BRPI1006435B1 - molécula de ácido nucleico recombinante e célula hospedeira microbiana - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR PELO MENOS UM AGPl, PARA PRODUZIR LIPÍDIOS ENRIQUECIDOS, PARA PRODUZIR VETOR RECOMBINANTE, PARA PRODUZIR CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE DHA E PARA ISOLAR LIPÍDÍOS, POLIPEPTÍDEOS E COMPOSIÇÃO. A presente invenção se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas e polipeptídeos das sintases de ácidos graxos poli-insaturados (AGPl) de traustocitridios envolvidas na produção de AGPls, incluindo AGPls enriquecidos com ácido docosaexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ou uma combinação destes. A presente invenção está direcionada para vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico, composições compreendendo as moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, e métodos de produção e uso dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas e polipeptídeos das sintases de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) envolvidas na produção de AGPIs, incluindo AGPIs enriquecidos com ácido docosaexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ou uma combinação destes. A presente invenção é direcionada a vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico, composições compreendendo as moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, e métodos de produção e uso dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os Traustocitrídios são microrganismos da ordem Thraustochytriales, incluindo membros do gênero Thraustochytrium e gênero Schizochytrium, e foram reconhecidos como uma fonte alternativa de AGPIs. Vide, por exemplo, a Patente US 5.130.242. Foi demonstrado recentemente que sistemas similares a policetídeo sintase (PKS) em bactérias marinhas e traustocitrídios (thraustochytrids) são capazes de sintetizar ácidos graxos poli- insaturados (AGPI) a partir da acetil-CoA e malonil-CoA. Estes sistemas similares a PKS-sintase também são referidos no presente como sistemas da sintase de AGPI. Os sistemas AGPI sintase nas bactérias marinhas Shewanella e Vibrio marinus estão descritos na Patente US 6.140.486. Um sistema AGPI sintase em um traustocitrídio do gênero Schizochytrium está descrito na Patente US 6.566.583. Sistemas AGPI sintase em traustocitrídios (thraustochytrids) do gênero Schizochytrium e gênero Thraustochytrium também estão descritos na Patente US 7.247.461. A Patente US 7.211.418 descreve um sistema AGPI sintase em um traustocitrídio do gênero Thraustochytrium e a produção de ácido eicosapentaenóico (C20:5, ômega-3) (EPA) e outros AGPIs usando o sistema. A Patente US 7.217.856 descreve sistemas AGPI sintase em Shewanella olleyana e Shewanella japonica. O documento WO 2005/097982 descreve um sistema AGPI sintase na cepa SAM2179. As patentes US 7.208.590 e US 7.368.552 descrevem genes e proteínas da AGPI sintase de Thraustochytrium aureum.
[003] Os sistemas PKS que foram tradicionalmente descritos na literatura caem em um dos três tipos básicos, normalmente referidos como Tipo I (modular ou iterativo), Tipo II e Tipo III. O sistema PKS modular Tipo I também foi referido como sistema PKS “modular” e o sistema PKS tipo I iterativo do também foi referido como um sistema PKS do “tipo I”. O sistema tipo II é caracterizado por proteínas separáveis, sendo que cada delas realiza uma reação enzimática distinta. As enzimas trabalham em conjunto para produzir o produto final e cada enzima individual do sistema normalmente participa várias vezes na produção do produto final. Este tipo de sistema funciona de maneira análoga aos sistemas ácido graxo sintases (FAS) encontrados em plantas e bactérias. Os sistemas PKS Tipo I iterativos são semelhantes aos sistemas Tipo II, onde as enzimas são usadas de forma iterativa para produzir o produto final. O sistema iterativo Tipo I difere do sistema Tipo II de modo que as atividades enzimáticas, em vez de estarem associadas com as proteínas separáveis, elas ocorrem como domínios de proteínas maiores. Este sistema é semelhante aos sistemas FAS tipo I encontrado em animais e fungos.
[004] Em contraste com os sistemas Tipo II, cada domínio de enzima nos sistemas PKS modular do tipo I é usado apenas uma vez na produção do produto final. Os domínios são encontrados em proteínas muito grandes e o produto de cada reação é passada para outro domínio na proteína PKS.
[005] Os sistemas do tipo III foram mais recentemente descobertos e pertencem à família da chalcona sintase de plantas de enzimas de condensação. Os PKSs tipo III são distintos dos sistemas PKS do tipo I e tipo II e utilizam substratos CoA livres em reações de condensação iterativas para produzirem normalmente um produto final heterocíclico.
[006] Na via convencional ou padrão para a síntese de ácidos graxos poli-insaturados, ácidos graxos saturados com comprimento de cadeia média (produtos do sistema da sintase de ácido graxo (FAS)) são modificados por uma série de reações de alongamento e dessaturação. Os substratos para a reação de alongamento são acil-CoA graxos (a cadeia de ácido graxo a ser alongada) e malonil-CoA (a fonte dos dois carbonos adicionados durante cada reação de alongamento). O produto da reação de elongase é uma acil-CoA graxa com dois carbonos adicionais na cadeia linear. As dessaturases criam ligações duplas cis na cadeia de ácidos graxos pré-existente por meio da extração de dois hidrogênios em uma reação dependente de oxigênio. Os substratos para a dessaturases são acil-CoA (em alguns animais) ou o ácido graxo que é esterificado na cadeia principal glicerol de um fosfolipídio (por exemplo, fosfatidilcolina).
[007] Os ácidos graxos são classificados com base no comprimento e características de saturação da cadeia de carbono. Ácidos graxos são denominados ácidos graxos de cadeia curta, de cadeia média ou, de cadeia longa com base no número de carbonos presentes nas cadeias, e são denominados de ácidos graxos saturados, quando ligações duplas entre os átomos de carbono não estão presentes, e são denominados de ácidos graxos insaturados quando ligações duplas estão presentes. Ácidos graxos de cadeia longa insaturados são monoinsaturados quando apenas uma dupla ligação está presente e são poli-insaturados, quando mais de uma ligação dupla está presente.
[008] Os AGPIs são classificados com base na posição da primeira dupla ligação a partir da extremidade metila do ácido graxo. Os ácidos graxos ômegas-3 (n-3) contêm uma primeira dupla ligação no terceiro carbono, enquanto os ácidos graxos ômega-6 (n-6) contêm uma primeira dupla ligação no sexto carbono. Por exemplo, o ácido docosaexaenoico (“DHA”) é um AGPI ômega-3 com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 duplas ligações, muitas vezes designado como “22:6 n-3”. Outros AGPIs ômega-3 incluem o ácido eicosapentaenóico (“EPA”), que é designado "20:5 n-3", e ácido docosapentaenoico ômega-3 (“DPA n-3”), que é designado de “22: 5 n-3”. DHA e EPA foram denominados de ácidos graxos “essenciais”. AGPIs ômega-6 importantes incluem o ácido araquidônico (“ARA”), designado “20:4 n-6”, e ácido docosapentaenoico ômega-6 (“DPA n-6”), designado “22:5 n-6”.
[009] Os ácidos graxos ômega-3 são moléculas biologicamente importantes que afetam a fisiologia celular devido à sua presença nas membranas celulares, regulam a produção e expressão gênica de compostos biologicamente ativos, e servem como substratos biossintéticos. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999). O DHA, por exemplo, é responsável por aproximadamente 15% - 20% dos lipídios no córtex cerebral humano, e 30% - 60% dos lipídios na retina está concentrada nos testículos e espermatozoides, e é um componente importante do leite materno. Berge, J.P., e Barnathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005). O DHA é responsável por até 97% dos ácidos graxos ômega-3 no cérebro e até 93% dos ácidos graxos ômega-3 na retina. Além disso, o DHA é essencial para o desenvolvimento tanto fetal quanto infantil, bem como para a manutenção das funções cognitivas nos adultos. Id. Pelo fato dos ácidos graxos ômega-3 não serem sintetizados de novo no corpo humano, esses ácidos graxos devem ser derivados de fontes nutricionais.
[0010] Óleo de linhaça e óleos de peixe são considerados boas fontes alimentares de ácidos graxos ômega-3. O óleo de linhaça não contém EPA, DHA, DPA, ou ARA, mas contém ácido linolênico (C18:3 n-3), uma unidade estrutural que permite que o corpo fabrique EPA. Há evidências, no entanto, de que a taxa de conversão metabólica pode ser lenta e variável, principalmente entre aqueles com a saúde debilitada. Óleos de peixe variam consideravelmente no tipo e nível de composição de ácidos graxos, dependendo da espécie em particular e de suas dietas. Por exemplo, peixes criados pela aquicultura tendem a ter um nível mais baixo de ácidos graxos ômega-3 do que aqueles encontrados na natureza. Além disso, os óleos de peixe têm o risco de conter contaminantes ambientais e podem estar associados a problemas de estabilidade, e odor ou gosto de peixe.
[0011] Os óleos produzidos a partir de traustocitrídios muitas vezes possuem perfis de ácidos graxos poli-insaturados mais simples do que os óleos correspondentes dos peixes ou microalgas. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999). Cepas de espécies de traustocitrídios foram descritas por produzirem ácidos graxos ômega-3 como uma percentagem elevada dos ácidos graxos totais produzidos pelos organismos. Patente US 5.130.242; Huang, J. et al, J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003). No entanto, traustocitrídios isolados variam na identidade e quantidades de AGPIs produzidas, de tal forma que algumas cepas descritas anteriormente podem ter perfis indesejáveis de AGPIs.
[0012] Têm se realizado esforços para produzir AGPIs em culturas de plantas de sementes oleaginosas pela modificação dos ácidos graxos produzidos endogenamente. A modificação genética destas plantas com diferentes genes individuais para elongases e dessaturases de ácidos graxos produziu folhas ou sementes contendo níveis mensuráveis de AGPIs, tais como EPA, mas também contém níveis significativos de mistura de AGPIs cadeia mais curta e menos insaturados (Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004); Publicação PCT WO 04/071467; Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)); Napier e Sayanova, Proc. Nutrition Society (54:387-393 (2005); Robert et al, Functional Plant Biology 32:473-419 (2005); e Pedido de Patente Publicado US 2004/0172682).
[0013] Desse modo, existe uma necessidade permanente para o isolamento de moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos associados com perfis de AGPIs desejáveis e métodos para produzir perfis de AGPIs desejáveis por meio da utilização de tais moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0014] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 1, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que compreende a atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo em atividade de beta-cetoacil-ACP sintase (KS), atividade de malonil-CoA:ACP aciltransferase (MAT), atividade de proteína transportadora de acila (ACP), atividade cetoredutase (KR), atividade de beta-hidroxi-ACP desidratase (DH), e combinações das mesmas, (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 7, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 9, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade MAT; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 ou 23, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP; (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 11, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP; (f) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 25, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KR, e (g) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 27, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[0015] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos, 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 1, 7. 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27, respectivamente.
[0016] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 2, e no qual o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade DH, e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 8, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 10, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade MAT; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 ou 24, e no qual o polipeptídeo compreende atividade ACP; (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% >idêntica a SEQ ID NO: 12, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (f) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 26, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KR; e (g) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% >idêntica a SEQ ID NO: 28, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH.
[0017] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28, respectivamente.
[0018] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 3, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que compreende a atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade fator de elongação de cadeia (CLF), atividade aciltransferase (AT), atividade enoil-ACP redutase (ER) e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 29, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 31, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade CLF; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 33, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AT; e (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 35, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[0019] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 3, 29, 31, 33 e 35, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 3, 29, 31, 33 e 35, respectivamente.
[0020] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 4, e no qual o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER, e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 30, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 32, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade CLF; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 34, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade AT; e (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 36, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0021] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 34 e 36, respectivamente. Em alguns exemplos de realização os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 34 e 36, respectivamente.
[0022] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 5, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que compreende a atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 37, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 39, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH; e (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 41, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[0023] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 5, 37, 39 e 41, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 5, 37, 39 e 41, respectivamente.
[0024] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 6, e no qual o polipeptídeo compreende atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 38, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 40, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH; e (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 42, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0025] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 6, 38, 40 e 42, respectivamente.
[0026] Em alguns exemplos de realização os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 38, 40 e 42, respectivamente.
[0027] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 120, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que possui atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo em atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, a atividade KR, atividade DH e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 74, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 76, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade MAT; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 ou 98, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP; (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 78, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP; (f) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 100, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KR; e (g) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 118, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[0028] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 68, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 118 e 120, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 68, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 118 e 120, respectivamente.
[0029] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 69, e no qual o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade DH, e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 75, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 77, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade MAT; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99, e no qual o polipeptídeo compreende atividade ACP; (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 79, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (f) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 101, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KR; e (g) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% >idêntica a SEQ ID NO: 119, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH.
[0030] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 69, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 e 119, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 69, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 e 119, respectivamente.
[0031] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 70 ou SE ID NO: 121, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que compreende a atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo em atividade KS, atividade fator de elongação de cadeia (CLF), atividade aciltransferase (AT), atividade enoil-ACP redutase (ER) e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 102, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 104, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade CLF; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 106, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AT; e (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 108, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[0032] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 70, 102, 104, 106, 108 e 121, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 70, 102, 104, 106, 108 e 121, respectivamente.
[0033] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 71, e no qual o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER, e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 103, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 105, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade CLF; (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 107, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade AT; e (e) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 109, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0034] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 71, 103, 105, 107 e 109, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 71, 103, 105, 107 e 109, respectivamente.
[0035] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 122, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo que compreende a atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo da atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 110, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 112, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH; e (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 114, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[0036] Em alguns exemplos de realização, as sequências de polinucleotídeos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 72, 110, 112, 114 e 122, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 72, 110, 112, 114 e 122, respectivamente.
[0037] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada, selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 73, e no qual o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 111, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH; (c) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 113, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade DH; e (d) molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 115, e no qual o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0038] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 73, 111, 113 e 115, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as sequências de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 73, 111, 113 e 115, respectivamente.
[0039] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss que codifica um polipeptídeo que compreende atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade CLF, atividade AT, atividade ER, atividade DH, e combinações destas, em que o polinucleotídeo hibridiza sob condições estringentes de maneira complementar a qualquer uma das sequências de polinucleotídeos descritas acima.
[0040] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss que é totalmente complementar a qualquer uma das sequências de polinucleotídeos descritas acima.
[0041] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descrita acima ou combinações das mesmas e uma sequência de controle de transcrição. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico recombinante é um vetor recombinante.
[0042] A presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira que expressa qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas acima, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas acima, e combinações destas. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula vegetal, célula microbiana e célula animal. Em alguns exemplos de realização, a célula microbiana é uma bactéria. Em algumas realizações, a bactéria é E. coli. Em algumas realizações, a bactéria é uma bactéria marinha. Em alguns exemplos de realização, a célula microbiana é um traustocitrídio. Em alguns exemplos de realização, o traustocitrídio é Schizochytrium. Em alguns exemplos de realização, o traustocitrídio é Thraustochytrium. Em alguns exemplos de realização, o traustocitrídio é uma Ulkenia.
[0043] A presente invenção é direcionada a um método para produzir pelo menos um AGPI, compreendendo:
[0044] a expressão de um gene AGPI sintase em uma célula hospedeira sob condições eficazes para a produção de AGPI, onde o gene da AGPI sintase compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas descritas acima, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas acima, ou combinações destas, e em que pelo menos um AGPI é produzido. Em um aspecto deste exemplo de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula vegetal, célula animal isolada e célula microbiana. Em outro aspecto deste exemplo de realização, o pelo menos um AGPI compreende ácido docosaexaenoico (DHA) ou ácido eicosapentaenoico (EPA).
[0045] A presente invenção é direcionada a um método para produzir lipídios enriquecidos por DHA, EPA ou uma combinação destes, compreendendo: a expressão de um gene AGPI sintase em uma célula hospedeira em condições eficazes para produzir lipídios, em que o gene da AGPI sintase compreende qualquer molécula de ácido nucleico isolada descrita acima, qualquer molécula de ácido nucleico recombinante descrita acima, ou combinações destas em uma célula hospedeira, de modo que são produzidos lipídios enriquecidos com DHA, EPA ou uma combinação destes. A presente invenção é direcionada a um método para a produção de vetor recombinante compreendendo a inserção de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas descritas acima em um vetor.
[0046] A presente invenção é direcionada a um método de a produção de uma célula hospedeira recombinante compreendendo a introdução de um vetor recombinante, tal como descrito anteriormente, em uma célula hospedeira. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula vegetal, célula animal isolada e célula microbiana.
[0047] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado codificado por qualquer uma das sequências de polinucleotídeos descritas acima.
[0048] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, a atividade KR, atividade DH e combinações destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 8, em que o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 10, em que o polipeptídeo compreende a atividade MAT; (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22 ou 24, em que o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (e) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 12, em que o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (f) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 26, em que o polipeptídeo compreende a atividade KR; e (g) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 28, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH.
[0049] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28, respectivamente.
[0050] Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28, respectivamente.
[0051] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 4, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER e combinações destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 30, em que o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 32, em que o polipeptídeo compreende a atividade CLF; (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 34, em que o polipeptídeo compreende a atividade AT; e (e) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 36, em que o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0052] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 34 e 36, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 34 e 36, respectivamente.
[0053] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 6, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 38, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 40, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH; e (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 42, em que o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0054] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 6, 38, 40 e 42, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 6, 38, 40 e 42, respectivamente.
[0055] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionada a partir do grupo que consistindo em: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 69, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade DH e combinações destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 75, em que o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 77, em que o polipeptídeo compreende a atividade MAT; (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99, em que o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (e) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 79, em que o polipeptídeo compreende a atividade ACP; (f) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 101, em que o polipeptídeo compreende a atividade KR; e (g) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 119, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH.
[0056] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 69, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 e 119, respectivamente. Em alguns exemplos de realização os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 69, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 e 119, respectivamente.
[0057] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionada a partir do grupo que consistindo em: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 71, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER e uma combinação destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 103, em que o polipeptídeo compreende a atividade KS; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 105, em que o polipeptídeo compreende a atividade CLF; (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 107, em que o polipeptídeo compreende a atividade AT; e (e) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 109, em que o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0058] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 71, 103, 105, 107 e 109, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 71, 103, 105, 107 e 109, respectivamente.
[0059] A presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado, selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 73, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste em atividade DH, atividade ER e combinações destas; (b) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 111, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH; (c) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 113, em que o polipeptídeo compreende a atividade DH; e (d) polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 115, em que o polipeptídeo compreende a atividade ER.
[0060] Em alguns exemplos de realização, as sequências de aminoácidos são pelo menos 90% idênticas ou, pelo menos 95% idênticas com as SEQ ID NOs: 73, 111, 113 e 115, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem as sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 73, 111, 113 e 115, respectivamente.
[0061] Em alguns exemplos de realização, qualquer um dos polipeptídeos isolados da invenção pode ser um polipeptídeo de fusão.
[0062] A presente invenção é direcionada a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos descritos acima e um veículo biologicamente aceitável.
[0063] A presente invenção é direcionada a um método para aumentar a produção de DHA, EPA ou uma combinação destes em um organismo possuindo atividade AGPI sintase, compreendendo: a expressão de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas acima, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas acima, ou combinações destas, no organismo em condições eficazes para produzir DHA, EPA, ou uma combinação destes, em que a atividade AGPI sintase substitui uma atividade inativa ou excluída, e introduz uma nova atividade, ou aumenta uma atividade existente no organismo, e em que a produção de DHA, EPA, ou uma combinação destes no organismo é aumentada.
[0064] A presente invenção é direcionada a um método de isolamento de lipídios a partir de uma célula hospedeira, que compreende: (a) a expressão de um gene AGPI sintase em uma célula hospedeira sob condições eficazes para a produção de lipídios, em que o gene da AGPI sintase compreende qualquer molécula de ácido nucleico isolada descrita anteriormente, qualquer molécula de ácido nucleico recombinante descrita anteriormente, ou combinações destas em uma célula hospedeira, de modo que são produzidos lipídios enriquecidos com DHA, EPA ou uma combinação destes. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula vegetal, célula animal isolada e célula microbiana. Em alguns exemplos de realização, os lipídios compreendem DHA, EPA, ou uma combinação destes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0065] A FIG. 1 exibe a arquitetura genética das AGPI sintases de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 da presente invenção.
[0066] A FIG. 2 exibe a arquitetura genética de AGPI sintases de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 da presente invenção.
[0067] A FIG. 3 exibe a arquitetura de domínio de AGPI sintases de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 e Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10 212 da invenção e as sintases de Schizochytrium sp. ATCC 20888, Thraustochytrium sp. ATCC 20892, Thraustochytrium Aureum e SAM2179.
[0068] A FIG. 4 exibe um alinhamento de uma sequência de aminoácidos PFA1p de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 2) e uma sequência de aminoácidos PFA1p de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 69) da invenção com as sequências orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 (SEQ ID NO: 54) e Thraustochytrium sp. ATCC 20892 (SEQ ID NO: 56) e a sequência ORFA de Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO: 55).
[0069] A FIG. 5 exibe um alinhamento de uma sequência de aminoácidos PFA2p de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 4) e uma sequência de aminoácidos PFA2p de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 71) da invenção com as sequências orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888 (SEQ ID NO: 57) e Thraustochytrium sp. ATCC 20892 (SEQ ID NO: 58) e a sequência ORF B de Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO: 59).
[0070] A FIG. 6 exibe um alinhamento de uma sequência de aminoácidos PFA3p de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 6) e uma sequência de aminoácidos PFA3p de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 73) da invenção com as sequências orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 (SEQ ID NO: 61) e Thraustochytrium sp. ATCC 20892 (SEQ ID NO: 60).
[0071] A FIG. 7 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA1 (SEQ ID: 1) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0072] A FIG. 8 exibe a sequência de aminoácido da PFA1p (SEQ ID: 2) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0073] A FIG. 9 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA2 (SEQ ID: 3) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0074] A FIG. 10 exibe a sequência de aminoácido da PFA2p (SEQ ID: 4) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0075] A FIG. 11 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA3 (SEQ ID: 5) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0076] A FIG. 12 exibe a sequência de aminoácido da PFA3p (SEQ ID: 6) de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695.
[0077] A FIG. 13 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA1 (SEQ ID: 68) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212.
[0078] A FIG. 14 exibe uma sequência de polinucleotídeos PFA1 (SEQ ID: 120) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212 que foi códon-otimizado para a expressão em Schizochytrium.
[0079] A FIG. 15 exibe a sequência de aminoácido da PFA1p (SEQ ID: 69) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212.
[0080] A FIG. 16 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA2 (SEQ ID: 70) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212.
[0081] A FIG. 17 exibe uma sequência de polinucleotídeos PFA2 (SEQ ID: 121) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212 que foi códon-otimizado para a expressão em Schizochytrium.
[0082] A FIG. 18 exibe a sequência de aminoácido da PFA2p (SEQ ID: 71) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212.
