CN1280626A - 采前和采后贮藏化合物再转移的抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种通过用编码海藻糖磷酸合酶的基因转化植物或来自该植物亲本株系的植物,来抑制营养繁殖植物萌芽的方法,这些植物例如有马铃薯、草莓、香蕉和球根植物如洋葱和鳞茎花卉。同时也提供了恢复萌芽的方法。

Description

采前和采后贮藏化合物再转移的抑制
发明领域
本申请涉及采前和采后贮藏化合物再转移的抑制，尤其描述了用重组DNA转化营养繁殖植物后对萌芽的抑制和一种恢复这些植物萌芽的方法。
发明背景
与农业遗传工程一样，传统育种的主要目的是获得高产的作物，即通常意味着育种目的是增加作物贮藏器官内，例如马铃薯的块茎、甜菜的直根、叶生作物如生菜的叶子中贮藏的量。但是，植物中的一些其它过程如开花和／或萌芽，经常对产量造成影响。
在非常低的温度冷藏(稍高于冰点)通常可以抑制萌芽。冷藏不但昂贵，而且会对贮藏器官造成破坏性作用，不利于进一步加工或导致有价值的产品如淀粉等物质的损失。例如，当马铃薯的块茎置于低温条件时，它们会把淀粉转化为还原糖，此种现象称为“冷甜化”。变成还原糖是不希望的，因为当在烤或油炸的过程中会发生诸如美拉德反应，这会导致其发生不希望的褐变。
为了防止冷甜化，马铃薯可以贮藏在较高温度下，但这样会引起它萌芽，这是我们不希望发生的。工业上采用氯苯胺灵(CIPC)来控制块茎萌芽。尽管CIPC的使用已经很有效，但仍然被认为是一种不希望的化学处理。在世界范围内，人们越来越重视用生物控制的机制来代替化学控制试剂，前者非常安全而且更符合环保的标准。
当考虑用遗传的方法来抑制萌芽时，应当考虑到对于用作种子的马铃薯，萌芽是一个必须的特性。因此所采用的机制既能够使种子马铃薯正常生产，又能抑制所培养的用于食用或进一步加工用的马铃薯的萌芽。
发明概述
本发明包括一种用来抑制采前和采后贮藏化合物再转移的方法。具体地讲，本发明包括一种通过用能够表达蛋白质的重组DNA转化植物或它的亲本，从而抑制植物部分萌芽的方法，其特征在于此蛋白质是海藻糖磷酸合酶(TPS)。更具体地讲，包含编码TPS基因的重组DNA来源于细菌、真菌、动物、植物或人类，优选地来自大肠杆菌。
在另一实施方案中，本发明包括一种诱导植物萌芽的方法，即给该植物提供编码TPS的重组DNA，其侧翼是位点特异性重组酶的目标位点，然后用编码相应重组酶的基因转化该植物或与能够表达该重组酶的植物杂交，来切除编码TPS的重组DNA。
本发明的另一实施方案也包括一种诱导植物萌芽的方法，即给植物提供编码TPS的重组DNA，随后或同时用另一重组DNA转化该植物，后一重组DNA包含编码能够在诱导型启动子控制下中和TPS作用的分子的基因，然后通过诱导型启动子的诱导迫使上述中和分子表达。中和分子的一个例子是海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)或反义TPS基因的产物。
本发明的另一实施方案是通过外源施加中和TPS基因表达的抑制作用的化合物，来解除采前和采后贮藏化合物转移的抑制。优选地，这种抑制的解除可以通过使用赤霉酸来完成。本发明的另一实施方案是用形成创伤(wounding)来恢复萌芽。
本发明的进一步目标是通过给植物提供编码TPS的重组DNA，随后或同时在诱导型启动子的控制下，用另一重组DNA转化该植物，后一重组DNA包含编码抑制基因的基因，来诱导植物萌芽。该抑制基因能够抑制TPS的表达，并且通过诱导型启动子的诱导迫使抑制基因表达。
本发明也提供了由上述任何一种方法培育的植物，尤其是营养繁殖植物，更具体来讲是马铃薯和洋葱。
另外，编码TPS的基因可以置于特定启动子的控制下，例如patatin启动子，它特异性的在马铃薯植物的块茎中驱动表达。
本发明的另一实施方案是抑制菊苣中菊粉的分解代谢、甜菜中蔗糖的分解代谢和马铃薯中淀粉的降解。
附图说明
图1．用赤霉酸(GA)和不用赤霉酸处理14天(图1A)和25天后(图1B)patatin-TPS块茎的萌芽状况。
