CN103319581B

CN103319581B - 植物耐冷相关蛋白ltt9及其编码基因和应用

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Publication number: CN103319581B
Application number: CN201210072826.XA
Authority: CN
Inventors: 孙传清; 刘加勇; 刘凤霞; 谭禄宾; 付永彩; 朱作峰; 苏震
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2032-03-19
Also published as: CN103319581A

Abstract

本发明公开了一种与植物耐冷相关的蛋白及其编码基因和应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白与植物耐冷性密切相关，利用该蛋白的编码基因培育耐冷植物的方法具有操作简单、周期短的特点，适于推广应用，本发明所获得的转LTT9基因水稻经低温处理后存活率仍可达100％，同时与未转基因的对照水稻相比，株高更高，鲜重更重；本发明对植物耐冷分子机制的研究，植物耐冷品种的选育及植物耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义。

Description

植物耐冷相关蛋白LTT9及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种与植物耐冷相关的蛋白及其编码基因和应用，特别涉及一种来源于普通野生稻(O.rufipogon Griff.)且与植物耐冷相关的蛋白LTT9及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，低温冷害严重影响着水稻的高产稳产，水稻生长所需要的最适宜温度为15-18℃至30-33℃，粳稻和籼稻分别在15℃和18℃以下就发生冷害，这严重制约着水稻的播种面积和播种范围。低温冷害的表现方式也是多种多样的，缺绿是不耐冷品种遇到低温侵袭时的最初表现，缺绿的叶片即使温度恢复正常，也不能恢复正常的光合作用，轻者引起幼苗生长迟钝，重者导致枯萎和死苗。最终造成水稻产量的大幅度降低，因此迫切需要培育出耐冷的水稻品种。

普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种，野生稻在演化成栽培稻的过程中，经过自然选择和人工选择，基因多样性降低、等位基因数减少。据统计，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60％(Sun C Q，Wang X K，Li Z C，YoshimuraA.Comparison of the geneticdiversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102：157-162)，从而导致当前水稻品种选育所面临的遗传瓶颈问题。因此从水稻近缘野生种的普通野生稻(Oryza rufipogonGriff.)基因组中发掘和利用在栽培稻中已丢失或削弱的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。

我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位和克隆耐冷相关基因不仅为培育超耐冷新品种提供新基因和新技术，而且对加强我国野生稻基因资源的保护、将资源优势变成经济优势具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐冷相关的蛋白及其编码基因和应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为LTT9蛋白，来源于稻属普通野生稻(O.rufipogonGriff.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述LTT9蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述LTT9蛋白的基因(命名为LTT9)；所述LTT9基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第650至1768位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

其中，序列2由1910个核苷酸组成，第650-1768位为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。序列1由372个氨基酸组成。序列3由3048个核苷酸组成，有4个外显子和3个内含子，也编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述LTT9基因转录的启动子可为super启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在super1300质粒(参考文献：Yang Q，Chen Z Z，Zhou X F，Yin H B，Li X，Xin X F，Hong X H，Zhu J K and Gong Z Z.Overexpression of SOS(Salt Overly Sensitive)Genes Increases Salt Tolerance inTransgenic Arabidopsis.Molecular Plant，2009，2：22～31)的多克隆位点处插入所述LTT9基因(如序列表中序列2的第650-1768位所示的DNA分子)得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Xba I和Kpn I。

所述表达盒由能够启动所述LTT9基因表达的启动子，所述LTT9基因，以及转录终止序列组成。

所述LTT9蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：

a1)调控植物耐冷性；

a2)选育耐冷植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植株耐冷性具体为提高植物的耐冷性。

所述选育耐冷植物品种的方法，具体可包括将所述LTT9蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法。

该方法包括将编码所述LTT9蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，耐冷性提高。

所述LTT9蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述LTT9蛋白的基因(即LTT9基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第650至1768位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述LTT9基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述植物可为单子叶植物，如水稻，也可为双子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为水稻品种日本晴。