[0083] A FIG. 19 exibe a sequência de polinucleotídeos PFA3 (SEQ ID: 72) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212.
[0084] A FIG. 20 exibe uma sequência de polinucleotídeos PFA3 (SEQ ID: 122) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212 que foi códon-otimizado para a expressão em Schizochytrium.
[0085] A FIG. 21 exibe a sequência de aminoácido da PFA3p (SEQ ID: 73) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212.
[0086] FIG. 22 mostra uma tabela dos códons de uso preferencial (codon usage) do Schizochytrium.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0087] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas e polipeptídeos das sintases de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) envolvidas na produção de AGPIs, incluindo AGPIs enriquecidos com ácido docosaexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ou uma combinação destes. A presente invenção é direcionada a vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico, composições compreendendo as moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, e métodos de produção e uso dos mesmos.
AGPI SINTASES
[0088] Conforme utilizado no presente, o termo “AGPI sintase” refere-se a uma enzima que está envolvida na produção de ácidos graxos poli- insaturados. Vide, por exemplo, Metz et al, Science 293:290-293 (2001).
[0089] A presente invenção é direcionada em parte a três subunidades da AGPI sintase denominadas PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), e PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), bem como os genes que codificam as subunidades, denominados PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), e PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122). Vide as Figuras 1-3 e 7-21. As AGPI sintases em outros traustocitrídios também foram designadas como ORF 1, ORF 2, e ORF 3, respectivamente, ou como orfA, orfB e orfC, respectivamente. Vide, por exemplo, Schizochytrium sp. (ATCC 20888) e Thraustochytrium sp. (ATCC: 20892) nas Patentes US 7.247.461 e US 7.256.022, referindo-se aos genes orfA, orfB e orfC e as proteínas correspondentes orfA, orfB e orfC e Thraustochytrium aureum (ATCC: 34 304) na Patente US 7.368.552, referindo- se aos genes e proteínas ORFA, ORF B e ORF C. Vide também as cepas, SAM2179 no documento WO/2005/097982, referindo-se a genes e proteínas ORF 1, ORF 2 e ORF 3.
MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO
[0090] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo sequências de polinucleotídeos para genes AGPI sintase e domínios derivados de um microrganismo isolado que é o objeto do pedido de patente copendente US 12/407687, depositado em 19 de março de 2009, incorporado ao presente pela referência em sua totalidade. O microrganismo foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste na Coleção de culturas Norte-Americana - American Type Culture Collection (ATCC), Depósito de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 7 de janeiro de 2009, e foi dado o número de acesso do ATCC: PTA- 9695, e também é referido como Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695. Quando expressos, estes genes produzem um perfil de ácido graxo único, que se caracteriza, em parte, pelos altos níveis de ácidos graxos ômega- 3, e especificamente, níveis elevados de DHA.
[0091] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo sequências de polinucleotídeos para genes AGPI sintase e domínios derivados de um microrganismo isolado que é o objeto do pedido de patente copendente US 61/296.456, depositado em 19 de janeiro de 2010, incorporado ao presente pela referência em sua totalidade. O microrganismo foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste na Coleção de cultura Norte-Americana - American Type Culture Collection (ATCC), Depósito de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 14 de julho de 2009 e foi dado o número de acesso do ATCC: PTA-10212, e também é referido como Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212. Quando expressos, estes genes produzem um perfil de ácido graxo único, que se caracteriza em parte por altos níveis de ácidos graxos ômega-3, e especificamente, altos níveis de DHA, EPA e uma combinação destes.
[0092] Conforme usado na presente invenção, um “polinucleotídeo” pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como as ligações encontradas em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). Um polinucleotídeo pode conter a sequência de nucleotídeos da sequência de cDNA de comprimento total, incluindo as sequências 5' e 3'não traduzidas, as sequências de codificação, bem como fragmentos, epítopos, domínios e variantes da sequência de ácidos nucleicos. O polinucleotídeo pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, polinucleotídeos podem ser compostos de DNA de fita simples e fita dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, RNA de fita simples ou fita dupla e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, moléculas híbridas compreendendo de DNA e RNA que podem ser de fita simples ou tipicamente, de fita dupla ou podem ser misturas de regiões de fita simples e fita dupla. Além disso, os polinucleotídeos podem ser compostos de regiões de cadeia tripla compreendendo RNA ou DNA ou ambos, RNA e DNA. Polinucleotídeos podem conter ribonucleosídeos (guanosina, adenosina, uridina, ou citidina, “moléculas de RNA”) ou desoxirribonucleosídeos (desoxiguanosina, desoxiadenosina, desoxitimidina, ou desoxicitidina; “moléculas de DNA”), ou qualquer fosfoéster análogo dos mesmos, tais como fosforotioatos e tioésteres. Os polinucleotídeos também podem conter uma ou mais bases modificadas ou cadeia principal de DNA ou RNA modificada para a estabilidade ou para outros propósitos. Bases “modificadas” incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA, desse modo “polinucleotídeo” abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas. O termo “molécula de ácido nucleico” refere- se apenas à estrutura primária e secundária da molécula, e não se limita a qualquer forma terciária específica. Desse modo, este termo engloba DNA de dupla fita encontrado, inter alia, em moléculas de DNA lineares ou circulares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos e cromossomos. Ao discutir a estrutura de determinadas moléculas de DNA dupla fita, as sequências podem ser descritas no presente de acordo com a convenção normal de dar somente a sequência na direção 5' para 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (ou seja, a fita que possui uma sequência homóloga ao mRNA).
[0093] A expressão molécula de ácido nucleico “isolada” refere-se a uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Outros exemplos de moléculas de ácido nucleico isoladas incluem moléculas de ácido nucleico compreendendo polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Moléculas de ácido nucleico isoladas de acordo com a presente invenção também incluem moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, uma molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou um terminador de transcrição.
[0094] Um “gene” refere-se a um conjunto de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, e inclui ácidos nucleicos cDNA e DNA genômico. "Gene"também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências intervenientes (introns) entre segmentos de codificação individuais (exons), bem como sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5’) e seguintes (sequências não codificadoras 3') à sequência codificadora. “Gene nativo" refere-se a um gene na forma como encontrado na natureza, com as suas próprias sequências regulatórias.
[0095] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo sequências de polinucleotídeos pelo menos 80% idênticas com as sequências de polinucleotídeos do Schizochytrium sp. ATCC: PTA-9695 PFA1 (SEQ ID NO: 1), Schizochytrium sp. ATCC: PTA-9695 PFA2 (SEQ ID NO: 3), Schizochytrium sp. ATCC: PTA-9695 PFA3 (SEQ ID NO: 5), Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 PFAl (SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 120), Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 PFA2 (SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 121), Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 PFA3 (SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 122), e combinações destes, em que os polinucleotídeos codificam polipeptídeos que compreende uma ou mais atividades AGPI sintase.
[0096] As atividades AGPI sintase são associadas com um ou mais domínios em cada polipeptídeo sintase, no qual os domínios podem ser identificados por seus motivos estruturais ou funcionais conservados com base em sua homologia com motivos conhecidos, e também podem ser identificadas com base em suas atividades bioquímicas específicas. Vide, por exemplo, Patente US 7.217.856 incorporada ao presente pela referência em sua totalidade. Exemplos de domínios AGPI sintase incluem: o domínio beta- cetoacil-ACP sintase (KS), domínio malonil-CoA:ACP aciltransferase (MAT), domínios proteína transportadora de acila (ACP), domínio cetoreductase (KR) e domínio beta-hidroxi-ACP desidratase (DH) em PFA1p; o domínio KS, domínio do fator de elongação de cadeia (CLF), domínio aciltransferase (AT), e domínio enoil-ACP redutase (ER) em PFA2p; e os domínios DH e domínio ER em PFA3p.
[0097] Um polipeptídeo ou domínio de um polipeptídeo possuindo atividade biológica (função) beta-cetoacil-ACP sintase (KS) foi previamente demonstrado por ser capaz de realizar a etapa inicial do ciclo de reação do alongamento de ácido graxo. O termo “beta-cetoacil-ACP sintase” tem sido usado de forma alternada com os termos “3-ceto acil- ACP sintase”, “beta- cetoacil-ACP sintase”, e “ceto-acil ACP sintase”. Em outros sistemas, foi demonstrado que o grupo acila para o alongamento está ligado a um resíduo de cisteína no sítio ativo da KS por uma ligação tioéster, e a acila-KS sofre condensação com malonil-ACP para formar -cetoacil-ACP, CO2 e KS não ligado (“livre”). Em tais sistemas, a KS foi demonstrada por possuir maior especificidade ao substrato do que outros polipeptídeos do ciclo de reação. Polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família KS por homologia com as sequências KS conhecidas.
[0098] Um polipeptídeo ou um domínio de um polipeptídeo possuindo atividade malonil-CoA:ACP aciltransferase (MAT) foi demonstrada anteriormente por ser capaz de transferir a fração malonil a partir da malonil- CoA para a ACP. O termo “malonil-CoA:ACP aciltransferase” tem sido usada de forma alternada com “malonil aciltransferase”. Além do motivo de sítio ativo (GxSxG), foi demonstrado que as MATs possuem um motivo estendido (aminoácidos R e Q em posições-chave). Os polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família MAT por homologia com as sequências MAT conhecidas e por sua estrutura de motivo estendida.
[0099] Um polipeptídeo ou um domínio de um polipeptídeo possuindo atividade proteína transportadora de acila (ACP) foi previamente mostrada por ser capaz de funcionar como um transportados de cadeias de acila graxas em crescimento por meio de uma ligação tioéster a um co-fator covalentemente ligado. As ACPs são tipicamente de cerca de 80 a cerca de 100 aminoácidos de comprimento e foram mostradas por serem convertidas de apo-formas inativas em holo-formas funcionais por meio da transferência da fração fosfopanteteinila de CoA para um resíduo de serina altamente conservado da ACP. Também foi demonstrado que os grupos acila são anexados às ACP por uma ligação tioéster na extremidade terminal livre da fração fosfopanteteinila. A presença de variações de um motivo do sítio ativo (LGIDS*) também foi reconhecida como uma assinatura das ACPs. A funcionalidade das serinas do sítio ativo (S*) foi demonstrada em uma AGPI sintase bacteriana (Jiang et al., J. Am. Chem. Soc. 730:6336-7 (2008)). Os polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família ACP pela marcação com panteteína radioativa e pela homologia de sequência para ACPs conhecidas.
[00100] Um polipeptídeo ou um domínio de um polipeptídeo possuindo atividade desidrase ou desidratase (DH) foi previamente demonstrado por ser capaz de catalisar uma reação de desidratação. Referência à atividade DH se refere normalmente com a atividade biológica beta-hidroxialcil-APC desidratase similar a FabA. A atividade biológica beta-hidroxialcil-APC desidratase similar a FabA remove HOH a partir de uma beta-cetoacil-ACP e, produz inicialmente uma dupla ligação trans na cadeia de carbono. O termo “beta-hidroxialcil-APC desidratase similar a FabA” tem sido utilizado de forma intercambiável com os termos “beta-hidroxi alcila-APC desidratase similar a FabA”, “beta-hidroxialcil- APC desidratase” e “desidratase”. Os domínios DH de sistemas AGPI sintase têm sido demonstrados por exibirem homologia com as enzimas DH bacterianas associadas com sistemas FAS (em vez de exibirem homologia com domínios DH de outros sistemas PKS). Vide, por exemplo, Patente US 7.217.856 incorporada ao presente pela referência em sua totalidade. Um subconjunto de DHs, DHs similares a FabA, possui atividade isomerase cistrans (Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)). Com base na homologia com as proteínas DH similares FabA, um ou todos os domínios DH do sistema AGPI sintase pode ser responsável pela inserção de dupla ligações cis nos produtos da AGPI sintase. Um polipeptídeo ou domínio também pode ter atividade DH não similar a FabA ou atividade (DH) beta-hidroxiacil-ACP desidratase não similar a FabA. Mais especificamente, um motivo do sítio ativo conservado de cerca de 13 aminoácidos de comprimento foi previamente identificado nos domínios DH da AGPI sintase. LxxHxxxGxxxxP (a posição L também pode ser um I no motivo). Vide, por exemplo, a patente US 7.217.856, e Donadio S, Katz L., Gene 777(1):51-60 (1992), sendo cada um deles incorporado ao presente pela referência em suas totalidades. Este motivo conservado é encontrado em uma região semelhante de todas as sequências de AGPI sintases conhecidas e poderia ser responsável por uma desidratação não similar a FabA.
[00101] Um polipeptídeo ou domínio de um polipeptídeo possuindo atividade beta-cetoacil-ACP redutase (KR) foi previamente demonstrado por ser capaz de catalisar a redução dependente de piridina-nucleotídeo das formas 3-cetoacila de ACP. O termo “beta-cetoacil-ACP redutase” tem sido usado de forma alternada com os termos “cetoredutase”, “3-cetoacil-ACP redutase”, e “ceto-acil ACP redutase”. Ela foi determinada em outros sistemas em que a função KR envolve a primeira etapa redutora no ciclo de alongamento da biossíntese de novo de ácidos graxos. Polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família KR por homologia de sequência com KRs da AGPI sintase conhecidas.
[00102] Um polipeptídeo ou um domínio de uma cadeia de polipeptídeo possuindo atividade de fator de elongação de cadeia (CLF) foi previamente definido como possuindo uma ou mais das seguintes atividades ou características: (1) ele pode determinar o número de ciclos de alongamento e, portanto, o comprimento da cadeia do produto final, (2) possui homologia a KS, mas carece da cisteína sítio ativa da KS, (3) pode heterodimerizar com a KS, (4), pode fornecer o grupo acila inicial a ser alongada, ou (5) pode decarboxilar o malonato (em malonil-ACP), formando assim um grupo acetato que pode ser transferido para a KS sítio ativa e que pode atuar como a molécula de “priming” que sofre a reação (condensação) inicial de alongamento. Um domínio CLF é encontrado em todos os sistemas AGPI sintase atualmente identificados e em cada caso é encontrado como parte de uma proteína multidomínio. Polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família CLF pela homologia de sequência com CLFs da AGPI sintase conhecidas.
[00103] Um polipeptídeo ou um domínio um polipeptídeo possuindo atividade aciltransferase (AT) foi previamente definido como possuindo uma ou mais das seguintes atividades ou características: (1) ele pode transferir o grupo acila graxo a partir do(s) domínio(s) ACP(s) para água (ou seja, uma tioesterase), liberando o grupo de acila graxa como um ácido graxo livre, (2) pode transferir um grupo acila graxa para um aceptor como a CoA, (3) pode transferir o grupo acila entre os vários domínios ACP, ou (4) pode transferir o grupo acila graxa para uma molécula receptora lipofílica (por exemplo, ácido lisofosfatídico). Polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família AT pela homologia de sequência com ATs de AGPI sintase conhecidas.
[00104] Um polipeptídeo ou um domínio de um polipeptídeo possuindo atividade biológica enoil-ACP redutase (ER) foi previamente demonstrado por ser capaz de reduzir a dupla ligação trans (introduzida pela atividade DH) no acil-ACP graxo, resultando na saturação dos carbonos associados. O domínio ER nos sistemas AGPI sintase foi previamente demonstrado por possuir homologia com uma família de enzimas ER (Heath et al, Nature 406:. 145-146 (2000), incorporado ao presente pela referência em sua totalidade), e um homólogo de ER foi demonstrado por funcionar como uma enoil-ACP redutase in vitro (Bumpus et al J. Am Chem Soc, 130:11614-11616 (2008), incorporado ao presente pela referência em sua totalidade). O termo “enoil-ACP redutase” tem sido usado de maneira alternada como “enoil redutase”, “enoil ACP- redutase”, e “enoil acil-ACP redutase”. Polipeptídeos (ou domínios de polipeptídeos) podem ser facilmente identificados como pertencente à família ER pela homologia de sequência com ERs de AGPI sintase conhecidas.
[00105] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 74), um domínio MAT (SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 76), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, ou 98), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 78, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 100), um domínio DH (SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 118), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende duas ou mais sequências de polinucleotídeos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos é 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas à mesma sequência de polinucleotídeoss dentro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120, que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas à sequências de polinucleotídeos diferentes dentro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120, em que cada uma codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas a sequências de polinucleotídeo diferentes dentro das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120, em que pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos estão localizadas na mesma ordem ou em uma ordem diferente na molécula de ácido nucleico quando comparada com a ordem das sequências correspondentes dentro das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 120. Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas a uma sequência de polinucleotídeoss dentro do PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 74), um domínio MAT (SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 76), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, ou 98), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 78, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 100), um domínio DH (SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 1), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeos dentro do PFA1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68, ou SEQ ID NO: 120), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00106] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase tal como, um domínio KS (SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 102), um domínio CLF (SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 104), um domínio AT (SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 106), um domínio ER (SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 108), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende duas ou mais sequências de polinucleotídeos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos é 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas à mesma sequência de polinucleotídeoss dentro da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121, que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas à sequências de polinucleotídeos diferentes dentro da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121, em que cada uma codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas a sequências de polinucleotídeo diferentes dentro das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121, em que pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos estão localizadas na mesma ordem ou em uma ordem diferente na molécula de ácido nucleico quando comparada com a ordem das sequências correspondentes dentro das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 121. Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as duas ou mais sequências de polinucleotídeos são pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase tal como, um domínio KS (SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 102), um domínio CLF (SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 104), um domínio AT (SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 106), um domínio ER (SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 108), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeos dentro do PFA2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 121), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00107] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como a SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 110 ou SEQ ID NO: 112) um domínio ER (SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 114), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende duas ou mais sequências de polinucleotídeos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos é 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas à mesma sequência de polinucleotídeoss dentro da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122, que codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas às sequências de polinucleotídeos diferentes dentro da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122, em que cada uma codifica um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos são 80% idênticas a sequências de polinucleotídeo diferentes dentro das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122, em que pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos estão localizadas na mesma ordem ou em uma ordem diferente na molécula de ácido nucleico quando comparada com a ordem das sequências correspondentes dentro das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 122. Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de polinucleotídeos é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro do PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como a SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 110 ou SEQ ID NO: 112) um domínio ER (SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 114), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeos dentro do PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 122), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00108] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 120, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo de; atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, a atividade KR, atividade DH e uma combinação destas;
[00109] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 74, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS.
[00110] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 76, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade MAT.
[00111] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 ou 98, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP;
[00112] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 78, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP.
[00113] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro da SEQ ID NO: 11, que codifica um, dois, três, quatro, cinco ou seis domínios ACP, de modo que a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 e 23 são sequência de polinucleotídeoss representativas de modo que cada uma codifica um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 11.
[00114] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro da SEQ ID NO: 78, que codifica um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez domínios ACP, em que a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 e 98 são sequências de polinucleotídeos representativas de modo que cada uma codifica um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 78.
[00115] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 100, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KR.
[00116] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 118, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[00117] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 121, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo de; atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER e uma combinação destas.
[00118] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 102, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade KS.
[00119] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 104, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade CLF.
[00120] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 106, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AT.
[00121] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 108, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[00122] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 122, em que a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo compreendendo atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste da; atividade DH, atividade ER e uma combinação destas.
[00123] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 37, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[00124] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 39, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[00125] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 110, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[00126] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 112, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade DH.
[00127] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 114, onde a sequência de polinucleotídeoss codifica um polipeptídeo compreendendo atividade ER.
[00128] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo sequências de polinucleotídeos codificando polipeptídeos, em que os polipeptídeos compreendem sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas com as sequências de aminoácidos de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), ou PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), em que os polinucleotídeos codificam polipeptídeos compreendendo uma ou mais atividades AGPI sintase.
[00129] A presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica com as sequências de aminoácidos de um ou mais domínios AGPI sintase das AGPI sintases da invenção.
[00130] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss codificando um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69) compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75), um domínio MAT (SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101), um domínio DH (SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à sequências de aminoácidos diferentes dentro da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas a uma sequência de aminoácidos dentro da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75), um domínio MAT (SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, ou 99), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101), um domínio DH (SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro da PFA1P (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00131] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss codificando um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71) compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103), um domínio CLF (SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105), um domínio AT (SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 107), um domínio ER (SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71). Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à sequências de aminoácidos diferentes dentro da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são pelo menos 80% idênticas a uma sequência de aminoácido dentro da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103), um domínio CLF (SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105), um domínio AT (SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 107), um domínio ER (SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro da PFA2P (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00132] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss codificando um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73) compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73) compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como as SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 111, ou SEQ ID NO: 113), um domínio de ER (SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115), e suas combinações. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas a sequências de aminoácidos diferentes dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 111, ou SEQ ID NO: 113) um domínio ER (SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro da PFA3P (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00133] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69, e em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade DH, e combinações destas.
[00134] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75, e no qual o polipeptídeo compreende atividade KS.
[00135] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77, e em que o polipeptídeo compreende atividade MAT.
[00136] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99, e em que o polipeptídeo compreende atividade ACP.
[00137] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, e em que o polipeptídeo compreende atividade ACP.
[00138] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 12, e em que o polipeptídeo compreende atividade ACP. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 12, compreendendo um, dois, três, quatro, cinco ou seis domínios ACP, de modo que o polipeptídeo compreende uma atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 e 24 são sequência de aminoácidos representativas de modo que cada uma compreende um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 12.
[00139] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 79, e em que o polipeptídeo compreende atividade ACP. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 79, compreendendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez domínios ACP, de modo que o polipeptídeo compreende uma atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95 e 99 são sequência de aminoácidos representativas de modo que cada uma compreende um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 79.
[00140] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101, e em que o polipeptídeo compreende atividade KR.
[00141] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119, e no qual o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00142] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica com a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71, e em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste da atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER e combinações destas.
[00143] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103, e no qual o polipeptídeo compreende atividade KS.
[00144] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105, e em que o polipeptídeo compreende atividade CLF.
[00145] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 107, e no qual o polipeptídeo compreende atividade AT.
[00146] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109, e em que o polipeptídeo compreende atividade ER.
[00147] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica com a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73, e em que o polipeptídeo compreende atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste da atividade DH, atividade ER e combinações destas.
[00148] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 38, e no qual o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00149] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 40, e no qual o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00150] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 111, e no qual o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00151] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 113, e no qual o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00152] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115, e no qual o polipeptídeo compreende atividade ER.
[00153] Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem sequências de polinucleotídeos pelo menos cerca de 80%, 85%, ou 90% idênticas às sequências de polinucleotídeos descritas no presente, ou cerca de pelo menos 95 %, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idênticas com as sequências de polinucleotídeos relatadas no presente. A expressão "porcentagem de identidade", como é conhecida no estado da técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. No estado da técnica, “identidade” significa também o grau de relação de sequência entre as sequências de aminoácidos ou polinucleotídeos, conforme o caso, tal como determinado pelo pareamento entre as cadeias de tais sequências.