发明详述
只从定义的角度来讲，转化植物这一通用概念指的是植物总体或植物群体。这一概念涵盖宽范围的植物，而不仅限于某一种特定的植物种。
本发明涉及一种采前和／或采后抑制贮藏化合物再转移的方法。贮藏化合物的再转移是植物利用贮藏化合物所采用的一种方法，这些物质通常贮藏在特化的贮藏器官里。一个如此转移的典型例子是从贮藏器官例如块茎、鳞茎或种子的萌芽过程。
具体讲，本发明提供了抑制萌芽，优选为营养繁殖植物萌芽的方法，以及再恢复萌芽被抑制的植物中萌芽能力的方法。此意义上的萌芽是指根尖、蔓、匍匐枝或吸器的形成，特别是从贮藏组织上形成。
本发明的基础基于以下事实，人们惊奇的发现TPS的表达能抑制萌芽。TPS是在海藻糖合成过程中有活性的一种酶，目前人们还不知道它在萌芽组织中起作用。然而最近人们发现(WO 97／42326)，TPS和TPP酶能够极大地改变它们所表达的组织中的碳水化合物代谢和光合能力。而且人们还发现TPS和TPP的作用是相反的，也就是说，二者同时表达时，在植物的生理和表型上观察不到任何变化。在该申请中，另外发现TPS在块茎中的表达也可以减小“冷甜化”过程的作用，因为在收获时和贮藏后还原糖的比例都减小了。因此，考虑到本发明，TPS的表达可能从两方面改善了马铃薯的贮藏：对于冷藏而言，冷甜化过程的减小作用非常重要，而对于在更温和温度下贮藏而言，预防萌芽就更为重要。
因此，TPS能够抑制贮藏化合物的再转移。这也可以应用到其它作物上，如菊苣，它的菊粉经降解为其它的碳水化合物。TPS在菊苣贮藏组织中的表达抑制了菊粉的分解性降解。同样，也可以抑制甜菜中蔗糖的降解。这样，TPS在甜菜块根中的表达抑制了贮藏过程中蔗糖的损失。
通常，通过在易于萌芽的组织如马铃薯块茎中表达TPS基因，可以获得抗萌芽的效果。对于在马铃薯块茎中的特异表达，可以使用patatin启动子或其它任何块茎专一性启动子来促进TPS基因的表达。但是，我们注意到，最重要的是在块茎灌浆期末和贮藏期阶段维持启动子的活性。如果在此阶段块茎专一性启动子活性不好，TPS表达产物的抑制作用就会减弱，结果导致萌芽的延迟而不是彻底地抑制萌芽。
TPS基因编码海藻糖磷酸合酶。已知晓编码此酶的基因，并且在所有的生物体内都可以找到(WO 97／42326)。支持本发明的实验使用从大肠杆菌中衍生的基因，但其它编码TPS的基因如来自酵母或植物的基因也同样有用。在本发明的其它实施方案中，使用了中和TPS作用的化合物如海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。编码TPP的基因也来自大肠杆菌，但也可以从其它生物体如酵母、植物甚至人类身上提取(WO 97／42326)。不仅TPP可以用来恢复TPS的作用，任何能够降解海藻糖6-磷酸的酶也可以使用。此种酶的另一个例子是海藻糖6-磷酸水解酶(TreC)。编码此种酶的基因可衍生自大肠杆菌(Rimmele．M和Boos．W大肠杆菌的海藻糖6-磷酸水解酶，细菌学杂志(J．Bacteriol．)，176，5654-5664，1994)。
本发明最简单的形式是用包含编码TPS的基因和任选地包含标记基因的重组DNA盒转化植物，从而抑制转基因植物采前和采后贮藏化合物的再转移。更具体地讲，这种方法能够抑制萌芽。中和TPS的作用可以恢复萌芽，这可以通过很多方法实现。以下是实施例，但抑制TPS作用的方法并不仅限于这些实施例。
