ES2717102T3 - Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de ácido graso poliinsaturado sintasas (PUFA) aislados implicados en la producción de los PUFA, incluyendo los PUFA enriquecidos con ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), o una combinación de los mismos. La presente invención se refiere a vectores y células hospedadoras que comprenden las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico, composiciones que comprenden las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, y métodos de preparación y usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
Los traustoquítridos son microorganismos del orden Traustoquitriales, que incluye miembros del género Thraustochytrium y el género Schizochytrium, y se han reconocido como una fuente alternativa de los PUFA. Véase, por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.130.242. Recientemente se ha mostrado que los sistemas similares a los de la poliquétido sintasa (PKS) en bacterias marinas y traustoquítridos son capaces de sintetizar ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. En el presente documento estos sistemas similares a los de la PKS sintasa también se denominan sistemas de PUFA sintasa. Los sistemas de PUFA sintasa en las bacterias marinas Shewanella y Vibrio marinus se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.140.486. Un sistema de PUFA sintasa en un traustoquítrido del género Schizochytrium se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.566.583. Los sistemas de PUFA sintasa en traustoquítridos del género Schizochytrium y del género Thraustochytrium también se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.247.461. El documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.211.418 describe un sistema de PUFA sintasa en un traustoquítrido del género Thraustochytrium y la producción de ácido eicosapentaenoico (C20: 5, omega-3) (EPA) y otros PUFA que usan el sistema. El documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856 describe los sistemas de PUFA sintasa en Shewanella olleyana y Shewanella japonica. El documento WO 2005/097982 describe un sistema de PUFA sintasa en la cepa SAM2179. Los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 7.208.590 y 7.368.552 describen genes y proteínas de PUFA sintasa de Thraustochytrium aureum.
En la bibliografía tradicionalmente se ha descrito que los sistemas de PKS entran en uno de tres tipos básicos, denominados por lo general Tipo I (modular o repetitivo), Tipo II, y Tipo III. El sistema de PKS modular de Tipo I también se ha denominado sistema de PKS "modular", y el sistema de PKS repetitivo de Tipo I también se ha denominado sistema de PKS de "Tipo I". El sistema de Tipo II se caracteriza por proteínas separables, cada una de las cuales realiza una reacción enzimática distinta. Las enzimas funcionan de manera sincronizada para producir el producto final y cada enzima individual del sistema por lo general participa varias veces en la producción del producto final. Este tipo de sistema funciona de manera análoga a los sistemas de ácido graso sintasa (FAS) encontrados en plantas y bacterias. Los sistemas de PKS repetitivos de Tipo I son similares al sistema de Tipo II en que las enzimas se usan de una manera repetitiva para producir el producto final. El sistema repetitivo de Tipo I se diferencia del sistema de Tipo II en que las actividades enzimáticas, en lugar de estar asociadas con proteínas separables, se producen como dominios de proteínas de mayor tamaño. Este sistema es análogo a los sistemas de FAS de Tipo I encontrados en animales y hongos.
A diferencia de los sistemas de Tipo II, cada dominio enzimático de los sistemas de PKS modulares de Tipo I se usa solamente una vez en la producción del producto final. Los dominios se encuentran en muchas proteínas grandes y el producto de cada reacción se transmite a otro dominio en la proteína PKS.
Más recientemente se han descubierto sistemas de Tipo III y pertenecen a la familia de la chalcona sintasa vegetal de enzimas de condensación. Las PKS de Tipo III son distintas de los sistemas de PKS de Tipo I y de Tipo II y utilizan sustratos de CoA libre en reacciones de condensación repetitivas para producir normalmente un producto final heterocíclico.
En la ruta convencional o estándar para la síntesis de PUFA, los ácidos grasos saturados con una cadena de longitud media (productos de un sistema de ácido graso sintasa (FAS)) se modifican mediante una serie de reacciones de elongación y desaturación. Los sustratos para la reacción de elongación son acil-CoA grasa (la cadena de ácido graso a alargar) y malonil-CoA (la fuente de los dos carbonos añadidos durante la reacción de elongación). El producto de la reacción de elongasa es una acil-CoA grasa que tiene dos carbonos adicionales en la cadena lineal. Las desaturasas crean dobles enlaces cis en la cadena de ácido graso existente previamente mediante extracción de dos hidrógenos en una reacción dependiente de oxígeno. Los sustratos para las desaturasas son cualquiera de acil-CoA (en algunos animales) o el ácido graso que se esterifica a la cadena principal de glicerol de un fosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina).
Los ácidos grasos se clasifican basándose en la longitud y características de saturación de la cadena del carbono. Los ácidos grasos se denominan ácidos grasos de cadena corta, cadena media o cadena larga basándose en el número de carbonos presentes en la cadena, se denominan ácidos grasos saturados cuando no hay presencia de dobles enlaces entre los átomos de carbono, y se denominan ácidos grasos insaturados cuando hay presencia de dobles enlaces. Los ácidos grasos insaturados de cadena larga son monoinsaturados cuando está presente solo un doble enlace y son poliinsaturados cuando hay presencia de más de un doble enlace.
Los PUFA se clasifican basándose en la posición del primer doble enlace desde el extremo metilo del ácido graso: los ácidos grasos omega-3 (n-3) contienen un primer doble enlace en el tercer carbono, mientras que los ácidos grasos omega-6 (n-6) contienen un primer doble enlace en el sexto carbono. Por ejemplo, el ácido docosahexaenoico ("DHA") es un PUFA omega-3 con una longitud de la cadena de 22 carbonos y 6 dobles enlaces, a menudo denominado "22: 6 n-3". Otros PUFA omega-3 incluyen ácido eicosapentaenoico ("EPA"), denominado "20: 5 n-3", y ácido docosapentaenoico omega-3 ("DPA n-3"), denominado "22: 5 n-3". DHA y EPA se han denominado ácidos grasos "esenciales". Los PUFA omega-6 incluyen ácido araquidónico ("ARA"), denominado "20: 4 n-6", y ácido docosapentaenoico omega-6 ("DPA n-6"), denominado "22: 5 n-6".
Los ácidos grasos omega-3 son moléculas biológicamente importantes que influyen en la fisiología celular debido a su presencia en membranas celulares, regulan la producción y la expresión genética de compuestos biológicamente activos, y sirven como sustratos biosintéticos. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999). Por ejemplo, el DHA representa aproximadamente un 15 %-20 % de lípidos en la corteza cerebral humana, y un 30 %-60 % de lípidos en la retina, se concentra en los testículos y el esperma, y es un componente importante de la leche de mama. Bergé, J.P., y Bamathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96: 49-125 (2005). El DHA representa hasta un 97 % de los ácidos grasos omega-3 en el cerebro y hasta un 93 % de los ácidos grasos omega-3 en la retina. Además, el DHA es esencial para el desarrollo tanto fetal como infantil, así como para el mantenimiento de las funciones cognitivas en adultos. Del mismo modo, dado que los ácidos grasos omega-3 no se sintetizan de novo en el cuerpo humano, estos ácidos grasos se deben obtener a partir de fuentes nutricionales.
El aceite de semillas de lino y los aceites de pescado se consideran buenas fuentes dietéticas de ácidos grasos omega-3. El aceite de lino no contiene EPA, DHA, DPA, o ARA, pero es un lugar contiene ácido linolénico (C18: 3 n-3), un componente básico que permite que el cuerpo fabrique EPA. Sin embargo, existen evidencias de que la tasa de conversión metabólica puede ser lenta y variable, en particular entre las personas con problemas de salud. Los aceites de pescado varían considerablemente en el tipo y nivel de composición de ácidos grasos dependiendo de la especie en particular y sus dietas. Por ejemplo, los peces criados mediante acuicultura tienden a tener un nivel más bajo de ácidos grasos omega-3 que los que están en el medio silvestre. Además, los aceites de pescado conllevan el riesgo de contener contaminantes ambientales y pueden estar asociados con problemas de estabilidad y un olor o sabor a pescado.
Los aceites producidos a partir de traustoquítridos a menudo tienen perfiles de ácido graso poliinsaturado más sencillos que los correspondientes aceites de pescado o microalgas. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999). Se ha informado que las cepas de especies de traustoquítridos producen ácidos grasos omega-3 como un alto porcentaje de los ácidos grasos totales producidos por los organismos. Documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.130.242; Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450­ 457 (2003). Sin embargo, los traustoquítridos aislados varían en la identidad y cantidades de los PUFA producidos, de modo que algunas cepas descritas previamente pueden tener perfiles de PUFA indeseables.
Se han realizado esfuerzos para producir los PUFA y plantas de cultivo de semillas oleaginosas mediante modificación de los ácidos grasos producidos de forma endógena. La modificación genética de estas plantas con diversos genes individuales para elongasas y desaturasas de ácidos grasos ha producido hojas o semillas que contienen niveles que se pueden medir de los PUFA tales como EPA, pero que también contienen niveles significativos de PUFA mixtos de cadena más corta y menos insaturados (Qi et al., Nature Biotech. 22: 739 (2004); Publicación de PCT N.° WO 04/071467; Abbadi et al., Plant Cell 16: 1 (2004)); Napier y Sayanova, Proc. Nutrition Society 64: 387-393 (2005); Robert et al., Functional Plant Biology 32: 473-479 (2005); y Solicitud de Publicación de Estados Unidos N.° 2004/0172682). El documento WO 2005/097982 divulga moléculas de ácido nucleico que codifican PKS y el uso de dichas moléculas de ácido nucleico para la producción de organismos recombinados y/o transgénicos.
Como tal, existe una necesidad continua para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos asociados con perfiles de PUFA deseables y métodos para producir perfiles de PUFA deseables a través del uso de tales moléculas de ácido nucleico y polipéptidos.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 72, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que consiste en actividad de p-hidroxiacil-AcP deshidrasa similar a FabA (DH) y actividad de enoil-ACP reductasa (ER);
(b) una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 72;
(c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER; (d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en la s Eq ID NO: 7.
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es totalmente complementaria a cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente.
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente o combinaciones de las mismas y una secuencia de control de la transcripción. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante es un vector recombinante. La presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende el vector recombinante de la reivindicación 4, en donde la célula hospedadora expresa la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula vegetal, una célula microbiana, y una célula animal. En algunas realizaciones, la célula microbiana es una bacteria. En algunas realizaciones, la bacteria es E. coli. En algunas realizaciones, la bacteria es una bacteria marina. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es un Schizochytrium. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es un Thraustochytrium. En algunas realizaciones, el traustoquítrido es un Ulkenia.
La presente invención se refiere a un método para producir al menos un PUFA, que comprende: expresar un gen de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir PUFA, en el que el gen de PUFA sintasa comprende cualquiera la molécula de ácido nucleico aislada como se ha descrito anteriormente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas anteriormente, o combinaciones de las mismas, y en el que se produce al menos un PUFA. En un aspecto de esta realización, la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula vegetal, una célula animal aislada, y una célula microbiana. En otro aspecto de esta realización, el al menos un PUFA comprende ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA). La presente invención se refiere a un polipéptido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad DH y actividad de ER;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 73.
En algunas realizaciones, cualquiera de los polipéptidos aislados de la invención puede ser un polipéptido de fusión. La presente invención se refiere a una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente un vehículo biológicamente aceptable.
La presente invención se refiere a un método para aumentar la producción de DHA en un organismo que tiene actividad de PUFA sintasa, que comprende: expresar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas anteriormente, o combinaciones de las mismas, en el organismo en condiciones eficaces para producir DHA, en el que la producción de DHA en el organismo aumenta.
La presente invención se refiere a un método para aislar lípidos a partir de una célula hospedadora, que comprende: (a) expresar un gen de PUFA sintasa en la célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, en el que el gen de PUFA sintasa comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas anteriormente, o combinaciones de las mismas, en la célula hospedadora, y (b) aislar lípidos a partir de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona a partir del grupo compuesto por una célula vegetal, una célula animal aislada y una célula microbiana. En algunas realizaciones, los lípidos comprenden DHA, EPA o una combinación de los mismos.
Breve descripción de los dibujos/figuras
FIG. 1 muestra la arquitectura genética de las PUFA sintasas de la cepa PT-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
FIG. 2 muestra la arquitectura genética de las PUFA sintasas de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
FIG. 3 muestra la arquitectura de dominio de las PUFA sintasas de la cepa PT-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., y las PUFA sintasas de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.y sintasas de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., la cepa 20892 de la ATCC de Thraustochytrium sp., Thraustochytrium aureum, y SAM2179.
FIG. 4 muestra un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de Pfa1p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 2) y una secuencia de aminoácidos de Pfa1p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (Se Q ID NO: 69) con las secuencias de OrfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SeQ ID No : 54) y de la cepa 20892 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 56) y la secuencia ORF A de Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO: 55).
FIG. 5 muestra un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de Pfa2p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 4) y una secuencia de aminoácidos de Pfa2p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (Se Q ID NO: 71) con las secuencias de OrfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SeQ ID No : 57) y de la cepa 20892 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 58) y la secuencia ORF B de Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO: 59).
FIG. 6 muestra un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de Pfa3p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 6) y una secuencia de aminoácidos de Pfa3p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 73) con las secuencias de OrfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 61) y de la cepa 20892 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 60). FIG. 7 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 1).
FIG. 8 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa1p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 2).
FIG. 9 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 3).
FIG. 10 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa2p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 4).
FIG. 11 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 5).
FIG. 12 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa3p de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 6).
FIG. 13 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 68).
FIG. 14 muestra una secuencia de polinucleótidos de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 120) que se ha optimizado con codón para su expresión en Schizochytrium. FIG. 15 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa1p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 69).
FIG. 16 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 70).
FIG. 17 muestra una secuencia de polinucleótidos de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 121) que se ha optimizado con codón para su expresión en Schizochytrium. FIG. 18 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa2p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 71).
FIG. 19 muestra la secuencia de polinucleótidos de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 72).
FIG. 20 muestra una secuencia de polinucleótidos de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 122) que se ha optimizado con codón para su expresión en Schizochytrium. FIG. 21 muestra la secuencia de aminoácidos de Pfa3p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 73).
FIG. 22 muestra una tabla de uso de codón para Schizochytrium.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de ácido graso poliinsaturado sintasas (PUFA) aislados implicados en la producción de los PUFA, incluyendo los PUFA enriquecidos con ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), o una combinación de los mismos. La presente invención se refiere a vectores y células hospedadoras que comprenden las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico, composiciones que comprenden las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, y métodos de preparación y uso de los mismos.
PUFA Sintasas
Como se usa en el presente documento, la expresión "PUFA sintasa" se refiere a una enzima que está implicada en la producción de ácidos grasos poliinsaturados. Véase, por ejemplo, Metz et al., Science 293: 290-293 (2001).
En el presente documento se describen tres subunidades de PUFA sintasa denominadas Pfa1p (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 69), Pfa2p (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 71) y Pfa3p (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 73), así como los genes que codifican las subunidades denominadas PFA1 (SeQ ID NO:1, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 120), PFA2 (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 121) y PFA3 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 122). La presente invención se dirige en parte a una subunidad de PUFA sintasa denominada Pfa3p (SEQ ID NO: 73), así como a los genes que codifican la subunidad denominada PFA3 (SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO:122). Véanse, FiGs.
1-3 y 7-21. Las PUFA sintasas en otros traustoquítridos también se han designado como ORF 1, ORF 2, y ORF 3, respectivamente, o como OrfA, OrfB, y OrfC, respectivamente. Véase, por ejemplo, Schizochytrium sp., (ATCC 20888) y Thraustochytrium sp. (ATCC 20892) en los documentos de patente de Estados Unidos N.°s 7.247.461 y 7.256.022, que hacen referencia a genes orfA, orfB, y orfC y a las correspondientes proteínas OrfA, OrfB, y OrfC, y Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) en el documento de patente de Estados Unidos N.° 7.368.552, que hacen referencia a genes y proteínas ORF A, ORF B, y ORF C. Véase también, la cepa SAM2179 en el documento WO/2005/097982, que hace referencia a genes y proteínas ORF 1, ORF 2, y ORF 3.
Moléculas de Ácido Nucleico
En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico aislados que comprenden secuencias de polinucleótidos para genes y dominios de PUFA sintasa obtenidas a partir de un microorganismo aislado que es el objeto de la Solicitud de Estados Unidos N.° 12/407.687 en trámite junto con la presente, presentada el 19 de marzo de 2009. El microorganismo se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 7 de enero de 2009, y se le dio el N.° PTA-9695 de Registro en la ATCC, y también se denomina cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.. Cuando se expresan, estos genes producen perfiles de ácido graso únicos, caracterizados en parte por niveles elevados de ácidos grasos omega-3, en particular niveles elevados de DHA.
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de polinucleótidos para genes y dominios de PUFA sintasa obtenidas a partir de un microorganismo aislado que es el objeto de la Solicitud de Estados Unidos N.° 61/296.456, en trámite junto con la presente, presentada el 19 de enero de 2010. El microorganismo se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 14 de julio de 2009, y se le dio el N.° PTA-10212, de Registro en la ATCC, y también se denomina cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.. Cuando se expresan, estos genes producen perfiles de ácido graso únicos, caracterizados en parte por niveles elevados de ácidos grasos omega-3, en particular niveles elevados de DHA, EPA, o una combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, un "polinucleótido" puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos peptidonucleicos (PNA)). Un polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, incluyendo las secuencias sin traducir en las posiciones 5' y 3', las secuencias de codificación, así como fragmentos, epítopo, dominios y variantes de la secuencia de ácidos nucleicos. El polinucleótido puede estar formado por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar formados por ADN mono y bicatenario, ADN que sea una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que sea una mezcla de mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser mono y bicatenarios, más habitualmente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, los polinucleótidos pueden estar formados por regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Los polinucleótidos pueden contener ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina, o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, o desoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualquier análogo fosfoéster de los mismos, tal como fosforotioatos y tioésteres. Los polinucleótidos también pueden contener una o más bases o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. En ADN y ARN se pueden hacer una diversidad de modificaciones; por lo tanto, "polinucleótido" incluye formas modificadas química, enzimática, o metabólicamente. La expresión molécula de ácido nucleico se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Por lo tanto, esta expresión incluye ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas de ADN de bicatenarias en particular, las secuencias se pueden describir en el presente documento de acuerdo con la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN no transcrita (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm).
La expresión molécula de ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno nativo. Los ejemplos adicionales de moléculas de ácido nucleico aislado incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención incluyen adicionalmente las moléculas de este tipo producidas por vía sintética. Además, una molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma, o un terminador de la transcripción.
