CN102070705B - 植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的TaFbox2基因导入水稻，转基因水稻对干旱胁迫表现出较强的耐受性。随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的增加，转基因植株与非转基因植株的耐逆性差异越来越明显。功能鉴定表明本发明克隆的TaFbox2基因能够增强植物的抗逆性，特别是对干旱抗性，在植物抗逆改良中具有重要应用前景。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，盐碱对作物生长存在很大抑制作用，通常土壤中含盐量为0.2-0.5％时就会影响植物的正常生长，严重时将导致植物萎蔫甚至死亡。这不仅造成农作物严重减产，也给生态环境造成巨大破坏。如何利用大面积的盐碱地和丰富的咸水资源发展农业，是迫切需要解决的重大课题。解决这一问题主要有两条途径：一是通过农业工程措施改良土壤，降低土壤盐分；另一种是走生物学路线，利用生物工程技术提高作物的抗逆性以改良和利用盐渍化土壤。相比之下，第二种是较经济有效的途径，分离与耐盐性相关的基因，并研究其功能及抗逆分子机制，从而寻找提高植物耐盐性的途径和方法，对于进一步利用分子育种方法培育耐盐作物品种具有重要意义。

植物通过泛素途径对相关蛋白水平进行调控，可以直接影响相应的生理生化过程，在细胞周期的控制、免疫应答、胁迫反应和细胞程序性死亡等许多细胞内基本生理过程中起重要作用。泛素途径主要有三种酶参与，包括泛素激活酶E1、结合酶E2和连接酶E3。其中，泛素连接酶E3对靶蛋白的特异性识别起关键作用(JacksonP.K.，Eldridge A.G.，Freed E.，Furstenthal L.，Hsu J.Y.，Kaiser B.K.，ReimannJ.D..The lore of the RINGs：substrate recognition and catalysis byubiquitin ligases.Trends Cell Biol，2000，10(10)：429-439.；Li M.，BrooksC.L.，Wu-baer F.，Chen D.，Baer R..Mono-versus polyubiquitination：differential control of p53 fate by Mdm2.Science，2003，302：1972-1975.)。SCF复合体是一种重要的E3连接酶，降解目标通常是某种转录的激活因子或抑制因子，是高等真核生物调节通路的重要方式，由Skp1、Cdc53(cullin)、F-box蛋白及RBX1四个亚基组成。除F-box蛋白以外的三个亚基组成一般性骨架，通过与不同的F-box蛋白结合识别不同的底物(Kong H.，Leebens-MackJ.，Ni W.，dePamphilis C.W.，Ma H..Highly heterogeneous rates of evolution in the SKP1gene family in plants and animals：functional and evolutionary implications.Mol Biol Evol，2004，21(1)：117-128.)。F-box蛋白的N端有一个由40-50个氨基酸组成的F-box结构域，通过参与SCF复合体的形成，介导泛素化蛋白底物的特异性识别(Bai C.，Sen P.，Hofmann K.，Ma L.，Goebl M.，Harper J.W.，ElledgeS.J..SKP1 connects cell cycle regulators to the ubiquitin proteolysismachinery through a novel motif，the F-box.Cell，1996，86(2)：263-74)，在降解过程中发挥关键作用。F-box蛋白质介导的泛素化蛋白质降解途径，是植物基因表达调控的一个非常重要的机制。