恢复萌芽的第一个系统是在紧邻TPS基因处引入一个编码TPP的基因，它可以克服由TPS引起的抗萌芽的作用。为了抑制TPP的组成型表达，构想了在诱导型启动子的控制下引入TPP的表达。诱导型启动子包括任何能够应答与诱导物接触从而增加特定基因产生的产物量的启动子。如果缺少诱导物，DNA序列就不会转录。一般情况下，特异性地结合于诱导型启动子上以激活转录的因子处于一种无活性的形式，然后通过诱导物直接或间接地转化为有活性的形式。诱导物可以是一种化学试剂如蛋白质、代谢产物(糖、醇等)、生长调节剂、除草剂、或酚类化合物，也可是一种直接由温度、盐、创伤、毒素造成的或间接地通过病原体作用或疾病(如病毒)引起的生理性逆境。可以通过给含有诱导型启动子的植物细胞外源施加诱导物，使诱导物与细胞接触，例如喷雾、浇水、加热或类似的方法。熟悉本领域的技术人员都了解诱导型启动子，有几个启动子可以令人信服地用来驱动TPP基因的表达。根据本发明适于使用的诱导型启动子包括但并不限于以下几种：热激启动子、哺乳动物类固醇受体系统和任何一种化学诱导型启动子。诱导型启动子的例子有果蝇(Drosophila melanogaster)的可诱导的70KD热激启动子(Freeling，M．等人，遗传学年鉴(Ann．Rev．Genet．)19，297-323)和乙醇诱导的醇脱氢酶启动子(Nagao，R．T．等人，Miflin，B．J．(编)植物分子和细胞生物学牛津纵览(Oxford Surveyof Plant Molecular and Cell Biology)，第3卷，页码：384-438，牛津大学出版社，1986)。由简单的化学物质诱导的启动子尤其有用。最后一类的例子是在WO90／08826，WO93／21334，WO93／031294，WO96／37609中描述过的启动子。
因此，用诱导物处理可以恢复抗萌芽作用，这些恢复萌芽的品系可以用来繁殖种子，如种子马铃薯。没有诱导物，后代的萌芽仍被TPS的表达所抑制。因此，这也可以用来进行种质保护。
恢复原始萌芽表型的另一个方法是用重组DNA盒供给植物，该DNA盒包含一个与TPS基因相邻的反义TPS基因，该反义基因受诱导型启动子的控制。与以上所述的TPP诱导的实例一样，反义TPS也能够抵消(有义)TPS表达的作用，因为随着与TPS mRNA的退火，它成功地阻止了TPS的转录，从而抑制了抗萌芽作用。
恢复原始萌芽表型的第三个系统是导入编码抑制基因蛋白质的DNA，该抑制基因能够抑制TPS的表达，同时抑制基因的表达受诱导型启动子的控制。此抑制作用可以例如通过使用tet-阻遏物系统来完成，其中可被阻遏物识别的一个特异性结合位点被引入到一种基因的RNA聚合酶结合位点附近，而该种基因的表达需要抑制。如果tet-阻遏物可得，此阻遏物将结合到特定的序列上，然后通过空间位阻，抑制RNA聚合酶起始转录。编码tet-阻遏物的基因可以与应受控表达的基因相邻，但并不必须如此。
当编码阻遏物的基因处于诱导型启动子的控制下时，阻遏物分子的表达和TPS基因的抑制可通过外源施加诱导物来诱导。然后，TPS就不会发生作用，从而正常萌芽。
恢复正常表型的另一个系统是提供编码TPS的基因或包含该基因的表达盒，此基因的侧翼有两个位点特异性重组位点，此位点可以被相应的重组酶识别。
根据本发明可以使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬茵体P1的Cre／lox系统、酵母FLP／FRT系统，噬菌体Mu的Gin重组酶，大肠杆茵的Pin重组酶，pSR1质粒的R／RS系统。使用最多的两个位点特异性重组酶系统是噬菌体P1 Cre／lox和酵母FLP／FRT系统。在这些系统里，重组酶(Cre或FLP)与它各自的位点特异性重组序列(分别为lox或FRT)专一地发生相互作用，转化或切除间插序列。对于这两个系统中的任何一个，位点特异性重组酶序列相对较短(对于lox为34 bp，对于FRT为34-47bp)。在植物中使用这种位点特异性重组酶在例如US 5，527，695中有描述。待切除的DNA的侧翼可为位点特异性重组位点的同向重复，随后引入重组酶切除DNA(从而恢复原始表型)。已经证明FLP／FRT重组酶系统在植物细胞中有效。尽管位点特异性重组序列必须连接在要切除或转化的DNA序列的末端，但编码位点特异性重组酶的基因也可位于其它位置，从而可以通过标准的转化步骤或通过与已经能够表达重组酶基因的植物异花传粉分别转入植物细胞。
但是，上述恢复萌芽的最后一种方法却使TPS基因从转基因植物中丢失了。