Un "gen" se refiere a un conjunto de nucleótidos que codifican un polipéptido, e incluye ADNc y ácidos nucleicos de ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias de intervención (intrones) entre segmentos codificante sin individuales (exones), así como secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en la posición 5') y que siguen (secuencias no codificantes en la posición 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.
En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de polinucleótidos al menos un 80% idénticas a las secuencias de polinucleótidos de la PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp (SEQ ID NO:1), la PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO:3), la PfA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO:5), la PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO:68 o SEQ ID NO:120), la PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO:70 o SEQ ID NO:121), la PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO:72 o SEQ ID NO:122) y combinaciones de estas, donde los polinucleótidos codifican polipéptidos que comprenden una o más actividades de PUFA sintasa. La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ IN NO: 72, donde a la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que consiste en actividad de p-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA (DH) y actividad de enoil-ACP reductasa (ER).
Las actividades de PUFA sintasa están asociadas con uno o más dominios en cada polipéptido de sintasa, en las que los dominios se pueden identificar mediante sus motivos estructurales o funcionales conservados basándose en su homología con motivos conocidos y también se pueden identificar basándose en sus actividades bioquímicas específicas. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856. Los ejemplos de dominios de PUFA sintasa incluyen: el dominio de beta-cetoacil-ACP sintasa (KS), dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT), dominios de proteína de vehículo de acilo (ACP), dominio de cetorreductasa (KR), y dominio de beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa (DH) en Pfa1p; el dominio de KS, el dominio de factor de longitud de cadena (CLF), dominio de aciltransferasa (AT), y dominio de enoil-ACP reductasa (ER) en Pfa2p; y los dominios DH y el dominio de ER en Pfa3p.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad biológica (función) de beta-cetoacil-ACP sintasa (KS) es capaz de realizar la etapa inicial del ciclo de reacción de elongación de ácido graso. La expresión "beta-cetoacil-ACP sintasa" se ha usado indistintamente con las expresiones "3-ceto acil-ACP sintasa", "beta-cetoacil-ACP sintasa", y "ceto-acil ACP sintasa". En otros sistemas, se ha mostrado que el grupo acilo para elongación está relacionado con un resto de cisteína en el sitio activo de KS mediante un enlace tioéster, y el acil-KS experimenta condensación con malonil-ACP para formar -cetoacil-ACP, CO2, y KS sin unir ("libre"). En los sistemas de este tipo, se ha mostrado que KS posee una especificidad de sustrato mayor que otros polipéptidos del ciclo de reacción. Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de KS mediante homología con secuencias conocidas de KS.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT) es capaz de transferir el resto malonilo de malonil-CoA a ACP. La expresión "malonil-CoA:ACP aciltransferasa" se ha usado indistintamente con "malonil aciltransferasa". Además del motivo de sitio activo (GxSxG), se ha mostrado que las MAT poseen un motivo ampliado (aminoácidos R y Q en posiciones fundamentales). Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de MAT mediante homología con secuencias conocidas de MAT y mediante su estructura de motivo ampliado.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de proteína transportadora de acilo (ACP) es capaz de funcionar como un vehículo para crecimiento de cadenas de acilo graso a través de un enlace tioéster a un cofactor unido de manera covalente. Las ACP por lo general tienen una longitud de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 aminoácidos y se ha mostrado que se convierte en de formas apo inactivas a formas holo funcionales mediante transferencia del resto fosfopanteteinilo de CoA a un resto de serina altamente conservado de la ACP. También se ha mostrado por los grupos acilo según en a las ACP mediante un enlace tioéster en el extremo libre del resto fosfopanteteinilo. La presencia de variaciones de un motivo de sitio activo (LGIDS*) también se ha reconocido como una firma de las ACP. La funcionalidad de la serina de sitio activo (S*) se ha demostrado en una PUFA sintasa bacteriana (Jiang et al., J. Am. Chem. Soc. 130: 6336-7 (2008)). Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de ACP mediante etiquetado con panteteína radiactiva y mediante homología de secuencias con ACP conocidas.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de deshidrasa o deshidratasa (DH) es capaz de catalizar una reacción de deshidratación. La referencia a la actividad de DH por lo general se refiere a la actividad biológica de beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA. La actividad biológica de beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA retira HOH de una beta-cetoacil-ACP e inicialmente produce un doble enlace trans en la cadena de carbono. La expresión "beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA" se ha usado indistintamente con las expresiones "beta-hidroxi acil-ACP deshidrasa similar a FabA", "beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa", y "deshidrasa". Previamente se ha demostrado que los dominios de DH de los sistemas de PUFA sintasa muestran homología con enzimas de DH bacterianas asociadas con sistemas de FAS (en lugar de los dominios de DH de otros sistemas de PKS). Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856. Un subconjunto de DH bacterianas, las DH similares a FabA, poseen actividad de isomerasa cis-trans (Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)). Basándose en la homología de las proteínas de DH similares a FabA, uno o todos los dominios de DH del sistema de PUFA sintasa pueden ser responsables de la inserción de dobles enlaces cis en los productos de PUFA sintasa. Un polipéptido o dominio también puede tener actividad de DH no similar a FabA, o actividad beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa no similar a FabA (DH). De forma más específica, un motivo de sitio activo conservado de aproximadamente 13 aminoácidos de longitud se ha identificado previamente en dominios de DH de PUFA sintasa: LxxHxxxGxxxxP (la posición L también puede ser una I en emotivo). Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856, y Donadio S, Katz L., Gene 111 (1): 51-60 (1992). Este motivo conservado se encuentra en una región similar de todas las secuencias conocidas de PUFA sintasa y podría ser responsable de una deshidratación similar a no FabA.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de beta-cetoacil-ACP reductasa (KR) es capaz de catalizar la reducción dependiente de piridina-nucleótido de formas 3-cetoacilo de ACP. La expresión "beta-cetoacil-ACP reductasa" se ha usado indistintamente con las expresiones "cetorreductasa", "3-cetoacil-ACP reductasa", y "ceto-acil ACP reductasa". En otros sistemas se ha determinado que la función de KR implica la primera etapa reductora en el ciclo de elongación de biosíntesis de ácidos grasos de novo. Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de KR mediante homología de secuencias con las k R de PUFA sintasa conocidas.
Previamente se ha definido que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad del factor de longitud de cadena (CLF) tiene una o más de las actividades o características siguientes: (1) puede determinar el número de ciclos de elongación y por tanto la longitud de la cadena del producto final, (2) tiene homología con KS, pero carece de la cisteína de sitio activo de KS, (3) se puede heterodimerizar con KS, (4) puede proporcionar el grupo acilo inicial a elongar, o (5) puede decarboxilar el malonato (como malonil-ACP), formando de este modo un grupo acetato que se puede transferir al sitio activo de KS y que puede actuar como la molécula de 'cebado' que experimenta la reacción de elongación (condensación) inicial. Un dominio de CLF se encuentra en todos los e los sistemas de PUFA sintasa identificados en la actualidad y en cada caso se encuentra como parte de una proteína de múltiples dominios. Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de CLF mediante homología de secuencias con los CLF de PUFA sintasa conocidos.
Previamente se ha definido que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de aciltransferasa (AT) tiene una o más de las actividades o características siguientes: (1) puede transferir el grupo acilo graso desde el dominio o dominios de ACP a agua (es decir, una tioesterasa), liberando el grupo acilo graso como un ácido graso libre, (2) puede transferir un grupo acilo graso a un aceptor tal como CoA, (3) puede transferir el grupo acilo entre los diversos dominios de ACP, o (4) puede transferir el grupo acilo graso a una molécula aceptora lipófila (por ejemplo, a ácido lisofosfádico). Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de AT mediante homología de secuencias con las AT de PUFA sintasa conocidas.
Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad biológica de enoil-ACP reductasa (ER) es capaz de reducir el doble enlace trans (introducido por la actividad de DH) en el acilo graso-ACP, dando como resultado la saturación de los carbonos asociados. Previamente se ha mostrado que el dominio de ER en los sistemas de PUFA sintasa tiene homología con una familia de enzimas de ER (Heath et al., Nature 406: 145-146 (2000), y se ha mostrado que un homólogo de ER funciona como una enoil-ACP reductasa in vitro (Bumpus et al., J. Am. Chem. Soc., 130: 11614-11616 (2008). La expresión "enoil-ACP reductasa" se ha usado indistintamente con "enoil reductasa", "enoil ACP-reductasa", y "enoil acil-ACP reductasa". Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de e R mediante homología de secuencias con las ER de PUFA sintasa conocidas.
La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos dentro de PFA3 (SEQ ID NO: 72) que codifica un dominio de DH (tal como SEQ ID NO: 110, o SEQ ID NO: 112), y un dominio de ER (SEQ ID NO: 114).
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 72, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.
Se divulga una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 110, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de DH.
Se divulga una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 112, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de DH.
Se divulga una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 114, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de ER.
En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos, donde los polipéptidos comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa1p (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:69), Pfa2p (SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:71) o Pfa3p (SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:73), donde los polinucleótidos codifican polipéptidos que comprenden una o más actividades de PUFA sintasa. La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aisladas que comprende secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos, en la que los polipéptidos comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa3p (SEQ ID NO: 73), en la que the polinucleótidos codifican polipéptidos que tienen actividades de PUFA sintasa que consisten en actividad de Dh y actividad de ER.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere una molécula de ácido nucleicos que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos dentro de Pfa3p (SEQ ID NO: 73) que comprende un dominio de DH (tal como SEQ ID NO: 111, o SEQ ID NO: 113), y un dominio de ER (SEQ ID NO: 115).
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:111, y donde el polipéptido comprende actividad de DH. En algunas realizaciones, la presente invención se dirige a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:113, y donde el polipéptido comprende actividad de DH. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:115 y donde el polipéptido comprende actividad de ER. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico comprenden secuencias de polinucleótidos idénticas en al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, o 90 % a las secuencias de polinucleótidos informadas en el presente documento, o al menos idénticas en aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a las secuencias de polinucleótidos informadas en el presente documento. La expresión "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, tal como se determina mediante comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de las secuencias entre secuencias de aminoácidos o polinucleótidos, según pueda ser el caso, tal como se determina mediante el emparejamiento entre hebras de tales secuencias.
Por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos "idénticas" en al menos, por ejemplo, un 95 % a una secuencia de polinucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende hacer referencia a que la secuencia de polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco diferencias de nucleótidos por cada 100 nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de polinucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia.
Como una cuestión práctica, cualquier secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos en particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos de la presente invención se puede determinar de manera convencional usando programas informáticos conocidos. Un método para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto se puede determinar usando el alineamiento de secuencias y cálculo de puntuaciones de identidad. Los alineamientos se realizaron usando el programa informático AlignX, que es un componente del paquete Vector NTI Suite 10.0 de Invitrogen (www.invitrogen.com). Los alineamientos se realizaron usando un alineamiento ClustalW (Thompson, J.D., et al., Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)) para alineamientos de secuencias tanto de aminoácidos como de polinucleótidos. Las matrices de puntuación por defecto, Blosum62mt2 y swgapdnamt, se usaron para alineamientos de secuencias de aminoácidos y polinucleótidos, respectivamente. Para secuencias de aminoácidos, la penalización de apertura de hueco por defecto es 10 y la penalización por extensión del hueco es 0,1. Para secuencias de polinucleótidos, la penalización de apertura de hueco por defecto es 15 y la penalización por extensión del hueco es 6,66.
Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de ER y actividad de DH, en la que el polinucleótido se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente.
Una molécula de ácido nucleico se puede "hibridar" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico se puede hibridar a la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ejemplifican. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar sistemáticamente fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de manera alejada, a fragmentos altamente similares, tales como genes quintuplican enzimas funcionales de organismos muy relacionados. Los lavados después de la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones usa una serie de grabados que parte de 6X SSC, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 15 min, a continuación se repite con 2X SSC, SDS al 0,5 % a 45 °C durante 30 min, y a continuación se repite dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5 % a 50 °C durante 30 min. Para condiciones más rigurosas, se realizan lavados a temperaturas más elevadas en que los lavados son idénticos a los mencionados anteriormente excepto para temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0,2X SSC, SDS al 0,5 % que aumentan a 60 °C. Otro conjunto de condiciones altamente rigurosos usados lavados finales en 0,1X SSC, 0,1 % SDS a 65 °C. Un conjunto adicional de condiciones altamente rigurosas se definen mediante hibridación a 0,1X SSC, 0,1 % SDS, 65 °C y se lava con 2X SSC, SDS al 0,1 % seguido de 0,1X SSC, SDS al 0,1 %.
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es totalmente complementaria a cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente. El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido puede incluir normalmente un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o de la traducción asociados de manera operativa con una o más regiones codificantes. Una asociación operable se produce cuando la región codificante para un producto genético, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de una manera tal que se coloca la expresión del producto genético bajo la influencia o control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) se "asocian de manera operativa" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto genético deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto genético o interferir con la capacidad del molde de ADN a transcribir. Por lo tanto, una región promotora se podría asociar de manera operativa con una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido si el promotor fuera capaz de realizar la transcripción de una secuencia de polinucleótidos. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirija la transcripción sustancial del a Dn solamente en células predeterminadas. En general, una región codificante se sitúa en la posición 3' con respecto a un promotor. Los promotores se pueden obtener en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden estar formados por diferentes elementos obtenidos a partir de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la materia entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes estadios del desarrollo, o como respuesta a diferentes condiciones ambientales o psicológicas. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayoría de las veces comúnmente se denominan "promotores constitutivos". Además se reconoce que dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica. Un promotor por lo general se une en su extremo 3' terminal mediante el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro del promotor se encontrará sitio de inicio de la transcripción (definido de forma conveniente por ejemplo, mediante formación de mapas con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa.
Las regiones reguladoras adecuadas incluyen regiones de ácido nucleico situadas cadena arriba (secuencias no codificantes en la posición 5'), dentro, o cadena abajo (secuencias no codificantes en la posición 3') de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión a efector y estructuras de tallo-lazo. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar de forma operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. Los límites de la región codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' terminal (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' terminal (carboxilo). Una región codificante puede incluir, pero no se limita a, regiones procariotas, ADNc de ARNm, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADN sintético, o moléculas de ARN. Si la región codificante está destinada a la expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se situarán normalmente en la posición 3' con respecto a la región codificante.
En ciertos aspectos de la invención, como cebadores de PCR se pueden usar secuencias de polinucleótidos que tengan al menos 20 bases, al menos 30 bases, al menos 50 bases y que se hibridan con una secuencia de polinucleótidos de la presente invención. Por lo general, en técnicas de amplificación de tipo PCR, los cebadores tienen secuencias diferentes y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de ensayo deseadas, las secuencias de los cebadores se deberían diseñar para proporcionar una replicación tanto eficaz como fiel del ácido nucleico diana. Los métodos de diseño de cebadores de PCR son comunes y se conocen bien en la técnica. Por lo general se pueden usar dos segmentos cortos de las secuencias presentes en protocolos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos a partir de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también se puede realizar en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados en los que la secuencia de un cebador se obtiene a partir de los presentes fragmentos de ácido nucleico y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de los tramos de ácido poliadenílico con respecto al extremo en la posición 3' del precursor de ARNm que codifica genes microbianos. Como alternativa, la segunda secuencia de cebadores se puede basar en secuencias obtenidas a partir del vector de clonación.
Además, se pueden diseñar cebadores específicos y usar para amplificar una parte o una longitud completa de las presentes secuencias. Los productos de amplificación resultantes se pueden etiquetar directamente durante las reacciones de amplificación o se pueden etiquetar después de reacciones de amplificación, y se pueden usar como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa en condiciones de rigurosidad apropiada.
Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar para aislar genes que codifican proteínas homólogas de la misma especie o de otras especies bacterianas. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencia se conoce bien en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación de ácidos nucleicos y métodos de amplificación de ADN y ARN como se usa a modo de ejemplo mediante diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, Mullis et al., documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.683.202; reacción en cadena de ligasa (LCR) (Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985)); o amplificación por desplazamiento de la hebra (s Da ; Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 392 (1992)).
En el presente documento se describen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se usan para aislar moléculas de ácido nucleico homólogas de otros organismos con el fin de identificar PUFA sintasas que produzcan perfiles de PUFA similares o mejorados. En el presente documento se describen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se usan para aislar moléculas de ácido nucleico homólogas de otros organismos que están involucrados en la producción de altas cantidades de DHA.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación también comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican un gen de PUFA sintasa, un dominio de un gen de PUFA sintasa, un fragmento del gen de PUFA sintasa fusionado en marco a una secuencia marcadora que permite la detección del polipéptido de la presente invención. Las secuencias marcadoras incluyen marcadores auxotróficos o dominantes conocidos por alguien con una experiencia habitual en la materia tal como ZEO (zeocina), NEG (G418), higromicina, arsenito, HPH, NAT, y similares.
La presente divulgación también incluye variantes del gen de PUFA sintasa. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. Los ejemplos son variantes de secuencias de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones, o deleciones, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En ciertas realizaciones, las variantes de secuencias de polinucleótidos se producen por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. En otras divulgaciones, se pueden producir variantes de secuencias de polinucleótidos por diversas razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón para un huésped particular (por ejemplo, el cambio de codones en el ARNm de traustoquítrido a los preferidos por otros organismos tales como E. coli o Saccharomyces cerevisiae).
En la presente divulgación también se proporcionan variantes alélicas, ortólogos, y/o especies homólogas. Los procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para obtener genes de longitud completa, variantes alélicas, variantes de corte y empalme, porciones de codificación de longitud completa, ortólogos, y/o homólogos de especies de los genes que se describen en el presente documento usando información de las secuencias desveladas en el presente documento. Por ejemplo, las variantes alélicas y/o los homólogos de especies se pueden aislar e identificar preparando sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias proporcionadas en el presente documento e identificando sistemáticamente una fuente de ácido nucleico adecuada para variantes alélicas y/o el homólogo deseado.
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de descritas anteriormente o combinaciones de las mismas y una secuencia de control de la transcripción. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante es un vector recombinante.
En el presente documento un método para preparar un vector recombinante que comprende insertar una o más moléculas de ácido nucleico aisladas como se describe en el presente documento en un vector.
Los vectores de la presente invención pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc.
Las secuencias de polinucleótidos de la invención se pueden incluir en una cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Los vectores de este tipo incluyen secuencias de ADN o ARN cromosómico, no cromosómico, y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; y plásmidos de levadura. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector apropiado conocido para alguien con una experiencia habitual en la materia.