研究表明F-box蛋白能够通过降解调控因子调节激素、自交不亲和及胁迫反应，参与相应的信号传导途径(Quint M.，Gray W.M..Auxin signaling.CurrentOpinion in Plant Biology，2006，9：448-453.；Zhao L.，Ma W.S.，Han B.，LiangL.Z.，Zhang Y.S.，Hong G.F.，Xue Y.B..An F-box gene linked to theself-incompatibility(S)locus of Antirrhinum is expressed specifically inpollen and tapetum.Plant Molecular Biology，2002，50：29-42.；Wang L.，DongL.，Zhang Y.E.，Zhang Y.S.，Wu W.H.，Deng X.W.，Xue Y.B..Genome-wideanalysis of S-Locus F-box-like genes in Arabidopsis thaliana.PlantMolecular Biology，2004，56：929-945.)。目前，SCF复合体参与的信号途径研究主要集中在生长素(Dharmasiri N.，Dharmasiri S.，Weijers D.，Lechner E.，Yamada M.，Hobbie L.，Ehrismann J.S.，Jurgens G.，Estelle M..Plantdevelopment is regulated by a family of auxin receptor F-box proteins.DevCell，2005，9：109-119.)、乙烯(Guo Y.，Qiu Q.，Quintero F.J.，Pardo J.M.，Ohta M.，Zhang c.，Schumaker K.S.，Zhu J.K..Transgenic evaluation ofactivated mutant alleles of SOS2 reveals a critical requirement for itskinase activity and C-terminal regulatory domain for salt tolerance inArabidopsis thaliana.Plant Cell，2004，16：435-449.)和赤霉素(Dill A.，Thomas S.G.，Hu J.，Steber C.M.，Sun T.P..The Arabidopsis F-box proteinSLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induceddegradation.Plant Cell，2004，16：1392-1405.；Gomi K，Sasaki A，Itoh H，Ueguchi-Tanaka M，Ashikari M，Kitano H，Matsuoka M.GID2，an F-box subunitof the SCF E3 complex，specifically interacts with phosphorylated SLR1protein and regulates the gibberellin-dependent degradation of SLR1 in rice.Plant J.2004，37(4)：626-34.)三种植物激素上，对其在非生物胁迫反应中的作用还未见报道，但越来越多的研究表明F-box蛋白是非生物胁迫反应中的重要的调解因子，拟南芥F-box蛋白7(AtFBP7)，表达受温度胁迫的诱导(Calderón-Villalobos L.I.A.，Nill.C.，Marrocco K.，Kretsch T.，Schwechheimer C..The evolutionarily conserved Arabidopsis thaliana F-boxprotein AtFBP7 is required for efficient translation during temperaturestress.Gene，2007，392(1-2)：106-116.)。水稻基因组中许多F-box基因受非生物胁迫的上调表达，推测其在逆境信号传导过程中发挥了重要的作用(Jain M.，Nijhawan A.，Arora R.，Agarwal P.，Ray S.，Sharma P.，Kapoor S.，Tyagi A.K.，Khurana J.P..F-box Proteins in Rice：Genome-wide Analysis，Classification，Temporal and Spatial Gene Expression during Panicle and Seed Development，and Regulation by Light and Abiotic Stress.Plant Physiology，2007，143：1467-1483.)。根据拟南芥全基因组预测，编码F-box蛋白的基因有1000多个，推测在植物信号传导过程中依赖SCF的蛋白降解途径可能起极为广泛而重要的作用，但现在只对其中其少一部分的生物学功能有所了解(王红云，黄剑，赖钊，薛勇彪.植物F-box蛋白质及其研究进展.科学通报，2002，47(12)：891-895.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用。

本发明提供的植物耐逆性相关蛋白(TaFbox2)，来源于小麦属小麦(Triticumaestivum L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由402个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的TaFbox2便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagII	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TaFbox2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TaFbox2的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物耐逆性相关蛋白的基因(TaFbox2)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第259至1467位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

TaFbox2的全长cDNA序列(1766bp)如序列表的序列2所示，开放阅读框为自5’端第259至1467位核苷酸。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组载体可为如下(I)或(II)或(III)：

(I)将所述基因与pGEM-T质粒连接得到的重组质粒；

(II)将所述基因插入pCHF3的多克隆位点得到的重组质粒；具体可为将所述基因取代pCHF3载体KpnI和BamHI位点间的小片段得到的重组表达载体；

(III)将所述基因插入pet30a的多克隆位点得到的重组质粒；具体可为将所述基因取代pet30a载体KpnI和SacI位点间的小片段得到的重组表达载体。

含有以上任一所述基因(TaFbox2)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(TaFbox2)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可将编码所述植物耐逆性相关蛋白的基因TaFbox2导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

所述耐逆性具体可为耐旱性。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐逆性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻(如Kitaake水稻)、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明提供的TaFbox2基因是从小麦耐盐品系98-160材料中获得的，该基因保守结构域预测该基因前50个氨基酸处具有明显的F-Box结构，因此命名为TaFbox2。通过RT-PCR分析初步鉴定该基因受逆境胁迫诱导表达。TaFbox2基因的同源基因在其他禾本科作物中未见研究报道。将该基因构建真核细胞表达载体，导入水稻，对筛选到的阳性植株进行胁迫鉴定，转基因水稻对干旱胁迫表现出较强的耐受性。随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的增加，转基因植株与非转基因植株的耐逆性差异越来越明显。功能鉴定表明本发明克隆的TaFbox2基因能够增强植物的抗逆性，特别是对干旱抗性，在植物抗逆改良中具有重要应用前景。