本发明所述耐冷主要为苗期耐冷。

本发明所提供的蛋白与植物耐冷性密切相关，利用该蛋白的编码基因培育耐冷植物的方法具有操作简单、周期短的特点，适于推广应用。本发明所获得的转LTT9基因水稻经低温处理后存活率仍可达100％，同时与未转基因的对照水稻相比，株高更高，鲜重更重。本发明对植物耐冷分子机制的研究，植物耐冷品种的选育及植物耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐冷性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为水稻耐冷系SIL208和桂朝2号的耐冷性比较。

图2为低温(4℃)处理条件下基因LTT9在耐冷系SIL208和桂朝2号中表达谱比较。其中，GC2代表桂朝2号；LOC_Os09g32310表示LTT9基因；Actin为内参基因。

图3为以Tge9BF和Tge9BR引物对对T₃代转LTT9基因水稻植株的PCR鉴定结果。其中，泳道1-40为鉴定阳性的转LTT9基因植株；泳道1300为转super1300空载植株对照。

图4为以F1和R1引物对对转super1300空载体水稻植株的PCR鉴定结果。其中，泳道1-50为鉴定阳性的转super1300空载体植株；泳道Ni为日本晴。

图5为T₃代转LTT9基因水稻植株和转super1300空载体植株的表型鉴定结果及T₃代转LTT9基因水稻植株和转空载体植株中LTT9基因的表达水平比较。其中，(A)为转LTT9基因植株和转空载体植株的表型鉴定结果；(B)为转LTT9基因植株和转空载体植株在图(A)中的分布；(C)为转LTT9基因植株和转空载体植株中LTT9基因的表达水平比较。(A)中，CK为正常条件下生长的T₃代转LTT9基因植株(OS9-1和OS9-3)和转空载体植株(1300)，对应(A)中的第一排；4℃为经4℃低温处理2d，正常条件下恢复生长7d后的T₃代转LTT9基因植株(OS9-1和OS9-3)和转空载体植株(1300)，对应(A)中的第二排。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻耐冷系SIL208：公众可以从中国农业大学获得。

水稻品种日本晴：国家种子资源库，库编号I1A13071。

水稻品种桂朝2号：公众可以从中国农业大学获得。参考文献：Zhang X，Zhou S X，Fu Y C，et al.Identification of a drought tolerant introgression line derived from Dongxiangcommon wild rice(O.rufipogon Griff.).Plant Mol Biol，2006，62：247～259。

植物表达载体super1300：公众可以从中国农业大学获得。参考文献：Yang Q，ChenZ Z，Zhou X F，Yin H B，Li X，Xin X F，Hong X H，Zhu J K and Gong Z Z.Overexpressionof SOS(Salt Overly Sensitive)Genes Increases Salt Tolerance in Transgenic Arabidopsis.Molecular Plant，2009，2：22～31。

实施例1、耐冷相关蛋白LTT9及基因的发现

首先将江西东乡普通野生稻与超高产水稻品种桂朝2号进行回交和自交，构建了以桂朝2号为遗传背景的渗入系群体(其中一个渗入系为SIL208)，对此群体进行苗期耐冷性鉴定，具体的鉴定方法为：种子用20％的次氯酸钠消毒后，置于底面直径5cm，高12cm的玻璃试管中，在25℃的组培室内催芽育苗。前期用蒸馏水培养，到一叶一心约13天后开始用1/3B₅培养液培养。将整齐的2叶1心幼苗置于底面直径5cm，高18cm的玻璃试管中，加入3cm左右深的1/3B₅培养液，放入4℃培养箱低温处理6天后移至组培室培养恢复生长7天。并观察统计活苗率。经过3次耐冷性重复鉴定发现：桂朝2号的活苗率仅有25％±3％，而来自野生稻的渗入系SIL208的活苗率均为100％，其表现出稳定的苗期耐冷性(图1)。

