JP2020511960A - 光呼吸効率が増加した植物 - Google Patents
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Abstract
Description
この特許出願は、35U.S.C.§119(e)により、米国仮出願第62/467,993号の優先権を主張し、その仮出願は、2017年3月7日に出願され、参照により本明細書に組み入れられている。
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個々に示されて参照により組み入れられているのと同じ程度で、参照により本明細書に組み入れられている。
単離された核酸は、構造が、任意の天然に存在する核酸の構造と同一ではない核酸である。したがって、その用語は、例えば、(a)天然に存在するゲノムDNA分子の部分の配列を有するが、それが天然で存在する生物体のゲノムにおいてその分子のその部分に隣接するどちらのコードまたは非コード配列にも隣接していないDNA;(b)ベクターへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへ、結果として生じた分子がいかなる天然に存在するベクターまたはゲノムDNAとも同一ではないような様式で組み込まれた核酸;(c)cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により産生された断片、または制限断片などの別個の分子;ならびに(d)ハイブリッド遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子、を包含する。この定義から具体的に排除されるのは、(i)DNA分子、(ii)形質転換またはトランスフェクションされた細胞の混合物、および(iii)細胞クローンの混合物に存在する核酸であり、例えば、これらは、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーなどのDNAライブラリーに存在している。
本開示の一つの実施形態は、1つ以上の変更された植物遺伝子および/または導入された遺伝子を含む植物または植物細胞を提供する。例えば、本開示は、葉緑体局在化輸送タンパク質BASS6および/またはPLGG1をコードする遺伝子の機能的発現を欠損するトランスジェニック植物を提供する。加えて、本明細書に提供されるいくつかの植物または植物細胞は、また、細菌由来、植物由来、および藻類由来の遺伝子によりコードされる酵素などの非天然遺伝子を発現する。あるいは、本明細書に提供されるいくつかの植物または植物細胞は、産生されたタンパク質が、それが天然では局在していないオルガネラ(例えば、葉緑体)または他の細胞内コンパートメントに局在するように天然遺伝子を発現することができる。他の遺伝要素(例えば、PLGG1タンパク質産生のノックダウンを生じさせるdsRNA)の発現もまた企図され、本明細書に記載される。
本明細書に開示された特定のタンパク質の様々なホモログは、欠失もしくはノックダウンアプローチのための標的にすること、またはバイパス経路を生み出すために利用することができることは、当業者により理解される。以下は、本明細書に開示された実施形態を実行するために利用することができる、この開示に提供された特定のタンパク質の、非限定的で、例示的なタンパク質ホモログである。
植物材料および成長条件
A.thaliana Columbia(Col−0)を野生型参照として用いた。Salk_03569C(plgg1−1)、CS859747(bass6−1)、およびSalk_052903C(bass6−2)を、Arabidopsis Biological Resource Center(abrc.osu.edu)から入手した。植物を、LC1 Sunshine Mixを用いるグロースチャンバー(Conviron、USA)において、上昇したCO2(2000ppm CO2)または環境CO2(400ppm CO2)のいずれかで、8時間明期/16時間暗期のサイクル(22℃/18℃)、250μmol・m−2・s−1 PAR、および65%相対湿度(RH)で成長させた。
Arabidopsis植物を、環境大気条件下で成長させ、クロロフィル蛍光測定の前に、(Badgerら et al.2009)と同様に、低CO2条件、一定照明下で、24時間、密封された透明のプラスチック容器へ移した。クロロフィル蛍光測定を、以前に記載したように(Oxborough and Baker、Plant、Cell & Environ.(1997)20:1473〜83;Badger et al.、supra)行った。簡単に述べれば、週齢4週間の植物の15分間の暗順応後、CF Imager Technologica(www.technologica.co.uk)を用いてFv/Fm画像を取得した。最大フラッシュ強度は、800ミリ秒間の6800μmol・m−2・s−1であった。各個々の植物について、画像値を、各位置を定義するfluorimagerソフトウェアプログラム内でコロニーを検出することにより、取得した。
