JP2002528047A - 植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生 - Google Patents
植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生Info
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Abstract
(57)【要約】
植物細胞凝集体及び植物組織を「ホイスカー」と呼ばれる長く伸びた針−様構造により形質転換することができる。方法は、形質転換されるべき植物の植物細胞凝集体及び植物組織をＤＮＡ及びホイスカーの存在下で撹拌することを含み、それによりＤＮＡ吸収及びその組込みが助長される。該方法を、他の方法によって容易に形質転換され得ることが証明されていない他の植物細胞凝集体及び植物組織に適用することができる。
Description
【０００１】 本発明は、植物細胞凝集体及び選ばれた植物組織の形質転換のために長く伸び
た針−様微小繊維又は「ホイスカー」を用いる方法に関する。
た針−様微小繊維又は「ホイスカー」を用いる方法に関する。
【０００２】 近年まで、遺伝子操作された植物はほとんど古典的育種法の適用により作られ
るもののみに限られていた。育種による新しい植物変種の創造は、ゲノム中の遺
伝子を同定し、交雑し、安定に定着させ、かくして所望の形質を創造するために
必要な経費と時間の故に、主に最も農業経営的に重要な作物、例えばトウモロコ
シのために保存された。それと比較して遺伝子工学の出現は、多様な異種遺伝子
及びその結果としての形質をトウモロコシ、綿、大豆、小麦、イネ、ヒマワリ及
びカノーラ（ｃａｎｏｌａ）を含む多様な作物中にもっと迅速な方法で導入する
結果となった。しかしながら、選択生殖細胞質中に新しい形質転換遺伝子を組込
む（ｉｎｔｅｒｇｒｅｓｓｉｏｎ）ことは、商業的に生き残れる選択系統を生産
するために必要な組織培養及び戻し交雑のために、まだ非常に労力のいる仕事で
ある。
るもののみに限られていた。育種による新しい植物変種の創造は、ゲノム中の遺
伝子を同定し、交雑し、安定に定着させ、かくして所望の形質を創造するために
必要な経費と時間の故に、主に最も農業経営的に重要な作物、例えばトウモロコ
シのために保存された。それと比較して遺伝子工学の出現は、多様な異種遺伝子
及びその結果としての形質をトウモロコシ、綿、大豆、小麦、イネ、ヒマワリ及
びカノーラ（ｃａｎｏｌａ）を含む多様な作物中にもっと迅速な方法で導入する
結果となった。しかしながら、選択生殖細胞質中に新しい形質転換遺伝子を組込
む（ｉｎｔｅｒｇｒｅｓｓｉｏｎ）ことは、商業的に生き残れる選択系統を生産
するために必要な組織培養及び戻し交雑のために、まだ非常に労力のいる仕事で
ある。
【０００３】 植物細胞における問題の異種遺伝子を含有する異種組換えベクターの導入、植
物再生、安定な組込み及び発現を可能にする数種の方法が存在する。１つのその
ような方法は遺伝物質がコーティングされた微粒子を直接植物細胞中に加速する
ことを含む（Ｃｏｒｎｅｌｌへの米国特許第４，９４５，０５０号；ＤｏｗＥｌ
ａｎｃｏへの米国特許第５，１４１，１３１号；及びＤｅｋａｌｂへの米国特許
第５，５３８，８７７及び５，５３８，８８０号）。この方法は通常「微粒子衝
撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」又は「バイオリ
スチックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）」と呼ばれる。アグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法を用いて植物を形質転換することもできる（Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｌｅｄｏへの米国特許第５，１７７，０１０号、Ｔ
ｅｘａｓ Ａ＆Ｍへの米国特許第５，１０４，３１０号、ヨーロッパ特許出願０
１３１６２４Ｂ１、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔへのヨーロッパ特許出願１２０５１
６、１５９４１８Ｂ１及び１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔへの米国特
許第５，１４９，６４５、５，４６９，９７６、５，４６４，７６３及び４，９
４０，８３８及び４，６９３，９７６号、すべてＭａｘ Ｐｌａｎｃｋへのヨー
ロッパ特許出願１１６７１８、２９０７９９、３２０５００、Ｊａｐａｎ Ｔｏ
ｂａｃｃｏへのヨーロッパ特許出願６０４６６２、６２７７５２及び米国特許第
５，５９１，６１６号、すべてＣｉｂａ−Ｇｅｉｇｙへのヨーロッパ特許出願０
２６７１５９及び０２９２４３５ならびに米国特許第５，２３１，０１９号、両
方ともＣａｌｇｅｎｅへの米国特許第５，４６３，１７４及び４，７６２，７８
５号ならびに両方ともＡｇｒａｃｅｔｕｓへの米国特許第５，００４，８６３及
び５，１５９，１３５号）。他の形質転換法は、細胞懸濁液培養の形質転換のた
めに長く伸びた針−様微小繊維もしくは「ホイスカー」を用いることを含む（両
方ともＺｅｎｅｃａへの米国特許第５，３０２，５２３及び５，４６４，７６５
号）。さらに、エレクトロポレーション法が植物細胞の形質転換に用いられ、そ
