aminosyrer med molekylvekt 49,8 kDa (fig. 2). En sekvenssammenlikning av disse to sekvenser fra Thraustochytrium sp. viste bare 16% aminosyreidentitet mellom de utledede proteiner. En detaljert analyse viste at Fad4 er 80 aminosyrer lengre enn Fad5, som finnes mellom det andre og tredje konserverende histidinmønster (fig. 3). Den åpne leseramme av Fad5-2 fra Pythium irregulare er 1371 bp og koder for 456 aminosyrer (fig. 4). Fad6 fra Pythium irregulare har en lengde på 1383 bp og koder for 460 aminosyrer (fig. 5). Sekvenssammenlikning av de to sekvenser fra Pythium irregulare viste over 39% likhet mellom de utledede proteiner (fig. 6).
Et BLASTP™-søk i protein-databasen viste følgende treff ("hits") for hvert av de fire proteiner, Fad4, Fad5, Fad5-2 og Fad6:
EKSEMPEL 8: EKSPRESJON AV FAD4, FAD5, FAD5-2 OG FAD6 I
GJÆRSOPP
For bekreftelse av funksjonen av Fad4 ble cDNA i hel lengde uttrykt i gjærsoppstammen lnvSc2 under kontroll av den induserbare promoter. Fig. 7 viser at med supplering av mediet med 22:5 (7,10,13,16,19) hadde gjærceller inneholdende Factø-cDNA en ekstra fettsyre sammenliknet med vektorkontrollen. Toppen har en retensjonstid identisk med DHA-standarden. LC/MS-analyse av den frie fettsyre viste at den gir deprotonerte molekyl-ioner (m/z=279) identiske med DHA-standarden i negativ ion-elektrospray. Dessuten bekreftet GC/MS-analyse av FAME at spektret for toppen er identisk med spektret for DHA-standarden (fig. 8). Disse resultater tyder på at Fad4 er en A4-fettsyredesaturase som kan innføre en dobbeltbinding i stilling 4 i 22:5 (7,10,13,16,19)-substratet, noe som resulterer i en A4-desaturert fettsyre, DHA (22:6-4,7,10,13,16,19).
For ytterligere undersøkelse av Fad4's substratspesifisitet ble en rekke substrater, innbefattende 18:2(9,12), 18:3(9,12,15), 20:3(8,11,14) og 22:4 (7,10,13,16) separat tilført til gjærsopptransformantene. Resultatene tydet på at Fad4 også kunne anvende 22:4(7,10,13,16) som substrat (fig. 9) for dannelse av en annen A4-desaturert fettsyre, DPA (22:5-4,7,10,13,16) (fig. 10). Resten av de undersøkte fettsyrer var ikke effektive substrater.
For bekreftelse av funksjonen av Fad5 og Fad5- 2 ble S. cerevisiae Invsc2 transformert med plasmider, som inneholder den åpne leseramme av henholdsvis Fad5 og Fad5- 2, under kontroll av den galaktose-induserbare promoter. Når gjærsopptransformantene ble indusert ved galaktose i et medium inneholdende homo-gammalinolensyre (HGLA, 20:3-8,11,14), ble det observert en ekstra topp i kromatogrammet for FAMEY som ble opphopet i transformantene sammenliknet med kontrollen (fig. 11). En sammenlikning av kromatogrammet med kromatogrammet for standardene viste at fettsyren hadde en retensjonstid identisk med arakidonsyrestandarden (AA, 20:4-5,8,11,14). For ytterligere bekreftelse av produktenes regiokjemi ble FAME'ne analysert ved hjelp av GC/MS. Fig. 12 viser at massespektraene for den nye fettsyre og AA-standarden er identiske. Disse resultater viser at Fad5 og Fad5-2 omdanner HGLA (20:3-8,11,13) til AA (20:4-5,8,11,14) i gjær. For ytterligere undersøkelse av substratspesifisiteten hos Fad5-2 ble plasmidet inneholdende Fad5- 2 overført til en annen gjærsoppstamme AMY-2a hvor olel, et A9-desaturasegen, er ødelagt. Stammen er ikke i stand til å vokse i minimalt medium uten supplering med énumettede fettsyrer. I dette forsøk ble stammen dyrket i minimalt medium supplert med 17:1(10Z), et ikke-substratfor Fad5-2, som muliggjorde undersøkelse av spesifisiteten av enzymet overfor forskjellige substrater, spesielt énumettede fettsyrer. En rekke mulige substrater innbefattende 16:1(9Z), 18:1(9Z), 18:1(11Z), 18:1(115), 18:1(125), 18:1(15Z), 18:2(9Z, 12Z), 18:3(9Z, 12Z, 15Z), 20:2(11Z, 14Z) og 20:3(11Z, 14Z, 17Z) ble testet. Resultatene viste at Fad5-2 kunne desaturere umettede fettsyrer med A9-etyleniske og A11-etyleniske dobbeltbindinger samt fettsyren med A8-etylenisk dobbeltbinding (20:3-8,11,14). Som vist på fig. 13, omdannet Fad5-2 effektivt både 18:1(9Z)- og 18:1(11Z)-substrater til deres tilsvarende A5-desaturerte fettsyrer, henholdsvis 18:2-5,9 (retensjonstiden 10,34 min) og 18:1-5,11 (retensjonstiden 10,44 min). Fad5-2 desaturerte også frans-fettsyre så som 18:1(115) og 18:1(125).
