CN1353763A - 来源于鸭跖草黄斑驳病毒和木薯叶脉花叶病毒的嵌合表达启动子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合启动子,所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。本发明还涉及这些启动子的制备方法,以及含有它们的表达盒、载体、和转基因植物以及种子。

Description

来源于鸭跖草黄斑驳病毒和木薯叶脉花叶病毒的嵌合表达启动子

〔说明〕

本发明涉及嵌合表达启动子，特别是打算用于植物生物工程领域的。

一般说来，表达启动子是生物工程和遗传操作领域中众所周知的。更具体就植物生物工程而论，编码希望在宿主细胞中产生的多肽的基因的表达率常常取决于所用的启动子。与此相关的问题是常用的各种启动子常常只是因为它们的组织特异性或表达强度而限于特定的应用或组织。例如可能列举的是花椰菜花叶病毒启动子35S，它与例如来源于nos基因的启动子相比是相对较强的启动子，这两种启动子都更特定地用于植物生物工程领域。因此，需要能够克服现今已知的启动子应用中的上述缺点的新的启动子。

在以WO97/48819号公布的PCT申请中已报道了解决该问题的一种尝试，它描述了得自木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)的启动子，整个启动子包含一部分具有与该申请书中提到的参比序列的同源性至少为80％的18个连续核苷酸的核酸序列。

除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中所用的表达方式具有以下含义：

-“核酸”是指DNA或RNA；

-“核酸序列”是指从5’末端朝向3’末端阅读的核苷酸碱基的单链或双链低聚体或多聚体，它包括自我复制型质粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA聚合体以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申请所用的核苷酸符号标示中，除非另有说明，否则单链核苷酸序列的左手末端一定是5’末端；

-“衍生核酸序列”是指从某序列例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成而直接或间接得到的序列；

-“启动子”或“启动子核酸序列”是指翻译起始密码子的核酸上游区，它直接参与识别和结合RNA聚合酶以及转录所需的其他蛋白质；

-“植物启动子”是能够在植物细胞中引发转录的启动子；

-“组成型启动子”是能够在生物体的整个发育过程中在该宿主生物体的所有或基本上所有组织中表达操作性连接的核酸序列的启动子；

-“组织特异性启动子”是能够在宿主生物体的某些特定组织中选择性表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；

-“操作性连接”是指将启动子与编码要产生的多肽的核酸序列或基因连接，使得该启动子真正驱动所述连接核酸序列的转录。应当理解，该启动子序列也包括位于转录起始位点和翻译起始密码子之间的转录序列；

-“表达盒”是指能够指导编码要在与所述序列相容的宿主生物体中产生的多肽的核酸序列或基因的表达的核苷酸序列。这种表达盒至少包括一个启动子和转录终止信号，以及可选的用于表达或表达所需的其他因子；

-“载体”是指表达系统，例如用DNA包被的发射物、基于核酸的转运载体、适于传递核酸的核酸分子、和自我复制型自主环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等等。当重组微生物或细胞培养物描述为表达载体的宿主时，这还可包括环状染色体外DNA(诸如象线粒体或叶绿体DNA)，已整合到宿主的染色体中的DNA，或者作为整合到宿主基因组中的自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定复制、或者保持在宿主的核或胞质中的载体；

-“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括称为“表达质粒”的质粒和称为“非表达质粒”的质粒。当重组微生物或细胞培养物在本申请中描述为“表达质粒”的宿主时，这是指环状染色体外DNA分子和已整合到宿主染色体中的DNA分子。若质粒保持在细胞宿主中，该质粒或者作为自主结构在有丝分裂期间由这些细胞稳定复制，或者整合到宿主基因组中；

“异源序列”或“异源核酸序列”是指来源于对其天然环境来说是外来的来源或种的序列，或者若是来自相同环境，则已对其原始天然形式进行了修饰。可以对核酸序列进行修饰，例如通过用限制酶处理核酸，以产生能够操作连接到启动子的核酸片段。修饰也可以用诸如位点特异性诱变或定点诱变等技术进行；

-“箱”是指赋予调节功能的核酸序列；

-“…样”是指该术语提到的箱和/或核酸序列包含某些与已知参比箱和/或核酸序列相同的序列或共有序列，优选与参比序列至少50％的序列同一性，甚至更优选至少75％的序列同一性，首选至少90％的序列同一性。序列同一性百分数是在至少6个邻接核苷酸碱基的比较窗口的基础上计算出的。可以使用序列对齐算法来确定比较窗口，以确定与参比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性对齐算法和相似检索算法，这些算法也有电子或计算机化形式，名称为GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分数通过比较参比序列与箱和/或核酸序列得到；

-“位于”是指鉴定元件核酸序列上的位置，诸如“箱”、限制酶部位或具有特定功能的密码子。给出的位置用在核酸序列中该元件的起始位置数指示，是以核酸序列的读框方向来说的，也就是说，除非另有说明，否则绝大多数是从5’向3’方向；

-“转基因植物”是指用基因操作技术得到的植物，包括由此得到的完整植物、它们的后代、以及用这些技术得到的生命植物器官，例如根、茎和叶。本发明的转基因植物可以有不同的倍性水平，特别可以是多倍体、二倍体和单倍体；

-“繁殖体”是指由此可能再生完整植物的植物细胞的有结构或无特定结构的集合或装配或联合体，例如外植体、愈合组织、茎、叶、根、插枝、甚至是种子。

本发明的申请人采用了与前面所讨论的PCT专利申请的申请人所用的不同方法。的确，本发明申请人已奇迹般成功地生产了能够满足并实现前述要求的嵌合启动子，尤其是相对现有的常用启动子来说，能够增加编码要在宿主细胞中、更特别是在植物细胞或再生植物中产生的多肽的基因或核酸序列的表达率的嵌合启动子。另外，为了能够选出最适合所面对的任务或应用以及将要进行工作的环境的启动子，申请人还成功地生产了一族完整的启动子，并因此使得有可能在一定程度上控制要表达的编码要产生的多肽的基因的表达率。

所以，本发明的一个目的是包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合表达启动子，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。

优选地，第一植物启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)，而第二植物启动子来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。

更优选地，启动子核酸序列来源于第一启动子和第二启动子的基因间隔区。

在特别优选的实施方案中，嵌合表达启动子包含至少部分SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，该序列与至少部分SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。在更优选的实施方案中，本发明的嵌合启动子选自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06和SEQ.ID.No.07所述的核酸序列。

按照本发明的另一个目的，申请人发现有可能从病毒来源的基础启动子开始生产特别具有活性的嵌合表达启动子，其部分由能够促进植物绿色组织表达(GT)的外源元件组成。优选地，外源GT启动子元件也是病毒来源的。此外，按照本发明此方面的优选实施方案，病毒来源的启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)。优选地，外源启动子元件来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。更优选的是，外源GT元件置换能够促进病毒来源的启动子的维管组织表达(VT)的内源元件。

按照上文中提到的先前确定的本发明目的的优选实施方案，该嵌合启动子还包含至少一个“胚乳样”箱，更优选包含4至10个“胚乳样”箱，首选包含6个“胚乳样”箱。

按照另一个优选实施方案，该启动子还包含至少一个与植物绿色组织GT启动子元件操作性连接的“as1样”箱。

按照又一个优选实施方案，本发明的启动子包含至少一个与植物绿色组织(GT)启动子元件操作性连接的“as1”箱。

在另一个优选实施方案中，该启动子还包含至少一个与植物绿色组织(GT)启动子元件操作性连接的“as2”箱。

优选地，一个或多个“as1样”、“as1”和“as2”箱操作性连接植物绿色组织表达GT启动子元件的上游或下游。

更优选的是，一个或多个“as1样”、“as1”和“as2”箱以正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向操作性连接。

最优选的是，启动子包含至少一个正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向的“as2/as2/as2”箱。

优选前述启动子选自SEQ.ID.No.01、SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的核酸序列。

本发明的另一个目的是包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的表达盒，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区，该启动子核酸序列与编码要产生的多肽的要表达的核酸序列或基因操作连接，后述核酸序列或基因又与转录终止子核酸序列操作性连接。

优选地，按照这一实施方案，所述第一植物启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)，而所述第二植物启动子来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。更优选该表达盒包含至少部分SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，该序列与至少部分SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。更优选的是，该表达盒的嵌合启动子的核酸序列选自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

按照本发明的另一个目的，提供了分离启动子核酸序列，它选自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

本发明还有一个目的涉及用于生产如上所定义的启动子或启动子核酸序列的脱氧核苷酸构件。这些构件可以是：

-“定向”构件，即以和最终启动子序列的读框相同的方向、通常是从5’末端到3’末端阅读的序列；和/或

-“引导”构件，即其末端包含与定向构件的末端重叠的核苷酸碱基的序列。

这样，优选定向构件对应于至少一个选自SEQ.ID.No.8、SEQ.ID.No.9、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.11、SEQ.ID.No.13和SEQ.ID.No.14所述的序列。另外，优选使用与至少一个选自SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列相对应的脱氧核苷酸“引导”构件。

本发明的另一个目的是包含能够引发编码要产生的多肽的核酸序列或基因的转录的启动子或启动子核酸序列的载体，其中所述启动子或启动子核酸序列相当于如上文中所述的嵌合表达启动子或启动子核酸序列。

优选该载体选自下列双元载体：pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172、pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188、pMRT1182、pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。

最后，本发明的另一个目的是制备如上文所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的方法，其中所述方法包括以下步骤：

-进行称作LCR的连接链式反应，以从至少一个选自分别由SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13和SEQ.ID.No.14所述的“定向”脱氧核苷酸构件S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的脱氧核苷酸构件和至少一个选自分别由SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的引导脱氧核苷酸G1、G2、G3和G4的、所述启动子核酸序列或启动子的“引导”脱氧核苷酸构件生产单链连续DNA；

-对从前一步骤得到的单链DNA进行PCR扩增，以生产相当于嵌合表达启动子或启动子核酸序列的双链DNA；

-可选地分离启动子核酸序列的启动子。

有利并优选地，脱氧核苷酸构件在连接前磷酸化。更优选连接在至少一种DNA连接酶的存在下以下列条件下的热循环进行：

-约94℃下约1分钟，1个循环；

-8个相同循环，每个由以下步骤组成：

-65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和37℃下10分钟。

本发明的另一个目的是具有稳定整合到其基因组中的至少一个如上文所定义的启动子或至少一个启动子核酸序列的转基因植物。该转基因植物最好选自双子叶植物，并优选马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、芸苔、低芥子酸菜子、甜菜根或向日葵，或选自单子叶植物，并优选小麦、大麦、燕麦、稻米或玉米。

本发明的又一个目的是如前文所定义的转基因植物的繁殖体，优选该繁殖体是种子。

按照本发明，另一个目的是含有如上文所定义的启动子或启动子核酸序列的细胞，优选该细胞是植物细胞。

按照本发明的另一个目的，提供了通过细胞表达编码要产生的多肽的核酸序列或基因的方法，其中该方法包括以下步骤：

-用包含如前文所定义的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化细胞；

-在使得编码所述多肽的核酸序列或基因能够表达和生产的条件下培养该细胞。优选该细胞是原核细胞或真核细胞，更优选是选自微生物细胞、藻类和微藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物和人类细胞以及植物细胞的细胞，首选是植物细胞。

按照本发明的另一个目的，提供了制备转基因植物或繁殖体的方法，其中该方法包括以下步骤：

-用包含如前文所定义的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；

-选出具有整合启动子或启动子核酸序列的植物细胞；

-通过培养或通过再生整个嵌合或转基因植物来繁殖选出和转化的植物细胞。

附图的简要描述

本发明将通过以下对一个或多个单纯作为非限制性实施例给出的优选实施方案的详细描述并参照附图而得到更好的理解，在附图中：

-图I、II和III图解表示了比较参比构建物的结构，使得本发明的嵌合启动子能够与已知并使用的那些启动子进行比较。图I中，有关的构建含有在完全没有任何这样的启动子序列的情况下编码β-葡糖醛酸糖苷酶的报道基因，并因此用作阴性对照。