其它消除TPS基因表达对贮藏化合物再转移的抑制作用的方法包括，给贮藏器官外源施加能中和TPS基因表达之作用的化合物。惊奇的是，我们发现赤霉酸(GA)处理能够诱导含有TPS基因的马铃薯块茎萌芽。通过在市售的GA溶液里培养整个块茎或切块来实现。但是，构想了处理的方法可能不同，例如用GA溶液喷施块茎可以产生类似的结果。根据喷施方法，溶液中GA的浓度应在0．1到10，000ppm范围内。
进一步认为，GA的作用是中和TPS基因之表达的作用。因此，在贮藏化合物再转移抑制的其它实施例中，构想了用GA处理将能恢复TPS表达的抑制作用。
同样我们也惊奇的发现，仅仅在马铃薯的块茎上形成创伤(切成小块，每块至少包含一个活性分生组织)即足以诱导那些切块萌芽。
本发明的重组DNA构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术来构建。重组基因构建体可插入到市售载体内，这些载体适于转化植物并在转化的细胞内表达基因产物。通过使用选择标记从未转化的细胞中筛选转化的细胞(那些含有插入到宿主细胞DNA中的重组DNA的细胞)，选择标记作为导入的重组DNA的一部分，它包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因。含有重组DNA的细胞能在抗生素或除草剂存在的浓度下生存，此浓度可杀死未转化的细胞。选择标记基因的例子包括赋予除草剂Basta抗性的bar基因，赋予卡那霉素抗性的nptⅡ基因和赋予潮霉素抗性的hpt基因，以及赋予氨基氰抗性的cah基因。采用本领域技术人员众所周知的细胞培养技术，一个转化的单个植物细胞可以产生一株完整的植株。
考虑到本发明对不同植物种类的适应性不同，需要指出本发明中某一详细的实施方案仅用转基因马铃薯植物作为例子来阐述。事实上，它的适应性并不仅限于此种植物。任何植物都可以获得根据本发明的重组DNA序列，但优选的那些通常营养繁殖的植物种类特别有用。
因为有些植物的基因转化难以施行，所以本发明的一些实施方案目前仍无法应用，但在这类植物中实施本发明只是一个时间问题，而不是原则问题，因为遗传转化的可行性与本发明以下的实施方案不相关。
对于大多数植物，包括双子叶植物和单子叶植物的植物种属的转化为常规技术。原则上，任何转化方法都可以将根据本发明的重组DNA导入到适宜的祖细胞，只要细胞能够再生为完整植株。从以下方法中选择适宜的方法：原生质体的钙／聚乙二醇方法(Krens，F．T．等人，1982，自然(Nature)296，72-74；Negrutiu I．等人，1987年6月，植物分子生物学(Plant Mol．Biol)8，363-373)、原生质体的电穿孔方法(Shillito R．D．等人，1985生物／技术(Bio／Technol．)3，1099-1102)、植物材料的显微注射法(Crossway A．等人，1986，分子基因遗传学(Mol．Gen．Genet．)202，179-185)，不同植物材料(DNA或RNA包被的)的微粒轰击法(Klein T．M．等人，1978，自然，327，70)，(非整合的)病毒或类似物质感染法。根据本发明的一种优选方法为农杆菌介导的DNA转移，尤其优选的是在EP A 120 516和美国专利4，940，838所公开的、所谓的双元载体技术)。
番茄的转化可优选基本上Van Roekel等人描述的方法进行(VanRoekel，J．S．CDamm，BMelchers，L．SHoekema，A．(1993)。影响番茄(Lycopersicon esculentum)转化频率的因素。植物细胞报告(Plant Cell Reports)，12，644-647)。马铃薯的转化可优选基本上根据Hoekema等人描述的方法进行(Hoekema，AHuisman，M．JMolendijk，LVan den Elzen，P．J．M和Conrnelissen，B．J．C．(1989)。两个商品马铃薯栽培种抗马铃薯病毒X的遗传工程，生物／技术，7，273-278)。