全ての発現ベクターを表2に記載した。プロモーターおよびオープンリーディングフレームを、The Arabidopsis Information Resource(TAIR)から得られた配列に基づいて合成した。制限部位および相同性の4塩基対領域を、植物合成生物学における一般的なシンタックスに従って設計した(Patronら、New Phytol.(2015)208:13〜19)。次に、構築物を、Golden Gateクローニングプロトコールを用いて集め、その後、バイナリーベクター(EC50505)へサブクローニングした(Werner et al.、Bioengineered(2012)3:38〜43;Engler et al.、ACS Synth.Biol.(2014)3:839〜43;Marillonnet and Werner、Glyco−engineering、A.Castilho編(Springer New York)269〜84ページ(2015);Patron et al.、supra)。安定的形質転換について、バイナリーベクターを、Agrobacterium tumefaciens C58C1へエレクトロポレーションにより形質転換し、その後、Col−0野生型系統、plgg1−1またはbass6−1 T−DNA挿入系列へフローラルディップにより形質転換した(Clough and Bent、Plant J.(1998)16:735〜43)。形質転換系列を、BASTA抵抗性に基づいて選択し、遺伝子挿入を、PCR分析により検証した。一過性発現について、上記のように、CaMV35sプロモーターにより駆動され、C末端GFP融合を有する構築物を設計した。
成長および浸潤実験は(Rolland et al.、上記)に記載されている。簡単に述べれば、Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90)を、関心対象となるプラスミドで形質転換し、リファンピシン(50μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)を含有するLB培地中で成長させた。培養物を、28〜30℃のインキュベータ内で約24時間、成長させ、N.benthamianaの葉の形質転換に用いた。P19を含有する細菌(OD600=0.3)を、関心対象となるプラスミドおよび/またはERコンパートメントマーカー(OD600=0.5)(Arabidopsis Biological Resource Center(http://abrc.osu.edu)からのプラスミドCD3−959(Nelsonら、2007))を含有する細菌と混合した。細胞を、2150 x gで8分間、遠心分離し、再懸濁した(10mM MES pH5.6、10mM MgCl2、および150μMアセトシリンゴン)。細胞を室温で2時間、インキュベートし、週齢3〜4週間のN.benthamianaの葉へ浸潤させた。
代謝産物分析について、約40mgの新鮮な葉組織を液体窒素中で凍結させ、粉砕し、その後、500μLの100%メタノールで抽出した。次に、試料を、Urbana−ChampaignにおけるMetabolomics Center、Roy J.Carver Biotechnology Center、University of Illinoisへ提出し、その後、そこで、以下の:イソプロパノール:アセトニトリル:水(3:3:2 v/v)、およびクロロホルム:メタノール(2:2 v/v)の2つの追加の抽出が実施された。Agilent 7890ガスクロマトグラフ、Agilent 5975質量選択検出器、およびHP 7683BオートサンプラーからなるGC−MSシステム(Agilent Inc.、CA、USA)を用いて、代謝産物を分析した。ガスクロマトグラフィを、ZB−5MS(60m×0.32mm I.D.および0.25umフィルム厚さ)キャピラリーカラム(Phenomenex、CA、USA)で実施した。入口およびMSインターフェイス温度は250℃であり、イオン源温度を230℃に調整した。1μLのアリコートを、10:1のスプリット比で注射した。ヘリウムキャリアガスを、2ml/分の一定流速に保った。温度プログラムは以下の:5分間の70℃での等温加熱、続いて、310℃まで5℃/分のオーブン温度上昇、および310℃での最終の10分間であった。質量分析計を、陽電子衝撃モード(EI)において、69.9eVイオン化エネルギー、m/z 30〜800スキャン範囲で操作した。全てのクロマトグラムピークのスペクトルを、電子衝撃質量スペクトルライブラリーNIST08(NIST、MD、USA)、W8N08(Palisade Corporation、NY、USA)、および特注のデータベース(464個の固有の代謝産物)と比較した。全ての既知の人工ピークを同定し、除去した。試料間での比較を可能にするために、全てのデータを、各クロマトグラムおよび試料湿重量において内部標準に対して標準化した。全てのクロマトグラムピークのスペクトルを、AMDIS 2.71(NIST、MD、USA)プログラムを用いて評価した。代謝産物濃度を、1グラム湿重量あたりの内部標準に対する濃度(すなわち、ヘントリアコンタン酸のピーク面積で割った、標的化合物ピーク面積:Ni=Xi*X−1IS)として報告した。計器変動は、5%の標準合格限界内であった。
上昇した[CO2]で成長した日齢30〜40日間のArabidopsis植物の最も若い完全展開した葉を、ガス交換による光合成の分析に用いた。ガス交換測定を、マニュアル(LI−COR Biosciences、Lincoln、NE、USA)に概略が述べられているように、ガスケット漏れを補正した2cm2蛍光測定ヘッドを有するLi−COR 6400XTを用いて実施した。25℃の葉温度および飽和光(1000μmol・m−2・s−1)において、示されたCO2濃度においてA、gs、およびCi測定値を得た。環境CO2下での順化後、上記で述べられた同じ温度および光条件下、CO2の範囲(50〜2000ppm)においてACi曲線を測定した。Vc Max、JMax Rd、およびgsを、ACiデータおよびPsFitモデルを用いて決定した(Bernacchi et al.、Plant Cell.Environ(2003)26:1419〜1430)。