附图说明

图1为TaFbox基因的扩增结果；A：5’RACE(1200bp)；B：3’RACE(800bp)；C：全长基因(1.7kb)。

图2为TaFbox基因的F-box结构域。

图3为TaFboxs在不同胁迫条件下的表达分析；A：250mM NaCl；B：16％PEG；C：低温(4℃)；1：0min(CK)；2：15min；3：2h；4：6h；5：12h；6：24h。

图4为TaFbox和TaFbox2蛋白原核表达分析；1：pet30a；2：TaFbox2(诱导前)；3：TaFbox2(诱导2h)；M：蛋白Marker。

图5为抗生素阳性植株PCR检测部分结果(箭头所指为目的片段)。

图6为PCR阳性植株southern杂交检测；A：HindIII酶切结果；B：杂交结果。

图7为转基因水稻苗期耐旱性鉴定。

图8为转基因水稻成株期耐旱性鉴定；A：控水处理的植株表型；B：正常处理的植株表型；C：控水处理的稻穗表型；D：正常处理的稻穗表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

培养基和溶液的配制：

NB基本培养基(1L)的配制方法如下：KNO₃ 2830mg，(NH₄)₂SO₄ 463mg，KH₂PO₄400mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，FeSO₄·7H₂O 27.85mg，Na₂-EDTA 37.25mg，MnSO₄·4H₂O 10mg，H₃BO₄ 3mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，KI 0.75mg，盐酸硫胺素(VB1)10mg，盐酸吡哆醇(VB6)1mg，烟酸(VB5)1mg，肌醇100mg，水解酪蛋白300mg，谷氨酰胺500mg，脯氨酸500mg，蔗糖30g，CEH(水解络蛋白)300mg，植物胶2.6g，定容到1L；pH调整为5.8，121℃灭菌20min。

NBco共培养基：NB基本培养基添加2，4-D 2mg/L和100μM的乙酰丁香酮(AS)，调整pH 5.5。

预筛选培养基NBps：NB基本培养基添加2，4-D 2mg/L和头孢霉素(cef)500mg/L，调整pH为5.8。

筛选培养基NBs：NB基本培养基添加2，4-D 2mg/L，头孢霉素(cef)500mg/L，潮霉素(Hyg)30mg/L，调整pH为5.8。

MS基本培养基：取50mL MS大量元素(20×)、5mL MS微量元素(200×)、5mL铁盐(200×)、5mL MS有机成分(200×)，混匀，加蔗糖30g，用1mol/L的NaOH调pH值到5.8，固体MS再加7g琼脂粉，定容至1000mL，121℃灭菌20min；

MS大量元素(20×)(1000mL)：NH₄NO₃33000mg，KNO₃ 38000mg，CaCl₂·2H₂O 8800mg，MgSO₄·7H₂O 7400mg，KH₂PO₄ 3400mg；

MS微量元素(200×)(1000mL)：KI 166mg，H₃BO₃ 1240mg，MnSO₄·7H₂O 4460mg，ZnSO₄·7H₂O 1720mg，Na₂MoO₄·2H₂O 50mg，CuSO₄·2H₂O 5mg，CoCl₂·2H₂O 5mg；

铁盐(200×)(1000mL)：FeSO4·7H₂O 5560mg，Na₂·EDTA·2H₂O 7460mg；

MS有机成分(200×)(1000mL)：肌醇(Inositol)20000mg，甘氨酸(Glycine)400mg，烟酸(Nicotinic acid)100mg，盐酸硫胺素(Vitamin B₁)100mg，盐酸吡哆醇(Vitamin B₆)100mg。

预再生培养基MSpr：MS基本培养基添加NAA 1mg/L，BAP 2mg/L，cef 500mg/L，Hyg 30mg/L，调整pH 5.8。

再生培养基MSr：MS基本培养基添加NAA 0.5mg/L，BAP 3mg/L，cef 500mg/L，Hyg 30mg/L，调整pH 5.8。

1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)(1000mL)：NaH₂PO₄ 38.9g、Na₂HPO₄ 258.12g；调pH值到7.2，ddH₂O定容至1000mL，121℃灭菌20min。

0.2mol/L NaH₂PO₄(pH7.0)(100mL)：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O溶于灭菌ddH₂O中，定容至100mL。

0.2mol/L Na₂HPO₄(pH7.0)(100mL)：7.17g Na₂HPO₄·12H₂O溶于灭菌ddH₂O中，定容至100mL。

GUS组织化学染色反应液(20mL)：0.2mol/L Na₂HPO₄(pH7.0)5mL、EDTA(0.5mol/L，pH8.0)5mL、Tween-2080μL、K₃[Fe(CN)₆](170mmol/L)118μL、K₄[Fe(CN)₆](170mmol/L)118μL、X-Gluc(20mg/mL)1mL；加ddH₂O定容至20mL，分装后-20℃贮存。