れから稔性植物が得られた（Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅへのＷＯ ８７／０６６１４；両方ともＤｅｋａｌｂへの５，４７２，８６９
及び５，３８４，２５３；Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｍｅｓへの５
，６７９，５５８、５，６４１，６６４、ＷＯ９２０９６９６及びＷＯ９３２１
３３５）。
物再生、安定な組込み及び発現を可能にする数種の方法が存在する。１つのその
ような方法は遺伝物質がコーティングされた微粒子を直接植物細胞中に加速する
ことを含む（Ｃｏｒｎｅｌｌへの米国特許第４，９４５，０５０号；ＤｏｗＥｌ
ａｎｃｏへの米国特許第５，１４１，１３１号；及びＤｅｋａｌｂへの米国特許
第５，５３８，８７７及び５，５３８，８８０号）。この方法は通常「微粒子衝
撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」又は「バイオリ
スチックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）」と呼ばれる。アグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法を用いて植物を形質転換することもできる（Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｌｅｄｏへの米国特許第５，１７７，０１０号、Ｔ
ｅｘａｓ Ａ＆Ｍへの米国特許第５，１０４，３１０号、ヨーロッパ特許出願０
１３１６２４Ｂ１、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔへのヨーロッパ特許出願１２０５１
６、１５９４１８Ｂ１及び１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔへの米国特
許第５，１４９，６４５、５，４６９，９７６、５，４６４，７６３及び４，９
４０，８３８及び４，６９３，９７６号、すべてＭａｘ Ｐｌａｎｃｋへのヨー
ロッパ特許出願１１６７１８、２９０７９９、３２０５００、Ｊａｐａｎ Ｔｏ
ｂａｃｃｏへのヨーロッパ特許出願６０４６６２、６２７７５２及び米国特許第
５，５９１，６１６号、すべてＣｉｂａ−Ｇｅｉｇｙへのヨーロッパ特許出願０
２６７１５９及び０２９２４３５ならびに米国特許第５，２３１，０１９号、両
方ともＣａｌｇｅｎｅへの米国特許第５，４６３，１７４及び４，７６２，７８
５号ならびに両方ともＡｇｒａｃｅｔｕｓへの米国特許第５，００４，８６３及
び５，１５９，１３５号）。他の形質転換法は、細胞懸濁液培養の形質転換のた
めに長く伸びた針−様微小繊維もしくは「ホイスカー」を用いることを含む（両
方ともＺｅｎｅｃａへの米国特許第５，３０２，５２３及び５，４６４，７６５
号）。さらに、エレクトロポレーション法が植物細胞の形質転換に用いられ、そ
れから稔性植物が得られた（Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅへのＷＯ ８７／０６６１４；両方ともＤｅｋａｌｂへの５，４７２，８６９
及び５，３８４，２５３；Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｍｅｓへの５
，６７９，５５８、５，６４１，６６４、ＷＯ９２０９６９６及びＷＯ９３２１
３３５）。
【０００４】 技術的業績のすべてにかかわらず、商業的に生き残れる選択生殖細胞質におけ
る遺伝子形質転換及び形質転換植物の日常的生産はまだ労力のいる仕事である。
例えば微粒子衝撃は個々の細胞、細胞凝集体又は植物組織において用いられ得る
が、ＤＮＡ−付着金粒子の調製及び高価でまだ広くは利用できない「ガン」装置
の最適化を必要とする。アグロバクテリウムを含む方法は非常に限られ、それは
すべての植物種又は与えられた種内の変種が該バクテリアにより感染し易いわけ
ではないからである。エレクトロポレーション法は、種々の植物種及びその組織
から原形質体を日常的に作る場合に典型的に出会う非常な困難さ及び経費ならび
に付随する低い生存率及びそれに伴う低い形質転換率のために好ましくない。
る遺伝子形質転換及び形質転換植物の日常的生産はまだ労力のいる仕事である。
例えば微粒子衝撃は個々の細胞、細胞凝集体又は植物組織において用いられ得る
が、ＤＮＡ−付着金粒子の調製及び高価でまだ広くは利用できない「ガン」装置
の最適化を必要とする。アグロバクテリウムを含む方法は非常に限られ、それは
すべての植物種又は与えられた種内の変種が該バクテリアにより感染し易いわけ
ではないからである。エレクトロポレーション法は、種々の植物種及びその組織
から原形質体を日常的に作る場合に典型的に出会う非常な困難さ及び経費ならび
に付随する低い生存率及びそれに伴う低い形質転換率のために好ましくない。
【０００５】 本明細書に開示する通り、出願人は、非−選択及び選択生殖細胞質からの植物
細胞凝集体及び植物組織を、ホイスカーを用い、選ばれた遺伝子を含有する組換
えベクターを用いて直接且つ安価に形質転換できる方法を発明した。出願人の発
明は、それが簡単、迅速且つ使用が容易であるという点で現在用いられている方
法より有利である。さらに出願人の発明は、それがＩＩＩ型カルス培養を確立す
る必要又は細胞懸濁液培養を確立して保持する必要を排除しており、Ｉ型もしく