通常来讲，筛选转化后的植物细胞或细胞群中是否存在一个或多个标记，这些标记由植物表达基因编码，与编码根据本发明的蛋白质的核酸序列一起共转移，随后转化的材料再生为整个植株。
虽然考虑到对遗传转化的抗性，但单子叶植物更容易转化，无菌转基因植物可以从转化的细胞或胚、或其它植物材料再生。当前，单子叶植物转化的优选方法是胚、外植体或悬浮细胞的显微注射轰击，和直接DNA吸收或电穿孔(Shimamoto，等人，1989，自然，338，274-276)。用显微注射轰击法，通过把吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因转入玉米悬浮培养物的胚胎发生细胞里，已经获得了转基因玉米，此bar基因编码膦丝菌素乙酰基转移酶(一种灭活除草剂phosphinothricin的酶)(Gordon-Kamm，1990，植物细胞(Plant Cell)，2，603-618)。已有报道遗传物质导入其它单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体内(Lee，1989，植物分子生物学，13，21-30)。选择老龄、密集的有突起的胚发生愈伤组织从胚发生悬浮培养物再生小麦植株(Vasil，1990，生物／技术．8，429-434)。结合这些作物的转化系统，本发明可以应用到单子叶植物。
包括有很重要商品价值的作物如水稻、香蕉和玉米的单子叶植物可通过农杆菌属(Agrobacterium)菌株来进行DNA转移(vide WO94／00977；EP 0 159 418 B1；Gould J，Michael D，Hasegawa O，UlianEC，Peterson G，Smith RH，(1991)，植物生理(Plant Physio1．)．95，426-434)。
DNA转移和植株再生后，可评价推定转化的植物，可例如使用Southern来分析依本发明的重组DNA的存在与否、拷贝数和／或基因组的构成。另外，也可使用本领域普通技术人员众所周知的Northern和／或Western分析技术，来分析新插入的DNA的表达水平。任选地初步分析之后，显示出根据本发明的新插入的重组DNA希望拷贝数和表达水平的转化植株，可用来检测它们的雄性不育或可育性恢复。另外，选择植株可用来进行另一轮转化，例如，导入其它基因的反义TPS基因、TPS基因或抑制基因。
为了获得能够组成型表达多于一个嵌合基因的转基因植物，可以采用诸多方法，包括：
A．带有与选择标记基因物理偶联的许多修饰基因的DNA(如双元质粒上的T-DNA)的使用。本方法的优点是这些嵌合基因物理上偶联，因此作为单一的孟德尔位点迁移。
B．各个能表达一个或多个嵌合基团，优选地与选择标记基因偶联的基因的转基因植物与来自另一个转基因植物的花粉异花传粉，后者包含一个或多个与另一种选择标记偶联的嵌合基因。杂交后获得的种子可以根据这两个选择标记存在与否来选择，或根据嵌合基因本身存在与否来选择。从选择的种子获得的植株可以用来作进一步的杂交。原则上讲，嵌合基因不在单一位点上，所以基因可能被作为独立的位点而分离。
C．大量的多重嵌合DNA分子的使用，例如质粒，每个都含有一个或多个嵌合基因和选择标记。如果共转化的频率很高，则基于一个标记来选择就足够了。在其它情况下，应优选考虑用多于一个标记来选择。
D．给已经含有第一种、第二种(等等)嵌合基因的转基因植物连续转化带有新的嵌合DNA的嵌合基因，嵌合基因任选地包含一个选择标记基因。同方法B一样，理论上嵌合基因不在单一位点上，所以嵌合基因可作为独立位点而分离。
E．上述策略的结合。
本发明中非常有用的植物是那些能进行营养繁殖的植物，但它们在某一阶段萌芽是不希望的性质。最普通的实施例是马铃薯和洋葱，但本发明也可以应用到开花的鳞茎、草莓和香蕉上。除了完全抑制萌芽和诱导恢复机制之外，还构想了抑制作用是可诱导的。这一点对例如草莓和香蕉非常重要，萌芽是植物繁殖的一个必需特性，但萌芽可能会对其它生长过程如果实成熟存在竞争。如果TPS基因置于诱导型启动子的控制下，则可能在作物生长过程中的任何时间抑制萌芽，例如在种子发育或果实成熟阶段。任选地，这样一种TPS基因表达的诱导可通过化学诱导型启动子来完成，此启动子可以和(外源)施加的化学物质相互作用。