Fig. 25 er en sammenlikning av substratpreferens hos Fad5-2 for fettsyresubstrater testet i gjærsoppstammen AMY-2oc. De relative andeler av substratene og de opphopede produkter er en nyttig indikator for substratpreferanse hos enzymet. Som vist på fig. 25, foretrekker Fad5-2 fettsyrer med 20-karbon som substrater, så som 20:3(8Z,11Z.14Z), 20:3(11Z,14Z,17Z) og 20:2(11Z.14Z), mens fettsyren med kortere kjede er et relativt svakere substrat for enzymet i gjærsopp.
For bekreftelse av funksjonen av Fad6 ble S. cerew's/'ae-vertsstammen Invsc2 transformert med et plasmid inneholdende den åpne leseramme av Fad6 under kontroll av den galaktose-induserbare promoter, GAL1. Når gjærsopp-transformanten ble indusert ved galaktose i et medium inneholdende linolsyre, ble det observert en ekstra topp i kromatogrammet for FAME'ne som ble opphopet i transformantene, sammenliknet med kontrollen (fig. 14). En sammenlikning av kromatogrammet med kromatogrammet for standardene viste at toppen hadde en retensjonstid identisk med gamma-linolensyre-(GI_A, 18:3-6,9,12)-standarden. For bekreftelse av produktenes regioselektivitet ble dietylaminderivatene av fettsyrer fra den uttrykkende stamme analysert ved hjelp av GC-MS. Fig. 15 viser at den nye topp faktisk er GLA med tre dobbeltbindinger i A6-, A9- og A12-stillingene. Hovedfragmenter av n og n+1 karboner som er forskjellige ved 12 D, er diagnostisk for en dobbeltbinding mellom karbon n+1 og n+2. Følgelig viser fragmentene ved 156 og 168,196 og 208, samt 236 og 248 dobbeltbindinger i henholdsvis A6-, A9- og A12-stillingene. Disse resultater viser at Fad6 er en A6-desaturase som omdanner linolsyre (18:2) til GLA i gjærsopp.
EKSEMPEL 9: EKSPRESJON AV FAD4 I B. JUNCEA
For bestemmelse av om hvorvidt Thraustochytrium- ?ad4 er funksjonell i oljefrø-dyrkningsplanter ble B. juncea transformert med konstruksjonen inneholdende Fad4 under kontroll av en konstitutiv promoter. Åtte uavhengige transgene planter ble oppnådd. I B. juncea er det ingen tilgjengelige A4-fettsyredesaturase-substrater. For undersøkelse av aktiviteten av det transgene enzym i plantene må følgelig 22:5 (n-3)-substratet tilføres eksogent. I dette forsøk ble både villtype- og transgene planter påført en vandig oppløsning av natriumdocosapentaeneat. Det ble funnet at eksogent påførte substrater lett ble opptatt av røtter, stengler og blader hos begge plantetyper, men omdannet til DHA bare i transgene planter. Blader har høyere nivå av produksjon av DHA enn røtter og stengler. I blader ble det eksogene substrat innlemmet til et nivå på 10-20% av de totale fettsyrer, og A4-desaturert fettsyre (22:6, n-3) ble produsert i et område på 3-6% av den totale mengde fettsyrer (fig. 16). Disse resultater tyder på at A4-fettsyre-desaturasen fra Thraustochytrium er funksjonell i oljefrø-dyrkningsplanter.
EKSEMPEL 10: EKSPRESJON AV FAD5-2 I B. JUNCEA
For bestemmelse av om hvorvidt Fad5-2 er funksjonell i oljefrø-dyrkningsplanter og om ekspresjonen av den har noen effekt på deres vekst og utvikling, ble B. juncea transformert med en binær vektor som inneholdt Fad5-2-cDNA bak en konstitutiv promoter (en tandem-blomkålmosaikkvirus-35S-promoter). Seks uavhengige primære transgene planter ble oppnådd, og fettsyreprofilen for lipider fra forskjellige vev ble bestemt. Fig. 17 viser fettsyresammensetningen i tre uker gamle frøplanter fra én Trlinje. Sammenliknet med villtype har alle transgene plantevev en forandret fettsyreprofil inneholdende fire ytterligere topper som ble identifisert som fire forskjellige A5-ikkedesaturerte polymetylen-avbrutte fettsyret (A5-UPIFA'er), spesifikt taxoleinsyre (18:2-5,9); efedreninsyre (18:2-5,11); pinolensyre (18:3-5,9,12) og coniferonsyre (18:4-5,9,12,15). Følgelig kan B. juncea, i likhet med gjærsopp, funksjonelt uttrykke P. irregulare A5-desaturase under omdannelse av de endogene substrater 18:1-9; 18:1-11; 18:2-9,12 og 18:3-9,12,15 til de tilsvarende A5-desaturerte fettsyrer. Røttene dannet den høyeste mengde av A5-UPIFA'ene, noe som representerte mer enn 20% av den totale mengde fettsyrer, fulgt av 6% i stengler og 5% i blader (fig. 17).