生物材料：

质粒pCHF3：王爱萍，景蕊莲，杨武德，董琦.小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化.2008，14(6)：750-752)；中国农业科学院作物科学研究所。

农杆菌GV3101：刘福秀，赵芹，阮小蕾，何云蔚，李华平.水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子.科学通报，2008，53(1)：96-103)；中国农业科学院作物科学研究所。

水稻种子(Kitaake；日本北海道早熟粳稻品种)：袁莉民，仇明，王朋，王志琴，杨建昌.C4转基因水稻秧苗叶片气孔和叶鞘维管束结构特征.中国农业科学，2006，39(5)：902-909)；中国农业科学院作物科学研究所。

98-160耐盐品系：秘彩莉，张学勇，温小杰，刘旭.利用cDNA-AFLP技术获得小麦耐盐性相关基因TaVHA-C.中国农业科学，2006，39(9)：1736-1742；中国农业科学院作物科学研究所。

中国春小麦：陈锋，何中虎，陈东升，张春利，夏先春.中国春小麦籽粒硬度puroindoline基因等位变异检测.中国农业科学，2007，40(2)：217-224；中国农业科学院作物科学研究所；原始来源不清。

实施例1、TaFboxs基因的发现

一、TaFboxs基因核苷酸序列的获得

将小麦耐盐品系98-160进行盐胁迫处理2h。利用cDNA-AFLP技术筛选到的盐胁迫处理后差异表达片段。以98-160的cDNA为模板，以cDNA-AFLP差异片段分别设计5’RACE和3’RACE引物，序列如下：92 3’-1：gCgATCAAAgCATAgTCCCTCTg和92 3’-2：gCgATCAAAgCATAgTCCCTCTgg，92 5’-1：gACACggAAggCAAgACATggAgg和92 5’-2：TTTAggTCCTCTggCTTTTATTggTCA。

PCR体系如表2所示：

表2PCR反应体系

试剂	5’RACE	3’RACE
			Gene racer 5’primer，10μM	3μl
Reverse GSP，10μM	2μl
			Gene racer 3’primer，10μM		3μl
Forward GSP，10μM		2μl
			RT template	4μl	4μl
10×LA buffer	5μl	5μl
			dNTP solution(25mM each)	0.5μl	0.5μl
LA Taq polymerase，5U/μl	0.5μl	0.5μl
			ddH2O	35μl	35μl
总体积	50μl	50μl

采用Touchdown PCR，程序如表3：

表3Touchdown PCR反应程序

扩增片段克隆到Promega的pGEM T-easy载体上进行测序。

5’RACE和3’RACE片段分别为1.2kb和800bp，分别进行测序。

二、TaFboxs全长cDNA的克隆

将得到的5’RACE和3’RACE片段进行拼接，即得到全长cDNA，以此为基础设计引物，序列如下：

92FL 5’-1ggCgggCAgCggCgACgAA

92FL 3’-1AgCAAACTTggTCAACATATACAgggTCTT

以LA-Taq进行扩增，程序如下：94℃5min，(94℃30sec；62℃1min；72℃4min)×32；72℃10min。

5’RACE、3’RACE和全长cDNA的电泳图见图1。

全长cDNA序列(1766bp)如序列表的序列2所示，开放阅读框为自5’端第259至1467位核苷酸，编码序列表的序列1所示的蛋白质(402个氨基酸残基)。将序列1所示的蛋白命名为TaFbox2，将TaFbox2的编码基因命名为TaFbox2。

将TaFbox2在NCBI中进行比对，同源性在禾本科作物中相似性不高。TaFbox2前50个氨基酸处具有明显的F-Box结构(见图2)。对其氨基酸组成进行统计分析(见表4)，分子量为46.5KD，含有极性氨基酸108个，等电点为4.995。

表4TaFbox2氨基酸组成分析

氨基酸数目	402
		分子量	46.5KD
强碱性氨基酸	38
		强酸性氨基酸	56
亲水性氨基酸	140
		极性氨基酸	108
等电点	4.995

根据TaFbox2全长cDNA序列设计一对引物如下：

上游引物：5’-GGTACCATGGCTTGCACACAGATGAACCGC-3’；

下游引物：5’-GAGCTCTCACGCTTCCACTCTTGGTTTGCC-3’。

以中国春小麦的cDNA为模板，用以上引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，发现PCR产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示，即小麦中国春和小麦耐盐品系98-160均具有TaFbox2基因。

