JP6659044B2 - 多価不飽和脂肪酸シンターゼの核酸分子およびポリペプチド、組成物、ならびにそれらの作製方法および使用 - Google Patents
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Description
[本発明1001]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:1に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、β−ケトアシル−ACPシンターゼ(KS)活性、マロニル−CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性、アシルキャリアータンパク質(ACP)活性、ケトレダクターゼ(KR)活性、β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼ(DH)活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:7に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:9に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がMAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:13、15、17、19、21または23のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(e)SEQ ID NO:11に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(f)SEQ ID NO:25に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKR活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(g)SEQ ID NO:27に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1002]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27に対して少なくとも90%同一である、本発明1001の単離された核酸分子。
[本発明1003]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27に対して少なくとも95%同一である、本発明1001の単離された核酸分子。
[本発明1004]
それぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1001の単離された核酸分子。
[本発明1005]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:2に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:8に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:10に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがMAT活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:14、16、18、20、22または24のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:12に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(f)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:26に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKR活性を含む、核酸分子;ならびに
(g)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:28に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子。
[本発明1006]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも90%同一である、本発明1005の単離された核酸分子。
[本発明1007]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも95%同一である、本発明1005の単離された核酸分子。
[本発明1008]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28のアミノ酸配列を含む、本発明1005の単離された核酸分子。
[本発明1009]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:3に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、鎖長因子(chain length factor)(CLF)活性、アシルトランスフェラーゼ(AT)活性、エノイル−ACPレダクターゼ(ER)活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:29に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:31に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がCLF活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:33に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(e)SEQ ID NO:35に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1010]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35に対して少なくとも90%同一である、本発明1009の単離された核酸分子。
[本発明1011]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35に対して少なくとも95%同一である、本発明1009の単離された核酸分子。
[本発明1012]
それぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1009の単離された核酸分子。
[本発明1013]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:4に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:30に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:32に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがCLF活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:34に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがAT活性を含む、核酸分子;ならびに
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
[本発明1014]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも90%同一である、本発明1013の単離された核酸分子。
[本発明1015]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも95%同一である、本発明1013の単離された核酸分子。
[本発明1016]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36のアミノ酸配列を含む、本発明1013の単離された核酸分子。
[本発明1017]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:5に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:37に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:39に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(d)SEQ ID NO:41に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1018]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41に対して少なくとも90%同一である、本発明1017の単離された核酸分子。
[本発明1019]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41に対して少なくとも95%同一である、本発明1017の単離された核酸分子。
[本発明1020] それぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1017の単離された核酸分子。
[本発明1021]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:6に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:38に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:40に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;ならびに
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:42に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