8時間/16時間の昼夜サイクル下、180μmol・m−2・s−1 PARおよび22℃/18℃温度状態、65%RHにおいて成長した週齢4週間のArabidopsis植物の、植物RNeasy抽出キットおよびQuantitec逆転写キット(QIAGEN USA)を用いて抽出されたRNAから、cDNAを作製した。それぞれ3つの技術的複製を含む3つの生物学的複製を、全ての試料に用いた。Bio−Rad CFX connectリアルタイムPCRシステム(Bio−Rad laboratories、USA)を用いて試料を分析し、転写産物における相対的変化を、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ(VDE)、Plgg1、およびBass6の転写産物へ方向づけられたプライマーを用いるΔΔCt方法を用いて決定した。cDNAを、SSO advanced SYBR green master mix(Bio−Rad)を用いて増幅し、プライマー配列は表3に記載されている。
酵母プラスミドを、以前記載されているように(South et al.、J.Biol.Chem.(2010)285:595〜607)、構築した。簡単に述べれば、RNAをCol−0野生型Arabidopsisから取得し、RNeasy抽出キットおよびQuantitec逆転写キット(QIAGEN、Hilden、Germany)によりcDNAへ変換した。葉緑体局在化シグナル(1〜24)無しの完全長Bass6およびPlgg1のCDS配列を、表3に記載されたプライマーを用いるPCRにより増幅した。PCR産物を、pRS415−ADH1ベクター(ATCC、VA USA)へBamHIおよびXhoI制限部位を用いてクローニングした。酵母形質転換を、以前記載されているように、BY4741 mat a野生型およびady2Δ系統(GE Dharmacon)を用いて実施した(South et al.、supra;Southら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(2013)110:E1016〜E1025)。
全ての実験は少なくとも3つの生物学的複製を有し、データは平均値を示す。相対的成長分析およびmRNAレベルの相対的変化は、標準偏差およびstudentのT検定を用いた有意性を含む。代謝産物分析および光合成測定値を、P<0.05の有意性閾値での一元配置ANOVA(遺伝子型)または二元配置ANOVA(CO2処理による遺伝子型)のいずれかにより解析した。全てのANOVAの後にTukeyのpost−hoc検定を行い、統計ソフトウェア(OriginPro 9.1、OriginLab、MA USA)を用いて決定した。
推定葉緑体内膜タンパク質BASS6の発現を欠損する、遺伝子At4g22840を標的にする2つの独立したT−DNA挿入系列を分析した。BASS6が光呼吸に関与するかどうかを決定するために、2つのT−DNA系列(bass6−1およびbass6−2)を、環境CO2(400ppm)条件下で成長させた。野生型対照と比較して、両方のbass6変異体系列は、光呼吸に関与するグリコール酸/グリセリン酸トランスポーター変異体plgg1−1と類似して、より小さいロゼットのサイズを示した(図2−環境CO2(グロースチャンバー内で、8週間、400ppm CO2 8時間明期/16時間暗期のサイクル(22℃/18℃)、250μmol・m−2・s−1光強度)で成長した、WTと比較した、bass6およびplgg1変異体の代表的な写真)。低濃度のCO2下での光呼吸変異体の照明は、光化学系IIへの光損傷に起因した可能性がある、暗順応したFv/Fmクロロフィル蛍光の低下を生じた(Badgeret al.、supra)。plgg1−1系列とbass6−1系列のどちらも、一定照明下での24時間後、野生型と比較して、Fv/Fmの有意な低下を示したが、低[CO2]処理前にはFv/Fmの低下は観察されなかった(図3)。光呼吸変異体表現型を検証するために、bass6−1変異体の成長分析を、低いCO2、環境CO2、および上昇したCO2において実施した。古典的な光呼吸変異体表現型と一致して、bass6−1変異体とplgg1−1変異体のどちらも、125ppm CO2において成長しなかった(図4B)。環境CO2条件下では、bass6−1 T−DNA系列とplgg1−1 T−DNA系列のどちらも、野生型対照と比較して、遅い成長の表現型を示した(図4Aおよび4B)。重要なことに、その遅い成長表現型は、高い[CO2]条件で成長した時、bass6−1変異体とplgg1−1変異体のどちらにおいても野生型表現型へと回復された(図4Aおよび4B)。
以前の研究は、BASS6タンパク質が葉緑体包膜に局在することを示唆しているが、細胞内位置予測プログラムは、BASS6のミトコンドリア局在をより強く支持した(Gigolashvili et al.、supra)。BASS6タンパク質の局在化を決定するために、BASS6−GFP融合タンパク質の一過性発現を、Nicotiana benthamianaにおけるプロトプラストと葉組織全体の両方において分析した。クロロフィル自己蛍光を用いて、葉緑体を同定した(図7、パネルB、E、H、およびK)。BASS6−GFPシグナルは、既知のグリコール酸/グリセリン酸トランスポーターPLGG1(図7、パネルD〜F)と同様に、葉緑体自己蛍光を囲み(図7、パネルG〜I)、BASS6が葉緑体包膜に局在していることを示している。さらに、BASS6−GFPまたはPLGG1−GFPのいずれの発現も、形が葉緑体内包膜に局在したタンパク質の典型であるストロミュール(図7、パネルD〜Iにおける星印の付いた矢じり)の形成を誘導した(Breuers et al.、Frontiers Plant Sci.、(2012)3:7)。葉組織全体からの光シート顕微鏡法実験は、また、葉緑体包膜および追加の非葉緑体領域への局在化を示したが、これは一過性過剰発現に起因した可能性がある(図7、パネルJ〜L)。追加の対照として、GFP対照タンパク質を、BASS6−GFPと比較し、BASS6が、サイトゾルに局在しないことを示した。