I B. juncea er det intet tilgjengelig homo-gammalinolensyre- (20:3-8,11,14)-substrat. For undersøkelse av om hvorvidt den transgene plante kan produsere AA, ble følgelig substratet 20:3(8,11,14) eksogent tilført. I dette forsøk ble både villtype- og transgene planter tilført en vandig oppløsning av natriumhomo-gammalinolenat. Det ble funnet at eksogent tilførte substrater lett ble opptatt av røtter, stengler og blader hos transgene planter og omdannet til AA i planter (fig. 18).
Det var ingen observerbar fenotypisk effekt på veksten og utviklingen i den transgene B. juncea, skjønt A5-UPIFA'ene ble opphopet i alle deler av planten. Vekst og differensiering av vegetative vev så som bladene, stenglene og røttene kunne ikke skjelnes fra den tilsvarende villtype.
For fremstilling av A5-desaturerte fettsyrer i frø ble B. juncea transformert med konstruksjonen inneholdende Fac/5-2-cDNA bak en heterolog frøspesifikk promoter (S. napus-napinpromoter). Fettsyreanalyse av transgene frø viste at to nye fettsyrer viste seg i gasskromatogrammet for transgene frø sammenliknet med villtype-kontrollen (fig. 19). De ble identifisert som taxoleinsyre (18:2-5,9) og pinolensyre (18:3-5,9,12). Til sammen representerer disse fettsyrer 9,4% av frø-fettsyrene. Opphopning av A5-UPIFA'er har ingen signifikant effekt på oljesyreinnholdet sammenliknet med den ikke-transformerte kontroll.
EKSEMPEL 11: EKSPRESJON AV FAD5-2 I LIN
For fremstilling av A5-desaturerte fettsyrer i linfrø ble lin transformert med Fad5- 2 under kontroll av to frøspesifikke promotere, en heterolog B. napus-napinpromoter og en endogen linpromoter. Som vist på fig. 26, dannet transgene planter inneholdende napinpromoteren én A5-desaturert fettsyre, taxoleinsyre, i frø ved et nivå på mindre enn 1% av den totale mengde fettsyrer, mens transgene planter inneholdende den linfrø-spesifikke promoter dannet tre A5-desaturerte fettsyrer: taxoleinsyre, pinolensyre og koniferonsyre. Blant disse var det mest av taxoleinsyre (18:2-5,9), og denne utgjorde mer enn 9% av den totale mengde fettsyrer i en elitelinje (FN-10-1), fulgt av koniferon- og pinolensyre. Overraskende nok har opphoping av A5-desaturerte fettsyrer i transgene frø signifikant virkning på sammensetningen av andre fettsyrer, spesielt oljesyrenivået. Opphopning av A5-UPIFA'er ble fulgt av en enorm økning av oljesyrene i begge typer transgene planter som uttrykte Fad5-2-desaturase under kontroll av de forskjellige promotere. Innholdet av oljesyre i transgene planter med napin-promoteren og linfrø-spesifikke promotere nådde gjennomsnittlig henholdsvis 44,7% og 24,3% av den totale mengde fettsyrer i forhold til den ikke-transformerte kontroll på 17,4%.
EKSEMPEL 12: EKSPRESJON AV FAD6 I LIN
For fremstilling av A6-desaturerte fettsyrer i linfrø ble to typer lin transformert med konstruksjonen som inneholder Fad6-cDNA under kontroll av en heterolog frøspesifikk promoter (S. napus-napinpromoter). Lin av type I (Normandy) er en tradisjonell industriell oljefrø-dyrkningsplante, mens type II (Solin) er en spiselig oljefrø-dyrkningsplante oppnådd ved kjemisk mutagenese av type I. Det ble frembrakt totalt tolv transgene planter. Hovedandelen av transgene planter oppviste to nye fettsyrer hvis retensjonstider svarer til GLA og SDA, og de utgjør 0,1-4,3% av den totale mengde fettsyrer (fig. 27). Nivået av GLA i transgen Solin-type er høyere enn i SDA, mens GLA i transgen Normandy er lavere enn SDA. Dette er forståelig på grunn av at linolsyre er en hovedfettsyre i Solin-linfrøtype, mens a-linolensyre er en hovedfettsyre i Normandy-frø.
EKSEMPEL 13: EKSPRESJON AV FAD6 I B. JUNCEA
For fremstilling av A6-desaturerte fettsyrer i frø av B. juncea, ble B. juncea transformert med den samme konstruksjon som ble anvendt til lintransformasjon, dvs. Fad6, under kontroll av B. napws-napinpromoteren. Det ble oppnådd femten uavhengige transgene planter. Fettsyreanalyse av de transgene frø viste at det var tre nye fettsyrer i gasskromatogrammet for de fleste transgene frø sammenliknet med villtypekontrollen (fig. 20). De tre fettsyrer ble identifisert som 18:26(6,9), 18:3(6,9,12) og 18:4(6,9,12,15). B. juncea kan, i likhet med lin, også funksjonelt uttrykke Fad6 fra P. irregulare, under innføring av en dobbeltbinding i stilling 6 i endogent substrat 18:1(9), 18:2(9,12) og 18:3(6,9,12), noe som resulterer i dannelse av tre tilsvarende A6-fettsyrer i de transgene frø. Blant de tre nye fettsyrer som frembringes i transgene frø er det mest rikelig av GLA, med et nivå i transgene frø på 30-38% av den totale mengde fettsyrer. Den nest mest rikelige komponent er SDA, som utgjør 3-10% av den totale mengde fettsyrer i flere transgene linjer (fig. 21).
