CN115927394A - 玉米VPS23类似基因ZmVPS23L及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米VPS23类似基因ZmVPS23L，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；还公开了通过提高玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达以提高植物抗大斑病、耐盐性和抗旱性，通过降低玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达以提高植物抗小斑病的应用。实验证实，通过对ZmVPS23L转基因过表达阳性株系的大田大斑病、小斑病鉴定，盐处理、旱处理实验，发现ZmVPS23L过表达阳性株系对大斑病抗性、耐盐性和抗旱性均增强，对小斑病表现出感病表型，证明了ZmVPS23L是一个新的调控抗逆的基因。进一步利用CRISPR/CAS9技术，针对ZmVPS23L设计两个靶点，对ZmVPS23L编辑株系进行小斑病鉴定，发现ZmVPS23L编辑株系表现出对玉米小斑病产生抗病性。本发明为玉米的抗病育种提供了新基因、新材料和新方法，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及玉米(Zea mays L.)VPS23类似基因ZmVPS23L及其在植物抗病、耐盐、抗旱中的应用。
背景技术
玉米是我国第一大粮食作物，在国家粮食安全中占据重要地位。玉米在生长过程中，经常受到各种不利环境胁迫的影响，包括病害、高盐、干旱等。这些环境胁迫严重影响玉米的产量。挖掘新的抗逆基因，研究玉米的抗病、耐盐、抗旱的机理，对玉米的遗传改良和农业生产具有非常重要的意义。
抗病蛋白在植物抗病中发挥关键作用。抗病蛋白能够在病原菌侵染的部位引起快速的、局部的程序性细胞死亡，称为超敏防卫反应。超敏防卫反应能够限制病原菌的扩散，所以通常被作为植物抗病的标志。玉米抗病基因突变体Rp1-D21能够在不需要病原菌侵染的条件下，自主产生超敏防卫反应，表现为植株矮化、叶片出现黄色斑点，被用于发掘和鉴定抗病功能基因。
内体分选转运复合物(Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是一种保守的多亚基复合物，对多泡体的生物发生和蛋白质的分选转运至关重要。VPS23是ESCRT-I复合物的关键组成部分。模式植物拟南芥中研究发现，AtVPS23在植物发育和非生物胁迫中发挥重要作用，如AtVPS23能够调控植株对盐胁迫和旱胁迫的响应。检索分析表明，拟南芥中还存在一个与AtVPS23进化较近的同源蛋白At2G38830，但其功能还未见报道。玉米基因组检索发现与拟南芥AtVPS23和At2G38830相似性较高的蛋白分别为ZmVPS23和ZmVPS23L(VPS23-like)，它们在玉米中的功能均未见报道。
发明内容
针对目前的技术状况，本发明的目的是提供一种玉米VPS23类似基因ZmVPS23L及其通过提高ZmVPS23L的表达以增强耐盐、抗旱和大斑病的抗性，或通过降低ZmVPS23L的表达以增强对玉米小斑病抗性的应用。
本发明所述的玉米VPS23类似基因ZmVPS23L，其特征在于：所述基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L编码的氨基酸序列，其特征在于：所述基因ZmVPS23L编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种含上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为ZmVPS23L-pCAMBIA3301。
本发明提供了一种通过提高上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的表达以提高植物抗大斑病、耐盐或抗旱的应用；其中，所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'-、3'-非翻译区的玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达提高同样具有提高植物大斑病抗性、耐盐或抗旱的功能；所述应用方法得到的材料包括将表现出增加抗逆性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加抗逆性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。
上述应用优选的实施方式是：所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物是玉米；所述抗逆性指抗旱性、耐盐性或对玉米大斑病的抗性。
本发明提供了一种含上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的CRISPR/CAS9基因编辑载体，其特征在于：所述编辑载体命名为CRISPR-ZmVPS23L，该编辑载体克隆区域ZmVPS23L的两个靶点序列分别命名为gRNA1和gRNA2；其中gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，对应于SEQ ID No.1中第93-112位核苷酸，gRNA2的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，对应于SEQ ID No.1中第240-259位核苷酸。