はＩＩ型カルスのいずれかで用いることができ、かくして生殖細胞質にあまり制
限されないことで、当該技術分野において記載されている発明より優れている。
これは本明細書に記載する通り、出願人の発明を選択遺伝子型の形質転換に直接
用いることができ、かくして一般に遺伝子組込みに伴う問題及び時間が排除され
ることを意味する。
細胞凝集体及び植物組織を、ホイスカーを用い、選ばれた遺伝子を含有する組換
えベクターを用いて直接且つ安価に形質転換できる方法を発明した。出願人の発
明は、それが簡単、迅速且つ使用が容易であるという点で現在用いられている方
法より有利である。さらに出願人の発明は、それがＩＩＩ型カルス培養を確立す
る必要又は細胞懸濁液培養を確立して保持する必要を排除しており、Ｉ型もしく
はＩＩ型カルスのいずれかで用いることができ、かくして生殖細胞質にあまり制
限されないことで、当該技術分野において記載されている発明より優れている。
これは本明細書に記載する通り、出願人の発明を選択遺伝子型の形質転換に直接
用いることができ、かくして一般に遺伝子組込みに伴う問題及び時間が排除され
ることを意味する。
【０００６】 本発明は、好ましくはゼア・メイズ植物の染色体中に組込まれ、その子孫に遺
伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換ゼア・メイズ植物の生産に関する。
伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換ゼア・メイズ植物の生産に関する。
【０００７】 本発明の１つの側面は、該異種ＤＮＡを含有する形質転換植物から誘導される
ゼア・メイズ植物、植物の一部、植物細胞、植物細胞凝集体及び種子に関する。
ゼア・メイズ植物、植物の一部、植物細胞、植物細胞凝集体及び種子に関する。
【０００８】 本発明は好ましくはオリザ・サチバ Ｌ．植物の染色体中に組込まれ、その子
孫に遺伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換オリザ・サチバ Ｌ．植物の
生産にも関する。
孫に遺伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換オリザ・サチバ Ｌ．植物の
生産にも関する。
【０００９】 本発明の他の側面は、該異種ＤＮＡを含有する形質転換植物から誘導されるオ
リザ・サチバ Ｌ．植物、植物の一部、植物細胞、植物細胞凝集体及び種子に関
する。
リザ・サチバ Ｌ．植物、植物の一部、植物細胞、植物細胞凝集体及び種子に関
する。
【００１０】 本発明は好ましくはゴシピウム・ヒルスツム Ｌ．植物の染色体中に組込まれ
、その子孫に遺伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換ゴシピウム・ヒルス
ツム Ｌ．植物の生産にも関する。
、その子孫に遺伝可能な異種ＤＮＡを含有する稔性形質転換ゴシピウム・ヒルス
ツム Ｌ．植物の生産にも関する。
【００１１】 本発明の他の側面は、該異種ＤＮＡを含有する形質転換植物から誘導されるゴ
シピウム・ヒメスツム Ｌ．植物、植物の一部、植物繊維、植物細胞、植物細胞
凝集体及び種子に関する。
シピウム・ヒメスツム Ｌ．植物、植物の一部、植物繊維、植物細胞、植物細胞
凝集体及び種子に関する。
【００１２】 本発明はさらにホイスカー−媒介形質転換によりＩ型カルス、ＩＩ型カルス、
胚軸−由来カルス又は子葉−由来カルスから稔性形質転換植物を生産するための
方法に関する。
胚軸−由来カルス又は子葉−由来カルスから稔性形質転換植物を生産するための
方法に関する。
【００１３】 本発明はさらにもっと、ホイスカー−媒介形質転換により分裂組織から稔性形
質転換植物を生産するための方法に関する。
質転換植物を生産するための方法に関する。
【００１４】 本発明の他の側面は、Ｉ型又はＩＩ型カルスから再生した稔性成熟トウロモコ
シ植物及びそれから生産される形質転換種子に関する。
シ植物及びそれから生産される形質転換種子に関する。
【００１５】 本発明の他の側面は、Ｉ型カルスから再生した稔性成熟イネ植物及びそれから
生産される形質転換種子に関する。
生産される形質転換種子に関する。
【００１６】 さらに、本発明の他の側面は胚軸−由来カルス又は子葉−由来カルスから再生
した稔性成熟綿植物及びそれから生産される形質転換種子及び繊維に関する。
した稔性成熟綿植物及びそれから生産される形質転換種子及び繊維に関する。
【００１７】 好ましい実施態様において本発明は、植物細胞凝集体及び植物組織に行われる
ホイスカー−媒介細胞穿孔及び異種ＤＮＡ吸収ならびにそれに続く形質転換植物
系の選択及び生産のための制御された管理を用いて、本明細書に記載する稔性形
質転換植物を生産する。
ホイスカー−媒介細胞穿孔及び異種ＤＮＡ吸収ならびにそれに続く形質転換植物
系の選択及び生産のための制御された管理を用いて、本明細書に記載する稔性形
質転換植物を生産する。
【００１８】 本発明の他の側面、実施態様、利点及び特徴は以下の明細書から明らかになる
であろう。
であろう。
【００１９】 本発明は、例えばゼア・メイズ、オリザ・サチバ Ｌ．、ゴシピウム・ヒルス
ツム Ｌ．及びブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種の植物
細胞凝集体及び植物組織をホイスカー−媒介形質転換を介して問題のＤＮＡ構築
物で形質転換することにより、該種の稔性形質転換植物及び種子を生産するため