Fettsyresammensetningene i transgene frø er vist på fig. 22. Det er klart at det høye nivå av produksjon av A6-desaturerte fettsyrer er på bekostning av to hovedfettsyrer, linolsyre og linolensyre. Andeler av olje- og stearinsyre i transgene frø er noe redusert, men ikke signifikant sammenliknet med andelene i villtypekontrollen. Innholdet av linolsyre i de transgene frø var dramatisk redusert. I den ikke-transformerte villtype utgjør linolsyre mer enn 40% av den totale mengde fettsyrer i frø. I transgene frø var nivået redusert til under 10%.
Sammenliknet med reduksjonen av linolsyre i transgene frø er reduksjonen i linolensyre i transgene frø mindre dramatisk, men fremdeles signifikant. I den ikke-transformerte villtype utgjør linolensyre mer enn 10% av den totale mengde fettsyrer i frø, mens nivået var redusert til under 5% i transgene frø. De to dramatisk reduserte fettsyrer i transgene frø er substratene for A6-desaturasen, og reduksjonen er kostnaden for fremstilling av to tilsvarende A6-desaturerte fettsyrer.

Claims (35)

1. Isolert nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et isolert nukleinsyremolekyl bestående av nukleotidsekvensen angitt i SEKV ID NR: 3 eller et komplement derav; (b) et nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid bestående av aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 4 eller et komplement derav; (c) et isolert nukleinsyremolekyl bestående av en nukleotidsekvens som er minst 80% identisk med hele nukleotidsekvensen av SEKV ID NR: 3 eller et komplement derav, hvor nukleinsyremolekylet koder for et polypeptid som har A5 desaturase aktivitet; og (d) et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid bestående av en aminosyresekvens som er minst 50% identisk med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 4 eller et komplement derav, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet.
2. Vektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
3. Vektor ifølge krav 2,karakterisert vedat den er en ekspresjonsvektor.
4. Vertscelle,karakterisert vedat den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 3.
5. Vertscelle ifølge krav 4,karakterisert vedat cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, en mikrobiell celle og en dyrecelle.
6. Vertscelle ifølge krav 5,karakterisert vedat plantecellen er en celle oppnådd fra en oljefrødyrkningsplante valgt fra gruppen bestående av lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.).
7. Vertscelle ifølge krav 5,karakterisert vedat den mikrobielle cellen er valgt fra gruppen bestående av Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizochytrium og Crythecodinium.
8. Fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid,karakterisert veda t den omfatter dyrkning av vertscellen ifølge krav 4 for å produsere polypeptidet.
9. Isolert polypeptid,karakterisert veda t det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et isolert polypeptid bestående av aminosyresekvensen i SEKV ID NR: 4; (b) et isolert polypeptid kodet for av et nukleinsyremolekyl bestående av nukleotidsekvensen angitt i SEKV ID NR: 3; (c) et isolert polypeptid som er kodet for av et nukleinsyremolekyl bestående av en nukleotidsekvens som er minst 80% identisk med hele nukleotidsekvensen av SEKV ID NR: 3, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet; og (d) et isolert polypeptid bestående av en aminosyresekvens som er minst 50% identisk med hele aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 4, hvor polypeptidet har A5 desaturase aktivitet.
10. Fremgangsmåte for å fremstille DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)),karakterisert vedat den omfatter transfektering eller transformering av en celle med det isolerte nukleinsyremolekylet ifølge krav 1 og dyrkning eller kultivering av cellen under betingelser slik at DHA, DPA, EPA eller AA blir produsert.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, en dyrecelle og en mikrobiell celle.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert veda t plantecellen er en celle fra en oljefrødyrkningsplante.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat oljefrødyrkningsplanten er valgt fra gruppen bestående av lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.).
14. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den videre omfatter det trinnet å gjenvinne DHA, DPA, EPA eller AA.
15. Fremgangsmåte for å fremstille DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4.7.10.13.16) ), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)), k a r a k t e risert ved at den omfatter kontakting av et preparat omfattende minst et desaturase målmolekyl med minst et isolert polypeptid ifølge krav 9 under betingelser slik at DHA, DPA, EPA eller AA blir produsert.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat den videre omfatter det trinnet å gjenvinne DHA, DPA, EPA eller AA.
17. Fremgangsmåte for frembringelse av en celle som er i stand til å produsere DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5.8.11.14.17) ) eller AA (20:4 (5,8,11,14)),karakterisert vedat den omfatter innføring inn i nevnte celle nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, hvor cellen inkorporerer fettsyre mole kylet 22:5 (7,10,13,16,19), 22:4 (7,10,13,16), 20:4 (8, 11,14, 17) eller 20:3 (8, 11,14).
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat cellen er valgt fra gruppen bestående av en plantecelle, et dyrecelle og en mikrobiell celle.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat plantecellen er en celle fra en oljefrøplante.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat oljefrøplanten er lin ( Linum sp.), rapsfrø ( Brassica sp.), soyabønne ( Glycine og Soja sp.), solsikke ( Helianthus sp.), bomull ( Gossypium sp.), mais ( Zea mays), oliven ( Olea sp.), fargetistel ( Carthamus sp.), kakao ( Theobroma cacoa) og jordnøtt ( Arachis sp.)