[00154] Uma molécula de ácido nucleico possuindo uma sequência de polinucleotídeoss, por exemplo, pelo menos 95% “idêntica” a uma sequência de polinucleotídeoss de referência da presente invenção, significa que a sequência de polinucleotídeoss da molécula de ácido nucleico é idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeoss pode conter até cinco diferenças de nucleotídeos para cada 100 nucleotídeos da sequência de polinucleotídeoss de referência. Em outras palavras, para obter uma molécula de ácido nucleico possuindo uma sequência de polinucleotídeoss pelo menos 95% idêntica a uma sequência de polinucleotídeoss de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem estar apagados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência podem estar inseridos na sequência de referência.
[00155] Como uma questão prática, para saber se qualquer sequência de polinucleotídeoss específica ou sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de polinucleotídeoss ou sequência de aminoácidos da presente invenção, a % de identidade pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos. Um método para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (a sequência da presente invenção) e uma sequência em questão pode ser feito usando o alinhamento de sequências e cálculo dos escores de identidade. Os alinhamentos foram feitos usando o programa de computador AlignX, que é um componente do suíte de programas “Vector NTI pacote 10.0” da Invitrogen (www.invitrogen.com). Os alinhamentos foram realizados através de um alinhamento ClustalW (Thompson, JD, et al. Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)) para os alinhamentos das sequências de aminoácidos e polinucleotídeos. As matrizes de pontuação padrões Blosum62mt2 e swgapdnamt foram utilizadas para alinhamentos das sequências de aminoácidos e polinucleotídeos, respectivamente. Para as sequências de aminoácidos, os parâmetros de programa “gap opening penalty” é de 10 e “gap extension penalty” é 0,1. Para as sequências de polinucleotídeos, os parâmetros predefinidos de programa “gap opening penalty” é de 15 e “gap extension penalty” é 6,66.
[00156] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss que codifica um polipeptídeo que compreende atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste da atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, atividade KR, atividade CLF, atividade AT, atividade ER, atividade DH, e combinações destas, em que o polinucleotídeo hibridiza sob condições estringentes de maneira complementar a qualquer uma das sequências de polinucleotídeos descritas acima.
[00157] Uma molécula de ácido nucleico é "hibridizável"a outra molécula de ácido nucleico, tal como um cDNA, DNA genômico, ou molécula de RNA, quando uma molécula de ácido nucleico na forma de fita-simples pode parear com uma molécula de ácido nucleico sob condições adequadas de temperatura e força iônica da solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas. Vide, por exemplo, Sambrook J. e Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual,3a Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. As condições de temperatura e força iônica determinam a "estringência"da hibridização. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados, a fragmentos muito similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos estreitamente relacionados. A lavagem pós-hibridização determina as condições de estringência. Um conjunto de condições usa uma série de lavagens iniciais com 6X SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente por 15 min, em seguida, repetido com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 °C por 30 min, e depois repetindo a lavagem duas vezes com 0,2 X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C por 30 min. Para condições mais estringentes, as lavagens são realizadas em temperaturas mais elevadas, de modo que as lavagens são idênticas às mencionadas anteriormente, exceto que a temperatura das duas últimas lavagens de 30 min em 0,2 X SSC, 0,5% de SDS são aumentadas para 60 °C. Outro conjunto de condições altamente estringentes usa duas lavagens finais em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65 °C. Um conjunto adicional de condições altamente estringentes inclui a hibridização em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65 °C e lavagens com 2X SSC, 0,1% de SDS, seguido por 0,1 X SSC, 0,1% de SDS.
[00158] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss que é totalmente complementar a qualquer uma das sequências de polinucleotídeos descritas acima. O termo "complementar"é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizarem entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina.
[00159] Em determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. No caso de DNA, uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeoss que codifica um polipeptídeo pode normalmente incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente ligado a uma ou mais regiões de codificação. Uma porção está “operacionalmente ligada” quando uma região de codificação para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo está associada a uma ou mais sequências reguladoras de forma a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região de codificação de polipeptídeos e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados” se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão induzirem a expressão do produto gênico ou não interfere com a capacidade do DNA molde ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a uma sequência de polinucleotídeoss codificando um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de polinucleotídeoss. O promotor pode ser um promotor célula-específica que direciona a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas. Em geral, uma sequência de codificação está localizada a 3' de um promotor. Os promotores podem ser obtidos em sua totalidade a partir de um gene nativo, ou ser compostos por diversos elementos provenientes de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É compreendido pelos técnicos no assunto que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares são na maioria das vezes comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, como na maioria dos casos, os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica. Um promotor é geralmente limitado em sua extremidade 3’ terminal pelo sítio de iniciação da transcrição e se estende a montante (direção 5') incluindo um número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima dos níveis de fundo (background). Dentro do promotor será encontrado um sítio de iniciação da transcrição (convenientemente definido, por exemplo, pelo mapeamento com nuclease SI), bem como os domínios de ligação à proteína (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase.
[00160] Regiões regulatórias adequadas referem-se a regiões de ácidos nucleicos localizadas a montante (sequências não codificadoras 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma região codificadora, e as quais influenciam na transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores, e estruturas stem-loop. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, sequências intensificadoras (enhancers), operadores, repressores, e sinais de término de transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para induzir a transcrição de maneira célula-específica. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de iniciação 5' (amino-) terminal e um códon de parada de tradução 3' (carboxi-) terminal. A região de codificação pode compreende, mas não está limitada, as regiões procarióticas, cDNA a partir do mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintético, ou moléculas de RNA. Se a região de codificação se destina à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação de transcrição normalmente estarão localizadas a 3’ da região de codificação.
[00161] Em certos aspectos da invenção, sequências de polinucleotídeos possuindo pelo menos 20 bases, pelo menos 30 bases, ou pelo menos 50 bases e que são capazes de hibridizar a uma sequência de polinucleotídeoss da presente invenção podem ser empregados como primers da PCR. Normalmente, em técnicas de amplificação do tipo PCR, os primerstêm sequências diferentes e não são complementares entre si. Dependendo das condições de ensaio desejadas, as sequências de primers devem ser projetadas para oferecer tanto eficiência quanto fidelidade de replicação do ácido nucleico alvo. Métodos para o desenho de primers de PCR são comuns e bem conhecidos no estado da técnica. Geralmente dois segmentos curtos das sequências descritas podem ser utilizados em protocolos de reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos maiores que codificam genes homólogos a partir do DNA ou RNA. A reação em cadeia da polimerase também pode ser realizada em uma biblioteca de fragmentos de ácidos nucleicos clonados em que a sequência de um primeré derivada a partir dos fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção, e a sequência dos outros primers aproveita a presença dos setores de ácido poliadenílico na extremidade 3' do gene microbiano que codifica o precursor do mRNA. Alternativamente, a segunda sequência de primer pode ser baseada em sequências derivadas a partir do vetor de clonagem.
[00162] Além disso, primersespecíficos podem ser criados e utilizados para amplificar uma parte ou todo o comprimento das presentes sequências. Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após as reações de amplificação, e utilizados como sondas para isolar fragmentos de DNA de comprimento total em condições adequadas de estringência.
[00163] Portanto, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser usadas para isolar genes que codificam proteínas homólogas da mesma ou de outras espécies, ou de espécies bacterianas. O isolamento de genes homólogos usando protocolos dependentes de sequência é bem conhecido no estado da técnica. Exemplos de protocolos de dependentes de sequência incluem, mas não estão limitados a, métodos de hibridização de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de DNA e RNA conforme exemplificado por vários usos de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, reação em cadeia da polimerase, Mullis et al, Patente US 4.683.202;. reação em cadeia da ligase (LCR) Tabor, S. et al. Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985), ou amplificação por deslocamento de fita (SDA), Walker et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392 (1992)).
[00164] Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção são usadas para isolar moléculas de ácido nucleico homólogas de outros organismos, a fim de identificar AGPI sintases que produzem perfis de AGPI semelhantes ou melhores. Em alguns exemplos de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção são usadas para isolar moléculas de ácido nucleico homólogas de outros organismos que estão envolvidos na produção de grandes quantidades de DHA.
[00165] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção também incluem sequências de polinucleotídeos que codificam um gene AGPI sintase, um domínio de um gene AGPI sintase, ou um fragmento do gene da AGPI sintase fundido no quadro de leitura a uma sequência marcadora permitindo assim a detecção do polipeptídeo da presente invenção. As sequências marcadoras incluem marcadores auxotróficos ou dominantes conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, como ZEO (zeocina), NEO (G418), higromicina, arsenito, HPH, NAT, e similares.
[00166] A presente invenção também abrange as variantes do gene da AGPI sintase. Variantes podem conter alterações nas regiões codificadoras, regiões não codificadoras, ou ambas. Exemplos disso são as sequências variantes de polinucleotídeos contendo alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em determinados exemplos de realização, variações na sequência de polinucleotídeoss são produzidas por substituições silenciosas devido à degenerescência do código genético. Em exemplos de realizações adicionais, sequências variantes de polinucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar o códon de expressão para um determinado hospedeiro (por exemplo, alterando os códons no mRNA traustocitrídio para aqueles preferidos por outros organismos, tal como a E. coli ou Saccharomyces cerevisiae).
[00167] Também são fornecidas na presente invenção variantes alélicas, ortólogos e/ou espécies homólogas. Procedimentos conhecidos no estado da técnica podem ser usados para se obter genes de comprimento total, variantes alélicas, variantes por splicing alternativo, porções codificadoras de comprimento total, ortólogos e/ou de espécies homólogas dos genes descritos na presente invenção usando as informações de sequências divulgadas no presente documento. Por exemplo, variantes alélicas e/ou de espécies homólogas podem ser isoladas e identificadas pela produção de sondas ou primers adequados a partir das sequências fornecidas no presente documento e, em seguida, triando uma fonte de ácido nucleico adequada para as variantes alélicas e/ou homólogas desejadas.
[00168] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descrita acima ou combinações das mesmas e uma sequência de controle de transcrição. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico recombinante é um vetor recombinante.
[00169] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de vetor recombinante compreendendo a inserção de uma ou mais moléculas de ácido nucleico isoladas descritas no presente em um vetor.
[00170] Os vetores da presente invenção podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, partícula viral, fago e etc.
[00171] As sequências de polinucleotídeos da invenção podem ser incluídas em qualquer um dentre uma variedade de vetores de expressão para expressar um polipeptídeo. Tais vetores incluem DNA cromossômico, não cromossômico e sintético ou sequências de RNA, por exemplo, derivados de SV40; plasmídeos bacterianos e plasmídeos de levedura. No entanto, qualquer outro vetor adequado conhecido por um técnico do assunto pode ser usado.
[00172] A sequência de DNA apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a sequência de DNA é inserida em um(alguns) sítio(s) de restrição de endonuclease(s) apropriada(s) por meio de procedimentos conhecidos. Tais procedimentos e outros são considerados como estando dentro do escopo dos técnicos hábeis no assunto.
[00173] A presente invenção também inclui construções recombinantes compreendendo uma ou mais das sequências de polinucleotídeos descritas acima. As construções compreendem um vetor, tal como um plasmídeo ou vetor viral, nos quais uma ou mais sequências da invenção foi(foram) inserida(s) na orientação direta (forward) ou reversa (reverse). Em um aspecto deste exemplo de realização, a construção compreende ainda sequências reguladoras, incluindo, por exemplo, um promotor, operacionalmente associado à sequência. Um grande número de vetores e promotores adequados é conhecido pelos técnicos hábeis no assunto, e está comercialmente disponível.
POLIPEPTÍDEOS
[00174] A presente invenção é direcionada a polipeptídeos isolados compreendendo sequências de aminoácidos para proteínas e domínios AGPI sintase derivadas de microrganismos isolados depositados com número de acesso ATCC: PTA-9695 e PTA-10212.
[00175] Conforme utilizado no presente, o termo “polipeptídeo” pretende abranger um “polipeptídeo” na forma singular, bem como “polipeptídeos” no plural e refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) de forma linear ligados por ligações amida (também conhecido como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácidos”, ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser usado de forma alternada com qualquer um destes termos. O termo “polipeptídeo” também é usado para se referir ao produto das modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem se limitar a glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação com aminoácidos de ocorrência não natural.
[00176] Os polipeptídeos conforme descrito no presente podem incluir fragmentos, variantes, ou moléculas derivadas dos mesmos sem qualquer limitação. Os termos “fragmento”, “variante”, “derivado” e “análogo” quando se referindo a um polipeptídeo, inclui qualquer polipeptídeo que retenha ao menos alguma atividade biológica. Fragmentos de polipeptídeos podem incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleção, e fragmentos que chegam mais facilmente ao local de ação, quando entregues a um animal. Fragmentos de polipeptídeos incluem ainda qualquer parte do polipeptídeo que compreende um epítopo antigênico ou imunogênico do polipeptídeo nativo, incluindo epítopos lineares, bem como tridimensionais. Os fragmentos variantes de polipeptídeos podem compreender regiões, incluindo fragmentos conforme descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido às substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ocorrer naturalmente, tal como uma variante alélica. Por “variante alélica” pretende-se dizer formas alternativas de um gene que ocupa um determinado locus em um cromossomo de um organismo. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese bem conhecidas no estado da técnica. Fragmentos de polipeptídeos da invenção podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras. Polipeptídeos variantes também podem ser referidos no presente como “polipeptídeos análogos”. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção também podem incluir moléculas derivativas. Conforme usado no presente um “derivado” de polipeptídeo ou de um fragmento polipeptídico refere-se a um polipeptídeo em questão que possui um ou mais resíduos quimicamente derivatizados pela reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos no termo “derivado” estão aqueles peptídeos que contêm um ou mais aminoácidos de ocorrência natural derivados dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metilhistidina pode ser substituída por histidina; homosserina pode ser substituída por serina, e ornitina pode ser substituída por lisina.
[00177] Os polipeptídeos da invenção podem ser codificados por qualquer molécula de ácido nucleico da presente invenção.
[00178] A presente invenção é direcionada a polipeptídeos isolados compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas com as sequências de aminoácidos de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), ou PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73) e combinações destes, em que os polipeptídeos compreendem uma ou mais atividades AGPI sintase.
[00179] A presente invenção é direcionada aos polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas com as sequências de aminoácidos de um ou mais domínios AGPI sintase das AGPI sintases da invenção.
[00180] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas com as sequências de aminoácidos dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75), um domínio MAT (SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101), um domínio DH (SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às sequências de aminoácidos diferentes dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA1p (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75), um domínio MAT (SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77), um domínio ACP (como qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, ou 99), uma combinação de dois ou mais domínios ACP, tal como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez domínios ACP, incluindo domínios em tandem (SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, e porções destes), um domínio KR (SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101), um domínio DH (SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro de PFA1P (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00181] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas às sequências de aminoácidos dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de polinucleotídeos dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), que codifica um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103), um domínio CLF (SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105), um domínio AT (SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 107), um domínio ER (SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71). Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à sequências de aminoácidos diferentes dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são pelo menos 80% idênticas a uma sequência de aminoácido dentro de PFA2p (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio KS (SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103), um domínio CLF (SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105), um domínio AT (SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 107), um domínio ER (SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro de PFA2P (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00182] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 80% idênticas às sequências de aminoácidos dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73) compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como as SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 111, ou SEQ ID NO: 113), um domínio de ER (SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115), e suas combinações. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende duas ou mais sequências de aminoácidos, onde cada uma dentre pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à mesma sequência de aminoácidos da PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas à sequências de aminoácidos diferentes dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), que compreende um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos são 80% idênticas às diferentes sequências de aminoácidos de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), onde a pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos estão localizadas na mesma ordem ou uma ordem diferente em comparação com a ordem dos domínios correspondentes dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73). Em alguns exemplos de realização, cada uma dentre as pelo menos duas ou mais sequências de aminoácidos é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de PFA3p (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, tal como um domínio DH (tal como a SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 113) um domínio ER (SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115), e combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos dentro da PFA3P (SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73), compreendendo um ou mais domínios AGPI sintase, incluindo uma ou mais cópias de qualquer domínio individual, em combinação com uma ou mais cópias de qualquer outro domínio individual.
[00183] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo que consiste de atividade KS, atividade MAT, atividade ACP, a atividade KR, atividade DH e uma combinação destas;
[00184] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 75, em que o polipeptídeo compreende atividade KS.
[00185] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 77, em que o polipeptídeo compreende atividade MAT.
[00186] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 ou 99, e em que o polipeptídeo compreende atividade ACP.
[00187] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 79, em que o polipeptídeo compreende atividade ACP.
[00188] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 12, em que o polipeptídeo compreende atividade ACP. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 12, compreendendo um, dois, três, quatro, cinco ou seis domínios ACP, de modo que o polipeptídeo compreende uma atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22 e 24 são sequência de aminoácidos representativas compreendendo um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 12.
[00189] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 79, em que o polipeptídeo compreende atividade ACP. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 79, compreendendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez domínios ACP, de modo que o polipeptídeo compreende uma atividade ACP associada a um ou mais domínios ACP. As SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95 e 99 são sequência de aminoácidos representativas, de modo que cada uma compreende um domínio ACP único dentro da SEQ ID NO: 79.
[00190] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 101, em que o polipeptídeo compreende atividade KR.
[00191] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 119, em que o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00192] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 71, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo de atividade KS, atividade CLF, atividade AT, atividade ER, e uma combinação destas.
[00193] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 103, em que o polipeptídeo compreende atividade KS.
[00194] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 105, em que o polipeptídeo compreende atividade CLF.
[00195] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 107, em que o polipeptídeo compreende atividade AT.
[00196] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 109, em que o polipeptídeo compreende atividade ER.
[00197] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 73, em que o polipeptídeo compreende uma atividade AGPI sintase selecionada a partir do grupo consistindo da atividade DH, atividade ER e uma combinação destas.
[00198] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 38, em que o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00199] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 40, em que o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00200] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 111, em que o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00201] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 113, em que o polipeptídeo compreende atividade DH.
[00202] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 115, em que o polipeptídeo compreende atividade ER.
[00203] Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos compreendem sequências de aminoácidos que são cerca de pelo menos 80%, 85%, ou 90% idênticas às sequências de aminoácidos descritas no presente, ou cerca de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de aminoácidos relatadas no presente.
[00204] Pela expressão; um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de aminoácido de consulta da presente invenção, pretende-se dizer que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo em questão é idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência de polipeptídeos em questão pode conter até cinco alterações de aminoácidos para cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de consulta. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido de consulta, até 5% de resíduos de aminoácidos na sequência em questão podem ser inseridos, deletados (indels), ou substituídos por outros aminoácidos. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino-terminal ou carboxi-terminal da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre as posições terminais, intercaladas tanto individualmente entre os resíduos na sequência de referência como em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
[00205] Como uma questão prática, para saber se qualquer sequência de polipeptídeo específica possuindo uma sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido da presente invenção, a % de identidade pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos. Como discutido acima, pode ser feito um método para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (a sequência da presente invenção) e uma sequência em questão usando o alinhamento de sequências e cálculo dos escores de identidade. Os alinhamentos foram feitos usando o programa de computador AlignX, que é um componente do suíte de programas “Vector NTI pacote 10.0” da Invitrogen (www.invitrogen.com). Os alinhamentos foram realizados através de um alinhamento ClustalW (J. Thompson et al. Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680 (1994)). O escore padrão da matriz Blosum62mt2 foi utilizado. O parâmetro “default gap opening penalty” é 10 e o “gap extension penalty” é 0,1.
[00206] Em outros aspectos da invenção, as moléculas de ácido nucleico possuindo sequências de polinucleotídeos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos às sequências de polinucleotídeo divulgadas no presente documento, codificam um polipeptídeo que possui uma ou mais atividade(s) AGPI sintase. Polipeptídeos possuindo uma ou mais atividade(s) AGPI sintase apresentam uma ou mais atividade(s) similares, mas não necessariamente idênticas, a uma ou mais atividades de uma AGPI sintase da presente invenção.
[00207] É claro que, devido à degenerescência do código genético, um técnico hábil no assunto irá reconhecer imediatamente que uma grande parte das moléculas de ácido nucleico possuindo uma sequência de polinucleotídeoss que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica com as sequências de polinucleotídeos descritas no presente irá codificar polipeptídeos “possuindo atividade AGPI sintase funcional”. De fato, visto que todas as variações degeneradas de qualquer uma dessas sequências de polinucleotídeos codificam o mesmo polipeptídeo, em muitos casos, isto pode ser previsto pelo técnico do assunto com base no conhecimento das substituições conservadoras, bem como domínios funcionais conservados, de modo que os polipeptídeos irão exibir atividade. Em certos aspectos da invenção, os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção são fornecidos de forma isolada, por exemplo, purificados até homogeneidade. Alternativamente, os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos sinteticamente por sintetizadores convencionais.
[00208] Como é conhecido no estado da técnica "similaridade" entre dois polipeptídeos é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos e os substitutos de aminoácidos conservados do polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo.
[00209] Em alguns exemplos de realização, um polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo de fusão.
[00210] Conforme utilizado no presente, “polipeptídeo de fusão” significa um polipeptídeo compreendendo um primeiro polipeptídeo linearmente ligado, através de ligações peptídicas, a um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo podem ser idênticos ou diferentes, e podem estar diretamente conectados, ou conectados através de um ligante peptídico. Conforme utilizado no presente, os termos “ligado”, “fundido”, ou “fusionado” são usados indistintamente. Esses termos referem-se a união de dois ou mais elementos ou componentes por qualquer meio, incluindo a conjugação química ou por meios recombinantes. Uma “fusão no quadro de leitura” (in-frame) refere-se a junção de dois ou mais quadros de leitura abertos para formar um quadro de leitura aberto contínuo maior, de forma que o novo quadro mantém a leitura correta dos quadros de leitura abertos originais. Assim, a proteína de fusão resultante recombinante é uma proteína simples contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos quadros de leitura abertos originais (em que tais segmentos não estão normalmente unidos na natureza). Embora a leitura do quadro seja feita, portanto, de maneira contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, com sequência ligante in-frame. Uma sequência “ligante” é uma série de um ou mais aminoácidos que separa duas regiões codificadoras de polipeptídeos na proteína de fusão.
[00211] A invenção é direcionada a uma composição compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção e um veículo biologicamente aceitável.
