CN101684469B

CN101684469B - 水稻籼型杂种育性基因S5-i的分离克隆及应用

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Publication number: CN101684469B
Application number: CN2009101488670A
Authority: CN
Inventors: 张启发; 欧阳亦聃; 陈炯炯; 丁寄花; 刘克德
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2007-10-15
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2027-10-15
Also published as: CN101684469A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻籼型杂种育性基因S5-i的分离克隆、功能验证及其在改良水稻中的应用。本发明包括籼型杂种育性基因的DNA序列和其编码的天冬氨酰蛋白酶。水稻籼稻和粳稻两个亚种之间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育性却限制了对其杂种优势的利用。本发明克隆的籼型杂种育性基因对克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性起重要作用。

Description

水稻籼型杂种育性基因S5-i的分离克隆及应用

技术领域

本发明是申请号200710053552.9专利申请案的分案申请。本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种籼型杂种育性基因S5-i的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。

背景技术

水稻属禾本科(Gramineae)、禾亚科(Pooideae)的稻属(Oryzeae)，分为两个栽培稻种：亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)和非洲栽培稻(Oryza glaberrima)。亚洲栽培稻又分为籼亚种(ssp.indica)和粳亚种(ssp.japonica)。两个亚种在形态和遗传上存在着明显的差异，同时也存在着生殖障碍，籼粳亚种间杂种往往表现为不育或半不育(Kato S，Kosaka H，Hara S(1928)On the affinity of ricevarieties as shown by fertility of hybrid plants.Bull Sci Fac Agric Kyushu Univ，3：132-147；Oka HI(1988)Origin of cultivated rice.Scientific Societies Press，Tokyo，Japan pp 181-209；Liu KD，Zhou ZQ，Xu CG，Zhang Q，Saghai Maroof MA(1996)An analysis of hybrid sterility in riceusing a diallel cross of 21 parents involving indica，japonica and wide compatibility varieties.Euphytica 90：275-280)。水稻籼粳亚种间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育性却限制了对其杂种优势的利用。研究者利用各种遗传标记对水稻籼粳亚种间杂种的不育现象进行了广泛的研究。研究表明影响小穗育性的位点分别对应于胚囊育性和花粉育性，说明雄性败育和雌性败育对亚种间杂种败育都有着很重要的作用。研究进一步表明，控制水稻籼粳杂种育性的基因在杂合状态下往往发生不亲和互作，使雄配子败育或雌配子败育，但是这些基因在纯合状态下(如纯和的亲本中)不影响配子的正常发育。

Ikehashi和Araki(Ikehashi H，Araki H(1986)Genetics of F₁ sterility in remote crosses ofrice.In：IRRI(ed)Rice genetics.IRRI，Manila，pp 119-130)首先将一个影响杂种育性的位点定位在第6染色体的色素基因C和糯性基因wx之间，并命名为S5。他们通过对育性分离结果的考察，指出S5位点是一组复等位基因：S5-n(广亲和)、S5-i(籼稻)、S5-j(粳稻)。所述基因符号S代表杂种不育性(Sterility)，n、i和j分别代表中性型(neutral)也称广亲和型(wide-compatibility)、籼型(indica)和粳型(japonica)的复等位基因。其中，由S5-n/S5-n、S5-n/S5-i、S5-n/S5-j组合而成的合子，杂种育性正常。而由S5-j/S5-i组成的合子，则表现为不育或半不育。

为了在杂交水稻育种中有效克服杂种不育性的问题，本发明通过图位克隆(map-based cloning)技术获得了水稻杂种育性基因S5的多个等位基因，包括广亲和型S5-n、籼型S5-i和粳型S5-j，通过转基因实验验证了此基因的功能。该基因的分离克隆使得水稻籼粳亚种间杂种优势的利用成为可能。其功能研究和应用将更好的利用水稻籼粳亚种间强大的杂种优势，进一步提高杂交水稻的生物学产量。

发明内容

本发明的目的是从籼稻中分离克隆一个水稻籼型杂种育性基因S5-i，提供上述杂种育性基因所编码的蛋白质，并对该基因进行功能验证及在水稻杂交育种中的应用。所述的基因与天冬氨酰蛋白酶基因序列高度同源，其生物学功能为控制水稻籼稻和粳稻杂种的胚囊育性。该基因导致籼稻和粳稻杂交后代雌配子败育，对利用籼粳亚种间的杂种优势和提高水稻的生物学产量起重要作用。

本发明涉及分离和应用一个编码天冬氨酰蛋白酶的籼型杂种育性基因S5-i的DNA片段，并对该片段的作用机理进行阐述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：3所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：3所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：3所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的籼型杂种育性基因S5-i的DNA片段作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。可以采用PCR技术，从栽培稻或野生稻的基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的籼型杂种育性基因S5-i以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。同样也可以采取化学合成的方法获得本发明的基因或同源基因。采用以上技术，可以分离得到包含籼型杂种育性基因S5-i的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对粳稻杂交后代不育的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。