本发明提供了一种应用上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的CRISPR/CAS9基因编辑载体获得小斑病抗性玉米突变体株系的方法，其特征在于：依据CRISPR/CAS9技术原理，将编辑载体命名为CRISPR-ZmVPS23L遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，即获得不含有CAS9但ZmVPS23L基因被成功编辑的小斑病抗性玉米突变体株系。
上述的方法中：所述不含有CAS9但ZmVPS23L基因被成功编辑的小斑病抗性玉米突变体株系优选是命名为type2和type3的两个玉米突变体株系；其中type2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，type3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明提供了一种通过降低上述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的表达以提高植物抗小斑病的应用；其中，所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'-、3'-非翻译区的玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达降低同样具有提高植物小斑病抗性的功能；所述降低基因ZmVPS23L表达的方法除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、EMS诱变方式为例的化学诱变或物理诱变；所述应用方法得到的材料包括将表现出增加小斑病抗性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加小斑病抗性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。
上述应用优选的实施方式是：所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物是玉米。
具体的，玉米VPS23类似基因ZmVPS23L及其在植物抗逆中应用的例证。
申请人首次从玉米自交系B73中克隆了VPS23类似基因ZmVPS23L，通过酶切、连接构建到pCAMBIA3301载体上，并转入农杆菌菌株EHA105中。将农杆菌菌株通过遗传转化转入玉米中，验证ZmVPS23L转基因过表达系的功能，包括抑制Rp1-D21介导的超敏防卫反应，提高玉米对盐处理、旱处理和大斑病的抗性。进一步利用CRISPR/CAS9技术，针对ZmVPS23L设计两个靶点gRNA1和gRNA2，获得ZmVPS23L的CRISPR/CAS9基因编辑载体CRISPR-ZmVPS23L；将CRISPR-ZmVPS23L载体遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，获得不含有CAS9但ZmVPS23L基因被成功编辑的突变体株系。对ZmVPS23L编辑株系进行小斑病菌接种鉴定，发现ZmVPS23L编辑株系增强了对小斑病的抗性。
综上，本发明提供了一种玉米VPS23类似基因ZmVPS23L，其cDNA核苷酸序列如SEQID No.1所示，并证明了ZmVPS23L是一个新的调控抗逆的基因；同时还提供了通过提高玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达以提高植物抗大斑病、耐盐性和抗旱性，通过降低玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达以提高植物抗小斑病的应用。本发明为玉米的抗病、耐盐和抗旱育种提供了新基因、新材料和新方法，对玉米的抗逆遗传育种意义重大，应用前景广阔。
附图说明
图1为植物过表达载体ZmVPS23L-pCAMBIA3301。
图2为ZmVPS23L的CDS全长克隆电泳图。
其中：M为Marker，泳道1为基因ZmVPS23L的CDS全长克隆，长度为1053bp。
图3为ZmVPS23L转基因过表达玉米的Western blotting鉴定。M为Marker。
图4为ZmVPS23L转基因过表达对玉米超敏防卫反应的抑制作用。
图5为ZmVPS23L转基因过表达增强对玉米大斑病的抗病性。
其中：A.ZmVPS23L过表达系抗大斑病的表型图。B.ZmVPS23L的过表达系(OE)感染大斑病后的分级鉴定结果(**p<0.01,Student’s t-test)。
图6为ZmVPS23L过表达植株对玉米小斑病更敏感。
其中：A.ZmVPS23L过表达系感染小斑病的表型图。B.ZmVPS23L的过表达系(OE)感染小斑病后的分级鉴定结果(*p<0.05,Student’s t-test)。
图7为ZmVPS23L过表达株系增强对盐处理的耐受性。
其中箭头表示萎蔫的叶片；OE-2、OE-3为ZmVPS23L的过表达系，Neg-2、Neg-3为对照玉米植株。
图8为ZmVPS23L过表达株系增强对旱处理的耐受性。
其中：OE-2、OE-3为ZmVPS23L的过表达系，Neg-2、Neg-3为对照玉米植株。
图9为ZmVPS23L基因编辑阳性株系的鉴定。
其中：A.ZmVPS23L基因结构以及gRNA1和gRNA2位点的位置示意图。B.两个CRISPR/Cas9编辑系的gRNA位点的序列变化以及测序色谱图。
图10为ZmVPS23L基因编辑系对小斑病抗病性增强。
其中图示为ZmVPS23L的基因编辑系(CR)感染小斑病后的分级鉴定结果(*p<0.05,Student’s t-test)。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。
本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中实施例中所涉及的玉米自交系B73来源于山东省农科院玉米研究所、Rp1-D21玉米构建相关信息来源于网址为https://www.maizegdb.org/search_engine/search？term＝rp1-D21
&type＝0&alldata＝true的maizegdb网站。
实施例1、ZmVPS23L的克隆
1.1玉米B73总RNA的提取
(1)将玉米B73的叶片用液氮研磨成粉末后，立即将100-200mg粉末转入2ml离心管中，迅速加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡，室温放置5min；
(2)4℃，12,000rpm，离心5min，取1ml上清液，转移到新的1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，振荡混匀，室温放置5min；
(3)4℃，12,000rpm，离心15min，将0.45ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，加入0.45ml异丙醇，上下翻转混匀，室温放置15min；
(4)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加1ml 75％的乙醇，洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；
(5)弃上清，干燥提取物RNA 2-5min，加入RNase-Free水，溶解RNA。
1.2RNA的反转录
(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：
(2)混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；
(3)向离心管中依次加入下列物质
(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。
1.3ZmVPS23L基因的克隆
ZmVPS23L-F：5’-CGGGATCCATGGCGATGGCAGCAGC-3’
ZmVPS23L-R：5’-TCCCCCCGGGATATTTTGTGACCTTGCTCATCG-3’
(1)使用高保真酶KOD进行扩增,反应体系如下(20μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)基因片段的回收纯化(使用天根胶回收试剂盒)
1)将含有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管，加入3倍体积的溶胶液，50℃溶胶10min，期间不断上下翻转；
2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；
3)室温，12000rpm，离心1min，弃溶液；
4)在柱中加入600μl的漂洗液，室温静置2min，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；
5)在柱中加入600μl的漂洗液，室温静置2min，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；
6)空柱，12000rpm，离心2min；
7)回收柱开盖晾干2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的30μl灭菌水，放置2min；
8)12000rpm离心2min，所得溶液即为回收的基因片段。
1.4克隆基因片段酶切、连接pCAMBIA3301载体
将克隆的基因片端及pCAMBIA3301载体，使用BamHI和XmaI进行双酶切。双酶切后的回收产物通过T4 DNA连接酶连接，连接体系如下：
16℃反应1h，获得连接产物。
1.5大肠杆菌感受态的制备
(1)取DH5α菌种接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；
(2)按1:100接种于50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，至OD600值为0.4-0.6；
(3)将菌液放置在冰上30min；
(4)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入10ml预冷的0.1M的CaCl2悬浮菌体；
(5)将菌液放置在冰上10min；
(6)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1M的CaCl2悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。
1.6大肠杆菌的质粒转化
(1)将1.4获得的连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)42℃，温水浴热激60sec，立即冰浴2-3min；
(3)加入1ml LB培养基，37℃培养1h；
(4)5000rpm，离心2min，收集菌体；
(5)将菌体涂布于含有卡那霉素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。
1.7大肠杆菌PCR验证
反应体系如下(20μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8DNA测序
挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Kan(25mg/L)的液体LB摇过夜，送公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
经过序列分析，上述cDNA序列与玉米B73的核苷酸同源100％，命名为ZmVPS23L，所述基因ZmVPS23L的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
1.9大肠杆菌质粒DNA的提取(使用天根质粒小提试剂盒)
(1)挑取单克隆，接种于5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；
(2)室温，12,000rpm，离心1min，收集菌体；
(3)弃上清，加入250μl低温预冷的溶液I，振荡悬浮菌体；
(4)加250μl溶液II，快迅翻转混匀；
(5)加入350μl溶液III，混匀；
(6)12000rpm，离心10min，吸取上清至带有吸附柱的1.5ml离心管中；
(7)12,000rpm，离心1min，弃废液；
(8)加入600μl溶液PW，12,000rpm，离心1min，弃废液；
(9)加入600μl溶液PW，12,000rpm，离心1min，弃废液；
(10)12000rpm，离心2min。
(11)室温干燥2min后，将吸附柱转移至新的1.5ml离心管，向吸附柱加入50μl灭菌水，放置2min，12,000rpm，离心2min，所得溶液即为提取的质粒DNA溶液。
其中：所述溶液I的配方是25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡糖糖；溶液II的配方是250mM NaOH，1％ SDS；所述溶液III的配方是3M醋酸钾,5M醋酸；所述溶液PW的配方是10mM Tris-HCl(pH 7.5)，80％乙醇。
1.10农杆菌感受态的制备
(1)取农杆菌GV3101或EHA105接种于10ml LB液体培养基中，28℃摇床培养过夜；
(2)按1：50接种于50ml LB液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD600值为0.4-0.6；
(3)4℃，4,000rpm，离心10min，收集菌体；
(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15mol/L的NaCl悬浮菌体；
(5)重复步骤3；
(6)弃上清，加入2ml预冷的20mmol/L的CaCl2悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积15％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。
1.11农杆菌的质粒转化
(1)取7μl提取的质粒DNA溶液加入100μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；
(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴3min；
(3)加入1ml LB培养基，28℃培养2-4h；
(4)室温，5,000rpm，离心2min，收集菌体；
(5)将菌体涂布于含有相应抗生素的LB培养平板上，28℃倒置培养48h。
1.12转化农杆菌的PCR验证
反应体系如下(20μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2、在玉米中对过表达VPS23类似基因ZmVPS23L转基因植株的功能验证2.1构建玉米转基因株系
将包含ZmVPS23L基因及表达载体(ZmVPS23L-pCAMBIA3301)的农杆菌EHA105送生物技术公司，构建玉米的转基因株系。
2.2通过免疫印迹进行转基因植株的筛选
(1)制备SDS-PAGE胶
配制10％的分离胶分离，用超纯水封住使液面平整，待分离胶凝固后将上层水倒掉，用吸水纸吸净液体；配制5％的浓缩胶，立即插上梳子，静置直至浓缩胶凝固。
分离胶和浓缩胶配方如下：
10％分离胶
5％浓缩胶
(2)蛋白样品制备
取少量玉米叶片放于1.5mL离心管中并置于液氮中速冻，用液氮预冷的研磨棒将样品研磨充分，迅速加入150μl蛋白提取缓冲液，冰浴30min。
蛋白提取缓冲液配方如下：
蛋白提取缓冲液
4℃，12000rpm，离心15min。取20μl上清与20μl 2×Laemmlli缓冲液按1:1混匀。
(3)80V，20min；150V，1h跑胶。
(4)转膜
按照黑色夹子-海绵-两层滤纸-胶-NC膜-两层滤纸-海绵-透明夹子的顺序安装转膜装置。
电泳槽置于4℃冰箱内转膜，45V，孵育2.5h，电流160-200mA。
(5)膜转完后，将其放在ddH2O洗10min，然后于封闭液中室温封闭1.5h。
(6)弃掉封闭液，1×PBS洗膜5min，将膜放入一抗，4℃过夜孵育。
(7)用1×PBST洗膜3次，每次10min。
(8)常温下二抗孵育一到两个小时。
(9)用1×PBST洗膜3次，每次10min。
(10)准备ECL试剂盒，显色液A与B按1:1混合加入，避光保存。
吸取适量的显色液加在NC膜上，使NC膜被完全浸润，吸掉膜上多余的显色液，然后将NC膜放在化学发光仪上曝光。
2.3ZmVPS23L转基因过表达植株与Rp1-D21植株的杂交及超敏防卫反应表型的观察
收集Rp1-D21玉米的花粉，分别对ZmVPS23L过表达系T2代纯系植株和对照玉米植株(图中Neg)进行授粉，得到杂交后代。通过观察杂交后代叶面斑点数量，确定ZmVPS23L对超敏防卫反应的抑制作用。结果见图4。
2.4ZmVPS23L转基因过表达植株大斑病的抗病鉴定
将玉米对照植株和ZmVPS23L过表达植株在大田种植，通过观察叶面大斑病的病斑面积，研究其在田间自发感染大斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越小等级越低。
结果发现过表达ZmVPS23L能够增强对玉米大斑病的抗病性，鉴定结果见图5，其中：A为ZmVPS23L过表达系抗大斑病的表型图，B为ZmVPS23L的过表达系(OE)感染大斑病后的分级鉴定结果(**p<0.01,Student’s t-test)。证实：通过提高玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达可以提高植物抗大斑病。
2.5ZmVPS23L转基因过表达植株小斑病的抗病鉴定
将玉米对照植株和ZmVPS23L过表达植株在大田种植，通过观察叶面小斑病的病斑面积，研究其在田间自发感染小斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越大等级越低。
结果发现过表达ZmVPS23L对玉米小斑病更敏感。鉴定结果见图6，其中：A为ZmVPS23L过表达系感染小斑病的表型图，B为ZmVPS23L的过表达系(OE)感染小斑病后的分级鉴定结果(*p<0.05,Student’s t-test)。
2.6ZmVPS23L转基因过表达植株盐处理实验
将玉米对照植株(Neg)和过表达植株(OE)培养至两叶一心，用200mM NaCl溶液培养处理。观察玉米叶片的萎蔫程度。
结果发现ZmVPS23L过表达植株对盐处理的耐受性增强。鉴定结果见图7，其中箭头表示萎蔫的叶片；OE-2、OE-3为ZmVPS23L的过表达系，Neg-2、Neg-3为对照玉米植株。证实：通过提高玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达可以提高植物的耐盐性。
2.7ZmVPS23L转基因过表达植株旱处理实验
将玉米对照植株(Neg)和过表达植株(OE)培养至两叶一心，开始停止浇水进行旱处理。观察玉米叶片的萎蔫程度。
结果发现ZmVPS23L过表达植株对旱处理的耐受性增强。鉴定结果见图8，其中箭头表示萎蔫的叶片；OE-2、OE-3为ZmVPS23L的过表达系，Neg-2、Neg-3为对照玉米植株。证实：通过提高玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达可以提高植物的抗旱性。
实施例3、ZmVPS23L基因编辑载体的构建和编辑株系的功能验证
3.1玉米ZmVPS23L基因编辑载体构建
用HindⅢ对CRISPR/CAS9基础载体进行单酶切。基于CRISPR/CAS9技术原理，根据ZmVPS23L基因组序列，设计了两个靶点gRNA1和gRNA2，gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
以U-S(U6-gRNA-sgRNA cassette)片段为模板设计带载体切口同源臂及重叠PCR重叠部分(20bp gRNA部分)的特异性扩增引物，具体为：GCATGTCCTCGCCGTACTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG(用于构建gRNA1的引物)及GGTACTCCAGGGGAAGCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG(用于构建gRNA2的引物)。
然后以U-S为模板扩增目标片段U6-2启动子和sgRNA scanfold片段，最终通过重叠PCR得到CPB::U6-2::gRNA::sgRNA::CPB重叠片段，将重叠PCR产物测序无误后，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接到CRISPR/CAS9基础载体，获得的含有玉米ZmVPS23L基因的CRISPR/CAS9基因编辑载体命名为CRISPR-ZmVPS23L。
连接后的载体转化E.coli，涂布LB+Kana平板，经Sanger测序得到的阳性克隆寄给转基因公司进行玉米转化。
3.2玉米ZmVPS23L基因编辑植株田间小斑病的抗病鉴定
将玉米编辑株系(CR)和对照材料(WT)于5月初在大田种植，统计其在田间感染小斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越大等级越低。
结果显示ZmVPS23L编辑系比其对应的野生型对田间小斑病更加抗病，鉴定结果见图10。证实：通过降低玉米VPS23类似基因ZmVPS23L表达可以提高植物抗小斑病。
Claims (10)
1.一种玉米VPS23类似基因ZmVPS23L，其特征在于：所述基因的cDNA核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种玉米VPS23类似基因ZmVPS23L编码的氨基酸序列，其特征在于：所述基因ZmVPS23L编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种含权利要求1所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为ZmVPS23L-pCAMBIA3301。
4.一种通过提高权利要求1所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的表达以提高植物抗大斑病、耐盐或抗旱的应用；其中，所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'-、3'-非翻译区的玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达提高同样具有提高植物大斑病抗性、耐盐或抗旱的功能；所述应用方法得到的材料包括将表现出增加抗逆性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加抗逆性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物是玉米；所述抗逆性指抗旱性、耐盐性或对玉米大斑病的抗性。
6.一种含权利要求1所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的CRISPR/CAS9基因编辑载体，其特征在于：所述编辑载体命名为CRISPR-ZmVPS23L，该编辑载体克隆区域ZmVPS23L的两个靶点序列分别命名为gRNA1和gRNA2；其中gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，对应于SEQ ID No.1中第93-112位核苷酸，gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，对应于SEQ IDNo.1中第240-259位核苷酸。
7.应用权利要求6所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的CRISPR/CAS9基因编辑载体获得小斑病抗性玉米突变体株系的方法，其特征在于：依据CRISPR/CAS9技术原理，将编辑载体命名为CRISPR-ZmVPS23L遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，即获得不含有CAS9但ZmVPS23L基因被成功编辑的小斑病抗性玉米突变体株系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述不含有CAS9但ZmVPS23L基因被成功编辑的小斑病抗性玉米突变体株系是命名为type2和type3的两个玉米突变体株系；其中type2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，type3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
9.一种通过降低权利要求1所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的表达以提高植物抗小斑病的应用；其中，所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'-、3'-非翻译区的玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达降低同样具有提高植物小斑病抗性的功能；所述降低基因ZmVPS23L表达的方法除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、EMS诱变方式为例的化学诱变或物理诱变；所述应用方法得到的材料包括将表现出增加小斑病抗性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加小斑病抗性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述玉米VPS23类似基因ZmVPS23L的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物是玉米。
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|---|---|---|---|
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| CN115927394A true CN115927394A (zh) | 2023-04-07 |
| CN115927394B CN115927394B (zh) | 2024-07-02 |
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170042103A1 (en) * | 2014-04-24 | 2017-02-16 | Purdue Research Foundation | Induced mutagenesis |
| CN106432449A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-02-22 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 植物耐旱相关蛋白vps23a及其编码基因与应用 |
| CN113512558A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-10-19 | 浙江大学 | 一种改良番茄对青枯病抗性的方法 |
| CN114752578A (zh) * | 2022-05-20 | 2022-07-15 | 山东大学 | 玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用 |
| CN115491380A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-12-20 | 山东大学 | 植物脂氧合酶基因lox及其在植物广谱抗病性中的应用 |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "Ubiquitin-conjugating enzyme/RWD-like protein [Zea mays] GenBank: AQK40140.1", 《 GENBANK》, 6 February 2017 (2017-02-06) * |
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