另外，在本发明的实施方案中，也应该优选的使TPS组织的表达特异于分生组织。对于分生组织特异的启动子在本领域很容易获得(例如来自Enjuto等人的HMG2启动子，植物细胞7，517，1995和来自Kosugi等人的水稻PCNA启动子，植物杂志(Plant J．)7，877，1995)。
除了萌芽，采前和采后贮藏化合物再转移的抑制机制也可以应用于菊苣中以防止菊粉的降解和在甜菜中防止蔗糖的降解。
下列实施例为本发明进一步提供说明，但绝不限制本发明的使用范围。
DNA分离、操作和扩增的标准方法以及重组DNA复制的适宜载体、适宜细菌菌株、选择标记、培养基等，描述在Sambrook，JFritsch，E．F和Maniatis，T．(1989)分子克隆实验室手册。Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约；DNA克隆：卷Ⅰ和卷Ⅱ(D．N．Glover编1985)；和：从基因到克隆(E．-L．Winnacker编1987)。DNA操作
所有的NDA操作步骤(DNA从大肠杆菌的分离、限制性酶切、连接、转化等)都根据标准步骤来操作(Sambrook等人(1989)，分子克隆：实验室手册，第二版．Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，纽约)。菌株
在所有的实施例中，大肠杆菌K-12 DH5α菌株用于克隆。用于植物转化实验的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株是EHA105和MOG101(Hood等人，转基因研究(Trans．Research)2，208-218，1993)。pat-TPS转基因马铃薯植物的产生
在WO 97／42326中描述了在块茎专一性patatin启动子控制下包含大肠杆菌tps基因的pMOG845的构建、农杆菌的三亲交配和转基因马铃薯Solanum tuberosum cv．Kardal的产生。实验部分
实施例1
在一部分实验中，从体外转基因pMOG845(patatin-tps)的马铃著植株上产生块茎材料。用9个独立的转基因株系来设计田间试验，每个株系3块地，每块地种5个块茎。5月初种植块茎，采用常规方法监测萌芽过程。结果如表1所示。在实验第二部分，将来自组培植株中的pat-TPS植株(var．Kardal)放在植物培养箱里，500μmol光量子m-2s-1(16小时光照，20_C；8小时黑暗(15_C))。3个月后收获块茎，并低温(4_C)贮藏2个月。然后移到室温(RT)下，4周内评估萌芽。
表1．
    植物株系     萌芽
    田间     培养箱
    Kardal     所有块茎     所有块茎
    845-17     所有块茎*     延迟
    845-13     所有块茎     所有块茎
    845-28     无     无
    845-4     所有块茎     所有块茎
    845-11     无     无
    845-22     2／15块茎     无
    845-2     所有块茎*     延迟
    845-1     所有块茎*     延迟
    845-25     所有块茎     所有块茎
*意思是与萌芽延迟的野生型比较，在那块地里的植株长得明显较小。延迟的意思是2个月的低温期后转入室温下2周，观察不到萌芽。无的意思是4周内没有萌芽。
已表明完全没有萌芽的块茎具有较高的转基因表达水平。在非萌芽株系中观察到了在WO 97／42326中描述过的冷甜化作用的减少，在萌芽延迟的块茎或正常萌芽的块茎中观察到这种作用减少不明显。
实验2赤霉酸逆转抗萌芽表型