の方法に関する。形質転換の後、該形質転換植物細胞凝集体及び植物組織から形
質転換植物を再生させ、該再生した植物は問題のキメラＤＮＡ構築物を発現する
。記載する方法により本明細書で生産される形質転換植物は：フィールドコーン
（ｆｉｅｌｄ ｃｏｒｎ）、ポップコーン、スイートコーン、フリントコーン（
ｆｌｉｎｔ ｃｏｒｎ）、デントコーン（ｄｅｎｔ ｃｏｒｎ）などを含むがこ
れらに限られないすべての種のトウモロコシ；すべての種の綿；ならびにすべて
の種のイネを含む。
ツム Ｌ．及びブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種の植物
細胞凝集体及び植物組織をホイスカー−媒介形質転換を介して問題のＤＮＡ構築
物で形質転換することにより、該種の稔性形質転換植物及び種子を生産するため
の方法に関する。形質転換の後、該形質転換植物細胞凝集体及び植物組織から形
質転換植物を再生させ、該再生した植物は問題のキメラＤＮＡ構築物を発現する
。記載する方法により本明細書で生産される形質転換植物は：フィールドコーン
（ｆｉｅｌｄ ｃｏｒｎ）、ポップコーン、スイートコーン、フリントコーン（
ｆｌｉｎｔ ｃｏｒｎ）、デントコーン（ｄｅｎｔ ｃｏｒｎ）などを含むがこ
れらに限られないすべての種のトウモロコシ；すべての種の綿；ならびにすべて
の種のイネを含む。
【００２０】 以下の句及び用語を下記に定義する： 「アンチセンス」により、標的ＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡあるいはその一部に
相補的な配列を含み、その一次転写物及び／又はｍＲＮＡのプロセシング、輸送
及び／又は翻訳を妨げることにより、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物
を意味する。標的ＲＮＡのいずれの部分との相補性も存在することができ、すな
わち５’非−コード配列、３’非−コード配列、イントロン又はコード配列との
相補性が存在し得る。アンチセンスＲＮＡは典型的にはセンスＲＮＡの相補体（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（鏡像）である。
相補的な配列を含み、その一次転写物及び／又はｍＲＮＡのプロセシング、輸送
及び／又は翻訳を妨げることにより、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物
を意味する。標的ＲＮＡのいずれの部分との相補性も存在することができ、すな
わち５’非−コード配列、３’非−コード配列、イントロン又はコード配列との
相補性が存在し得る。アンチセンスＲＮＡは典型的にはセンスＲＮＡの相補体（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（鏡像）である。
【００２１】 「ｃＤＮＡ」により、ｍＲＮＡに相補的であり、それから誘導されるＤＮＡを
意味する。
意味する。
【００２２】 「キメラＤＮＡ構築物」により、１種もしくはそれより多い種からの遺伝子も
しくはその一部をセンスもしくはアンチセンス配向で含有する組換えＤＮＡを意
味する。
しくはその一部をセンスもしくはアンチセンス配向で含有する組換えＤＮＡを意
味する。
【００２３】 「構成的プロモーター」により、すべての細胞型において、そして常に連続的
遺伝子発現を方向付けるプロモーター要素を意味する（すなわちアクチン、ユビ
キチン、ＣａＭＶ ３５Ｓ、３５Ｔなど）。
遺伝子発現を方向付けるプロモーター要素を意味する（すなわちアクチン、ユビ
キチン、ＣａＭＶ ３５Ｓ、３５Ｔなど）。
【００２４】 「コサプレッション」により、内在性遺伝子への実質的相同性を有し、植物細
胞において異種遺伝子及び／又は内在性遺伝子産物の活性の低下を引き起こす異
種遺伝子の導入を意味する。コサプレッションは該植物細胞中に遺伝子のプロモ
ーター配列、５’及び／又は３’末端、イントロンあるいはコード領域を導入す
ることにより行われ得ることがある。
胞において異種遺伝子及び／又は内在性遺伝子産物の活性の低下を引き起こす異
種遺伝子の導入を意味する。コサプレッションは該植物細胞中に遺伝子のプロモ
ーター配列、５’及び／又は３’末端、イントロンあるいはコード領域を導入す
ることにより行われ得ることがある。
【００２５】 「発育特異的」プロモーターにより、初期及び後期胚形成などにおけるように
特定の植物発育段階における遺伝子発現を担うプロモーター要素を意味する。
特定の植物発育段階における遺伝子発現を担うプロモーター要素を意味する。
【００２６】 「エンハンサー」により、トウモロコシ ストリークウィルス（ＭＳＶ）、ア
ルファルファ モザイクウィルス（ＡＭＶ）、アルコールデヒドロゲナーゼ イ
ントロン １などからのもののような、プロモーター活性を刺激することができ
るヌクレオチド配列要素を意味する。
ルファルファ モザイクウィルス（ＡＭＶ）、アルコールデヒドロゲナーゼ イ
ントロン １などからのもののような、プロモーター活性を刺激することができ
るヌクレオチド配列要素を意味する。
【００２７】 本明細書で用いられる「発現」により、植物細胞内部における酵素的核酸分子
、ｍＲＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡの転写を意味する。遺伝子の発現は遺