-图II图解表示了含有受CaMV双35S启动子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶基因的构建物，用作强参比对照；

-图III表示了用作瞬时表达实验的内部参照的构建物，包括受CaMV 35S启动子控制的编码荧光素酶的报道基因；

-图IV图解表示了按照本发明生产的嵌合启动子的几种优选实施方案的结构。嵌合启动子MPr1116和MPr1117用称为lb-PCR的技术得到。MPr1146和MPr1147通过在限制酶位点DraIII克隆来自CaMV启动子的激活元件as1和as2得到。启动子MPr1154通过存在于MPr1147的5’区域中的来自CoYMV启动子的两个“as-1样”序列的缺失得到。所有这些启动子在限制位点PstI和BamHI克隆到载体pMRT1144中，以得到具有报道基因uidA的转录融合体；

-图V表示了用本发明的不同启动子转化的烟草叶的组织化学染色情况。烟草叶利用biolistic方法使用从BIORAD购得的《PDS1000/He》基因枪在下列条件下进行转化：断裂圆盘以900psi、2μgDNA连续轰击两轮以上，发射体由直径约1μm的金珠或金球组成，植物材料安置在从大载体开始6至9cm处。轰击完后，这些烟草叶在黑暗中在培养室中培养48小时，使得报道基因得以表达。然后这些烟草叶在37℃下在含有2mg/mlX-Glu的0.1M磷酸盐缓冲液中培养24至48小时，之后在70％乙醇浴中漂白。

-图VI表示了烟草叶中不同构建物在瞬时表达后的相对启动子活性的对比图。轰击3天后，将这些烟草叶磨碎，然后通过离心澄清粗提物。用荧光测定法测量粗提物试样的β-葡糖醛酸糖苷酶和荧光素酶活性，然后确定GUS活性/LUC活性的比率。直方图相当于所示构建物的平均比率+/-标准均差；

-图VII图解表示了本发明嵌合启动子的其他优选实施方案，其中：

深色圆盘形符号代表绿色组织表达特异性元件；

小的白色平行六面体符号代表“胚乳样”箱；

小的和大的黑色阴影平行六面体分别代表来自CaMV启动子的“as-2”和“as-1”箱。

-图VIII表示在瞬时表达实验中本发明的不同启动子在玉米胚乳中的相对活性的比较，其中利用荧光测定法测量粗提物试样的β-葡糖醛酸糖苷酶和荧光素酶活性。直方图相当于所示构建物的平均值+/-标准均差；

-图IX表示在稳定的烟草表达中评估的嵌合启动子MPr1116、MPr1146、MPr1167和参比启动子MPr1092的相对活性的比较。样品从在植物转移到温室中后的第2、4、6、8和10周的每种初级转化体采集。测量每种样品的β-葡糖醛酸糖苷酶活性并称量其相对蛋白质总重量的量。对于每一系列转化体，在所示时间，将活性按减小的顺序排序并进行比较。

在各图中，某些术语具有以下含义：

-uidA＝编码β-葡糖醛酸糖苷酶的序列；

-IV2＝patatin基因内含子；

-nos term＝来自胭脂氨酸合酶基因的终止子；

-35S term＝RNA 35S CaMV终止子；

-CaMV＝花椰菜花叶病毒；

-as-1＝来自CaMV 35S启动子的活化序列1；

-as-2＝来自CaMV 35S启动子的活化序列2；

-B＝内切核酸酶限制位点BamHI；

-E＝内切核酸酶限制位点EcoRI；

-H＝内切核酸酶限制位点HindIII；

-P＝内切核酸酶限制位点PstI；

-Sp＝内切核酸酶限制位点SphI；

-D＝内切核酸酶限制位点DraIII；

-N＝内切核酸酶限制位点NdeI；

-S＝内切核酸酶限制位点SpeI；

-CoYMV＝鸭跖草黄斑驳病毒；

-CsVMV＝木薯叶脉花叶病毒；

-TATA＝TATA箱；

-+1＝转录起始位点；

-“…样”如前文所定义，是指与其提到的序列不是100％同源的序列。

实施例

实施例1

比较构建物(对照)

为了能够进行本发明的嵌合启动子和已知且目前常用的那些启动子之间的比较，在一种启动子和得自根癌农杆菌的胭脂氨酸合酶基因(nosterm)的终止子的控制下，将编码β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986年)和含有得自马铃薯patatin基因ST-LS1的内含子IV2序列(Vancanneyt等，1990年)的uidA基因(uidA-IV2)放置到由Promega公司(Madison，USA)商业化的质粒pGEM3Z中。

1.1.阴性对照pMRT1144的构建

为了促进克隆，生产只含有序列“uidA-IV2/nos term”并没有任何启动子序列的得自pGEM3Z的质粒。将这种质粒命名为pMRT1144并用作阴性对照(图I)。为了将uidA/nos term序列插入到pGEM3Z中，在来自豌豆质体蓝素基因的整个启动子和胭脂氨酸合酶终止子的控制下从5μg质粒pGA492-PpetE分离uidA序列。这种质粒已通过将得自质粒pKHn2的来源于豌豆质体蓝素基因的petE启动子(Pwee et Gray，1993)代替来源于质粒bp I221-Pem2的em2启动子(Gaubier等，1993年)克隆到质粒pGA492-Pem2-uidA中得到。质粒bp I221-Pem2在37℃下用各20单位的酶HindIII和EcoRI消化1小时。然后，表达盒“Pem2/uidA/nosterm”通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中并插入质粒pGA492(An，1986)的HindIII和EcoRI位点处，质粒pGA492事先用这两种酶在37℃下消化1小时，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后再悬浮于水中。连接在1.0μl T410X DNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下进行16小时。将先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌转化(Hannahan，1983)。在添加了四环素(12mg/l)的Luria-Bertani培养基(LB，细菌用胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l，琼脂15g/l)上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法(Birnboim et Doly，1983)提取并通过酶消化进行分析。

从所得pGA492-Pem2-uidA质粒开始，通过用HindIII和XbaI双重消化除去启动子Pem2。该质粒片段通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，按照制造商的建议在37℃下接受DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)作用30分钟。然后，其通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水。之后，其在37℃下使用10单位的小牛肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)按照制造商的建议去磷酸化1小时，通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中。所得质粒命名为pGA492ΔPem2。

并列地，对应于豌豆质体蓝素基因的启动子的启动子petE(818bp)通过在37℃下用NcoI消化1小时而从质粒pKHn2得到。828bp启动子片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中，然后按照制造商的建议在30℃下接受5单位的绿豆核酸酶(New England Biolabs)作用30分钟，通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水。如上所述，将这种启动子片段在1.0μl T4 10XDNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小时而插入到质粒pGA492ΔPem2中。将先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌转化(Hannahan，1983)。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGA492-petEprom。

为了分离表达盒“petE prom/uidA/nos term”，5μg质粒pGA492-petEprom用PstI(位于豌豆质体蓝素基因启动子的5′区的位点)和EcoRI(位于终止子序列的3′区的位点)在37℃下消化1小时，接受0.8琼脂糖凝胶电泳并按照供应商的建议在QIAquick亲和柱(Qiagen，Hilden，Germany)上纯化。另外，500ng质粒pGEM3Z同时在37℃下用EcoRI和PstI(存在于多克隆部位或多接头中的限制位点)消化1小时，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，然后在QIAquick亲和柱上纯化。连接用50ng载体pGEM3Z-PstI/EcoRI和50ng表达盒petE prom/uidA/nos term在18℃下以12μl的反应体积在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。先前制备的大肠杆菌DH5α细菌用连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGEM3Z-petE prom。

为了将来自马铃薯patatin基因的192bp IV2内含子插入到编码uidA序列中，将该基因的内部部分(pGEM3Z-petE prom中的710bp的片段SnaBI/BstBI)切除，然后用含有IV2内含子的同等序列(902bp的片段SnaBI/BstBI)取代。为此，质粒pGEM3Z-petE prom在37℃下用SnaBI(位于uidA基因起始ATG密码子下游的+383bp位的限制位点)消化1小时，然后在65℃下用BstBI(位于+1093bp位的位点)消化1小时。缺失了这710bp片段的质粒通过0.8％凝胶琼脂糖电泳分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。对应于IV2内含子序列的902bp的片段BstBI/SnaBI再加上从位置+383延伸至+1093bp的uidA序列从质粒pSCV1.2-GI分离并纯化。按照常规克隆方法，该质粒得自质粒pSCV1.2，它又得自由G.A.Edwards于1990年构建的质粒pSCV1。双元质粒pSCV1.2通过带有表达盒“35S prom/nptll/nos term”的片段HindIII(Fromm等，1986)在pSCV1的HindIII位点的克隆得到。表达盒“35S prom/GUS-IV2/35Sterm”通过如Vancanneyt等(1990)所述在37℃下用HindIII消化质粒p35S GUS INT达1小时而得到。对应于该表达盒的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，然后在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥并再悬浮于水中。该片段的5′突出端通过DNA聚合酶I克列诺片段(New England Biolabs)按照制造商的建议在37℃下作用30分钟而钝化，并且该片段通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟后，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，并最终在1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小时而与在25℃下用SmaI消化了1小时的20ng质粒pSCV1.2连接。转化先前制备的感受态并有活力的大肠杆菌DH5α细菌。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。

5微克(5μg)质粒pSCV1.2-GI在37℃下用SnaBI(位于uidA基因的起始ATG密码子下游的+383bp位的限制位点)消化1小时，然后在65℃下用BstBI(位于+1285bp位的位点)消化1小时。该902bp片段通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。连接用20ng载体pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI和80ng 902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下以10μl的反应体积在1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。先前制备的感受态并有活力的大肠杆菌DH5α细菌用连接反应混合物的一半转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGEM3Z-petE prom/IV2。

为了从质粒pGEM3Z-petE prom/IV2除去对应于818bp片段(petE)的启动子序列，该质粒在37℃下用BamHI消化1小时，然后在37℃下用PstI消化1小时，通过电泳在0.8％凝胶琼脂糖上分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。该质粒的5′突出端按照供应商的建议用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。连接用10ng由此修饰的质粒在18℃下以12μl的反应体积在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。先前制备的感受态并有活力的大肠杆菌DH5α细菌用一半的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，通过酶消化进行分析，并通过按照Sanger等(1977)所述方法测序来检定。所得质粒命名为pMRT1144(图I)。

1.2.阳性对照MPr1092的构建

为了得到参比启动子序列，将来自花椰菜花叶病毒的“双35S”启动子(CaMV D35S prom)置于序列uidA-IV2/nos term的上游。质粒pMRT1092(图I)由以下克隆步骤得到：首先，如1.1部分中所述将来自马铃薯patatin基因的192bp IV2内含子插入到编码序列uidA的+383bp位置。1微克量(1μg)的质粒pBI221(Clontech，CA，USA)在37℃下用SnaBI消化1.5小时，然后在65℃下用BstBI消化1.5小时。缺失了710bp片段的质粒通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

20纳克量(20ng)的载体pBI221 BstBI/SnaBI和80ng如前所述来源于pSCV1.2-GI的902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下以10μl的反应体积在1μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接1夜。先前制备的感受态并有活力的大肠杆菌DH5α细菌用一半的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pBI221/uidA-IV2。

接着，存在于质粒pBI221/uidA-IV2中的单纯35S CaMV启动子序列用“CaMV D35S”序列置换。为此，质粒pBI221/uidA-IV2在37℃下用10单位的HindIII消化10.5小时，然后粘端通过DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)按照制造商的建议在37℃下作用30分钟而钝化。该反应的产物在QIAquick亲和柱上纯化后，DNA在37℃下用10单位的BamHI消化1夜。对应于缺失828bp CaMV 35S启动子片段的载体的质粒片段通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