[00212] Em alguns exemplos de realização, a composição inclui um “excipiente” biologicamente aceitável, onde o excipiente é um componente, ou uma mistura de componentes, que é usada em uma composição da presente invenção para dar características desejáveis a composição, e também inclui veículos. A expressão “biologicamente aceitável” significa um composto, material, composição, sal e/ou forma de dosagem que é, no âmbito do julgamento médico, adequado para o contato com os tecidos de células vivas, sem excessiva toxicidade, irritação, resposta inflamatória, ou outras complicações problemáticas ao longo da duração de contato desejada compatível com uma relação risco/benefício razoável. Diversos excipientes podem ser usados. Em alguns exemplos de realização, o excipiente pode ser, mas não está limitado a, um agente alcalino, um estabilizante, um antioxidante, um agente de adesão, um agente de separação, um agente de revestimento, um componente de fase exterior, um componente de liberação controlada, um solvente, um tensoativo, um umectante, um agente de tamponamento, um agente de enchimento, um emoliente, ou combinações destes. Excipientes, além dos discutidos no presente, podem incluir os excipientes listados, embora não limitados, em “Remington: The Science and Practice of Pharmacy’,21aEd. (2005). A inclusão de um excipiente em uma classificação particular na presente invenção (por exemplo, “solvente’) é destinada a ilustrar ao invés de limitar o papel do excipiente. Um excipiente específico pode cair dentro de múltiplas classificações.
[00213] A presente invenção também se refere a um fragmento, variante, derivado ou análogo de qualquer um dos polipeptídeos divulgados aqui.
[00214] O polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo recombinante, um polipeptídeo natural, ou um polipeptídeo sintético.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[00215] A presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira que expressa qualquer uma das moléculas de ácido nucleico e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas acima bem como combinações destas.
[00216] O termo “expressão’, conforme utilizado no presente refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem se limitar, o silenciamento (knockdown) de genes, bem como a expressão transitória ou expressão estável. Ele inclui, sem se limitar, a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA curto em grampo (hairpin) (shRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), ou qualquer outro RNA produto, e a tradução do mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto final desejado é bioquímico, a expressão inclui a criação de tal bioquímico e quaisquer precursores.
[00217] Para produzir um ou mais ácidos graxos poli-insaturados desejados, uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para introduzir um sistema AGPI sintase da presente invenção na célula hospedeira.
[00218] Ao modificar geneticamente os organismos para expressar um sistema AGPI sintase de acordo com a presente invenção, alguns organismos hospedeiros podem expressar endogenamente proteínas acessórias que são necessárias em conjunto com um sistema AGPI sintase, a fim de produzir AGPIs. No entanto, pode ser necessário transformar alguns organismos com moléculas de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteína(s) acessória(s) a fim de permitir ou aumentar a produção de AGPIs pelo organismo, mesmo que o organismo produza uma proteína endógena acessória homóloga. Algumas proteínas acessórias heterólogas podem operar de forma mais eficaz ou eficiente com as proteínas AGPI sintase transformadas do que a(s) proteína(s) endógena(s) acessória(s) das células hospedeiras.
[00219] Proteínas acessórias são definidas no presente como proteínas que não são consideradas parte do sistema AGPI sintase central (isto é, não fazem parte do complexo de enzimas da AGPI sintase em si), mas podem ser necessárias para a produção ou produção eficiente de AGPI usando o complexo enzimático AGPI sintase central da presente invenção. Por exemplo, a fim de produzir AGPIs, um sistema AGPI sintase deve trabalhar com uma proteína acessória que transfere uma fração 4'-fosfopanteteinila da coenzima A para o(s) domínio(s) da proteína transportadora de acila (ACP). Portanto, um sistema sintase AGPI pode ser considerado como incluindo pelo menos um domínio 4'-fosfopanteteinila transferase (PPTase), ou um domínio que possa ser considerado como um domínio ou proteína acessória para o sistema AGPI sintase. As características estruturais e funcionais de PPTases foram descritas em detalhe, por exemplo, nas Publicações de Pedidos de Patentes US 2002/0194641, US 2004/0235127 e US 2005/0100995.
[00220] Um domínio ou proteína possuindo atividade biológica (função) 4'- fosfopanteteinila transferase (PPTase) é caracterizada como a enzima que transfere uma fração 4'-fosfopanteteinila a partir da coenzima A para a proteína transportadora de acila (ACP). Esta transferência para uma serina invariante residente do ACP ativa a apo-forma inativa em uma holo-forma. Tanto no policetídeo como na síntese de ácidos graxos, o grupo fosfopanteteína forma tioésteres com crescimento de cadeias acila. As PPTases são uma família de enzimas que têm sido bem caracterizadas na síntese de ácidos graxos, síntese de policetídeo, e síntese de peptídeos não ribossomal. As sequências de PPTases muitos são conhecidos, estruturas cristalinas foram determinadas (por exemplo, em Reuter K., et al, EMBO J. 75(23):6823-31 (1999)), e a análise mutacional identificou resíduos de aminoácidos importantes para a atividade (Mofid MR, et al, Biochemistry 43(14):4128-36 (2004)).
[00221] Uma PPTase heteróloga que foi anteriormente demonstrada por reconhecer domínios ACP de Schizochytrium como substratos é a proteína Het I de Nostoc sp. PCC-7120 (anteriormente chamado de Anabaena sp. PCC 7120). A Het I está presente em um conjunto de genes na Nostoc conhecido por ser responsável pela síntese de ácidos hidroxi-graxos de cadeias longas que são um componente de uma camada glico-lipídica presente nos heterocistos desse organismo (Preto e Wolk, J. Bacteriol. 176:2282-2292 (1994); Campbell et al, Arch Microbiol. 167:251-258 (1997)). A Het I é que provavelmente ativa os domínios ACP de uma proteína, Hgl E, presente nesse conjunto. As sequências e construções contendo Het I foram descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Publicado US 2007/0244192, incorporado ao presente pela referência em sua totalidade.
[00222] Outra PPTase heteróloga que foi anteriormente demonstrada por reconhecer os domínios ACP de Schizochytriumé a Sfp, derivada do Bacillus subtilis. A Sfp foi bem caracterizada e é amplamente utilizada devido à sua capacidade de reconhecer uma ampla gama de substratos. Com base em informações de sequência publicadas (Nakana, et al, Molecular and General Genetics 232:313-321 (1992)), um vetor de expressão foi anteriormente produzido para Sfp pela clonagem da região codificadora juntamente com as sequências a montante e a jusante que flanqueiam o DNA, em um vetor de clonagem pACYC -184. Esta construção codifica uma PPTase funcional conforme demonstrado por sua capacidade de ser co-expressa com ORFs de Schizochytrium em E. coli, que, em condições adequadas, resultou na acumulação de DHA nas células (vide o Pedido de Patentes Publicado US 2004/0235127, incorporado ao presente pela referência em sua totalidade).
[00223] Células hospedeiras podem incluir células microbianas; células animais, células vegetais e células de inseto. Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas, bactérias termofílicas ou mesofílicas; bactérias marinhas; traustocitrídios; células fúngicas, tal como leveduras, células vegetais, células de insetos, e células de animais isoladas. As células hospedeiras podem ser células não transfectadas ou células que já estão transfectadas com pelo menos outra molécula de ácido nucleico recombinante. As células hospedeiras também podem incluir células transgênicas que foram projetadas para expressar uma AGPI sintase. A seleção de uma célula hospedeira apropriada é considerada como estando dentro do âmbito dos técnicos hábeis no assunto a partir dos ensinamentos da presente invenção.
[00224] Células hospedeiras incluem qualquer microrganismo da ordem Thraustochytriales, tais como microrganismos de um gênero, incluindo mas não limitado a: Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium, e Schizochytrium. As espécies dentro destes gêneros incluem, mas não estão limitados a: qualquer espécie de Schizochytrium, incluindo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum; qualquer espécie de Thraustochytrium (incluindo as espécies anteriormente denominadas de Ulkenia tais como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta e Ulkenia sp. BP -5601), e incluindo Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum, e qualquer espécie de Japonochytrium. As cepas de Thraustochytriales incluem, mas não estão limitadas a: Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp. (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein e Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda e Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); e Japonochytrium sp. (LI) (ATCC 28207). Outros exemplos de microrganismos hospedeiros adequados para a modificação genética incluem, mas não são limitados a, leveduras incluindo a Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, ou outras leveduras como a Candida, Kluyveromyces, ou outros fungos, por exemplo, fungos filamentosos como o Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. As células bacterianas também podem ser usadas como hospedeiros. Isto inclui a Escherichia coli, que pode ser útil em processos de fermentação. Alternativamente, um hospedeiro tal como uma espécie Lactobacillus ou espécie Bacillus pode ser usado como um hospedeiro.
[00225] Células vegetais hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, células de quaisquer plantas superiores, incluindo tanto plantas dicotiledôneas como monocotiledôneas e plantas consumíveis, incluindo plantas cultivadas e plantas usadas por seus óleos. Tais plantas podem incluir, por exemplo: canola, soja, colza, linhaça, milho, cártamo, girassol e tabaco. Outras plantas incluem aquelas plantas que são conhecidas por produzirem compostos usados como agentes farmacêuticos, agentes aromatizantes, agentes neutracêuticos, ingredientes para alimentos funcionais, agentes cosmeticamente ativos, ou plantas que são geneticamente modificadas para produzir estes compostos/agentes. Assim, qualquer espécie de planta ou célula vegetal pode ser selecionada. Exemplos de plantas e células vegetais e plantas cultivadas ou derivados destas, incluem, mas não estão limitados a, plantas e células vegetais obtidas a partir da canola (Brassica rapa L.); cultivares de canola NQC02CNX12 (ATCC PTA-6011), NQC02CNX21 (ATCC PTA-6644), e NQC02CNX25 (ATCC PTA-6012) bem como cultivares, cultivares de reprodução, e partes de plantas derivadas de cultivares de canola NQC02CNX12, NQC02CNX21, e NQC02CNX25 (vide, as Patentes US 7.355.100, 7.456.340 e 7.348.473, respectivamente); soja (Glycine max); colza (Brassica spp.);linhaça/linho (Linum usitatissimum); milho (maize) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girassol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana, castanha do Pará (Betholettia excelsa); mamona (Riccinus communis); coco (Cocus nucifera); coentro (Coriandrum sativum);algodão (Gossypium spp.); amendoim (Arachis hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); mostarda (Brassica spp. e Sinapis alba);óleo de palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa);abóbora (Cucurbita maxima); cevada (Hordeum vulgare); trigo (Traeticum aestivum); e lentilha-d'água (Lemnaceae sp.). As linhagens vegetais a partir destas e outras plantas podem ser produzidas, selecionadas, ou otimizadas para uma característica desejável, tal como associado, mas não limitado a, rendimento de grãos, resistência ao acamamento, emergência, resistência a doenças ou tolerância, maturidade, preservação da planta no final de temporada, altura da planta, resistência à ruptura, facilidade de transformação vegetal, teor de óleo, ou perfil de óleo. Linhagens de plantas podem ser selecionadas através do melhoramento de plantas, tais como a seleção genealógica, melhoramento por seleção recorrente, reprodução por intercruzamento e retrocruzamento, bem como métodos como a criação e cultivo assistidos por marcadores. Vide, por exemplo, a Patente US 7.348.473.
[00226] Células animais incluem quaisquer células animais isoladas.
[00227] A presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira que expressa uma ou mais moléculas de ácido nucleico ou moléculas de ácido nucleico recombinantes, incluindo vetores, da invenção.
[00228] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de uma célula hospedeira recombinante compreendendo a introdução de um vetor recombinante em uma célula hospedeira.
[00229] As células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas (transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com vetores da presente invenção que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou vetor de expressão. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, partícula viral, fago e etc. O vetor contendo uma sequência de polinucleotídeoss conforme descrito no presente, bem como uma sequência promotora ou de controlo adequada, pode ser empregado para transformar um hospedeiro apropriado para permitir a expressão do polipeptídeo codificado pela sequência de polinucleotídeos. A modificação genética das células hospedeiras também pode incluir a otimização de genes para o códon de uso preferencial ótimo ou preferido para o hospedeiro.
[00230] As células hospedeiras modificadas podem ser cultivadas em meios de cultura convencionais modificados conforme o necessário para ativar os promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes da presente invenção. A condições de cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para os técnicos conhecedores do assunto.
[00231] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a modificação genética de uma planta ou parte de uma planta para expressar um sistema AGPI sintase descrito no presente, que inclui, pelo menos um complexo de enzima AGPI sintase central. Uma “parte de uma planta” ou “parte da planta”, conforme definido no presente inclui qualquer parte de uma planta, tal como, mas não se limitando a, sementes (imaturas ou maduras), óleos, pólen, embriões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules, explantes e etc. Em alguns exemplos de realização, a planta ou parte de uma planta geneticamente modificada produz um ou mais AGPIs, tais como EPA, DHA, DPA (n-3 ou n-6), ARA, GLA, SDA, ou outros AGPIs, e combinações destes. As plantas não são conhecidas por conter endogenamente um sistema AGPI sintase, portanto, os sistemas de AGPI sintase da presente invenção podem ser usados para desenvolver plantas com capacidades únicas de produção de ácidos graxos. Em um exemplo de realização, a planta ou parte de uma planta é adicionalmente modificada geneticamente para expressar pelo menos uma proteína acessória da AGPI sintase, (por exemplo, uma PPTase). Em alguns exemplos de realização, a planta é uma planta oleaginosa, em que as sementes oleaginosas, e/ou o óleo nas sementes oleaginosas, contêm ácidos graxos poli-insaturados produzidos pelo sistema AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, as plantas ou partes de plantas geneticamente modificadas, sementes oleaginosas, e/ou óleos nas sementes oleaginosas contêm uma quantidade detectável de pelo menos um AGPI que é o produto do sistema AGPI sintase. Em exemplos de realizações adicionais, tais plantas, partes de plantas, sementes oleaginosas, e/ou óleos nas sementes oleaginosas podem ser substancialmente isentos de produtos intermediários ou secundários que não são os produtos AGPI primários do sistema AGPI sintase instituído e que não são produzidos naturalmente pelo sistema FAS endógeno nas plantas do tipo selvagem. Embora as plantas tipo selvagem produzam alguns AGPIs de cadeia curta ou média, tal como AGPIs de 18 carbonos através do sistema FAS, AGPI novos ou adicionais serão produzidos na planta, partes de plantas, sementes oleaginosas, e/ou óleos nas sementes oleaginosas como resultado da modificação genética com um sistema AGPI sintase descrito na presente invenção.
[00232] A modificação genética de uma planta pode ser realizada utilizando a linhagem clássica de desenvolvimento e/ou técnicas de genética molecular. Vide o Pedido de Patente Publicado 2007/0244192. Métodos para a produção de uma planta transgênica, na qual uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma sequência de aminoácido desejada é incorporada ao genoma da planta são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, vetores virais podem ser usados para produzir plantas transgênicas, tal como pela transformação de uma planta monocotiledônea com um vetor viral utilizando os métodos descritos nas Patentes US 5.569.597; US 5.589.367 e US 5.316.931. Métodos para a engenharia genética ou a modificação de plantas por transformação também são bem conhecidos no estado da técnica, incluindo protocolos de transformação biológica e física. Vide, por exemplo, B.L. Miki et al, Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, em Methods In Plant Molecular Biology And Biotechnology 67-88 (Glick, B.R. e Thompson, J.E. Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993). Além disso, estão disponíveis vetores e métodos de cultura in vitro de células vegetais ou transformação de tecidos e regeneração de plantas. Vide, por exemplo, M. Y. Gruber et al, Vectors for Plant Transformation, em Methods In Plant Molecular Biology And Biotechnology 89-119 (Glick, B.R. e Thompson, J.E. Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993).
[00233] Um método amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Vide, por exemplo, Horsch et al, Science 227:1229 (1985) e Patente US 6.051.757. A. tumefaciens e A. rhizogenessão bactérias do solo fitopatogênicas que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri do A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Vide, por exemplo, Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). Descrições de sistemas de vetores Agrobacterium e métodos para a transferência de genes mediada por Agrobacteriumsão fornecidos por inúmeras referências, incluindo Gruber et al, supra;. Miki et al, supra;. Moloney et al, Plant Cell Reports 8:238(1989);. Patentes US 5.177.010; US 5.104.310; US 5.149.645; US 5.469.976; US 5.464.763; US 4.940.838; US 4.693.976; US 5.591.616; US 5.231.019; US 5.463.174; US 4.762.785; US 5.004.863 e US 5.159.135, e Pedidos de Patentes Europeus 0131624, 120516, 159418, 176112, 116718, 290799, 320500, 604662, 627752, 0267159 e 0292435.
[00234] Outros métodos de transformação de plantas incluem a transformação mediada por microprojétil, no qual o DNA é transportado sobre a superfície de microprojéteis. O vetor de expressão é introduzido em tecidos vegetais com um dispositivo de biobalística que acelera os microprojéteis a velocidades suficientes para penetrar as paredes e membranas celulares. Vide, por exemplo, Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:21 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992), e as Patentes US 5.,015.580 e US 5.322.783. Técnicas para a aceleração de micropartículas revestidas com material genético direcionadas para dentro das células também são descritas, por exemplo, nas Patentes US 4.945.050 e US 5.141.141. Outro método para a entrega física do DNA para plantas é a sonicação de células-alvo. Vide, por exemplo, Zhang et al, Bio/Technology 9:996 (1991). Alternativamente, lipossomas ou fusão de esferoplastos têm sido usados para introduzir vetores de expressão em plantas. Vide, por exemplo, Deshayes et al., EMBO J., 4:2121 (1985), Christou et al, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987). A captação direta de DNA em protoplastos utilizando precipitação de CaCf, injeção de DNA, álcool polivinílico ou poli-L-ornitina também foram relatados. Vide, por exemplo, Ffain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) e Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). A eletroporação de protoplastos e células e tecidos inteiros também foram descritos. Vide, por exemplo, Donn et al., no resumo do 7° Congresso Internacional de Cultura de Célula e Tecido Vegetal IAPTC, A2- 38, p. 53 (1990); D'Halluin et al, Plant Cell 4:1495-1505 (1992); Spencer et al, Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994); Publicações Internacionais WO 87/06614, WO 92/09696, e WO 93/21335; e Patentes Norte-americanas US 5.472.869 e 5.384.253. Outra tecnologia de transformação inclui a tecnologia de cristais capilares, vide, por exemplo, as Patentes US 5.302.523 e US 5.464.765.
[00235] Cloroplastos ou plastídeos também podem ser transformados diretamente. Como tal, as plantas recombinantes podem ser produzidas de um modo em que apenas o cloroplasto ou DNA plastídio fosse modificado com qualquer uma dentre as moléculas de ácido nucleico e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas acima, bem como combinações das mesmas. Os promotores que funcionam em cloroplastos e plastídios são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Hanley-Bowden et al. Trends in Biochemical Sciences 72:67-70 (1987). Métodos e composições para a obtenção de células contendo cloroplastos nos quais o DNA heterólogo foi inserido foram descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-americanas US 5.693.507 e US 5.451.513.
[00236] Quaisquer outros métodos que preveem a transformação eficiente também podem ser empregados.
[00237] Vetores adequados para o uso na transformação de plantas são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, as Patentes US 6.495.738; US 7.271.315; US 7,348.473; US 7.355.100; US 7.456.340; e as referências nelas reveladas.
[00238] Vetores de expressão pode incluir pelo menos um marcador genético, operacionalmente ligado a um elemento regulador (por exemplo, um promotor) que permite que as células transformadas contendo o marcador sejam recuperadas por seleção negativa, ou seja, que inibindo o crescimento de células que não contêm o gene marcador de seleção, ou por seleção positiva, ou seja, a triagem pelo produto codificado pelo marcador genético. Muitos genes marcadores para seleção comumente usados para transformação de plantas são bem conhecidos no estado da técnica da transformação, e incluem, por exemplo, genes que codificam enzimas que desintoxicam metabolicamente um agente químico seletivo, que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado, que é insensível ao inibidor. Marcadores de seleção adequados para o uso na transformação de plantas incluem, mas não estão limitados a, gene da aminoglicosídeo fosfotransferase de transposon Tn5 (Aph II), que codifica a resistência a antibióticos canamicina, neomicina, e G418, bem como os genes que codificam resistência ou tolerância ao glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialophos), imidazolinonas, sulfoniluréias e herbicidas triazolopirimidina, como clorsulfuron, bromoxinil, dalapon, e similares. Um gene marcador de seleção comumente utilizado para transformação de plantas é o gene neomicina fosfotransferase II (npt ll) sob o controle de sinais reguladores de plantas que confere resistência à canamicina. Vide, por exemplo, Fraley et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Outro gene marcador de seleção comumente usado é o gene higromicina fosfotransferase que confere resistência ao antibiótico higromicina. Vide, por exemplo, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5:299 (1985). Genes marcadores de seleção adicionais de origem bacteriana que conferem resistência à antibióticos incluem gentamicina acetil transferase, estreptomicina fosfotransferase, aminoglicosídeo-3'-adenil- transferase, e o determinante de resistência bleomicina. Vide, por exemplo, Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al, Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987), Svab et al, Plant Mol. Biol 14:191 (1990), Hille et al, Plant Mol Biol. 7:171 (1986). Outros genes marcadores de seleção conferem resistência a herbicidas como o glifosato, glufosinato ou bromoxinila. Vide, por exemplo, Comai et al, Nature 317:141-144 (1985), Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2:603618 (1990) e Stalker et al, Science 242:419-423 (1988). Outros genes marcadores de seleção para transformação de plantas não são de origem bacteriana. Estes genes incluem, por exemplo, diidrofolato redutase de camundongo, 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase vegetal e acetolactato sintase vegetal. Vide, por exemplo, Eichholtz et al, Somatic Cell Mol. Genet. 13:61 (1987), Shah et al, Science 233:418 (1986), Charest et al, Plant Cell Rep. 5:643 (1990).
[00239] Um gene repórter pode ser usado com ou sem um marcador selecionável. Os genes repórteres são genes que normalmente não estão presentes no organismo ou tecido receptor e normalmente codificam proteínas, resultando em uma alteração fenotípica ou propriedade enzimática. Vide, por exemplo, K. Weising et al, Ann. Rev. Genetics 22: 421 (1988). Genes repórteres incluem, mas não estão limitados a; beta-glucuronidase (GUS), beta-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase, genes da proteína verde fluorescente e luciferase. Vide, por exemplo, Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol Rep. 5:387 (1987), Teeri et al, EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131 (1987), DeBlock et al, EMBO J. 5:1681 (1984), e Chalfie et al, Science 263:802 (1994). Um ensaio para detectar a expressão do gene repórter pode ser realizado em um tempo adequado após a introdução do gene nas células receptoras. Um desses testes implica a utilização do gene que codifica a beta-glucuronidase (GUS) do locus uidA da E. coli, tal como descrito por Jefferson et al, Biochem. Soc. Trans. 15: 17-19 (1987).