伝子の転写も含み、ｍＲＮＡの前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を含むこ
とができるか、又は含まなくとも良い。
、ｍＲＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡの転写を意味する。遺伝子の発現は遺
伝子の転写も含み、ｍＲＮＡの前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を含むこ
とができるか、又は含まなくとも良い。
【００２８】 「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」又は「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子
」により、宿主細胞中に通常は存在せず、ホイスカー−媒介形質転換により導入
されるＤＮＡ配列を有する遺伝子を意味する。
」により、宿主細胞中に通常は存在せず、ホイスカー−媒介形質転換により導入
されるＤＮＡ配列を有する遺伝子を意味する。
【００２９】 「遺伝子」により、キメラＤＮＡ構築物、遺伝子、植物遺伝子及びその一部を
含むタンパク質発現に含まれるすべての遺伝物質を包含することを意味する。
含むタンパク質発現に含まれるすべての遺伝物質を包含することを意味する。
【００３０】 「ゲノム」により、生物及び／又はウィルスの各細胞に含有される遺伝物質を
意味する。
意味する。
【００３１】 「誘導プロモーター」により、特定の信号、例えば：物理的刺激（熱ショック
遺伝子）；光（ＲＵＢＰ カルボキシラーゼ）；ホルモン（Ｅｍ）；代謝産物、
ストレスなどに応答する遺伝子の発現を担うプロモーター要素を意味する。
遺伝子）；光（ＲＵＢＰ カルボキシラーゼ）；ホルモン（Ｅｍ）；代謝産物、
ストレスなどに応答する遺伝子の発現を担うプロモーター要素を意味する。
【００３２】 「改変植物（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｌａｎｔ）」により、ｍＲＮＡ量、タンパ
ク質量又は特定のタンパク質の酵素特異的活性が非改変植物において見られるも
のに対して改変されている植物を意味する。改変はアンチセンス、コサプレッシ
ョン又は過剰−発現のような方法により行われ得る。
ク質量又は特定のタンパク質の酵素特異的活性が非改変植物において見られるも
のに対して改変されている植物を意味する。改変はアンチセンス、コサプレッシ
ョン又は過剰−発現のような方法により行われ得る。
【００３３】 「植物細胞凝集体」、「植物細胞系」及び「カルス細胞系」により、新規の（
ｄｅ ｎｏｖｏ）形態形成を行っている未分化及び分化細胞の組合わせから成り
、１片の植物材料（外植片）を無菌条件下で成長−支持培地（ｇｒｏｗｔｈ−ｓ
ｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）上に置くことにより形成される増殖組織塊
を意味する。「植物細胞凝集体」、「植物細胞系」及び「カルス細胞系」という
用語は、単子葉植物におけるＩ型及びＩＩ型カルス培養ならびに双子葉植物にお
ける胚軸−及び子葉由来培養を含むことを意味する。本明細書で定義する用語は
、植物細胞懸濁液培養又はＩＩＩ型カルス培養を含むことを意図していない。
ｄｅ ｎｏｖｏ）形態形成を行っている未分化及び分化細胞の組合わせから成り
、１片の植物材料（外植片）を無菌条件下で成長−支持培地（ｇｒｏｗｔｈ−ｓ
ｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）上に置くことにより形成される増殖組織塊
を意味する。「植物細胞凝集体」、「植物細胞系」及び「カルス細胞系」という
用語は、単子葉植物におけるＩ型及びＩＩ型カルス培養ならびに双子葉植物にお
ける胚軸−及び子葉由来培養を含むことを意味する。本明細書で定義する用語は
、植物細胞懸濁液培養又はＩＩＩ型カルス培養を含むことを意図していない。
【００３４】 「植物組織」により、分裂組織、胚、花粉、子葉、胚細胞などを含むがこれら
に限られない組織された組織（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｒｅｓ）を意味
する。
に限られない組織された組織（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｒｅｓ）を意味
する。
【００３５】 「プロモーター調節要素」により、ある核酸フラグメント又は遺伝子の発現を
調節するその核酸フラグメント又は遺伝子内のヌクレオチド配列要素を意味する
。プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼ及び有効な転写に必要な他の転写因子
に関する認識を与える。センス及びアンチセンス遺伝子構築物の発現のために、
多様な源からのプロモーター調節要素を植物細胞中で有効に用いることができる
。プロモーター調節要素は、構成的プロモーター、組織−特異的プロモーター、
発育−特異的プロモーター、誘導プロモーターなどを含むことも意味する。プロ
モーター調節要素は、転写もしくは翻訳効率を向上させるある種のエンハンサー
配列要素も含むことができる。
調節するその核酸フラグメント又は遺伝子内のヌクレオチド配列要素を意味する
。プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼ及び有効な転写に必要な他の転写因子