[本発明1022]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも90%同一である、本発明1021の単離された核酸分子。
[本発明1023]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも95%同一である、本発明1021の単離された核酸分子。
[本発明1024]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42のアミノ酸配列を含む、本発明1021の単離された核酸分子。
[本発明1025]
KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、CLF活性、AT活性、ER活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、
該ポリヌクレオチドが、本発明1001〜1024のいずれかのポリヌクレオチド配列の相補物と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
[本発明1026]
本発明1001〜1024のいずれかのポリヌクレオチド配列に対して完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
[本発明1027]
本発明1001〜1025のいずれかの核酸分子またはそれらの組み合わせと、転写制御配列とを含む、組換え核酸分子。
[本発明1028]
組換えベクターである、本発明1027の組換え核酸分子。
[本発明1029]
本発明1001〜1025のいずれかの核酸分子、本発明1027もしくは本発明1028の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを発現する、宿主細胞。
[本発明1030]
植物細胞、微生物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、本発明1029の宿主細胞。
[本発明1031]
微生物細胞である、本発明1030の宿主細胞。
[本発明1032]
細菌である、本発明1031の微生物細胞。
[本発明1033]
ヤブレツボカビ(thraustochytrid)である、本発明1031の微生物細胞。
[本発明1034]
ヤブレツボカビがシゾキトリウム属(Schizochytrium)であるか、またはヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)である、本発明1033の微生物細胞。
[本発明1035]
以下の段階を含む、少なくとも1つのPUFAを産生するための方法:
宿主細胞において、PUFAを産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ遺伝子が、本発明1001〜1025のいずれかの単離された核酸分子、本発明1027もしくは本発明1028の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
少なくとも1種類のPUFAが産生される、段階。
[本発明1036]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
少なくとも1種類のPUFAがドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、本発明1035の方法。
[本発明1038]
以下の段階を含む、DHAに富む脂質を産生するための方法:
宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、該PUFAシンターゼ遺伝子が、宿主細胞において、本発明1001〜1025のいずれかの単離された核酸分子、本発明1027もしくは本発明1028の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
DHAに富む脂質が産生される、段階。
[本発明1039]
本発明1001〜1025のいずれかの単離された核酸分子をベクター中に挿入する段階を含む、組換えベクターを作製する方法。
[本発明1040]
本発明1039の組換えベクターを宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
[本発明1041]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
本発明1001〜1025のいずれかのポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
[本発明1043]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:2に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:10に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、MAT活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:14、16、18、20、22または24のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(e)SEQ ID NO:12に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(f)SEQ ID NO:26に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KR活性を含むポリペプチド;ならびに
(g)SEQ ID NO:28に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド。
[本発明1044]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも90%同一である、本発明1043の単離されたポリペプチド。
[本発明1045]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも95%同一である、本発明1043の単離されたポリペプチド。
[本発明1046]
それぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28のアミノ酸配列を含む、本発明1043の単離されたポリペプチド。
[本発明1047]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:4に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:30に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:32に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CLF活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:34に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、AT活性を含むポリペプチド;ならびに
(e)SEQ ID NO:36に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
[本発明1048]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも90%同一である、本発明1047の単離されたポリペプチド。
[本発明1049]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも95%同一である、本発明1047の単離されたポリペプチド。
[本発明1050]
それぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36のアミノ酸配列を含む、本発明1047の単離されたポリペプチド。
[本発明1051]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:6に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:38に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:40に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;ならびに
(d)SEQ ID NO:42に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
[本発明1052]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも90%同一である、本発明1051の単離されたポリペプチド。
[本発明1053]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも95%同一である、本発明1051の単離されたポリペプチド。
[本発明1054]
それぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42のアミノ酸配列を含む、本発明1051の単離されたポリペプチド。
[本発明1055]
融合ポリペプチドである、本発明1042〜1054のいずれかの単離されたポリペプチド。
[本発明1056]
本発明1042〜1054のいずれかのポリペプチドと、生物学的に許容される担体とを含む、組成物。
[本発明1057]
以下の段階を含む、PUFAシンターゼ活性を有する生物におけるDHAの産生を増加させる方法:
生物において、本発明1001〜1025のいずれかの単離された核酸分子、本発明1027もしくは本発明1028の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを、DHAを産生させるのに有効な条件下で発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ活性が、該生物において、不活性な活性もしくは消失した活性に取って代わるか、新たな活性を導入するか、または既存の活性を増強し、かつ