21. Fremgangsmåte for å modulere fremstillingen av DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)), eller AA (20:4 (5,8,11,14)),karakterisert vedat den omfatter dyrkning av cellen ifølge krav 4, slik at modulering av fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA forekommer.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert vedat fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA er forbedret.
23. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert vedat den videre omfatter gjenvinning av DHA, DPA, EPA eller AA.
24. Fremgangsmåte for stor-skala fremstilling av DHA (22:6 (4,7,10,13,16,19)), DPA (22:5 (4,7,10,13,16)), EPA (20:5 (5,8,11,14,17)) eller AA (20:4 (5,8,11,14)),karakterisert vedat den omfatter dyrkning av cellen ifølge krav 4, slik at DHA , DPA, EPA eller AA blir produsert.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA er forbedret.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat den videre omfatter gjenvinning av det fremstilte DHA, DPA, EPA eller AA.
27. Preparat,karakterisert vedat det omfatter polypeptidet ifølge krav 9.
28. Preparat,karakterisert vedat det omfatter DHA, DPA, EPA eller AA fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 10.
29. Preparat,karakterisert vedat det omfatter DHA, DPA, EPA eller AA produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 15.
30. Preparat,karakterisert vedat det omfatter cellen produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 17.
31. Preparat ifølge krav 27,karakterisert vedat preparatet blir anvendt i dyrefor.
32. Preparat ifølge krav 28,karakterisert vedat preparatet blir anvendt i dyrefor.
33. Preparat ifølge krav 28,karakterisert veda t preparatet blir anvendt som et kosttilskudd.
34. Anvendelse av preparat ifølge krav 27 for supplering av dietten til et menneske eller et dyr.
35. Anvendelse av preparatet ifølge krav 27 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en lidelse valgt fra gruppen bestående av stress, diabetes, kreft, inflammatoriske lidelser og kardiovaskulære lidelser.
NO20101157A 2000-09-28 2010-08-18 Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate for a fremstille et polypeptid og DHA,DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for a modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav NO332128B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23630300P 2000-09-28 2000-09-28
US29756201P 2001-06-12 2001-06-12
PCT/IB2001/002346 WO2002026946A2 (en) 2000-09-28 2001-09-28 Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20101157L NO20101157L (no) 2003-05-15
NO332128B1 true NO332128B1 (no) 2012-07-02

Family

ID=26929655

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20031405A NO331104B1 (no) 2000-09-28 2003-03-27 Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate, isolert polypeptid, preparat og anvendelse.
NO20101157A NO332128B1 (no) 2000-09-28 2010-08-18 Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate for a fremstille et polypeptid og DHA,DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for a modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20031405A NO331104B1 (no) 2000-09-28 2003-03-27 Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate, isolert polypeptid, preparat og anvendelse.

Country Status (13)

Country Link
US (7) US7087432B2 (no)
EP (3) EP1322752B2 (no)
JP (3) JP4071622B2 (no)
CN (3) CN101845446B (no)
AT (2) ATE510908T1 (no)
AU (3) AU2002218447C9 (no)
CA (1) CA2421267C (no)
DE (1) DE60141760D1 (no)
DK (2) DK1911837T3 (no)
ES (2) ES2343106T3 (no)
NO (2) NO331104B1 (no)
PT (2) PT1911837E (no)
WO (1) WO2002026946A2 (no)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6566583B1 (en) * 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US20070244192A1 (en) * 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) * 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) * 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7217856B2 (en) * 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US6635451B2 (en) * 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
CA2435685C (en) * 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
TWI350854B (en) * 2001-04-16 2011-10-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
DE10137374A1 (de) * 2001-07-31 2003-02-27 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure in transgenen Organismen
EP2239028A1 (en) 2001-12-12 2010-10-13 Martek Biosciences Corporation Extraction and Winterization of Lipids From Oilseed and Microbial Sources
EP1549133B1 (en) 2002-05-22 2015-04-22 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from fungi
US7485414B2 (en) * 2002-08-30 2009-02-03 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of angiogenesis
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
KR101234200B1 (ko) * 2003-03-26 2013-02-19 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도
WO2004090123A2 (de) * 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US9433228B2 (en) 2003-08-01 2016-09-06 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of multiple-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP1656449B1 (en) * 2003-08-21 2009-05-06 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from primula
WO2005047480A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
EP1720988B1 (de) 2004-02-27 2011-10-12 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
CN1968688A (zh) * 2004-04-16 2007-05-23 孟山都技术有限公司 脂肪酸去饱和酶在玉米中的表达
CN102559364B (zh) 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US7834250B2 (en) * 2004-04-22 2010-11-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA2568689A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
AU2005267202B2 (en) 2004-06-25 2011-10-27 Corteva Agriscience Llc Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7928294B2 (en) 2004-07-12 2011-04-19 Suntory Holdings Limited Polypeptide having Δ5 desaturating activity, polynucleotide coding for the polypeptide, and use thereof
US7138391B2 (en) * 2004-08-09 2006-11-21 Silverbrook Research Pty Ltd Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes
CA2598792A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
DE102005013779A1 (de) * 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
EP1899453B1 (en) 2005-06-07 2013-12-18 Ocean Nutrition Canada Limited Eukaryotic microorganisms for producing lipids and antioxidants
DE102005038036A1 (de) * 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
JP5123861B2 (ja) 2005-11-23 2013-01-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
JP2009529044A (ja) * 2006-03-03 2009-08-13 モンサント テクノロジー エルエルシー 心臓血管健康を改善するための手段
WO2007106905A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US9023616B2 (en) 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
US20080152636A1 (en) * 2006-09-08 2008-06-26 Kaneka Corporation Composition containing reduced coenzyme Q10 and lysolecithin
JP5101894B2 (ja) * 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
JP2010523113A (ja) * 2007-04-03 2010-07-15 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）および多価不飽和脂肪酸の製造におけるその使用
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN101827934B (zh) * 2007-07-13 2014-02-26 帝斯曼营养品股份公司 D4去饱和酶和d5延伸酶
BRPI0821508B1 (pt) * 2007-12-11 2018-12-26 Synthetic Genomics Inc cultura celular compreendendo uma cianobactéria recombinante da espécie synechococcus elongatus e método para converter carbono inorgânico em ácidos graxos.