携带有本发明籼型杂种育性基因S5-i的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach(1998)Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant MolecularBiology(2^nd Edition))。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有S5-n基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ IDNO：2显示的是本发明分离克隆的包含有S5-j基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ ID NO：3显示的是本发明分离克隆的包含有S5-i基因编码区DNA片段序列。

图1：S5基因克隆和分离鉴定流程图。

图2：S5基因效应下籼稻、粳稻和广亲和品种杂种育性示意图。

图3：互补载体构建示意图。

图4：遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。

图5：T₁代转基因阳性植株(左)小穗不育和转基因阴性植株(右)小穗可育。

图6：T₁代转基因阴性植株(a)和转基因阳性植株(b)花粉均可育。

图7：T₁代转基因阴性植株(a)胚囊可育和转基因阳性植株(b)胚囊败育。标尺长度50μm。

图8：T₀代转基因阳性植株和转基因阴性植株(a)以及T₁代转基因阳性植株和转基因阴性植株(b)胚囊育性、花粉育性和小穗育性图示。

图9：广亲和品种、粳稻和籼稻S5基因cDNA结构示意图。

图10：广亲和品种、粳稻和籼稻S5蛋白结构示意图。

图11：S5基因在水稻全生育期不同组织中表达水平示意图。使用的芯片数据包括籼稻Zhenshan 97和Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织。

图12：体外检测S5蛋白绝对活性(a)和相对活性(b)。其中绝对活性以水为对照测定，相对活性以该蛋白活性最高的点为对照测定。白色柱状图示意蛋白酶在不同pH条件下活性，深色柱状图示意蛋白酶活性被pepstatin A抑制。

图13：SDS-PAGE胶图显示S5蛋白在不同pH条件下自身剪接活性。

图14：原位杂交确定S5基因在水稻中的表达部位。(a)该基因在Ballila珠被和孢母细胞表达；(b)该基因在02428珠心和孢母细胞中表达；(c)该基因在Ballila小孢子母细胞中表达。标尺长度为25μm。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有S5基因完整编码区段的DNA片段以及验证S5基因功能的方法(发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有S5基因区段的DNA片段

1.利用图位克隆技术鉴定水稻S5基因

本发明中构建定位群体时用到了三个亲本：02428、南京11和Balilla。02428是一个粳型的广亲和品种，是选用两个粳稻品种云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分别用辐射诱变处理，并经高光效筛选出的材料间杂交，从后代中选育成的(邹江石等，广亲和选系02428在籼粳亚种间杂交的初步利用.中国农业科学，1989，22：6-14)。南京11为江苏农科院育成的中籼品种，属胜利籼衍生品系。巴利拉(Balilla)是引自意大利的粳型品种。

本发明在前期工作中构建了一个包含7000个单株的三交F₁大群体。1999年春在海南陵水配制02428/南京11杂交组合。同年夏天在武汉种植F₁代植株，筛选阳性单株。1999年冬天，将杂种稻篼移往海南陵水基地，并尽量分篼。在2000春天，以02428/南京11真杂种稻篼作为母本，与Balilla大量配制三交F₁杂种。2000年夏天，在水稻生长季节，在华中农业大学(武汉)水稻试验田分单株植株02428/南京11//Balilla三交F₁群体，最后共成苗7000株。

考察7000株三交F₁群体中所有高结实率的单株，总共获得了1000多株结实率在70％以上的单株。从中随机选取202株结实率在70％以上的真杂种单株，进行DNA抽提和标记分析，对S5区段的分子标记进行重组交换分析。DNA的抽提按Murray和Thompson的CTAB法进行(Murray M G，Thompson W F(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucl Acids Res.8：4321-4325)。分子标记的RFLP分析，包括DNA酶切、电泳、转膜和杂交，按Liu等人(Liu K D et al.(1997)A genome-wideanalysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecularmap.Theor Appl Genet.95：809-814)的实验程序进行。S5基因限定在分子标记N29和23D12R之间，结果如表1所示。

表1利用202株高结实率单株对广亲和基因的定位

选取SSR标记RM253或PCR-RFLP标记C11和RG213对所有高结实率的单株进行了扫描，单株用到SSR标记RM276和RM225进行筛选。其中，标记RM225、RM253和C11位于基因S5的一侧，标记RG213和RM276位于基因S5的另一侧。共筛选到了44株在标记之间发生重组的单株。利用S5区段的分子标记对这44株高结实率的重组单株进行了重组分析，结果显示S5基因限定在分子标记7B1和15D2之间，两端各有一个重组单株，部分重组单株的信息如表2所示。

表2利用S5区段的分子标记对44株重组单株的基因型分析(部分数据)

^aGenotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla

^bGenotype 1 of each locus was composed of an allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla

上述结果将S5基因定位在两个亚克隆分子标记7B1和15D2之间约40kb的DNA区段上。利用http://www.softberry.com网站上的FGENSH软件对分子标记7B1和15D2之间40kb的DNA片段进行了开放阅读框(open reading frame：ORF)的预测，共检测到了5个完整的ORFs，Blaxt X同源性分析发现候选基因ORF5与天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。

2.遗传转化载体的构建及转基因植株的表现

本发明基因S5位点是一组复等位基因：S5-n(广亲和)、S5-i(籼稻)、S5-j(粳稻)。其中，由S5-n/S5-n、S5-n/S5-i、S5-n/S5-j组合而成的合子，杂种育性正常。而由S5-j/S5-i组成的合子，则表现为不育或半不育(图2)。根据此基因的功能，申请人采取将籼稻片段转化粳稻植株的策略，从转基因植株(基因型S5-j/S5-j+S5-i)的育性表型来验证。此基因将会产生不育表型。

互补载体的构建方法是：根据籼稻南京11基因组序列设计PCR引物ASPHF(5’-TAAAAAGCTTCATCATGGGCTGCTGCTAGATGGA-3’)和ASPHR(5’-TGCTAAGCTTTACGAGGTCATGGGTTGAAGTCCT-3’)将候选基因区段扩增出来，互补载体外源PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司，反应条件为：94℃，3min；94℃，1min，60℃，1min，68℃，6min，30cycles；72℃，5min。

互补载体构建示意图如图3所示。PCR产物直接用HindIII酶切，双元载体(图4)pCAMBIA1301(来自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture)，携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitinl的农杆菌介导的遗传转化载体)也采用HindIII酶切，去磷酸化后连接。转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，筛选阳性克隆。采用农杆菌介导的方法转化，农杆菌菌株为超毒力菌株EHA105(Sun X，Cao Y，Yang Z，Xu C，Li X，Wang S，Zhang Q(2004)Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae inrice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J 37：517-527)，转基因的受体为粳稻品种Balilla。

本发明遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)

硝酸钾(KNO₃) 28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66克

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI) 0.08克

硼酸(H₃BO₃) 0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15克

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1克

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1克

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1克

甘氨酸(Glycine) 0.2克

肌醇(Inositol) 10克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5克

硝酸钾 19.0克

磷酸二氢钾 1.7克

硫酸镁 3.7克

氯化钙 4.4克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86克

硼酸(H₃BO₃) 0.62克

碘化钾(KI) 0.083克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同) 100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的) 2.5毫升

脯氨酸(Proline) 0.3克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

2，4-D贮存液 2.0毫升

脯氨酸 0.5克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.15克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.2克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5毫升

N6mix母液(100X) 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5毫升

维生素贮存液(100X) 1毫升

2，4-D贮存液 0.2毫升

CH 0.08克

蔗糖 2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.625毫升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

6-BA贮存液 0.5毫升

KT贮存液 0.5毫升

NAA贮存液 50微升

IAA贮存液 50微升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

6-BA贮存液 2毫升

KT贮存液 2毫升

NAA贮存液 0.2毫升

IAA贮存液 0.2毫升

CH 1克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50毫升

MSmix母液(100X) 5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5毫升

维生素贮存液(100X) 5毫升

蔗糖 20克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

1)将成熟的Ballila水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L潮霉素的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

4.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

4.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

本发明共获得独立转基因T₀代水稻植株33株，包括29株阳性单株和4株阴性单株。所获得的T₁代水稻植株以B10家系为例，包括15株阳性单株和14株阴性单株。

转基因水稻阳性和阴性植株小穗育性(图5)差异显著(t＝7.4，P＝0.0000)；转基因水稻阴性植株小穗平均育性(53.3％)远高于转基因水稻阳性植株2.8％的小穗育性。申请人亦检测了T₀代转基因水稻植株的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在转基因阳性和阴性水稻植株中无显著差异(见图6)，而转基因阴性植株胚囊育性显著高于转基因阳性植株胚囊育性(图7)(t＝12.33，P＝0.0000)。T₀代转基因阳性植株和转基因阴性植株以及T₁代转基因阳性植株和转基因阴性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如图8所示，结果表明本发明克隆的籼型杂种育性基因S5-i参与决定籼稻和粳稻亚种间杂交后代的雌配子育性，将导致胚囊败育，进而导致杂种育性降低。

3.含有S5基因区段的DNA片段的分离克隆

分别使用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法获得该基因全长cDNA。使用材料为籼稻南京11，粳稻Ballila和广亲和品种02428幼穗发育的五期叶片，液氮冷冻后于-70℃冰箱待用。按照TRIZOL说明书所述步骤提取RNA(注：TRIZOL Reagent，Invitrogen Cat.No.15596-018)，稀释浓度至1μg/μl，-70℃保存待用。