に関する認識を与える。センス及びアンチセンス遺伝子構築物の発現のために、
多様な源からのプロモーター調節要素を植物細胞中で有効に用いることができる
。プロモーター調節要素は、構成的プロモーター、組織−特異的プロモーター、
発育−特異的プロモーター、誘導プロモーターなどを含むことも意味する。プロ
モーター調節要素は、転写もしくは翻訳効率を向上させるある種のエンハンサー
配列要素も含むことができる。
【００３６】 「組織−特異的」プロモーターにより、特定の細胞もしくは組織の型、例えば
葉又は種子における遺伝子発現を担うプロモーター要素を意味する（すなわちゼ
イン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）。
葉又は種子における遺伝子発現を担うプロモーター要素を意味する（すなわちゼ
イン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）。
【００３７】 「形質転換（された）」により、ホイスカーによってカルス、組織、植物の一
部もしくは植物中に導入され、続いて有性もしくは無性細胞交雑又は細胞分裂に
より後の世代に転移された異種ＤＮＡ又はキメラ遺伝子構築物を含有するいずれ
のＩ型もしくはＩＩ型カルス、胚軸−もしくは子葉由来カルス、組織、植物の一
部又は植物も含むことを意味する。
部もしくは植物中に導入され、続いて有性もしくは無性細胞交雑又は細胞分裂に
より後の世代に転移された異種ＤＮＡ又はキメラ遺伝子構築物を含有するいずれ
のＩ型もしくはＩＩ型カルス、胚軸−もしくは子葉由来カルス、組織、植物の一
部又は植物も含むことを意味する。
【００３８】 「ホイスカー」により、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ａｒｔｈｕｒ
＆ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｒｏｓｅ，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６）に記載されているような多数の
物質から製造され得る長く伸びた針−様の物体を意味する。本発明はホイスカー
が作られる材料に制限されることを意味しておらず、針−様の形の構造を限定す
ることを意味しており、ここで該ホイスカーは細胞の形質転換においてそれが用
いられるべき細胞より小さい。細胞中へのＤＮＡ侵入が助長されるような方法で
ホイスカーが形作られるべきことは、本発明の範囲内である。該発明の範囲が針
−様の形を有するいずれの材料も含むことも意図されており、該針−様の形の材
料は細胞壁を有するか、もしくは有していない植物細胞を穿孔し、かくしてＤＮ
Ａ吸収及び植物細胞形質転換を助長することができる。本発明の範囲が、細胞中
に最初に挿入された針に固有のオリフィスにＤＮＡを通過させることにより、Ｄ
ＮＡ分子を細胞中に挿入するような微小注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
法を含まないことも意図されている。好ましくはホイスカーは金属もしくはセラ
ミックの針−様物体であり、最も好ましいものは炭化ケイ素又は窒化ケイ素から
作られ、寸法が３０ｘ０．５μｍ〜１０ｘ０．３μｍである。
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ａｒｔｈｕｒ
＆ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｒｏｓｅ，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６）に記載されているような多数の
物質から製造され得る長く伸びた針−様の物体を意味する。本発明はホイスカー
が作られる材料に制限されることを意味しておらず、針−様の形の構造を限定す
ることを意味しており、ここで該ホイスカーは細胞の形質転換においてそれが用
いられるべき細胞より小さい。細胞中へのＤＮＡ侵入が助長されるような方法で
ホイスカーが形作られるべきことは、本発明の範囲内である。該発明の範囲が針
−様の形を有するいずれの材料も含むことも意図されており、該針−様の形の材
料は細胞壁を有するか、もしくは有していない植物細胞を穿孔し、かくしてＤＮ
Ａ吸収及び植物細胞形質転換を助長することができる。本発明の範囲が、細胞中
に最初に挿入された針に固有のオリフィスにＤＮＡを通過させることにより、Ｄ
ＮＡ分子を細胞中に挿入するような微小注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
法を含まないことも意図されている。好ましくはホイスカーは金属もしくはセラ
ミックの針−様物体であり、最も好ましいものは炭化ケイ素又は窒化ケイ素から
作られ、寸法が３０ｘ０．５μｍ〜１０ｘ０．３μｍである。
【００３９】 「ホイスカー−媒介形質転換」により、ホイスカーによる植物細胞凝集体及び
／又は植物組織中へのＤＮＡ挿入の助長ならびに過渡的又は安定な方法における
該ＤＮＡの発現を意味する。
／又は植物組織中へのＤＮＡ挿入の助長ならびに過渡的又は安定な方法における
該ＤＮＡの発現を意味する。
【００４０】 植物細胞系の生産においては、問題の組織を無菌状態で単離し、固体イニシェ
ーション（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）培地上に置き、それにより組織された植物細