US8119784B2 (en) * 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
DE112009001585T5 (de) 2008-07-01 2012-02-23 Basf Plant Science Gmbh Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression
EP2304032A1 (en) * 2008-08-01 2011-04-06 E. I. du Pont de Nemours and Company 6 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2358882B1 (en) 2008-11-18 2017-07-26 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
TWI504749B (zh) 2009-03-16 2015-10-21 Dsm Ip Assets Bv 於網黏菌門微生物中生產蛋白質之技術
CA3012998C (en) * 2009-03-19 2021-09-07 Dsm Ip Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
US20100272875A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Monsanto Technology Llc Omega-3 enriched cereal, granola, and snack bars
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
US8993841B2 (en) 2009-06-08 2015-03-31 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid elongation components and uses thereof
EP2448955B1 (en) * 2009-06-29 2015-09-30 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-acp thioesterase genes and uses therefor
CA3037072C (en) 2009-07-17 2022-07-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
EP3418387B1 (en) 2009-08-31 2020-11-25 Basf Plant Science Company GmbH Regulatory nucleic acid molecules for enhancing seed-specific gene expression in plants promoting enhanced polyunsaturated fatty acid synthesis
WO2011037207A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 国立大学法人九州大学 ストラメノパイルの形質転換方法
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
CA2781559C (en) 2009-11-24 2018-09-04 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
US9388437B2 (en) 2010-06-25 2016-07-12 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
JP2012096498A (ja) * 2010-11-05 2012-05-24 Tomoegawa Paper Co Ltd 両面印刷用熱転写受像シートおよびその製造方法
CN102559710B (zh) * 2011-06-27 2013-10-30 中国农业科学院油料作物研究所 等鞭金藻δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法
US8946460B2 (en) 2012-06-15 2015-02-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Process for producing polyunsaturated fatty acids in an esterified form
CN104520313A (zh) 2012-08-03 2015-04-15 巴斯夫植物科学有限公司 新的酶、酶组合物及其用途
PT2970926T (pt) * 2013-03-13 2018-03-22 Dsm Nutritional Products Ag Modificação genética de microrganismos
MX2016000225A (es) 2013-07-05 2016-06-15 Basf Plant Science Co Gmbh Elementos potenciadores de la expresion o actividad genica.
CA2932740C (en) 2013-12-17 2021-11-23 Basf Plant Science Company Gmbh Methods for conversion of the substrate specificity of desaturases
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
KR102527795B1 (ko) 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
MX2017006304A (es) 2014-11-14 2018-02-16 Basf Plant Science Co Gmbh Materiales y metodos para aumentar el contenido de tocoferol en semillas oleaginosas.