La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los expertos en la materia.
La presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una o más secuencias de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto de la presente realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, asociado en forma operativa a la secuencia. Los expertos en la materia conocen grandes números de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el mercado.
Polipéptidos
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos para proteínas y dominios de PUFA sintasa obtenidos a partir del microorganismo aislado depositado como Registro en la ATCC N.° PTA-10212.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende incluir un "polipéptido" en singular así como "polipéptidos" en plural y se refiere a una molécula formada por monómeros (aminoácidos) unidos de manera lineal mediante enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se hace referencia a una longitud específica del producto. Por lo tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término usado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de modificaciones después de la expresión del polipéptido, que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de prevención/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, o modificación mediante cualquier aminoácido de origen natural.
Los polipéptidos, como se describe en el presente documento, pueden incluir fragmentos, variante o moléculas derivadas de los mismos sin limitación. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", cuando se refieren a un polipéptido, incluyen cualquier polipéptido que retenga al menos una cierta actividad biológica. Los fragmentos de polipéptidos pueden incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleción, y fragmentos que alcancen más fácilmente el sitio de acción cuando se administran a un animal. Los fragmentos de polipéptidos incluyen adicionalmente cualquier porción del polipéptido que comprende un epítopo antigénico o inmunogénico del polipéptido nativo, incluyendo epítopos lineales así como tridimensionales. Los fragmentos de polipéptidos pueden comprender regiones variantes, incluyendo fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes se pueden producir de manera natural, tal como una variante alélica. Por una "variante alélica" se hace referencia a formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Se pueden producir variantes de origen no natural usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. En el presente documento los polipéptidos variantes también se pueden denominar "análogos de polipéptido". Los fragmentos de polipéptido de la presente invención también pueden incluir moléculas derivadas. Como se usa en el presente documento un "derivado" de un polipéptido o un fragmento de polipéptido se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno más restos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. Como "derivados" también se incluyen los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; homoserina se puede sustituir por serina; y ornitina se puede sustituir por lisina.
Los polipéptidos de la invención se pueden codificar mediante cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención.
En el presente documento se describen polipéptidos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa1p (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:69), Pfa2p (SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:71), Pfa3p (SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:73), y combinaciones de las mismas, donde los polipéptidos comprenden una o más actividades de PUFA sintasa. La presente invención se refiere a péptidos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa3p (SEQ ID NO:73), donde el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consta de actividad de DH y actividad de ER.
La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos dentro de Pfa3p (SEQ ID NO: 73) que comprende dominios de PUFA sintasa tales como un dominio DH (tal como la SEQ ID nO: 111 o la SEQ ID NO: 1113) y un dominio ER (SEQ ID NO:115).
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:111, donde el polipéptido comprende actividad de DH.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:113, donde el polipéptido comprende actividad de DH.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:115, donde el polipéptido comprende actividad de ER.
En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden secuencias de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, o un 90 % idénticas a las secuencias de aminoácidos informadas en el presente documento, o al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos informadas en el presente documento.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de búsqueda de la presente invención, se hace referencia a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto es idéntica a la secuencia de búsqueda excepto en que la secuencia de polipéptidos objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de búsqueda. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de búsqueda, hasta un 5 % de los restos de aminoácidos en la secuencia objeto se puede insertar, suprimir, (indels) o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea de forma individual entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como una cuestión práctica, cualquier polipéptido en particular que tenga una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la presente invención se puede determinar de manera convencional usando programas informáticos conocidos. Como se ha analizado anteriormente, un método para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto se puede determinar usando el alineamiento de secuencias y cálculo de puntuaciones de identidad. Los alineamientos se realizaron usando el programa informático AlignX, que es un componente del paquete Vector NTI Suite 10.0 de Invitrogen (www.invitrogen.com). Los alineamientos se realizaron usando un alineamiento ClustalW (J. Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673-4680 (1994). Se usó la matriz Blosum62mt2 de puntuación por defecto. La penalización de apertura de hueco por defecto es 10 y la penalización por extensión del hueco es 0,1.
En aspectos adicionales de la invención, las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de polinucleótidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos desveladas en el presente documento, codifican un polipéptido que tiene una o más actividades de PUFA sintasa. Los polipéptidos que tienen una o más actividades de PUFa sintasa presentan una o más actividades similares a, pero no necesariamente idénticas a, una o más actividades de una PUFA sintasa de la presente invención.
Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien con experiencia habitual en la materia reconocerá inmediatamente que una gran parte de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de polinucleótidos al menos un 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o un 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos que se describen en el presente documento codificarán polipéptidos "que tengan actividad funcional de PUFA sintasa". De hecho, dado que todas las variantes degeneradas de cualquiera de estas secuencias de polinucleótidos codifican el mismo polipéptido, en muchos casos, el experto en la materia puede predecir, basándose en el conocimiento de sustituciones conservativas así como de dominios funcionales conservados, qué polipéptidos presentarán actividad. En ciertos aspectos de la invención, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan en una forma aislada, por ejemplo, purificada hasta homogeneidad. Como alternativa, los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden producir de forma sintética mediante sintetizadores convencionales.
Como se sabe en la técnica, la "similitud" entre todos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados de la misma del polipéptido con respecto a la secuencia de un segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, un polipéptido de la invención es un polipéptido de fusión.
Como se usa en el presente documento, "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende un primer polipéptido conectado de manera lineal, a través de enlaces peptídicos, a un segundo polipéptido. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser idénticos o diferentes, y se pueden conectar directamente, o se pueden conectar a través de un conector peptídico. Como se usa en el presente documento, los términos "unido", "fusionado", o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión en conjunto de dos o más elementos o componentes mediante cualquier medio que incluye medios de conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos para formar un marco de lectura abiertos más largo continuo, de una manera que mantenga el marco de lectura correcto de los marcos de lectura abiertos originales. Por lo tanto, la proteína de fusión recombinante resultante es una sola proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los marcos de lectura abiertos originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos a la naturaleza). Aunque el marco de lectura por lo tanto se hace continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, mediante secuencia conectora en marco. Una secuencia "conectora" es una serie de uno o más aminoácidos que separan dos regiones codificantes de polipéptidos en una proteína de fusión.
Se divulga una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención y un vehículo biológicamente aceptable.
En algunas divulgaciones, la composición incluye un "excipiente" biológicamente aceptable, en la que el excipiente es un componente, o mezcla de componentes, que se usa en una composición de la presente invención para dar características deseables a la composición, y también incluyen vehículos. "Biológicamente aceptable" se refiere a un compuesto, material, composición, sal, y/o forma de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico sensato, es adecuado para su contacto con los tejidos de células vivas sin una toxicidad, irritación, respuesta inflamatoria excesivas, otras complicaciones problemáticas con respecto a la duración deseada del contacto o proporcionar con una relación razonable de beneficio/riesgo. Se pueden usar diversos excipientes. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser, pero no se limita a, un agente alcalino, un estabilizante, un antioxidante, un agente de adhesión, un agente de separación, un agente de revestimiento, un componente de fase exterior, un componente de liberación controlada, un disolvente, un tensioactivo, un humectante, un agente de tamponamiento, una carga, un emoliente, o combinaciones de los mismos. Los excipientes, además de los que se discuten en el presente documento, pueden incluir excipientes que se enumeran en, aunque no se limitan a to, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed. (2005). La inclusión de un excipiente en una clasificación en particular en el presente documento (por ejemplo, "disolvente") pretende ilustrar más que limitar el papel del excipiente. Un excipiente en particular puede entrar dentro de múltiples clasificaciones.
En el presente documento se describe un fragmento, variante, derivado, o análogo de cualquiera de los polipéptidos que se desvelan en el presente documento.
El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural, o un polipéptido sintético.
Células Hospedadoras
La presente invención se refiere a una célula hospedadora que expresa cualquiera de las moléculas de ácido nucleico y moléculas de ácido nucleico recombinante descritas anteriormente así como combinaciones de los mismos.
El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un agente bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, pero no se limita, supresión genética así como tanto expresión transitoria como expresión estable. Incluye, pero no se limita, transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN horquillado pequeño (ARNsh), ARN de interferencia pequeño (ARNsi), o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de tal ARNm en polipéptido(s). Si el producto final deseado es bioquímico, la expresión incluye la creación de ese agente bioquímico y cualquier precursor.
Para producir uno o más ácidos grasos poliinsaturados deseados, una célula hospedadora se puede modificar genéticamente para introducir un sistema de PUFA sintasa de la presente invención en la célula hospedadora.
Cuando se modifican genéricamente organismos para expresar un sistema de PUFA sintasa de acuerdo con la presente invención, algunos organismos operadores pueden expresar de forma endógena proteínas auxiliares que se requieren en conjunto con un sistema de PUFA sintasa para producir los PUFA. Sin embargo, puede ser necesario transformar algunos organismos con moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteína o proteínas auxiliares para permitir o para aumentar la producción de los PUFA por el organismo, incluso si el organismo produce de manera endógena una proteína auxiliar homóloga. Algunas proteínas auxiliares heterólogas pueden funcionar de manera más eficaz o más eficiente con las proteínas de PUFA sintasa transformadas que quien la proteína o proteínas auxiliares endógenos de las células hospedadoras.
Las proteínas auxiliares se definen en el presente documento como proteínas de las que no se considera que forman parte del sistema de PUFA sintasa núcleo (es decir, no forman parte del propio complejo enzimático de PUFA sintasa) pero que pueden ser necesarias para la producción de PUFA o una producción eficaz de PUFA usando el complejo enzimático de PUFA sintasa de núcleo de la presente invención. Por ejemplo, para producir los PUFA, un sistema de PUFA sintasa debe funcionar con una proteína auxiliar que transfiera un resto de 4'-fosfopanteteinilo desde la coenzima A al dominio o dominios de proteína transportadora de acilo (ACP). Por lo tanto, se puede considerar que un sistema de PUFA sintasa incluye al menos un dominio de 4'-fosfopanteteinil transferasa (PPTasa), o se puede considerar que un dominio de ese tipo es un dominio o proteína auxiliar para el sistema de PUFA sintasa. Las características estructurales y funcionales de las PPTasas se han descrito con detalle, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Estados Unidos N.°s 2002/0194641; 2004/0235127; y 2005/0100995.
Un dominio o proteínas que tenga actividad (función) biológica de 4'-fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) se caracteriza como la enzima que transfiere un resto de 4'-fosfopanteteinilo desde la Coenzima A a la proteína transportadora de acilo (ACP). Esta transferencia a un resto de serina invariable de la ACP activa la forma apo inactiva en la forma holo. En las síntesis tanto de poliquétido como de ácido graso, el grupo fosfopanteteína forma tioésteres con las cadenas de acilo en crecimiento. Las PPTasas son una familia de enzimas que se han caracterizado bien en síntesis de ácido graso, síntesis de poliquétido, y síntesis de péptidos no ribosómicos. Se conocen las secuencias de muchas PPTasas, se han determinado estructuras cristalinas (por ejemplo, Reuter K., et al., EMBO J. 18 (23): 6823-31 (1999)), y el análisis de mutación ha identificado restos de aminoácidos importantes para la actividad (Mofid M.R., et al., Biochemistry 43 (14): 4128-36 (2004)).
Una PPTasa heteróloga que previamente se ha demostrado que reconoce dominios de ACP de Schizochytrium como sustratos es la proteína Het I de la cepa PCC 7120 de Nostoc sp. (denominada anteriormente cepa PCC 7120 de Anabaena sp.). Het I está presente en un grupo de genes en Nostoc conocido por ser responsable de la síntesis de ácidos hidroxi-grasos de cadena larga que son un componente de una capa glico-lipídica presente en heterocistos de ese organismo (Black y Wolk, J. Bacteriol. 176: 2282-2292 (1994); Campbell et al., Arch. Microbiol.
167: 251-258 (1997)). Es probable que Het I active los dominios de ACP de una proteína, Hgl E, presente en ese grupo. Se han descrito secuencias y construcciones que contienen Het I, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0244192.
Otra PPTasa heteróloga que previamente se ha demostrado que reconoce los dominios de ACP de Schizochytrium es Sfp, obtenida a partir de Bacillus subtilis. Sfp se ha caracterizado bien y se usa ampliamente debido a su capacidad para reconocer una amplia gama de sustratos. Basándose en la información de secuencias publicadas (Nakana, et al., Molecular and General Genetics 232: 313-321 (1992)), previamente un vector de expresión se produjo para Sfp por clonación de la región codificante, junto con secuencias de ADN de flanqueo cadena arriba y cadena abajo definidas, en un vector de clonación pACYC-184. Esta construcción codifica una PPTasa funcional como se demuestra mediante su capacidad para ser coexpresada con los Orf de Schizochytrium en E. coli que, en condiciones apropiadas, da como resultado la acumulación de DHA en esas células (véase, la Publicación de Solicitud de Estados Unidos N.° 2004/0235127).
Las células hospedadoras pueden incluir células microbianas; células animales; células vegetales; y células de insecto. Los ejemplos representativos de los predadores apropiados incluyen células bacterianas; bacterias termófilas o mesófilas; bacterias marinas; traustoquítridos; células fúngicas, tales como levadura; células vegetales; células de insecto; y células animales aisladas. Las células hospedadoras pueden ser células no transfectadas o células que ya están transfectadas con al menos otra molécula de ácido nucleico recombinante. Las células hospedadoras también pueden incluir células transgénicas que se han diseñado para expresar una PUFA sintasa. Se considera que la selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas en el presente documento.
Las células hospedadoras incluyen cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales, tal como microorganismos de un género que incluye, pero no se limita a: Thraustochytrium Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium. Las especies dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo las especies anteriores de Ulkenia tales como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), e incluyen Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp., (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp., (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp., (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp., (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky) (At Cc 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATc C 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207). Otros jemplos de microorganismos hospedadores adecuados para modificación genética incluyen, pero no se limitan a, levaduras que incluyen including Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otras levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos filamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las células bacterianas también se pueden usar como hospedadores. Esto incluye Escherichia coli, que puede ser útil en procesos de fermentación. Como alternativa, un hospedador tal como una especie de Lactobacillus o una especie de Bacillus se puede usar como un hospedador.
Las células hospedadoras vegetales incluyen, pero no se limitan a cualquier planta superior, incluyendo plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, y tantas consumibles, incluyendo plantas de cultivo y plantas usadas por sus aceites. Las plantas de este tipo pueden incluir, por ejemplo: canola, sojas, colza, lino, maíz, cártamos, girasoles, y tabaco. Otras plantas incluyen las plantas que se conocen porque producen compuestos usados como agentes farmacéuticos, agentes saborizantes, agentes nutracéuticos, ingredientes alimentarios funcionales, agentes cosméticamente activos, o plantas que se modifican genéticamente para producir estos compuestos/agentes. Por lo tanto, se puede seleccionar cualquier especie vegetal o célula vegetal. Los ejemplos de plantas y células vegetales, y plantas cultivadas u obtenidas a partir de las mismas, incluyen, pero no se limitan a, plantas y células vegetales obtenidas a partir de canola (Brassica rapa L.); variedades de cultivo de canola NQC02CNX12 (ATCC PTA-6011), NQC02CNX21 (ATCC PTA-6644), y NQC02CNX25 (ATCC PTA-6012) así como variedades de cultivo, variedades de cultivo de cría, y partes de plantas obtenidas a partir de variedades de cultivo de canola NQC02CNX12, NQC02CNX21, y NQC02CNX25 (véanse, los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 7.355.100, 7.456.340, y 7.348.473, respectivamente); soja (Glycine max); colza (Brassica spp.); lino/linaza (Linum usitatissimum); maíz (maíz) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girasol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana, de Brasil (Betholettia excelsa); semilla de ricino (Riccinus communis); coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuete (Arachis hypogaea); yoyoba (Simmondsia chinensis); mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); aceite de palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); calabacín (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare); trigo (Traeticum aestivum); y lentejas de agua (Lemnaceae sp.). Las líneas de plantas a partir de estas y otras plantas se pueden producir, seleccionar, u optimizar para un rasgo deseado tal como hubo asociado con, pero que no se limita a, rendimiento de la semilla, resistencia a la fijación en la siembra, aparición, resistencia o tolerancia enfermedades, madurez, nivel de integridad de la planta en estación tardía, altura de la planta, resistencia a la destrucción, facilidad de transformación de la planta, contenido de aceite, o perfil del aceite. Las líneas de plantas se pueden seleccionar a través de cultivo de plantas tales como cultivo de pedigrí, cultivo de de selección recurrente, cultivo intercruzado y retrocruzado, así como métodos tales como reproducción asistida por marcador y labranza. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.348.473.
Las células animales incluyen cualquier célula animal aislada.
La presente invención se refiere a una célula hospedadora que expresa una o más moléculas de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico recombinante, incluyendo vectores, de la invención.
En el presente documento se describe un método para preparar una célula hospedadora recombinante que comprende introducir un vector recombinante en una célula hospedadora.
Las células hospedadoras se pueden modificar modificar por ingeniería genética (transducir o transformar o transfectar) con los vectores de la presente invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector se puede encontrar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. El vector que contiene una secuencia de polinucleótidos como se describe en el presente documento, así como un promotor o secuencia de control apropiados, se puede usar para transformar un hospedador apropiado para permitir la expresión del polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótidos. La modificación genética en células hospedadoras también por incluir la optimización de genes para uso de codón de hospedador preferente u óptimo.
Las células hospedadoras modificadas por ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados y para apropiado para la activación de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las que se han usado previamente con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y sean evidentes para una persona con una experiencia habitual en la materia.