RACE具体步骤：使用Clontech的SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit，步骤参照该试剂盒说明书。

5’端RACE引物S5-GSP1：CCGTTCCAACCAGAATAGTCGTGCT

S5-R1：ACCCGAACATGAGATCCATAAACGA

3’端RACE引物S5-GSP2：AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA

S5-RACE4：CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC

UPM：Long(0.4M)：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCAA CGCAGAGT

Short(2μM)：CTAATACGACTCACTATAGGGC

NUPM：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

其中UPM和NUPM由上述试剂盒提供。

第一轮PCR反应条件：

94℃变性30秒，72℃3分钟，5个循环；

94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟，5个循环；

94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分钟，27个循环；

72℃最终延伸10分钟。

5’RACE使用引物UPM+S5-GSP1

3’RACE使用引物UPM+S5-GSP2

第二轮PCR反应条件：

94℃预变性4分钟；

94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟20秒，35个循环；

72℃最终延伸10分钟。

5’RACE使用引物NUPM+S5-R1

3’RACE使用引物NUPM+S5-RACE4

PCR引物延伸具体步骤：反转录采用20μl体系，按照DNaseI说明书所述步骤去除RNA中痕量DNA后，按SuperScript^TM II说明书所述步骤操作，产物于-20℃保存待用。(注：Deoxyribonuclease I，Invitrogen Cat.No.18068-015；SuperScript^TM II Reverse Transcriptase，Invitrogen Cat.No.18064-022)使用上述反转录产物1μl为模板做PCR。使用Takara Ex Taq(Takara code：DRR01AM)做PCR，PCR所用试剂均来自Takara Ex Taq包装。

PCR所用引物如下：

F5-3：ATCAACCCATTTCCTTTCCTACG

F5-2：CTGCCCCTGAGCAAGCAAGAAAG

F19-3：AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT

5F2：CCAAGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT

BDF2：GACGACGAGTTGGAGTGT

S5-F11：CAGCCGACGACGAGTTGGAGT

S5-F2：GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT

S5-GSP2：AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA

S5-RACE4：CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC

R11：ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA

BDR：CATTAGGAACAGGAAGTCGT

S5-R11：CTCTGCCCGTTGGCGATAAGC

S5-R2：TCTGGGTGGCAAAGCGAGTGC

S5-R33：ATGGCGGCACGGTCGTATCTT

R3-1：ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA

R3-2：TTGGCACGAACGGTTCAAGAG

R3-3：GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG

R3-4：GGTCCCAAATCAAGTACCGCTAG

R3-5：GCTCAACAATTAGGACATACGAC

分别对RACE产物和PCR产物测序获得所需全长基因。

实施例2：S5基因在水稻不同亚种的结构分析

对实施例1中测序得到的序列进行分析：水稻品种02428(广亲和)、Ballila(粳稻)和南京11(籼稻)的全长cDNA分别是1778bp、1912bp和1911bp，其结构由三个外显子和两个内含子组成(图9)。籼稻和粳稻有且仅有三个碱基的差异，其中南京11在3’非翻译区有一个单碱基的缺失，南京11和Ballila在编码区有两个单碱基多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，这两个SNP在编码蛋白中形成两个错义突变(图10)。S5基因编码一个472氨基酸的蛋白质，BLASTp分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)表明该蛋白与天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE(http://www.expasy.ch/cgi-bin/prosite/)分析发现该蛋白在第129-140个氨基酸和334-345个氨基酸存在两个活性位点。SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/)软件分析表明S5蛋白存在一个信号肽，它在蛋白成熟过程中被切除。

实施例3：利用芯片数据检测S5基因在水稻全生育期中表达水平

本发明利用芯片数据(Database of the National Center of Plant Gene Research，available athttp://crep.ncpgr.cn/.)检测S5基因在水稻全生育期不同组织中表达水平，使用的芯片数据包括籼稻Zhenshan 97和Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织(表3)的表达谱(图11)。结果表明S5基因在全生育期都极低水平表达。

表3芯片数据对应水稻组织名称

实施例4：S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性

天冬氨酰蛋白酶在酸性条件下被激活且其活性为pepstatin A所抑制(Rawlings ND，Barrett AJ(1995)Families of aspartic peptidases，and those of unknown catalytic mechanism.Methods Enzymol.248：105-20)。而本发明基因与天冬氨酰蛋白酶高度同源，为了验证本发明基因S5是否编码一个典型的天冬氨酰蛋白酶，本实例设计一个体外实验来验证S5蛋白是否具有这一功能。

具体实施步骤为：

(1)原核表达载体构建

设计引物5F1(5’-GGGAGATCTATGGTGATCTTGGAGCAGCCA-3’，接头加BglII酶切位点)和5R(5’-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAAACGGCA-3’接头加XhoI酶切位点)，以日本晴全长cDNA(来自北京凯拓公司)为模板PCR扩增全长。PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司。反应条件为：94℃，5min；94℃，1min，59℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，5min。产物构建到