CaMV D35S启动子从质粒pJIT163Δ得到。该质粒得自pJIT163，它又得自质粒pJIT160(Guerineau et Mullineaux，1993)。质粒pJIT163具有在多接头的位点HindIII和SalI之间的ATG密码子。为了除去该ATG并得到质粒pJIT163Δ，pJIT163的质粒DNA用HindIII和SalI消化，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，按照制造商的建议在37℃下接受DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)作用30分钟，通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取并最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥并最终在1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下连接16小时。转化先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。

10微克(10μg)质粒pJIT163Δ在37℃下用10单位的KpnI(位于启动子5′区中的位点)消化10.5小时，然后粘端用6单位的T4 DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)在37℃下按照制造商的建议作用30分钟而钝化。该反应的产物在QIAquick亲和柱上纯化后，DNA在37℃下用10单位的BamHI消化1夜。对应于D35S启动子的所得761bp DNA片段通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。含有10ng质粒载体、100ng 761bp片段、1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的反应混合物以10ml在18℃下连接1夜。先前制备的有活力且为感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1092(图II)。

1.3.参比质粒pCaMV35Sluc的描述

用作瞬时表达的内部参照的质粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在RNA CaMV 35S启动子和终止子控制下的荧光素酶(luc)报道基因的表达盒(图III)。

实施例2

将来自CsVMV的元件与CoYMV启动子结合的嵌合启动子的构建

CoYMV的基因间隔区的整个启动子对应于从-1026bp位延伸至+12bp位的1038bp序列(关于CoYMV转录物的5′末端，先前已确定为序列EMBL X52938，Medberry等，1992年)。保留该整启动子的243bp片段(Medberry和Olszewski，1993)用于构建本发明的如序列表中SEQ.ID01所述的嵌合启动子。在这个243bp片段上，已推定了几个可能的调节序列(从5′末端朝3′末端方向，其位置用关于转录引发起始点+1的碱基对(bp)指示，如图IV中所示)：

-与存在于CaMV 35S启动子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的长度为16bp的“as-1样”箱，从-226bp位延伸至-210bp位；

-引起在维管组织中的表达的76bp序列(Medberry等，1992)，从-161bp位延伸至-85bp位，在图IV中指示为VT；

-位于-76bp位的对在绿色组织中的表达专一的GTAA元件；

-与引起在谷类植物胚乳中的特定表达的箱具有一定相似性的3个“胚乳样”箱，位于-118bp位、-77bp位和-20bp位；

-在-32bp位的“TATA”箱；

-转录起始点+1(1位)；

-从+1位延伸至+12bp位的5′未翻译区(UTR)。

CsVMV的基因间隔区的启动子对应于从+7162bp位延伸至+7677bp位的515 bp序列(先前已确定为序列EMBLU59751，Verdaguer等，1996年)。在这个由序列表中SEQ.ID02所述的515bp片段上，已推定了几个可能的调节序列(从5′末端朝3′末端方向，其位置用关于转录引发起始点+1的碱基对(bp)指示，如图IV中所示)：

-据报道能引起在绿色组织中的强表达的104bp序列，从-220bp位延伸至-116bp位，在图IV中指示为GT；

-与存在于CaMV 35S启动子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的长度为16bp的“as-1样”箱，从-219bp位延伸至-203bp位；

-对在绿色组织中的表达专一的7个“GTAA”元件，位于-437、-216、-144、-130、-116bp、+16和+63bp位；

-与引起在谷类植物胚乳中的特定表达的箱具有一定相似性的7个“胚乳样”箱，位于-196、-145、-136、-130、-122、+14和+31bp位；

-在-33bp位的“TATA”箱；

-转录引发起始点+1(+1位)；

-从+1位延伸至71bp位的5′未翻译区(UTR)。

2.1.MPr1116的构建

从-221bp位延伸至-116bp位(以转录启发起始点+1为参照)的CsVMV的104bp序列具有4个“胚乳样”箱，4个对在绿色组织中的表达专一的“GTAA”元件，和1个as-1型元件，该序列可引起在维管组织中的表达。CoYMV的76bp区(如序列表中SEQ.ID.No.01所述从-160bp位延伸至-84bp位)可引起在维管组织中的表达。

如图IV中图解说明的，启动子MPr1116通过使用lb-PCR技术将来自CsVMV基因组的基因间隔区的启动子的104bp序列(由序列表中SEQ.ID02所述)与缺失了其76bp区的CoYMV序列融合加以制备。

这种技术结合了从“定向”寡脱氧核苷酸构件开始生产单链连续DNA的称为LCR的连接链式反应(Barany，1991)和用于生产双链DNA的PCR反应。

单链连续DNA从以下“定向”脱氧核苷酸开始形成：

-S1＝5′

CATGCTGCAGACTAGTATCCGCCGTCATCAATGACATCATCACAGTACTGAGGAGATGAATAGCT 3′(SEQ.ID08)

-S2＝5′

AGCCATGACACTCTGTGCGAATATTGAAGACGTAAGCACTGACGACAACAATGAAAAGAA 3′(SEQ.ID09)

-S3＝5′

GAAGATAAGGTCGGTGATTGTGAAAGAGACATAGAGGACACATGTAAGGTGGAAAATGTAAG 3′(SEQ.ID10)

-S4＝5′

GGCGGAAAGTAACCTTATGCATTTGTAACTTGGTTACCCGGTATGCCGGTTCCCAAGCTTTAT 3′(SEQ.ID11)

-S5＝5′

TTCCTTATTTAAGCACTTGTGTAGTAGCTTAGAAAACCAACACAACAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID12)

100微微摩尔脱氧核苷酸S1、S2和S3在5’区中通过在5μl10X激酶缓冲液(Amersham)和500微微摩尔ATP(Sigma)的存在下用15单位的激酶(Amersham)在37℃下作用30分钟而磷酸化。这些磷酸化寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。

为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′GACTCCTCTACTTATCGATCGGTACTGTGAGACA 3′(SEQ.ID15)

-G2＝5′GCTGTTGTTACTTTTCTTCTTCTATTCCAGCCA 3′(SEQ.ID16)

-G3＝5′ATTCCACCTTTTACATTCCCGCCTTTCATTG 3′(SEQ.ID17)

-G4＝5′CAAGGGTTCGAAATAAAGGAATAAATTCGTGA 3′(SEQ.ID18)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化“定向”脱氧核苷酸S1、S2、S3、S4和S5在10pmol的“引导”脱氧核苷酸G1、G2、G3和G4、5μl10X Taq DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接。该连接反应以GeneAmpPCR系统9700热循环(Perkin Elmer，Norwalk，USA)进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列连续步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在QIAquick柱上纯化。

最后，所得单链DNA的PCR扩增以GeneAmp PCR System 9700热循环在各100pmol的寡脱氧核苷酸探针5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTGT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的DNA Vent聚合酶(New England Biolabs)的存在下完成。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、55℃下30秒杂交步骤和72℃下45秒延伸步骤组成的25个循环，然后在72℃下继续延伸5分钟。

来自该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在QIAquick柱上纯化。将它们插入到在37℃下用BamHI消化1小时然后在37℃下用PstI消化1小时的质粒pGEM3Z-petE prom(1.2.部分中所述)中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在QIAquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl10X缓冲液3(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在QIAquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng从PCR反应得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和使用在启动子上选出的脱氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和在uidA序列上选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增进行分析。将所得2个质粒pMRT1116和pMRT1117测序。质粒pMRT1116含有启动子MPr1116(SEQ.ID03)，而质粒pMRT1117具有启动子MPr1117(SEQ.ID04)，它与MPr1116的不同在于在嵌合启动子的5’区中“as-1样”箱及其直接环境的复本，其长度为33bp，以及在-140、-25和-24位缺失了3bp，和在-54bp位胞嘧啶被胸腺嘧啶置换(如图IV所示IV)。

2.2.启动子MPr1146的构建：

启动子MPr1146(图IV)通过将来源于RNA 35S CaMV启动子的对应于as-2元件(Lam et Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)复本的58bp序列插入MPr1116的限制位点NheI和DraIII得到。

为此，质粒pMRT1116在37℃下用25单位的NheI消化1小时，然后在37℃下用4单位的DraIII消化1小时。由此消化的质粒在QIAquick亲和柱上分离，在37℃下在12μl 10X缓冲液3(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后再在QIAquick亲和柱上纯化1次。

含有2个as-2元件和as-1元件的70bp片段SpeI/DraIII从质粒pMRT1111得到。该质粒含有来源于通过加入“G”箱修饰的最小豌豆质体蓝素启动子上游35S RNA CaMV启动子的对应于as-2元件(Lam etChua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)复本的58bp序列，该质粒通过lb-PCR以下列方式得到。单链连续DNA使用以下“定向”脱氧核苷酸产生：

-S1＝5′

TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID08)

-S2＝5′

CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA 3′(SEQ.ID09)

-S5＝5′

CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)

-S7＝5′

CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID14)

100微微摩尔(100pmol)脱氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl 10X激酶缓冲液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15单位的激酶(Amersham)进行5′磷酸化30分钟。这些磷酸化寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)

-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化定向脱氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的“引导”脱氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(NewEngland Biolabs)的存在下连接。该连接反应以GeneAmp PCR系统9700热循环(Perkin Elmer，Norwalk，USA)进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列连续步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在QIAquick亲和柱上纯化。

最后，所得单链连续DNA的PCR扩增以GeneAmp PCR System 9700热循环在各100pmol下列寡脱氧核苷酸探针5′CAIGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后进一步在72℃下延伸5分钟。

该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在QIAquick柱上纯化。将它们插入到在37℃下用BamHI消化1小时然后在37℃下用PstI消化1小时的质粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在QIAquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl10X缓冲液3(New EnglandBiolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在QIAquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。这些克隆之一pMRT1111通过测序检定。

含有2个as-2元件和as-1元件的70bp片段通过25μg质粒pMRT1111在37℃下用40单位SpeI消化1小时、然后在37℃下用4单位DraIII消化1小时得到。该片段通过电泳在Nu-Sieve3％凝胶琼脂糖(FMC，Rockland，USA)上分离，最后在QIAquick亲和柱上纯化。

连接用30ng去磷酸化质粒载体pMRT1116 NheI/DraIII和50ng该70bp片段在18℃下以20μl的反应体积在2.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和800单位的T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)的存在下进行15小时。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和使用在启动子上选出的脱氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和在uidA序列上选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增进行分析。这些克隆之一的启动子序列MPr1146(SEQ.ID05)通过测序检定。

2.3.启动子MPr1147的构建：

启动子MPr1147(图IV)通过将来自RNA 35S CaMV启动子的含有as-2和as-1元件(Lam，1989；Lam等，1989)的44 bp序列插入与MPr1117(SEQ.ID04)的NheI和DraIII位点相邻的限制位点得到。

为此，质粒pMRT1117在37℃下用25单位的NheI消化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。所产生的末端按照供应商的建议通过PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化，然后所得质粒在37℃下用4单位的DraIII消化1小时。由此修饰的质粒在0.8％琼脂糖凝胶上分离，在QIAquick亲和柱上纯化，并在37℃下在12μl 10X缓冲液3(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后再次在QIAquick亲和柱上纯化。

含有CaMV 35S的44bp的as-2和as-1元件的54bp片段PstI/DraIII从质粒pMRT1110得到。含有通过加入“G”箱修饰的最小豌豆质体蓝素启动子上游35S RNA CaMV启动子的对应于as-2元件(Lam et Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)的44bp序列的质粒pMRT1110通过lb-PCR以下列方式得到。单链连续DNA使用下列“引导”脱氧核苷酸形成：

-S1＝5′

TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID08)

-S2＝5′

CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID09)

-S5＝5′

CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)

-S6＝5′

CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID13)

100微微摩尔(100pmol)脱氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl 10X激酶缓冲液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15单位的激酶(Amersham)在5′区中磷酸化30分钟。这些磷酸化寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)

-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化“定向”脱氧核苷酸S1、S2、S5和S6在10pmol的“引导”脱氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10XDNA连接酶缓冲液和40单位Taq DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接。该连接反应以GeneAmp PCR系统9700热循环进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列连续步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在QIAquick柱上纯化。