該生物におけるDHAの産生が増加する、段階。
[本発明1058]
以下の段階を含む、宿主細胞から脂質を単離する方法:
(a)宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、PKS系が、宿主細胞において、本発明1001〜1025のいずれかの単離された核酸分子、本発明1027もしくは本発明1028の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含む、段階、および
(b)宿主細胞から脂質を単離する段階。
[本発明1059]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1058の方法。
[本発明1060]
脂質がDHAを含む、本発明1058の方法。
[本発明1061]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:120に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:74に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:76に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がMAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:80、82、84、86、88、90、92、94、96または98のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(e)SEQ ID NO:78に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(f)SEQ ID NO:100に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKR活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(g)SEQ ID NO:118に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1062]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120に対して少なくとも90%同一である、本発明1061の単離された核酸分子。
[本発明1063]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120に対して少なくとも95%同一である、本発明1061の単離された核酸分子。
[本発明1064]
それぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1061の単離された核酸分子。
[本発明1065]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:69に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:75に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:77に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがMAT活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93、95、97または99のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:79に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(f)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:101に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKR活性を含む、核酸分子;ならびに
(g)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:119に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子。
[本発明1066]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも90%同一である、本発明1065の単離された核酸分子。
[本発明1067]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも95%同一である、本発明1065の単離された核酸分子。
[本発明1068]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119のアミノ酸配列を含む、本発明1065の単離された核酸分子。
[本発明1069]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:70またはSEQ ID NO:121に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:102に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:104に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がCLF活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:106に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(e)SEQ ID NO:108に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1070]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121に対して少なくとも90%同一である、本発明1069の単離された核酸分子。
[本発明1071]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121に対して少なくとも95%同一である、本発明1069の単離された核酸分子。
[本発明1072]
それぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1069の単離された核酸分子。
[本発明1073]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:71に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:103に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:105に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがCLF活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:107に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがAT活性を含む、核酸分子;ならびに
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:109に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
[本発明1074]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも90%同一である、本発明1073の単離された核酸分子。
[本発明1075] アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも95%同一である、本発明1073の単離された核酸分子。
[本発明1076]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109のアミノ酸配列を含む、本発明1073の単離された核酸分子。
[本発明1077]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:72またはSEQ ID NO:122に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:110に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:112に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(d)SEQ ID NO:114に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1078]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122に対して少なくとも90%同一である、本発明1077の単離された核酸分子。
[本発明1079]
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122に対して少なくとも95%同一である、本発明1077の単離された核酸分子。
[本発明1080]
それぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122のポリヌクレオチド配列を含む、本発明1077の単離された核酸分子。
[本発明1081]
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:73に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:111に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:113に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;ならびに