胞組織において起こる細胞の分化及び特殊化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）
に伴うプロセスを中断させ、かくして該組織を分化しないようにする。典型的に
イニシェーション培地は寒天などの添加により固化され、それはカルスが液体培
地中では容易にイニシェーションされ得ないからである。培地は典型的にはスク
ロース、ビタミン、ミネラル（ｍｉｎｅｒａｌｓ）、アミノ酸及びいくつかの場
合には合成ホルモンが補足されたＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，Ｐｒｏｃ
．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｐｒ
ｅｓｓ，ｐ４３−５６）のＮ６塩に基づく。しかしながらカルス組織はＭｕｒａ
ｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．
１５：４７３−４９７）のＭＳ塩から誘導される培地上で増殖することもできる
。培養は一般に約２８℃における暗い無菌の環境中に保たれる。
ーション（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）培地上に置き、それにより組織された植物細
胞組織において起こる細胞の分化及び特殊化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）
に伴うプロセスを中断させ、かくして該組織を分化しないようにする。典型的に
イニシェーション培地は寒天などの添加により固化され、それはカルスが液体培
地中では容易にイニシェーションされ得ないからである。培地は典型的にはスク
ロース、ビタミン、ミネラル（ｍｉｎｅｒａｌｓ）、アミノ酸及びいくつかの場
合には合成ホルモンが補足されたＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，Ｐｒｏｃ
．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｐｒ
ｅｓｓ，ｐ４３−５６）のＮ６塩に基づく。しかしながらカルス組織はＭｕｒａ
ｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．
１５：４７３−４９７）のＭＳ塩から誘導される培地上で増殖することもできる
。培養は一般に約２８℃における暗い無菌の環境中に保たれる。
【００４１】 典型的には、植物細胞系を好ましくは幼葉基底領域（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｌｅ
ａｆ ｂａｓａｌ ｒｉｇｉｏｎｓ）、未成熟のふさ毛（ｉｍｍａｔｕｒｅ ｔ
ａｓｓｅｌｓ）、胚軸組織及び子葉節（ｃｏｔｙｌｅｎｄｏｎａｒｙ ｎｏｄｅ
ｓ）に存在する組織から誘導する。トウモロコシ及びイネの場合、分裂組織を与
える植物細胞系を用いることができ、接合子型胚組織からのものが最も好ましい
。該植物細胞系の生産のために最も好ましい組織は、受粉から１０〜１４日後の
発育中のトウモロコシの穂及び非−発芽イネ種子から単離される。綿植物細胞系
の生産のためには実生からの胚軸及び子葉−誘導組織が最も好ましい。
ａｆ ｂａｓａｌ ｒｉｇｉｏｎｓ）、未成熟のふさ毛（ｉｍｍａｔｕｒｅ ｔ
ａｓｓｅｌｓ）、胚軸組織及び子葉節（ｃｏｔｙｌｅｎｄｏｎａｒｙ ｎｏｄｅ
ｓ）に存在する組織から誘導する。トウモロコシ及びイネの場合、分裂組織を与
える植物細胞系を用いることができ、接合子型胚組織からのものが最も好ましい
。該植物細胞系の生産のために最も好ましい組織は、受粉から１０〜１４日後の
発育中のトウモロコシの穂及び非−発芽イネ種子から単離される。綿植物細胞系
の生産のためには実生からの胚軸及び子葉−誘導組織が最も好ましい。
【００４２】 該組織を固体培地上に置いた後、数日から数週間で新しい分裂組織がトウモロ
コシ及びイネの場合には小盾板領域（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ）から
、又は綿の場合には胚軸もしくは子葉組織から生ずる。これらの新しい分裂組織
は、それが由来する組織の構造的な秩序の特性のない未分化柔細胞凝集体を与え
る。植物細胞凝集体は認識可能な全体的構造がなく、無損傷の組織された植物組
織に存在する多くの種類の特殊化された細胞型を限られた数だけ含有する。該凝
集体はその再生能力、生殖の様式及び組織の形態に依存して非−胚形成性と胚形
成性に分類された（Ｆｒａｎｚ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
）。
コシ及びイネの場合には小盾板領域（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ）から
、又は綿の場合には胚軸もしくは子葉組織から生ずる。これらの新しい分裂組織
は、それが由来する組織の構造的な秩序の特性のない未分化柔細胞凝集体を与え
る。植物細胞凝集体は認識可能な全体的構造がなく、無損傷の組織された植物組
織に存在する多くの種類の特殊化された細胞型を限られた数だけ含有する。該凝
集体はその再生能力、生殖の様式及び組織の形態に依存して非−胚形成性と胚形
