CN100451121C

CN100451121C - 一种控制水稻抽穗期基因及其应用

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Publication number: CN100451121C
Application number: CNB2006100181040A
Authority: CN
Inventors: 张启发; 陈志辉; 吴昌银
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2006-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2009-01-14
Anticipated expiration: 2026-01-05
Also published as: CN1995357A

Abstract

本发明公开了一种控制水稻抽穗期基因及应用，涉及一种从水稻突变体中鉴定的控制抽穗期的基因OsCM2的分离克隆、功能验证和应用。OsCM2基因编码的蛋白与拟南芥CM-2基因编码的蛋白有50%的同源性，OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通过基因工程技术提高或减弱OsCM2基因的表达量能够控制植物抽穗期，从而提高品种的地区与季节适应性。

Description

一种控制水稻抽穗期基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻抽穗期基因，采用正向遗传学的方法，筛选水稻T-DNA插入突变体库，通过突变表型与T-DNA插入位点基因共分离检测及互补实验证明，分离克隆的OsCM2基因为控制水稻抽穗期基因。本发明还涉及含有该基因或其同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植物的抽穗期在农业生产中的应用。

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线性，而被作为基因组研究的模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。水稻基因功能的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

水稻抽穗期是决定品种地区与季节适应性的重要农艺性状，能否适应特定地区生态环境、栽培耕作制度，主要取决于该品种在当地的生育期。选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种家所重视，水稻早熟基因的发现和利用将有助于解决早熟与丰产难以兼顾的矛盾，也有利于克服籼粳亚种间F1超亲迟熟的障碍。水稻籼粳亚种间杂种具有强大的杂种优势。但目前亚种间强优组合的广泛选配和实际利用仍受到诸多限制，其中生育期超亲就是最主要的制约因素之一。抽穗期遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，另外越来越频繁的自然灾害使选育合适生育期以及抽穗期受环境影响较小的品种在避灾利用中显得尤其重要。因此发掘和鉴定水稻抽穗期基因包括QTL(quantitative trait locus)，并深入探讨水稻抽穗期基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和应用价值。此外，分析抽穗期感光基因在栽培稻主要生态型中的分布频率，对探讨水稻类型的演化、起源与进化，以及种质的合理利用也具有重大意义。同时水稻作为单子叶模式植物，这方面研究也对同类植物特别是禾本科粮食作物的抽穗期基因和QTL研究具有指导意义。研究水稻抽穗期基因和QTL的最终目的是促进水稻遗传育种，实现水稻早熟高产。(董春林等，水稻抽穗期基因研究进展。中国农学通报，2005，21(6)：75-78；岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遗传研究进展。分子植物育种，2005，3(2)：222-228；邓晓建等，水稻品种生育期的遗传和基因定位。四川农业大学学报，2001，19(2)：172-178)

抽穗期的长短主要由品种的基本营养生长、感光性和感温性决定，但感温性与水稻的抽穗期没有直接关系。在生理上，水稻生育期可分为营养生长阶段和生殖生长阶段，营养生长阶段又可分为基本营养阶段(basic vegetative phase，BVP)和感光阶段(photoperiod sensitive phase，PSP)。水稻的生殖生长期和成熟期对大多数水稻品种来说都较稳定，而营养生长期则变化较大。因此，水稻品种生育期的不同主要是营养生长期变化所致，通常可用抽穗期即播种到抽穗的天数来反映生育期长短。由营养生长阶段转入生殖生长阶段是水稻感受外界信号完成其生活史的重要过程，植物感受外界光温信号后，通过一系列信号传导及放大最终引起营养生长向生殖生长的转变。感光性和基本营养生长性组合的多样性及强弱的不同，使得抽穗期呈现多种多样的变化，同时抽穗期容易受到环境条件的影响，其遗传基础较为复杂，一般认为抽穗期是由主效基因和微效基因共同控制的(岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遗传研究进展。分子植物育种，2005，3(2)：222-228；罗林广等，水稻抽穗期的遗传学研究。江苏农业学报，2001，17(2)：119～126；邓晓建等，水稻品种生育期的遗传和基因定位。四川农业大学学报，2001，19(2)：172-178)。

由于抽穗期的重要性，人们对抽穗期的研究已较为深入。特别是DNA分子标记技术的发展，借助高密度的分子连锁图谱，使数量性状基因定位工作发展很快。利用分子标记进行水稻抽穗期QTL定位已有不少研究报道。其它禾谷类作物抽穗期QTL定位工作也已广泛开展。

已有的遗传研究表明在控制水稻抽穗期基因中，感光基因及其修饰基因有18个：显性感光基因有Se-1、Se-3(t)、Se-4(t)、Se-5、E1、E2、E3、E4和U，隐性感光基因有se-2、se-6(t)、se-7(t)、se-9(t)和ef-2(t)，感光修饰基因有i-Se-1、Su-Se-1(t)、En-Se-1(t)和se-pat(t)。感光基因中，效应较大的是位于第6染色体的Se-1和位于第7染色体的E1，可能是控制水稻感光性的2个最主要基因。在已报道的11个非感光基因及其修饰基因中，显性早熟基因有Ef-1、Ef-x(t)、Ef-y(t)和Ef-cd(t)，隐性早熟基因有ef(t)，隐性迟熟基因有ef-3(t)、ef-4(t)和1f-3(t)，修饰基因有m-Ef-1w-Ef-1(t)和Su-Ef-cd(t)。而基本营养生长期则由2至3个基因控制。(董春林等，水稻抽穗期基因研究进展。中国农学通报，2005，21(6)：75-78)

同时不同基因间还存在互作关系，显性早熟基因位点Ef-1，有增强其早熟效应的修饰基因m^a-和m^b-Ef-1，及减弱Ef-1早熟效应的修饰基因w-Ef-1。非感光基因之间，如Ef-1与ef-3或ef-4结合时，二者的早、迟熟效应相互抵消，ef-3与ef-4结合时，二者的迟熟效应累加。感光基因与非感光基因之间也存在互作或修饰。如隐性感光基因se-6和se-7在与显性早熟基因Ef-1结合时，二者的效应可被Ef-1抑制。隐性感光基因ef-2与Ef-1结合时，二者的迟、早熟效应相互抵消，与ef-3或ef-4结合时，二者的迟熟效应累加。强感光基因E1的隐性等位基因e1则是Ef-1的修饰基因。此外隐性基因ef-1和se-1的同时存在可显著延长水稻的基本营养生长期。控制水稻感光性的基因E1、E2、E3，其中E1基因的作用远比E2和E3大，但E3的存在，特别是E2和E3同时存在时，E1的感光性效应显著增强。而隐性感光抑制基因i-Se-1的存在，可抑制Se-1的感光性，使得水稻在长日照下提前抽穗。已有研究表明，大多数早籼品种虽然带有感光基因但不表现出感光特性，原因就在于这些品种存在隐性感光抑制基因i-Se-1。(罗林广等，水稻抽穗期的遗传学研究。江苏农业学报，2001，17(2)：119-126；徐俊锋等，水稻光温敏雄性不育系培矮64S的抽穗期基因型分析。遗传学报，2005，32(1)：57-65；邓晓建等，水稻品种生育期的遗传和基因定位。四川农业大学学报，2001，19(2)：172-178)

根据Gramene网站(http://www.gramene.org/qtl/index.html)最新公布的数据，水稻抽穗期QTL定位方面，目前共定位了653个QTLs，分布于水稻12条染色体上，其中第3、7染色体上定位的QTL较多，而第10染色体上发现的最少。

对定位的水稻抽穗期QTL构建近等基因系并进行精细定位后，可用图位克隆法加以克隆。目前有许多控制抽穗期基因已被克隆，如Hd1基因(Yano M.et al.，Hd1，a ma jorphotoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice，is closely relatedto the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS，The Plant Cell，2000，12：2473-2483)；SE5基因(Izawa T.et al.，Phytochromes confer the photoperiodiccontrol of flowering in rice(a short-day plant)，Plant J.，2000，22：391-399)；Hd6基因(Takahashi Y.et al.，Hd6，a rice quantitative trait locus involved inphotoperiod sensitivity，encodes the αsubunit of protein kinase CK2，Proc.Natl.Acad.Sci.，2001，98：7922-7927)；Hd3a基因(Kojima S.et al.，Hd3a，a rice orthologof the Arabidopsis FT gene，promotes transition to flowering downstream of Hd1under short-day conditions，Plant Cell Physiol，2002，43：1096-1105)；Ehd1基因(Doi K.et al.，Ehdl，a B-type response regulator in rice，confers short-daypromotion of flowering and controls FT-like gene expression independently ofHd1，Genes Dev.，2004，18(8)：926-936)。

以上这些抽穗期基因或QTL都是通过传统图位克隆法克隆到，首先必须构建一个很好的群体，如重组自交系，DH群体或近等基因系等，再上大量标记，通过基因与标记的共分离，逐渐缩小目标区段，是一个耗时耗力的过程。而通过T-DNA标签技术克隆基因，完全从另一个不同的角度，打开了克隆抽穗期基因的一扇窗。大量研究表明，农杆菌T-DNA是随机整合到植物基因组中，由于T-DNA序列已知，犹如给基因组“贴”了一个序列标签，为分离侧翼序列带来方便。可以通过创建T-DNA插入突变体，观察突变体抽穗期变异，检测T-DNA与突变表型共分离，根据分离到的侧翼序列，可知道是什么基因发生突变，再做互补实验验证就可以克隆到抽穗期基因。本发明通过T-DNA标签技术克隆到了控制水稻抽穗期的基因OsCM2。

水稻抽穗期遗传基础的揭示最终依赖于所有抽穗期基因的克隆及功能分析。对拟南芥的成花基因研究发现，至少存在生物钟、光周期、春化作用及自主促进开花等路径。另外，Cerdan和Chory发现还存在一个光质调控植物开花的路径(Cerdan P.D.，andChory J.，Regulation of flowering time by light quality，Nature，2003，423：881-885)。水稻与拟南芥在诱导开花的基因上具有保守性，水稻作为短日模式植物将与长日模式植物拟南芥一起，在最终揭开植物成花的机理的研究中将发挥不可替代的作用。(岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遗传研究进展。分子植物育种，2005，3(2)：222-228)

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制水稻抽穗期基因OsCM2，该基因从T-DNA插入突变体中鉴定并分离克隆，具有如SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列。以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

本发明的另一个目的是提供OsCM2基因在控制水稻抽穗期中的应用，通过OsCM2基因，SEQ.ID.NO：1或与其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表达或抑制表达，一种分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列，来达到控制水稻抽穗期的目的，从而提高水稻品种的地区与季节适应性。

实现本发明的技术如下：

创建水稻T-DNA插入突变体库T0代(Wu等，Development of enhancer trap lines forfunctional analysis ofthe rice genome.Plant J.2003，35：418-27.)。从T0代突变体库中选出3000份种子(T1代)，正常大田条件下种植，每份种20株(称为1个家系)。观察突变体抽穗期变化，共观察到约72个家系有抽穗期突变。用PCR(polymerase chain reaction)方法检测突变家系与T-DNA是否共分离，72个突变家系中有35个为PCR阳性共分离。并对每个共分离家系所种的20个单株做PCR阳性检测，大致估算T-DNA拷贝数，根据孟德尔遗传规律单位点基因会出现3∶1分离，当阳性∶阴性＝3∶1为单拷贝，检测结果约有30％家系为单拷贝。对35个T-DNA共分离家系做Tail-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)(Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatableamplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones forchromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)分离侧翼序列。有12个家系分离到侧翼序列，分析侧翼序列发现6个家系的侧翼序列能很好的定位在水稻基因组上。接着设计引物做进一步共分离验证，如图2，A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA边界序列设计的引物。在T1代植株中，T-DNA位点纯合植株只有A和C配对可以扩增出电泳带，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。结果6个家系中只有一个家系证明突变表型与T-DNA插入共分离。该突变体比正常植株抽穗迟20天。为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代，结果T2代仍然表现出稳定的突变表型，且表型与基因型完全符合。该突变体T-DNA插入在水稻第2染色体上，为单拷贝，GenBank核苷酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中对应的克隆号：AP004087，插入该克隆第22640位碱基旁，分析插入位点附近序列发现，T-DNA插入一个假定的分枝酸变位酶基因中。由于T-DNA上含有Enhancer Trap(Springer P S.Gene Traps：Tools for plant development and genomics.Plant Cell，2000，12：1007-1020)，其上的报告基因带有一个剪切过的小启动子，仅含TATAbox和转录起始点，不足以启动报告基因β-glucuronidase A(GUS)表达，而只有借助邻近的增强子元件才能表达。通过检测报告基因的表达模式，可以判断该增强子元件所控制基因的表达模式。对突变体GUS染色结果发现在根、茎、叶中全部有GUS表达，这与该基因在拟南芥中的表达模式相同(Jenny Eberhard et al.，Cloning and expression in yeast of a higher plantchorismate mutase molecular cloning，sequencing of the cDNA and characterizationof the Arabidopsis thaliana enzyme expressed in yeast.Plant Journal，1996，334(2)：233-236)。对正常水稻做RNAi(RNA interference)实验，结果发现约有1/5的转化子抽穗时间推迟约17-22天，其它抽穗时间介于突变与正常之间。同时做互补实验验证OsCM2基因功能，用限制性内切酶BamHI和PstI(Takara公司)酶切日本晴BAC克隆OSJNBa0037D03(http://www.genome.arizona.edu)可以切出含有OsCM2基因的约11.5KB的片段，连接到载体pCAMBIA2301上(pCAMBIA2301由澳大利亚CAMBIA实验室Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将构建好的互补载体导入抽穗迟突变体。最后获得互补转化的组培苗100株，作为对照的由突变体愈伤不经过转化直接分化得到的30株苗子，以及野生型粳稻品种中花11号愈伤分化苗子30株，都种于大田，结果没经过互补的突变苗全部表现抽穗迟，野生型粳稻品种中花11号愈伤分化苗抽穗正常，30株互补的转化苗有50％恢复正常。说明OsCM2基因具有控制抽穗期的功能。

本发明的优点：

1.采用T-DNA标签法克隆基因速度快，效率高。

2.虽然在低等生物和拟南芥中克隆到了分枝酸变位酶基因(chori smate mutase，CM)，但只是对其做酶学特性和生化途径中的作用进行分析，甚至对CM-2在生化途径中的作用也很模糊，更不知其具体的生物学功能，目前在水稻中还没有对CM-2具体研究的报道，本发明克隆的OsCM2基因对水稻抽穗期有显著的影响，这对阐明分枝酸变位酶基因的生物学功能有重要意义。

3.该突变体使抽穗期推迟20天，说明OsCM2基因对改变抽穗期效果很明显，通过基因工程技术提高或减弱OsCM2基因的表达量能够控制植物抽穗期。

4.水稻抽穗期决定了品种的地区与季节适应性，一个品种能否适应特定地区生态环境、栽培耕作制度，主要取决于该品种在当地的生育期。通过基因工程技术提高或减弱OsCM2基因的表达量能够达到控制植物抽穗期的目的，OsCM2基因的克隆将有助于提高水稻品种的地区与季节适应性。

5.选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种家所重视，水稻早熟基因的发现和利用将有助于解决早熟与丰产难以兼顾的矛盾，通过超量表达OsCM2基因可以达到早熟的目的，从而解决早熟与丰产的矛盾。

6.水稻籼粳亚种间杂种具有强大的杂种优势，但目前亚种间强优组合的广泛选配和实际利用仍受到诸多限制，其中生育期超亲就是最主要的制约因素之一。OsCM2基因的克隆有利于克服籼粳亚种间F1超亲迟熟的障碍。

7.越来越频繁的自然灾害使选育合适生育期以及抽穗期受环境影响较小的品种在避灾利用中显得尤其重要。OsCM2基因的克隆将有助于培育更适合的品种。

8.抽穗期遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，因此发掘和鉴定水稻抽穗期基因，并深入探讨水稻抽穗期基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和应用价值。同时水稻作为单子叶模式植物，这方面研究也对同类植物特别是禾本科粮食作物的抽穗期基因研究具有指导意义。水稻抽穗期遗传基础的揭示最终依赖于所有抽穗期基因的克隆及功能分析。对拟南芥的成花基因研究发现，至少存在生物钟、光周期、春化作用及自主促进开花等路径。水稻与拟南芥在诱导开花的基因上具有保守性，水稻作为短日模式植物将与长日模式植物拟南芥一起，在最终揭开植物成花的机理的研究中将发挥不可替代的作用。

附图说明

图1.创建突变体库所用载体图pSMR-J18R(http://rmd.ncpgr.cn/)。

图2.根据插入位点设计引物验证共分离示意图。A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA边界序列设计的引物。在T1代植株中，T-DNA插入位点纯合突变体只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，T-DNA插入位点杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。

图3.T1代单株根据插入位点设计引物PCR扩增的结果。上一行引物：A+B，下一行引物：C+B，M表示2KB Maker，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，为T-DNA插入位点纯合植株DNA样品；4，12，13，14，15为T-DNA插入位点杂合植株DNA样品；6，8，10，17，18为该位点不含T-DNA插入的DNA样品。PCR扩增结果与该植株田间表型对应发现，T-DNA插入位点纯合植株均表现为迟抽穗；T-DNA插入位点杂合与T-DNA阴性植株均表现为抽穗正常。

图4.迟抽穗突变体Oscm2的照片。

图5.T2代验证共分离的PCR结果。上一行引物：A与B配对，下一行引物：C与B配对，M表示2KB Maker，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37为T-DNA插入位点纯合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40为T-DNA插入位点杂合单株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39为T-DNA阴性单株。与田间表型对照，T-DNA纯合植株表型为抽穗迟；T-DNA杂合与T-DNA阴性植株表型为抽穗正常。

图6.OsCM2基因结构图。

图7.莽草酸途径。(Lars M.Voll，The Arabidopsis phenylalanine insensitivegrowth Mutant Exhibits a Deregulated Amino Acid Metabolism.Plant Physiology，2004，136，3058-3069)。

图8.抽穗迟Oscm2突变体GUS染色结果。

图9.pHellsgate 8载体图

(http://www.pi.csiro.au/tech_licensing_biol/MapsProtocol.htm)。

图10.粳稻品种中花11号RNAi干涉基因OsCM2后的表型。

具体实施方式

实施例1：OsCM2基因的分离克隆

1.创建突变体库(T0代)

所用载体pSMR-J18R由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture)惠赠，如图1，以农杆菌EHA105介导方式在粳稻水稻品种中花11号(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua 11)基因组中随机插入T-DNA(含Enhancer Trap)(Springer P S.Gene Traps：Tools for plantdevelopment and genomics.Plant Cell，2000，12：1007-1020)创建突变体库，突变体库的构建是按照Wu等所描述的方法构建而成(Wu等，Development of enhancer traplines for functional analysis of the rice genome.Plant J，2003，35：418-427)。目前约得到10万株独立转化子。

2.T1代分蘖性状大田筛选

从T0代突变体库中选出3000份T1代种子，先在秧田划5×8寸的格子播种，20天后再移栽至大田筛选。每份材料种2行，每行10株，共20株(为1家系)，行与行间间距8寸，株与株间间距5寸。从开始抽穗起，每隔一天下田观察登记抽穗日期。共观察到约72个家系有抽穗期突变(与正常中花11抽穗期相比早或迟7天以上)。

3.突变株系与T-DNA共分离检测及T-DNA拷贝数初步分析。

用PCR方法检测突变家系与T-DNA是否共分离，即突变株必需是T-DNA阳性。所用引物：GAL4-L 5’AGACCGGCAACAGGATTCAATC 3’，GAL4-R 5’TTCGTCCAGGACAACGTGAAC A 3’，反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mMMgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3U Taq酶，加ddH₂O(无菌去离子水)至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。扩出的片段为T-DNA上的一个片段，大小为611bp。72个突变家系中有35个为PCR阳性共分离。并对每个共分离家系所种的20个单株做阳性检测，大致估算T-DNA拷贝数，根据孟德尔遗传规律单位点基因会出现3∶1分离，当阳性∶阴性＝3∶1时为单拷贝。检测结果约有30％家系为单拷贝。

4.分离侧翼序列

对35个T-DNA共分离家系按Liu等的Tail-PCR方法(Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing ofinsert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)分离侧翼序列。利用CTAB法抽提突变体总DNA，方法如SAGHAI-MAROOF等(SAGHAI-MAROOF et al.，Ribosomal DNA spacer-lengthpolymorphisms in barley：Mendelian inheritance，chromosomal location，andpopulation dynamics.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，81：8014-8018)。根据转化载体pSMR-J18R的T-DNA左侧末端设计的嵌套式特异引物序列和引物在载体上对应的位置如下引物LSP2：5’-GAA GTA CTC GCC GAT AGT GGA AAC C-3’6701-6677；LBT2引物：5’-ATA GGG TTT CGC TCA TGT GTT GAG CAT-3’6550-6524；LBT3引物：5’-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCC CCC GAA T-3’6447-6420。用于分离侧翼序列的简并引物及其序列为：引物AD2a：5’-(AGCT)GT CGA(GC)(AT)G A(AGCT)A(AT)GAA-3’。反应体系为：第一轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2Mm dNTP 2.0μl；25Mm MgCl2 2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH20至20μl。第二轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2Mm dNTP 2.0μl；25Mm MgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH₂O至20μl。第三轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2mM dNTP 1.5μl；25mM MgCl₂1.2μl；50％甘油2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O至20μl。反应程序按照Liu等的方法进行。反应完成后，取第三轮反应产物5μl在0.8％的琼脂糖凝胶上检测。采用低熔点琼脂糖挖胶回收的方法纯化PCR反应产物。纯化方法为：将第三轮PCR反应产物在1％的低熔点琼脂糖上电泳，把扩增产物条带从胶上切下放入1.5ml Eppendoff离心管中，65℃水浴15min，加入等体积PH7.9苯酚，颠倒摇匀5min，13000r/min离心8min，取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)颠倒摇匀5min，13000r/min离心8min，取上清，加入1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，2倍体积预冷的95％乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min以上，13000r/min离心15min，倒掉95％乙醇后再用75％乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于20μl无菌去离子水。把回收产物测序，测序引物序列及在载体上位置为：引物NTLB55’-AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA-3’6437-6418，有12个家系分离到侧翼序列，分析侧翼序列发现有6个家系的侧翼序列能很好的定位在水稻基因组上。

5.根据侧翼序列设计引物进一步做共分离检测

根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物A和B，及T-DNA上设计一条引物C，如图2，A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。如果突变性状是隐性的，那所有突变株用A和B配对扩不出的为共分离。如果突变性状是显性的，那所有突变单株用C和B配对都扩出，正常单株用C和B配对都扩不出的为共分离。结果6个家系中只有一个家系是共分离。该家系突变表型，如图4，该突变体比正常植株抽穗迟20天。其分离的侧翼序列全长520bp如下：

atgctcttat tagtaattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcttacca gctgtggctt attgcttggccgaatggtgc tgcaaagtga cattctgacc gccatcctga ctctttcgcc aaaatatttt cagctgcaaa tatgatgaacacaattatgt aagcacatat aaatagactt attgaatgtg gcatgaggaa atccatcaag aacagctaac agcggtgacttgctgtagaa tttccggtac tgtatcttgg atctttcttc atctctctcg accatctcgt accggatttt ggttttaggaattagaaatt ttattgatat atttatttaa gaaatgcaaa tacatagtaa gggtttctta tacgctcaac acatgagcgaaaccctatag gaaacatttt tgcccttatc tgggaaactt cctcccacat attttatgga aaacctcaat ttttcccaataaaaaaatcc cctggcggaa atctgccttt tttttttttt

采用BLAST分析方法(Altschul S F et al.，Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.，1990，215：403-410)发现侧翼序列16-54与载体左末端匹配，93-110，125-285分别和GenBank核苷酸数据库中的克隆：AP004087的22640-22657，22492-22332匹配，同源性高达100％。根据插入位点设计的引物序列为A(引物)：5’CCACTAATCCGTGCAAAGGT 3’。B(引物)：5’CCCTCAGTATCAGCCACCAC 3’。C(引物)：5’AATCCAGATCCCCCGAATTA 3’，PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。PCR结果，如图3，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，为T-DNA纯合；4，12，13，14，15为T-DNA杂合；6，8，10，17，18为T-DNA阴性。与田间表型对照，T-DNA纯合植株表型为抽穗迟；T-DNA杂合与T-DNA阴性植株表型为抽穗正常。其中突变株偏多，可能是群体偏小，或者是插秧时不完全随机造成。而到T2代就是3∶1分离。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。

6.T2代进一步做共分离验证

为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代(将T1代收获的种子播种得到T2代)，分别种了突变体，杂合子及正常3种类型，突变单株(即T-DNA纯合)下一代不再分离，表型一致都是抽穗迟；杂合单株下一代出现3∶1的表型分离，即正常∶抽穗迟＝3∶1；正常植株下一代没有出现分离，全部正常。同时PCR检测也表明基因型与表现型吻合，如图5，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37为T-DNA纯合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40为T-DNA杂合单株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39为T-DNA阴性单株。与田间表型对照，T-DNA纯合植株表型为抽穗迟；T-DNA杂合与T-DNA阴性植株表型为抽穗正常。由此证明，这个突变体是由于T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

7.确定突变位点，获得候选基因，并进行功能分析。

采用BLAST分析发现，该突变体T-DNA插入水稻第2染色体，对应GenBank核苷酸数据库中的克隆号为：AP004087，插入该克隆第22640位碱基旁，分析插入位点附近序列发现，T-DNA插入一个假定的分枝酸变位酶基因CM-2(putative chorismate mutase2)的外显子中，该基因有全长cDNA，在KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)对应的克隆号：AK101220，全长cDNA序列如下：

cgtgtggaggatcagcagcagcagctttcccttagctcgcgagctcatcagtcatcacagggcggatcgagagatcatcgatgggcgaggcggagctgagcctggcggcggtgcgcgacgcgctggtgcgggaggaggactccatcgtcttcgccctcatcgagcgcgccaggcgcccgcgcaacgcgccggcatacgcggccgccgccgccgccggcggccgatccctcgccgagttcttcgtccgggaagccgaggttctgcacgccaaggccggacaataccaaaagccagaagatgttccattctttccccaagatctcccttcacctctatttcctaccaaagattacccaaaggttttgcactcttttgcatcatcagtcagtgtgaatgatgcaatatggaagatgtatttcaacgagttgcttccactattcactgtggatggagatgatggtaactatgcagaaacagttgcattagattttgcatgtctgaaggccctgtcaagaagaattcatattggtaaatatgttgctgaggtgaagttcaaagatgcttcccaagattatagtccactaatccgtgcaaaggataccaaggctctgatgaatctgctaacattcaaggcggttgaagagaaggtgaaaaggagagtagagaagaaggccaggatatttggtcagaatgtcactttggaggacaatgctgacaagcaagaaggcaatgcaggtgacagtgagtgcaaagttaatcctgaagtgctatctaagctatatgatctgtgggtaatgcctttgacgaaggatgttgaagttgagtatcttctccgccgtcttgactgattcgccaaaatattttcagctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtggcatgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtactgtatcttggatctttcttcatctccgttttcggagctgagacatatagggcctgtttggtacagctctaactcctaaatttagctccaagagttgggtctggagtggagttgtggagctgcctaaacccagctccacaactctagttcattttgtgagagagctccacccagctccactcccagttttggtggagctgaaactgtttggctgagctccagctccaggaggggtagagctggagctggagctgtgccaaaacaggcccatagattgatggcaatgatctgcaacccaaaaggttcatcctacctaactgtggtggctgatactgagggcctggtgaattcccagcaaagatgctgcaactccagtttctgtaacaatctgtaactcctgttattatatcaccatagttttgtgctacttcttggtagtagcatttctgttc。该基因结构如图6。其编码的蛋白与拟南芥的CM-2有50％同源性。

分枝酸变位酶CM(Chorismate mutase，EC 5.4.99.5)是莽草酸途径中分枝部位的第一个酶，当代谢终产物苯丙氨酸，酪氨酸过量时会抑制分枝酸变位酶活性，同时另一分枝代谢产物色氨酸过量时会激活分枝酸变位酶活性，如图7。生物体中许多物质都含有苯环，它们主要来自莽草酸途径。构成蛋白质的3种芳香族氨基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，都是莽草酸途径的初级代谢产物，同时这3种芳香族氨基酸还是各种含苯环的次级代谢物的前体，通过次级代谢可生成如生长素，生物碱，类黄酮等。有些次级代谢产物还是防御反映的信号分子，如创伤，辐射，病源感染等会造成芳香族氨基酸及次级代谢产物的增强(Evelyn M.Mobley et al.，Identification，characterizationand comparative analysis of a novel chorismate mutase gene in Arabidopsisthaliana Gene，1999，240(1999)：115-123)。在许多真菌和细菌中都鉴定到分枝酸变位酶活性，但各自在结构和活性上都有很大差异，对应的一些基因也已被克隆。在拟南芥中已分离到3种分枝酸变位酶基因CM-1，CM-2，CM-3，它们在结构和活性上有一定的差异(Jenny Eberhard et al.，Cloning and expression in yeast of a higher plantchorismate mutase Molecular cloning，sequencing of the cDNA and characterizationof the Arabidopsis thaliana enzyme expressed in yeast.FEBS，1993，334(2)：233-236；Jenny Eberhard et al.，Cytosolic and plastidic chorismate mutaseisozymes from Arabidopsis thaliana：molecular characterization and enzymaticproperties.Plant Journal，1996，10(5)：815-821；Evelyn M.Mobley et al.，Identification，characterization and comparative analysis of a novel chorismatemutase gene in Arabidopsis thaliana Gene，1999，240(1999)：115-123)，之前的这些研究只是集中在对分枝酸变位酶酶学特性和生化途径中的作用进行分析，甚至对CM-2在生化途径中的作用也很模糊，更不知其具体的生物学功能，目前在水稻中还没有对CM-2具体研究的报道。

实施例2：基因表达分析

本发明所得的突变体是由T-DNA随机插入水稻基因组造成的，该T-DNA上含有Enhancer Trap，其上的报告基因带有一个剪切过的小启动子，仅含TATAbox和转录起始点，不足以启动报告基因表达，而只有借助邻近的增强子元件才能表达。同过检测报告基因的表达模式可以，可以判断该增强子元件所控制基因的表达模式。对突变体GUS染色结果，如图8，在根、茎、叶中全部表达，这与该基因在拟南芥中的表达模式相同(Jenny Eberhard et al.，Cytosolic and plastidic chorismate mutase isozymes fromArabidopsis thaliana：molecular characterization and enzymatic properties.Plant Journal，1996，10(5)：815-821)。这也从另一角度证明了T-DNA是插在该基因上。

实施例3：RNAi(RNA interference)转化验证基因功能

在OsCM2基因的第一个外显子和最后一个外显子设计RNAi片段。引物序列：1588Si1 5’ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gt AAACGGAGATGAAGAAAGATCC 3’，1588Ai1 5’ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ct GTCACTTTGGAGGACAATGCTG 3’，1588Si2 5’ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gt CTTACCTTGGCGTGCAGAAC 3’，1588Ai2 5’ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ct GAGCTGTGGAGGATCAGCAG 3’。PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rTaq酶(Takara公司)，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性3min，94℃50s、55℃80s、72℃90s 35cycles，72℃延伸5min，2个片段各扩增10管，分别收集PCR产物于2个1.5ml离心管纯化，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500ul 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，每管加10ul ddH₂O溶解。把纯化的2个DNA片段分别连接到RNAi载体pHellsgate 8上，如图9，连接体系为：gatway BP clonase 1ul，pHellsgate8载体0.5ul，BP reaction buffer 1ul，PCR纯化产物2.5ul，25℃反应10小时，反应结束加0.5ul proteinase K，37℃，10分钟。取1ul电转大肠杆菌DH10B，挑单克隆，扩大培养抽质粒，PCR验证是否含有目标片段，把构建好的载体电转农杆菌EHA105，构建好的载体分别命名为pH1588i1，pH1588i2，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant Journal1994，6：271-282)，转到正常的中花11水稻品种中。RNAi结果发现约有1/5的转化子抽穗迟约17-22天，其它抽穗时间介于突变体与野生型植株之间，具体统计结果见表1、表2。表型照片如图10。说明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能。

表1RNAi转化植株的抽穗期统计表

表2RNAi转化植株迟抽穗的天数

实施例4：互补验证

1.互补载体的构建

所用载体是pCAMBIA2301。日本晴BAC克隆OSJNBa0037D03用BamH1和Pst1可以酶切出含有OsCM2基因的约11.5KB的片段，接种BAC克隆OSJNBa0037D03于含氯霉素的250ml的LB，37℃，210转/分钟摇床，过夜。用1.5ml离心管收集菌液2次，约83管，抽质粒。最后每管加20ul ddH₂O溶解。收集质粒溶液，分3管纯化：加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃冷冻30分钟，再12000rpm离心20分钟，弃上清，75％乙醇浸洗，凉干，每管加25ul ddH₂O溶解。收集质粒溶液酶切，体系：总体积100ul，质粒75ul，BamH1 30U，Pst1 30U，10X K buffer 10ul，ddH₂O 11ul，37℃酶切5小时。1％琼脂糖TAE胶电泳，电压40V，24小时。挖胶，透析袋回收，步骤见科学出版社《分子克隆实验指南》，第二版，321-322页。回收液加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃冷冻30分钟，再12000rpm离心20分钟，弃上清，75％乙醇浸洗，晾干，加10ul ddH₂O溶解。取1ul测浓度，剩下9ul全部用于连接反应，载体0.5ul，2U T4 ligase，5X buffer 3ul，总15ul体积，连接24小时。取0.5ul连接产物，电压18000V，电转到大肠杆菌DH10B，加800ul LB，复苏45分钟，取200ul涂于含卡那霉素、X-gal、IPTG的LA平板，37℃，过夜。挑单克隆做细菌PCR，先在0.2mlPCR离心管加10ul ddH₂O，用20ul枪头挑菌斑，在离心管中搅拌，取出枪头在加有卡那霉素的LA平板上画线作为备份。引物A：5’CCACTAATCCGTGCAAAGGT 3’，引物B：5’CCCTCAGTATCAGCCACCAC 3’，PCR反应体系的总体积为20μl，1×Taq酶反应缓冲液、25mMMgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3U Taq酶。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。跑胶观察，挑阳性克隆，扩大培养，抽质粒，再做PCR和酶切验证。把构建好的载体(命名为pC1588c)电转农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，取750ul农杆菌菌液加等体积的50％甘油混匀，-70℃保存。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法将互补载体导入抽穗迟突变体。农杆菌介导的遗传转化步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)

(2)组织培养的溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。

2)N6mix母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

20-25℃下下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

20-25℃下溶解并定容至1000ml。

6)MSmix母液(100X)

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

20-25℃下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，20-25℃下保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蛋白胨 2.5g

酵母粉 1.25g

氯化钠 2.5g

琼脂粉 3.2g

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20-25℃保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养4周，温度24-26℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度24-26℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度24-26℃。

4.4农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(G418筛选浓度为50μm)

4.7分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养(2000lx)，温度26℃。

4.8生根

(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

最后获得互补转化的组培苗100株，作为对照的由突变体愈伤不经过转化直接分化得到30株苗子，以及正常中花11愈伤分化苗子30株，都种于大田，结果没经过互补的突变苗全部表现抽穗迟，互补的转化苗约有50％恢复正常，抽穗期统计结果见表3。说明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通过基因工程技术提高或减弱OsCM2基因的表达量能够控制植物抽穗期，从而提高品种的地区与季节适应性。

表3互补转化植株的抽穗期统计结果

SEQ.ID.No.1

<110>华中农业大学

<120>一种控制水稻抽穗期基因及应用

<130>Patent

<140>1

<141>2005-10-25

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2881

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(81)..(272)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1144)..(1230)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1318)..(1461)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1668)..(1760)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2044)..(2292)

<223>

<400>1

cgtgtggagg atcagcagca gcagctttcc cttagctcgc gagctcatca gtcatcacag 60

ggcggatcga gagatcatcg atg ggc gag gcg gag ctg agc ctg gcg gcg gtg 113

Met Gly Glu Ala Glu Leu Ser Leu Ala Ala Val

1 5 10

cgc gac gcg ctg gtg cgg gag gag gac tcc atc gtc ttc gcc ctc atc 161

Arg Asp Ala Leu Val Arg Glu Glu Asp Ser Ile Val Phe Ala Leu Ile

15 20 25

gag cgc gcc agg cgc ccg cgc aac gcg ccg gca tac gcg gcc gcc gcc 209

Glu Arg Ala Arg Arg Pro Arg Asn Ala Pro Ala Tyr Ala Ala Ala Ala

30 35 40

gcc gcc ggc ggc cga tcc ctc gcc gag ttc ttc gtc cgg gaa gcc gag 257

Ala Ala Gly Gly Arg Ser Leu Ala Glu Phe Phe Val Arg Glu Ala Glu

45 50 55

gtt ctg cac gcc aag gtaagcccgc cacctctcgt tgttcttgag tcttgactcc 312

Val Leu His Ala Lys

60

ccattgattc atgattcagt atcctgccca actagatccc cttacgtttt ctttaccaaa 372

atcgatcctt tttataccat gttgtagtgt agcatagcca tgatgaactt gtacaggaag 432

attttttttt gcctggtgaa atttctgagg ccaatctttc tattcagtca ccttagtgat 492

tagtaaactc atggctgagg aattcgtatg tgaaattcag tcacacagat cttacaggct 552

aggcttgtat ttcgttacca cattgttttt ttggcagtag tttatctacc ttggtctcca 612

ctgtaccatg atgaattgaa agatagcatc ggagggtaag atgctgatat gtccattctg 672

gtaatcatgc ggcattgcgg cttatgttgg cttgacgaat tcattttgag tacctcgaac 732

ggacacacag tatcggatga gatttatatt aacaaaagaa tggctatgct acatgtgtag 792

gtaaatcatg tgttttaaag gcacttccat ttacggatca ttcaacaagt gaaagtgatc 852

agaagggaaa aatagtgacg atggagaaaa aaagtttgaa ccgtaccatc ccctattaat 912

aatagaaaac ataaatgatt tactattatt tttcttgtac tttactaaat gggaaatttt 972

gttatgctat ttttcaactt gtatatctta tccagcatcc tattaaaact gtcaaaatca 1032

atcaacataa aatacagcat tggtatagct atgttgacag tcagatatta gcatattacc 1092

atttccaagc atccctctac agaatctaat tacatctgtg aaatctgata g gcc gga 1149

Ala Gly

65

caa tac caa aag cca gaa gat gtt cca ttc ttt ccc caa gat ctc cct 1197

Gln Tyr Gln Lys Pro Glu Asp Val Pro Phe Phe Pro Gln Asp Leu Pro

70 75 80

tca cct cta ttt cct acc aaa gat tac cca aag gtaaatacta agctttacaa 1250

Ser Pro Leu Phe Pro Thr Lys Asp Tyr Pro Lys

85 90

tattagttac aatgaactga tgactaatga ttgttgaggt tctgagtttt tattgctttg 1310

ttgttag gtt ttg cac tct ttt gca tca tca gtc agt gtg aat gat gca 1359

Val Leu His Ser Phe Ala Ser Ser Val Ser Val Asn Asp Ala

95 100 105

ata tgg aag atg tat ttc aac gag ttg ctt cca cta ttc act gtg gat 1407

Ile Trp Lys Met Tyr Phe Asn Glu Leu Leu Pro Leu Phe Thr Val Asp

110 115 120

gga gat gat ggt aac tat gca gaa aca gtt gca tta gat ttt gca tgt 1455

Gly Asp Asp Gly Asn Tyr Ala Glu Thr Val Ala Leu Asp Phe Ala Cys

125 130 135

ctg aag gtacatgttc tgtgtttatt gtttctttta gatattccat caatttggtc 1511

Leu Lys

140

gttctttaaa aaaaacataa atctagttgc tactaggata tgttctttca atctttcagc 1571

acgcgaaagc aaaatttgca caaattattg caaattaatg gtaaattgtt tccaatcagt 1631

gtatatctgt gaaatgtatt gatcatttct ttgtag gcc ctg tca aga aga att 1685

Ala Leu Ser Arg Arg Ile

145

cat att ggt aaa tat gtt gct gag gtg aag ttc aaa gat gct tcc caa 1733

His Ile Gly Lys Tyr Val Ala Glu Val Lys Phe Lys Asp Ala Ser Gln

150 155 160

gat tat agt cca cta atc cgt gca aag gttgttttta gttaacatct 1780

Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Ala Lys

165 170

catactcact acaccaaatt ttcttaaaca tcttgcaata aacggttgat ttatagaaat 1840

tgtgaatact ccttggtctt attctgatta gcttcattct tatctagctt ctacttagtt 1900

tcatgtgtta gatgtttaac tcctgcatac actccatttc ttggtaggaa ctgcctgcta 1960

ggctgctagc attgggcctt taaatcttta atttattttt tgaagctgat ctttaattta 2020

ttatatccct ctcttttcaa cag gat acc aag gct ctg atg aat ctg cta aca 2073

Asp Thr Lys Ala Leu Met Asn Leu Leu Thr

175 180

ttc aag gcg gtt gaa gag aag gtg aaa agg aga gta gag aag aag gcc 2121

Phe Lys Ala Val Glu Glu Lys Val Lys Arg Arg Val Glu Lys Lys Ala

185 190 195

agg ata ttt ggt cag aat gtc act ttg gag gac aat gct gac aag caa 2169

Arg Ile Phe Gly Gln Asn Val Thr Leu Glu Asp Asn Ala Asp Lys Gln

200 205 210

gaa ggc aat gca ggt gac agt gag tgc aaa gtt aat cct gaa gtg cta 2217

Glu Gly Asn Ala Gly Asp Ser Glu Cys Lys Val Asn Pro Glu Val Leu

215 220 225 230

tct aag cta tat gat ctg tgg gta atg cct ttg acg aag gat gtt gaa 2265

Ser Lys Leu Tyr Asp Leu Trp Val Met Pro Leu Thr Lys Asp Val Glu

235 240 245

gtt gag tat ctt ctc cgc cgt ctt gac tgattcgcca aaatattttc 2312

Val Gl u Tyr Leu Leu Arg Arg Leu Asp

250 255

agctgcaaat atgatgaaca caattatgta agcacatata aatagactta ttgaatgtgg 2372

catgaggaaa tccatcaaga acagctaaca gcggtgactt gctgtagaat ttccggtact 2432

gtatcttgga tctttcttca tctccgtttt cggagctgag acatataggg cctgtttggt 2492

acagctctaa ctcctaaatt tagctccaag agttgggtct ggagtggagt tgtggagctg 2552

cctaaaccca gctccacaac tctagttcat tttgtgagag agctccaccc agctccactc 2612

ccagttttgg tggagctgaa actgtttggc tgagctccag ctccaggagg ggtagagctg 2672

gagctggagc tgtgccaaac aggcccatag attgatggca atgatctgca acccaaaagg 2732

ttcatcctac ctaactgtgg tggctgatac tgagggcctg gtgaattccc agcaaagatg 2792

ctgcaactcc agtttctgta acaatctgta actcctgtta ttatatcacc atagttttgt 2852

gctacttctt ggtagtagca tttctgttc 2881

SEQ ID No.2

<110>华中农业大学

<120>一种控制水稻抽穗期基因及应用

<130>Patent

<141>2005-10-25

<170>PatentIn version 3.1

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Gly Glu Ala Glu Leu Ser Leu Ala Ala Val Arg Asp Ala Leu Val

1 5 10 15

Arg Glu Glu Asp Ser Ile Val Phe Ala Leu Ile Glu Arg Ala Arg Arg

20 25 30

Pro Arg Asn Ala Pro Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Arg

35 40 45

Ser Leu Ala Glu Phe Phe Val Arg Glu Ala Glu Val Leu His Ala Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Tyr Gln Lys Pro Glu Asp Val Pro Phe Phe Pro Gln Asp

65 70 75 80

Leu Pro Ser Pro Leu Phe Pro Thr Lys Asp Tyr Pro Lys Val Leu His

85 90 95

Ser Phe Ala Ser Ser Val Ser Val Asn Asp Ala Ile Trp Lys Met Tyr

100 105 110

Phe Asn Glu Leu Leu Pro Leu Phe Thr Val Asp Gly Asp Asp Gly Asn

115 120 125

Tyr Ala Glu Thr Val Ala Leu Asp Phe Ala Cys Leu Lys Ala Leu Ser

130 135 140

Arg Arg Ile His Ile Gly Lys Tyr Val Ala Glu Val Lys Phe Lys Asp

145 150 155 160

Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Ala Lys Asp Thr Lys Ala

165 170 175

Leu Met Asn Leu Leu Thr Phe Lys Ala Val Glu Glu Lys Val Lys Arg

180 185 190

Arg Val Glu Lys Lys Ala Arg Ile Phe Gly Gln Asn Val Thr Leu Glu

195 200 205

Asp Asn Ala Asp Lys Gln Glu Gly Asn Ala Gly Asp Ser Glu Cys Lys

210 215 220

Val Asn Pro Glu Val Leu Ser Lys Leu Tyr Asp Leu Trp Val Met Pro

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Leu Leu Arg Arg Leu Asp

245 250 255

Claims

1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

3.一种如权利要求1所述的基因在控制水稻抽穗期中的应用。