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:115に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
[本発明1082]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも90%同一である、本発明1081の単離された核酸分子。
[本発明1083]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、本発明1081の単離された核酸分子。
[本発明1084]
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115のアミノ酸配列を含む、本発明1081の単離された核酸分子。
[本発明1085]
KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、CLF活性、AT活性、ER活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、
該ポリヌクレオチドが、本発明1061〜1084のいずれかのポリヌクレオチド配列の相補物と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
[本発明1086]
本発明1061〜1084のいずれかのポリヌクレオチド配列に対して完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
[本発明1087]
本発明1061〜1085のいずれかの核酸分子またはそれらの組み合わせと、転写制御配列とを含む、組換え核酸分子。
[本発明1088]
組換えベクターである、本発明1087の組換え核酸分子。
[本発明1089]
本発明1061〜1085のいずれかの核酸分子、本発明1087もしくは本発明1088の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを発現する、宿主細胞。
[本発明1090]
植物細胞、微生物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、本発明1089の宿主細胞。
[本発明1091]
微生物細胞である、本発明1090の宿主細胞。
[本発明1092]
細菌である、本発明1091の微生物細胞。
[本発明1093]
ヤブレツボカビである、本発明1091の微生物細胞。
[本発明1094]
ヤブレツボカビがシゾキトリウム属であるか、またはヤブレツボカビ属である、本発明1093の微生物細胞。
[本発明1095]
以下の段階を含む、少なくとも1種類のPUFAを産生するための方法:
宿主細胞において、PUFAを産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ遺伝子が、本発明1061〜1085のいずれかの単離された核酸分子、本発明1087もしくは本発明1088の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
少なくとも1種類のPUFAが産生される、段階。
[本発明1096]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1095の方法。
[本発明1097]
少なくとも1種類のPUFAがDHAまたはエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、本発明1095の方法。
[本発明1098]
以下の段階を含む、DHA、EPA、またはそれらの組み合わせに富む脂質を産生するための方法:
宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、該PUFAシンターゼ遺伝子が、宿主細胞において、本発明1061〜1085のいずれかの単離された核酸分子、本発明1087もしくは本発明1088の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
DHA、EPA、またはそれらの組み合わせに富む脂質が産生される、段階。
[本発明1099]
本発明1061〜1085のいずれかの単離された核酸分子をベクター中に挿入する段階を含む、組換えベクターを作製する方法。
[本発明1100]
本発明1099の組換えベクターを宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
[本発明1101]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1100の方法。
[本発明1102]
本発明1061〜1085のいずれかのポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
[本発明1103]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:69に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:75に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:77に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、MAT活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93、95、97または99のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(e)SEQ ID NO:79に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(f)SEQ ID NO:101に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KR活性を含むポリペプチド;ならびに
(g)SEQ ID NO:119に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド。
[本発明1104]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも90%同一である、本発明1103の単離されたポリペプチド。
[本発明1105]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも95%同一である、本発明1103の単離されたポリペプチド。
[本発明1106]
それぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119のアミノ酸配列を含む、本発明1103の単離されたポリペプチド。
[本発明1107]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:71に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:103に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:105に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CLF活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:107に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、AT活性を含むポリペプチド;ならびに
(e)SEQ ID NO:109に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
[本発明1108]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも90%同一である、本発明1107の単離されたポリペプチド。
[本発明1109]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも95%同一である、本発明1107の単離されたポリペプチド。
[本発明1110]
それぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109のアミノ酸配列を含む、本発明1107の単離されたポリペプチド。
[本発明1111]
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:73に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:111に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:113に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;ならびに
(d)SEQ ID NO:115に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
[本発明1112]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも90%同一である、本発明1111の単離されたポリペプチド。
[本発明1113]
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、本発明1111の単離されたポリペプチド。
[本発明1114]
それぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115のアミノ酸配列を含む、本発明1111の単離されたポリペプチド。
[本発明1115]
融合ポリペプチドである、本発明1102〜1114のいずれかの単離されたポリペプチド。
[本発明1116]
本発明1102〜1114のいずれかのポリペプチドと、生物学的に許容される担体とを含む、組成物。
[本発明1117]
以下の段階を含む、PUFAシンターゼ活性を有する生物におけるDHA、EPA、またはそれらの組み合わせの産生を増加させる方法:
生物において、本発明1061〜1085のいずれかの単離された核酸分子、本発明1087もしくは本発明1088の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを、DHA、EPA、またはそれらの組み合わせを産生させるのに有効な条件下で発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ活性が、該生物において、不活性な活性もしくは消失した活性に取って代わるか、新たな活性を導入するか、または既存の活性を増強し、かつ
該生物におけるDHA、EPA、またはそれらの組み合わせの産生が増加する、段階。
[本発明1118]
以下の段階を含む、宿主細胞から脂質を単離する方法:
(a)宿主細胞において脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、PKS系が、宿主細胞において、本発明1061〜1085のいずれかの単離された核酸分子、本発明1087もしくは本発明1088の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含む、段階、および
(b)宿主細胞から脂質を単離する段階。
[本発明1119]
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、本発明1118の方法。
[本発明1120]
脂質がDHA、EPA、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1118の方法。
本発明は、ドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、またはそれらの組み合わせに富むPUFAを含むPUFAの産生に関与する、多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼの単離された核酸分子およびポリペプチドを対象とする。本発明は、それらの核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、それらの核酸分子によってコードされるポリペプチド、それらの核酸分子またはポリペプチドを含む組成物、ならびにそれらの作製方法および使用を対象とする。
本明細書で用いる場合、「PUFAシンターゼ」という用語は、多価不飽和脂肪酸の産生に関与する酵素のことを指す。例えば、Metz et al., Science 293:290−293 (2001)を参照。
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2009年3月19日に提出された同時係属中の米国特許出願第12/407,687号の主題である、分離された微生物に由来する、PUFAシンターゼ遺伝子およびドメインに対するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を対象とする。これらの微生物は、ブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110−2209に2009年1月7日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA−9695が割り当てられており、シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695とも呼ばれる。発現されると、これらの遺伝子は、ω−3脂肪酸のレベルが高いこと、特にDHAのレベルが高いことを特徴の1つとする、独特の脂肪酸プロフィールを生じる。
本発明は、ATCCアクセッション番号PTA−9695およびPTA−10212として寄託された分離された微生物に由来するPUFAシンターゼタンパク質およびドメインのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを対象とする。
本発明は、上記の核酸分子および組換え核酸分子の任意のもの、さらにはそれらの組み合わせを発現する宿主細胞を対象とする。
本発明は、以下の段階を含む、少なくとも1種類のPUFAを産生するための方法を対象とする:宿主細胞において、PUFAを産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ系を発現させる段階であって、PUFAシンターゼ系が、本明細書に記載された単離された核酸分子および組換え核酸分子のいずれか、ならびにそれらの組み合わせを含み、少なくとも1つのPUFAが産生される、段階。いくつかの態様において、少なくとも1種類のPUFAには、DHA、EPA、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞は植物細胞、単離された動物細胞、または微生物細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はヤブレツボカビである。
PUFAシンターゼのKSおよびDHドメイン用の縮重プライマーを、シゾキトリウム属種ATCC PTA9695としても公知であるATCCアクセッション番号PTA−9695として寄託された分離された微生物から対応する配列を単離する目的で設計した。
PUFAシンターゼ遺伝子を、シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695から同定した。
シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1、PFA2およびPFA3のPUFAシンターゼドメインおよび活性部位のそれぞれについて、配列座標に注釈づけを行うためにドメイン解析を行った。ドメインは、PUFAシンターゼ、脂肪酸シンターゼおよびポリケチドシンターゼの公知のドメインに対する相同性に基づいて同定した。
PUFAシンターゼのKS、ERおよびDHドメイン用の縮重プライマーを、ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212としても公知であるATCCアクセッション番号PTA−10212として寄託された分離された微生物から対応する配列を単離する目的で設計した。
PUFAシンターゼ遺伝子を、ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212から同定した。
ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1、PFA2およびPFA3のPUFAシンターゼドメインおよび活性部位のそれぞれについて、配列座標に注釈づけを行うためにドメイン解析を行った。ドメインは、PUFAシンターゼ、脂肪酸シンターゼおよびポリケチドシンターゼの公知のドメインに対する相同性に基づいて同定した。
PUFA栄養要求性菌株を作製するためのシゾキトリウム属種ATCC 20888におけるネイティブPUFAシンターゼ遺伝子の不活性化、およびPUFA合成を回復させるための、外因性に導入された相同遺伝子によるそのような不活性化遺伝子の置換は、以前に実証され、記載されている。例えば、米国特許第7,217,856号を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。シゾキトリウム属種ATCC 20888由来の3種のPUFAシンターゼ遺伝子は以前はorfA、orfBおよびorfCと称されており、これらはそれぞれ、本明細書中で用いるPFA1、PFA2およびPFA3という命名に対応する。同上。
ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1(SEQ ID NO:68)を再合成し(DNA2.0)、シゾキトリウム属における発現のためにコドンを最適化した上で(SEQ ID NO:120)、発現ベクター中にクローニングし、pLR95を作製した。コドン最適化は、図22中のシゾキトリウム属コドン使用頻度の表を用いて行った。この発現ベクターは、シゾキトリウム属種ATCC 20888由来のネイティブorfA遺伝子座のフランキング領域に由来するおよそ2kbのDNAを含んでいた。
シゾキトリウム属種ATCC 20888におけるネイティブorfB遺伝子を、orfBフランキング領域由来の配列によって囲まれたZeocin(商標)耐性マーカーを含むベクターによる、酵素前処理を伴うエレクトロポレーション(実施例7参照)を介した形質転換後に相同組換えによって置換させた。機能的なorfB遺伝子を持たない突然変異菌株が生じた。この突然変異菌株は栄養要求性であり、PUFA補給を増殖のために必要とした。
ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2(SEQ ID NO:70)を再合成し(DNA2.0)、シゾキトリウム属における発現のためにコドンを最適化した上で(SEQ ID NO:121)、発現ベクター中にクローニングし、pLR85を作製した。コドン最適化は、図22中のシゾキトリウム属コドン使用頻度の表を用いて行った。この発現ベクターは、シゾキトリウム属種ATCC 20888由来のネイティブorfB遺伝子座のフランキング領域に由来するおよそ2kbのDNAを含んでいた。
シゾキトリウム属において機能を有するパロモマイシン耐性マーカーカセットを含むプラスミドを、pMON50000/pTUBZEO11−2(米国特許第7,001,772 B2号)におけるブレオマイシン/Zeocin(商標)耐性遺伝子(ble)コード領域の、元来は細菌トランスポゾンTn5に由来するネオマイシン ホスホトランスフェラーゼII(npt)のものによる置換により、シゾキトリウム属種ATCC 20888用に開発した。pMON50000において、ble耐性遺伝子はシゾキトリウム属α−チューブリンプロモーターによって作動し、後方にはSV40転写ターミネーターがある。pMON50000におけるble領域は、ATG開始コドンの箇所にあるNcoI制限部位、およびTGA終止シグナルの直後にあるPmlI制限部位を範囲に含む。PCRを用いて、pCaMVnpt(Shimizu et al., Plant J. 26(4):375 (2001))中に存在するnptコード領域を増幅し、その結果、産物が、開始ATG(太字)の箇所にあるBspHI制限部位(以下の下線部、プライマーCAX055)および終止シグナル(太字−逆相補物)の直後にあるPmlI制限部位(以下の下線部、プライマーCAX056)を含むようにした:
シゾキトリウム属種ATCC 20888におけるネイティブorfC遺伝子を、orfCフランキング領域由来の配列によって囲まれたパロモマイシン耐性マーカーを含むベクターによる形質転換後に相同組換えによって置換させた。機能的なorfC遺伝子を持たない突然変異菌株が生じた。この突然変異菌株は栄養要求性であり、PUFA補給を増殖のために必要とした。
ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3(SEQ ID NO:72)を再合成し(DNA2.0)、シゾキトリウム属における発現のためにコドンを最適化した上で(SEQ ID NO:122)、発現ベクターpREZ22中にクローニングして、pREZ237を作製した。コドン最適化は、図22中のシゾキトリウム属コドン使用頻度の表を用いて行った。この発現ベクターは、シゾキトリウム属種ATCC 20888由来のネイティブorfC遺伝子座のフランキング領域に由来するおよそ2kbのDNAを含んでいた。
シゾキトリウム属種ATCC 20888におけるorfA遺伝子、orfB遺伝子およびorfC遺伝子のいずれか2つ、または3つすべてを、適切なorfフランキング領域由来の配列によって囲まれたZeocin(商標)耐性マーカーまたはパロモマイシン耐性マーカーのいずれかを含むベクターによる形質転換後に相同組換えによって置換させる。orfA、orfBおよびorfCのいずれか2つ、または3つすべてに関して機能的な遺伝子を持たない突然変異菌株が生じる。これらの突然変異菌株は栄養要求性であり、PUFA補給を増殖のために必要とする。
シゾキトリウム属種ATCC 20888由来のorfA遺伝子、orfB遺伝子およびorfC遺伝子を、一連のDuetベクター(Novagen)中にクローニングした。Duet発現ベクターは、複数の標的遺伝子がクローニングされて、大腸菌においてT7誘導性プロモーターから共発現される、適合性プラスミドのセットである。DuetプラスミドpREZ91には、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAをpETDuet−1中に含めた;duetプラスミドpREZ96には、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBをpCDFDuet−1中に含めた;duetプラスミドpREZ101には、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCをpCOLADuet−1中に含めた。DuetプラスミドpREZ91、pREZ96およびpREZ101を、必要とされる補助遺伝子HetI(米国特許第7,217,856号に記載、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)を含めたプラスミドpJK737とともに、誘導性T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。細胞を増殖させ、IPTGを製造元(Novagen)の指示に従って添加すると、DHAおよびDPA n−6が産生された。手短に述べると、細胞の600nmでの光学密度が約0.5に達した時点で、1mMのIPTGを誘導のために添加した。細胞をLuriaブロス中で30℃で12時間増殖させた上で採取した。標準的な手法を用いて、脂肪酸をメチル−エステルに変換させた。脂肪酸プロフィールを、フレームイオン化検出ガスクロマトグラフィー(GC−FID)を用いて、脂肪酸メチルエステル(FAME)として決定した。
コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1(SEQ ID NO:120)遺伝子を、発現ベクターpETDuet−1中にクローニングして、pLR100を作製する。DuetプラスミドpLR100(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1を含む)、pREZ96(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBを含む)およびpREZ101(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させる。実施例15参照。ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1遺伝子を、シゾキトリウム属種ATCC 20888のorfB遺伝子およびorfC遺伝子と共発現させる。ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBおよびorfCと併せて発現されることにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHAおよびEPAの産生が裏づけられる。
シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3(SEQ ID NO:5)遺伝子を発現ベクターpCOLADuet−1中にクローニングして、pREZ326を作製した。DuetプラスミドpREZ326(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3を含む)、pREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)およびpREZ96(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAおよびorfBと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.3%であった。
コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3(SEQ ID NO:122)遺伝子を発現ベクターpCOLADuet−1中にクローニングして、pREZ348を作製した。DuetプラスミドpREZ348(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3を含む)、pREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)およびpREZ96(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。ヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAおよびorfBと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして2.9%であり、DPA n−6含量は0.4%であった。
シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2(SEQ ID NO:3)遺伝子を発現ベクターpCDFDuet−1中にクローニングして、pREZ330を作製した。DuetプラスミドpREZ330(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2を含む)、pREZ326(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3を含む)およびpREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例9参照。シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2およびPFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.8%であり、DPA n−6含量は0.2%であった。
コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2(SEQ ID NO:121)遺伝子を発現ベクターpCDFDuet−1中にクローニングして、pLR87を作製した。DuetプラスミドpLR87(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2を含む)、pREZ348(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3を含む)およびpREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2およびPFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生、および低レベルのEPA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして4.4%であり、DPA n−6含量は1.1%であり、EPA含量は0.1%であった。
DuetプラスミドpREZ346(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1を含む)、pREZ330(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2を含む)およびpREZ326(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3を含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1、PFA2およびPFA3の発現により、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.3%であり、EPA含量は0.3%であった。
DuetプラスミドpLR100(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1を含む)、pLR87(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2を含む)およびpREZ348(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3を含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させる。実施例15参照。コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212のPFA1、PFA2およびPFA3の発現により、誘導条件下での大腸菌におけるDHAおよびEPAの産生が裏づけられる。