-T(购自Promega)载体中，测序验证。然后分别将外源构建到pMAL-c2x载体中(购自BioLabs)，载体用BamHI和XhoI酶切。

(2)蛋白诱导表达

将构建好的表达载体转化表达菌株BL21(购自Invitrogen公司)，等菌液OD值达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside)，然后37℃诱导表达3hrs。收集菌体，加入一倍体积的PBS悬浮，置-20℃过夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入终浓度为1mM的PMSF，超声处理，整个超声过程在冰上进行，以保证蛋白处于天然状态。超声处理完成之后12000rpm，4℃冷冻离心。收集上清，用Amylose Resin(购自BioLabs)纯化。纯化步骤参照pMAL^TM Protein Fusion and PurificationInstruction Manual，Catalog #E8000S

(3)蛋白酶活性检测

20μl(10μg)纯化的蛋白，加入等体积的pH缓冲液与20μl FITC-casein(Protease FluorescentDetection Kit)，37℃下反应15小时后加入100ul 0.6N TCA(三氯乙酸)沉淀，12000rpm离心10min，吸上清100ul，加入2ml assay buffer，用荧光分光光度计(Fluorescence spectrophotometer，Hitachi850)测量。水为对照。

pH缓冲液配方：

0.1M Gly-HCl，pH2.5

0.1M 0.1M sodium citrate，pH3.0，pH3.5，pH 4.0；

0.1M sodium acetate，pH 5.0；

0.1M sodium phosphate，pH 6.0；

(4)检测ASP是否被pepstatin A抑制剂抑制

实验步骤：8μg纯化的目标蛋白中加入终浓度为0.15mM pepstatin A，4℃孵育1.5小时后，加入pH＝3的缓冲液至终体积40μl，然后再加入底物FITC-Casein 20μl(sigma，PF0100)，37℃下孵育12小时后，加入100μl 0.6NTCA沉淀，吸上清100μl，加入2ml assay buffer，用荧光分光光度计(HitachiM850 fluorescence spectrophotometer，Japan)测量。只含有标签MBP(麦芽糖结合蛋白)的纯化蛋白作为对照，每个做三次重复。

(5)天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析

原核表达纯化的Asp10μl(20μg)，加入1/2体积的PH缓冲液，37℃反应过夜，加入一倍体积的loading buffer，水煮5min，12％SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染液染胶。

结果表明该蛋白在pH3.0的条件下活性最高(图12)，且被pepstatin A完全抑制(图12)。实验同时表明该蛋白pH 2.5-4.0的条件下通过自身剪接，形成成熟蛋白(图13)。

上述结果表明本发明基因确实编码一个典型的天冬氨酰蛋白酶。

实施例5：S5基因的表达部位

为了确定S5基因的表达部位，本实例使用了RNA原位杂交技术。根据RNA探针杂交信号确定本发明基因在珠心、珠被、孢母细胞和小孢子母细胞中表达(图14)。

RNA原位杂交流程参见Drews(Drews GN(1998)In situ hybridization.Methods Mol Biol 82：353-71Drews GN(1998)In situ hybridization.Methods Mol Biol 82：353-71)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻籼型杂种育性基因S5-i的分离克隆及应用

<130>

<141>2007-10-10

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1778

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1778)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1441)..(1778)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1)..(21)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(22)..(1440)

<223>

<400>1

atcaacccat ttcctttcct a cgt ttg act gcc tgc ctg ccc ctg agc aag 51

Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys

1 5 10

caa gaa aga aag aaa gaa ggg att aaa ttt gct taa tcc ggc gcc aca 99

Gln Glu Arg Lys Lys Glu Gly Ile Lys Phe Ala Ser Gly Ala Thr

15 20 25

gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tcc tcc atc ttc gat cac gct 147

Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser Ile Phe Asp His Ala

30 35 40

gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc cac aag aag cac 195

Val Asn Ser Gln Gly Ala Ile Gln Phe Pro Val Phe His Lys Lys His

45 50 55

caa tgc ctc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag gca tcc tcg acc 243

Gln Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gln Ala Ser Ser Thr

60 65 70

gga gca tca gga gca gga aaa gga gga gga ttg aac aat cta cag gaa 291

Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gln Glu

75 80 85

gag gag atc act tca tca agt agt aca aaa atc gac gtg atc gaa gac 339

Glu Glu Ile Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ile Asp Val Ile Glu Asp

90 95 100 105

agc agc atc aac gac ttc ctg ttc cta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387

Ser Ser Ile Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys

110 115 120

cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg atc gac acg gga tcc acc ctc tcg 435

Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala Ile Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser

125 130 135

tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac acg cag tcc gcg 483

Trp Val Gln Cys Gln Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gln Ser Ala

140 145 150

aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tcc tac aca tcc cgg cga 531