实施例2、TaFboxs在不同胁迫条件下的表达分析

将中国春小麦的种子浸泡过夜，然后转入铺有滤纸的培养皿中，待幼苗长至5cm时，转入盛有Hoagland营养液的塑料盒中培养。当幼苗长至两叶一心时，分别进行盐胁迫处理、干旱胁迫处理和低温胁迫处理，处理时间为0h、15m、2h、6h、12h、24h。

盐胁迫处理：将幼苗根部浸在含有250mM NaCl的水溶液中，25℃培养。

干旱胁迫处理：将幼苗根部浸在含有16％(质量百分含量)PEG的水溶液中，25℃培养。

低温胁迫处理：将幼苗放置在4℃人工气候相中培养。

设计特异引物(TaFbox2-FORWARD：5’-ACAGCCTCATCTCCCACCCTG-3’和TAFBOX-REVERSE：5’-TCACGCTTCCACTCTTGGTTT-3’)，进行RT-PCR分析。

结果见图3。TaFboxs的表达受盐、干旱和低温胁迫的诱导，对盐和干旱的反应较为敏感，在短时间内迅速诱导表达。结果表明，转TaFboxs基因在增加植物的抗逆性方面具有应用前景。

实施例3、重组表达载体A(原核)的构建

一、TaFbox2的制备

根据基因的开放阅读框设计引物，加上酶切位点KpnI和SacI，引物序列如下：

上游引物：5’-GGTACCATGGCTTGCACACAGATGAACCGC-3’；

下游引物：5’-GAGCTCTCACGCTTCCACTCTTGGTTTGCC-3’。

提取中国春小麦的叶片mRNA，以mRNA反转录的cDNA为模板，用以上引物对进行PCR扩增获得目的基因。

二、重组表达载体A(原核)的构建

将原核表达载体pet30a(NOVAGEN 70782-3，购自Merck-Novagen)进行KpnI和SacI双酶切。将PCR产物与酶切后得到的载体骨架连接，得到重组表达载体A。

三、蛋白表达检测

将重组表达载体A(用pet30a作为对照)转化大肠杆菌(Trans1-T1；货号：CD501；购自Merck-Novagen)、挑选阳性克隆、提取单克隆质粒热激转化大肠菌株BL21(DE3)(货号：NOVAGEN 70782-3；购自Merck-Novagen)、挑取单菌落菌斑接种于2ml的LB液体培养基(含100mg/L羧卞青霉素)中，于37℃振荡培养过夜，次日将菌液按1∶100转接到50ml液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.5，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导目标蛋白表达，继续于37℃摇床培养，2h后分别取1ml菌液，7000rpm离心1min收集菌体。

将收集的菌体加入适量蛋白提取液，然后进行电泳检测。电泳结束后小心剥离胶，放入200-400ml 10％三氯乙酸染色液的盘内染色。电泳结果见图4。结果表明，序列2所示的TaFbox2能够表达完整的氨基酸序列(而对照没有相应的条带)，分子量大小与分析预测结果一致，从而表明所克隆基因的准确性及表达活性，可用于基因转化研究。

实施例4、转基因植物的获得和耐逆性鉴定

一、TaFbox基因的扩增

设计一对引物如下：

根据基因的开放阅读框设计引物，加上酶切位点KpnI和BamHI，引物序列如下：

Primer F：5’-GGTACCATGGCTTGCACACAGATGAACTGC-3’；

Primer R：5’-GGATCCTCACGCTTCCACTCTTGGTTTGCC-3’。

提取中国春小麦的mRNA，以mRNA反转录的cDNA为模板，用以上引物对进行PCR扩增获得目的基因。

PCR反应体系如表5。

表5PCR反应体系

反应程序：94℃5min，(94℃30sec；55℃30sec；72℃1min)×32，72℃10min。平末端加A反应体系(表6)。

表6加A反应体系

成分	体积(μl)
		10×Buffer	2
Mg2+	1.8
		Taq(5U/μl)	0.16
dNTP(25mM)	0.15
		PCR product	15
总体积	20

反应程序：72℃30min。

PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后挖胶回收。用百泰克时代公司的凝胶回收试剂盒进行纯化。

二、重组表达载体的构建

用限制性内切酶KpnI和BamHI酶切pCHF3，将得到的骨架载体与步骤一的纯化后酶切产物进行连接，室温下连接2小时以上。连接体系为表7。

表7pGEM-Teasy Vector连接体系

成分	体积
		T4 DNA ligase	1μl
2×T4 DNA ligase	2.5μl
		骨架载体	1μl
PCR products	xμl
		总体积	5μl