En el presente documento se describe la modificación genética de una planta o parte de una planta para expresar un sistema de PUFA sintasa que se describe en el presente documento, que incluye al menos el complejo enzimático de PUFA sintasa de núcleo. Una "parte de una planta" o "parte de planta", se define en el presente documento incluye cualquier parte de una planta, tal como, pero no se limita a, semillas (inmaduras o maduras), aceites, polen, embriones, flores, frutos, brotes, hojas, raíces, yemas, explantes, etc. Como se describe en el presente documento, la planta o parte de una planta modificada genéticamente produce uno o más PUFA, tales como EPA, DHA, DPA (n-3 o n-6), ARA, GLA, s Da , otros PUFA, y combinaciones de los mismos. No se sabe si las plantas contienen de manera endógena un sistema de PUFA sintasa; por lo tanto, los sistemas de PUFA sintasa de la presente invención se pueden usar para modificar por ingeniería plantas con capacidades públicas de producción de ácido graso. Como se describe en el presente documento, la planta o parte de una planta además se modifica genéticamente para expresar al menos una proteína auxiliar de PUFA sintasa, (por ejemplo, una PPTasa). Como se describe en el presente documento, la planta es una planta con semillas oleaginosas, en la que las semillas oleaginosas, y/o y la aceite en las semillas oleaginosas, contienen los PUFA producidos por el sistema de PUFA sintasa. Como se describe en el presente documento, las plantas modificadas genéticamente, partes de plantas, semillas oleaginosas, y/o aceites en las semillas oleaginosas contienen una cantidad detectable de al menos un PUFA que es el producto del sistema de PUFA sintasa. Como se describe en el presente documento, tales plantas, partes de plantas, semillas oleaginosas, y/o aceites en las semillas oleaginosas pueden estar sustancialmente libres de productos intermedios o secundarios que no son los productos primarios de PUFA del sistema de PUFA sintasa introducido y que no se produce una naturaleza por el sistema de FAS endógeno en las plantas de tipo silvestre. Aunque las plantas de tipo silvestre producen algunos PUFA de cadena corta o media de tipo silvestre, tales como los PUFA de 18 carbonos a través del sistema de FAS, se producirán PUFA nuevos o adicionales en la planta, partes de plantas, semillas oleaginosas, y/o aceites en las semillas oleaginosas como resultado de la modificación genética con un sistema de PUFA sintasa que se describe en el presente documento.
La modificación genética de una planta se puede realizar usando desarrollo de cepas y/o técnicas de genética molecular clásicos. Véase, Publicación de Solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0244192. En la técnica se conocen métodos para producir una planta transgénica, en la que una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos deseada se incorpora en el genoma de la planta. Por ejemplo, se pueden usar vectores virales para producir plantas transgénicas, tal como mediante transformación de una planta monocotiledónea con un vector viral usando los métodos descritos en los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.569.597; 5.589.367; y 5.316.931. En la técnica tamil se conocen métodos para la ingeniería genética o modificación de plantas mediante transformación, incluyendo protocolos de transformación biológica y física. Véase, por ejemplo, B.L. Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA in Plants, en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 67-88 (Glick, B. R. y Thompson, J. E. eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993). Además, hay disponibilidad de vectores y métodos de cultivo in vitro para transformación de células o tejidos vegetales y regeneración de plantas. Véase, por ejemplo, M. Y. Gruber et al., Vectors for Plant Transformation, en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 89-119 (Glick, B. R. y Thompson, J. E. eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993).
Un método ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227: 1229 (1985) y el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.051.757. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas vegetales que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, por genes responsables de la transformación genética de la planta. Véase, por ejemplo, Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 (1991). Las descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para transferencia genética mediada por Agrobacterium se proporcionan en numerosas referencias, incluyendo Gruber et al., mencionado anteriormente; Mild et al., mencionado anteriormente; Moloney et al., Plant Cell Reports 8: 238 (1989); los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.177.010; 5.104.310; 5.149.645; 5.469.976; 5.464.763; 4.940.838; 4.693.976; 5.591.616; 5.231,019; 5.463.174; 4.762.785; 5.004.863; y 5.159.135; y las Solicitudes de Patente Europea N.°s 0131624, 120516, 159418, 176112, 116718, 290799, 320500, 604662, 627752, 0267159, y 0292435.
Otros métodos de transformación de plantas incluyen transformación mediada por microproyectil, en la que el ADN se conserva en la superficie de los microproyectiles. El vector de expresión se introduce en tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles a velocidades suficientes para penetrar las paredes y membranas de las células vegetales. Véase, por ejemplo, Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992), y los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.015.580 y 5.322.783. También se describen técnicas para acelerar el material genético revestido sobre micropartículas dirigidas en células, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 4.945.050 y 5.141.141. Otro método para administración física de ADN a plantas es la sonicación de células diana. Véase, por ejemplo, Zhang et al., Bio/Technology 9: 996 (1991). Como alternativa, para introducir vectores de expresión en plantas se ha usado fusión de liposomas o esferoplastos. Véase, por ejemplo, Deshayes et al., EMBO J., 4: 2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84: 3962 (1987). La absorción directa de ADN en protoplastos usando precipitación de CaCl2, inyección de ADN, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina también se informado. Véase, por ejemplo, Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982). También se ha descrito la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Véase, por ejemplo, Donn et al., en Abstracts of VlIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992); Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24: 51-61 (1994); Publicaciones de Solicitud Internacional N.°s WO 87/06614, WO 92/09696, y WO 93/21335; y en los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.472.869 y 5.384.253. Otra tecnología de transformación incluye tecnología de partículas, véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.302,523 y 5.464.765.
Los cloroplastos o plástidos también se pueden transformar directamente. Como tal, se pueden producir plantas recombinantes en las que solamente se ha modificado el ADN de cloroplasto o plástido con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico y moléculas de ácido nucleico recombinante descritas anteriormente así como combinaciones de las mismas. En la técnica se conocen promotores que funcionan en cloroplastos o plástidos. Véase, por ejemplo, Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12: 67-70 (1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en las que se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 5.693.507 y 5.451.513.
También se puede usar cualquier otro método que proporcione una transformación eficaz.
En la técnica se conocen vectores adecuados para su uso en transformación de plantas. Véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.°s 6.495.738; 7.271.315; 7, 348,473; 7.355.100; 7.456.340; y referencias desveladas en los mismos.
Los vectores de expresión pueden incluir al menos un marcador genético, unido de forma operativa a un elemento regulador (un promotor, por ejemplo) que permite que las células transformadas que contienen el marcador se recuperen mediante selección negativa, es decir, que inhiben el crecimiento de las células que lo contienen el gen marcador seleccionable, o mediante selección positiva, es decir, identificando sistemáticamente el producto codificado por el marcador genético. Muchos genes marcadores seleccionables usados comúnmente para transformación de plantas se conocen bien en las técnicas de transformación, e incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas que detoxifican por vía metabólica un agente químico selectivo que puede ser un antibiótico o un herbicida, o genes que codifican una diana alterada que es insensible al inhibidor. Los marcadores seleccionables adecuados para su uso en transformación de plantas incluyen, pero no se limitan a, el gen de aminoglicósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph II) que codifican resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina, y G418, así como esos genes que codifican resistencia o tolerancia a herbicidas glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialophos), imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina, tales como clorsulfurón, bromoxinilo, dalapón, y similares. Un gen marcador seleccionable usado comúnmente para transformación de plantas es el gen de neomicina fosfotransferasa II (nptII) bajo el control de señales reguladoras de plantas que confiere resistencia a la kanamicina. Véase, por ejemplo, Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Otro gen de marcador seleccionable usado comúnmente es el gen de higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Véase, por ejemplo, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985). Los genes de marcador seleccionable adicionales de origen bacteriano que confieren resistencia a antibióticos incluyen gentamicin acetil transferasa, estreptomicina fosfotransferasa, aminoglicósido-3'-adenil transferasa, y el determinante de resistencia a bleomicina. Véase, por ejemplo, Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986). Otros genes de marcador seleccionables confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato, glufosinato, o bromoxinilo. Véase, por ejemplo, Comai et al., Nature 317: 741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) y Stalker et al., Science 242: 419-423 (1988). Otros genes de marcador seleccionables para transformación de plantas no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa vegetal y acetolactato sintasa vegetal. Véase, por ejemplo, Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet.
13: 67 (1987), Shah et al., Science 233: 478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).
Un gen indicador se puede usar con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que por lo general no están presentes en el organismo tejido del receptor y por lo general codifican proteínas que dan como resultado algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Véase, por ejemplo, K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22: 421 (1988). Los genes indicadores incluyen, pero no se limitan a genes de beta-glucuronidasa (GUS), betagalactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, proteína fluorescente de color verde, y luciferasa. Véase, por ejemplo, Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84: 131 (1987), DeBlock et al., EMBO J. 3: 1681 (1984), y Chalfie et al., Science 263: 802 (1994). Un ensayo para detectar la expresión de genes indicadores se puede realizar en un momento adecuado después de haber introducido el gen en células receptoras. Uno de tales ensayos implica el uso de la beta-glucuronidasa codificante genética (GUS) del locus uidA de E. coli como se describe en Jefferson et al., Biochem. Soc. Trans. 15: 17-19 (1987).
Los elementos reguladores del promotor de una diversidad de fuentes se pueden usar de manera eficaz en células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, se pueden usar elementos reguladores del promotor de origen bacteriano, tales como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa, así como promotores de origen viral, tales como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un promotor 35S reestructurado mediante ingeniería, véase la Publicación de Solicitud Internacional WO 97/13402). Los elementos reguladores del promotor de vegetales incluyen, pero no se limitan a, ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP) subunidad pequeña de carboxilasa (ssu), promotor de beta-conglicinina, promotor de betafaseolina, promotor de ADH, promotores de choque térmico y promotores específicos de tejidos. Para mejorar la eficacia de la transcripción o la integración de ADN también se pueden usar regiones de unión a matriz, regiones de unión de armazón, intrones, potenciadores, y secuencias de poliadenilación. Los elementos de este tipo se pueden incluir para obtener un rendimiento óptimo del ADN transformado en la planta. Los elementos habituales incluyen, pero no se limitan a, Adh-intrón 1, Adh-intrón 6, la secuencia líder de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa, la secuencia líder de la proteína de la cubierta del virus de la raíz de maíz, así como otras secuencias disponibles para un experto en la materia. También se pueden usar elementos reguladores del promotor constitutivo para dirigir la expresión genética continua. Los promotores constitutivos incluyen, pero no se limitan a, promotores de virus de plantas tales como el promotor 35S de CaMV (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)), y promotores de tales genes tales como actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)), ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12: 619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992)), pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588 (1991)), MAS (Velten et al., EMBO J. 3: 2723-2730 (1984)), histona H3 de maíz (Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231: 276-285 (1992) y Atanassova et al., Plant Journal 2(3): 291-300 (1992)), y el promotor de ALS, fragmento en la posición 5' de XbaI/NcoI con respecto al gen estructural ALS3 de Brassica napus (o una secuencia de nucleótidos similar a la del fragmento XbaI/NcoI) (Publicación de Solicitud Internacional N.° WO 96/30530). Para la expresión genética en tipos específicos de células o tejidos también se pueden usar elementos reguladores del promotor específico de tejidos, tales como hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina, y similares). Los promotores específicos de tejidos o preferentes para tejidos incluyen, pero no se limitan a, un promotor preferente de raíz, tal como del gen de faseolina (Murai et al., Science 23: 476-482 (1983) y Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3320-3324 (1985)); un promotor específico de la hoja e inducido por la luz, tal como de repollo o rubisco (Simpson et al., EMBO J. 4 (11): 2723-2729 (1985) y Timko et al., Nature 318: 579-582 (1985)); un promotor específico de la antera tal como de LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217: 240-245 (1989)); un promotor específico del polen tal como de Zm13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244: 161-168 (1993)); o un promotor preferente de microesporas tal como de apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6: 217-224 (1993)). Los elementos reguladores del promotor también pueden estar activos durante una cierta etapa del desarrollo de las plantas, así como tejidos y órganos de las plantas, que incluyen, pero no se limitan a, elementos reguladores del promotor específicos de polen, específicos de embrión, específicos de la seda de maíz, específicos de la fibra de algodón, específicos de la raíz, y específicos de de endospermo de semilla. Se puede usar un elemento regulador promotor inducible, que es responsable de la expresión de genes a una respuesta a una señal específica, tales como: estímulo físico (genes de choque térmico); luz (RUBP carboxilasa); hormona (Em); metabolitos; agentes químicos; y estrés. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor del sistema ACEI que responde al cobre (Mett et al., PNAS 90: 4567-4571 (1993)); del gen In2 del maíz que responde a fitoprotectores herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227: 229-237 (1991) y Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)), del represor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)); y de un gen de hormona esteroidea, cuya actividad de transcripción está inducida por una hormona glucocorticosteroidea (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 0421 (1991).
Para dirigir un polipéptido a cualquiera de un orgánulo intracelular o compartimento subcelular o para secreción del apoplasto también se pueden usar secuencias señal. Véase, por ejemplo, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20: 49 (1992), Knox, C., et al., Plant Mol. Biol. 9: 3-17 (1987), Lerner et al., Plant Physiol. 91: 124-129 (1989), Fontes et al., Plant Cell 3: 483-496 (1991), Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 834 (1991), Gould et al., J. Cell. Biol. 108: 1657 (1989), Creissen et al., Plant J. 2: 129 (1991), Kalderon, et al., Cell 39: 499-509 (1984), y Steifel et al., Plant Cell 2: 785-793 (1990). Las secuencias de dirección de este tipo proporcionan la proteína expresada deseada a transferir a la estructura celular en la que funciona de la manera más eficaz o a áreas de la célula en las que se concentran los procesos celulares necesarios para las funciones fenotípicas deseadas.
Como se describe en el presente documento, se usan secuencias señal para dirigir proteínas de la invención a un compartimento subcelular, por ejemplo, al plástido o cloroplasto. Los productos genéticos, incluyendo productos genéticos heterólogos, se pueden dirigir al plástido o cloroplasto fusionando el producto genético con una secuencia señal que se extiende durante la importación de cloroplasto proporcionando la proteína madura. Véase, por ejemplo, Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988) y van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985). El ADN que codifican secuencias señal apropiadas se puede aislar de los ADNc que codifican la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima EPSP sintasa, la proteína GS2, o de cualquier proteína dirigida a cloroplasto de origen natural que contenga una secuencia señal (también denominado péptido de tránsito de cloroplasto (CTP)) que dirige la proteína dirigida a cloroplasto. Las proteínas dirigidas a cloroplasto de este tipo se conocen bien en la técnica. Las proteínas dirigidas a cloroplasto se sintetizan como proteínas precursoras más grandes que contienen un CTP amino-terminal, que dirige el precursor a la maquinaria de importación de cloroplasto. Por lo general, los CTP se escinden con endoproteasas específicas situadas dentro del orgánulo del cloroplasto, liberando de ese modo la proteína madura dirigida, incluyendo proteínas activas tales como enzimas, del precursor en el medio del cloroplasto. Los ejemplos de secuencias que codifican péptidos adecuados para dirigir un gen o producto genético al cloroplasto o plástido o de la célula vegetal incluyen el CTP de EPSPS de petunia, el CTP2 e intrón de EPSPS de Arabidopsis, y otras secuencias conocidas en la técnica. Los ejemplos específicos de CTP incluyen, pero no se limitan a, el péptido de tránsito de ats1A de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato de Arabidopsis thaliana, un péptido de tránsito de EPSPS de Arabidopsis thaliana, y un péptido de tránsito de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de maíz Zea. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, en Van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985). Las secuencias de señal procariotas y eucariotas se desvelan, por ejemplo, en Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. 36: 425 (1982). Los ejemplos adicionales de péptidos de tránsito que se pueden usar en la invención incluyen péptidos de tránsito de cloroplasto descritos en Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep.
9: 104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988); Chen y Jagendorf, J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993); un péptido de tránsito del gen rbcS de Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)); y un péptido de tránsito obtenido a partir de acil-ACP tioesterasa de Brassica napus (Loader et al., Plant Mol. Biol. 23: 769-778 (1993); Loader et al., Plant Physiol. 110: 336-336 (1995).
Las plantas modificadas genéticamente se prevén modificar adicionalmente para producir deleción o inactiva una ácido grasa sintasa endógena, para reducir la competición endógena con el sistema de PUFA sintasa exógena para malonil CoA, para aumentar el nivel de malonil CoA en el organismo, y combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0245431.
Una planta modificada genéticamente se puede cultivar en un medio de fermentación o puede crecer en un medio de adecuado tal como el suelo. Un medio de crecimiento adecuado para plantas superiores f incluye cualquier medio de crecimiento para plantas, tal como, pero no se limita a, suelo, arena, cualquier otro medio de partículas que soporten el crecimiento de la raíz (por ejemplo, vermiculita, perlita, etc.) o cultivo hidropónico así como luz, agua, y suplementos nutricionales adecuados que optimicen el crecimiento de la planta superior. Los PUFA se pueden recuperar de las plantas modificadas genéticamente a través de procesos de purificación que extraen los compuestos de la planta. Los PUFA se pueden recuperar cosechando la planta así como cosechando la aceite de la planta (por ejemplo, de las semillas oleaginosas). La planta también se puede consumir en su estado natural o procesar adicionalmente en productos consumibles. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una planta modificada genéticamente, en la que la planta produce al menos un PUFA como resultado de la modificación genética, y en la que el perfil de ácido graso total en la planta, o la parte de la planta que acumula los PUFA, comprende la cantidad detectable del PUFA producido como resultado de la modificación genética de la planta. En algunas divulgaciones, la planta es una planta de semillas oleaginosas. En algunas divulgaciones, la planta de semillas oleaginosas produce los PUFA en sus semillas maduras o contiene los PUFA en el aceite de sus semillas.
Para expresar proteína recombinante también se pueden usar diversos sistemas de cultivo de células de mamífero. Los vectores de expresión comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y receptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo en la posición 5'.
Métodos que implican expresión heteróloga
La presente invención se refiere a un método para producir al menos un PUFA que comprende la expresión de un sistema de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir PUFA, en el que el sistema de PUFA sintasa comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas, en el que se produce al menos un PUFA. En algunas realizaciones, el al menos un PUFA incluye DHA, EPA, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula vegetal, una célula animal aislada, o una célula microbiana. En algunas realizaciones la célula hospedadora es un traustoquítrido.
La presente invención se refiere a un método para producir lípidos enriquecidos con DHA, EPA, o una combinación de los mismos, que comprende expresar un gen de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, en el que el gen de PUFA sintasa comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en la célula hospedadora, en el que se producen lípidos enriquecidos con DHA, EPA, o una combinación de los mismos.
La invención se refiere a un método para aislar lípidos a partir de una célula hospedadora, que comprende expresar un gen de PUFA sintasa en la célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, y aislar lípidos a partir de la célula hospedadora, en el que el sistema de PUFA sintasa en la célula hospedadora comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, una o más fracciones lipídicas que contienen los PUFA se aíslan de las células hospedadoras. En algunas realizaciones, la una o más fracciones aisladas de la célula hospedadora incluyen la fracción total de ácido graso, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicérido, la fracción de ácido graso libre, la fracción de esterol, la fracción de diglicerol, la fracción de fosfolípido, o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los PUFA se aíslan de las células hospedadoras, en las que los PUFA están enriquecidos con ácidos grasos omega-3 ácidos, grasos omega-6, o combinaciones de los mismos basándose en la composición del sistema de PUFA sintasa introducido en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, dos PUFA están enriquecidos con DHA, EPA, DPA n-6, ARA, o combinaciones de los mismos basándose en la composición del sistema de PUFA sintasa introducido en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, los PUFA están enriquecidos con DHA, EPA, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de DHA y concentraciones más bajas de EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de DHA y EPA, y concentraciones más bajas de ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de EPA y concentraciones más bajas de DHA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos.