Lys Ala Gly Pro Ile Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg

155 160 165

gtt cgc tgc tcg tcg gtc aag tgc ggc gag ctg agg tac gat ctg cgg 579

Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg

170 175 180 185

ctc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac agc tgc acg tac agc 627

Leu Gln Gln Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser

190 195 200

gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac agc gtg ggc aag atg gtg aca 675

Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr

205 210 215

gac acg ctg agg att ggg gac tcg ttt atg gat ctc atg ttc ggg tgc 723

Asp Thr Leu Arg Ile Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys

220 225 230

agc atg gat gtc aag tac agc gaa ttc gag gcc ggc atc ttt ggt ttc 771

Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly Ile Phe Gly Phe

235 240 245

ggc agc agc agc ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct gat 819

Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gln Leu Ala Gly Tyr Pro Asp

250 255 260 265

att ctg agt tac aag gca ttc agc tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867

Ile Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr

270 275 280

aag ccc gga tac atg atc ctg gga aga tac gac cgt gcc gcc atg gat 915

Lys Pro Gly Tyr Met Ile Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp

285 290 295

ggg ggt tac act cct ctc ttc cgg tca atc aac agg cca acc tac tca 963

Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser Ile Asn Arg Pro Thr Tyr Ser

300 305 310

ctg acg atg gag atg ctt atc gcc aac ggg cag aga ttg gtg aca tcg 1011

Leu Thr Met Glu Met Leu Ile Ala Asn Gly Gln Arg Leu Val Thr Ser

315 320 325

tct tcg gag atg atc gtc gat tcc ggg gcc cag agg acg tcc ctg tgg 1059

Ser Ser Glu Met Ile Val Asp Ser Gly Ala Gln Arg Thr Ser Leu Trp

330 335 340 345

cct tcc act ttt gct ctc ctt gac aag acc atc acg cag gca atg tcg 1107

Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr Ile Thr Gln Ala Met Ser

350 355 360

tcg att ggg tat cac cgg aca tca aga gcg cgc caa gaa tca tac atc 1155

Ser Ile Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gln Glu Ser Tyr Ile

365 370 375

tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac ggc acc atc acg 1203

Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr Ile Thr

380 385 390

ccc ttc tcc aac tgg tcc gcc ttg cct ctg ctg gag atc ggc ttc gcc 1251

Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu Ile Gly Phe Ala

395 400 405

ggc ggt gct gca ctc gct ttg cca ccc aga aac gtc ttc tac aac gat 1299

Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val Phe Tyr Asn Asp

410 415 420 425

cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt gct cag aat cct gct ctc agg 1347

Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gln Asn Pro Ala Leu Arg

430 435 440

tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tcc ttc gga aca acc ttc 1395

Ser Gln Ile Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe Gly Thr Thr Phe

445 450 455

gac atc cag ggg aaa caa ttc ggc ttc aaa tat gcc gct tgc tga 1440

Asp Ile Gln Gly Lys Gln Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Ala Cys

460 465 470

tcgtcgatta ttcctcatcc tatgatatat cttatagctt gcgggtcgat taattagctg 1500

gtttgcccaa ataactgatc ggattggagt cttctcccgc gctacactac ccctagctgc 1560

gatcgtatca caagctagcg gtacttgatt tgggacctaa ttcgttcaaa aaaaacttgg 1620

cagcttaatt tgggacctag tagctagctg agccactact agatgtttac gtaccagcta 1680

tccgtcgttt gtttgtgtct cctgtgcttg tgctaaacct atctcttgaa ccgttcgtgc 1740

caacttaatt atttggtcgt atgtcctaat tgttgatc 1778

<210>2

<211>21

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gln Glu Arg Lys Lys Glu

1 5 10 15

Gly Ile Lys Phe Ala

20

<210>3

<211>450

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>3

Ser Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser Ile

1 5 10 15

Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Ile Gln Phe Pro Val Phe

20 25 30

His Lys Lys His Gln Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gln

35 40 45

Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn

50 55 60

Asn Leu Gln Glu Glu Glu Ile Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ile Asp

65 70 75 80

Val Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val

85 90 95

Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala Ile Asp Thr Gly

100 105 110

Ser Thr Leu Ser Trp Val Gln Cys Gln Pro Cys Ala Val His Cys His

115 120 125

Thr Gln Ser Ala Lys Ala Gly Pro Ile Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr

130 135 140

Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg

145 150 155 160

Tyr Asp Leu Arg Leu Gln Gln Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser

165 170 175

Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly

180 185 190

Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg Ile Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu

195 200 205

Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly

210 215 220

Ile Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gln Leu Ala

225 230 235 240

Gly Tyr Pro Asp Ile Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro

245 250 255

Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met Ile Leu Gly Arg Tyr Asp Arg

260 265 270

Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser Ile Asn Arg

275 280 285

Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu Ile Ala Asn Gly Gln Arg

290 295 300

Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met Ile Val Asp Ser Gly Ala Gln Arg