连接产物热击法转化大肠杆菌(Trans-T1；货号：CD501；购自全式金生物公司北京全式金生物技术有限公司)。

三、转基因植物的获得

1、用百泰克生物公司质粒小量提取试剂盒提取步骤二得到的大肠杆菌重组菌(或pCHF3，作为对照)的质粒。

2、农杆菌电击感受态的制备

1)从划线平板上挑取农杆菌GV3101单克隆，接种到5ml YEB培养基中，28℃、250rpm培养过夜；

2)按1∶200的比例接种到500ml YEP液体培养基(含50mg/L壮观霉素、50mg/L利福平)中，培养至OD600为0.6-0.8左右；

3)将菌液分装到预冷并灭菌的50ml离心管内，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体；

4)弃上清，加入50ml 10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体(甘油用超纯水配制，并灭菌)，4℃、4000rpm离心10min；

5)弃上清，加入25ml 10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

6)弃上清，加入5ml 10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

7)弃上清，加入1ml 10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，分装为20μl/管，液氮速冻后存于-70℃备用。

3、农杆菌的电击转化

在Gibico公司的cell Porter电击仪上进行。

1)将农杆菌感受态细胞、电击杯以及步骤1提取的质粒一起放到冰上直至感受态细胞融化；

2)打开电击仪的开关，并在电击槽内放入冰水混合物进行预冷；

3)将1μl步骤1提取的质粒加入已融化的盛有农杆菌感受态的离心管内，轻弹管底混匀；

4)将已混匀的质粒和农杆菌感受态一起转移至电击杯中，注意不要有气泡，并将电击杯放到电击槽内；

5)将电击槽与电击仪连接好，将开关拧向CHARGE，按MP将电压升至390伏以上，将开关转向ARM，待电压降到390伏时，按trigger键(电击参数：电容为330μF；电击速度为fast)；

6)取出转化液，加入500μl YEP液体培养基，28℃、220rpm复苏培养3h；

7)取3μl培养液加入适量YEP液体培养基均匀涂布在YEP固体平板(含有50mg/L壮观霉素，50mg/L利福平)上，28℃倒置培养2天。

4、转化用农杆菌菌液的制备

取PCR检测正确的农杆菌菌液5μl接种于5ml YEB液体培养基(含50mg/L壮观霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm培养30h。菌液按1∶400转接到300mlYEB液体培养基中，28℃、250rpm培养14h至OD6001.5-3.0。7000rpm、4℃离心15min收集菌液，重悬菌体于2倍体积的转化渗透液(1/2MS+2％Sucrose，6-BA：0.01mg/L，VB1：10mg/L，VB6：1mg/L，Silwet L-77：0.02％)。

5、水稻转化

(1)成熟水稻(Kitaake)种子用70％(体积百分含量)乙醇进行表面消毒1min后，用20％(体积百分含量)次氯酸钠(滴加一滴Tween-20)消毒20min，无菌水冲洗4-5次，于滤纸上吸干，种子的胚朝上置于NB固体培养基上，26℃、16h/8h光周期下培养，诱导愈伤组织。

(2)10-15d后，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入新的NB固体培养基在相同的条件下继代培养。3-4cm大小的愈伤组织即可用于侵染转化。

(3)将步骤4的农杆菌菌液均匀涂在固体YEP平板(含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平)上28℃黑暗培养2-3d，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养培养基AAM(含100μM乙酰丁香酮，简称AS)中，调整菌液浓度至OD600为0.2-0.5。

(4)将步骤2的胚性愈伤组织放入步骤3的农杆菌悬浮液中浸没，不时轻轻摇动15min。倾除菌液，将水稻愈伤组织用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，置于NBco共培养基上，28℃、黑暗共培养2-3d。

(5)共培养2-3d的愈伤组织用无菌水洗三次，用含有500mg/L的头孢霉素(cef)的水清洗15min，再用水冲洗一次，将愈伤组织吹干水分，转到含卡那霉素的预筛选培养基NBps上，26℃暗培养。

(6)培养7d后转入含卡那霉素的筛选培养基NBs，诱导抗性愈伤组织2-3次。待抗性愈伤组织长到一定大小后，挑选色泽金黄、质地紧凑的抗性愈伤组织转入预再生培养基MSpr，将来源相同的抗性愈伤组织移至培养基的同一区域，作为同一株系，26℃光照培养。

(7)7d后转入再生培养基MSr，直到出绿、分化出芽。长出的小苗到3-4cm后，移至生根培养基1/2MS的试管中，生根培养。生根培养2-3周，待小苗长出粗壮的根系后可移至温室培养。培养一段时间后即可移栽大田收获种子，得到T1代种子。