CN107236679A (zh) * 2017-04-27 2017-10-10 广州弘宝元生物科技有限公司 一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法
CN112040766A (zh) * 2018-04-13 2020-12-04 嘉吉公司 栽培含lc-pufa的转基因芸苔属植物的方法
CA3129494A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cargill, Incorporated Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
US20230397562A1 (en) 2020-11-04 2023-12-14 Cargill, Incorporated Harvest Management
WO2022204454A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Cargill, Incorporated Fertilizer management

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8025A (en) * 1851-04-08 Apparatus eor boltiitg flouk
US4873191A (en) * 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
NL8200523A (nl) * 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4441972A (en) * 1983-04-08 1984-04-10 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4476004A (en) * 1983-04-08 1984-10-09 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4806476A (en) * 1983-09-08 1989-02-21 Lovelace Medical Foundation Efficient cell fusion process
US4608339A (en) * 1983-10-25 1986-08-26 Yoakum George H Protoplast fusion method for high-frequency DNA transfection in human cells
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
US4686186A (en) * 1984-09-26 1987-08-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant vector and eukaryotic host transformed thereby
US5223263A (en) * 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US4970162A (en) * 1985-11-13 1990-11-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human-mouse hybrid cell line expressing monocyte-macrophage properties
US4935350A (en) * 1985-11-18 1990-06-19 Amgen Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability
US4784737A (en) * 1986-04-18 1988-11-15 The United States Department Of Energy Electromicroinjection of particles into living cells
US4906576A (en) * 1986-05-09 1990-03-06 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US4923814A (en) * 1986-05-09 1990-05-08 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US5215914A (en) * 1986-06-18 1993-06-01 American Registry Of Pathology Adherent and invasive mycoplasma
US5364761A (en) * 1986-07-24 1994-11-15 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Method for isolating a DNA encoding an autonomously replicating sequence
US4801540A (en) * 1986-10-17 1989-01-31 Calgene, Inc. PG gene and its use in plants
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4997764A (en) * 1987-04-23 1991-03-05 New York University Transformation of human B-lympocytes with Epstein Barr virus and c-myc containing vectors
CA1297431C (en) * 1987-04-24 1992-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the isolation of nucleic acids
US5063162A (en) * 1987-04-24 1991-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Process for isolating nucleic acids utilizing protease digestion
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
DE3730246A1 (de) * 1987-09-09 1989-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh Expressionsvektor und verfahren zur expression von heterologen proteinen in saeugerzellen
JP2798459B2 (ja) * 1988-01-21 1998-09-17 マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー エレクトロポレーションを利用した診断装置及び分子の組織内移動装置
US4955378A (en) * 1988-05-02 1990-09-11 University Of South Florida Apparatus and methods for performing electrofusion at specific anatomical sites
US5162215A (en) * 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
GB8823068D0 (en) * 1988-09-30 1988-11-09 Ici Plc Recombinant dna
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5144019A (en) * 1989-06-21 1992-09-01 City Of Hope Ribozyme cleavage of HIV-I RNA
US5272262A (en) * 1989-06-21 1993-12-21 City Of Hope Method for the production of catalytic RNA in bacteria
US5501967A (en) * 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
GB8918226D0 (en) * 1989-08-09 1989-09-20 Wellcome Found Dna assays
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5434086A (en) * 1989-08-22 1995-07-18 The Regents Of The University Of Michigan Method of testing potential cystic fibrosis treating compounds using cells in culture
US5149796A (en) * 1989-08-31 1992-09-22 City Of Hope Chimeric DNA-RNA catalytic sequences
DE69033911D1 (de) * 1989-10-24 2002-03-14 Chiron Corp System zur freisetzung von infektiösen proteinen
AU6882791A (en) * 1989-11-22 1991-06-13 Children's Hospital Of Los Angeles Bcr/abl transgenic animals as models for philadelphia chromosome positive chronic myelogenous and acute lymphoblastic leukemia
US5292658A (en) * 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US5436392A (en) * 1990-01-12 1995-07-25 Arizona Technology Development Corporation Transgenic plants expressing M. sexta protease inhibitor
CA2042093C (en) * 1990-05-09 2002-12-24 Gyula Hadlaczky Cell line carrying an excess of mammalian centromeres
WO1991019810A1 (en) * 1990-06-15 1991-12-26 California Biotechnology Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
ATE352612T1 (de) * 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5470730A (en) * 1990-09-28 1995-11-28 Immunex Method for producing TH -independent cytotoxic T lymphocytes
US5382524A (en) * 1990-10-24 1995-01-17 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-n-acetylgalactosaminidase
ATE169061T1 (de) * 1990-10-25 1998-08-15 Clague Pitman Hodgson Methode des gentransfers mittels retrotransposons
US5300431A (en) * 1991-02-26 1994-04-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system
US5461032A (en) * 1991-03-01 1995-10-24 Fmc Corporation Insecticidally effective peptides
NZ241910A (en) * 1991-03-11 1993-09-27 Ici Plc Biological proteins from mirabilis, their use and manufacture
US5240840A (en) * 1991-04-05 1993-08-31 Regents Of The University Of Michigan Dna superfragment cloning
US5468634A (en) * 1991-06-24 1995-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Axl oncogene
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5288625A (en) * 1991-09-13 1994-02-22 Biologic Research Center Of The Hungarian Academy Of Sciences Mammalian artificial chromosomes
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