DuetプラスミドpREZ330(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2を含む)、pREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)およびpREZ101(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAおよびorfCと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.6%であり、DPA n−6含量は0.3%であった。
DuetプラスミドpLR87(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2を含む)、pREZ91(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAを含む)およびpREZ1O1(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfAおよびorfCと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生、および低レベルのEPA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして1.7%であり、DPA n−6含量は0.9%であり、EPA含量は0.1%であった。
DuetプラスミドpREZ346(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1を含む)、pREZ330(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA2を含む)およびpREZ101(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。PFA1およびPFA2が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.3%であり、DPA n−6含量は0.1%であり、EPA含量は0.5%であった。
DuetプラスミドpLR100(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1を含む)、pLR87(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA2を含む)およびpREZ101(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCを含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させる。実施例15参照。コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1およびPFA2が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfCと併せて発現されることにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHAおよびEPAの産生が裏づけられる。
DuetプラスミドpREZ346(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1を含む)、pREZ96(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBを含む)およびpREZ326(シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA3を含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させた。実施例15参照。シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695 PFA1およびPFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBと併せて発現されたことにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHA産生が裏づけられた。細胞を増殖させ、実施例15に記載した通りにFAMEに関して分析した。形質転換された大腸菌のDHA含量はFAMEとして0.1%であり、EPA含量は0.1%であった。
DuetプラスミドpLR100(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1を含む)、pREZ96(シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBを含む)およびpREZ348(コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA3を含む)を、pJK737(HetIを含む)とともに、大腸菌株BLR(DE3)に導入して形質転換させる。実施例15参照。コドンが最適化されたヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212 PFA1およびPFA3が、シゾキトリウム属種ATCC 20888 orfBと併せて発現されることにより、誘導条件下での大腸菌におけるDHAおよびEPAの産生が裏づけられる。
シゾキトリウム属種ATCC PTA−9695およびヤブレツボカビ属種ATCC PTA−10212におけるPfa1p、Pfa2pおよびPfa3p PUFAシンターゼ活性を、標準的な手順によって個別にノックアウトする。例えば、米国特許第7,217,856号を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (17)
- 以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:72またはSEQ ID NO:122に対して少なくとも90%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼ(DH)活性、エノイル−ACPレダクターゼ(ER)活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:110に対して少なくとも90%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:112に対して少なくとも90%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(d)SEQ ID NO:114に対して少なくとも90%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。 - ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122に対して少なくとも95%同一である、請求項1記載の単離された核酸分子。
- それぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:73に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:111に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:113に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;ならびに
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:115に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。 - アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、請求項4記載の単離された核酸分子。
- ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115のアミノ酸配列を含む、請求項4記載の単離された核酸分子。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸分子またはそれらの組み合わせと、転写制御配列とを含む、組換え核酸分子。
- 組換えベクターである、請求項7記載の組換え核酸分子。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸分子、請求項7もしくは請求項8記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを発現する、宿主細胞。
- 植物細胞、微生物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、請求項9記載の宿主細胞。
- 微生物細胞である、請求項10記載の宿主細胞。
- 細菌である、請求項11記載の宿主細胞。
- ヤブレツボカビである、請求項11記載の宿主細胞。
- ヤブレツボカビがシゾキトリウム属であるか、またはヤブレツボカビ属である、請求項13記載の宿主細胞。
- 以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:73に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:111に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:113に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;ならびに
(d)SEQ ID NO:115に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。 - アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、請求項15記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項15または請求項16記載のポリペプチドと、生物学的に許容される担体とを含む、組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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