RubisCO酸素化速度が相当にある場合、光呼吸に欠陥を有する変異体植物は、光呼吸経路内に様々な代謝産物中間体を蓄積する。光呼吸経路においてBASS6の輸送ステップを同定するのを助けるために、高い(2000ppm)または低い(150ppm)[CO2]のいずれかに曝された葉組織において代謝産物プロファイルを分析した。高い[CO2]条件下での野生型対照と比較して、bass6−1系列は、アミノ酸セリンの増加を示し、一方、以前に報告されたplgg1−1系列は、高いCO2濃度においてさえも、グリコール酸、グリシン、およびグリセリン酸などの複数の光呼吸中間体を蓄積した(図9)。葉が低レベルのCO2に曝されてRubisCO酸素化速度を増加させた場合、bass6−1におけるグリシンおよびグリコール酸のレベルは、野生型と比較して、有意に増加した(図9)。比較として、bass6−1は、葉が低レベルのCO2に曝された場合、plgg1−1植物と同様のグリシンレベルを蓄積した(図9)。
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて既知のグリコール酸トランスポーターはないが、酢酸トランスポーターADY2は、酢酸とグリコール酸の両方を輸送することが知られているEscherichia coli yjcGと相同である(Gimenez et al.、J.Bacteriol.、(2003)185:6448〜55)。したがって、本発明者らは、BASS6とPLGG1の両方を発現する酵母ベクターを作製し、それらを、野生型BY4741と同質遺伝子的ady2Δ系統の両方において発現させた。成長を測定するスポットアッセイにより、空ベクターのみを発現するady2Δ系列は、グリコール酸を唯一の炭素源として成長することはできないことを示した(図11)。予想された通り、ady2Δ酵母系統におけるPLGG1の発現は、唯一の炭素源としてグリコール酸を用いて、成長を野生型のレベルまで戻して救出した(図11)。Bass6遺伝子の発現もまた、ady2Δ系統において成長を救出し、BASS6がグリコール酸輸送を補完し得るという証拠を示した(図11)。炭素源としてグルコースおよび乳酸を用いる対照は、酵母におけるBASS6およびPLGG1の発現が成長にネガティブには影響しないこと、およびady2Δ系統が両方の炭素源を利用できることを示している(図11)。
ArabidopsisにおけるBass6またはPlgg1のいずれかの欠損は、環境またはより低い[CO2]大気において、野生型と比較して成長速度が低下した光呼吸変異体表現型をもたらす(図2)。加えて、BASS6およびPLGG1の発現を欠損する二重変異体植物は、植物の成長する能力をさらに低下させた(図6A)。BASS6またはPLGG1のいずれかの欠損は光呼吸表現型を生じさせたが、いずれのT−DNA挿入系列も、多数の他の光呼吸変異体に関して見られたように、環境大気において成長した場合、致死性ではなかった。これは、輸送過程における重複性、および1つの遺伝子の欠損の別の遺伝子発現の増加による補完によるものであり得た。Bass6またはPlgg1の欠損が他の遺伝子の発現の変化を生じるかどうかを試験するために、リアルタイムPCR(RT−PCR)実験を実施した。plgg1−1系列において、野生型と比較して、Bass6発現における検出可能な差はなかった(図13)。しかしながら、Plgg1の発現は、bass6−1系列において野生型に対して4.8倍増加し、Plgg1発現が、BASS6の欠損により引き起こされた代謝変化を補完するように顕著に増加したことを示唆している(図13)。Plgg1発現がbass6−1植物において増加したことを決定した後、Plgg1発現の変化が、plgg1−1と比較してbass6−1においてそれほど重篤ではない表現型が観察されることの理由であると仮定した。このことにより、Bass6またはPlgg1のいずれかの発現が、単一変異体のそれぞれの遅い成長表現型を潜在的に補完し得るかどうかを試験することに至った。
植物材料
Nicotiana tabacum c.v.「Petite Havana」を、標準方法論を用いたAgrobacterium tumefaciens媒介性形質転換を用いて(Glowacka et al.、Plant Cell Environ.、(2016)39:908〜17)、形質転換し、18個のバイナリープラスミドが、表5に記載および列挙されているように、構築された。以下の:(TSR)タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ、(Spm)トウモロコシサプレッサー−ミュテータ−転位可能エレメントプロモーター(Maize Supressor−mutator transposable element promoter)、(RbcS)Rubisco小サブユニットプロモーターおよびシグナルペプチド、(Ocs)Agrobacteriumオパインシンターゼ、(GdD)E.coliグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットD、(Act2)アクチン2プロモーターおよびターミネーター、(35s)カリフラワーモザイクウイルス35sプロモーターおよびターミネーター、(Pgm)ホスホグルコムターゼシグナルペプチド、(GdE)E.coliグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットE、(GdF)E.coliグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットF、(Gcl)グリオキシル酸カルボリガーゼ、(GO)グリコール酸オキシダーゼ、(MS)リンゴ酸シンターゼ、(Cat)カタラーゼ、(Nos)Agrobacteriumノピン(Nopine)シンターゼプロモーターおよびターミネーター、(2×35S)二重35sプロモーター、(Ubi)ユビキチンプロモーターが略語として表で利用されている。
タバコ種子を、管理環境チャンバー(Environmental Growth Chambers、Chagrin Falls、Ohio、USA)内、14時間昼(25℃)/10時間夜(22℃)および500μmol m−2 s−1の光強度で、必須ビタミンを含むムラシゲスクーク(MS)プレート上、環境大気下で発芽させた。発芽から8日後、実生プレートを、管理環境グロースチャンバー内の特注で組み立てられた低CO2チャンバーへ移した。光レベルを、24時間、1200μmol m−2 s−1へ増加させ、CO2濃度を35μbar未満に維持した。Fv’/Fm’を、CF Imager Technologica(www.technologica.co.uk)を用いて各プレート上で決定した。最大フラッシュ強度は、800ミリ秒間、6800μmol・m−2 s−1であった。以前に記載されているように(South et al.、Plant Cell(2017)29:808〜823;Badger et al.、Funct.Plant Biol.(2009)36:867〜73;Schmidt & Delaney、Mol.Genet.Genomics(2010)283:233〜41)、各位置を定義するfluorimagerソフトウェアプログラム内でコロニーを検出することにより、各個々の植物について画像値を得た。
植物を、下に記載された温室または圃場条件下で成長させた。5つの葉片を、系列あたり3つの植物から採取した(2.9cm2、約100mg)。RNAおよびタンパク質を、同じ葉試料からNucleoSpin RNA/タンパク質キット(Macherey−Nagel GmbH & Co.KG、Duren、Germany)を用いて抽出した。cDNAを、抽出されたRNAからQuantinova逆転写酵素キット(QIAGEN、USA)を用いて作製した。それぞれ3つの技術的複製を含む最低限3つの生物学的複製を、全試料について用いた。遺伝子発現を、Bio−Rad CFX connectリアルタイムPCRシステム(Bio−Rad Laboratories、USA)を用いて分析した。転写産物の相対的変化を、導入遺伝子転写産物および標準対照遺伝子としてのL25遺伝子へ方向づけられたプライマーを用いてΔΔCt方法を用いて決定した(Brooks and Farquhar、Planta(1985)165:397〜406)。cDNAを、SSO advanced SYBR green master mix(Bio−Rad)および表6に記載されたプライマー配列を用いて増幅した。
光呼吸の3つのバイパスが成長能力および成長速度の増加を生させるかどうかを決定するために、茎の高さおよび乾燥重量バイオマスを決定した。単一インサートT2種子を、LC1 sunshine mix(Sun Gro 202 Horticulture、Agawam、MA、USA)上で発芽させた。発芽から10日後、実生を、徐放性肥料(Osmocote Plus 15/9/12、The Scotts Company LLC、Marysville、OH、USA)を追加したLC1 sunshine mixを含む4Lのポット(400C、Hummert International、Earth City、MO、USA)に移した。ポットを温室内でランダム化し、各灌水前に位置を変化させた。温室内の光強度を、量子センサー(LI−190R、LI−COR、Lincoln、Nebraska、USA)を用いて測定した。大気温度、相対湿度、および[CO2]を、複合型温度湿度センサー(HMP60−L、Vaisala Oyj、Helsinki、Finland)、および赤外線ガスアナライザ(SBA−5、PPsystems、Amesbury、MA、USA)を用いて測定した。全ての気候データを、データロガー(CR1000、Campbell Scientific Inc、Logan、UT、USA)を用いて記録した。利用された温室成長条件は、文献(Kromdijk et al.、supra)に以前報告されたものと同様であった。地上バイオマスを、茎の高さの決定後7週間目に採取し、2週間、乾燥させ、乾燥重量を各画分について決定した。
概念実験の立証として、各光呼吸バイパスデザインの効果を、イリノイ州中央において2016年期についての圃場条件下で評価した。バイパス3の5つの独立した形質転換事象、バイパス1の4つの事象、およびWTと比較して貧弱な性能により、バイパス2のたった2つの独立した形質転換を、2つの野生型(WT)および2つの空ベクター(EV)対照と共に、ランダム化されたブロックデザインに植えた。以前記載されているように(Kromdijk et al.、Science(2016)354:857〜61)、ホモ接合性単一インサートT2種子を、soil mix(Sun Gro 202 Horticulture、Agawam、MA、USA)を含有するポットにおいて2016年5月14日に発芽させ、7日間、成長させて、その後、浮きトレイに移した。植物を、Universtiy of Illinois Energy Farm圃場ステーション(40.11°N、88.21 261°W、Urbana、IL、USA)へ、その圃場を記載されているように(Kromdijk et al.、supra)準備した後、2016年6月6日に移植した。各ブロックは、30cmの間隔をあけた6×6であった。ブロックあたり内側の16個の植物は、WT境栽に囲まれた、示されたトランスジェニック植物系列であった。WT植物の追加の2列の境栽がその実験を囲んだ。プロット内に置かれた6つの給水塔から必要に応じて灌水が提供された。光強度、大気温度、および降水量を含む気象データを、記載される2016年圃場季節について測定した(データ未呈示)。
農業条件下でのバイパス3の植物生産性への効果のより正確な評価を得るために、繰り返しランダム化されるブロック設計を、2017年圃場期に用いた。圃場プロットは、ブロックあたり7個のランダム化される6×6プロットを有する、5つの複製ブロックからなった。中央の16個の植物は、WT境栽に囲まれた、試験されるトランスジェニック系列またはWTであった。35個のプロット全体は、境栽としてのWTの追加の列により囲まれた。同じ収穫期からの単一インサートホモ接合性系列は、LC1 sunshine mix上に蒔かれ、7日間、発芽した。7日後、上記のように、実生を浮きトレイへ移植した。浮きトレイへの移植から14日後、植物を、University of Illinois、Urbana、IL USAのEnergy farm圃場ステーションへ、2017年6月21日に移植した。灌水を必要に応じて、並列細流灌漑(滴下ライン)を用いて提供した。光強度、大気温度、および降水量を含む気象データを、2017年圃場期について記録した。Φaを決定するための光合成測定を2017年7月2〜5日、実施し、それと共に、同時期の間、最も若い完全展開した葉において光合成色素を採取した。
CO2用量応答から正味光合成同化速度を決定するために、週齢7週間のN.tabacum植物の底面から5番目の葉を、LI−COR 6800赤外線ガスアナライザ(Li−Cor Biosciences、Lincoln、NE、USA)の蛍光キュベットへクランプし、葉温度を25℃に管理し、光強度を1500μmol m−2 s−1に設定した。定常状態に達するように葉を400μmol mol−1で気候順化した。応答曲線のCO2濃度を、400、200、100、50、30、400、600、800、1000、1500、2000μmol mol−1に設定し、同化作用が定常状態に達した時に、測定値をとった。カルボキシル化の最大速度(Vcmax)、最大電子伝達速度(Jmax)、およびミトコンドリア呼吸速度を決定するために、収集されたCO2応答曲線から無限葉肉伝導度を想定した温度補正を有する葉光合成のモデルを用いた。Γ*およびRd測定を、一般的な交差方法を用い、ガス交換を、蛍光チャンバーを使用するLI−COR 6800(LI−COR Biosciences)を用いて実施した。Γ*を、様々な亜飽和照射量下での光合成のCO2応答を測定することにより、一般的な交差方法を用いて測定した。一般的な交差は、Ci*およびRdのより正確かつ一貫した値を生じるために、傾き切片回帰を用いて決定した(Walker et al.、Plant Cell Environ.(2016)39:1198〜1203)。植物を、光合成が定常に達するまで、150μBar CO2において、250μmol m−2 s−1光下で気候順化させ、150、120、90、70、50、および30μBar CO2において250、165、120、80、および50μmol m−2 s−1の照射量下で測定した。以前報告されているように(Walker et al.、supra)、x交点を、Γ*に変換した。
全ての統計解析を、Origin pro 2016(バージョン9.3.226、Origin lab corporation Northampton、MA、USA)を用いて実施した。Fv’/Fm’測定について、各プレートは、最低限10個の実生を含有し、データは平均値を示す。有意性を、一元配置分散分析(ANOVA)により評価した。遺伝子発現の相対変化を、温室または圃場のいずれかで成長した試料からの生物学的複製あたり3つの技術的複製に関して、一元配置ANOVAにより解析した。温室バイオマスおよび茎の高さ実験を、最低限8つの生物学的複製に関して、一元配置ANOVAにより解析した。2016年圃場期からのバイオマスおよび茎の高さ実験を、8つの生物学的複製に関して、一元配置ANOVAにより解析した。2017年圃場期からのバイオマスデータを、ブロックあたり遺伝子型につき8つの生物学的複製に関して、二元配置ANOVA(遺伝子型×ブロック)により解析した。温室光合成測定値を、測定あたり3つの生物学的に関して、一元配置ANOVAにより解析し、圃場光合成測定値を、プロットあたり2つの植物複製および5つのランダム化された複製ブロックに関して二元配置ANOVAにより解析した。図に示されているように、全てのANOVA検定を、P<0.05またはそれ未満で実施した。全てのANOVA解析の後に、平均値比較のためにTukeyのpost−hoc検定を行った。
Nicotiana tabacumを、5つの遺伝子を発現する3つの異なる光呼吸バイパスデザインで形質転換した(図14、表5)。バイパス1およびバイパス2は、文献において以前報告された。しかしながら、新しく開発されたバイパス3は、グリコール酸オキシダーゼの代わりにChlamydomonas reinhardtiiグリコール酸デヒドロゲナーゼ(配列番号45)を利用して、設計され、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、有益なことに、グリコール酸からグリオキシル酸への変換中の副産物としての過酸化水素を生成しない(Abolemy et al.、Plant Physiol.Biochem.(2014)79:25〜30)。
Claims (36)
- グリコール酸を葉緑体の少なくとも一部分から輸送する植物の能力の喪失または低下を含み、かつ前記植物の葉緑体の少なくとも一部分内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得を含む、1つ以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変植物。
- 前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号6と少なくとも70%配列同一性、少なくとも75%配列同一性、少なくとも80%配列同一性、少なくとも85%配列同一性、少なくとも90%配列同一性、または少なくとも95%配列同一性を有する内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失を含む、請求項1の植物。
- 前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号46と少なくとも95%同一のRNA分子の発現により誘導されるRNA干渉を含む、請求項1または請求項2の植物。
- 前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む、請求項1〜3のいずれか一項の植物。
- 前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号43のアミノ酸残基41〜607と少なくとも95%同一である、請求項4の植物。
- 前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号45のアミノ酸残基41〜1136と少なくとも95%同一である、請求項4または請求項5の植物。
- 前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号43を含み、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号45を含む、
請求項4の植物。 - 前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号3と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生の欠如、および配列番号6と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生の欠如を含み、
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号43と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号45と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生を含む、請求項1の植物。 - 前記植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項の植物。
- a.グリコール酸を植物の葉緑体の少なくとも一部分から輸送する能力の喪失を含む遺伝子改変を植物に導入する工程と、
b.葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得を含む遺伝子改変を植物に導入し、それにより植物の成長または生産性を増加させる工程と、
を含む、成長または生産性が増加した植物を作製する方法。 - 前記植物の葉緑体の少なくとも一部分からグリコール酸を輸送する能力の喪失は、
配列番号3と少なくとも95%同一性を有する内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、もしくは活性の完全な喪失を含み、
また、配列番号6と少なくとも95%同一性を有した第2の内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、もしくは活性の完全な喪失を含み、
またはその両方を含む、
請求項10に記載の方法。 - 前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号46と少なくとも95%同一のRNA分子の発現によりRNA干渉を誘導することを含む、請求項10または請求項11の方法。
- 前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む、請求項10〜12のいずれか一項の方法。
- 前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号43のアミノ酸残基41〜607と少なくとも95%同一であり、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号45のアミノ酸残基41〜1136と少なくとも95%同一である、
請求項13の方法。 - 前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号43を含み、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号45を含む、
請求項13の方法。 - 前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号3と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生の欠如、配列番号6と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生の欠如、または両方に起因し、
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号43と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号45と少なくとも95%同一性を有するタンパク質の産生を含む、
請求項13の方法。 - 前記植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項10〜16のいずれか一項の方法。
- リンゴ酸シンターゼをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと、
グリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと、
を含む遺伝子改変植物であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在する、植物。 - 前記植物の葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する、請求項18の植物。
- 前記リンゴ酸シンターゼは、Cucurbita maxima由来である、請求項18または請求項19の植物。
- 前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号43のアミノ酸残基41〜607と少なくとも95%同一である、請求項18〜20のいずれか一項の植物。
- 前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、Chladymonas reinhardtii由来である、請求項18〜21のいずれか一項の植物。
- 前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号45のアミノ酸残基41〜1136と少なくとも95%同一である、請求項18〜22のいずれか一項の植物。
- 前記第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号43のアミノ酸配列をコードし、
前記第2の異種ポリヌクレオチドは、配列番号45のアミノ酸配列をコードする、
請求項18〜23のいずれか一項の植物。 - 前記植物の葉緑体において、1つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失をさらに含む、請求項18〜24のいずれか一項の植物。
- 前記植物の葉緑体からのグリコール酸輸送の低下または喪失を有する、請求項25の植物。
- 前記1つ以上のグリコール酸輸送タンパク質は、PLGG1およびBASS6を含む、請求項25または請求項26の植物。
- 前記1つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも1つは、配列番号6と少なくとも70%配列同一性、少なくとも75%配列同一性、少なくとも80%配列同一性、少なくとも85%配列同一性、または少なくとも90%配列同一性を有する、請求項25〜27のいずれか一項の植物。
- 前記1つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも1つは、配列番号6と少なくとも95%配列同一性を有する、請求項28の植物。
- グリコール酸輸送タンパク質の発現を阻害するRNA分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項25〜29のいずれか一項の植物。
- 前記1つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも1つのレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失は、CRISPR/Cas、TALEN、Zn−フィンガーヌクレアーゼ、およびRNAiからなる群から選択される技術を用い生じさせられる、請求項25〜29のいずれか一項の植物。
- 前記RNA分子は、配列番号46と少なくとも95%同一である、請求項30の植物。
- イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項18〜32のいずれか一項の植物。
- リンゴ酸シンターゼをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと、
グリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと、
を含む遺伝子改変植物であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在する、植物。 - 配列番号43と少なくとも95%同一性を有する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと、
配列番号45と少なくとも95%同一性を有する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと、
を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、植物の葉緑体に局在する、遺伝子改変植物。 - リンゴ酸シンターゼをコードする第1の異種ポリヌクレオチドおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを植物へ導入することを含む、成長または生産性が増加した植物を作製する方法であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在し、
植物は、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の増加を有し、それにより植物の成長または生産性を増加させる、方法。
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