[00240] Elementos promotores da regulação de uma variedade de fontes podem ser utilizados de forma eficiente nas células vegetais para a expressão de genes estranhos. Por exemplo, elementos reguladores promotores de origem bacteriana, tal como o promotor octopina sintase, promotor nopalina- sintase, promotor manopina sintase, bem como os promotores de origem viral, tal como o vírus do mosaico da couve-flor (35S e 19S), 35T (que é um promotor 35S reprojetado por engenharia genética, vide a Publicação Internacional WO 97/13402) podem ser usados. Elementos reguladores promotores vegetais incluem, mas não estão limitados a; pequena subunidade (ssu) da ribulose-1,6-bifosfato (RuBP) carboxilase, promotor da beta- conglicinina, promotor da beta-Faseolina, promotor de ADH, promotores da proteína de choque térmico, promotores e tecidos específicos. As regiões de interação com a matriz, regiões de interação com o eixo proteico, íntrons, intensificadores (enhancers), e sequências de poliadenilação também podem ser usados para melhorar a eficiência de transcrição ou integração do DNA. Tais elementos podem ser incluídos para se obter um ótimo desempenho do DNA transformado na planta. Elementos típicos incluem, mas não estão limitados a, Adh-intron 1, Adh-intron 6, sequência líder de proteína do vírus do mosaico da alfalfa, sequência líder da proteína da cápside do vírus do milho (maize streak vírus), bem como outros disponíveis para um técnico hábil no assunto. Elementos reguladores promotores constitutivos também podem ser usados para direcionar a expressão contínua do gene. Promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a, promotores de vírus de plantas, como o promotor CaMV 35S (Odell et al, Nature 373:810-812 (1985)), e os promotores de genes como o da actina do arroz (McElroy et al, Plant Cell 2:163-171 (1990)), ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 72:619-632 (1989) e Christensen et al, Plant Mol. Biol. 75:675-689 (1992) ), pEMU (Last et al, Theor. Appl. Genet. 57:581-588 (1991)), MAS (Velten et al, EMBO J. 3:2121-2130 (1984), histona H3 do milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genetics 237:276-285 (1992) e Atanassova et al, Plant Journal 2 (3):291-300 (1992)), e o promotor ALS, fragmento 5' Xbal/ncol do gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma sequência de nucleotídeos semelhantes ao fragmento Xbal/ncol) (Publicação Internacional WO 96/30530). Elementos reguladores promotores tecidos-específicos também podem ser usados para a expressão de genes em células ou tipos de tecidos específicos, tais como folhas ou sementes (por exemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina e similares). Promotores tecido-específicos ou tecido-preferenciais incluem, mas não estão limitados a, promotor preferencial de raiz, tal como do gene Faseolina (Murai et al, Science 23:476-482 (1983) e Sengupta-Gopalan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 52:3320-3324 (1985)); um promotor folha-específico e induzível por luz tal como a Cab ou Rubisco (Simpson et al, EMBO J. 4(11 ):2723-2729 (1985) e Timko et al, Nature 375:579-582 (1985)); um promotor antera-específico, tal como LAT52 (Twell et al, Mol. Gen. Genetics 277:240-245 (1989)); um promotor pólen-específico, como Zml3 (Guerrero et al, Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)); ou um promotor microsporo-preferencial como apg (Twell et al, Sex. Plant Reprod. (6:217-224 (1993)).
[00241] Elementos reguladores promotores também podem ser ativos durante certo estágio do desenvolvimento de uma planta, bem como em tecidos e órgãos vegetais, incluindo, mas não se limitando a, elementos reguladores promotores pólen - específicos, embrião-específicos, cabelo de milho-específicos, fibra de algodão-específicos, raiz-específicos, e endosperma da semente-específicos. Um elemento regulador promotor induzível pode ser usado, de modo que ele é responsável pela expressão de genes em resposta a um sinal específico, tal como: estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RuBP carboxilase); hormonal (Em); metabólitos, produtos químicos, e estresse. Promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, um promotor do sistema ACEI, que responde ao cobre (Mett et al, PNAS 90:4567-4571 (1993)); do gene In2 a partir do milho, que responde a protetores do herbicida benzenosulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991) e Gatz et al, Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)), a partir do repressor do Tet do TnlO (Gatz et al, Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)); e de um gene do hormônio esteróide, do qual a atividade transcricional é induzida por um hormônio glicocorticóide (Schena et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991).
[00242] As sequências sinais também podem ser usadas para direcionar um polipeptídeo para qualquer organela intracelular ou compartimento subcelular ou para a secreção para o apoplasto. Vide, por exemplo, Becker et al, Plant Mol. Biol. 20:49 (1992), Knox, C., et al, Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987), Lerner et al, Plant Physiol. 97:124-129 (1989), Fontes et al, Plant Cell 3:483496 (1991), Matsuoka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991), Gould et al, J. Cell. Biol. 108:1657 (1989), Creissen et al, Plant J. 2:129 (1991), Kalderon, et al, Cell 59:499-509 (1984), e Steifel et al, Plant Cell 2:785-793 (1990). Tais sequências de direcionamento fazem com que a proteína expressa desejada seja transferida para a estrutura celular na qual ela funciona de maneira mais eficaz ou seja transferida para áreas da célula em que os processos celulares necessários para as funções fenotípicas desejadas estão concentrados.
[00243] Em alguns exemplos de realização, as sequências sinais são usadas para direcionar as proteínas da invenção para um compartimento subcelular, por exemplo, para o plastídio ou cloroplasto. Os produtos de genes, incluindo produtos de genes heterólogos, podem ser direcionados para o plastídio ou cloroplasto pela fusão o produto gênico a uma sequência sinal que é clivada durante a importação para o cloroplasto produzindo a proteína madura. Vide, por exemplo, Comai et al, J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988) e van den Broeck et al, Nature 313: 358-363 (1985). O DNA de codificação das sequências sinais apropriadas pode ser isolado a partir de cDNAs de codificação da proteína RUBISCO, proteína CAB, enzima EPSP sintase, proteína GS2, ou de qualquer proteína direcionada para o cloroplasto de ocorrência natural que contenham uma sequência sinal (também denominado de peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP)) que direciona a proteína alvo para o cloroplasto. Tais proteínas de direcionamento para o cloroplasto são bem conhecidas no estado da técnica. As proteínas de direcionamento para o cloroplasto são sintetizadas como proteínas precursoras maiores que contêm um CTP amino-terminal, que direciona o precursor para a maquinaria de importação do cloroplasto. Os CTPs são geralmente clivados por endoproteases específicas localizadas dentro da organela cloroplasto, liberando assim a proteína alvo madura, incluindo proteínas ativas tais como enzimas, a partir do precursor no meio do cloroplasto. Exemplos de sequências que codificam peptídeos apropriados para o direcionamento de um gene ou produto gênico para o cloroplasto ou plastídio da célula vegetal incluem a EPSPS CTP de petunia, a EPSPS CTP2 e intron da Arabidopsis, e outras sequências conhecidas no estado da técnica. Exemplos específicos de CTPs incluem, mas não estão limitados a, subunidade pequena do peptídeo de trânsito atslA da ribulose bifosfato carboxilase de Arabidopsis thaliana, peptídeo de trânsito EPSPS de Arabidopsis thaliana, e uma subunidade pequena do peptídeo de trânsito da ribulose bifosfato carboxilase de Zea maize. Um peptídeo de trânsito otimizado é descrito, por exemplo, por Van den Broeck et al, Nature 373:358-363 (1985). Sequências sinais de procariotos e eucariotos são divulgadas, por exemplo, por Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. 36: 425 (1982). Exemplos adicionais de peptídeos de trânsito que podem ser usados na invenção incluem peptídeos de trânsito para cloroplastos descritos em Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126(1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988); Chen & Jagendorf, J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993); um peptídeo de trânsito a partir do gene de rbcS da Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)); e um peptídeo de trânsito derivado da acil-ACP tioesterase de Brassica napus (Loader et al., Plant Mol. Biol. 23: 769-778 (1993); Loader et al, Plant Physiol. 110:336-336 (1995).
[00244] As plantas geneticamente modificadas da invenção podem ser modificadas para eliminar ou inativar um sintase de ácido graxo endógena, para reduzir a competição pela malonil CoA do sistema endógeno com a AGPI sintase exógena, para aumentar o nível de malonil CoA no organismo e as combinações deste. Vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2007/0245431.
[00245] Uma planta geneticamente modificada pode ser cultivada em um meio de fermentação ou cultivada em um meio adequado, tal como o solo. Um meio de crescimento adequado para plantas superiores inclui qualquer meio de crescimento para plantas, tais como, mas não se limitando a, terra, areia, qualquer meio formado por outras partículas que suporte o crescimento das raízes (por exemplo, vermiculita, perlita, e etc.) ou cultura hidropônica, bem como luz, água e suplementos nutricionais adequados que otimizam o crescimento das plantas superiores. Os AGPIs podem ser recuperados a partir das plantas geneticamente modificadas por meio de processos de purificação que extraem os compostos da planta. Os AGPIs podem ser recuperados pela colheita da planta, bem como colhendo o óleo a partir da planta (por exemplo, a partir de sementes oleaginosas). A planta também pode ser consumida em seu estado natural ou ser adicionalmente transformada em produtos consumíveis. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção é direcionada a uma planta geneticamente modificada, em que a planta produz pelo menos um AGPI como resultado da modificação genética, e no qual o perfil de ácidos graxos totais na planta, ou parte da planta em que o AGPI é acumulado, compreende uma quantidade detectável de AGPI produzido como resultado da modificação genética da planta. Em alguns exemplos de realização, a planta é uma planta de sementes oleaginosas. Em alguns exemplos de realização, a planta de sementes oleaginosas produz AGPIs em suas sementes maduras ou contém os AGPIs no óleo de suas sementes.
[00246] Vários sistemas de cultura de células de mamíferos também podem ser utilizados para expressar a proteína recombinante. Os vetores de expressão compreendem uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados, bem como qualquer sítio de ligação ao ribossomo necessário, sítio de poliadenilação, sítio doador de aceptor do splicing, sequências de terminação da transcrição, e sequências não transcritas flanqueadoras 5’, desenvolvendo a expressão heteróloga.
MÉTODOS QUE ENVOLVEM EXPRESSÃO HETERÓLOGA
[00247] A presente invenção é direcionada a um método para produzir pelo menos um AGPI compreendendo a expressão de um sistema AGPI sintase em uma célula hospedeira sob condições eficazes para a produção de ácidos graxos poli-insaturados, em que o sistema AGPI sintase compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas no presente, bem como combinações das mesmas, em que pelo menos um AGPI é produzido. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um AGPI inclui DHA, EPA, ou uma combinação destes. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é uma célula vegetal, uma célula animal isolada, ou uma célula microbiana. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é um traustocitrídio.
[00248] A presente invenção é direcionada a um método para produzir lipídios enriquecidos por DHA, EPA, ou uma combinação destes, compreendendo a expressão de um gene AGPI sintase em uma célula hospedeira sob condições eficazes para a produção de lipídios, onde o gene da AGPI sintase compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas ou moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas no presente, bem como combinações das mesmas na célula hospedeira, onde lipídios enriquecido com DHA, EPA, ou uma combinação destes são produzidos.
[00249] A invenção é direcionada a um método de isolamento de lipídios a partir de uma célula hospedeira, que compreende expressar um gene AGPI sintase na célula hospedeira sob condições eficazes para a produção de lipídios, e isolar os lipídios da célula hospedeira, onde o sistema AGPI sintase na célula hospedeira compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas no presente, bem como combinações das mesmas.
[00250] Em alguns exemplos de realização, uma ou mais frações lipídicas contendo AGPIs são isoladas das células hospedeiras. Em alguns exemplos de realização, a uma ou mais frações isoladas a partir da célula hospedeira inclui a fração de ácidos graxos totais, a fração ésteres de esterol, a fração de triglicéride, a fração de ácidos graxos livres, a fração de esterol, a fração diglicerol, a fração de fosfolipídios, ou a combinação destes. Em alguns exemplos de realização, os AGPIs são isolados a partir das células hospedeiras, onde os AGPIs são enriquecidos com ácidos graxos ômega-3, ácidos graxos ômega-6, ou uma combinação dos mesmos com base na composição do sistema AGPI sintase introduzido em uma célula hospedeira. Em alguns exemplos de realização, os AGPIs são enriquecidos por DHA, EPA, DPA n-6, ARA, ou combinações destes com base na composição do sistema AGPI sintase introduzido em uma célula hospedeira. Em alguns exemplos de realização, os AGPIs são enriquecidos com DHA, EPA, ou uma combinação destes. Em alguns exemplos de realização, o perfil de AGPIs dos AGPIs isolados de uma célula hospedeira incluem altas concentrações de DHA e concentrações menores de EPA, ARA, DPA n-6, ou combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o perfil de AGPIs dos AGPIs isolados de uma célula hospedeira incluem altas concentrações de DHA e EPA e concentrações menores de ARA, DPA n-6, ou combinações destes. Em alguns exemplos de realização, o perfil de AGPIs dos AGPIs isolados de uma célula hospedeira incluem altas concentrações de EPA e concentrações menores de DHA, ARA, DPA n-6, ou combinações destes.
[00251] A invenção é direcionada a um método de substituição de uma atividade AGPI sintase inativa ou deletada, introduzindo uma nova atividade AGPI sintase, ou melhorando uma atividade AGPI sintase existente em um organismo com atividade AGPI sintase, compreendendo a expressão de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas na presente invenção, bem como combinações das mesmas no organismo sob condições eficazes para a expressão da atividade AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende um ou mais sequências de polinucleotídeo PFA1, PFA2, ou PFA3 da AGPI sintase descritas no presente que codificam um ou mais domínios AGPI sintase. Em alguns exemplos de realização, os perfis dos AGPIs dos organismos são alterados pela introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico da invenção. Em alguns exemplos de realização, os perfis de AGPIs alterados incluem um aumento dos ácidos graxos ômega-3 e uma diminuição dos ácidos graxos ômega-6. Em alguns exemplos de realização, os perfis de AGPIs alterados incluem um aumento dos ácidos graxos ômega-6 e uma diminuição dos ácidos graxos ômega-3. Em alguns exemplos de realização, os ácidos graxos tanto ômega-3 quanto ômega-6 estão aumentados. Em alguns exemplos de realização, a quantidade de DHA está aumentada enquanto as quantidades de um ou mais EPA, ARA, DPA n-6, ou combinações destes, estão mantidas ou diminuíram. Em alguns exemplos de realização, as quantidades de EPA e DHA estão aumentadas, enquanto as quantidades de ARA, DPA n-6, ou uma combinação de ambos estão mantidas ou diminuíram. Em alguns exemplos de realização, a quantidade de EPA está aumentada enquanto as quantidades de um ou mais dentre DHA, ARA, DPA n-6, ou combinações destes, estão mantidas ou diminuíram. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeoss PFA3 ou um ou mais domínios desta. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeoss PFA3 ou um ou mais domínios desta e a quantidade de ácidos graxos ômega-3 no organismo está aumentada enquanto a quantidade de ácidos graxos ômega-6 está reduzida. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeoss PFA2 ou um ou mais domínios desta e a quantidade de DHA no organismo está aumentada enquanto a quantidade de EPA está reduzida.
[00252] A invenção é direcionada a métodos para aumentar a produção de DHA, EPA, ou uma combinação destes em um organismo com atividade AGPI sintase, compreendendo a expressão de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isoladas e moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas no presente, bem como combinações das mesmas no organismo sob condições eficazes para a produção de DHA, EPA, ou uma combinação destes, onde a atividade AGPI sintase substitui uma atividade inativa ou deletada, introduz uma nova atividade, ou aumenta uma atividade já existente no organismo, e onde a produção de DHA, EPA, ou um combinação destes no organismo está aumentada.
[00253] Depois de descrito de modo geral, um melhor entendimento pode ser obtido da presente invenção tendo por base os exemplos fornecidos. Estes exemplos são apenas para propósitos ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante do escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00254] Os primers degenerados para os domínios de KS e DH da AGPI sintase foram projetados a fim de isolar as sequências correspondentes a partir do microrganismo isolado depositado sob o número de acesso ATCC: PTA- 9695, também conhecido como Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695.
[00255] Os primers degenerados para a região KS do PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 (ou seja, a região contendo o domínio KS) foram projetados com base nas sequências PFA1 publicadas (anteriormente denominado de orfA ou ORF1) para Shewanella japonica, Schizochytrium sp. ATCC 20888, Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), e Thraustochytrium sp. 23B ATCC 20892: prDS173 direto (forward): GATCTACTGCAAGCGCGGNGGNTTYAT (SEQ ID NO: 62), e prDS174 reverso (reverse): GGCGCAGGCGGCRICNACNAC (SEQ ID NO: 63).
[00256] Primers degenerados para a região DH de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 PFA3 (anteriormente denominado orfC ou ORF3) foram projetados com base nas sequências publicadas para Moritella marina; Schizochytrium sp. ATCC 20888; Shewanella sp. SCRC-2738; Photobacterprofunclum e Thraustochytrium sp. 23B ATCC: 20892: JGM190 - (direto): CAYTGGTAYTTYCCNTGYCAYTT (SEQ ID NO: 64); e BLR242 - (reverso): CCNGGCATNACNGGRTC (SEQ ID NO: 65).
[00257] As condições da PCR com o DNA molde cromossômico foram as seguintes: 0,2 μM de DNTPs, 0,1 μM de cada primer, DMSO 8%, 200 ng de DNA cromossômico, 2,5 U da polimerase de fusão “Herculase® II” (Stratagene) e tampão “IX Herculase®” (Stratagene) em um volume total de 50 μL. O protocolo da PCR incluiu as seguintes etapas: (1) 98 °C por 3 minutos, (2) 98 °C por 30 segundos; (3) 50 °C por 30 segundos; (4) 72 °C por 2 minutos; (5) repetição das etapas 2-4 por 40 ciclos; (6) 72 °C por 5 minutos, e (7) mantido a 6 °C.
[00258] Para ambos os pares de primers, a PCR produziu produtos de DNA distintos, com os tamanhos esperados usando modelos cromossômico de Schizochytrium sp número de acesso ATCC: PTA-9695. Os respectivos produtos da PCR foram clonados no vetor pJET1.2/blunt (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante, e a sequência inserida foi determinada utilizando primers padrões fornecidos.
[00259] As sequências de DNA obtidas a partir dos produtos da PCR foram comparadas com as sequências conhecidas disponíveis no NCBI GenBank em uma busca padrão no BLASTx (parâmetros BLASTx: Filtro de baixa complexidade; Matriz: BLOSUM62; “Gap cost; Existence 11”, Extensão de nl. de Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, e David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.).
[00260] Com relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis mais altos de homologia com a sequência de aminoácidos deduzida derivada do DNA clonado contendo o fragmento KS do Schizochytrium sp. ATCC: PTA-9695 foram: Schizochytrium sp. ATCC: 20888 “sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade A” (identidade = 87%; positivos = 92%); Shewanella oneidensis MR-1 “multi-domínio beta-cetoacil sintase” (identidade = 49%; positivos = 64%) e Shewanella sp. MR-4 “beta-cetoacil sintase” (identidade = 49%; positivos = 64%).
[00261] Com relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis mais altos de homologia com a sequência de aminoácidos deduzida derivada do DNA clonado contendo o fragmento DH do Schizochytrium sp. ATCC: PTA-9695 foram: Schizochytrium sp. ATCC: 20888 “sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade C” (identidade = 61%; positivos = 71%); Shewanella paleneana ATCC: 700345 “Beta-hidroxi-(proteína transportadora de acila) desidratase FabA/FabZ” (identidade = 35%; positivos = 50%) e Shewanella sediminis HAW- EB3 “PfaC sintase de ácido graxo poli-insaturado ômega-3” (identidade = 34%; positivos = 50%).
EXEMPLO 2 GENES DA AGPI SINTASE FORAM IDENTIFICADOS A PARTIR DO SCHIZOCHYTRIUM SP. ATCC: PTA- 9695.
[00262] O DNA genômico foi preparado a partir do microrganismo por meio de procedimentos padrões. Vide, por exemplo, Sambrook J. e Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual,3a Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Resumidamente: (1) 500 μL de células foram sedimentadas (peletizadas) a partir de culturas no meio da fase logarítmica. As células foram recentrifugadas e todos os vestígios de líquido foram removidos do sedimento (pellet) celular com uma ponteira de pipeta de pequeno calibre (2); os pellets foram resuspensos com 200 μL de tampão de lise (20mM de Tris pH 8,0, 125 μg/ml de proteinase K, 50 mM de NaCI, 10 mM de EDTA pH 8,0, SDS 0,5%), (3) as células foram lisadas a 50 °C por 1 hora; (4) a mistura de lise foi pipetada em tubos phase-lock gel (PLG - Eppendorf) de 2mL; (5) um volume igual de P:C:I foi adicionado e a mistura foi deixada misturar por 1,5 horas; (6) os tubos foram centrifugados a 12k x g por 5 minutos, (7) a fase aquosa foi retirada de cima do gel no interior do tubo e PLG e um volume igual de clorofórmio foi adicionado à fase aquosa, e misturado por 30 minutos; (8) os tubos foram centrifugados a 14k por aproximadamente 5 minutos; (9) a camada superior (fase aquosa) foi retirada do clorofórmio com o uso de uma pipeta, e colocada em um novo tubo, (10) 0,1 volume de NaOAC 3M foi adicionado e misturado (invertido várias vezes); (11) 2 volumes de etanol 100% foi adicionado e misturado (invertido várias vezes) com o DNA genômico precipitante formando nesta fase; (12) os tubos foram centrifugado a 4 °C em uma microcentrífuga a 14k por aproximadamente 15 minutos; (13) o líquido foi cuidadosamente vertido para fora do tubo com o DNA genômico permanecendo no fundo do tubo; (14) o pellet foi lavado com 0,5 mL de EtOH 70%; (15) os tubos foram centrifugado a 4 °C em uma microcentrífuga a 14k por aproximadamente 5 minutos; (16) o EtOH foi cuidadosamente decantado e o pellet de DNA genômico foi seco e (17) um volume adequado de H2O e RNase foi adicionado diretamente ao sedimento de DNA genômico.
[00263] O DNA genômico isolado foi usado para gerar bibliotecas recombinantes compostas de grandes fragmentos (cerca de 40 kB) de acordo com as instruções do fabricante no cosmídeo pWEB-TNC™ (Epicentre). As bibliotecas de cosmídeos foram selecionadas por procedimentos padrões de hibridização de colônias usando sondas marcadas radioativamente com P32 (Sambrook J. e Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual,3a Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). As sondas continham DNA homólogo às sequências da AGPI sintase publicadas a partir de outros organismos, conforme descrito no exemplo 1. Estas sondas foram geradas por uma digestão com enzimas de restrição de DNA dos fragmentos clonados a partir dos respectivos clones do pJET1.2/blunt descrito acima e marcadas utilizando métodos convencionais. Em todos os casos, uma forte hibridação das sondas individuais para certos cosmídeos indicou os clones que continham DNA homólogos aos genes AGPI sintase.