Se divulga un método para reemplazar una actividad de PUFA sintasa inactiva o con deleción, introducir una nueva actividad de PUFA sintasa, o mejorar una actividad de PUFA sintasa existente en un organismo que tiene actividad de PUFA sintasa, que comprende la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en el organismo en condiciones eficaces para expresar la actividad de PUFA sintasa. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una o más secuencias de polinucleótido de PUFA sintasa de PFA3 descritas en el presente documento que codifican uno o más dominios de PUFA sintasa. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA de los organismos se alteran mediante la introducción de la una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA alterados incluyen un aumento de ácidos grasos omega-3 y una disminución de ácidos grasos omega-6. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA alterados incluyen un aumento de ácidos grasos omega-6 y una disminución de ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, los ácidos grasos tanto omega-3 como omega-6 aumentan. En algunas realizaciones, la cantidad de DHA aumenta mientras que las cantidades de uno o más de t EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, las cantidades de EPA y DHA aumentan mientras que las cantidades de ARA, DPA n-6, o una combinación de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, la cantidad de EPA aumenta mientras que las cantidades de uno o más de EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de PFA3 o uno o más dominios en la misma. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de PFA3 o uno o más dominios en la misma y la cantidad de ácidos grasos omega-3 en el organismo aumenta mientras que la cantidad de ácidos grasos omega-6 disminuye.
La invención se refiere a métodos para aumentar la producción de DHA en un organismo que tiene actividad de PUFA sintasa, que comprende la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en el organismo en condiciones eficaces para producir DHA, EPA, o una combinación de los mismos, en los que la producción de DHA en el organismo aumenta.
Por lo general habiendo descrito la presente invención, se puede obtener una comprensión adicional por referencia a los ejemplos que se proporcionan en el presente documento. Estos ejemplos son solo para fines de ilustración y no pretenden ser limitantes.
EJEMPLO 1
Se diseñaron cebadores degenerados para los dominios de KS y DH de PUFA sintasa para aislar las secuencias correspondientes a partir del microorganismo aislado depositado con el N.° PTA-9695 de Registro en la ATCC, también conocido como cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
Se diseñaron cebadores degenerados para la región de KS de f PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (es decir, la región que contiene el dominio de KS) basándose en las secuencias publicadas de PFA1 (denominadas previamente orfA u ORF 1) para Shewanella japónica, la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), y ATCC 20892 de Thraustochytrium sp. 23B: prDS173 (directo): GATCTACTGCAAGCGCGGNGGNTTYAT (SEQ ID NO: 62), y
prDS174 (inverso): GGCGCAGGCGGCRTCNACNAC (SEQ ID NO: 63).
Se diseñaron cebadores degenerados para la región de DH de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (denominado previamente orfC u ORF 3) basándose en las secuencias publicadas para Moritella marina; la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.; SCRC-2738 de Shewanella sp.; Photobacterprofundum; y23B ATCC 20892 de Thraustochytrium sp.:
JGM190 (directo): CAYTGGTAYTTYCCNTGYCAYTT (SEQ ID NO: 64); y
BLR242 (inverso): CCNGGCATNACNGGRTC (SEQ ID NO: 65).
Las condiciones de PCR con molde de ADN cromosómico fueron las que siguen a continuación: dNTPs 0,2 pM, 0,1 uM cada cebador, DMSO al 8 %, 200 ng de ADN cromosómico, 2,5 U de polimerasa de fusión Herculase® II (Stratagene), y 1X de tampón Herculase® (Stratagene) en un volumen total de 50 pl. El Protocolo de PCR incluía las siguientes etapas: (1) 98 °C durante 3 minutos; (2) 98 °C durante 30 segundos; (3) 50 °C durante 30 segundos; (4) 72 °C durante 2 minutos; (5) etapas 2-4 repetidas durante 40 ciclos; (6) 72 °C durante 5 minutos; y (7) se mantiene a 6 °C.
Para ambos pares de cebadores, la PCR proporcionó productos de ADN distintos con los tamaños esperados usando moldes cromosómicos a partir de la cepa de Schizochytrium sp., con N.° PTA-9695 de Registro en la ATCC. Los respectivos productos de PCR se clonaron en el vector pjET 12/blunt (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la secuencia del inserto se determinó usando cebadores convencionales suministrados.
Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los productos de PCR se compararon consecuencias conocidas disponibles a partir del GenBank de NCBI en una búsqueda de BLASTx convencional (parámetros de BLASTx: Filtro de baja complejidad activado; Matriz: BLOSUM62; Coste de hueco; Existence 11, Extenstion1. Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), " Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.).
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos deducida obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de KS de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad A de ácido graso poliinsaturado sintasa" (Identidad = 87 %; positivos = 92 %); Shewanella oneidensis MR-1 "beta-cetoacil sintasa de múltiples dominios" (Identidad = 49 %; positivos = 64 %); y Shewanella sp. MR-4 "beta-cetoacil sintasa" (Identidad = 49 %; positivos = 64 %).
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos deducida obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de DH de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad C de ácido graso poliinsaturado sintasa " (Identidad = 61 %; positivos = 71 %); cepa 700345 de la ATCC de Shewanella pealeana "Beta-hidroxiacil-(proteína transportadora de acilo) deshidratasa FabA/FabZ" (Identidad = 35 %; positivos = 50 %); y Shewanella sedimines HAW-EB3 "PfaC de ácido graso poliinsaturado sintasa omega-3" (Identidad = 34 %; positivos = 50 %).
EJEMPLO 2
Los genes de PUFA sintasa se identificaron a partir de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El ADN genómico se preparó a partir del microorganismo mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. En resumen: (1) se sedimentaron 500 pl de células a partir del cultivo de logaritmo medio. Las células se volvieron a centrifugar, y todas las trazas de líquido se retiraron del sedimento celular con una punta de calibre pequeño; (2) los sedimentos se volvieron a suspender con 200 pl de tampón de lisis (Tris 20 mM a pH 8,0, 125 pg/ml de Proteínas K, NaCI 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8,0, SDS al 0,5 %); (3) las células se lisaron a 50 °C durante 1 hora; (4) la mezcla de lisis se pipeteó en tubos de 2 ml de gel en fase de bloqueo (PLG -Eppendorf); (5) se añadió un volumen igual de P:C:I y se permitió la mezcla durante 1,5 horas; (6) los tubos se centrifugaron a 12k x g durante 5 minutos; (7) la fase acuosa se retiró del gel mencionado anteriormente dentro del tubo de PLG y se añadió un volumen igual de cloroformo a la fase acuosa, y se mezcló durante 30 minutos; (8) los tubos centrifugaron a 14k durante aproximadamente 5 minutos; (9) la fase superior (fase acuosa) se retiró mediante pipeteo del cloroformo, y se colocó en un nuevo tubo; (10) se añadieron 0,1 volúmenes de NaOAC 3 M se y se mezcló (se invirtió varias veces); (11) se añadieron 2 volúmenes de EtOH al 100 % y se mezcló (se invirtió varias veces) con precipitante de ADN genómico formándose en esta etapa; (12) los tubos se centrifugaron a 4 °C en una microcentrifugadora a 14k durante aproximadamente 15 minutos; (13) el líquido se vertió suavemente con el ADN genómico restante en el fondo del tubo; (14) del sedimento se lavó con 0,5 ml de EtOH al 70 %; (15) los tubos centrifugaron a 4 °C en una microcentrifugadora a 14k durante aproximadamente 5 minutos; (16) el EtOH se vertió suavemente y el sedimento de ADN genómico se secó; y (17) se añadió un volumen adecuado de H2O y RNasa directamente al sedimento de ADN genómico.
El ADN genómico aislado se usó para generar bibliotecas recombinantes que consisten en fragmentos grandes (de aproximadamente 40 kB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en el pWEB-TNC™ cósmido (Epicentre). Las bibliotecas de cósmidos se identificaron sistemáticamente mediante procedimientos de hibridación de colonias convencionales usando sondas etiquetadas radiactivamente con 32P (Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Las sondas contenían ADN homólogo a las secuencias de PUFA sintasa publicadas de otros organismos como se describe en el Ejemplo 1. Estas sondas se generaron mediante una digestión de restricción de ADN de los fragmentos clonados a partir de los respectivos clones de pJET1.2/blunt descritos anteriormente y se etiquetaron con métodos convencionales. En todos los casos, la fuerte hibridación de las sondas individuales para ciertos cósmidos indicaban clones que contenían ADN homólogo a los genes de PUFA sintasa.
El clon pDS115 cósmido demostraba una fuerte hibridación de la sonda a la región de KS y se seleccionó para secuenciación de ADN del gen de PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. El clon pDS115 cósmido, que contenía los genes de PFA1 y PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 27 de enero de 2009, y se le dio el N.° PTA-9737de Registro en la ATCC. Se diseñaron cebadores de secuenciación para la secuencia de ADN de la región de KS determinada en el Ejemplo 1 usando métodos convencionales. Para determinar la secuencia de ADN de PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se realizaron rondas sucesivas de secuenciación de ADN, que implicaban el posterior diseño de cebador de secuenciación con métodos convencionales, para "acompañar" al clon cósmido.
En los sistemas de PUFA sintasa de traustoquítrido publicados previamente, los genes de PFA1 y PFA2 de PUFA sintasa se agruparon en conjunto y se colocaron para que se transcribieran de manera divergente. Este también es el caso para p FA1 y PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. A través del "acompañamiento" de la secuencia de ADN del clon cósmido pDS115, se encontró que el inicio conceptual de PFA2 tenía 493 nucleótidos desde el inicio de PFA1 y se transcribía de manera divergente. Cada par de bases de nucleótidos de los genes de PUFA sintasa de PFA1 y PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se cubrieron con al menos dos reacciones de secuenciación de ADN separadas con alta calidad con al menos una puntuación Phred mínima agregada de 40 (nivel de confianza de un 99,99 %).
El clon pBS4 cósmido demostraba una fuerte hibridación de la sonda a la región de DH y se seleccionó para secuenciación de ADN del gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. El clon pBS4 cósmido, que contiene el gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 27 de enero de 2009, y se le dio el N.° de Registro en la ATCC PTA-9736. Se diseñaron cebadores de secuenciación usando métodos convencionales para la secuencia de ADN de la región de DH determinada en el Ejemplo 1. Para determinar la secuencia de ADN de el gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se realizaron rondas sucesivas de secuenciación de ADN, que implicaban el posterior diseño de cebador de secuenciación con métodos convencionales, para "acompañar" al clon cósmido. Cada par de bases de nucleótidos de el gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. se cubrió con al menos dos reacciones de secuenciación de ADN separadas de alta calidad con al menos una puntuación Phred mínima agregada de 40 (nivel de confianza de un 99,99 %).
La Tabla 1 muestra identidades para las secuencias de polinucleótidos de PFA1 (SEQ ID NO: 1), PFA2 (SEQ ID NO: 3), y PFA3 (SEQ ID NO: 5) de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en comparación con secuencias publicadas previamente. Las identidades se determinaron con la matriz de puntuación "swgapdnamt" dentro del programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de ADN.
Tabla 1: Porcentaje de Identidad para Secuencias de Polinucleótidos de PFA1, PFA2, y PFA3
Figure imgf000024_0001
La Tabla 2 muestra identidades para las secuencias de aminoácidos de Pfalp (SEQ ID NO: 2), Pfa2p (SEQ ID NO: 4), y Pfa3p (SEQ ID NO: 6) de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en comparación con secuencias de aminoácidos de PUFA sintasa publicadas previamente. Las identidades se determinaron a través del uso de la matriz de puntuación "blosum62mt2" dentro del programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de proteínas.
T l 2: P r n I ni r n i Amin i Pf 1 Pf 2 Pf
Figure imgf000024_0002
EJEMPLO 3
El análisis de dominios se realizó para anotar las coordenadas de la secuencia para los dominios de PUFA sintasa y sitios activos de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., respectivamente. Los dominios identificaron basándose en homología con respecto a dominios conocidos de PUFA sintasa, ácido graso sintasa, y policéptido sintasa.
La Tabla 3 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
T l : An li i D mini PFA1 l PTA- l AT hiz h ri m .
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El primer dominio en Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., es un dominio de KS. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de KS de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 7, que corresponde a las posiciones 7-1401 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KS de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 8, que corresponde a las posiciones 3-467 de SEQ ID NO: 2. El dominio de KS contiene un motivo de sitio activo: DxAC* (s Eq ID NO: 43), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a C203 de SEQ ID NO: 2. Además, un motivo característico está presente en el extremo del dominio de KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), que corresponde a las posiciones 455-458 de SEQ ID NO: 2 y a las posiciones 453-456 de SEQ ID NO: 8.
El segundo dominio en Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., es un dominio MAT. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio MAT de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 9, que corresponde a las posiciones 1798-2700 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio MAT de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 10, que corresponde a las posiciones 600-900 de SEQ ID NO: 2. El dominio MAT contiene un motivo de sitio activo: GHS*XG (SeQ ID NO: 46), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a S699 de SEQ ID NO: 2.
Los dominios tercero a octavo de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., son seis dominios de ACP en tándem, también denominados ACp 1, ACP2, ACP3, ACP4, ACP5, y ACP6 en el presente documento. La secuencia de nucleótidos que contiene el primer dominio de ACP, ACP1, en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 13 y está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 3325 a aproximadamente la posición 3600 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP1, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 14, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1109 a aproximadamente la posición 1200 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP2, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 15, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 3667 a aproximadamente la posición 3942 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP2, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 16, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1223 a aproximadamente la posición 1314 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP3, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 17, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4015 a aproximadamente la posición 4290 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP3, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 18, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1339 a aproximadamente la posición 1430 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP4, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 19, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4363 a aproximadamente la posición 4638 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP4, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 20, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1455 a aproximadamente la posición 1546 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP5, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 21, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4711 a aproximadamente la posición 4986 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP5, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 22, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1571 a aproximadamente la posición 1662 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP6, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 23, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 5053 a aproximadamente la posición 5328 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP6, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 24, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1685 a aproximadamente la posición 1776 de SEQ ID NO: 2. Los seis dominios de ACP en conjunto se extienden a una región de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., desde aproximadamente la posición 3298 a aproximadamente la posición 5400 de SEQ ID NO: 1, que corresponde a posiciones del aminoácido de aproximadamente 1100 a aproximadamente 1800 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos para toda la región de ACP que contiene los seis dominios en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 11; mientras que la secuencia de aminoácidos para toda la región de ACP que contiene los seis dominios en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 12. Se encontró que el intervalo de repetición para los seis dominios de ACP dentro de SEQ ID NO: 11 se producía a aproximadamente cada 342 nucleótidos (el número real de aminoácidos medido entre serinas de sitio activo adyacentes varía de 114 a 116 aminoácidos). Cada uno de los seis dominios de ACP contiene un motivo de unión a panteteína LGIDS* (SEQ ID NO: 47) en el que S* es la serina de sitio de unión a panteteína (S). La serina de sitio de unión a panteteína (S) está situada cerca del centro de cada secuencia del dominio de ACP. Las posiciones de los restos de serina de sitio activo (es decir, el sitio de unión a panteteína) para cada uno de los seis dominios de ACPD, con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 son: ACP1 = S1152, ACP2 = S1266, ACP3 = S1382, ACP4 = S1498, ACP5 = S1614, y ACP6 = S1728.
El noveno dominio en Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., es un dominio KR. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio KR de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 25, que corresponde a las posiciones 5623-7800 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio KR de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 26, que corresponde a las posiciones 1875-2600 de SEQ ID NO: 2. Dentro del dominio KR se encuentra una región de núcleo (contenida dentro de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 48, y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49) con homología con respecto a las aldehído-deshidrogenasas de cadena corta (KR es un miembro de esta familia). Esta región de núcleo se extiende desde aproximadamente la posición 5998 a aproximadamente 6900 de SEQ ID NO: 1, que corresponde las posiciones de los aminoácidos 2000-2300 de SEQ ID NO: 2.
El décimo dominio en Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., es un dominio de DH. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 27, que corresponde a las posiciones 7027-7065 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH de Pfa1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 28, que corresponde a las posiciones 2343-2355 de SEQ ID NO: 2. El dominio de DH contiene un motivo de sitio activo conservado (Véase, Donadio, S. y Katz., L., Gene 111 (1): 51-60 (1992)): LxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO: 50).
La Tabla 4 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
T l 4: An li i D mini PFA2 l PTA- l AT hiz h ri m .
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El primer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., es un dominio de KS. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de KS de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 29, que corresponde a las posiciones 10-1350 de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KS de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 30, que corresponde a las posiciones 4-450 de SEQ ID NO: 4. El dominio de KS contiene un motivo de sitio activo: DXAC* (s Eq ID NO: 43), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a C191 de SEQ ID NO: 4. Además, un motivo característico está presente en el extremo del dominio de KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), que corresponde a las posiciones 438-441 de SEQ ID NO: 4 y a las posiciones 435-438 de SEQ ID NO: 30.
El tercer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. es un dominio de CLF. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de CLF Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 31, que corresponde a las posiciones 1408-2700 de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de CLF Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 32, que corresponde a las posiciones 470-900 de SEQ ID NO: 4.
El tercer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. es un dominio de AT. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 33, que corresponde a las posiciones 2998-4200 de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 34, que corresponde a las posiciones 1000-1400 de SEQ ID NO: 4. El dominio de AT contiene un motivo de sitio activo de GxS*xG (SEQ ID NO: 52) es característico de proteínas aciltransferasa (AT), con un resto de serina de sitio activo que corresponde a S1141 de SEQ ID NO: 4.
El cuarto dominio de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. es un dominio de ER. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de ER de Pfa2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 35, que corresponde a las posiciones 4498-5700 de SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de ER de Pfa2 en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 36, que corresponde a las posiciones 1500-1900 de SEQ ID NO: 4.
La Tabla 5 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.
T l : An li i D mini PFA l PTA- ^ l AT hiz h ri m .