从实施例1中描述的生长在培养箱条件下的植株中获得完整的块茎。转入室温后大约1周，在含有0．17％(w／v)赤霉酸的溶液中培养24小时(GA 4和GA 7；制剂可以从Berele，Zeneca，Ridderkerk，荷兰购实到)。对照块茎没有培养。继续在室温下贮藏。8天后在用GA处理和没处理的野生型块茎中诱导萌芽。14天后，14个没有处理的野生型块茎中有95％萌芽，而转基因株系却没有萌芽(图1A)。相反，GA处理的所有野生型块茎(5)都萌芽，来自株系845-1、845-17、845-22、845-28的用GA处理过的转基因块茎分别有80％、50％、100％和17％萌芽。所有未处理的转基因块茎都没有萌芽。
25天后，可以观察到株系845-1和845-17的未处理块茎延迟萌芽(图1B)。
实验3形成创伤逆转抗萌芽表型
来自组织培养植物的Pat-TPS的植株(Var．Kardal)生长在500μmol光量子m-2s-1(16小时光照，20_C；8小时黑暗(15_C)的培养箱内。3个月后收获块茎，低温(4_C)冷藏2个月。
转入室温(RT)后3天，用小刀将块茎切成小块，每块上至少有一个有活性的分生组织(芽眼)。来自每个株系的3-10个块茎上的切块用自来水冲洗15分钟。随后大约6-10个切块在水中或在1、10或1000ppm的赤霉酸(GA3，SIGMA，Zwijndrecht，荷兰)溶液中培养10分钟。来自同一批处理的所有切块转到一个放有湿纸的容器里，然后用塑料封口以防干燥。在水或不同的赤霉酸溶液中培养的野生型及tps块茎切块在4天内可观察到萌芽，这表明形成创伤自身足以恢复萌芽。

Claims (16)

1．一种抑制采前和／或采后植物中贮藏化合物再转移的方法，其是通过用能够表达蛋白质的重组DNA转化植物或来自其亲本株的植物，其特征在于蛋白质是海藻糖磷酸合酶(TPS)。
2．一种抑制植物部分萌芽的方法，其是通过用能够表达蛋白质的重组DNA转化植物或来自其亲本株的植物，其特征在于蛋白质是海藻糖磷酸合酶(TPS)。
3．根据权利要求2的方法，其特征在于重组DNA包含的编码TPS的基因来自细菌、真菌、动物、植物或人类，优选地来自大肠杆菌。
4．一种诱导根据权利要求2或3的方法培育的不萌芽的植物萌芽的方法，其特征在于该植物被导入编码TPS的重组DNA，其侧翼是位点特异性重组酶的目标位点，然后通过用编码相应重组酶的基因转化该植物或与包含能表达该重组酶的重组DNA的植物杂交，来切除编码TPS的重组DNA。
5．一种诱导根据权利要求2或3的方法培育的不萌芽的植物萌芽的方法，其是通过用包含编码一种化合物的基因的重组DNA来转化该植物，此化合物在诱导型启动子的控制下能中和TPS的作用，并通过诱导型启动子的诱导驱使TPS中和化合物的表达。
6．根据权利要求5的方法，其特征在于中和化合物是海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)。
7．根据权利要求5的方法，其特征在于中和化合物是反义海藻糖磷酸合酶。
8．根据权利要求5的方法，其特征在于中和化合物是海藻糖磷酸水解酶(Tre C)。
9．根据权利要求5的方法，其特征在于中和因子是能够抑制TPS表达的抑制基因。
10．一种通过用赤霉酸处理植物贮藏器官，解除由海藻糖磷酸合酶表达引起的植物贮藏化合物采前和／或采后再转移抑制的方法。
11．一种通过赤霉酸处理植物来诱导根据权利要求2或3的方法培育的不萌芽植物萌芽的方法。
12．一种通过在植物上形成创伤来诱导根据权利要求2或3的方法培育的不萌芽植物萌芽的方法。
13．根据权利要求1的方法，其特征在于贮藏化合物是菊粉，植物是菊苣。
14．根据权利要求1O的方法，其特征在于贮藏化合物是菊粉，植物是菊苣。
15．根据权利要求1的方法，其特征在于贮藏化合物是蔗糖，植物是甜菜。
16．根据权利要求10的方法，其特征在于贮藏化合物是蔗糖，植物是甜菜。
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