随后以水稻耐冷系SIL208为供体，以桂朝2号为受体构建F_2:3群体，对其群体按照上述方法进行苗期耐冷性鉴定，统计各株系的活苗率。并提取上述F_2:3群体各单株的基因组DNA，进行SSR分析，获得各株系的基因型，并利用QTXMAP17软件进行耐冷性QTL分析，结果在第9染色体上检测到与苗期耐冷性相关的主效QTL，其来自江西东乡普通野生稻的等位基因可增加群体的苗期耐冷性。与此同时，以水稻耐冷系SIL208及对照亲本水稻品种桂朝2号为材料进行芯片(芯片为Affimetrix公司的水稻全基因组芯片Rice Genome Array)，货号：900599)杂交，并在芯片数据分析的基础上，结合比较基因组学分析，在QTL定位区域内筛选耐冷相关基因，经过基因组比较、耐冷相关性分析，最后从水稻耐冷系SIL208获得一个新的耐冷基因，该基因的基因组序列与江西东乡普通野生稻的序列相同，而与桂朝2号不同，说明该基因来自江西东乡普通野生稻。经检测发现4℃低温处理(3h)条件下，该基因的表达量明显增加(图2)，初步判断该基因可能是冷诱导基因。将该基因命名为LTT9基因，LTT9基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，序列2由1910个核苷酸组成，其中自5’末端第650至1768位核苷酸为其开放阅读框。序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质(命名为LTT9蛋白)，序列1由372个氨基酸残基组成。序列2在耐冷渗入系SIL208基因组中的对应序列为序列表中序列3(由3048个核苷酸组成，有4外显子和3个内含子)。

实施例2、转LTT9基因水稻的获得及其鉴定

一、重组表达载体super1300-LTT9的构建

1、设计特异引物对

根据日本晴的LOC_Os09g32310的全长cDNA序列(genbank：AK074021)设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶Xba I和Kpn I识别位点及保护碱基，引物序列(下划线标注酶切识别序列和保护碱基)如下：

Ge9F：5’-GCTCTAGAATGCAGCTCAGTTTCTTCC-3’(携带XbaI酶切识别序列)；

Ge9R：5’-GCGGTACC TCATCCTATGGTTATTTCAGC-3’(携带KpnI酶切识别序列)。

2、将水稻耐冷系SIL208的苗期植株经4℃低温处理后，取地上部提取总RNA。

3、以步骤2提取的总RNA为模板，使用SuperScriptII反转录酶(Invitrogen，Catno.18064-014)进行反转录得到cDNA。

4、以步骤3得到的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对(Ge9F和Ge9R)进行PCR扩增，回收纯化PCR扩增产物。所述PCR产物的序列为GCTCTAGA+序列2的第650-1768位+GGTACCGC。

5、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切步骤4的PCR扩增产物，得到酶切产物。

6、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切植物表达载体super1300，回收载体骨架(约9700bp)。

7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到经测序证实含有LTT9基因的重组质粒，将其命名为super1300-LTT9。

根据测序结果，对重组质粒super1300-LTT9进行结构描述如下：以super1300载体为骨架载体，在Xba I和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第650至1768位核苷酸所示的LTT9基因，由super启动子(参考文献：Yang Q，Chen Z Z，ZhouX F，Yin H B，Li X，Xin X F，Hong X H，Zhu J K and Gong Z Z.Overexpression of SOS(Salt Overly Sensitive)Genes Increases Salt Tolerance in Transgenic Arabidopsis.Molecular Plant，2009，2：22～31)启动所述LTT9基因的表达。在重组质粒super1300-LTT9的制备过程中，也可采用人工合成序列表的序列2自5’末端第650至1768位核苷酸所示的LTT9基因。

二、LTT9转基因水稻的获得

1、LTT9转基因水稻的获得

将步骤一获得的重组表达载体super1300-LTT9用基因枪法转化水稻品种日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到潮霉素抗性植株(T₀代)。

为了避免日本晴内源LTT9基因的干扰，根据基因组和cDNA的序列设计了1对跨内含子的引物(由Tge9BF和Tge9BR组成)：

Tge9BF：5’-GTTCAGGTTGACCGAGCTTA-3’(序列2的第1183-1202位)

Tge9BR：5’-CCATCACAAATCCTGTAATC-3’(序列2的第1522-1541位的反向互补序列)