305 310 315 320

Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr Ile Thr

325 330 335

Gln Ala Met Ser Ser Ile Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gln

340 345 350

Glu Ser Tyr Ile Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn

355 360 365

Gly Thr Ile Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu

370 375 380

Ile Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val

385 390 395 400

Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gln Asn

405 410 415

Pro Ala Leu Arg Ser Gln Ile Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe

420 425 430

Gly Thr Thr Phe Asp Ile Gln Gly Lys Gln Phe Gly Phe Lys Tyr Ala

435 440 445

Ala Cys

450

<210>4

<211>1912

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1912)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1577)..(1912)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1)..(157)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(158)..(1576)

<223>

<400>4

atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60

aagaaagaag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact 120

gacttttaat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg atc ttg gag cag 175

Met Val Ile Leu Glu Gln

1 5

cca cag ctg ctc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca gct gca gct gca 223

Pro Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala

10 15 20

acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tcc tcc atc 271

Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser Ile

25 30 35

ttc gat cac gct gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319

Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Ile Gln Phe Pro Val Phe

40 45 50

cac aag aag cac caa tgc ctc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367

His Lys Lys His Gln Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gln

55 60 65 70

gca tcc tcg acc gga gca tca gga gca gga aaa gga gga gga ttg aac 415

Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn

75 80 85

aat cta cag gaa gag gag atc act tca tca agt agt aca aaa atc gac 463

Asn Leu Gln Glu Glu Glu Ile Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ile Asp

90 95 100

gtg atc gaa gac agc agc atc aac gac ttc ctg ttc cta atg gcc gtc 511

Val Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val

105 110 115

agt ctg ggc aag cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg atc gac acg gga 559

Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala Ile Asp Thr Gly

120 125 130

tcc acc ctc tcg tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac 607

Ser Thr Leu Ser Trp Val Gln Cys Gln Pro Cys Ala Val His Cys His

135 140 145 150

acg cag tcc gcg aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tcc tac 655

Thr Gln Ser Ala Lys Ala Gly Pro Ile Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr

155 160 165

aca tcc cgg cga gtt cgc tgc tcg tcg gtc aag tgc ggc gag ctg agg 703

Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg

170 175 180

tac gat ctg cgg ctc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac agc 751

Tyr Asp Leu Arg Leu Gln Gln Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser

185 190 195

tgc acg tac agc gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac agc gtg ggc 799

Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly

200 205 210

aag atg gtg aca gac acg ctg agg att ggg gac tcg ttt atg gat ctc 847

Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg Ile Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu

215 220 225 230

atg ttc ggg tgc agc atg gat gtc aag tac agc gaa ttc gag gcc ggc 895

Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly

235 240 245

atc ttt ggt ttc ggc agc agc agc ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca 943

Ile Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gln Leu Ala

250 255 260

ggg tac cct gat att ctg agt tac aag gca tta agc tac tgc ttg ccc 991

Gly Tyr Pro Asp Ile Leu Ser Tyr Lys Ala Leu Ser Tyr Cys Leu Pro

265 270 275

act gac gag acc aag ccc gga tac atg atc ctg gga aga tac gac cgt 1039

Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met Ile Leu Gly Arg Tyr Asp Arg

280 285 290

gcc gcc atg gat ggg ggt tac act cct ctc ttc cgg tca atc aac agg 1087

Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser Ile Asn Arg

295 300 305 310

cca acc tac tca ctg acg atg gag atg ctt atc gcc aac ggg cag aga 1135

Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu Ile Ala Asn Gly Gln Arg

315 320 325

ttg gtg aca tcg tct tcg gag atg atc gtc gat tcc ggg gcc cag agg 1183

Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met Ile Val Asp Ser Gly Ala Gln Arg

330 335 340

acg tcc ctg tgg cct tcc act ttt gct ctc ctt gac aag acc atc acg 1231

Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr Ile Thr

345 350 355

cag gca atg tcg tcg att ggg tat cac cgg aca tca aga gcg cgc caa 1279

Gln Ala Met Ser Ser Ile Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gln

360 365 370

gaa tca tac atc tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac 1327

Glu Ser Tyr Ile Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn

375 380 385 390

ggc acc atc acg ccc ttc tcc aac tgg tcc gcc ttg cct ctg ctg gag 1375

Gly Thr Ile Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu

395 400 405

atc ggc ttc gcc ggc ggt gct gca ctc gct ttg cca ccc aga aac gtc 1423

Ile Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val

410 415 420

ttc tac aac gat cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt gct cag aat 1471

Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gln Asn

425 430 435

cct gct ctc agg tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tcc ttc 1519

Pro Ala Leu Arg Ser Gln Ile Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe

440 445 450

gga aca acc ttc gac atc cag ggg aaa caa ttc ggc ttc aaa tat gcc 1567

Gly Thr Thr Phe Asp Ile Gln Gly Lys Gln Phe Gly Phe Lys Tyr Ala

455 460 465 470

gtt tgc tga tcgtcgatta ttcctcatcc tatgatatct tatagcttgc 1616

Val Cys

gggtcgatta attagctggt ttgcccaaat aactgatcgg attggagtct tctcccgcgc 1676

tacactaccc ctagctgcga tcgtatcaca agctagcggt acttgatttg ggacctaatt 1736

cgttcaaaaa aaacttggca gcttaatttg ggacctagta gctagctgag ccactactag 1796

atgtttacgt accagctatc cgtcgtttgt ttgtgtctcc tgtgcttgtg ctaaacctat 1856

ctcttgaacc gttcgtgcca acttaattat ttggtcgtat gtcctaattg ttgatc 1912

<210>5

<211>472

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>5

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Val Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu

20 25 30

Glu Cys Pro Ser Ser Ile Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala

35 40 45

Ile Gln Phe Pro Val Phe His Lys Lys His Gln Cys Leu Arg Pro Trp

50 55 60

Ser Val Arg Ala Thr Gln Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly

65 70 75 80

Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gln Glu Glu Glu Ile Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Lys Ile Asp Val Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Asp Phe

100 105 110

Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu

115 120 125

Val Ala Ile Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser Trp Val Gln Cys Gln Pro

130 135 140

Cys Ala Val His Cys His Thr Gln Ser Ala Lys Ala Gly Pro Ile Phe

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Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val

165 170 175

Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg Leu Gln Gln Ala Asn Cys

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Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly

195 200 205

Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg Ile Gly

210 215 220

Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr

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Ser Glu Phe Glu Ala Gly Ile Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser

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Leu Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met Ile

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Ile Ala Asn Gly Gln Arg Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met Ile Val

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Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr Ile Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser

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Ala Leu Pro Leu Leu Glu Ile Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala

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<223>

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<223>

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25 30 35

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Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn

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Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala Ile Asp Thr Gly

120 125 130

tcc acc ctc tcg tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac 607

Ser Thr Leu Ser Trp Val Gln Cys Gln Pro Cys Ala Val His Cys His

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acg cag tcc gcg aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tcc tac 655

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aca tcc cgg cga gtt cgc tgc tcg tcg gtc aag tgc ggc gag ctg agg 703

Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg

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Tyr Asp Leu Arg Leu Gln Gln Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser

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tgc acg tac agc gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac agc gtg ggc 799

Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly

200 205 210

aag atg gtg aca gac acg ctg agg att ggg gac tcg ttt atg gat ctc 847

Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg Ile Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu

215 220 225 230

atg ttc ggg tgc agc atg gat gtc aag tac agc gaa ttc gag gcc ggc 895

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Ile Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gln Leu Ala

250 255 260

ggg tac cct gat att ctg agt tac aag gca ttc agc tac tgc ttg ccc 991

Gly Tyr Pro Asp Ile Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro

265 270 275

act gac gag acc aag ccc gga tac atg atc ctg gga aga tac gac cgt 1039

Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met Ile Leu Gly Arg Tyr Asp Arg

280 285 290

gcc gcc atg gat ggg ggt tac act cct ctc ttc cgg tca atc aac agg 1087

Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser Ile Asn Arg

295 300 305 310

cca acc tac tca ctg acg atg gag atg ctt atc gcc aac ggg cag aga 1135

Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu Ile Ala Asn Gly Gln Arg

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Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met Ile Val Asp Ser Gly Ala Gln Arg

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Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr Ile Thr

345 350 355

cag gca atg tcg tcg att ggg tat cac cgg aca tca aga gcg cgc caa 1279

Gln Ala Met Ser Ser Ile Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gln

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Glu Ser Tyr Ile Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn

375 380 385 390

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Gly Thr Ile Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu

395 400 405

atc ggc ttc gcc ggc ggt gct gca ctc gct ttg cca ccc aga aac gtc 1423

Ile Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val

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425 430 435

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Pro Ala Leu Arg Ser Gln Ile Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe

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Gly Thr Thr Phe Asp Ile Gln Gly Lys Gln Phe Gly Phe Lys Tyr Ala

455 460 465 470

gct tgc tga tcgtcgatta ttcctcatcc tatgatatct tatagcttgc 1616

Ala Cys

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50 55 60

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65 70 75 80

Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gln Glu Glu Glu Ile Thr Ser Ser

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Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu

115 120 125

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Phe Arg Ser Ile Asn Arg Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu

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Ile Ala Asn Gly Gln Arg Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met Ile Val

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Thr Ser Arg Ala Arg Gln Glu Ser Tyr Ile Cys Tyr Leu Ser Glu His

370 375 380

Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr Ile Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser

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Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Ala Cys

465 470

Claims

1.分离克隆的籼型杂种育性基因S5-i，它是(a)SEQ ID NO：6中第1-1911位所示的核苷酸序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的基因在水稻改良中的应用。