[00264] O clone cosmídeo pDS115 demonstrou forte hibridização da sonda para a região KS e foi selecionado para o sequenciamento de DNA do gene PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. O cosmídeo clone pDS115, contendo os genes PFA1 e PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695, foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste, na Coleção de Culturas Norte-Americana - American Type Culture Collection (ATCC), Depósitos de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 27 de janeiro de 2009, e foi atribuído o número de acesso do ATCC: PTA-9737. Os primers de sequenciamento para a sequência de DNA da região KS determinada no Exemplo 1 foram projetados usando métodos padrões. Para determinar a sequência de DNA do PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695 foram realizadas sucessivas rodadas de sequenciamento de DNA envolvendo o subsequente desenho de primers de sequenciamento por métodos padrões, a fim de realizar a estratégia “walk” no clone cosmídeo.
[00265] Em publicações anteriores de sistemas AGPI sintase de traustocitrídios, os genes PFA1 e PFA2 da AGPI sintase foram agrupados e dispostos de modo a serem divergentemente transcritos. Este é também o caso do PFA1 e PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695. Através do “walking” de sequências de DNA a partir do cosmídeo clone pDSl 15, o início conceitual do PFA2 foi encontrado com estando 493 nucleotídeos a partir do início de PFA1 e divergentemente transcrito. Cada par de bases de nucleotídeos dos genes da AGPI sintase, PFA1 e PFA2, do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 foram cobertos por pelo menos duas reações de sequenciamento de DNA separadas de alta qualidade com uma pontuação Phred agregada mínima de pelo menos 40 (nível de confiança de 99,99%).
[00266] O clone cosmídeo pBS4 demonstrou forte hibridização da sonda para a região DH e foi selecionado para o sequenciamento de DNA do gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. O cosmídeo clone pBS4, contendo o gene PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695, foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste, na Coleção Norte-americana de Culturas - American Type Culture Collection (ATCC), Depósitos de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 27 de janeiro de 2009, e foi atribuído o número de acesso do ATCC: PTA-9736. Os primers de sequenciamento foram projetados usando métodos padrões para a sequência de DNA da região DH determinada no Exemplo 1. Para determinar a sequência de DNA do PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695 foram realizadas sucessivas rodadas de sequenciamento de DNA envolvendo o subsequente desenho de primers de sequenciamento por métodos padrões, a fim de realizar a estratégia “walk” no clone cosmídeo. Cada par de bases de nucleotídeos do gene da AGPI sintase PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 foi coberto por pelo menos duas reações de sequenciamento de DNA separadas de alta qualidade com uma pontuação Phred agregada mínima de pelo menos 40 (nível de confiança de 99,99%).
[00267] A Tabela 1 exibe as identidades para as sequências de polinucleotídeos do PFA1 (SEQ ID NO: 1), PFA2 (SEQ ID NO: 3), e PFA3 (SEQ ID NO: 5) do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695, em comparação com as sequências publicadas anteriormente. As identidades foram determinadas pela matriz de pontuação “swgapdnamt” dentro do programa “AlignX” do programa “VectorNTI”, que é um padrão para o alinhamento de DNA. TABELA 1: PORCENTAGEM DE IDENTIDADE PARA AS SEQUÊNCIAS DE POLINUCLEOTÍDEOS PFA1, PFA2 E PFA3
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[00268] A Tabela 2 exibe as identidades para as sequências de aminoácidos PFA1p (SEQ ID NO: 2), PFA2p (SEQ ID NO: 4), e PFA3p (SEQ ID NO: 6) do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695, em comparação com as sequências de aminoácidos AGPI sintase publicadas anteriormente. As identidades foram determinadas pelo uso de matriz de pontuação “blosum62mt2” dentro do programa “AlignX” do programa “VectorNTI”, que é um padrão para o alinhamento de proteína. TABELA 2: PORCENTAGEM DE IDENTIDADE PARA AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PFAIP, PFA2P E PFA3P
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EXEMPLO 3
[00269] A análise de domínio foi realizada para anotar as coordenadas de sequência para os domínios AGPI sintase e sítios ativos de PFA1, PFA2 e PFA3, respectivamente do Schizochytrium sp. ATCC: PTA- 9695. Os domínios foram identificados com base na homologia dos domínios AGPI sintase, ácido graxo sintase, e policetídeo sintase conhecidos.
[00270] A Tabela 3 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. TABELA 3: ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA1 DE SCHIZOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 9695
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[00271] O primeiro domínio no PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio KS. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KS PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 7, correspondendo às posições 7-1401 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KS PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 8, correspondendo às posições 3-467 da SEQ ID NO: 2. O domínio KS contém um motivo sítio ativo: DXAC* (SEQ ID NO: 43), com um sítio de ligação a acila* correspondente a C203 da SEQ ID NO: 2. Além disso, um motivo característico está presente no final do domínio KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), correspondendo às posições 455-458 da SEQ ID NO: 2 e posições 453-456 da SEQ ID NO: 8.
[00272] O segundo domínio no PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio MAT. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio MAT PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada no presente como SEQ ID NO: 9, correspondendo às posições 1798-2700 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo o domínio MAT PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 10, correspondendo às posições 600-900 da SEQ ID NO: 2. O domínio MAT contém um motivo de sítio ativo: GHS*XG (SEQ ID NO: 46), com um sítio de ligação a acila* correspondente a D699 da SEQ ID NO: 2.
[00273] Do terceiro até o oitavo domínio no PFA1 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 são seis domínios ACP em tandem, também referido no presente como ACP1, ACP2, ACP3, ACP4, ACP5 e ACP6. A sequência de nucleotídeos contendo o primeiro domínio ACP, ACP1, é representada no presente como a SEQ ID NO: 13 e está contida dentro da sequência de nucleotídeos abrangendo desde a posição 3325 até cerca da posição 3600 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP1, representada no presente como a SEQ ID NO: 14 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1109 até aproximadamente a posição 1200 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos contendo ACP2, representada no presente como a SEQ ID NO: 15 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 3667 até aproximadamente a posição 3942 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP2, representada no presente como a SEQ ID NO: 16 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1223 até aproximadamente a posição 1314 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos contendo ACP3, representada no presente como a SEQ ID NO: 17 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4015 até aproximadamente a posição 4290 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP3, representada no presente como a SEQ ID NO: 18, está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1339 até aproximadamente a posição 1430 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos contendo ACP4, representada no presente como a SEQ ID NO: 19 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4363 até aproximadamente a posição 4638 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP4, representada no presente como a SEQ ID NO: 20 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1455 até aproximadamente a posição 1546 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos contendo ACP5, representada no presente como a SEQ ID NO: 21 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4711 até aproximadamente a posição 4986 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP5, representada no presente como a SEQ ID NO: 22 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1571 até aproximadamente a posição 1662 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos contendo ACP6, representada no presente como a SEQ ID NO: 23 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 5053 até aproximadamente a posição 5328 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo ACP6, representada no presente como a SEQ ID NO: 24 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1685 até aproximadamente a posição 1776 da SEQ ID NO: 2. Todos os seis domínios ACP juntos abrangem uma região do PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 desde a posição 3298 até aproximadamente a posição 5400 da SEQ ID NO: 1, correspondendo a posições de aminoácidos 1100 a aproximadamente 1800 da SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos para a região ACP inteira que contém todos os seis domínios é representada no presente como SEQ ID NO: 11, enquanto a sequência de aminoácidos para a região ACP inteira contendo todos os seis domínios é representada no presente como a SEQ ID NO: 12. O intervalo de repetição para os seis domínios ACP dentro da SEQ ID NO: 11 foi encontrado por ser de aproximadamente a cada 342 nucleotídeos (o número real de aminoácidos adjacentes mensurado entre serinas do sítio ativo varia de 114 a 116 aminoácidos). Cada um dos seis domínios ACP contém um motivo de ligação a panteteína LGIDS* (SEQ ID NO: 47) onde S* é a serina (S) do sítio de ligação à panteteína. A serina (S) do sítio de ligação a panteteína está localizada próxima do centro de cada sequência do domínio ACP. Os locais dos resíduos de serina do sítio ativo (ou seja, o sítio de ligação à panteteína) para cada um dos seis domínios ACPD, com relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 são: ACP1 = S1152, ACP2 = S1266, ACP3 = S1382, ACP4 = S1498, ACP5 = S1614, e ACP6 = S1728.
[00274] O nono domínio no PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio KR. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KR PFA1 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 25, correspondendo às posições 5623- 7800 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KR PFA1 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 26, correspondendo às posições 1875-2600 da SEQ ID NO: 2. Dentro do domínio KR está uma região central (contida dentro da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 48, e sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 49) com homologia a uma aldeído desidrogenase de cadeia curta (KR é um membro dessa família). Essa região central se estende desde a posição 5998 até a aproximadamente a posição 6900 da SEQ ID NO: 1, o que corresponde a posições de aminoácidos de 2000 a 2300 da SEQ ID NO: 2.
[00275] O décimo domínio no PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio DH. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 27, correspondendo às posições 70277065 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 28, correspondendo às posições 2343-2355 da SEQ ID NO: 2. O domínio DH contém um motivo de sítio ativo conservado (vide, Donadio, S. e Katz, L., Gene 111(1):51-60 (1992)): LxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO: 50).
[00276] A Tabela 4 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. TABELA 4 ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA2 DE SCHIZOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 9695
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[00277] O primeiro domínio no PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio KS. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KS PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 29, correspondendo às posições 10-1350 da SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KS PFA2 da Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 30, correspondendo às posições 4-450 da SEQ ID NO: 4. O domínio KS contém um motivo sítio ativo: DXAC* (SEQ ID NO: 43), com um sítio de ligação a acila* correspondente a C191 da SEQ ID NO: 4. Além disso, um motivo característico está presente no final do domínio KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), correspondendo às posições 438-441 da SEQ ID NO: 4 e posições 435-438 da SEQ ID NO: 30.
[00278] O segundo domínio no PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio CLF. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio CLF PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 31, correspondendo às posições 14082700 da SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos contendo o domínio CLF PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 32, correspondendo às posições 470-900 da SEQ ID NO: 4.
[00279] O terceiro domínio no PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio AT. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio AT PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 33, correspondendo às posições 2998-4200 da SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos contendo o domínio AT PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 34, correspondendo às posições 1000-1400 da SEQ ID NO: 4. O domínio AT contém um motivo de sítio ativo GXS*xG (SEQ ID NO: 52) que é característico de proteínas aciltransferse (AT), com um resíduo serina do sítio ativo correspondendo a posição S1141 da SEQ ID NO: 4.
[00280] O quarto domínio no PFA2 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio ER. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio ER PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 35, correspondendo às posições 4498-5700 da SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos contendo o domínio ER PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 36, correspondendo às posições 1500-1900 da SEQ ID NO: 4.
[00281] A Tabela 5 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. TABELA 5: ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA3 DE SCHIZOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 9695
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[00282] Os primeiro e segundo domínios de PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 são domínios DH, referidos no presente como DH1 e DH2, respectivamente. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH1 PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 37, correspondendo às posições 1-1350 da SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH1 PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 38, correspondendo às posições 1-450 da SEQ ID NO: 6. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH2 PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 39, correspondendo às posições 1501-2700 da SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH2 PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 40, correspondendo às posições 501-900 da SEQ ID NO: 6. Os domínios DH contêm um motivo de sítio ativo: FxxH*F (SEQ ID NO: 53). A sequência de nucleotídeos contendo o motivo de sítio ativo em DH1 corresponde às posições 931-933 da SEQ ID NO: 5, enquanto a sequência de nucleotídeos contendo o motivo de sítio ativo no DH2 corresponde às posições 2401-2403 da SEQ ID NO: 5. O sítio ativo H* no motivo FxxH*F é baseado nos dados de Leesong et al., Structure 4:253-64 (1996) e Kimber et al. J Biol Chem. 279:52593-602 (2004), com o sítio ativo H* em DH1 correspondendo a H310 da SEQ ID NO: 6 e o sítio ativo H* em DH2 correspondendo ao H801 da SEQ ID NO: 6.
[00283] O terceiro domínio no PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é um domínio ER. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio ER PFA3 do Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 41, correspondendo às posições 28484200 da SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos contendo o domínio ER PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 é representada aqui como SEQ ID NO: 42, correspondendo às posições 950-1400 da SEQ ID NO: 6.
EXEMPLO 4
[00284] Os primers degenerados para os domínios KS, ER e DH da AGPI sintase foram projetados a fim de isolar as sequências correspondentes a partir do microrganismo isolado depositado sob o número de acesso ATCC: PTA- 10212, também conhecido como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212.
[00285] Os primers degenerados para a região KS do PFA1 (ou seja, a região contendo o domínio KS) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 foram projetados com base nas sequências PFA1 publicadas (anteriormente denominado de orfA ou ORF 1) do Schizochytrium sp. ATCC 20888, Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), e Thraustochytrium sp. 23B ATCC 20892: prDS233 - (direto): TGATATGGGAGGAATGAATTGTGTNGTNGAYGC (SEQ ID NO: 123) prDS235 - (reverso): TTCCATAACAAAATGATAATTAGCTCCNCCRAANCC (SEQ ID NO: 124).
[00286] Os primers degenerados para a região ER do PFA2 (ou seja, a região contendo o domínio ER) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 foram projetados com base nas sequências PFA2 publicadas (anteriormente denominado de orfB ou ORF 2) para Shewanella japonica, Schizochytrium sp. ATCC 20888, Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), e Thraustochytrium sp. 23B ATCC 20892: prDS183 (direto): GGCGGCCACACCGAYAAYMGNCC (SEQ ID NO: 125). prDS184 (reverso): CGGGGCCGCACCANAYYTGRTA (SEQ ID NO: 126).
[00287] Os primers degenerados para a região ER do PFA3 (ou seja, a região contendo o domínio ER) de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA-10212 foram projetados com base nas sequências PFA3 publicadas (anteriormente denominado orfC ou ORF 3) para Shewanella japonica, Schizochytrium sp. ATCC 20888, Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), e Thraustochytrium sp. 23B ATCC 20892: prDS181 (direto): TCCTTCGGNGCNGSNGG (SEQ ID NO: 127) prDS184 (reverso): CGGGGCCGCACCANAYYTGRTA (SEQ ID NO: 126).
[00288] Os primers degenerados JGM190 (direto, SEQ ID NO: 64) e BLR242 (reverso, SEQ ID NO: 65), conforme descrito acima, foram utilizados para amplificar a região DH do PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212.
[00289] As condições da PCR com o DNA molde cromossômico foram as seguintes: 0,2 μM de DNTPs, 0,1 μM de cada primer, DMSO 6%, 200 ng de DNA cromossômico, 2,5 U da polimerase de fusão “Herculase® II” (Stratagene) e tampão “IX Herculase®” (Stratagene) em um volume total de 50 μL. O protocolo da PCR incluiu as seguintes etapas: (1) 98 °C por 3 minutos, (2) 98 °C por 30 segundos; (3) 54 °C por 45 segundos; (4) 72 °C por 2 minutos; (5) repetição das etapas 1-4 por 40 ciclos; (6) 72 °C por 5 minutos, e (7) mantido a 6 °C.
[00290] Para todos os pares de primers, a PCR produziu produtos de DNA distintos, com os tamanhos esperados usando modelos cromossômico de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. Os respectivos produtos da PCR foram clonados no vetor pJET1.2/blunt (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante, e a sequência inserida foi determinada utilizando primers padrões fornecidos.
[00291] As sequências de DNA obtidas a partir dos produtos da PCR foram comparadas com as sequências conhecidas disponíveis no GenBank NCBI conforme descrito no Exemplo 1.
[00292] Em relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis de homologia mais alto com as sequência de aminoácidos deduzidas derivadas do DNA clonado contendo o fragmento KS a partir do PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foram: Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade A" (Identidade = 80%; positivos = 90%); Shewanella benthica KT99"sintase de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 PfaA" (Identidade = 51%; positivos = 67%); Shewanella loihica PV-4"beta- cetoacil sintase" (Identidade = 50%; positivos = 67%); Shewanella wooclyi ATCC 51908"sintase de ácido graxo poli-insaturado tipo policetídeo PfaA" (Identidade = 51%; positivos = 66%).
[00293] Em relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis de homologia mais alto com as sequência de aminoácidos deduzidas derivadas do DNA clonado contendo o fragmento ER a partir do PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foram: Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade B" (Identidade = 70%; positivos = 85%); Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade C" (Identidade = 66%; positivos = 83%); Nodularia spumigena CCY9414"2-nitropropano dioxigenase" (Identidade = 57%; positivos = 74%); Moritella sp. PE36 "sintase de ácido graxo poli-insaturado PfaD" (Identidade = 57%; positivos = 71%).
[00294] Em relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis de homologia mais alto com as sequência de aminoácidos deduzidas derivadas do DNA clonado contendo o fragmento ER a partir do PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foram: Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade C" (Identidade = 80%; positivos = 90%); Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade B" (Identidade = 78%; positivos = 89%); Moritella sp. PE36 "sintase de ácido graxo poli-insaturado PfaD" (Identidade = 56%; positivos = 71%); Shewanella amazonensis SB2B "sintase de ácido graxo poli-insaturado ômega- 3 PfaD" (Identidade = 55%; positivos = 73%).
[00295] Em relação aos aminoácidos, as sequências com os níveis de homologia mais alto com as sequência de aminoácidos deduzidas derivadas do DNA clonado contendo o fragmento DH a partir do PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foram: Schizochytrium sp. ATCC 20888 "sintase de ácido graxo poli-insaturado subunidade C" (Identidade = 63%; positivos = 76%); Shewanella pealeana ATCC 700345 "Beta-hidroxi-desidratase (proteína transportadora de acila) FabA/FabZ" (Identidade = 35%; positivos = 53%); Shewanella piezotolerans WP3 "beta-cetoacil sintase multidomínio"(Identidade = 36%; positivos = 52%); Shewanella benthica KT99 "sintase de ácido graxo poli-insaturado ômega-3 PfaC" (Identidade = 35%; positivos = 51%).
EXEMPLO 5 GENES DA AGPI SINTASE FORAM IDENTIFICADOS A PARTIR DO THRAUSTOCHYTRIUM SP. ATCC PTA-10212
[00296] A partir de um criofrasco a -80 °C, 1 mL de células foram descongeladas em temperatura ambiente e adicionadas a 50 mL de meio líquido HSFM (abaixo) em um balão de 250 mL sem reentrâncias. O balão foi incubado a 23 °C por 3 dias. As células foram coletadas e utilizadas para a construção da biblioteca de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) (Lucigen Corporation, Middleton, Wf EUA). TABELA6: MEIO HSFM
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As condições de cultivo típicas incluem as seguintes:
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[00297] As bibliotecas BAC recombinantes, consistindo de grandes fragmentos (média de aproximadamente 120 kB) foram tratadas de acordo com as instruções do fabricante no vetor BAC - pSMART® (Lucigen Corporation). As bibliotecas BAC foram selecionadas por procedimentos padrões de hibridização de colônias usando sondas marcadas radioativamente com P32 (Sambrook J. e Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual,3a Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). As sondas continham DNA homólogo às sequências da AGPI sintase publicadas a partir de outros organismos, conforme descrito no exemplo 4. Estas sondas foram geradas por uma digestão com enzimas de restrição de DNA dos fragmentos clonados a partir dos respectivos clones do pJET1.2/blunt descrito acima e marcadas utilizando métodos convencionais. Em todos os casos, uma forte hibridação das sondas individuais para certos BACs indicou os clones que continham DNA homólogos aos genes AGPI sintase.
[00298] O clone BAC pLR130 (também conhecido como LuMaBAC 2M23) demonstrou forte hibridização da sonda tanto para a região KS como para a região ER, indicando que continha os genes PFA1 e PFA2, e foi selecionado para sequenciamento de DNA dos genes PFA1 e PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC: PTA- 10212. O BAC foi sequenciado por procedimentos padrões (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). O BAC clone pLR130, contendo os genes PFA1 e PFA2 foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste na Coleção Norte-americana de Culturas - American Type Culture Collection (ATCC), Depósitos de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 1 de dezembro de 2009, e foi atribuído a ele o número de acesso ATCC: PTA-10511.
[00299] Em publicações anteriores de sistemas AGPI sintase de traustocitrídios, os genes PFA1 e PFA2 da AGPI sintase foram agrupados e dispostos de modo a serem divergentemente transcritos. Este é também o caso para o PFA1 e PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. O início conceitual do PFA2 foi encontrado por estar a 693 nucleotídeos do início de PFA1 e é divergentemente transcrito.
[00300] O BAC clone pDS127 (também conhecido como LuMaBAC 9K17) demonstrou forte hibridização da sonda tanto para a região DH como para a região ER do PFA3 e foi selecionado para o sequenciamento de DNA do gene PFA3. O BAC clone pLR127, contendo o gene PFA3 foi depositado com base nos termos do Tratado de Budapeste na Coleção Norte-americana de Culturas - American Type Culture Collection (ATCC), Depósitos de Patente, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 1 de dezembro de 2009, e foi atribuído a ele o número de acesso ATCC: PTA-10510. Os primers de sequenciamento foram projetados usando métodos padrões para a sequência de DNA da região DH e região ER determinada no Exemplo 4. Para determinar a sequência de DNA do gene PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foram realizadas sucessivas rodadas de sequenciamento de DNA envolvendo o subsequente desenho de primers de sequenciamento por métodos padrões, a fim de realizar a estratégia “walk” no clone BAC. Cada par de bases de nucleotídeos do gene PFA3 foi coberto por pelo menos duas reações de sequenciamento de DNA separadas de alta qualidade com uma pontuação Phred agregada mínima de pelo menos 40 (nível de confiança de 99,99%).
[00301] A Tabela 7 exibe as identidades para as sequências de polinucleotídeos do PFA1 (SEQ ID NO: 68), PFA2 (SEQ ID NO: 70), e PFA3 (SEQ ID NO: 72) do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212, em comparação com as sequências publicadas anteriormente e as sequências do Schizochytrium sp. PTA- 9695. As identidades foram determinadas pela matriz de pontuação “swgapdnamt” dentro do programa “AlignX” do programa “VectorNTI”, que é um padrão para o alinhamento de DNA. TABELA 7: PORCENTAGEM DE IDENTIDADE PARA AS SEQUÊNCIAS DE POLINUCLEOTÍDEOS PFA1, PFA2 E PFA3
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[00302] A Tabela 8 exibe as identidades para as sequências de aminoácidos PFA1p (SEQ ID NO: 69), PFA2p (SEQ ID NO: 71), e PFA3p (SEQ ID NO: 73) do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 em comparação com as sequências de aminoácidos de AGPI sintase publicadas anteriormente e as sequências do Schizochytrium sp. PTA- 9695. As identidades foram determinadas pelo uso de matriz de pontuação “blosum62mt2” dentro do programa “AlignX” do programa “VectorNTI”, que é um padrão para o alinhamento de proteína. TABELA 8: PORCENTAGEM DE IDENTIDADE PARA AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PFAIP, PFA2P E PFA3P
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EXEMPLO 6
[00303] A análise de domínio foi realizada para anotar as coordenadas de sequência para os domínios AGPI sintase e sítios ativos de PFA1, PFA2 e PFA3, respectivamente do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. Os domínios foram identificados com base na homologia dos domínios AGPI sintase, ácido graxo sintase, e policetídeo sintase conhecidos.