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El primer y segundo dominios de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., son dominios de DH, denominados DH1 y DH2 en el presente documento, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH1 de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 37, que corresponde a las posiciones 1-1350 de SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH1 de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 38, que corresponde a las posiciones 1-450 de SEQ ID NO: 6. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH2 de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 39, que corresponde a las posiciones 1501-2700 de SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH2 de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 40, que corresponde a las posiciones 501-900 de SEQ ID NO: 6. Los dominios de DH contienen un motivo de sitio activo: FxxH*F (SEQ ID NO: 53). La secuencia de nucleótidos que contiene el motivo de sitio activo en DH1 corresponde a las posiciones 931-933 de SEQ ID NO: 5, mientras que la secuencia de nucleótidos que contiene el motivo de sitio activo en DH2 corresponde a las posiciones 2401-2403 de SEQ ID NO: 5. El sitio activo H* en el motivo FxxH*F se basa en datos de Leesong et al., Structure 4: 253-64 (1996) y Kimber et al., J Biol Chem. 279: 52593-602 (2004), con el sitio activo H* en DH1 que corresponde a H310 de SeQ ID NO: 6 y el sitio activo H* en DH2 que corresponde a H801 de SEQ ID NO: 6.
El tercer dominio de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. es un dominio de ER. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de ER de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 41, que corresponde a las posiciones 2848-4200 de SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de ER de Pfa3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 42, que corresponde a las posiciones 950-1400 de SEQ ID NO: 6.
EJEMPLO 4
Se diseñaron cebadores degenerados para los dominios de KS, ER, y DH de PUFA sintasa para aislar las secuencias correspondientes a partir del microorganismo aislado depositado con el N.° PTA-10212 de Registro en la ATCC, también conocido como cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
Se diseñaron cebadores degenerados para la región de KS de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (es decir, la región que contiene el dominio de KS) basándose en las secuencias de PFA1 (denominado previamente orfA u ORF 1) publicadas para la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), y cepa 23B ATCC 20892 de Thraustochytrium sp.:
prDS233 (directo): TGATATGGGAGGAATGAATTGTGTNGTNGAYGC (SEQ ID NO: 123)
prDS235 (inverso): TTCCATAACAAAATGATAATTAGCTCCNCCRAANCC (SEQ ID NO: 124).
Se diseñaron cebadores degenerados para la región de ER de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (es decir, la región que contiene el dominio de ER) las secuencias de PFA2 (denominado previamente orfB u ORF 2) publicadas para Shewanella japonica, la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), y la cepa 23B AtCC 20892 de Thraustochytrium sp.:
prDS183 (directo): GGCGGCCACACCGAYAAYMGNCC (SEQ ID NO: 125)
prDS184 (inverso): CGGGGCCGCACCANAYYTGRTA (SEQ ID NO: 126).
Se diseñaron cebadores degenerados para la región de ER de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (es decir, la región que contiene el dominio de ER) basándose en las secuencias de PFA3 (denominado previamente orfC u ORF 3) publicadas para Shewanella japonica, la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), y la cepa 23B ATCC 20892 de Thraustochytrium sp.: prDS181 (directo): TCCTTCGGNGCNGSNGG (SEQ ID NO: 127)
prDS184 (inverso): CGGGGCCGCACCANAYYTGRTA (SEQ ID NO: 126).
Los cebadores degenerados JGM190 (directo, SEQ ID NO: 64) y BLR242 (inverso, SEQ ID NO: 65), como se ha descrito anteriormente, se usaron para amplificar la región de DH de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
Las condiciones de PCR con molde de ADN cromosómico fueron las que siguen a continuación: dNTPs 0,2 jM, 0,1 uM cada cebador, DMSO al 6 %, 200 ng de ADN cromosómico, 2,5 U de polimerasa de fusión Herculase® II (Stratagene), y 1X de tampón Herculase® (Stratagene) en un volumen total de 50 jl. El Protocolo de PCR incluía las siguientes etapas: (1) 98 °C durante 3 minutos; (2) 98 °C durante 30 segundos; (3) 54 °C durante 45 segundos; (4) 72 °C durante 1 minuto; (5) etapas 2-4 repetidas durante 40 ciclos; (6) 72 °C durante 5 minutos; y (7) se mantiene a 6 °C.
Para todos los pares de cebadores, la PCR proporcionó distintos productos de ADN con los tamaños esperados usando moldes cromosómicos de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. Los respectivos productos de PCR se exploraron en el vector pJET1.2/blunt (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la secuencia del inserto se determinó usando cebadores convencionales suministrados.
Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los productos de PCR se compararon con secuencias conocidas disponibles a partir del NCBI GenBank como se describe en el Ejemplo 1.
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de KS de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa A" (Identidad = 80 %; positivos = 90 %); KT99 de Shewanella benthica "PfaA de ácido graso poliinsaturado sintasa omega-3" (Identidad = 51 %; positivos = 67 %); PV-4 de Shewanella loihica "beta-cetoacil sintasa" (Identidad = 50 %; positivos = 67 %); ATCC 51908 Shewanella woodyi " PfaA de ácido graso poliinsaturado sintasa similar a poliquétido" (Identidad = 51 %; positivos = 66 %).
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de ER de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa B" (Identidad = 70 %; positivos = 85 %); la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa C" (Identidad = 66 %; positivos = 83 %); CCY9414 de Nodularia spumigena "2-nitropropano dioxigenasa" (Identidad = 57 %; positivos = 74 %); PE36 de Moritella sp. "PfaD de ácido graso poliinsaturado sintasa" (Identidad = 57 %; positivos = 71 %).
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de ER de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa C" (Identidad = 80 %; positivos = 90 %); la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa B" (Identidad = 78 %; positivos = 89 %); PE36 de Moritella sp. "PfaD de ácido graso poliinsaturado sintasa" (Identidad = 56 %; positivos = 71 %); SB2B de Shewanella amazonensis "omega-3 PfaD de ácido graso poliinsaturado sintasa" (Identidad = 55 %; positivos = 73 %).
Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de DH de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad de ácido graso poliinsaturado sintasa C" (Identidad = 63 %; positivos = 76 %); ATCC 700345 de Shewanella pealeana "Betahidroxiacil-(proteína transportadora de acilo) deshidratasa FabA/FabZ" (Identidad = 35 %; positivos = 53 %); WP3 de Shewanella piezotolerans "beta-cetoacil sintasa de múltiples dominios" (Identidad = 36 %; positivos = 52 %); KT99 de Shewanella benthica "PfaC de ácido graso poliinsaturado sintasa omega-3" (Identidad = 35 %; positivos = 51 %).
EJEMPLO 5
Los genes de PUFA sintasa se identificaron a partir de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
A partir de un criovial a -80 °C, se descongeló 1 ml de células a temperatura ambiente y se añadió a 50 ml de medio líquido de HSFM (a continuación) en un matraz sin tabique deflector de 250 ml. El matraz se incubó a 23 °C durante 3 días. Las células se recogieron y se utilizaron para construcción de biblioteca convencional de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) (Lucigen Corporation, Middleton, WI USA).
Tabla 6: Medios de HSFM
Ingrediente Concentración Intervalos
Na2SO4 g/l 31,0 0-50, 15-45, o 25-35
NaCl g/l 0,625 0-25, 0,1-10, o 0,5-5
KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3, o 0,5-2
MgSO4-7H2O g/l 5,0 0-10, 2-8, o 3-6
(NH4)2SO4 g/l 0,44 0-10, 0,25-5, o 0,05-3
MSG*1H2O g/l 6,0 0-10, 4-8, o 5-7
CaCl2 g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3, o 0,2-1
T 154 (extracto de levadura) g/l 6,0 0-20, 0,1-10, o 1-7
KH2PO4 g/l 0,8 0,1-10, 0,5-5, o 0,6-1,8
Después de autoclave (Metales)
Ácido cítrico mg/l 3,5 0,1-5000, 10-3000, o 3-2500
FeSO4-7H2O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50, o 5-25
MnCl2-4H2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50, o 2-25
Después de autoclave (Metales)
ZnSO4-7H2O mg/l 3,10 0,01-100, 1-50, o 2-25
CoCl2-6H2O mg/l 0,04 0-1, 0,001-0,1, o 0,01-0,1
Na2MoO4-2H2O mg/l 0,04 0,001-1, 0,005-0,5, o 0,01-0,1 CuSO4-5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25
NiSO4-6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25
Después de autoclave (Vitaminas)
Tiamina mg/l 9,75 0,1-100, 1-50, o 5-25
Vitamina B 12 mg/l 0,16 0,01-100, 0,05-5, o 0,1-1
Ca^-pantotenato mg/l 2,06 0,1-100, 0,1-50, o 1-10
Biotina mg/l 3,21 0,1-100, 0,1-50, o 1-10
Después de autoclave (Carbono)
Glicerol g/l 30,0 5-150, 10-100, o 20-50 Alimentación de nitrógeno:
Ingrediente Concentración
'MSG-1H2O 'g/l 17 '0-150, 10-100, o 15-50 ' Las condiciones habituales de cultivo podrían incluir las siguientes:
pH aproximadamente 6,5 - aproximadamente 9,5, aproximadamente 6,5 - aproximadamente 8,0, o aproximadamente 6,8 - aproximadamente 7,8;
temperatura: aproximadamente 15 - aproximadamente 30 grados Celsius, aproximadamente 18 -aproximadamente 28 grados Celsius, o aproximadamente 21 a aproximadamente 23 grados Celsius;
oxígeno disuelto: aproximadamente 0,1 - aproximadamente 100 % de saturación, aproximadamente 5 -aproximadamente 50 % de saturación, o aproximadamente 10 - aproximadamente 30 % de saturación; y/o
glicerol controlado a: aproximadamente 5 - aproximadamente 50 g/l, aproximadamente 10 - aproximadamente 40 g/l, o aproximadamente 15 - aproximadamente 35 g/l.
Las bibliotecas de BAC recombinante, que consisten en grandes fragmentos (promedio de aproximadamente 120 kB) se manipularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante en el vector pSMART® de BAC (Lucigen Corporation). Las bibliotecas de BAC se identificaron sistemáticamente mediante procedimientos convencionales de hibridación de colonias usando sondas etiquetadas radiactivamente con 32P (Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Las sondas contenían ADN homólogo a las secuencias de PUFA sintasa publicadas de otros organismos como se describe en el Ejemplo 4. Estas sondas se generaron mediante una digestión de restricción de ADN de los fragmentos clonados a partir de los respectivos clones de pJET1.2/blunt descritos anteriormente y se etiquetaron con métodos convencionales. En todos los casos, la fuerte hibridación de las sondas individuales para ciertos BAC indicaban clones que contenían ADN homólogo a los genes de PUFA sintasa.
El clon pLR130 de BAC (también conocido como LuMaBAC 2M23) demostraba una fuerte hibridación de la sonda tanto en la región de KS como en la región de ER, lo que indica que contenía los genes de PFA1 y PFA2, y se seleccionó para secuenciación de ADN de los genes PFA1 y PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. El BAC se secuenció mediante procedimientos convencionales (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). El clon pLR130 de BAC, que contenía los genes de PFA1 y PFA2, se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 1 de diciembre de 2009, y se le dio el N.° de Registro en la ATCC PTA-10511.
En los sistemas de PUFA sintasa de traustoquítrido publicados previamente, los genes de PFA1 y PFA2 de PUFA sintasa se agruparon en conjunto y se colocaron para que se transcribieran de manera divergente. Este también es el caso para PFA1 y PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. Se encontró que el inicio conceptual de PFA2 era de 693 nucleótidos desde el inicio de PFA1 y se transcribió de manera divergente.
El clon pDS127 de BAC (también conocido como LuMaBAC 9K17) demostraba una fuerte hibridación de la sonda tanto en la región de DH como en la región de ER de PFA3 y se seleccionó para secuenciación de ADN del gen de PFA3. El clon pDS127 de BAC, que contenía el gen de PFA3, se depositó bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Depósito de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110­ 2209, el 1 de diciembre de 2009, y se le dio el N.° de Registro en la ATCC PTA-10510. Se diseñaron cebadores de secuenciación usando métodos convencionales para la región de DH y la región de ER y la secuencia de ADN determinada en el Ejemplo 4. Para determinar la secuencia de ADN del gen de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., se realizaron rondas sucesivas de secuenciación de ADN, que implicaban el posterior diseño de cebador de secuenciación con métodos convencionales, para "acompañar" al clon de BAC. Cada par de bases de nucleótidos del gen PFA3 se cubrió con al menos dos reacciones de secuenciación de ADN separadas de alta calidad con al menos una puntuación Phred mínima agregada de 40 (nivel de confianza de un 99,99 %).
La Tabla 7 muestra identidades para las secuencias de polinucleótidos de PFA1 (SEQ ID NO: 68), PFA2 (SEQ ID NO: 70), y PFA3 (SEQ ID NO: 72) de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en comparación con secuencias publicadas previamente y las secuencias de la cepa PTA-9695 de Schizochytrium sp. Las identidades se determinaron con la matriz de puntuación "swgapdnamt" dentro del programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de ADN.
T l 7: P r n I ni r n i P lin l i PFA1 PFA2 PFA
Figure imgf000032_0001
La Tabla 8 muestra identidades para las secuencias de aminoácidos de Pfa1p (SEQ ID NO: 69), Pfa2p (SEQ ID NO: 71), y Pfa3p (SEQ ID NO: 73) de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en comparación con secuencias de aminoácidos de PUFA sintasa publicadas previamente y las secuencias de la cepa PTA-9695 de Schizochytrium sp. Las identidades se determinaron a través del uso de la matriz de puntuación "blosum62mt2" dentro del programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de proteínas.
T l : P r n I ni r n i Amin i Pf 1 Pf 2 Pf
Figure imgf000032_0002
EJEMPLO 6
El análisis de dominios se realizó para anotar las coordenadas de la secuencia para los dominios de PUFA sintasa y sitios activos de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., respectivamente. Los dominios identificaron basándose en homología con respecto a dominios conocidos de PUFA sintasa, ácido graso sintasa, y policéptido sintasa
La Tabla 9 muestra los dominios y los sitios activos asociados con el PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
T a b la 9: A n á lis is de D o m in io de P FA 1 de la ce a P T A -10212 de la A T C C de T hra u s to ch tr iu m s .
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
El primer dominio en Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de KS. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de Ks de Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 74, que corresponde a las posiciones 13-1362 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KS de Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 75, que corresponde a las posiciones 5-454 de SEQ ID NO: 69. El dominio de KS contiene un motivo de sitio activo: dXa C* (SeQ ID NO: 43), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a C204 de SEQ ID NO: 69. Además, un motivo característico está presente en el extremo del dominio de KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), que corresponde a las posiciones 451-454 de SEQ ID NO: 69 y a las posiciones 447-450 de SEQ ID NO: 75.
El segundo dominio en Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio MAT. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio MAT de Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 76, que corresponde a las posiciones 1783-2703 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio MAT de Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 77, que corresponde a las posiciones 595-901 de SEQ ID NO: 69. El dominio MAT contiene un motivo de sitio activo: g Hs*XG (s Eq ID NO: 46), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a S695 de SEQ ID NO: 69.
Los dominios tercero a decimosegundo de Pfa1p de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. son diez dominios de ACP en tándem, también denominados Ac P1, ACP2, ACP3, ACP4, ACP5, ACP6, ACP7, ACP8, ACP9, y ACP10 en el presente documento. La secuencia de nucleótidos que contiene el primer dominio de ACP, ACP1, en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 80 y está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 3280 a aproximadamente la posición 3534 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP1, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 81, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1094 a aproximadamente la posición 1178 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP2, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 82, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 3607 a aproximadamente la posición 3861 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP2, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 83, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1203 a aproximadamente la posición 1287 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP3, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 84, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 3934 a aproximadamente la posición 4185 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP3, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 85, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1312 a aproximadamente la posición 1396 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP4, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 86, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4261 a aproximadamente la posición 4515 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP4, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 87, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1421 a aproximadamente la posición 1505 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP5, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 88, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4589 a aproximadamente la posición 4842 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP5, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 89, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1530 a aproximadamente la posición 1614 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP6, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 90, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 4915 a aproximadamente la posición 5169 de SEQ ID NO: 68.
La secuencia de aminoácidos que contiene ACP6, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 91, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1639 a aproximadamente la posición 1723 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP7, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 92, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 5242 a aproximadamente la posición 5496 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP7, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 93, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1748 a aproximadamente la posición 1832 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP8, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 94, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 5569 a aproximadamente la posición 5832 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP8, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 95, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1857 a aproximadamente la posición 1941 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP9, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 96, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 5896 a aproximadamente la posición 6150 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP9, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 97, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 1966 a aproximadamente la posición 2050 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos que contiene ACP10, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 98, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 6199 a aproximadamente la posición 6453 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene ACP10, representada en el presente documento como SEQ ID NO: 99, está contenida dentro de la secuencia de nucleótidos que se extiende desde aproximadamente la posición 2067 a aproximadamente la posición 2151 de SEQ ID NO: 69. Los diez dominios de ACP en conjunto se extienden a una región de Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. desde aproximadamente la posición 3208 a aproximadamente la posición 6510 de SEQ ID NO: 68, que corresponde a posiciones del aminoácido de aproximadamente 1070 a aproximadamente 2170 de SEQ ID NO: 69. La secuencia de nucleótidos para toda la región de ACP que contiene los 10 dominios en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 78; mientras que la secuencia de aminoácidos para toda la región de ACP que contiene los seis dominios en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 79. Se encontró que el intervalo de repetición para los 10 dominios de ACP dentro de SEQ ID NO: 78 se producía aproximadamente cada 327 nucleótidos (el número real de aminoácidos medido entre serinas de sitio activo adyacentes varía de 101 a 109 aminoácidos). Cada uno de los diez dominios de ACP contiene un motivo de unión a panteteína LGIDS* (SEQ ID NO: 47) en el que S* es la serina de sitio de unión a panteteína (S). La serina de sitio de unión a panteteína (S) está situada cerca del centro de cada secuencia de dominio de ACP. Las posiciones de los restos de serina de sitio activo (es decir, el sitio de unión a panteteína) para cada uno de los seis dominios de ACPD, con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 son: ACP1 = S1135, ACP2 = S1244, ACP3 = S1353, ACP4 = S1462, ACP5 = S1571, ACP6 = S1680, APC7 = S1789, ACP7 = S1789, ACP8 = S1898, ACP9 = S=2007, y ACP10 = S2108.