Tge9BF和Tge9BR的靶序列为序列表的序列2自5’末端第1183-1541位核苷酸所示的DNA，日本晴的基因组DNA作为模板时因存在内含子仅能扩增出包含内含子的更大的DNA片段。

从分化得到潮霉素抗性植株后代(T₀代)中分别提取基因组DNA，用LTT9基因引物对(Tge9BF和Tge9BR)进行PCR鉴定，得到40株转基因植株(图3)，将经鉴定表明含有外源LTT9基因(PCR产物大小为359bp)转基因植株命名为OS9(其中两株编号为OS9-1和OS9-3)。

2、转super1300空载体水稻的获得

将植物表达载体super1300用基因枪法转化水稻品种日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到潮霉素抗性植株(T₀代)。

从分化得到阳性植株(T₀代)中分别提取基因组DNA，用潮霉素引物对F1和R1(引物序列如下)进行PCR鉴定，得到50株转空载体植株(图4)，将经鉴定表明含有潮霉素基因的(PCR产物大小约为1000bp)植株命名为1300。

F1：5’-tacttctaca cagccatc-3’；

R1：5’-cgtctgtcga gaagtttc-3’

3、LTT9基因的表达量比较

分别提取T₃代转基因植株OS9-1和OS9-3(各10株)和转空载体植株1300(10株)的叶片的总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用q9-1F和q9-1R(引物序列如下)组成的引物对进行实时荧光PCR鉴定，比较LTT9基因的表达量。以转空载体植株1300中LTT9基因的表达量为0，计算转基因植株中LTT9基因的相对表达量，取平均值。进行三次重复试验，结果取平均值。

q9-1F：5’-atggagcgagctgtgaactt-3’

q9-1R：5’-gcagacgaggagaatccatc-3’

结果如图5中(C)和表1所示：LTT9基因在转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3叶片中的表达量均显著高于转空载体植株1300。其中，LTT9基因在转LTT9基因植株OS9-1叶片中的相对表达量为3.19±0.19，在OS9-3叶片中的相对表达量高达8.39±0.09。

表1LTT9基因在转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3叶片中的相对表达量

编号	重复1	重复2	重复3	平均值	标准误
						1300	0.00	0.00	0.00	0.00	0.40
OS9-1	3.52	2.84	3.22	3.19	0.19
						OS9-3	8.61	8.02	8.55	8.39	0.09

4、表型鉴定

将T₃代阳性转LTT9基因植株OS9-3和OS9-1单株的种子用20％的次氯酸钠消毒后，在25℃的组培室内催芽育苗。前期用蒸馏水培养，到一叶一心期，将10株整齐健壮的幼苗移到1∶1的蛭石∶营养土中，在培养箱中培养至二叶一心期，后转到低温培养箱中进行4℃低温处理，恢复生长7天后，观察统计转LTT9基因株系和转空载体对照1300植株的活苗率、株高、鲜重。进行三次重复试验，结果取平均值。

结果如图5和表2所示：低温处理后，转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3的活苗率均为100％±0％，而转空载体对照1300的活苗率为70％±14％；转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3的株高分别为19.7±2.3cm，20.4±1.2cm，而转空载体对照1300的株高只有14.6±1.8cm；转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3的鲜重分别为0.0823±0.0171g/植株和0.0865±0.0083g/植株，而转空载体对照1300的鲜重仅为0.0359±0.0054g/植株。转LTT9基因株系与转空载对照在以上指标中均达到了显著水平。由此可以表明，低温处理条件下，转LTT9基因株系OS9-1和OS9-3的长势均比转空载对照1300要好，表现出更强的耐冷性，过表达LTT9基因能显著增强水稻的耐冷性。

表2转LTT9基因植株OS9-1和OS9-3的活苗率、株高和鲜重

Claims

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为super启动子。

9.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或7或8所述的重组载体，或权利要求5所述的表达盒，或权利要求6所述的重组菌在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物耐冷性；

a2)选育耐冷植物品种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。

12.一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，耐冷性提高。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。