最后，所得单链DNA的PCR扩增在热循环GeneAmp PCR System9700中在各100pmol寡脱氧核苷酸探针5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl 10X Vent DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后进一步在72℃下延伸5分钟。该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在QIAquick柱上纯化。将它们插入在37℃下用BamHI消化1小时然后在37℃下用PstI消化1小时的质粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在QIAquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl 10X缓冲液3(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在QIAquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。该质粒pMRT1110具有的启动子序列MPr1110通过测序检定。

含有来源于CaMV启动子的as-2和as-1序列的54bp片段通过25μg质粒pMRT1110在37℃下用80单位PstI消化1小时得到，然后所产生的末端按照供应商的建议通过Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化。由此修饰的质粒在37℃下用4单位的DraIII消化1小时，该54bp片段通过电泳在3％Nu-Sieve琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，USA)上分离，并最终在QIAquick亲和柱上纯化。连接用30ng如前所述制备的载体pMRT1117和50ng该54bp片段在18℃下以20μl的反应体积在2.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和800单位的T4DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行15小时。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和使用从启动子选出的脱氧核苷酸5′CATGCTGCAGACTAGTATCC 3′和从uidA序列选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增进行分析。这些克隆之一的启动子序列MPr1147(SEQ.ID06)通过测序检定。

2.4.启动子MPr1154的构建：

启动子MPr1154(图IV)通过从存在于启动子MPr1147(SEQ.ID04)中的CoYMV除去含有复制as-1-样元件的44 bp序列得到。

为此，质粒pMRT1147在37℃下用20单位的SpeI消化1小时，在0.8％凝胶琼脂糖上分离，在QIAquick亲和柱上纯化，并在18℃下以10μl反应体积在1μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下再连接15小时。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和使用从质粒选出的脱氧核苷酸5′ATTTAGGTGACACTATAG 3′和从uidA序列选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增进行分析。这些克隆之一的启动子序列MPr1154(SEQ.ID07)通过测序检定。

2.5.启动子MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165的构建：

启动子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165(图VII)通过将在两侧具有限制位点的对应于35S RNA CaMV启动子的as-2箱(Lam和Chua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的复本的70bp序列的一个或多个拷贝以5′＞3′方向或反过来、即以3′＞5′方向插入到MPr1116(SEQ.ID03)的BstEII位点中得到。

为此，质粒pMRT1116在37℃下用4单位的BstEII消化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。所产生的末端按照供应商的建议通过PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化，然后在37℃下在12μl 10X“缓冲液3”(New England Biolabs)和25单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时。最后，由此得到的质粒再次在QIAquick亲和柱上纯化。

含有2个“as-2”箱和“as-1”箱的70bp SpeI/DraIII片段从质粒pMRT1111得到。

含有来自通过加入“G”箱修饰的最小豌豆质体蓝素启动子上游的35S RNA CaMV启动子的对应于as-2箱(Lam et Chua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的复本的58bp序列的质粒pMRT1111通过lb-PCR以下列方式得到。单链DNA在下列定向寡脱氧核苷酸的帮助下生产：

-S1＝5′

TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG 3′(SEQ.ID08)

-S2＝5′

CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID09)

-S5＝5′

CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID12)

-S7＝5′

CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID14)

100微微摩尔(100pmol)寡脱氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶缓冲液(Amersham)和500 pmol ATP(Sigma)的存在下用15单位的激酶(Amersham)进行5′磷酸化30分钟。这些磷酸化脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。为了连接定向寡脱氧核苷酸，使用以下引导寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID15)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID16)

-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID18)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化定向寡脱氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的引导寡脱氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(NewEngland Biolabs)的存在下连接。该连接反应以“GeneAmp PCR系统9700”热循环(Perkin Elmer，Norwalk，USA)进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列连续步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在QIAquick柱上纯化。

最后，所得单链DNA的PCR扩增以“GeneAmp PCR System 9700”热循环在各100pmol寡脱氧核苷酸探针5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X  DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后进一步在72℃下延伸5分钟。

来自该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在QIAquick柱上纯化。将它们插入到先前在37℃下用BamHI消化1小时然后在37℃下用PstI消化了1小时的质粒pGEM3Z-petE prom中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在QIAquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl 10X“缓冲液3”(New England Biolabs)和25单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在QIAquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如此处理过的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得克隆之一的启动子序列MPr1111通过测序检定。

含有2个“as-2”箱和“as-1”箱的70bp片段通过25mg质粒MPr1111在37℃下用40单位的SpeI消化1小时、然后在37℃下用4单位的DraIII消化1小时而得到。该片段通过电泳在Nu-Sieve 3％琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，USA)上分离，并最终在QIAquick亲和柱上纯化。该片段的末端按照供应商的建议通过Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化，然后在QIAquick亲和柱上再次纯化。

连接用30 ng如前所述制备的pMRT1116载体和50ng 70bp片段在18℃下在20μl反应混合物中在2.0μl 10X T4 DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行15小时。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用三分之一的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和借助位于启动子5’区的通用SP6寡脱氧核苷酸(5′TAAATCCACTGTGATATCTTATG3′)和在uidA序列上选出的寡脱氧核苷酸5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增进行分析。这种克隆策略使得生产的70bp片段能够以5′＞3′方向(序列as-2/as-2/as-1以和它们的天然启动子相同的方向克隆)、以3′＞5′反义方向(与CaMV 35S启动子中存在的相反的方向)和以一个或多个拷贝插入到载体中。下列合成和嵌合启动子可使用这种策略得到：MPr1162(SEQ.ID19)，相当于以正常的5’＞3’方向插入单70bp序列；MPr1163(SEQ.ID20)，相当于以正常的5’＞3’方向插入2个70bp序列；MPr1164(SEQ.ID21)，相当于以相反或反义方向插入单70bp序列；和MPr1165(SEQ.ID22)，相当于以正常的5’＞3’方向插入4个70bp序列。这些克隆中的每一个都通过测序检定。

2.6.启动子MPr1167、MPr1168和MPr1169的构建：

启动子MPr1167、MPr1168和MPr1169(图VII)由MPr1147(SEQ.ID06)产生。它们通过将含有对应于35S RNA CaMV启动子的as-2箱(Lam etChua，1989)和as-1箱(Lam等，1989)的复本的58bp序列的一个或多个正常的5’＞3’方向(即以和CaMV启动子中的序列的天然方向相同的方向克隆)的70bp序列插入到MPr1147的BstEII位点中而得到。

为此，质粒pMRT1147在37℃下用4单位的BstEII消化1小时，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。所产生的末端按照供应商的建议通过PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化，然后在37℃下在12μl 10X“缓冲液3”(New England Biolabs)和25单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs)的存在下去磷酸化1小时。最后，由此得到的质粒再次在QIAquick亲和柱上纯化。

含有2个“as-2”箱和“as-1”箱的70bp SpeI/DraIII片段从质粒pMRT1111得到，其生产如前所述。该片段的末端如上所述加以钝化。

连接用30ng如前所述制备的载体pMRT1147和50ng 70bp片段在18℃下在20μl反应混合物中在2.0μl 10X T4 DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行15小时。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌通过与三分之一的连接反应混合物反应而转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化和使用位于启动子5’区的通用SP6寡脱氧核苷酸(5′TAAATCCACTGTGATATCTTATG3′)和从uidA序列选出的寡脱氧核苷酸5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因扩增进行分析。下列合成启动子可通过前面的方法制备：MPr1167(SEQ.ID23)，相当于以正常的5’＞3’方向插入3个70bp序列；MPr1168(SEQ.ID24)，相当于以正常的5’＞3’方向插入2个70bp序列；和MPr1169(SEQ.ID25)，相当于以正常的5’＞3’方向插入单70bp序列。这些克隆中的每一个都通过测序检定。

2.7.含有启动子MPr1218的双元载体pMRT1218的生产：

用于GUS报道基因在玉米种子胚乳中的表达的参比启动子是编码属于γ-玉米醇溶蛋白族的玉米种子中的28kDa贮藏蛋白的基因的启动子。这种构建物已在以本申请人的名义于1999年9月30日提交的法国专利申请FR9912373中作了描述，该文结合在此，目的是具体说明所述参比启动子和载体。将如Reina等(1990)所述包含在质粒p63中的1.7kbγ-玉米醇溶蛋白全长启动子序列(Prγ-玉米醇溶蛋白)置于命名为pMRT1126的载体中的uidA-IV2/term-nos序列的上游。载体pMRT1126在上述法国专利申请中作了充分描述，其说明书结合在此以便说明该载体。载体pMRT1126中的启动子Mpr1126从HMWG-Dx5(高分子量麦谷蛋白)启动子通过除去位于核苷酸-142上游的序列得到，该序列包含2个“醇溶蛋白样”箱、2个“GATA”箱、1个“G”箱和激活物元件。该启动子片段通过PCR扩增并分离。1.7kbγ-玉米醇溶蛋白启动子通过15μg质粒p63在37℃下用限制酶HindIII和BamHI消化1小时得到。由此释放的1.7kb Prγ-玉米醇溶蛋白片段在0.8％琼脂糖凝胶上使用《Concert Rapid Gel Extraction System》试剂盒分离。

并列地，10μg质粒pMRT1126在37℃下用限制酶HindIII和BamHI消化1小时。该载体片段然后在0.8％琼脂糖凝胶上使用《Concert RapidGel Extraction System》试剂盒分离，并在10X“缓冲液3”的存在下用40单位的小牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)在37℃下去磷酸化1小时。

连接反应用50ngγ-玉米醇溶蛋白启动子片段和100ng质粒pMRT1126、以10μl的反应体积、在塞子T4 10X DNA连接酶和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下、以如上所述的《GeneAmp PCR System 9700》热循环进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用全部连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1218。

3.含有启动子的双元质粒的构建

用3种类型的双元载体来克隆各种表达盒。载体pGA492用于制备含有MPr1116、MPr1146、MPr1147和MPr1092的盒，以便分别制造表达盒或双元载体pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172和pGA492MPr1092。载体pGA492如下所述制备。25μg量的质粒pGA492(An，1986)用80单位的HindIII在37℃下消化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。该质粒的5′突出端按照供应商的建议使用PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此修饰的质粒用80单位的EcoRI在37℃下消化1小时，然后该缺失其291bp片段的载体在0.7％琼脂糖凝胶上分离，并在QIAquick亲和柱上纯化。25μg量的质粒pGA492(An，1986)用80单位的HindIII在37℃下消化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

载体pMRT1118用于在启动子MPr1162、MPr1164、MPr1165、MPr1167和MPr1092的控制下克隆这些表达盒，以分别得到载体pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188和pMRT1182。

质粒pMRT1118在也是以本申请人的名义于1999年9月3日提交的法国专利申请FR9911112中作了充分描述，该申请的具体说明结合在此作用参考。双元质粒pMRT1118(5971pb)通过利用AvrII酶消化将T-DNA片段引入到另一个去磷酸化质粒(该质粒也在同一申请人的前述在先申请中作了充分描述，并命名为pMRT1106，该文也具体结合在此作为参考)的AvrII位点中得到。为了实现插入，pMRT1106质粒DNA(5μg)用AvrII酶消化，借助《QIAquick PCR Purification》试剂盒纯化，然后用50单位的小牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)以120μl终反应混合物体积在12μl 3x 10缓冲液(New England Biolabs)的存在下在37℃下去磷酸化1小时，通过电泳在0.6％琼脂糖凝胶上在TBE缓冲液中分离，用《QIAquick Gel Extraction》试剂盒纯化，在上述条件下用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化1秒钟，最后用《QIAquick PCR Purification》试剂盒纯化并转移到50μl H₂O中。

PCR连接反应用32.5ng经过消化的去磷酸化质粒pMRT1106和50ng的以10μl反应混合物体积在1μl T4 10x DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行了消化的T-DNA片段进行。连接包含各自包括2个步骤的180个循环，第一个是在《GeneAmp PCR System 9700》热循环中在10℃下进行30秒，第二个步骤是在30℃下进行30秒。

转化先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取(Birnboim et Doly，1979)并通过酶消化和测序加以检定。所得质粒命名为pMRT1118。

这种载体然后用下列方式制备：25μg量的质粒在37℃下用80单位的HindIII消化1小时，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。该质粒的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此修饰的质粒用80单位的EcoRI在37℃下消化1小时，然后该载体在0.7％琼脂糖凝胶上分离，并在QIAquick亲和柱上纯化。其然后按照制造商的建议在37℃下用10单位的小牛肠碱性磷酸酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

载体pMRT1195用于在启动子MPr1116、MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165、MPr1167、MPr1168、MPr1169和MPr1092的控制下克隆这些表达盒，以分别得到载体pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。

载体pMRT1195也在以本申请人的名义于1999年9月3日提交的在先法国申请FR9911112中作了描述，该文结合在此作为特定方面的参考，该载体次序包含：oriRK2区加上ori ColEI区，接着是nptIII和nptII区，然后是trfA区，随后接着转化DNA左边缘区，nos终止子区，条棒区(编码膦丝菌素乙酰转移酶-一种引起除草剂抗性的蛋白质)，稻米肌动蛋白内含子-1区，聚腺苷酸化转录终止信号区，多克隆位点区，然后是转化DNA右边缘区。载体pMRT1195用以下方式制备。20μg量的质粒pMRT1195在37℃下用15单位的HpaI消化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。由此断开的载体按照制造商的建议用10单位的小牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)在37℃下去磷酸化1小时，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

3.1.pMRT1152的生产

表达盒MPr1116/uidA-IV2/nos term在双元质粒pGA492的修饰HindIII位点克隆。它从用80单位的PstI在37℃下消化1小时并在QIAquick亲和柱上纯化的质粒pMRT1116得到。该质粒的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此修饰的质粒同时用80单位的EcoRI和40单位的XmnI在37℃下消化1小时，然后对应于表达盒的2.5kb DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在QIAquick亲和柱上纯化。

连接通过将100ng如上所述制备的双元质粒pGA492和50ng表达盒在18℃下以20μl的反应体积在2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下混合在一起过1夜来进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化以及通过使用从该双元质粒的转化DNA选出的脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′和从uidA序列中的表达盒选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′的基因扩增加以分析。所得克隆命名为pMRT1152。

3.2.双元质粒pMRT1171的生产

表达盒MPr1146/uidA-IV2/nos term通过与对质粒pMRT1152所述的相同的方案在双元质粒pGA492的修饰HindIII位点克隆，不同的只是该表达盒从质粒pMRT1146分离。所得克隆命名为pMRT1171。

3.3.双元质粒pMRT1172的生产

表达盒MPr1147/uidA-IV2/nos term通过与对质粒pMRT1152所述的相同的方案在双元质粒pGA492的修饰HindIII位点克隆，不同的只是该表达盒从质粒pMRT1147分离。所得克隆命名为pMRT1172。

3.4.双元质粒pGA492MPr1092的生产

将启动子片段MPr1092和uidA-IV2/nos term序列插入如上所述制备的双元质粒pGA492中。这两个片段以下列方式制备：

-CaMV D35S prom通过10μg质粒pJIT163Δ在37℃下用40单位的KpnI消化1小时而分离。该线型化质粒的末端按照制造商的建议使用6单位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下钝化30分钟。由此修饰的质粒在QIAquick亲和柱上纯化，然后用80单位的HindIII在37℃下再消化1小时。对应于该启动子的743bp片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

-盒“uidA-IV2/nos term”通过4μg质粒pMRT1092用40单位的HindIII和EcoRI消化1小时而得到。对应于序列uidA-IV2/nos term的2.2kb片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在QIAquick亲和柱上纯化。

这三个片段之间的连接通过将100ng双元质粒、50ng启动子片段和50ng对应于“uidA-IV2/nos term”序列的片段以20μl的反应体积、在2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下混合而进行。培养通过使连接混合物经受198个各自由“在30℃下培养30秒和在10℃下培养30秒”组成的循环而以热循环进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化以及使用从双元质粒的转化DNA选出的脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和从uidA序列中的表达盒选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因扩增加以分析。保留的克隆之一命名为pGA492MPr1092。

质粒pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172和pMRT1182按照Holsters等(1978)描述的技术转移到根癌农杆菌菌株LBA4404中。在添加了利福平(50mg/l)和四环素(5mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，通过向细胞再悬浮缓冲液中加入溶菌酶(25mg/ml)进行修饰。所得质粒DNA通过酶消化以及使用从质粒选出的脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和从表达盒选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因扩增进行分析。所得农杆菌克隆用于进行植物遗传转化。

3.5.双元载体pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187和pMRT1188的生产：

表达盒MPr1162/uidA-IV2/nos term、MPr1164/uidA-IV2/nos term、MPr 1165/uidA-IV2/nos term和MPr1167/uidA-IV2/nos term分别从质粒pMRT1162、pMRT1164、pMRT1165和pMRT1167生产，并将它们如前所述克隆到双元质粒pMRT1118中。各10μg量的质粒pMRT1162、pMRT1164、pMRT1165和pMRT1167在37℃下用PstI消化1小时，然后在亲和柱上纯化。这些不同的断开的载体的5’突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此处理过的载体再次在37℃下同时用20单位的EcoRI和10单位的XmnI消化1小时。对于每个消化作用来说，对应于表达盒的DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接以热循环(GeneAmp PCR Systems 9700)通过将100ng如上所述制备的双元质粒pMRT1118和50ng表达盒以12μl反应体积在1.2μl T410X DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3单位的10X DNA连接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而完成。该连接反应由一系列各自由“在10℃下的30秒步骤和在30℃下的30秒步骤”组成的200个相同循环组成。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过用酶BamHl和EcoRI进行的酶消化加以分析。所得克隆命名为pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187和pMRT1188，它们分别含有启动子MPr1162、MPr1164、MPr1165和MPr1167。

3.6.阳性对照双元载体pMRT1182的生产

双元载体pMRT1182通过将PrD35S CaMV启动子片段和uidA-IV2/term-nos序列插入到如上所述制备的双元质粒pMRT1118中得到。

PrD35S CaMV启动子通过10μg质粒pJIT163Δ在37℃下连续用KpnI和HindIII消化1小时而分离。对应于pD35S CaMV的743bp片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

“uidA-IV2/nos term”序列通过4μg质粒pMRT1092用40单位的HindIII和EcoRI消化1小时而得到。对应于“uidA-IV2/nos term”序列的2.2kb片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接在100ng双元质粒、50ng PD35S CaMV片段和50ng对应于uidA-IV2/term-nos序列的片段的存在下以20μl的反应体积、在T4(1X)DNA连接酶缓冲液和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行。培养如前所述以《GeneAmp PCR System 9700》热循环通过PCR循环进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1182。

3.7.双元载体pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252和pMRT1253的生产：

表达盒MPr1116/uidA-IV2/nos term、MPr1154/uidA-IV2/nos term、MPr1162/uidA-IV2/nos term、MPr1163/uidA-IV2/nos term、MPr1164/uidA-IV2/nos term、MPr1165/uidA-IV2/nos term、MPr1167/uidA-IV2/nos term、MPr1168/uidA-IV2/nos term和MPr1169/uidA-IV2/nos term分别从质粒pMRT1116、pMRT1154、pMRT1162、pMRT1163、pMRT1164、pMRT1165、pMRT1167、pMRT1168和pMRT1169生产，并将它们克隆到双元载体pMRT1195的HpaI位点中。各10μg量的质粒pMRT1116、pMRT1154、pMRT1162、pMRT1163、pMRT1164、pMRT1165、pMRT1167、pMRT1168、pMRT1169在37℃下同时用20单位的PstI、20单位的EcoRI和10单位的XmnI消化1小时。对于每个消化作用，与表达盒对应的DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在Qiaquick亲和柱上纯化。这些不同片段的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。连接以热循环(GeneAmp PCR Systems 9700)通过将100ng如上所述制备的双元载体pMRT1195和50ng表达盒以12μl的反应体积在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3单位10X DNA连接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而进行。该连接反应由一系列各自由“在10℃下的30秒步骤和在30℃下的30秒步骤”组成的200个相同循环组成。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过用酶BamHI和EcoRI进行的酶消化加以分析。所得克隆命名为pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252和pMRT1253，它们分别含有启动子MPr1116、MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1165、MPr1167、MPr1168和MPr1169。

3.8.阳性对照双元载体pMRT1254的生产

双元载体pMRT1254在评估植物中的表达期间用作阳性对照。

将表达盒MPr1092/uidA-IV2/nos term克隆到如上所述制备的双元载体pMRT1195的HpaI位点中。它通过10μg质粒pMRT1182用40单位的KpnI在37℃下消化1小时、该消化产物在亲和柱上纯化、然后用40单位的EcoRI消化而得到。对应于表达盒的2.8kb DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在Qiaquick亲和柱上纯化。该片段的5’突出端sortantes按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。连接以热循环(GeneAmp PCR Systems 9700)通过将100ng如前所述制备的双元载体pMRT1195和50ng表达盒以12μl的反应体积在1.2μlT4 10X DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies)、1.2μl 25mM ATP溶液和3单位10X DNA连接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而进行。该连接反应由一系列各自由“在10℃下的30秒步骤和在30℃下的30秒步骤”组成的200个相同循环组成。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过用酶BamHI和EcoRI进行的酶消化加以分析。所得克隆命名为pMRT1254。

3.9.阴性对照双元载体pMRT1255的生产

双元载体pMRT1255在评估植物中的表达期间用作阴性对照。

将丧失了启动子并与“uidA-IV2/nos term”序列对应的表达盒克隆到双元载体pMRT1195的HpaI位点中，以使用这种质粒作为阴性对照。

该序列通过10μg质粒pMRT1163在37℃下用40单位的BamHI消化1小时、在亲和柱上纯化该消化产物、然后用40单位的EcoRI在37℃下消化1小时而得到。与该无启动子的表达盒对应的2.2kb DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在Qiaquick亲和柱上纯化。该片段的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。

连接以热循环(GeneAmp PCR Systems 9700)通过将100ng如上所述制备的双元载体pMRT1195和50ng表达盒以12μl的反应体积在1.2μlT4 10X DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies )、1.2μl 25mM ATP溶液和3单位10X DNA连接酶(Epicentre Technologies)的存在下混合而进行。该连接反应由一系列各自由“在10℃下的30秒步骤和在30℃下的30秒步骤”组成的200个相同循环组成。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过用酶BamHI和EcoRI进行的酶消化加以分析。所得克隆命名为pMRT1255。

4.通过瞬时表达实验测量和对比本发明的不同启动子的表达水平。

4.1.培养物和植物材料的生产。

4.1.1烟草的体外培养物，叶制剂。

瞬时表达实验用6周大的烟草叶(Nicotiana tabacum L.)品种PBD6进行。成熟的烟草cv.PBD6种子在饱和次氯酸钙溶液(70g/l)中灭菌10分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次5分钟。将这些无菌种子置于MS20培养基(Murashige和Skoog，1962)上并在培养室中培养6周(恒温24℃，光周期为16小时光/8小时黑暗，发光强度为200μmol光子.m^-2.sec^-1)。

为了避免叶肉细胞在转化过程中分裂，在用基因枪转化前24小时从6周大的烟草植物PBD6上切下2片主叶，并将其面朝上附着地置于温和的质壁分离BY3培养基上(盐MS4,4g/l，肌醇100mg/l，硫胺1mg/l，KH2PO4 200mg/l，蔗糖30g/l，山梨糖醇45,5g/l，2,4D 1mg/l，pH5.8)。

4.1.2.玉米种子的生产和制剂。

瞬时表达实验用L2玉米种子(品种SN 87 165)的胚乳进行，这些玉米种子是从在24℃、60％相对湿度和16小时光/8小时黑暗的光周期条件下在人工气候室中培养的玉米植物得到的。授粉12天(12DAP)后，将玉米种子取出并在20％Domestos浴中灭菌，同时搅拌5分钟。通过用无菌去离子水连续冲洗除去Domestos后，在无菌条件下仔细地移开果皮和糊粉细胞层。切向割开刚才暴露出的胚乳并将其置于用最小Murashige和Skoog培养基(MS5524，Sigma)浸透的滤纸上。

4.1.3.玉米叶的生产

瞬时表达实验用L2玉米(品种SN 87 165)的叶子进行，这些叶子是从在24℃、60％相对湿度和16小时光/8小时黑暗的光周期的条件下在人工气候室中培养2周后的植物得到的。

发芽12天后，取下最年幼的叶子并在20％Domestos浴中灭菌，同时搅拌5分钟。通过用无菌去离子水连续冲洗除去Domestos后，将这些叶子放置到弱质壁分离培养基N6P60.4M(盐MS 3.98g/l，维生素N6 100mg/l，L-脯氨酸700mg/l，水解酪蛋白(casein hydrosylate)100mg/l，蔗糖20g/l，山梨糖醇36,4g/l，甘露糖醇36,4g/l，2,4D 1mg/l，pH5.8，植物凝胶(phytagel)3g/l)上24小时，面朝上附着，以避免叶细胞在转化过程中分裂。

4.2.用嵌合构建物DNA包被的金颗粒

Biolistic转化需要优先将DNA沉积到直径为0.6μm的球形金珠上，这些金珠已用无水乙醇(99.98％，小于0.02％的水)灭菌10分钟，用无菌去离子水洗涤4次，并最终在-20℃下在50％甘油溶液中储存最多4周。

在这些转化实验中所用的所有对照和测试质粒的浓度都调节至1μg/μl。在每个转化实验中，共同转化内部参比对照(pCaMV35Sluc)，以使不同实验间GUS活性的差异正常化(Leckie等，1994)。

DNA向如上制备的金珠上的包被在无菌室中在层流下进行。1.8mg无菌珠粒在30μl甘油50％中的悬浮液试样在涡旋中充分混合1分钟，然后与含有4μg要测试的质粒之一和2μg参比质粒pCaMV35Sluc的20μlDNA悬浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5M CaCl2并用力混合10秒。接着向该混合物中加入20μl 0.1M亚精胺并将整个混合物在涡旋中再搅拌30秒。这些珠粒通过将该混合物在冰中培养15分钟继续进行DNA包被，然后包被的珠粒以低速率离心5秒并用无水乙醇洗涤两次。

洗涤后，将这些包被的珠粒再悬浮于32μl无水乙醇中，进行超声处理三次，每次持续2秒，在涡旋中用力混合15秒，然后立即在按照供应商的建议制备的Biolistic PDS-1000/He系统(BioRad，Hercule，USA)的无菌“大载体”圆盘上分成4等份试样。“大载体支持物/带有珠粒沉积物的大载体”的整个组件放置干燥5分钟。

4.3烟草叶组织的轰击和瞬时表达

按照供应商(BioRad，Hercule，USA)有关操作法和装置的不同组件的装配的通用建议，使用Biolistic PDS-1000/He基因枪系统进行对烟草叶的轰击。每片叶子在下列发射条件下连续轰击两次：

-用于加速包被金珠所选择的氦压为6200kPa(900psi)。

-将植物样品置于距离珠粒加速区9cm处。

-发射在27mm汞的真空中进行。

轰击完后，将这些叶子置于BY3培养基中并在培养室中在黑暗中在24℃下培养48小时。这种培养使得引入到细胞中的转基因发生瞬时表达。

4.3.1通过组织化学染色评估不同启动子的活性

β-葡糖醛酸糖苷酶表达的揭示如Jefferson等(1987)所述通过组织化学染色进行。在培养室中培养48小时后，将每片叶子沿着中棱纵轴切成两半。半片叶子在用于β-葡糖醛酸糖苷酶(5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)500mg/l，Triton x100 0.05％溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，pH7.0)的染色缓冲液中在37℃下培养48小时，而另半片在液氮中冷冻，然后储存在-80℃下。

染色后，通过将这些叶子分别浸到两份95％乙醇浴中3小时和12小时进行漂白，然后用蒸馏水冲洗并在两张玻璃纸之间平展干燥。这些组织化学染色的结果见图V。不同构建物的启动子活性通过每半片叶子在用总量为2μg的带有GUS报道基因的DNA轰击两次后所显示出的蓝色斑点的数量来评估。

鉴定出两类启动子。用启动子MPr1116和MPr1146轰击的叶子显示出的平均蓝色斑点量比在相同条件下用相同量的参比对照质粒pMRT1092轰击的叶子显示出的蓝色斑点量明显多150(图VIII)。用启动子MPr1117和MPr1147轰击的叶子显示出包含在50和150之间的平均蓝色斑点量(参见图VIII)。

总之，嵌合启动子MPr1116和MPr1146使得能够或促进β-葡糖醛酸糖苷酶的表达到大于或等于使用强组成型参比启动子D35S prom得到的水平。

4.3.2.利用发光酶活性测定量化不同启动子对β-葡糖醛酸糖苷酶的表达

将冷冻的半片叶子在乳钵中磨碎，然后让这些粉末在提取缓冲液(Tris磷酸盐25mM pH7.8，二硫苏糖醇2mM，1，2-二氨基环己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中以1ml缓冲液对200mg组织的比例融解。使该混合物均匀后在冰中培养15分钟，然后通过以16060g离心5分钟使澄清。

使用“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供应商的建议测量20μl澄清的粗制叶提取物的GUS活性。光发射的测量使用Lumat LB-9507发光计(EGG-Berthold，BadWildbad，Germany)进行。

使用“荧光素酶测定系统”检测试剂盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供应商的建议测量20μl粗制叶提取物的荧光素酶活性。光发射的测量使用Lumat LB-9507发光计进行。

结果呈现在图VI中。对于每项实验(1片受过轰击的叶子＝1份粗提物)，计算利用发光计测量的β-葡糖醛酸糖苷酶和荧光素酶活性间的比例。确定所给构建物不同实验的均值和标准平均误差。所得结果显示：

启动子MPr1116和MPr1146(图IV)显示出比双35S CaMV参比启动子(MPr1092，图II)显著增加的表达。启动子MPr1146与启动子MPr1116的不同在于在位于CoYMV启动子的“as-1样”箱和CsVMV启动子的绿色组织特异性元件之间的35S CaMV启动子的“as-1”箱前面插入“as-2”箱的复本。在MPr1146中插入来自35S CaMV启动子的元件显示稍微增加了关于启动子MPr1116(4.5％)的平均表达度。这些元件似乎与这样一种组合的正向协同作用有关。

启动子MPr1116和MPr1117(图IV)的不同仅在于MPr1117中加入了来自CoYMV启动子的“as-1样”箱。由启动子MPr1117带来的平均表达明显低于用MPr1116(22％)得到的。这种结果提示位于嵌合启动子5’区中的来自CoYMV的“as-1样”元件在启动子活性中起阻抑物作用。

启动子MPr1147(图IV)与启动子MPr1117的不同在于在来自CoYMV启动子的“as-1样”元件和来自CsVMV启动子的绿色组织特异性元件之间插入了“as-1”和“as-2”箱。这些箱的加入和与其他元件的相互作用看来导致了关于MPr1117(43％)的平均表达率的显著减小。这些元件的联合似乎有助于负协同作用。这可以用于当在转化细胞中需要相对低的表达水平时的构建物中，例如当为选择或标记目的而提供抗生素或除草剂抗性时。虽然如此，但由启动子MPr1147带来的最弱的表达与由启动子MPr1092得到的仅相差51％。就嵌合启动子而言，这种负作用可以解释为与反式激活元件的竞争或者这些因子对启动子的位阻作用，因此减小了其活性。

最后，嵌合启动子MPr1116和MPr1146似乎引起了烟草叶中GUS报道基因的平均表达，它明显优于用MPr1092得到的。启动子MPr1092在文献中一般报道为是最强的嵌合启动子(比强组成型启动子CaMVp35S大约10倍(Kay等，1987))，常规用于基因转移。MPr1116和MPr1146因此可归类为迄今已知的最强的嵌合启动子。

如上所述所研究的较弱的表达启动子可以作为启动子用于为选择目的而带来抗生素抗性，例如以和“nos”型启动子相同的方式。

图IX说明了补充结果。对于每项实验，计算用发光计测量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和荧光素酶活性之间的比值。确定所给构建物不同实验的均值和标准平均误差。所得结果显示：

-启动子MPr1163和MPr1165(参见图VII)与启动子MPr1116和MPr1146(参见图VII)很象，引起报道基因的平均表达比用参比启动子MPr1092得到的分别稍大8％、5％、6.5％和11.5％。启动子MPr1163和MPr1165与启动子MPr1116的不同在于在来自CsVMV启动子的绿色组织特异性区的下游立即分别插入了2列和4列as-2/as-2/as-1箱。向MPr1116中插入来自CaMV 35S启动子的多数箱没有使关于启动子MPr1116的平均表达度增加。

-启动子MPr1146和MPr1162的平均活性的比较显示：向MPr1116中将来自CaMV启动子的一系列激活元件“as-2/as-2/as-1”克隆到CsVMV启动子的绿色组织特异性区的5’区中(MPr1146就是这样的)比将这些相同元件克隆到该序列的3’区中(MPr1162是这样的)更有利。该数据表明：激活元件彼此的位置与启动子对有效转录的能力显著相关。因此激活元件之间有协同作用。

-启动子MPr1162、MPr1163和MPr1165的平均活性的比较显示：as-2/as-2/as-1箱在CsVMV启动子的绿色组织特异性区下游的立即增殖没有导致这些启动子在瞬时表达中的活性显著成比例增加。该数据倾向表明在这类结合物中装配的所有这些激活元件箱之间没有正向协同作用。不希望受到理论的限制，这可以解释为反式激活元件的竞争或这些反式激活元件对启动子的位阻问题。

-所报道的来自CoYMV的“as-1样”箱的负作用(该负作用已在上文中比较只有一个这种箱的启动子MPr1116和有两个这种箱的启动子MPr1117的活性时提到过)得到证实。这些“as-1样”箱在启动子MPr1154中关于启动子MPr1147的缺失使得启动子的活性显著增加65％。

-启动子MPr1162和MPr1164(图VII)只是CsVMV序列下游来自CaMV的一系列as-2/as-2/as-1箱的方向不同。这两种启动子之间没有观察到显著差异。这些箱的方向因此至少以目前的构型没有显示出对嵌合启动子活性的任何削弱作用。

最后，嵌合启动子MPr1163和MPr1165看来刺激了烟草叶中GUS报道基因的平均表达，程度至少与用启动子MPr1092得到的一样大。嵌合启动子MPr1163和MPr1165与启动子MPr1116和MPr1146很象，因此可归类为迄今所述的最强的嵌合启动子，并因此可作为CaMVD35S(双35S或增强的)启动子的代替物在基因转移程序中常规用于双子叶植物。

4.4.玉米轰击和瞬时表达

对不同玉米组织和其中的幼叶和胚乳的轰击按照供应商(BioRad，Hercule，USA)有关操作法和装置的不同组件的装配的通用建议使用Biolistic PDS-1000/He基因枪系统进行。每份胚乳用直径为0.6μm的钨颗粒连续轰击两次，使用以下发射条件：

-用于加速颗粒的氦压为6200kPa(900psi)，

-植物样品置于距离颗粒加速区6cm处，

-发射在27mm汞的真空中进行。

轰击结束后，将胚乳放置在适当位置并在培养室中在黑暗中在26℃下培养24小时，使得引入到细胞中的转基因能够瞬时表达。

4.5.通过组织化学染色评估不同启动子在玉米胚乳中的活性

β-葡糖醛酸糖苷酶表达的揭示如Jefferson等(1987)所述通过组织化学染色进行。在培养室中培养48小时后，每份胚乳在37℃下在已加入了Triton x100 0.05％的存在于0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0中的500mg/l5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物X-Gluc底物的存在下培养48小时。

染色后，每份胚乳用水冲洗，然后储存在96％乙醇浴中。

不同构建物的启动子活性通过每份胚乳在用总量为2μg的带有GUS报道基因的DNA轰击两次后所显示出的蓝色斑点的数量来评估。

组织化学染色结果的分析显示可鉴定出两类启动子。用启动子MPr1092、MPr1116、MPr1146和MPr1147轰击的胚乳显示出平均相对较少的小直径蓝色斑点，数量范围从1至15。用启动子MPr1154、MPr1162、MPr1163、MPr1164、MPr1167和MPr1169以及参比对照启动子MPr1218轰击的胚乳显示的蓝色斑点数在10至30之间，这些斑点的直径大于用前面所述的启动子得到的那些。

4.6.使用发光酶测定评估玉米胚乳中β-葡糖醛酸糖苷酶的表达

将冷冻的胚乳部分在试管中在以1ml缓冲液对200mg组织比例的提取缓冲液(Tris磷酸盐25 mM pH7.8，二硫苏糖醇2mM，1，2-二氨基环己烷N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中磨碎。使该混合物均匀后在冰中培养15分钟，然后通过以16060g离心5分钟使澄清。使用“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供应商的建议测量20μl澄清的粗提物的GUS活性。光发射的测量使用Lumat LB-9507发光计(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)进行。使用“荧光素酶测定系统”检测试剂盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供应商的建议测量20μl粗提物的荧光素酶活性。发射光的测量使用Lumat LB-9507发光计进行。

结果呈现在图VIII中。对于每份粗提物，计算利用发光计测量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和荧光素酶活性之间的关系。确定所给构建物不同实验的均值和标准平均误差。所得结果显示原始嵌合病毒启动子MPr1116带来的活性比用参比启动子MPr1218得到的活性大3.8倍。这表明含有“胚乳样”箱的嵌合启动子具有GUS报道基因在玉米种子中表达所必需的信号。从启动子MPr1116衍生的嵌合启动子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165具有的活性是用MPr1218得到的活性的4.7至6倍，是用MPr1116得到的1.2至1.6倍。考虑到从MPr1116衍生的所有嵌合启动子都具有包含除了来自CaMV启动子的激活元件之外的相同调节元件或箱的相同基础序列这一事实，所观察到的活性的差异似乎是由于来自CaMV的激活元件导致的。含有来自CoYMV的“as-1样”箱的复本的启动子(启动子MPr1167、MPr1168和MPr1169的情况就是这样)都显示出比只含有单个“as-1样”箱的启动子(启动子MPr1162、MPr1163、MPr1164和MPr1165的情况是这样)显著小的平均活性。这些结果似乎证实了来自CoYMV的这种元件的阻抑物作用，这种作用已在烟草的瞬时表达中观察到。但是，由启动子MPr1116和MPr1154带来的平均活性的比较显示：在MPr1154中“as-1样”箱的缺乏及其被来自CaMV的激活序列“as-2/as-1”的置换并没有导致关于MPr1116的活性的增加。由此看来，似乎是CsVMV的104bp序列的5’区中立即插入的箱的位置不利于活性而不是箱本身。不希望受到理论的束缚，很可能在该位置中的反式激活物的附着诱导了整个“启动子序列/蛋白质”组件中的构象变化，且这不利于其他激活元件和/或转录机构的附着。对结果的分析显示：“as-2/as-2/as-1”箱组合的重复数有可能调节嵌合启动子的活性。例如，在具有单列元件的Mpr1162、具有两列这种元件的Mpr1163、和具有4列这种元件的Mpr1165之间观测到了平均活性的增加，虽然差异并不非常显著。以相同的方式，分别具有1、2和3列箱的MPr1169、MPr1168和MPr1167之间的活性也增加了。最后，这些激活箱或元件的方向看来对活性没有任何削弱作用，因为在启动子MPr1162和MPr1164之间没有观测到显著差异。

总之，按照本发明制造的嵌合启动子在单子叶植物中是功能性和操作性的，并显示出特别是在玉米胚乳中的强活性。启动子MPr1163和MPr1165是在授粉12天后的玉米胚乳中的瞬时表达中显示出最大的GUS基因活性的启动子。这种活性是高水平的，因为它比用引起玉米胚乳中主要的贮存蛋白γ-玉米醇溶蛋白的活性表达的强启动子得到的高大约6倍。这些启动子因此可常规用于单子叶植物的基因转移程序中，作为其他异源启动子的有效代替物。

5.稳定转化后不同启动子在烟草中的表达

5.1.烟草的稳定转化

烟草转化(Nicotiana tabacum L.，品种PBD6)通过按照Horsch等(1985)描述的方法用重组农杆菌感染6周大的从烟草植物分离的叶片来进行。

转化期间，陪替氏培养皿在培养室中在下列条件下培养：温度为24℃，光周期为16小时黑暗/8小时光，发光强度为200μmol光子.m^-2.sec^-1，且除了开始的共培养步骤以外，整个callogenesis、再生和生根步骤都在添加了Augmentin(400mg/l)和卡那霉素(200或100mg/ml)的不同选择培养基上进行；所用的不同步骤和培养基如下：

-共培养步骤持续3天，在用农杆菌感染植物细胞期间，在添加了1mg/l苄氨基嘌呤和0.1mg/l吲哚-3乙酸的固体MS30共培养基(添加了维生素(Gamborg等，1968)4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖30g/l、琼脂8g/l(Merck)，pH5.7的带有MS基质的培养基(Murashige和Skoog，1962))上进行。

-形成两个芽的步骤持续两周，各自在培养室中在添加了1mg/l苄氨基嘌呤、0.1mg/l吲哚-3乙酸、400mg/l Augmentin和200mg/l卡那霉素的固体MS20再生培养基(盐和维生素，MS4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖20g/l、琼脂8g/l(Merck)，pH5.7)上进行。

-发育和生根步骤持续3周，在培养室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固体MS20发育培养基上进行。

-移植到玻璃盆中的步骤在培养室中在添加了400mg/l Augmentin和100mg/l卡那霉素的固体MS20发育培养基上进行。

5.2.再生烟草植物中β-葡糖醛酸糖苷酶的测量和比较

β-葡糖醛酸糖苷酶活性用第一代转基因植物样品测量，该样品取自在温室中适应环境2周后的植物。对于每个植物取3份叶样品，一份来自“老化”叶(位于基底的叶子)，一份来自成熟叶(位于中部的叶子)，一份来自幼叶(位于植物顶端)。每份样品在液氮中在乳钵中磨碎，然后将这些粉末以1ml缓冲液对200mg组织的比例再悬浮于提取缓冲液(Tris磷酸盐25mM pH7.8，二硫苏糖醇2mM，1，2-二氨基环己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使该混合物均匀后在冰中培养15分钟，然后通过以16060g离心5分钟使澄清。使用“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供应商的建议测量20μl澄清的粗制叶提取物的GUS活性。光发射的测量使用Lumat LB-9507发光计(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)进行。

粗提物中存在的蛋白质总量按照Bradford技术(1976)使用“BioRad蛋白质测定”(BioRad，Munchen，Germany)进行测量。

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                     序列表<110>默里斯坦治疗公司(MERISTEM THERAPEUTICS)<120>嵌合表达启动子，含有它们的表达盒、载体、转基因植物和种子，

以及它们的生产方法(CHIMERIC EXPRESSION PROMOTERS，EXPRESSION

CASSETTES，VECTORS，TRANSGENIC PLANTS

AND SEEDS CONTAINING THEM，AND METHODS FOR THEIR

MANUFACTURE.)<130>嵌合启动子CoYMV/CsVMV<140><141><160>25<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>243<212>DNA<213>人工序列<220><223>来自鸭跖草黄斑驳病毒基因间隔区的243bp启动子片段<220><221>启动子<222>(1)..(243)<300><301>Medberry，S.L.Lockhart，B.E.Olszewski，N.E.<302>来自鸭跖草黄斑驳病毒启动子是脉管和生殖组织中的强

启动子<303>Plant Cell<304>4<306>185-192<307>1992<313>(1)..(243)<400> 1atccgccgtc atcaatgaca tcatcacagt actgaggaga tgaatactta gccatgaagt 60agcgtgcgaa tattacctat gcctttattc gcagcgttag tggcactgaa aggcataaag 120tttgttcgtt cttatcaaaa acgaatctta tctttgtaac ttggttaccc ggtatgccgg 180ttcccaagct ttatttcctt atttaagcac ttgtgtagta gcttagaaaa ccaacacaac 240aac                                            243<210>2<211>515<212>DNA<213>人工序列<220><223>来自木薯叶脉花叶病毒基因间隔区的长度为515bp的启动子<220><221>启动子<222>(1)..(515)<300><301>Verdaguer，B.ofKochko，A.Beachy，R.N.Fauquet，C.<302>木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子在转基因烟草

 和稻米植物中的分离和表达<303>Plant Mol.Biol.<304>31<306>1129-1139<307>1996<308>EMBL U59751<400>2ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60gaagtattat gtgagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttg                   515<210>3<211>317<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1116<220><221>启动子<222>(1)..(317)<400>3aagcttgcat gctgcagact agtatccgcc gtcatcaatg acatcatcac agtactgagg 60agatgaatag ctagccatga cactctgtgc gaatattgaa gacgtaagca ctgacgacaa 120caatgaaaag aagaagataa ggtcggtgat tgtgaaagag acatagagga cacatgtaag 180gtggaaaatg taagggcgga aagtaacctt atgcatttgt aacttggtta cccggtatgc 240cggttcccaa gctttatttc cttatttaag cacttgtgta gtagcttaga aaaccaacac 300aacaacctag aggatcc                                  317<210>4<211>348<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1117<220><221>启动子<222>(1)..(348)<400>4aagcttgcat gcctgcagac tagtatccgc cgtcatcaat gacatcatca gactagtatc 60cgccgtcatc aatgacatca tcacagtact gaggagatga atagctagcc atgacactct 120gtgcgaatat tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg 180tgattgtgaa gagacataga ggacacatgt aaggtggaaa atgtaagggc ggaaagtaac 240cttatgcatt tgtaacttgg ttacccggta tgctggttcc caagctttat ttccttattt 300aaacttgtgt agtagcttag aaaaccaaca caacaaccta gaggattcc           348<210>5<211>371<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1146<220><221>启动子<222>(1)..(371)<400> 5aagcttgcat gctgcagact agtatccgcc gtcatcaatg acatcatcac agtactgagg 60agatgaatag ctagtgattg atgtgatatc aagattgatg tgatatctcc actgacgtaa 120gggatgacgc atgccactct gtgcgaatat tgaagacgta agcactgacg acaacaatga 180aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa agagacatag aggacacatg taaggtggaa 240aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatgcat ttgtaacttg gttacccggt atgccggttc 300ccaagcttta tttccttatt taagcacttg tgtagtagct tagaaaacca acacaacaac 360ctagaggatc c                                    371<210>6<211>398<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1147<220><221>启动子<222>(1)..(398)<400>6aagcttgcat gcctgcagac tagtatccgc cgtcatcaat gacatcatca gactagtatc 60cgccgtcatc aatgacatca tcacagtact gaggagatga atagctagcc tgcagactag 120tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc atgccactct gtgcgaatat 180tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 240gagacataga ggacacatgt aaggtggaaa atgtaagggc ggaaagtaac cttatgcatt 300gtaaacttgg ttacccggta tgctggttcc caagctttat ttccttattt aaacttgtgt 360agtagcttag aaaaccaaca caacaaccta gaggatcc                      398<210>7<211>301<212>DNA<213>人工序列<220><23>启动子MPr1154<220><221>启动子<222>(1)..(301)<400>7aagcttgcat gcctgcagac tagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 60cgcatgccac tctgtgcgaa tattgaagac gtaagcactg acgacaacaa tgaaaagaag 120aagataaggt cggtgattgt gaagagacat agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag 180ggcggaaagt aaccttatgc atttgtaact tggttacccg gtatgctggt tcccaagctt 240tatttcctta tttaaacttg tgtagtagct tagaaaacca acacaacaac ctagaggatc 300c                                             301<210>8<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S1<400>8catgctgcag actagtatcc gccgtcatca atgacatcat cacagtactg aggagatgaa 60tagct                                       65<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S2<400>9agccatgaca ctctgtgcga atattgaaga cgtaagcact gacgacaaca atgaaaagaa 60<210>10<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S3<400>10gaagataagg tcggtgattg tgaaagagac atagaggaca catgtaaggt ggaaaatgta 60ag                                       62<210>11<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件S4<200>11ggcggaaagt aaccttatgc atttgtaact tggttacccg gtatgccggt tcccaagctt 60tat                                         63<210>12<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S5<400>12ttccttattt aagcacttgt gtagtagctt agaaaaccaa cacaacaacc tagaggatcc 60ccg                                         63<210>13<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S6<400>13catgctgcag actagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 60act                                         63<210>14<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向脱氧核苷酸构件

S7<400>14catgctgcag actagtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 60agggatgacg catgccact                                79<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导脱氧核苷酸构件

G1<400>15gactcctcta cttatcgatc ggtactgtga gaca                34<10>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导脱氧核苷酸构件

G2<400>16gctgttgtta cttttcttct tctattccag cca            33<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导脱氧核苷酸构件

G3<400>17attccacctt ttacattccc gcctttcatt g            31<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导脱氧核苷酸构件

G4<400>18caagggttcg aaataaagga ataaattcgt ga              32<210>19<211>393<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1162<220><221>启动子<222>(1)..(393)<400>19aagcttgcat gcctgcagca ctagtatccg ccgtcatcaa tgacatcatc acagtactga 60ggagatgaat agctagccat gacactctgt gcgaatattg aagacgtaag cactgacgac 120aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag gacacatgta 180aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatgcattt gtaatttggt tacgactagt 240gattgatgtg atatcaagat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 300acgttacccg gtatgccggt tcccaagctt tatttcctta tttaagcact tgtgtagtag 360cttagaaaac caacacaaca acctagagga tcc 393<210>20<211>462<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1163<220><221>启动子<222>(1)..(462)<400>20aagcttgcat gcctgcagca ctagtatccg ccgtcatcaa tgacatcatc acagactga 60ggagatgaat agctagccat gacactctgt gcgaatattg aagacgtaag cactgacgac 120aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag gacacatgta 180aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatgcattt gtaatttggt tacgactagt 240gattgatgtg atatcaagat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 300acgactagtg attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 360acgcatgcca cgttacccgg tatgccggtt cccaagcttt atttccttat ttaagcactt 420gtgtagtagc ttagaaaacc aacacaacaa cctagaggat 462<210>21<211>392<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1164<220><221>启动子<222>(1)..(392)<400>21aagcttgcat gcctgcagca ctagtatccg ccgtcatcaa tgacatcatc acagtactga 60ggagatgaat agctagccat gacactctgt gcgaatattg aagacgtaag cactgacgac 120aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag gacacatgta 180aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatgcattt gtaatttggt tacgtggcat 240gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatctt gatatcacat caatcactag 300tcgttacccg gtatgccggt tcccaagctt tatttcctta tttaagcact tgtgtagtag 360cttagaaaac caacacaaca actagaggat cc 392<210>22<211>600<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1165<220><221>启动子<222>(1)..(600)<400>22aagcttgcat gcctgcagca ctagtatccg ccgtcatcaa tgacatcatc acagtactga 60ggagatgaat agctagccat gacactctgt gcgaatattg aagacgtaag cactgacgac 120aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag gacacatgta 180aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatgcattt gtaatttggt tacgactagt 240gattgatgtg atatcaagat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 300acgactagtg attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 360acgcatgcca cgactagtga ttgatgtgat atcaagattg atgtgatatc tccactgacg 420taagggatga cgcatgccac gactagtgat tgatgtgata tcaagattga tgtgattatc 480ccactgacgt aagggatgac gcatgccacg ttacccggta tgccggttcc caagctttat 540ttccttattt aagcacttgt gtagtagctt agaaaaccaa cacaacaacc tagaggatcc 600<210>23<211>604<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1167<220><221>启动子<222>(1)..(604)<400> 23aagcttgcat gcctgcagac tagtatccgc cgtcatcaat gacatcatca gactagtatc 60cgccgtcatc aatgacatca tcacagtact gaggagatga atagctagtc tgcagactag 120tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc atgccactct gtgcgaatat 180tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 240gagacataga ggacacatgt aaggtggaaa atgtaagggc ggaaagtaac cttatgcatt 300tgtaacttgg ttacctagtg attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac 360gtaagggatg acgcatgcca cctagtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc 420cactgacgta agggatgacg catgccacct agtgattgat gtgatatcaa gattgatgtg 480atatctccac tgacgtaagg gatgacgcat gccacgttac ccggtatgct ggttcccaag 540ctttatttcc ttatttaaac ttgtgtagta gcttagaaaa ccaacacaac aacctagagg 600atcc 604<210>24<211>541<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1168<220><221>启动子<222>(1)..(541)<400>24aagcttgcat gcctgcagac tagtatccgc cgtcatcaat gacatcatca gactagtatc 60cgccgtcatc aatgacatca tcacagtact gaggagatga atagctagtc tgcagactag 120tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc atgccactct gtgcgaatat 180tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 240gagacataga ggacacatgt aaggtggaaa atgtaagggc ggaaagtaac cttatgcatt 300tgtaacttgg ttacgactag tgattgatgt gatatcaaga ttgatgtgat atctccactg 360acgtaaggga tgacgcatgc cacgactagt gattgatgtg atatcaagat tgatgtgata 420tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc acgttacccg gtatgctggt tcccaagctt 480tatttcctta tttaaacttg tgtagtagct tagaaaacca acacaacaac ctagaggatc 540c 541<210>25<211>478<212>DNA<213>人工序列<220><223>启动子MPr1169<220><221>启动子<222>(1)..(478)<400>25aagcttgcat gcctgcagac tagtatccgc cgtcatcaat gacatcatca gactagtatc 60cgccgtcatc aatgacatca tcacagtact gaggagatga atagctagtc tgcagactag 120tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc atgccactct gtgcgaatat 180tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 240gagacataga ggacacatgt aaggtggaaa atgtaagggc ggaaagtaac cttatgcatt 300tgtaacttgg ttacgactag tgattgatgt gatatcaaga ttgatgtgat atctccactg 360acgtaaggga tgacgcatgc cacgttaccc ggtatgctgg ttcccaagct ttatttcctt 420atttaaactt gtgtagtagc ttagaaaacc aacacaacaa cctagaggat cc 472

Claims (48)

1、包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合表达启动子，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。

2、按照权利要求1的嵌合表达启动子，其中所述第一植物启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)，而所述第二植物启动子来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。

3、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中核酸序列来源于所述第一和第二启动子的基因间隔区。

4、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它包含至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，该序列与至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。

5、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中该嵌合启动子的核酸序列由选自下列成员的序列组成：在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

6、包含病毒来源的启动子的嵌合表达启动子，其部分由能够促进植物绿色组织(GT)中的表达的外源元件组成。

7、按照权利要求6的嵌合表达启动子，其中GT外源启动子元件也是病毒来源的。

8、按照权利要求6的嵌合表达启动子，其中病毒来源的启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)。

9、按照权利要求8的嵌合表达启动子，其中外源启动子元件来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。

10、按照权利要求6的嵌合表达启动子，其中外源GT元件置换病毒来源的内源维管组织表达(VT)启动子。

11、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它还包含至少一个“胚乳样”箱。

12、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它还包含至少一个与植物绿色组织表达GT启动子元件操作性连接的“as1样”箱。

13、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它还包含至少一个与绿色组织表达GT启动子元件操作性连接的“as1”箱。

14、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它还包含至少一个与植物绿色组织表达GT启动子元件操作性连接的“as2”箱。

15、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中一个或多个“as1样”、“as1”和“as2”箱操作性连接植物绿色组织表达GT启动子元件的上游或下游。

16、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中一个或多个“as1样”、“as1”和“as2”箱以正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向操作性连接。

17、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中它包含至少一个正常(5’＞3’)或相反(3’＞5’)方向的“as2/as2/as2”箱。

18、按照权利要求6-17任一项所述的嵌合启动子，其中它包含至少一个选自下列成员的序列：在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

19、包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的表达盒，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区，该序列与编码要产生的多肽的核酸序列或基因操作连接，后述核酸序列或基因自身又与转录终止核酸序列操作性连接。

20、按照权利要求19的表达盒，其中所述第一植物启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)，而所述第二植物启动子来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。

21、按照权利要求19的表达盒，其中它包含至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，该序列与至少部分在序列表中由SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。

22、按照权利要求19的表达盒，其中启动子核酸序列由选自下列成员的序列组成：在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

23、分离启动子核酸序列，其中它包含至少部分各自在序列表中由SEQ.ID.No.01和SEQ.ID.No.02所述的序列的融合体。

24、按照权利要求23的分离启动子核酸序列，其中它对应于下列序列中的任何一个：在序列表中由SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21、SEQ.ID.No.22、SEQ.ID.No.23、SEQ.ID.No.24和SEQ.ID.No.25所述的序列。

25、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.08所述的序列。

26、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.09所述的序列。

27、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.10所述的序列。

28、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.11所述的序列。

29、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.12所述的序列。

30、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.13所述的序列。

31、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.14所述的序列。

32、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的引导脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.15所述的序列。

33、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的引导脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.16所述的序列。

34、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的引导脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.17所述的序列。

35、用于构建权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或分离启动子核酸序列的引导脱氧核苷酸构件，其中它对应于在序列表中由SEQ.ID.No.18所述的序列。

36、包含能够引发编码要产生的多肽的核酸序列或基因的转录的启动子或启动子核酸序列的载体，其中所述启动子或分离启动子核酸序列对应于权利要求1-18或23或24任一项所述的嵌合表达启动子或启动子核酸序列。

37、按照权利要求36的载体，其中它选自下列双元载体：pMRT1152、pMRT1171、pMRT1172、pMRT1185、pMRT1186、pMRT1187、pMRT1188、pMRT1182、pMRT1245、pMRT1246、pMRT1247、pMRT1248、pMRT1249、pMRT1250、pMRT1251、pMRT1252、pMRT1253和pMRT1254。

38、具有稳定整合到其基因组中的至少一个分别如权利要求1-18或23或24任一项所述的启动子或至少一个启动子核酸序列的转基因植物。

39、按照权利要求38的转基因植物，其中它选自双子叶植物，优选马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、芸苔、甜菜根或向日葵，或选自单子叶植物，优选小麦、大麦、燕麦、稻米或玉米。

40、按照权利要求38或39任一项所述的转基因植物的繁殖体。

41、按照权利要求40的转基因植物繁殖体，其中它是种子。

42、含有分别按照权利要求1-18或23或24任一项所述的启动子或启动子核酸序列的细胞，优选是植物细胞、人类细胞、动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类、微观藻类细胞。

43、按照权利要求42的细胞，其中它是植物细胞。

44、通过细胞表达编码要产生的多肽的核酸序列或基因的方法，其中该方法包括以下步骤：

-用包含按照权利要求1-18或23或24任一项所述的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化细胞；

-在使得编码多肽的核酸序列或基因能够表达的条件下培养该细胞。

45、按照权利要求44的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。

46、按照权利要求44或45任一项所述的方法，其中所述细胞是选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、人类细胞、动物细胞、藻类细胞、微观藻类细胞和植物细胞的细胞。

47、按照权利要求44-46任一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。

48、制备按照权利要求38或39任一项所述的转基因植物或按照权利要求40的繁殖体的方法，其中该方法包括以下步骤：

-用包含按照权利要求1-18或23或24任一项所述的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；

-选出具有整合启动子或启动子核酸序列的植物细胞；

-通过培养或通过再生整个嵌合或转基因植物来繁殖选出的转化植物细胞。

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