El decimotercer dominio en Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de KR. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de KR de Pfa1 en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 100, que corresponde a las posiciones 6808-8958 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KR de Pfa1 en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 101, que corresponde a las posiciones 2270-2986 de SEQ iD NO: 69. Dentro del dominio de KR se encuentra una región núcleo (contenida dentro de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116, y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117) con homología para aldehído-deshidrogenasas de cadena corta (KR es un miembro de esta familia). Esta región núcleo se extiende desde aproximadamente la posición 5998 a aproximadamente 6900 de SEQ ID NO: 68, que corresponde a las posiciones 2000-2300 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 69.
El decimocuarto dominio en Pfa1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de DH. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH de Pfa1 en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 118, que corresponde a las posiciones 7027-7065 de SEQ ID NO: 68. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH de Pfa1 en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 119, que corresponde a las posiciones 2343-2355 de SEQ iD NO: 69. El dominio de DH contiene un motivo de sitio activo conservado (véase, Donadio, S. y Katz., L., Gene 111 (1): 51-60 (1992)): LxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO: 50).
La Tabla 10 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
T a b la 10: A n á lis is de D o m in io de P F A 2 de la ce a P T A -10212 de la A T C C de de T hra u s to ch tr iu m s .
Figure imgf000037_0001
El primer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de KS. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de Ks de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 102, que corresponde a las posiciones 10-1320 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KS de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 103, que corresponde a las posiciones 4-440 de SEQ ID NO: 71. El dominio de KS contiene un motivo de sitio activo: DxAc * (SEQ ID NO: 43), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a C191 de SEQ ID NO: 71. Además, un motivo característico está presente en el extremo del dominio de KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), que corresponde a las posiciones 423-426 de SEQ ID NO: 71 y a las posiciones 1267-1278 de SEQ ID NO: 70.
El segundo dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de CLF. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de CLF de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 104, que corresponde a las posiciones 1378-2700 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de CLF de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 105, que corresponde a las posiciones 460-900 de SeQ ID NO: 71.
El tercer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de AT. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica the el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 106, que corresponde a las posiciones 2848-4200 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 107, que corresponde a las posiciones 950-1400 de SEQ ID NO: 71. El dominio de AT contiene un motivo de sitio activo de GxS*xG (SEQ ID NO: 50) que es característico de proteínas aciltransfersa (AT), con un resto de serina de sitio activo que corresponde a S1121 de SEQ ID NO: 71.
El cuarto dominio de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de ER. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de Er de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 108, que corresponde a las posiciones 4498-5700 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de ER de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 109, que corresponde a las posiciones 1500-1900 de SEQ ID NO: 71.
La Tabla 11 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.
T a b la 11: A n á lis is de D o m in io de P F A 3 de la ce a P T A -10212 de la A T C C de de T hra u s to ch tr iu m s .
Figure imgf000038_0001
El primer y segundo dominios de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. son dominios de DH, denominados DH1 y DH2 en el presente documento, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH1 de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 110, que corresponde a las posiciones 1-1350 de SEQ ID NO: 72. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH1 de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 111, que corresponde a las posiciones 1-450 de SEQ ID NO: 73. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de DH2 de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 112, que corresponde a las posiciones 1501-2700 de SEQ ID NO: 72. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de DH2 de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 113, que corresponde a las posiciones 501-900 de SEQ ID NO: 73. Los dominios de DH contienen un motivo de sitio activo: FxxH*F (SEQ ID NO: 53). La secuencia de nucleótidos que contiene el motivo de sitio activo en DH1 corresponde a las posiciones 934-936 de SEQ ID NO: 72, mientras que la secuencia de nucleótidos que contiene el motivo de sitio activo en DH2 corresponde a las posiciones 2401-2403 de SEQ ID NO: 72. El sitio activo H* en el motivo FxxH*F se basa en datos de Leesong et al., Structure 4: 253-64 (1996) y Kimber et al. J Biol Chem. 279: 52593-602 (2004), con el sitio activo H* en DH1 que corresponde a H312 de SEQ ID NO: 73 y el sitio activo H* en DH2 que corresponde a H801 de SEQ ID NO: 73.
El tercer dominio de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de ER. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de Er de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 114, que corresponde a las posiciones 2848-4200 de SEQ ID NO: 72. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de ER de Pfa3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 115, que corresponde a las posiciones 950-1400 de SeQ ID NO: 73.
EJEMPLO 7
La inactivación de los genes de PUFA sintasa nativa en la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., para generar auxótrofos de PUFA, y la sustitución de los genes inactivados de este tipo con genes homólogos introducidos por vía exógena para restablecer la síntesis de PUFA se ha demostrado y descrito previamente. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856. Los tres genes de PUFA sintasa de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se han denominado previamente orfA, orfB, y orfC, que corresponden a la nomenclatura PFA1, PFA2, y p FA3 usada en el presente documento, respectivamente. Del mismo modo.
El gen orfA nativo en la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se sustituyó mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orfA. Se generó una cepa mutante que carecía de un gen orfA funcional. La cepa mutante era auxotrófica y para su crecimiento requería suplemento de PUFA.
El PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 1) se clonó en el vector de expresión pREZ37 para generar pREZ345. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfA nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. El orfA funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se transformó a través de electroporación con tratamiento enzimático previo (véase a continuación) con pREZ345 que contenía PFA1. Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante y que flanquea el gen PFA1 en pREZ345, se produjo una recombinación de doble cruce de modo que PFA1 se insertó en el locus de orfA nativo. La recombinación con PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 1) restableció la producción de PUFA en el orfA que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. En resumen, las células se cultivaron en medio líquido M2B (véase el párrafo que sigue a continuación) a 30 °C con agitación a 200 rpm durante 3 días. Las células se cosecharon y los ácidos grasos se convirtieron en ésteres de metilo usando técnicas convencionales. Los perfiles de ácido graso se determinaron usando detección mediante cromatografía de gases con ionización a la llama (GC-FID) como ésteres de metilo de ácido graso (FAME). La cepa nativa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., que contiene un gen orfA funcional produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 2,3:1. La cepa recombinante que contenía PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 1) en lugar del gen orfA inactivado también produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 2,4:1. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 2,7 % de ésteres de metilo de ácido graso (FAME), el contenido de DPA n-3 era de un 0,7 %, el contenido de DPA n-6 era de un 8,8 %, y el contenido de DHA era de un 21,2 %.
Medio de M2B - 10 g/l de glucosa, 0,8 g/l de (NH4)2SO4, 5 g/l de Na2SO4, 2 g/l de MgSO4^ 7H2O, 0,5 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de KCl, 0,1 g/l de C a C h ^ O , MES 0,1 M (pH 6,0) metales de PB26 al 0,1 %, y Vitaminas de PB26 al 0,1 % (v/v). Las vitaminas de PB26 consistían en 50 mg/ml de vitamina B12, 100 pg/ml de tiamina, y 100 pg/ml de Capantotenato. Los metales de PB26 se ajustaron a pH 4,5 y consistían en 3 g/l de FeSO4^ 7H2O, 1 g/l de MnCl2MH2O, 800 mg/ml de ZnSO4^ 7H2O, 20 mg/ml de CoCh^6H2O, 10 mg/ml de Na2MoO4^ 2H2O, 600 mg/ml de CuSO4^ 5H2O, y 800 mg/ml de NiSO4^ 6H2O. Las soluciones de reserva de PB26 se esterilizaron mediante filtración por separado y se añadieron al caldo de cultivo después de tratamiento en autoclave. Cada uno de glucosa, KH2PO4, y CaC^2H2O se trataron en autoclave por separado a partir del resto de los ingredientes del caldo de cultivo antes de la mezcla para evitar la precipitación de sal y la caramelización del carbohidrato. Todos los ingredientes del medio se adquirieron en Sigma Chemical (St. Louis, Mo ).
Electroporación con tratamiento enzimático previo - Las células se cultivaron en 50 ml de medio M50-20 (véase la Publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422) en un agitador a 200 rpm durante 2 días a 30 °C. Las células se diluyeron a 1: 100 en medio M2B y se cultivaron durante una noche (16-24 h), intentando alcanzar el crecimiento de fase logarítmica medio (DO600 de 1,5-2,5). Las células se centrifugaron en un tubo cónico de 50 ml durante 5 min a aproximadamente 3000 x g. El sobrenadante se retiró y las células se volvieron a suspender en manitol 1 M, pH 5,5, en un volumen adecuado para alcanzar una concentración final de 2 unidades de DO600. Se tomaron alícuotas de 5 ml en el matraz agitador de 25 ml y se modificó con CaCl210 mM (solución de reserva 1,0 M, esterilizado mediante filtración) y 0,25 mg/ml de Protease XIV (10 mg/ml de solución de reserva, esterilizado mediante filtración; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los matraces se incubaron en un agitador a 30 °C y aproximadamente 100 rpm durante 4 h. Las células se controlaron bajo el microscopio para determinar el grado de formación de protoplastos, con las células individuales deseadas. Las células centrifugaron durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo (es decir, tubos Falcon™ de 14 ml, BD Biosciences, San Jose, CA). El sobrenadante se retiró y las células se volvieron a suspender con cuidado con 5 ml de glicerol al 10 % enfriado en hielo. Las células se volverán a centrifugar durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. El sobrenadante se retiró y las células se volverán a suspender con cuidado con 500 pl de glicerol al 10 % enfriado en hielo, usando puntas de pipeta de calibre ancho. Se tomaron alícuotas de 90 pl de células en una electrocubeta enfriada previamente (cubeta Gene Pulser® - 0,1 cm de hueco, o 0,2 cm de hueco, Bio-Rad, Hercules, CA). De un pg a 5 pg de ADN (en un volumen inferior o igual a 10 pl de volumen) se añadieron a la cubeta, se mezcló con cuidado con una punta de pipeta, y se colocó en hielo durante 5 min. Las células se electroporaron a 200 ohmios (resistencia), 25 pF (capacitancia), y cualquiera de 250 V (para hueco de 0,1 cm) o 500 V (hueco de 0,2 cm). Se añadieron 0,5 ml de medio M50-20 inmediatamente a la cubeta. A continuación, las células se transfirieron a 4,5 ml de medio M50-20 en un matraz agitador de 25 ml y se incubaron durante 2-3 h a 30 °C y aproximadamente 100 rpm en un agitador. Las células se centrifugaron durante 5 min a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. El sobrenadante se retiró y el sedimento celular se volvió a suspender en 0,5 ml de medio M50-20. Las células se sembraron en un número apropiado (de 2 a 5) de placas M2B con la selección apropiada y se incubaron a 30 °C.
El orfA funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., también se transforma con pREZ345 que contiene PFA1, de modo que PFA1 se integra de manera aleatoria en el mutante y restablece la producción de PUFA.
EJEMPLO 8
El PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 68) se volvió a sintetizar (DNA2.0) y se optimizó con codón para su expresión en Schizochytrium (SEQ ID NO: 120) y se clonó en un vector de expresión para generar pLR95. La optimización con codón se produjo usando la tabla de uso de codón de Schizochytrium en la FIG. 22. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfA nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El orfA funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., del Ejemplo 7 se transformó mediante electroporación con tratamiento enzimático previo (Véase el Ejemplo 7) con pLR95 que contiene PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ iD NO: 120). Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante y que flanquean el gen PFA1 en pLR95, se produjo recombinación de doble cruce de modo que el PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón se insertó en el locus de orfA nativo. La recombinación con el PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 120) restableció la producción de PUFA en el orfA que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. La cepa 20888 nativa de la ATCC de Schizochytrium sp., que contiene un gen orfA funcional produjo DHA y EPA en una proporción de 25:1. La cepa recombinante que contiene PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 120) en lugar del gen orfA inactivado produjo DHA y EPA en una proporción de 5,4:1, lo que demuestra adicionalmente que el perfil de PUFA de Schizochytrium se puede alterar con las moléculas de ácido nucleico que se describen en el presente documento. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 4,4 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 2,3 %, el contenido de DPA n-6 era de un 4,9 %, y el contenido de DHA era de un 24,0 %.
El orfA funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., también se transforma con pLR95 que contiene PFA1, de modo que PFA1 se integra de manera aleatoria en el mutante y restablece la producción de PUFA.
EJEMPLO 9
El gene orfB nativo en la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se reemplazó mediante recombinación homóloga después de transformación mediante electroporación con tratamiento enzimático previo (Véase el Ejemplo 7) con un vector que contenía el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orfB. Se generó una cepa mutante que carecía de un gen de orfB funcional. La cepa mutante era auxotrófica y requería suplemento de PUFA para su crecimiento.
El PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 3) se clonó en el vector de expresión pDS04 para generar pREZ331. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfB nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El orfB funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se transformó con pREZ331 que contiene PFA2. Basándose en la integración aleatoria en el mutante, la producción de PUFA se restableció con PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ iD NO: 3). Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. La cepa 20888 nativa de la ATCC de Schizochytrium sp., que contiene un gen orfB funcional produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 2,3: 1. La cepa recombinante que contiene PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 3) como un reemplazo del gen orfB inactivado produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 3,5: 1. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 0,8 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,1 %, el contenido de DPA n-6 era de un 7,1 %, y el contenido de DHA era de un 25,1 %.
El orfB funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., también se transforma con pREZ331 que contiene PFA2, de modo que PFA2 se inserta en el locus de orfB nativo y restablece la producción de PUFA.
EJEMPLO 10
El PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 70) se volvió a sintetizar (DNA2.0) y se optimizó con codón para su expresión en Schizochytrium (SEQ ID NO: 121) y se clonó en un vector de expresión para generar pLR85. La optimización con codón se produjo usando la tabla de uso de codón de Schizochytrium en la FIG. 22. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfB nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El reemplazo de los genes orf también se estudió en una cepa hija de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., con un aumento de la productividad de DHA. El gene orfB nativo en la cepa hija se reemplazó mediante recombinación homóloga después de transformación mediante electroporación con tratamiento enzimático previo (Véase el Ejemplo 7) con un vector que contenía el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orfB. Se generó una cepa mutante que carecía de un gen orfB funcional. La cepa mutante era auxotrófica y requería suplemento de PUFA para su crecimiento. La cepa mutante se transformó a través de electroporación con tratamiento enzimático previo (véase el Ejemplo 8) con pLR85 que contiene PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121). Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante y que flanquean el gen PFA2 en pLR85, se produjo recombinación de doble cruce de modo que el PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121) se insertó en el locus de orfB nativo de la cepa mutante. La recombinación con el PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121) restableció la producción de PUFA en el orfB que carece de mutante de la cepa hija. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,0 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,3 %, el contenido de DPA n-6 era de un 7,0 %, y el contenido de DHA era de un 31,0 %.
En un experimento a realizar, el orfB funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., del Ejemplo 9 se transforma mediante electroporación con tratamiento enzimático previo (véase el Ejemplo 8) con pLR85 que contiene PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121). Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante que flanquea el gen PFA2 en pLR85, se produce recombinación de doble cruce de modo que el PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121) se inserta en el locus de orfB nativo. La recombinación con el PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 121) restablece la producción de PUFA en el orfB que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
La cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., y orfB funcional que carece de mutantes de la cepa hija también se transforman con pLR85 que contiene PFA2, de modo que PFA2 se integra de manera aleatoria en los mutantes y restablece la producción de PUFA en cada uno de los mutantes.
EJEMPLO 11
Un plásmido que contiene un casete de marcador de resistencia a paromomicina funcional en Schizochytrium se desarrolló para la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., mediante el reemplazo de la región codificante del gen (ble) de resistencia a bleomicina/Zeocin™ en pMON50000/pTUBZEO11-2 (documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.001.772 B2) con el de la neomicina fosfotransferasa II (npt), originalmente a partir del transposón Tn5 bacteriano. En pMON50000, el gen de resistencia ble está dirigido por el promotor de a-tubulina de Schizochytrium iba seguido del terminador de la transcripción SV40. La región de ble en pMON50000 incluye un sitio de restricción NcoI en el codón de inicio de ATG y un sitio de restricción PmlI que sigue inmediatamente a la señal de parada de TGA. La PCR se usó para amplificar la región codificante de npt presente en pCaMVnpt (Shimizu et al., Plant J. 26 (4): 375 (2001)) de modo que el producto incluía un sitio de restricción EspHI (subrayado a continuación, cebador CAX055) en el ATG de inicio (en negrita) y un sitio de restricción PmlI (subrayado a continuación, cebador CAX056) que sigue inmediatamente a la señal de parada (en negrita - complemento):
CAX055 (directo): GTCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC (SEQ ID NO: 66)
CAX056 (inverso): CCACGTGTCAGAAGAACTCGTCAAGAA (SEQ ID NO: 67).
La PCR se realizó con el kit de polimerasa TaqMaster (5Prime), los productos se clonaron en pCR4-TOPO (Invitrogen), y los plásmidos resultantes se transformaron en TOP10 de E. coli (Invitrogen). El análisis de la secuencia de ADN usando cebadores de vector identificó múltiples planes que contienen la estructura de 805 pb deseada (es decir, las secuencias se emparejan con las del molde de la fuente más los sitios de restricción modificados por ingeniería). La región codificante npt modificada se aisló mediante digestión con enzimas de restricción BspHI más PmlI, y el fragmento de ADN purificado se ligó con un fragmento de vector de pMON50000 generado por digestión con enzimas NcoI más PmlI. Las enzimas de restricción EspHI y NcoI dejan extremos de solapamiento compatibles, y PmlI deja extremos romos. El plásmido resultante, pTS-NPT, contiene el gen npt de resistencia a neomicina/paromomicina en el contexto idéntico al del gen ble original en pMON50000.
Para evaluar la función del nuevo casete de resistencia a paromomicina en pTS-NPT se usó bombardeo de partículas de Schizochytrium (documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.001.772 B2). La selección para resistencia a paromomicina (PAR) se realizó en placas de agar que contenían 50 pg/ml de sulfato de paromomicina (Sigma). Los transformantes de Schizochytrium resistentes a paromomicina se encontraron a frecuencias similares a las de resistencia a Zeocin™ de pMON50000. El casete "terminador de promotor/npt/SV40 de a-tubulina" se puede liberar de pTS-NPT con diversas enzimas de restricción para su uso posterior en otros esfuerzos de desarrollo.
EJEMPLO 12
El gen orfC nativo en la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se reemplazó mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a paromomicina rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orfC. Se generó una cepa mutante que carecía de un gen orfC funcional. La cepa mutante era auxotrófica y requería suplemento de PUFA para su crecimiento.
El PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 5) se clonó en el vector de expresión pREZ22 para generar pREZ324. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfC nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El orfC funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se transformó con pREZ324 que contenía PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a paromomicina en el mutante y que flanquea al gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. en pREZ324, se produjo recombinación de doble cruce de modo que PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. se insertó en el locus de orfC nativo. La recombinación homóloga con PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 5) restableció la producción de PUFA en el orfC que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. La cepa 20888 nativa de la ATCC de Schizochytrium sp., que contenía un gen orfC funcional produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 2,3: 1. La cepa recombinante que contenía PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 5) en lugar del gen orfC inactivado produjo DHA y DPA n-6 en una proporción de 14: 9, lo que demuestra adicionalmente que el perfil de PUFA de Schizochytrium se puede alterar con las moléculas de ácido nucleico que se describen en el presente documento. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,2 % de FAm E, el contenido de DPA n-3 era de un 0,2 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,9 %, y el contenido de DHA era de un 43,4 %.
El orfC funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., también se transformó con pREZ324 que contenía PFA3, de modo que PFA3 se integró de manera aleatoria en el mutante y restableció la producción de PUFA. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,2 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,2 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,5 %, y el contenido de DHA era de un 39,1 %.
El gen orfC nativo en la cepa hija discutida en el Ejemplo 10 se reemplazó mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a paromomicina rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orfC. Se generó una cepa mutante que carecía de un gen orfC funcional. La cepa mutante era auxotrófica y requería suplemento de PUFA para su crecimiento. El orfC funcional que carece de mutante se transformó con pREZ324. Se produjo recombinación de doble cruce de modo que PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. se insertó en el locus de orfC nativo de la cepa mutante. La recombinación homóloga con PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (Se Q ID NO: 5) restableció la producción de PUFA en el orfC que carece de mutante de la cepa hija. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,2 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,3 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,8 %, y el contenido de DHA era de un 43,1 %.
El orfC funcional que carece de mutante de la cepa hija también se transforma con pREZ324 que contiene PFA3, de modo que PFA3 se integra de manera aleatoria en el mutante y restablece la producción de PUFA.
EJEMPLO 13
El PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 72) se volvió a sintetizar (DNA2.0) y se optimizó con codón para su expresión en Schizochytrium (SEQ ID NO: 122) y se clonó en el vector de expresión pREZ22 para generar pREZ337. La optimización con codón se produjo usando la tabla de uso de codón de Schizochytrium en la FIG. 22. El vector de expresión contenía aproximadamente 2 kb de ADN de la región de flanqueo del locus del gen orfC nativo de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
El orfC funcional que carece de mutante de la cepa hija del Ejemplo 12 se transformó a través de electroporación con tratamiento enzimático previo (véase el Ejemplo 8) con pREZ337 que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122). Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante y que flanquean el gen PFA3 en pREZ337, se produjo recombinación de doble cruce de modo que el PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122) se insertó en el locus de orfC nativo. La recombinación con PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122) restableció la producción de PUFA en el orfC que carece de mutante de la cepa hija. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,3 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,4 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,7 %, y el contenido de DHA era de un 50,2 %.
En un experimento a realizar, el orfC funcional que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., del Ejemplo 12 se transforma mediante electroporación con tratamiento enzimático previo (véase el Ejemplo 8) con pREZ337 que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122). Basándose en regiones homólogas que flanquean el marcador de resistencia a Zeocin™ en el mutante y que flanquean el gen PFA3 en pREZ337, se produce recombinación de doble cruce de modo que el PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122) se inserta en el locus de orfC nativo. La recombinación con PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón (SEQ ID NO: 122) restablece la producción de PUFA en el orfC que carece de mutante de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.
La cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., y el orfC funcional que carece de mutantes de la cepa hija también se transforman con pREZ337 que contiene p FA3, de modo que p FA3 se integra de manera aleatoria en los mutantes y restablece la producción de PUFA en cada uno de los mutantes.
E JE M P L O 14
Cualesquiera dos o los tres de genes orfA, orfB, y orfC en la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se reemplazan mediante recombinación homóloga después de transformación con vectores que contienen cualquiera del marcador de resistencia a Zeocin™ o paromomicina rodeado por secuencias de la región de flanqueo de orf apropiada. Se generan cepas mutantes que carecen de genes funcionales para cualesquiera dos o los tres de orfA, orfB, y orfC. Las cepas mutantes son auxotróficas y requieren suplemento de PUFA para su crecimiento.
Los mutantes de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., que carecen de genes funcionales de orf se transforman con uno o más vectores de expresión que contienen los genes PFA correspondientes (una o más de las SED ID NOs: 1, 3, 5, 120, 121, o 122). Basándose en regiones homólogas que flanquean los marcadores de resistencia a Zeocin™ o paromomicina en los mutantes y que flanquean los genes PFA en los respectivos vectores de expresión, se puede producir recombinación de doble cruce de modo que los genes PFA se insertan en los loci de orf nativos. La integración aleatoria de estos vectores de expresión también se puede producir con la selección de transformantes basándose únicamente en el restablecimiento de la producción de PUFA. La recombinación homóloga con genes PFA que establece la producción de PUFA en los mutantes, de modo que los perfiles de PUFA nativo se restablecen o se alteran basándose en la combinación de genes PFA insertados en los mutantes.
En un experimento realizado, la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., del Ejemplo 12 que carece de un gen orfC funcional y que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., integrado de manera aleatoria (SEQ ID NO: 5) se usó para el reemplazo de los genes orfA y orfB. Los genes orfA y orfB nativos en la cepa se reemplazaron mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contiene el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de las regiones de flanqueo de orfA y orfB. Se generó una cepa que carecía de orfA, orfB, y orfC funcional, y que contenía PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., integrado de manera aleatoria. La cepa se transformó con pREZ345 que contenía PFA1 de la cepa pTa -9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SeQ ID NO: 1) y pREZ331 que contenía PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 3) de modo que se produjo la integración aleatoria de PFA1 y PFA2. La cepa recombinante resultante carecía de orfA, orfB, y orfC funcional y contenía interacciones aleatorias de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. Las células se cultivaron y se analizaron para los fAm E como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 6,6 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,8 %, el contenido de DPA n-6 era de un 1,6 %, y el contenido de DHA era de un 20,9 %.
En otro experimento realizado, la cepa hija del Ejemplo 12 que carece de un gen orfC funcional y que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 5) insertado en el locus de orfC nativo se usó para el reemplazo de los genes orfA y orfB. Los genes orfA y orfB nativos en la cepa se reemplazaron mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a paromomicina rodeado por secuencias de las regiones de flanqueo de orfA y orfB. Se generó una cepa que carecía de orfA, orfB, y orfC funcional, y que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., insertado en el locus de orfC nativo. La cepa se transformó con pREZ345 que contenía PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 1) y pREZ331 que contenía PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 3). Se produjeron recombinaciones de doble cruce de modo que p FA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se insertó en el locus de orfA nativo y PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se insertó en el locus de orfB nativo. La cepa recombinante resultante carecía de orfA, orfB, y orfC funcional y contenía PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., insertados en los respectivos loci de orfA, orfB, y orfC. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 7,3 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,4 %, el contenido de DPA n-6 era de un 1,5 %, y el contenido de DHA era de un 23,9 %.
En otro experimento realizado, la cepa hija del Ejemplo 12 que carece de un gen orfC funcional y que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., integrado de manera aleatoria (SEQ ID NO: 5) se usó para el reemplazo de los genes orfA y orfB. Los genes orfA y orfB nativos en la cepa se reemplazaron mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de las regiones de flanqueo de orfA y orfB. Se generó una cepa que carecía de orfA, orfB, y orfC funcional, y que contenía PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., integrado de manera aleatoria. La cepa se transformó con pREZ345 que contenía PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ Id NO: 1) y pREZ331 que contenía p Fa 2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 3) de modo que se produjo la integración aleatoria de PFA1 y PFA2. La cepa recombinante resultante carecía de orfA, orfB, y orfC funcional y contenía interacciones aleatorias de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 6,2 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 1,3 %, el contenido de DPA n-6 era de un 0,9 %, y el contenido de DHA era de un 16,6 %.
En otro experimento realizado, la cepa hija del Ejemplo 13 que carece de un gen orfC funcional y que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 122) insertado en el locus de orfC nativo se usó para el reemplazo de los genes orfA y orfB. Los genes orfA y orfB nativos en la cepa se reemplazaron mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a paromomicina rodeado por secuencias de las regiones de flanqueo de orfA y orfB. Se generó una cepa que carecía de orfA, orfB, y orfC funcional, y que contenía PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., insertado en el locus de orfC nativo. La cepa se transformó con pLR95 que contenía PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 120) y pLR85 que contenía PFA2 de la cepa PTA-10212 de la a Tc C de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 121). Se produjeron recombinaciones de doble cruce de modo que Schizochytrium sp., ATCC PTA-10212 PFA1 se insertó en el locus de orfA nativo y PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., se insertó en el locus de orfB nativo. La cepa recombinante resultante carecía de orfA, orfB, y orfC funcional y contenía PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., insertados en los respectivos loci de orfA, orfB, y orfC. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 5,2 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 0,6 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,1 %, y el contenido de DHA era de un 47,1 %.
En otro experimento realizado, la cepa hija del Ejemplo 13 que carece de un gen orfC funcional y que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., Integrado de manera aleatoria (SEQ iD NO: 122) se usó para el reemplazo de los genes orfA y orfB. Los genes orfA y orfB nativos en la cepa se reemplazaron mediante recombinación homóloga después de transformación con un vector que contenía el marcador de resistencia a Zeocin™ rodeado por secuencias de las regiones de flanqueo de orfA y orfB. Se generó una cepa que carecía de orfA, orfB, y orfC funcional, y que contenía PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., integrado de manera aleatoria. La cepa se transformó con pLR95 que contenía PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ iD NO: 120) y pLR85 que contenía p Fa 2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp., optimizado por codón (SEQ ID NO: 121) de modo que se produjo la integración aleatoria de PFA1 y PFA2. La cepa recombinante resultante carecía de orfA, orfB, y orfC funcional y contenía interacciones aleatorias de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Schizochytrium sp. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de EPA de la cepa recombinante era de un 1,8 % de FAME, el contenido de DPA n-3 era de un 1,8 %, el contenido de DPA n-6 era de un 2,3 %, y el contenido de DHA era de un 34,1 %.
EJEMPLO 15
Los genes orfA, orfB, y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., se clonaron en una serie de vectores Duet (Novagen). Los vectores de expresión Duet son un conjunto de plásmidos compatibles en los que se clonan y se coexpresan múltiples genes diana a partir del promotor inducible de T7 en E. coli. El plásmido pREZ91 de Duet contenía que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. en pETDuet-1; plásmido pREZ96 de Duet contenía la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., orfB en pCDFDuet-1; y plásmido pREZ101 de Duet contenía la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., orfC en pCOLADuet-1. Los plásmidos pREZ91, pREZ96, y pREZ101 de Duet, junto con el plásmido pJK737, que contenía el gen HetI auxiliar requerido (descrito en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.217.856), se transformaron en la cepa BLR(DE3) de E. coli, que contenía un gen de T7 ARN polimerasa inducible. Después del crecimiento celular y la adición de IPTG, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Novagen), se produjeron DHA y DPA n-6. En resumen, se añadió IPTG 1 mM a la inducción cuando las células alcanzaron una densidad óptica de aproximadamente 0,5 a 600 nm. Las células se cultivaron durante 12 horas a 30 °C en caldo de cultivo Luria y se cosecharon. Los ácidos grasos se convirtieron en ésteres de metilo usando técnicas convencionales. Los perfiles de ácido graso se determinaron usando cromatografía de gases con detección de ionización a la llama (GC-FID) como ésteres de metilo de ácido graso (FAME).
El gen PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 1) se clonó en el vector de expresión pETDuet-1, generando pREZ346. Los plásmidos Duet pREZ346 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ96 (que contiene orfB), y pREZ101 (contiene orfC) se transformaron en la cepa BLR(DE3) de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). El gen p Fa 1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., se coexpresaba con los genes orfB y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. La expresión de PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en combinación con orfB y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoyaban la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 2,8 % de FAME, el contenido de DPA n-6 era de un 1,1 %, el contenido de DPA n-3 era de un 0,6 %, y el contenido de EPA era de un 3,7 %.
EJEMPLO 16
El gen de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 120) optimizado con codón se clonó en el vector de expresión pETDuet-1, generando pLR100. Los plásmidos Duet pLR100 (que contiene PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pREZ96 (que contiene orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pRFz101 (que contiene orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transforman en la cepa BLR(DE3) de E. coli junto con pJK737 (que contenía Hetl). Véase el Ejemplo 15. El gen PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. se coexpresa con los genes orfB y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp. La expresión de PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp., en combinación con orfB y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA y EPA en E. coli en condiciones de inducción.
EJEMPLO 17
El gen de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 5) se clonó en el vector de expresión pCOLADuet-1, generando pREZ326. Los plásmidos Duet pREZ326 (que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ96 (que contiene orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCc de Schizochytrium sp., en combinación con orfA y orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,3 % de FAME.
EJEMPLO 18
El gen de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 122) optimizado con codón se clonó en el vector de expresión pCOLADuet-1, generando pREZ348. Los plásmidos Duet pREZ348 (que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ96 (que contiene orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCc de Thraustochytrium sp., en combinación con orfA y orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 2,9 % de FAME y el contenido de DPA n-6 era de un 0,4 %.
EJEMPLO 19
El gen de PFA2 PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (SEQ ID NO: 3) se clonó en el vector de expresión pCDFDuet-1, generando pREZ330. Los plásmidos Duet pREZ330 (que contienen PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ326 (que contiene PfA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 9. La expresión de PFA2 y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en combinación con orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,8 % de FAME y el contenido de DPA n-6 era de un 0,2 %.
EJEMPLO 20
El gen de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 121) optimizado con codón se clonó en el vector de expresión pCDFDuet-1, generando pLR87. Los plásmidos Duet pLR87 (que contienen PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pREZ348 (que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), y pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA2 y PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón, en combinación con orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya niveles de DHA y niveles bajos de producción de EPA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 4,4 % de FAME, el contenido de DPA n-6 era de un 1,1 %, y el contenido de EPA era de un 0,1 %.
EJEMPLO 21
Los plásmidos Duet pREZ346 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ330 (que contiene PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATc C de Schizochytrium sp.), y pREZ326 (que contiene PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,3 % de FAME y el contenido de EPA era de un 0,3 %.
E JE M P L O 22
Los plásmidos Duet pLR100 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pLR87 (que contiene PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), y pREZ348 (que contiene PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón) se transforman en la cepa BLR(DE3) de E. coli junto con pJK737 (que contenía Hetl). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATc C de Thraustochytrium sp., optimizados con codón apoya la producción de DHA y EPA en E. coli en condiciones de inducción.
EJEMPLO 23
Los plásmidos Duet pREZ330 (que contienen PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ101 (que contiene orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en combinación con orfA y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de d Ha en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,6 % de FAME y el contenido de DPA n-6 era de un 0,3 %.
EJEMPLO 24
Los plásmidos Duet pLR87 (que contienen PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pREZ91 (que contiene orfA de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ101 (que contiene orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCc de Thraustochytrium sp. optimizado con codón, en combinación con orfA y orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya niveles de DHA y niveles bajos de producción de EPA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 1,7 % de FAME, el contenido de DPA n-6 era de un 0,9 %, y el contenido de EPA era de un 0,1 %.
EJEMPLO 25
Los plásmidos Duet pREZ346 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ330 (que contiene PFA2 de la cepa PTA-9695 de la ATc C de Schizochytrium sp.), y pREZ101 (que contiene orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA1 y PFA2, en combinación con orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,3 % de FAME, el contenido de DPA n-6 era de un 0,1 %, y el contenido de EPA era de un 0,5 %.
EJEMPLO 26
Los plásmidos Duet pLR100 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), pLR87 (que contiene PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizado con codón), y pREZ101 (que contiene orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transforman en la cepa BLR(DE3) de E. coli junto con pJK737 (que contiene HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA1 y PFA2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. optimizados con codón, en combinación orfC de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA y EPA en E. coli en condiciones de inducción.
EJEMPLO 27
Los plásmidos Duet pREZ346 (que contienen PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.), pREZ96 (que contiene orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.), y pREZ326 (que contiene p Fa 3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.) se transformaron en BLR(DE3) de la cepa de E. coli junto con pJK737 (que contenía HetI). Véase el Ejemplo 15. La expresión de PFA1 y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en combinación con orfB de la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., apoya la producción de DHA en E. coli en condiciones de inducción. Las células se cultivaron y se analizaron para los FAME como se describe en el Ejemplo 15. El contenido de DHA de la E. coli transformada era de un 0,1 % de FAME y el contenido de EPA era de un 0,1 %.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre el grupo que consiste en:
(a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 72, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que consiste en actividad de p-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA (DH) y actividad de enoil-ACP reductasa (ER);
(b) una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 72;
(c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER;
(d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEQ ID NO: 73.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es totalmente complementaria a la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1.
3. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 y una secuencia de control de la transcripción.
4. Una molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3 en la que la molécula de ácido nucleico recombinante es un vector recombinante.
5. Una célula hospedadora que comprende el vector recombinante de la reivindicación 4 en la que la célula hospedadora expresa la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, o combinaciones de las mismas.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en la que la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula vegetal, una célula microbiana y una célula animal.
7. La célula hospedadora de la reivindicación 6, en la que la célula hospedadora es una célula microbiana.
8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, en la que la célula microbiana es una bacteria o un traustoquítrido.
9. La célula hospedadora de la reivindicación 8, en la que el traustoquítrido es un Schizochytrium o un Thraustochutrium.
10. Un método para producir al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA), que comprende:
expresar un gen de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir PUFA, en el que el gen de PUFA sintasa comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, o combinaciones de las mismas, y en el que se produce al menos un PUFA.
11. Un polipéptido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 73.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación 11, en las que el polipéptido es un polipéptido de fusión.
13. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 11 y un vehículo biológicamente aceptable.
14. Un método para aumentar la producción de DHA en un organismo que tiene actividad de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa, que comprende:
expresar la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, o combinaciones de las mismas, en el organismo en condiciones eficaces para producir DHA, en el que la producción de DHA en el organismo aumenta.
15. Un método para aislar lípidos a partir de una célula hospedadora, que comprende:
(a) expresar un gen de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa en la célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, en el que el sistema de poliquétido sintasa (PKS) comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3, o combinaciones de las mismas, en la célula hospedadora, y
(b) aislar lípidos a partir de la célula hospedadora;
opcionalmente, en el que la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula vegetal, una célula animal aislada y una célula microbiana.
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