PH31293A (en) * 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
CA2098498A1 (en) * 1991-10-15 1993-04-16 Ning-Sun Yang Particle-mediated transformation of mammalian unattached cells
US5246842A (en) * 1991-10-30 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of eicosapentaenoic acid from filamentous fungi utilizing lactose as a primary carbon source
US5260191A (en) * 1992-01-30 1993-11-09 Agracetus, Inc. Method for diagnosing tumors
US5266600A (en) * 1992-02-28 1993-11-30 Bristol-Myers Squibb Company BU-4641V, an antibacterial, antiviral and antitumor antibiotic
JP3314241B2 (ja) * 1992-04-06 2002-08-12 ヤマハ発動機株式会社 自動二輪車用エンジンの排気浄化装置
US5501662A (en) * 1992-05-22 1996-03-26 Genetronics, Inc. Implantable electroporation method and apparatus for drug and gene delivery
EP0578627A1 (en) * 1992-07-09 1994-01-12 Monsanto Company Virus resistant plants
US5453357A (en) * 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
US5496731A (en) * 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
US5468615A (en) * 1993-07-01 1995-11-21 The Upjohn Company Binding assay employing a synthetic gene for D4 dopamine receptors
US5413914A (en) * 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
US5457182A (en) * 1994-02-15 1995-10-10 Merck & Co., Inc. FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
IT1274168B (it) 1994-04-15 1997-07-15 Eniricerche Spa Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US5543319A (en) * 1995-03-31 1996-08-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombination-proficient avian/mammalian microcell hybrids
US6133503A (en) * 1995-10-31 2000-10-17 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US5721118A (en) * 1995-10-31 1998-02-24 The Regents Of The University Of California, San Diego Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US6077697A (en) * 1996-04-10 2000-06-20 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US6025155A (en) * 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
CA2261231C (en) 1996-07-23 2012-11-27 Nagase Biochemicals, Ltd. Process using ulkenia sp. to prepare docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
US6051754A (en) * 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
CN1253588A (zh) * 1997-04-11 2000-05-17 艾博特公司 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物
GB9724783D0 (en) * 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
HUP0101153A3 (en) 1997-12-23 2006-03-28 Univ Bristol Bristol Desaturase
CA2330024C (en) 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
AU1097900A (en) * 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
AU6503699A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
EP1121150A4 (en) 1998-10-09 2003-06-04 Merck & Co Inc DELAT 6 FATTY ACID DESATURASE
CN1326344A (zh) 1998-10-15 2001-12-12 Dsm公司 Pufa增补剂
JP4383671B2 (ja) 1998-12-07 2009-12-16 ワシントン ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション 不飽和化酵素、およびそれらを多価不飽和脂肪酸の合成のために用いる方法
WO2000051444A1 (fr) 1999-03-04 2000-09-08 Suntory Limited Utilisation d'une matiere contenant de l'acide docosapentaenoique
KR20020025069A (ko) 1999-06-07 2002-04-03 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제
JP3520328B2 (ja) 2000-10-06 2004-04-19 奈良先端科学技術大学院大学長 コーヒー属植物のテオブロミン合成酵素ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子
CA2435685C (en) * 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10137374A1 (de) * 2001-07-31 2003-02-27 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure in transgenen Organismen
CA2519169C (en) 2002-03-16 2013-04-30 The University Of York Transgenic plants expressing enzymes involved in fatty acid biosynthesis
WO2004090123A2 (de) 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle

Also Published As

Publication number Publication date
CN101845446B (zh) 2016-01-20
CA2421267C (en) 2009-01-06
ES2399806T3 (es) 2013-04-03
JP2004516017A (ja) 2004-06-03
US20110229944A1 (en) 2011-09-22
US20120094904A1 (en) 2012-04-19
ES2343106T3 (es) 2010-07-23
CN1551914A (zh) 2004-12-01
US7671252B2 (en) 2010-03-02
EP1911837B1 (en) 2011-05-25
NO331104B1 (no) 2011-10-10
ATE510908T1 (de) 2011-06-15
JP4071622B2 (ja) 2008-04-02
US20060117414A1 (en) 2006-06-01
US20090305365A1 (en) 2009-12-10
AU2007203008B2 (en) 2010-07-29
ATE463560T1 (de) 2010-04-15
EP2166087A2 (en) 2010-03-24
CA2421267A1 (en) 2002-04-04
CN100567483C (zh) 2009-12-09
DK1911837T3 (da) 2011-08-29
US7977469B2 (en) 2011-07-12
AU2007203008A1 (en) 2007-07-19
JP2006314321A (ja) 2006-11-24
CN101845446A (zh) 2010-09-29
JP4365387B2 (ja) 2009-11-18
AU2002218447C9 (en) 2008-04-17
EP2166087B1 (en) 2012-11-14
EP1911837A3 (en) 2008-04-30
US20200002712A1 (en) 2020-01-02
AU2002218447C1 (en) 2002-04-08
JP2009148297A (ja) 2009-07-09
US20160369289A1 (en) 2016-12-22
DE60141760D1 (de) 2010-05-20
NO20101157L (no) 2003-05-15
WO2002026946A3 (en) 2003-05-08
US9359597B2 (en) 2016-06-07
EP1322752A2 (en) 2003-07-02
NO20031405L (no) 2003-05-15
EP1322752B1 (en) 2010-04-07
US8088906B2 (en) 2012-01-03
WO2002026946A2 (en) 2002-04-04
CN105483142A (zh) 2016-04-13
JP4456172B2 (ja) 2010-04-28
US7087432B2 (en) 2006-08-08
EP1322752B2 (en) 2015-02-11
DK1322752T3 (da) 2010-07-19
US20020156254A1 (en) 2002-10-24
NO20031405D0 (no) 2003-03-27
PT1322752E (pt) 2010-05-06
AU2002218447B2 (en) 2007-03-29
EP1911837A2 (en) 2008-04-16
PT1911837E (pt) 2011-06-07
EP2166087A3 (en) 2010-04-07
AU1844702A (en) 2002-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO332128B1 (no) Isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle, fremgangsmate for a fremstille et polypeptid og DHA,DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for frembringelse av en celle som kan produsere DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for a modulere fremstillingen av DHA, DPA, EPA eller AA, fremgangsmate for stor-skala fremstilling av DHA, DPA, EPA eller AA, samt preparat og anvendelse derav
AU2002218447A1 (en) Fad4, Fad5, Fad5-2, and Fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
CA2656786C (en) Fatty acid desaturases and uses thereof
CA2737595C (en) Utilization of fatty acid desaturases from hemiselmis spp.
CA2608848C (en) Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired