CN1510141A - 转反义vp1基因培育水稻抗穗萌雄性不育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，该方法的特征是：(1)从水稻保持系中利用PCR技术克隆VP1基因的部分片断；(2)用内切酶切出长度为400－800bp的DNA片断；(3)用组成型启动子UBI、35S等或胚特异表达启动子，上述DNA片断的反义链及终止子NOS，构建反义表达载体；(4)应用转基因手段将构建的反义载体导入目标不育系对应的保持系；(5)用转基因保持系与目标不育系回交，即获得转反义VP1基因抗穗萌不育系。本发明方法较化学药剂喷法操作方便，不受天气好坏影响；成本也较低，每亩可降低50－100元；较常规方法可缩短3－5年。抽穗后30天的穗上发芽率≤5％。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻雄性不育系的培育方法，尤其是水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法。
背景技术
目前，水稻雄性不育系抗穗萌育种主要是选用无穗萌的育种材料进行杂交选育，但常规育种材料中的不穗萌材料绝大多数不具备雄性不育保持基因，故较难用于培育不育系，而目前大多数优良保持系又是不抗穗萌的，因而，抗穗萌雄性不育系培育周期长，耗费多。
现有的另一种抗穗萌方法是喷施一定浓度的化学药剂(例如多效唑)，但该方法也存在以下缺陷：一是成本高，二是操作较困难，雨天喷药效果不好，晴天又没必要喷药；三是效果欠佳。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种快捷有效、便于操作，成本较低的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法。
本发明方法的技术方案是：(1)从水稻保持系中应用PCR技术克隆VP1基因(该基因在基因银行的登记号为D16640.1 GI：391884)的部分片断；(2)用合适的内切酶切出长度为400-800bp的DNA片断；(3)用组成型启动子UBI、35S等或胚特异表达启动子，上述DNA片断的反义链及终止子NOS，构成反义的表达载体；(4)用转基因手段将构建的反义载体导入目标不育系对应的保持系；(5)用转基因保持系与目标不育系回交，获得转反义VP1基因抗穗萌不育系。
采用本发明方法培育水稻抗穗萌雄性不育系，较常规方法快速有效，可节省时间3-5年；较化学药剂喷施法操作方便，不受天气好坏影响，成本较低，每亩可节省50-100元。抽穗后15天的发芽率为0，30天的发芽率不超过5％。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的具体实施方式加以说明。
实施例1：
(1)扩增VP1基因第182到934核苷酸的一对具有BamHI和KpnI酶切位点的引物：R：5-TAG GAT CCG TCG TCA ATC GCC-3，F：5-ATG GTA CCGCAC TCG CAC GGG AACC-3；从冈46BDNA中用PCR技术，调出VP1第182-934的核苷酸序列；
(2)用BamHI和KpnI的酶切，将VP1基因的第一个外显子的第182-934核苷酸序列克隆在公知的pGEM-T载体上，并在大肠杆菌DH52中扩增；
(3)对克隆到pGEM-T载体上的部分VP1序列进行测序，证实其真实性；
(4)用BamHI和KpnI的酶切携带目标VP1序列pGEM-T质粒，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳分离，检测片断大小是否与目标片断大小一致，并回收目标片断；
(5)用BamHI和KprI的酶切携带目标片断的pGEM-T质粒(VP1基因的第480个核苷酸位置含有一个SacI酶切位点)，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳分离，检测片断大小是否与目标片断大小(454bp)一致，并回收目标片断vp454；
(6)分别用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切具有多酶切位点且已在一个T-DNA区中携带潮霉素抗性基因，另一个T-DNA区内已具备玉米泛素启动子ubi和胭脂碱基因终止子NOS的超级双元载体PSB130，回收酶切后的载体；
(7)将vp752和vp454与回收的载体PSB130连接，获得下列四种反义VP1基因的载体构建：
a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)
b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)
c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)
d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)；
(8)将构建好的载体在大肠杆菌DH52中扩增，分别用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，检测目标片断大小是否正确；
(9)将构建好的载体用冻融法导入根癌农杆菌菌株EHA105中，并在1.2％甘油中-70℃保存；
(10)取容易穗萌的保持系金23B开花后12天的未成熟种子灭菌后挑出未成熟胚诱导愈伤组织，培养4天后，取新生愈伤组织直接用于农杆菌介导的转化；
(11)在含潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织；
(12)在分化培养基上进行分化，再生的小苗在培养基上生长壮苗后移入人工气候室盆栽；
(13)应用Southern分析(提DNA后，用BamHI/KpnI，或BamHI/SacI酶切，再作Southern杂交)，筛选转基因植株；
(14)在转基因植株后代中，对vp752和vp454作正向选择(Southern)，对潮霉素抗性基因作负向选择(PCR或Southern)，保留仅带vp752或vp454而不含潮霉素抗性基因的单株；
(15)自交纯合目标单株，进行Northern分析，并在开花后14天取新鲜种子浸种进行发芽试验，保留三个星期内不发芽的单株；
(16)转基因的保持系VP752-金23B和VP454金23B与目标不育系回交5次，即获得转基因的抗穗萌的目标不育系VP752-金23A和VP454-金23A。
转反义vp1基因的金23A不育系穗萌情况
| 材料 | 抽穗后15天的穗上发芽率 | 抽穗后30天穗上发芽率 |
| vp752-金23A | 0 | 0 |
| Vp454-金23A | 0 | 0-2％ |
| 金23A(对照) | 15-30％ | 50-80％ |
实施例2：
(1)--(3)步同实施例1(1)--(3)；
(4)用BamHI和KpnI的酶切携带目标VP1序列pGEM-T质粒，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳分离，检测片断大小与目标片断大小一致，并回收目标片断；
(5)用BamHI和SanI酶片携带目标片断的pGEM-T质粒(VP1基因的第480个核苷酸位置含量有一个SacI酶切位点)，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳分离，检测片断大小与目标片断大小(454bp)一致，并回收目标片断vp454；
(6)分别用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切具有多酶切位点且已在一个T-DNA区中携带潮霉素抗性基因，另一个T-DNA区内已具备玉米泛素启动子ubi和胭脂碱基因终止子NOS的超级双元载体PSB130，回收酶切后的载体；
(7)将vp752和vp454与回收的载体PSB130连接，获得下列四种反义构建：
a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)
b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)
c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)
d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)；
(8)将构建好的载体在大肠杆菌DH52中扩增，分别用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离，检测目标片断大小正确；
(9)将构建好的载体用冻融法导入根癌农杆菌菌株EHA105中，并在1％甘油中于-70℃保存；
(10)取容易穗萌的保持系冈46B开花后15天的未成熟种子灭菌后挑出未成熟胚诱导愈伤组织，培养5天后，取新生愈伤组织直接用于农杆菌介导转化；
(11)在含潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织；
(12)在分化培养基上进行分化，再生的小苗在培养基上生长壮苗后移入人工气候室盆栽；
(13)应用Southern分析(提DNA后，用BamHI/KpnI，或BamHI/SacI酶切，再作Southern杂交)，筛选转基因植株；
(14)在转基因植株后代中，对vp752、vp454作正向选择(Southern)，对潮霉素抗性基因作负向选择(PCR或southern)，保留仅带vp752或vp454而不含潮霉素抗性基因的单株；
(15)自交纯合目标单株，进行Northern分析，并在开花后15天取新鲜种子浸种进行发芽试验(包括对照)，保留二个星期内不发芽的单株；
(16)转基因的保持系与目标不育系冈46A回交5次，即获得转基因的抗穗萌的目标不育系vp752冈46A和vp454冈46A。
转反义vp1基因的冈46A不育系穗萌情况
| 材料 | 抽穗后15天的穗上发芽率 | 抽穗后30天穗上发芽率 |
| vp752-冈46A | 0 | 0 |
| Vp454-冈46A | 0 | 0-5％ |
| 冈46A(对照) | 30-50％ | 70-90％ |
Claims (4)
1、一种水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从水稻保持系中应用PCR技术克隆VP1基因的部分片断；
(2)用合适的内切酶切出长度为400-800bp的DNA片断；
(3)用组成型启动子UBI、35S等或胚特异表达启动子，上述DNA片断的反义链及终止子NOS，构成反义的表达载体；
(4)用转基因手段将构建的反义载体导入目标不育系对应的保持系；
(5)用转基因保持系与目标不育系回交，获得转反义VP1基因抗穗萌不育系。
2、根据权利要求1所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，克隆所用的引物为VP1基因第182到934核苷酸的一对具有BamHI和KpnI酶切位点的引物：R：5-TAG GAT CCG TCG TCA ATC GCC-3，F：5-ATG GTACCG CAC TCG CAC GGG AACC-3；
3、根据权利要求1所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，构建的反义载体为下列四种：
a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)
b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)
c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)
d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)
--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)。
4、根据权利要求1或者2或者3所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，将构建好的载体在大肠杆菌DH52中扩增，用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在0.8％-1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离后，用冻融法导入根癌农杆菌菌株EHA105中，然后置于0.8％-1.2％甘油中于-70℃保存；再取容易穗萌的保持系开花后12-15天的未成熟种子灭菌后挑出未成熟胚诱导愈伤组织，培养4-5天后，取新生愈伤组织直接用于农杆菌介导的转化。
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|---|---|---|---|
| CNA021398704A CN1510141A (zh) | 2002-12-25 | 2002-12-25 | 转反义vp1基因培育水稻抗穗萌雄性不育系的方法 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1510141A true CN1510141A (zh) | 2004-07-07 |
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Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN1510141A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100451121C (zh) * | 2006-01-05 | 2009-01-14 | 华中农业大学 | 一种控制水稻抽穗期基因及其应用 |
| CN102577929A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-07-18 | 福建省三明市农业科学研究所 | 水稻三系不育系低发芽率的一种改良方法 |
-
2002
- 2002-12-25 CN CNA021398704A patent/CN1510141A/zh active Pending
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| CN100451121C (zh) * | 2006-01-05 | 2009-01-14 | 华中农业大学 | 一种控制水稻抽穗期基因及其应用 |
| CN102577929A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-07-18 | 福建省三明市农业科学研究所 | 水稻三系不育系低发芽率的一种改良方法 |
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