[00304] A Tabela 9 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. TABELA 9: ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA1 DE THRAUSTOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 10212
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[00305] O primeiro domínio no PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio KS.
[00306] A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KS PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 74, correspondendo às posições 13-1362 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KS PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 75, correspondendo às posições 5-454 da SEQ ID NO: 69. O domínio KS contém um motivo sítio ativo: DXAC* (SEQ ID NO: 43), com um sítio de ligação a acila* correspondente a C204 da SEQ ID NO: 69. Além disso, um motivo característico está presente no final do domínio KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), correspondendo às posições 451-454 da SEQ ID NO: 69 e posições 447-450 da SEQ ID NO: 75.
[00307] O segundo domínio no PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio MAT. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio MAT PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 76, correspondendo às posições 1783-2703 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo o domínio MAT PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 77, correspondendo às posições 595-901 da SEQ ID NO: 69. O domínio MAT contém um motivo de sítio ativo: GHS*XG (SEQ ID NO: 46), com um sítio de ligação a acila* correspondendo a S695 da SEQ ID NO: 69.
[00308] O terceiro até o décimo segundo domínio de PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 são dez domínios ACP em tandem, também referidos no presente como ACP1, ACP2, ACP3, ACP4, ACP5, ACP6, ACP7, ACP8, ACP9 e ACP10. A sequência de nucleotídeos contendo o primeiro domínio ACP, ACP1, é representada no presente como a SEQ ID NO: 80 e está contida dentro da sequência de nucleotídeos abrangendo desde a posição 3280 até cerca da posição 3534 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP1, representada no presente como a SEQ ID NO: 81 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1094 até aproximadamente a posição 1178 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP2, representada no presente como a SEQ ID NO: 82 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 3607 até aproximadamente a posição 3861 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP2, representada no presente como a SEQ ID NO: 83 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1203 até aproximadamente a posição 1287 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP3, representada no presente como a SEQ ID NO: 84 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 3934 até aproximadamente a posição 4185 da SEQ ID NO: 68. 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP3, representada no presente como a SEQ ID NO: 85 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1312 até aproximadamente a posição 1396 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP4, representada no presente como a SEQ ID NO: 86 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4261 até aproximadamente a posição 4515 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP4, representada no presente como a SEQ ID NO: 87 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1421 até aproximadamente a posição 1505 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP5, representada no presente como a SEQ ID NO: 88 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4589 até aproximadamente a posição 4842 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP5, representada no presente como a SEQ ID NO: 89 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1530 até aproximadamente a posição 1614 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP6, representada no presente como a SEQ ID NO: 90 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 4915 até aproximadamente a posição 5169 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP6, representada no presente como a SEQ ID NO: 91 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1639 até aproximadamente a posição 1723 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP7, representada no presente como a SEQ ID NO: 92 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 5242 até aproximadamente a posição 5496 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP7, representada no presente como a SEQ ID NO: 93 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1748 até aproximadamente a posição 1832 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP8, representada no presente como a SEQ ID NO: 94 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 5569 até aproximadamente a posição 5832 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP8, representada no presente como a SEQ ID NO: 95 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1857 até aproximadamente a posição 1941 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP9, representada no presente como a SEQ ID NO: 96 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 5896 até aproximadamente a posição 6150 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP9, representada no presente como a SEQ ID NO: 97 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 1966 até aproximadamente a posição 2050 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos contendo ACP10, representada no presente como a SEQ ID NO: 98 está contida dentro da sequência de nucleotídeos que abrange desde a posição 6199 até aproximadamente a posição 6453 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo ACP10, representada no presente como a SEQ ID NO: 99 está contida dentro da sequência de aminoácidos que abrange desde a posição 2067 até aproximadamente a posição 2151 da SEQ ID NO: 69. Todos os dez domínios ACP juntos abrangem uma região do PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 desde a posição 3208 até aproximadamente a posição 6510 da SEQ ID NO: 68, correspondendo a posições de aminoácidos 1070 a aproximadamente 2170 da SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos para a região ACP inteira que contém todos os dez domínios é representada no presente como SEQ ID NO: 78, enquanto a sequência de aminoácidos para a região ACP inteira contendo todos os seis domínios é representada no presente como a SEQ ID NO: 79. O intervalo de repetição para os dez domínios ACP dentro da SEQ ID NO: 78 foi encontrado por ser de aproximadamente a cada 327 nucleotídeos (o número real de aminoácidos adjacentes mensurado entre serinas do sítio ativo varia de 101 a 109 aminoácidos). Cada um dos dez domínios ACP contém um motivo de ligação a panteteína LGIDS* (SEQ ID NO: 47) onde S* é a serina (S) do sítio de ligação à panteteína. A serina (S) do sítio de ligação a panteteína está localizada próxima do centro de cada sequência do domínio ACP. Os locais dos resíduos de serina do sítio ativo (ou seja, o sítio de ligação à panteteína) para cada um dos seis domínios ACPD, com relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 69 são: ACP1 = S1135, ACP2 = S1244, ACP3 = S1353, ACP4 = S1462, A CPS = S1571, ACP6 = S1680, APC7 = S1789, ACP7 = S1789, ACP8 = S1898, ACP9 = S=2007, e ACP 10 = S2108.
[00309] O décimo terceiro domínio no PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é um domínio KR. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KR PFA1é representada no presente como SEQ ID NO: 100, correspondendo às posições 6808-8958 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KR PFA1é representada no presente como SEQ ID NO: 101, correspondendo às posições 2270-2986 da SEQ ID NO: 69. Dentro do domínio KR está uma região central (contida dentro da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 116, e sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 117) com homologia a uma aldeído desidrogenase de cadeia curta (KR é um membro dessa família). Essa região central se estende desde a posição 5998 até a aproximadamente a posição 6900 da SEQ ID NO: 68, o que corresponde a posições de aminoácidos de 2000 a 2300 da SEQ ID NO: 69.
[00310] O décimo quarto domínio no PFA1 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é um domínio DH. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH PFA1é representada no presente como SEQ ID NO: 118, correspondendo às posições 7027-7065 da SEQ ID NO: 68. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH PFA1é representada no presente como SEQ ID NO: 119, correspondendo às posições 2343-2355 da SEQ ID NO: 69. O domínio DH contém um motivo de sítio ativo conservado (vide, Donadio, S. e Katz, L., Gene 111(1):51-60 (1992)): LxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO: 50).
[00311] A Tabela 10 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. TABELA 10: ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA2 DE THRAUSTOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 10212
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[00312] O primeiro domínio no PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio KS.
[00313] A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio KS PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 102, correspondendo |às posições 10-1320 da SEQ ID NO: 70. A sequência de aminoácidos contendo o domínio KS PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 103, correspondendo às posições 4-440 da SEQ ID NO: 71. O domínio KS contém um motivo sítio ativo: DXAC* (SEQ ID NO: 43), com um sítio de ligação a acila* correspondente a C191 da SEQ ID NO: 71. Além disso, um motivo característico está presente no final do domínio KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), correspondendo às posições 423-426 da SEQ ID NO: 71 e posições 1267-1278 da SEQ ID NO: 70.
[00314] O segundo domínio no PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio CLF. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio CLF PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 104, correspondendo |às posições 1378- 2700 da SEQ ID NO: 70. A sequência de aminoácidos contendo o domínio CLF PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 105, correspondendo às posições 460-900 da SEQ ID NO: 71.
[00315] O terceiro domínio no PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio AT. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio AT PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 106, correspondendo |às posições 28484200 da SEQ ID NO: 70. A sequência de aminoácidos contendo o domínio AT PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 107, correspondendo às posições 950-1400 da SEQ ID NO: 71. O domínio AT contém um motivo de sítio ativo GXS*xG (SEQ ID NO: 50) que é característico de proteínas aciltransferse (AT), com um resíduo serina do sítio ativo correspondendo a posição S1121 da SEQ ID NO: 71.
[00316] O quarto domínio no PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio ER. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio ER PFA2 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 108, correspondendo |às posições 44985700 da SEQ ID NO: 70. A sequência de aminoácidos contendo o domínio ER PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada aqui como SEQ ID NO: 109, correspondendo às posições 1500-1900 da SEQ ID NO: 71.
[00317] A Tabela 11 exibe os domínios e sítios ativos associados com o PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. TABELA 11: ANÁLISE DO DOMÍNIO PFA3 DE THRAUSTOCHYTRIUM SP. ATCC PTA- 10212
Figure img0018
Figure img0019
[00318] Os primeiro e segundo domínios de PFA3 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 são domínios DH, referidos no presente como DH1 e DH2, respectivamente. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH1 PFA3 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 110, correspondendo às posições 1-1350 da SEQ ID NO: 72. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH1 PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 111, correspondendo às posições 1-450 da SEQ ID NO: 73. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio DH2 PFA3 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 112, correspondendo às posições 1501-2700 da SEQ ID NO: 72. A sequência de aminoácidos contendo o domínio DH2 PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 113, correspondendo às posições 501-900 da SEQ ID NO: 73. Os domínios DH contêm um motivo de sítio ativo: FxxH*F (SEQ ID NO: 53). A sequência de nucleotídeos contendo o motivo de sítio ativo em DH1 corresponde às posições 934-936 da SEQ ID NO: 72, enquanto a sequência de nucleotídeos contendo o motivo de sítio ativo no DH2 corresponde às posições 2401-2403 da SEQ ID NO: 72. O sítio ativo H* no motivo FxxH*F é baseado nos dados de Leesong et al., Structure 4:253-64 (1996) e Kimber et al. J Biol Chem. 279:52593-602 (2004), com o sítio ativo H* em DH1 correspondendo a H312 da SEQ ID NO: 73 e o sítio ativo H* em DH2 correspondendo ao H801 da SEQ ID NO: 73.
[00319] O terceiro domínio do PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 é um domínio ER. A sequência de nucleotídeos contendo a sequência que codifica o domínio ER PFA3 do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 114, correspondendo às posições 2848-4200 da SEQ ID NO: 72. A sequência de aminoácidos contendo o domínio ER PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é representada no presente como SEQ ID NO: 115, correspondendo às posições 950-1400 da SEQ ID NO: 73.
EXEMPLO 7
[00320] A inativação de genes AGPI sintase nativos em Schizochytrium sp. ATCC 20888, para gerar auxotróficos de AGPI, e substituição de tais genes inativados com genes homólogos exogenamente introduzidos para restaurar a síntese de ácidos graxos poli-insaturados foi demonstrado e descrito anteriormente. Vide, por exemplo, Patente US 7.217.856 incorporada ao presente pela referência em sua totalidade. Os três genes da AGPI sintase de Schizochytrium sp. ATCC 20888 eram anteriormente denominados de orfA, orfB e orfC, correspondendo a nomenclatura utilizada no presente como PFA1, PFA2 e PFA3, respectivamente.
[00321] O gene orfA nativo no Schizochytrium sp. ATCC 20888 foi substituído por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ cercado por sequências da região flanqueadora de orfA. Foi gerada uma cepa mutante com ausência de um gene orfA funcional. A cepa mutante era auxotrófica e necessitava de suplementação com AGPI para o crescimento.
[00322] O PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 1) foi clonado em um vetor de expressão pREZ37 para gerar o pREZ345. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888. O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA funcional foi transformado por meio da eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide abaixo) com pREZ345 contendo PFA1. Com base nas regiões flanqueadoras do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e regiões flanqueadoras do gene PFA1 no pREZ345, ocorreu uma recombinação duplo-crossover de forma que o PFA1 foi inserido dentro do locus orfA nativo. A recombinação com o Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 PFA1 (SEQ ID NO: 1) restaurou a produção de AGPI no Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA. Em resumo, as células foram cultivadas em meio líquido M2B (vide parágrafo seguinte) a 30 °C sob agitação de 200 rpm durante 3 dias. As células foram coletadas e os ácidos graxos foram convertidos em metil-ésteres usando técnicas padrões. Os perfis de ácidos graxos foram determinados por cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama (GC- FID) como ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME). A cepa nativa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 contendo um gene orfA funcional produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 2,3:1. A cepa recombinante Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 contendo PFA1 (SEQ ID NO: 1) no lugar do gene orfA inativado também produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 2,4:1. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 2,7% de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), o teor de DPA n-3 foi de 0,7%, o teor de DPA n-6 foi de 8,8%, e o teor de DHA foi de 21,2%.
[00323] Meio M2B - 10 g/L de glicose, 0,8 g/L (NH4)2SO4; 5 g/L de Na2SO4, 2 g/L de MgSO4^7H2O; 0,5 g/L KH2PO4; 0,5 g/L KCl, 0,1 g/L CaCl2^2H2O; MES 0,1M (pH 6,0); 0,1% de metais PB26 e 0,1% de vitaminas PB26 (v/v). Vitaminas PB26 consistiu de 50 mg/mL de vitamina B12, 100 μg/mL de tiamina e 100 μg/mL de Ca-pantotenato. Metais PB26 foram ajustados para pH 4,5 e consistiu de 3 g/L FeSO4^7H2O, 1 g/L MnCl2^4H2O, 800 mg/mL de ZnSO4^7H2O, 20 mg/mL CoCl2^6H2O, 10 mg/mL Na2MoO4^2H2O, 600 mg/mL CuSO4^5H2O, e 800 mg/mL NiSO4^6H2O. As soluções PB26 de estoque foram esterilizadas por filtração, separadamente e adicionadas ao caldo após a autoclavagem. Glicose, KH2PO4 e CaCl2^2H2O foram autoclavados separadamente do restante do caldo antes da mistura dos ingredientes para evitar a precipitação de sais e caramelização dos carboidratos. Todos os ingredientes do meio foram adquiridos da Sigma Chemical (St. Louis, MO).
[00324] Eletroporação com pré-tratamento enzimático - As células foram cultivadas em 50 mL de meio M50-20 (vide Publicação US 2008/0022422) em agitador a 200 rpm durante 2 dias a 30 °C. As células foram diluídas a 1:100 em meio M2B e cultivadas durante a noite (16-24 h), na tentativa de atingir o meio da fase logarítmica de crescimento (OD600 de 1,5-2,5). As células foram centrifugadas em tubo cônico de 50 mL por 5 min a cerca de 3000 x g. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em 1 M manitol, pH 5,5, em um volume adequado para atingir uma concentração final de 2 unidades OD600. 5 mL de células foram aliquotadas em um frasco de agitação de 25 mL e alterado com 10 mM de CaCl (estoque de 1,0 M, esterilizado por filtração) e 0,25 mg/mL de Protease XIV (estoque de 10 mg/mL, esterilizado por filtração; Sigma -Aldrich, St. Louis, MO). Os frascos foram incubados em um agitador a 30 °C a cerca de 100 rpm durante 4 h. As células foram monitoradas sob o microscópio para determinar o grau de protoplastização, com uma única célula desejada. As células foram centrifugadas por 5 min a cerca de 2.500 x g em tubos de fundo redondo (tubos Falcon™ de 14 mL, BD Biosciences, San Jose, CA). O sobrenadante foi removido e as células foram gentilmente ressuspensas com 5 mL de glicerol 10% em gelo. As células foram recentrifugadas por 5 min a cerca de 2.500 xg em tubos de fundo redondo. O sobrenadante foi removido e as células foram cuidadosamente ressuspensas com 500 μL de glicerol 10% em gelo usando ponteiras de pipeta de orifício largo. 90 μL de células foram aliquotadas em uma eletro cubeta previamente resfriada (Gene Pulser ® com fenda de 0,1 cm ou fenda de 0,2 cm, Bio- Rad, Hercules, CA). Um μg a 5 μg de DNA (em um volume menor ou igual a 10 μL) foi adicionado à cubeta, misturado levemente com uma ponteira de pipeta e colocado no gelo por 5 min. As células foram eletroporadas a 200 ohms (resistência), 25 μF (capacitância), e também 250V (para fenda de 0,1 cm) ou 500V (para fenda de 0,2 cm). 0,5 ml de meio M50-20 foi adicionado imediatamente à cubeta. As células foram então transferidas para 4,5 mL de meio M50-20 em um frasco de agitador de 25 mL e incubadas por 2-3 h a 30 °C a cerca de 100 rpm em um agitador. As células foram centrifugadas por 5 min a cerca de 2.500 xg em tubos de fundo redondo. O sobrenadante foi removido e o sedimento de células foi resuspenso em 0,5 mL de meio M50-20. As células foram semeadas em um número adequado (2 a 5) de placas M2B com a seleção apropriada e incubadas a 30 °C.
[00325] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA funcional é também transformado com pREZ345 contendo PFA1, de tal forma que o PFA1é integrado aleatoriamente no mutante e restaura a produção de AGPI.
EXEMPLO8
[00326] O PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 68) foi resintetizado (DNA2.0) e códon-otimizado para a expressão em Schizochytrium (SEQ ID NO: 120) e foi clonado em um vetor de expressão para gerar o pLR95. A códon-otimização ocorreu utilizando a tabela de uso de códon do Schizochytrium na FIG. 22. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888.
[00327] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA funcional do Exemplo 7 foi transformado por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide exemplo 7) com o pLR95 contendo PFA1 códon otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 120). Com base nas regiões flanqueadoras do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e regiões flanqueadoras do gene PFA1 no pLR95, ocorreu uma recombinação duplo-crossover de forma que o PFA1 códon- otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 foi inserido dentro do locus orfA nativo. A recombinação com o PFA1 códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 120) restaurou a produção de AGPI no Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. A cepa nativa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 contendo um gene orfA funcional produziu DHA e EPA em uma proporção de 25:1. A cepa recombinante contendo o PFA1 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 120) no lugar do gene orfA inativado produziu DHA e EPA em uma proporção de 5,4:1, demonstrando que o perfil de ácidos graxos poli-insaturados do Schizochytrium pode ser alterado pelas moléculas de ácido nucleico descritas na presente invenção. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 4,4% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 2,3%, o teor de DPA n-6 foi de 4,9%, e o teor de DHA foi de 24,0%.
[00328] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfA funcional é também transformado com pLR95 contendo PFA1, de tal forma que o PFA1é integrado de maneira aleatória no mutante e restaura a produção de AGPI.
EXEMPLO 9
[00329] O gene orfB nativo no Schizochytrium sp. ATCC 20888 foi substituído por recombinação homóloga, seguido pela transformação por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide o exemplo 7) com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ flanqueado por sequências da região flanqueadora de orfB. Foi gerada uma cepa mutante com ausência de um gene orfB funcional. A cepa mutante era auxotrófica e necessitava de suplementação com AGPI para o crescimento.
[00330] O PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 3) foi clonado em um vetor de expressão pDS04 para gerar o pREZ331. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfB do Schizochytrium sp. ATCC 20888.
[00331] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante carecendo do gene orfB funcional foi transformado com o pREZ331 contendo PFA2. Baseado na integração aleatória no mutante, a produção de AGPI foi restaurada pelo PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 3). As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. A cepa nativa Schizochytrium sp. ATCC 20888 contendo um gene orfB funcional produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 2,3:1. A cepa recombinante Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 contendo PFA2 (SEQ ID NO: 3) como um substituto do gene orfB inativado produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 3,5:1. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 0,8% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,1%, o teor de DPA n-6 foi de 7,1%, e o teor de DHA foi de 25,1%.
[00332] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfB funcional é também transformado com pREZ331 contendo PFA2, de tal forma que o PFA2é inserido dentro do locus nativo do orfB e restaura a produção de AGPI.
EXEMPLO 10
[00333] O PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 70) foi resintetizado (DNA2.0) e códon-otimizado para a expressão no Schizochytrium (SEQ ID NO: 121) e foi clonado em um vetor de expressão para gerar o pLR85. A códon-otimização ocorreu utilizando a tabela de uso de códon do Schizochytrium na FIG. 22. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfB do Schizochytrium sp. ATCC 20888.
[00334] A substituição de genes orf também foi estudada em uma cepa filha de Schizochytrium sp. ATCC 20888 possuindo produtividade de DHA melhorada. O gene orfB nativo na cepa filha foi substituído por recombinação homóloga, seguido pela transformação por meio de eletroporação com pré- tratamento enzimático (vide o exemplo 7) com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ cercado por sequências da região flanqueadora de orfB. Foi gerada uma cepa mutante com ausência de um gene orfB funcional. A cepa mutante era auxotrófica e necessitava de suplementação com AGPI para o crescimento. A cepa mutante foi transformada por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide Exemplo 8) com o pLR85 contendo PFA2 códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121). Com base nas regiões flanqueadoras do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e regiões flanqueadoras do gene PFA2 no pLR85, ocorreu uma recombinação duplo-crossover de forma que o PFA2 códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121) foi inserido dentro do locus orfB nativo da cepa mutante. A recombinação com o PFA2 códon- otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 121) restaurou a produção de AGPI na cepa filha mutante que carecia do gene orfB. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,0% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,3%, o teor de DPA n-6 foi de 7,0%, e o teor de DHA foi de 31,0%.
[00335] Em um experimento a ser realizado, o Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante carecendo do gene orfB funcional do Exemplo 9 é transformado por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide exemplo 8) com o pLR85 contendo PFA2códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121). Com base nas regiões flanqueadoras homólogas do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e regiões flanqueadoras do gene PFA2 no pLR85, ocorre uma recombinação duplo- crossover de forma que o PFA2códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121) é inserido dentro do locus orfB nativo.
[00336] A recombinação com o PFA2códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 121) restaurou a produção de AGPI no Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfB.
[00337] Os mutantes Schizochytrium sp. ATCC 20888 e a cepa filha que careciam do gene orfB funcional são também transformados com pLR85 contendo PFA2, de modo que o PFA2é integrado de maneira aleatória nos mutantes e restaura a produção de AGPI em cada mutante.
EXEMPLO 11
[00338] Um plasmídeo contendo um cassete marcador de resistência a paromomicina funcional em Schizochytrium foi desenvolvido para o Schizochytrium sp. ATCC 20888 pela substituição da região de codificação do gene de resistência a bleomicina/Zeocin™ (ble) no pMON50000/pTUBZEO11-2 (Patente US 7.001.772 B2) com o gene da neomicina-fosfotransferase II (npt), originalmente do transposon bacteriano Tn5. No pMON50000, o gene de resistência ble é induzido pelo promotor da α-tubulina do Schizochytrium e é seguido pelo terminador de transcrição SV40. A região ble no pMON50000 abrange um sítio de restrição Ncol no códon de iniciação ATG e um sítio de restrição Pmll imediatamente após ao sinal de parada TGA. Foi utilizada a PCR para amplificar a região de codificação npt presente no pCaMVnpt (Shimizu et al, Plant J. 26(4): 375 (2001)) de modo que o produto incluído no sítio de restrição BspHI (sublinhado abaixo no primer CAX055) no início ATG (em negrito) e um sítio de restrição Pmll (sublinhado abaixo no primer CAX056) imediatamente após o sinal de parada (negrito - complemento reverso): CAX055 (direto): GTCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC (SEQ ID NO: 66) CAX056 (reverso): CCACGTGTCAGAAGAACTCGTCAAGAA (SEQ ID NO: 67).