将T1代种子长成的植株进行PCR和Southern鉴定(部分鉴定结果见图5和图6)，鉴定阳性的植株即为转基因植株。鉴定阳性的T1代植株自交得到T2代种子。将T2代种子进行抗逆性鉴定。

6、抗逆性鉴定

(1)苗期干旱胁迫

将T2代转基因水稻、T2代转空载体对照水稻和野生型水稻(WT)的幼苗(各100株)一起进行干旱胁迫处理(2周不浇水)，2周后观察表型进行拍照，见图7。结果表明转TaFbox2基因的水稻表现出较强的抗旱性，苗期水稻干旱胁迫两周仍能存活，而非野生型水稻和转空载体植株则死亡。

(2)孕穗期干旱胁迫

将种植于田间的孕穗期的T2代转基因水稻(四个株系：line21、line22、line23和line24)、T2代转空载体对照水稻和野生型水稻(ck)转基因水稻和野生型水稻(各100株)进行控水处理(不人为浇水)和正常处理(每天灌水至水田保持3-5cm水层)，30天后观察植株和稻穗的表型并拍照，同时统计穗长、穗粒数和株高。植株和稻穗的表型见图8。水稻的穗长、穗粒数和株高结果表8。结果表明，在干旱胁迫的条件下，成熟的转基因水稻的穗长、穗粒数和株高明显高于野生型水稻，转空载体对照和野生型水稻的结果没有明显差异。因此，该基因能应用于改良植物抗逆性研究。

表8转基因株系与非转基因水稻性状比较

(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用

<130>CGGNARY92694

<160>2

<210>1

<211>402

<212>PRT

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

Met Ala Cys Thr Gln Met Asn Arg Ser Lys Asn Gly Ala Thr Ser Val

1               5                   10                  15

Ala Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ile Ile Glu Ile Leu Ser Leu Leu Pro

            20                  25                  30

Val Lys Ser Val Cys Arg Phe Lys Cys Val Ser Arg Leu Trp Tyr Ser

        35                  40                  45

Leu Ile Ser His Pro Glu His Arg Lys Arg Leu Pro Gln Thr Ile Ser

    50                  55                  60

Gly Phe Phe Tyr Pro Lys His Arg Leu Asn Asp Glu Tyr Asp Val Ile

65                  70                  75                  80

Thr Phe Pro Thr Phe Asp Gly Ile Ser Arg Asp Gln Glu Gln Leu Phe

                85                  90                  95

Pro Asp Ser Ser Leu Pro Phe Leu Thr Ala Tyr Arg Gln Ile Phe Pro

            100                 105                 110

Lys Asp Cys Cys Asn Gly Leu Ile Phe Cys Leu Cys Trp Lys Asp Ser

        115                 120                 125

Pro Ile Asp Glu Ala Asp Tyr Val Val Cys Asn Pro Ala Thr Glu Glu

    130                 135                 140

Trp Val Val Leu Pro Asp Ala Gly His Lys Ser Asp Ala Ile Ala Tyr

145                 150                 155                 160

Arg Leu Gly Phe Asp Gly Ala Met Ser Leu His Phe His Val Phe Gln

                165                 170                 175

Ile Leu Glu Asp Asp Glu Asp Tyr Gly Tyr Ile Ser Gly Val Asn Ile

            180                 185                 190

Tyr Ser Ser Glu Thr Gly Ala Trp Ser Tyr Lys Glu Asn Gly Trp Gly

        195                 200                 205

Asp Asn Glu Ile Gln Ile Val Glu Met Arg Gly Val Phe Phe Asn Gly

    210                 215                 220

Met Met His Leu Leu Thr Arg Glu Phe Lys Ile Leu Ala Val Asp Thr

225                 230                 235                 240

Glu Gly Lys Thr Trp Arg Thr Ile Ser Leu Leu Glu Thr Met Cys Asp

                245                 250                 255

Glu Asn Ile Tyr Leu Gly His Leu Ala Phe Ile Gly Gln Ser Gln Gly

            260                 265                 270

Arg Leu Tyr Tyr Ile Asn Met Arg Asp Asn Asp Ser Ser Lys Leu Ser

        275                 280                 285

Val Trp Ile Leu Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Glu Trp Ile Phe Lys Tyr