[00339] A PCR foi realizada com o kit TaqMaster polimerase (5Prime), os produtos foram clonados em pCR4-TOPO (Invitrogen), e os plasmídeos resultantes foram transformados em E. coli TOP 10 (Invitrogen). A análise da sequência de DNA usando primers de vetores identificou diversos clones contendo a estrutura de 805bp desejada (ou seja, as sequências que correspondem com aquelas do molde de origem mais os sítios de restrição projetados). A região de codificação npt modificada foi isolada pela digestão com as enzimas de restrição BspHI mais Pmll, e o fragmento de DNA purificado foi ligado com um fragmento do vetor pMON50000 gerado pela digestão com as enzimas Ncol mais Pmll. Enzimas de restrição e BspHl e Ncol deixaram extremidades sobrepostas compatíveis, e a Pmll produziu extremidades cegas. O plasmídeo resultante, pTS-NPT, contém o gene de resistência a neomicina npt/paromomicina no contexto idêntico ao do gene original ble no pMON50000.
[00340] Bombardeio de partículas no Schizochytrium (Patente US 7.001.772 B2) foi utilizado para avaliar a função do novo cassete de resistência à paromomicina no pTS-NPT. A seleção para resistência à paromomicina (PAR) foi realizada em placas de ágar contendo 50 μg/mL de sulfato de paromomicina (Sigma). Os Schizochytrium transformantes resistentes à paromomicina foram encontrados em frequências semelhantes aos de resistência à Zeocin™ do pMON50000. O cassete “promotor α- tubulina/npt/terminador SV40” pode ser libertado do pTS- NPT com diferentes enzimas de restrição para posterior utilização em outros esforços de desenvolvimento.
EXEMPLO 12
[00341] O gene orfC nativo no Schizochytrium sp. ATCC 20888 foi substituído por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência à paromomicina flanqueado pelas sequências da região flanqueadora do orfC. Foi gerada uma cepa mutante com ausência de um gene orfC funcional. A cepa mutante era auxotrófica e necessitava de suplementação com AGPI para o crescimento.
[00342] O PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) foi clonado em um vetor de expressão pREZ22 para gerar o pREZ324. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfC do Schizochytrium sp. ATCC 20888.
[00343] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante carecendo do gene orfC funcional foi transformado com o pREZ324 contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. Com base nas regiões flanqueadoras do marcador de resistência à paromomicina no mutante e regiões flanqueadoras do gene PFA3 no Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695, ocorreu uma recombinação duplo-crossover de modo que o PFA3 foi inserido dentro do locus orfC nativo. A recombinação com o PFA3 Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) restaurou a produção de AGPI no Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfC. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. A cepa nativa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 contendo um gene orfC funcional produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 2,3:1. A cepa recombinante contendo o PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 (SEQ ID NO: 5) no lugar do gene orfC inativado produziu DHA e DPA n-6 em uma proporção de 14:9, demonstrando adicionalmente que o perfil de AGPI do Schizochytrium pode ser alterado pelas moléculas de ácido nucleico descritas na presente invenção. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,2% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,2%, o teor de DPA n-6 foi de 2,9%, e o teor de DHA foi de 43,4%.
[00344] O Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carecia do gene orfC funcional também foi transformado com pREZ324 contendo PFA3, de tal forma que o PFA3 foi integrado aleatoriamente no mutante e restaurou a produção de AGPI. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,2% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,2%, o teor de DPA n-6 foi de 2,5%, e o teor de DHA foi de 39,1%.
[00345] O gene orfC nativo na cepa filha discutida no Exemplo 10 foi substituída por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência à paromomicina flanqueado pelas sequências da região flanqueadora do orfC. Foi gerada uma cepa mutante carecendo de um gene orfC funcional. A cepa mutante era auxotrófica e necessitava de suplementação com AGPI para o crescimento. O mutante com ausência de orfC funcional foi transformado com pREZ324. Uma recombinação duplo-crossover ocorreu de tal forma que o PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 foi inserido no locus orfC nativo da cepa mutante. A recombinação homóloga com PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) restaurou a produção de AGPI na cepa filha mutante que carecia do gene orfC. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,2% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,3%, o teor de DPA n-6 foi de 2,8%, e o teor de DHA foi de 43,1%.
[00346] A cepa filha mutante que carecia do gene orfB funcional também é transformada com pREZ324 contendo PFA3, de tal forma que o PFA3é integrado de maneira aleatória no mutante e restaura a produção de AGPI.
EXEMPLO 13
[00347] O PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 72) foi resintetizado (DNA2.0) e códon-otimizado para a expressão em Schizochytrium (SEQ ID NO: 122) e foi clonado em um vetor de expressão pREZ22 para gerar o pREZ337. A códon-otimização ocorreu utilizando a tabela de uso de códon do Schizochytrium na FIG. 22. O vetor de expressão continha aproximadamente 2 kb de DNA da região flanqueadora do locus nativo do gene orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888.
[00348] A cepa filha mutante carecendo do gene orfC funcional do Exemplo 12 foi transformada por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide Exemplo 8) com o pREZ337 contendo o PFA3códon- otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122). Com base nas regiões homólogas flanqueadoras do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e as regiões flanqueadoras do gene PFA3 no pREZ337, ocorreu uma recombinação duplo-crossover de forma que o PFA3códon- otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122) foi inserido dentro do locus orfC nativo. A recombinação com o PFA3códon- otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 122) restaurou a produção de AGPI na cepa filha mutante que carecia do gene orfC. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,3% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,4%, o teor de DPA n-6 foi de 2,7%, e o teor de DHA foi de 50,2%.
[00349] Em um experimento a ser realizado, o Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante carecendo do gene orfC funcional do Exemplo 12 é transformado por meio de eletroporação com pré-tratamento enzimático (vide exemplo 8) com o pREZ337 contendo o PFA3códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122). Com base nas regiões homólogas flanqueadoras do marcador de resistência Zeocin™ no mutante e as regiões flanqueadoras do gene PFA3 no pREZ337, ocorre uma recombinação duplo-crossover de modo que o PFA3códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122) é inserido dentro do locus orfC nativo. A recombinação com o PFA3códon-otimizado do Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 (SEQ ID NO: 122) restaura a produção de AGPI no Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutante que carece do gene orfC.
[00350] Os mutantes Schizochytrium sp. ATCC 20888 e a cepa filha que carecem do gene orfC funcional são também transformados com o pREZ337 contendo PFA3, de modo que o PFA3é integrado de maneira aleatória nos mutantes e restaura a produção de AGPI em cada mutante.
EXEMPLO 14
[00351] Dois ou todos os três genes orfA, orfB e orfC no Schizochytrium sp. ATCC 20888 são substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com vetores contendo ambos marcadores de resistência, Zeocin™ e paromomicina, cercados pelas sequências das regiões flanqueadoras de orf apropriadas. As cepas mutantes são geradas com ausências de dois ou todos os três genes funcionais, orfA, orfB e orfC. As cepas mutantes são auxotróficas e necessitam de suplementação com AGPI para o crescimento.
[00352] Os Schizochytrium sp. ATCC 20888 mutantes carecendo dos genes orf funcionais são transformados com um ou mais vetores de expressão contendo genes PFA correspondentes (uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 120, 121 ou 122). Com base nas regiões flanqueadoras homólogas do marcador Zeocin™ ou marcador de resistência à paromomicina nos mutantes e as regiões flanqueadoras dos genes PFA nos respectivos vetores de expressão, a recombinação duplo-crossover pode ocorrer de tal forma que os genes PFA são inseridos nos locus orf nativos. A integração aleatória destes vetores de expressão também pode ocorrer com a seleção de transformantes baseada unicamente na restauração da produção de AGPI. A recombinação homóloga com genes PFA restaura a produção de AGPI nos mutantes, de modo que os perfis de AGPI nativos são restaurados ou alterados com base na combinação dos genes PFA inseridos nos mutantes.
[00353] Em um experimento realizado, a cepa Schizochytrium sp. ATCC 20888 do Exemplo 12 carecendo do gene orfC funcional e contendo o gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) aleatoriamente integrado foi utilizada para a substituição dos genes orfA e orfB. Os genes nativos orfA e orfB na cepa foram substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ flanqueado por sequências das regiões flanqueadoras de orfA e orfB. A cepa foi gerada carecendo dos genes orfA, orfB e orfC funcionais, e contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 aleatoriamente integrado. A cepa foi transformada com pREZ345 contendo PFA1códon- otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 1) e pREZ331 contendo PFA2códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 3) de tal forma que ocorreu a integração aleatória de PFA1 e PFA2. A cepa recombinante resultante carecia de orfA, orfB e orfC funcionais e continha integrações aleatórias de PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 6,6% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,8%, o teor de DPA n-6 foi de 1,6%, e o teor de DHA foi de 20,9%.
[00354] Em outro experimento realizado, a cepa filha do Exemplo 12 carecendo do gene orfC funcional e contendo o gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) inserido no locus orfC nativo foi utilizada para a substituição dos genes orfA e orfB. Os genes nativos orfA e orfB na cepa foram substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência à paromomicina cercado pelas sequências das regiões flanqueadoras de orfA e orfB. Foi gerada uma cepa carecendo dos genes orfA, orfB e orfC funcionais, e contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 inserido no locus do orfC nativo. A cepa foi transformada com pREZ345 contendo PFA1códon- otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 1) e pREZ331 contendo PFA2códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 3). Uma recombinação duplo-crossover ocorreu de tal forma que o PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 foi inserido no locus do orfA nativo e o PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 foi inserido no locus do orfB nativo da cepa. A cepa recombinante resultante carecia dos genes orfA, orfB e orfC funcionais e continha os genes PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 inseridos nos respectivos locus de orfA, orfB e orfC. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 7,3% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,4%, o teor de DPA n-6 foi de 1,5%, e o teor de DHA foi de 23,9%.
[00355] Em outro experimento realizado, a cepa filha do Exemplo 12 carecendo do gene orfC funcional e contendo o gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) aleatoriamente integrado foi utilizada para a substituição dos genes orfA e orfB. Os genes nativos orfA e orfB na cepa foram substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ flanqueado por sequências das regiões flanqueadoras de orfA e orfB. A cepa foi gerada carecendo dos genes orfA, orfB e orfC funcionais, e contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 aleatoriamente integrado. A cepa foi transformada com pREZ345 contendo PFA1códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 1) e pREZ331 contendo PFA2códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 3) de tal forma que ocorreu a integração aleatória de PFA1 e PFA2. A cepa recombinante resultante carecia de orfA, orfB e orfC funcionais e continha integrações aleatórias de PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 6,2% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 1,3%, o teor de DPA n-6 foi de 0,9%, e o teor de DHA foi de 16,6%.
[00356] Em outro experimento realizado, a cepa filha do Exemplo 13 carecendo do gene orfC funcional e contendo o gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122) inserido no locus orfC nativo foi utilizada para a substituição dos genes orfA e orfB. Os genes nativos orfA e orfB na cepa foram substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência à paromomicina cercado pelas sequências das regiões flanqueadoras de orfA e orfB. Foi gerada uma cepa carecendo dos genes orfA, orfB e orfC funcionais, e contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 inserido no locus do orfC nativo. A cepa foi transformada com pLR95 contendo PFA1códon- otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 120) e pLR85 contendo PFA2códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121). Ocorreu uma recombinação duplo-crossover de tal forma que o PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 foi inserido no locus do orfA nativo e o PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 foi inserido no locus do orfB nativo da cepa. A cepa recombinante resultante carecia dos genes orfA, orfB e orfC funcionais e continha os genes PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 inseridos nos respectivos locus de orfA, orfB e orfC. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 5,2% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 0,6%, o teor de DPA n-6 foi de 2,1%, e o teor de DHA foi de 47,1%.
[00357] Em outro experimento realizado, a cepa filha do Exemplo 13 carecendo do gene orfC funcional e contendo o gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122) aleatoriamente integrado foi utilizada para a substituição dos genes orfA e orfB. Os genes nativos orfA e orfB na cepa foram substituídos por recombinação homóloga seguido pela transformação com um vetor contendo o marcador de resistência Zeocin™ flanqueado por sequências das regiões flanqueadoras de orfA e orfB. A cepa foi gerada carecendo dos genes orfA, orfB e orfC funcionais, e contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 aleatoriamente integrado. A cepa foi transformada com pLR95 contendo PFA1códon-otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 120) e pLR85 contendo PFA2códon- otimizado do Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121) de tal forma que a integração aleatória de PFA1 e PFA2 ocorreu. A cepa recombinante resultante carecia dos genes orfA, orfB e orfC funcionais e continha integrações aleatórias dos genes PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-10212. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 7. O teor de EPA da cepa recombinante foi de 1,8% de FAME, o teor de DPA n-3 foi de 1,8%, o teor de DPA n-6 foi de 2,3%, e o teor de DHA foi de 34,1%.
EXEMPLO 15
[00358] Os genes orfA, orfB e orfC do Schizochytrium sp. ATCC 20888 foram clonados em uma série de vetores Duet (Novagen). Os vetores de expressão Duet são um conjunto de plasmídeos compatíveis no qual genes alvos múltiplos são clonados e coexpressos a partir do promotor induzível T7 em E.coli. O plasmídeo Duet pREZ91 continha o orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 no pETDuet-1; o plasmídeo Duet pREZ96 continha o orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888 no pCDFDuet-1, e o plasmídeo Duet pREZ101 continha o orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 no pCOLADuet- 1. Os plasmídeos duet pREZ91, pREZ96 e pREZ101, juntamente com o plasmídeo pJK737, que continha o gene acessório necessário Hetl (descrito na Patente US 7.217.856, e incorporado ao presente pela referência em sua totalidade), foram transformados na cepa E. coli BLR (DE3) que contém um gene RNA polimerase induzível por T7. Após o crescimento celular e a adição de IPTG, de acordo com as instruções do fabricante (Novagen), DHA e DPA n- 6 foram produzidos. Em resumo, foi adicionado 1 mM de IPTG para a indução quando as células atingiram uma densidade óptica de cerca de 0,5 a 600 nm. As células foram cultivadas por 12 horas a 30 °C em caldo Luria e coletadas. Os ácidos graxos foram convertidos em ésteres metílicos usando técnicas padrões. Os perfis de ácidos graxos foram determinados por cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama (GC- FID) como ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME).
[00359] O PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 1) foi clonado em um vetor de expressão pETDuet-1 para gerar o pREZ346. Os plasmídeos duet pREZ346 (contendo PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695), pREZ96 (contendo orfB), e pREZ101 (contendo orfC) foram transformados em E. coli cepa BLR (DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). O gene PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 foi coexpresso com os genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888. A expressão do PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695, em combinação com a expressão dos genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888, estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 2,8% de FAME, o teor de DPA n-6 foi de 1,1%, o teor de DPA n-3 foi de 0,6%, e o teor de EPA foi de 3,7%.
EXEMPLO 16
[00360] O gene PFA1 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 120) foi clonado em um vetor de expressão pETDuet- 1 para gerar o pLR100. Os plasmídeos duet pLR100 (contendo o gene PFA1 códon-otimizado de Thraustochytrium. sp. ATCC PTA-10212), pREZ96 (contendo orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888), e pREZ101 (contendo orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. O gene PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 é coexpresso com os genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888. A expressão do PFA1 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212, em combinação com a expressão dos genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimula a produção de DHA e EPA em E. coli sob condições de indução.
EXEMPLO 17
[00361] O gene PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 (SEQ ID NO: 5) foi clonado em um vetor de expressão pCOLADuet-1, gerando o pREZ326. Os plasmídeos duet pREZ326 (contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695), pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888), e pREZ96 (contendo orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695, em combinação com a expressão dos genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,3% de FAME.
EXEMPLO 18
[00362] O gene PFA3 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 122) foi clonado em um vetor de expressão pCOLADuet-1, gerando o pREZ348. Os plasmídeos duet pREZ348 (contendo PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212), pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888), e pREZ96 (contendo orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212, em combinação com a expressão dos genes orfB e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 2,9% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 0,4%.
EXEMPLO 19
[00363] O gene PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 (SEQ ID NO: 3) foi clonado em um vetor de expressão pCDFDuet-1, gerando o pREZ330. Os plasmídeos duet pREZ330 (contendo PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695), pREZ326 (contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695) e pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 9. A expressão do PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695, em combinação com a expressão do gene orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,8% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 0,2%.
EXEMPLO 20
[00364] O gene PFA2 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 (SEQ ID NO: 121) foi clonado em um vetor de expressão pCDFDuet-1, gerando o pLR87. Os plasmídeos duet pLR 87 (contendo o gene PFA2 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212), pREZ348 (contendo o gene PFA3 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212) e pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do PFA2 e PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212, em combinação com a expressão do gene orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA e baixos níveis EPA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 4,4% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 1,1%, e o teor de EPA foi de 0,1%.
EXEMPLO 21
[00365] Os plasmídeos duet pREZ346 (contendo PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695), pREZ330 (contendo PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695) e pREZ326 (contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão de PFA1, PFA2 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,3% de FAME e o teor o teor de EPA foi de 0,3%.
EXEMPLO 22
[00366] Os plasmídeos duet pLR100 (contendo o gene PFA1 códon- otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212), pLR87 (contendo o gene PFA2 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212) e o pREZ348 (contendo o gene PFA3 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão dos genes códon-otimizados PFA1, PFA2 e PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 estimulou a produção de DHA e EPA em E. coli sob condições de indução.
EXEMPLO 23
[00367] Os plasmídeos duet pREZ330 (contendo PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695), pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888), e pREZ101 (contendo orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695, em combinação com a expressão dos genes orfA e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,6% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 0,3%.
EXEMPLO 24
[00368] Os plasmídeos duet pLR87 (contendo o gene PFA2 códon- otimizado de Thraustochytrium. sp. ATCC PTA-10212), pREZ91 (contendo orfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888), e pREZ101 (contendo orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do gene PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212, em combinação com a expressão dos genes orfA e orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA e baixos níveis EPA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 1,7% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 0,9%, e o teor de EPA foi de 0,1%.
EXEMPLO 25
[00369] Os plasmídeos duet pREZ346 (contendo PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695), pREZ330 (contendo PFA2 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695) e pREZ101 (contendo orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão de PFA1 e PFA2 em combinação com a expressão do gene orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,3% de FAME e o teor de DPA n-6 foi de 0,1%, e o teor de EPA foi de 0,5%.
EXEMPLO 26
[00370] Os plasmídeos duet pLR100 (contendo o gene PFA1 códon- otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212), pLR87 (contendo o gene PFA2 códon-otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212) e o pREZ101 (contendo o gene orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão dos genes códon-otimizados PFA1 e PFA2 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 em combinação com a expressão do gene orfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimula a produção de DHA e EPA em E. coli sob condições de indução.
EXEMPLO 27
[00371] Os plasmídeos duet pREZ346 (contendo PFA1 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695), pREZ96 (contendo orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888) e pREZ326 (contendo PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão do gene PFA1 e PFA3 de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695, em combinação com a expressão do gene orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimulou a produção de DHA em E. coli sob condições de indução. As células foram cultivadas e analisadas quanto aos FAMEs conforme descrito no Exemplo 15. O teor de DHA da E. coli transformada foi de 0,1% de FAME e o teor o teor de EPA foi de 0,1%.
EXEMPLO 28
[00372] Os plasmídeos duet pLR100 (contendo o gene PFA1 códon- otimizado de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212), pREZ96 (contendo orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888) e pREZ348 (contendo o gene códon- otimizado PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212) foram transformados em E. coli cepa BLR(DE3), juntamente com pJK737 (contendo Hetl). Vide o Exemplo 15. A expressão dos genes códon-otimizados PFA1 e PFA3 de Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212 em combinação com a expressão do gene orfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888 estimula a produção de DHA e EPA em E. coli sob condições de indução.
EXEMPLO 29
[00373]As atividades AGPI sintase de PFA1p, PFA2p e PFA3p no Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 e Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212 são individualmente submetidas à deleção gênica (nocaute) por meio de procedimentos padrões. Vide, por exemplo, Patente US 7.217.856 incorporada ao presente pela referência em sua totalidade.
[00374] O marcador de resistência Zeocin™, higromicina, blasticidina, ou outro marcador de resistência adequado é inserido em um sítio de restrição do gene PFA1 (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 68) que está contido em um plasmídeo. Após a inserção do marcador de resistência, o plasmídeo é introduzido no Schizochytrium sp. ATCC PTA- 9695 ou Thraustochytrium sp. ATCC PTA- 10212, respectivamente, por bombardeamento de partículas, eletroporação, ou por qualquer outro método de transformação apropriado. A recombinação homóloga ocorre, gerando mutantes em que o gene PFA1 nativo é substituído ou interrompido pelo marcador de resistência Zeocin, higromicina, blasticidina, ou outro marcador de resistência adequado. Os transformantes são selecionados em placas contendo Zeocin™, higromicina, blasticidina, ou outro marcador de seleção apropriado, suplementadas com AGPIs. As colônias são adicionalmente examinadas pela capacidade de crescimento na ausência de suplementação de AGPI. O DNA genômico é isolado das colônias que são resistentes ao agente de seleção e incapazes de crescer na ausência de suplementação com AGPI. A análise do DNA por PCR e Southern Bloté realizada para demonstrar que o gene PFA1está deletado ou interrompido.
[00375] O gene PFA2é submetido ao nocaute por procedimentos similares. O mutante nocaute resultante necessitando da suplementação de AGPI exibe ausência do comprimento total do gene PFA2.
[00376] O gene PFA3é submetido ao nocaute por procedimentos similares. O mutante nocaute resultante necessitando da suplementação de AGPI exibe ausência do comprimento total do gene PFA3.
[00377] Todos dentre os diferentes aspectos, exemplos de realizações e opções descritos na presente invenção podem ser combinados em quaisquer e todas as alterações.
[00378]Todas as publicações, publicações de patentes e pedidos de patentes mencionadas neste relatório descritivo são incorporadas a ele pela referência, tal como se cada publicação individual de patente ou pedido de patente tivesse sido especificamente e individualmente indicada como incorporada ao presente pela referência.

Claims (4)

1. Molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada por compreender uma sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, em que a referida sequência de polinucleotídeo é heteróloga à referida sequência de controle de transcrição.
2. Célula hospedeira microbiana caracterizada por expressar a molécula de ácido nucleico recombinante, conforme definida na reivindicação 1, em que a referida molécula de ácido nucleico recombinante é heteróloga à célula hospedeira.
3. Célula hospedeira microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato da célula microbiana ser um traustocitrídio, excluindo Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695.
4. Célula hospedeira microbiana, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do traustocitrídio ser um Schizochytrium ou um Thraustochytrium, excluindo Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695.
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