    290                 295                 300

Asn Ile Ser Thr Ser Gln Leu Phe Gly Glu Leu Phe Gly Glu Lys Asp

305                 310                 315                 320

Val Thr Leu Gln Arg Asp Tyr Ala Asp Leu Leu Leu Gln Arg Asp Tyr

                325                 330                 335

Ala Leu Ile Ala Ile His Pro Glu Cys Asn Leu Ile Phe Phe Val Trp

            340                 345                 350

Arg Cys Glu Asp Val Leu Leu Ser Tyr Asp Met Asp Arg Gly Lys Ala

        355                 360                 365

Arg Val Ile Cys Ser Leu Lys Glu His Ser Tyr His Thr Phe Pro Pro

    370                 375                 380

Tyr Leu Pro Tyr Val Pro Ser Phe Ser Arg Ile Gly Lys Pro Arg Val

385                 390                 395                 400

Glu Ala

<210>2

<211>1766

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

tggacactga catggactga aggagtaaaa accctaaatc ggaccatgga tcgactatgc     60

ggaagcatgg cttgagatcc tgtagtcgat cccgaatgtg gcgggcagcg gcgacgaacc    120

gggacgaagc ggcggcggtc tggaagctcg ccggcaggac aggaaaagag cagcggcgtc    180

tgacttacta gccgtcagcc gcagaaccgc cattgatagc cacttccatc gttgccgctc    240

cctgcttcag tagactgaat ggcttgcaca cagatgaacc gctccaagaa cggggcaacc    300

tctgttgctg accttacaga tgaccttatc atcgagattc tgtccctgct gccagtcaag    360

tcagtgtgcc gattcaagtg tgtctcccgg ctctggtaca gcctcatctc ccaccctgaa    420

caccgcaaaa ggcttcccca gaccatctcc ggcttcttct accccaagca cagactcaat    480

gatgagtatg atgtgataac atttcccact tttgatggta tttcaaggga tcaagagcag    540

ctattccctg attcctcgtt gcccttcttg accgcataca ggcagatttt cccaaaggac    600

tgctgcaatg gccttatttt ctgcctctgc tggaaggact ccccaataga cgaagccgat    660

tatgtggtat gcaatcctgc cactgaggaa tgggtagtcc tgcctgatgc tggccataaa    720

agtgatgcaa tagcctaccg tttgggtttc gatggagcca tgtcactcca cttccatgtg    780

ttccagatcc tagaggatga tgaggactat ggatatatct caggtgttaa tatctactca    840

tcagagacag gagcctggag ttacaaggaa aatggttggg gcgacaatga gattcagata    900

gttgagatga gaggcgtctt tttcaatgga atgatgcact tgctcacacg tgagtttaag     960

atactagcag ttgacactga gggtaagaca tggaggacca tttctttgct ggaaactatg    1020

tgtgatgaaa acatttattt aggtcatctt gcttttattg gtcaatctca agggcgactg    1080

tattatataa atatgagaga caatgatagc tccaaattat cagtctggat tcttgaggac    1140

tataatggta atgaatggat ctttaagtac aacatcagca cttcacaact ttttggggag    1200

ctttttgggg agaaggatgt cacgttacaa cgggactatg ctgatctctt gttgcaaagg    1260

gactatgctt tgatcgcaat ccatcctgag tgcaatttga tattctttgt ttggaggtgc    1320

gaggatgtgt tactgtcata tgacatggac cgtggtaaag ctcgtgttat ctgcagtcta    1380

aaagagcact cgtatcacac atttcctcca tatcttccct atgttccatc tttctcacgc    1440

attggcaaac caagagtgga agcgtgactc cagggtggag gctgacagtt gttaccgaca    1500

attatatgga gtcttttaga agtgttggac ctccagttat cacagctaaa ccatagggct    1560

acagctttgg tatagctctc taataacttt tcttgttccc tctgcagttt ttgcttttgc    1620

tttgatttag tcttgatatg tctatgaaat gctttcagtc attaagaccc tgtatatgtt    1680

gaccaagttt gcttgttttg gactggcctg attatttacc aagtttttat gggagacggt    1740

gtgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                         1766

Claims (10)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第259至1467位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体如下(I)或(II)或(III)：

(I)将权利要求2或3所述基因与pGEM-T质粒连接得到的重组质粒；

(II)将权利要求2或3所述基因插入pCHF3的多克隆位点得到的重组质粒；

(III)将权利要求2或3所述基因插入pet30a的多克隆位点得到的重组质粒。

8.一种培育耐旱转基因水稻的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的水稻中，得到耐旱性高于所述目的水稻的转基因水稻。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或7所述重组载体导入所述目的水稻中。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述目的水稻为Kitaake水稻。

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