成性に分類された（Ｆｒａｎｚ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
）。
【００４３】 トウモロコシ及びイネの場合、非−胚形成性カルス（ｃａｌｌｉ）は植物再生
が不可能な長く伸びた液胞化細胞から成る柔らかい顆粒状の半透明組織を含む。
別の場合、体細胞胚形成及び植物再生の可能な胚形成性単子葉カルスが３つの独
特の形態型：Ｉ型；ＩＩ型；及びＩＩＩ型で存在する。
が不可能な長く伸びた液胞化細胞から成る柔らかい顆粒状の半透明組織を含む。
別の場合、体細胞胚形成及び植物再生の可能な胚形成性単子葉カルスが３つの独
特の形態型：Ｉ型；ＩＩ型；及びＩＩＩ型で存在する。
【００４４】 Ｉ型カルスは、苗条及び／又は小盾板−様構造を示す複雑な組織の混合物とし
て増殖する密集した節状の成長の遅い胚形成性カルスから成る（Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｉｎ，Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｍｅｎｔ，ｐｐ ３４５−３８７）。該カルスは高度の細胞分化、十分に発達
した脈管構造を特徴とし、密集胚形成性カルス（ｃｏｍｐａｃｔ ｅｍｂｒｙｏ
ｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ）と呼ばれた（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓへの米国特許第５，６４１，６６４号）。本質的にすべての単子葉植物
はＩ型カルスを生産することができる組織を有している。Ｉ型カルスにおける植
物再生は通常、分裂組織の延長による器官形成を介して（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９７５，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，１５：４１７−４２１）、
及び／又は十分に限定された根−苗条軸からの体細胞胚形成を介して（Ｖａｓｉ
ｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．７１：１５８−１６１）
起こる。Ｉ型カルスにおける再生苗条の起源は常に明らかなわけではなく、表皮
下分裂組織形成を介して起こると思われる（Ｆｒａｎｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌ，
１９９１，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．６９：２６−３３）。
て増殖する密集した節状の成長の遅い胚形成性カルスから成る（Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｉｎ，Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｍｅｎｔ，ｐｐ ３４５−３８７）。該カルスは高度の細胞分化、十分に発達
した脈管構造を特徴とし、密集胚形成性カルス（ｃｏｍｐａｃｔ ｅｍｂｒｙｏ
ｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ）と呼ばれた（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓへの米国特許第５，６４１，６６４号）。本質的にすべての単子葉植物
はＩ型カルスを生産することができる組織を有している。Ｉ型カルスにおける植
物再生は通常、分裂組織の延長による器官形成を介して（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９７５，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，１５：４１７−４２１）、
及び／又は十分に限定された根−苗条軸からの体細胞胚形成を介して（Ｖａｓｉ
ｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．７１：１５８−１６１）
起こる。Ｉ型カルスにおける再生苗条の起源は常に明らかなわけではなく、表皮
下分裂組織形成を介して起こると思われる（Ｆｒａｎｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌ，
１９９１，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．６９：２６−３３）。
【００４５】 Ｉ型のように普通にはないＩＩ型カルスは柔らかくて脆い胚形成性細胞から成
り、ある種の単子葉遺伝子型からのみ形成され得る（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ
ａｌ，１９８８，Ｉｎ，Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
，ｐｐ ３４５−３８７）。それは迅速に成長し、ほとんどか又は全く脈管要素
を含有せず、脆い胚形成性カルスと記述され得る（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓへの米国特許第５，６４１，６６４号）。ＩＩ型カルスの顕
著な特徴は、その表面上の胚柄−様構造に付着した多数の球状体細胞胚をそれが
含有し、それを介して明確に同定可能な段階で植物再生が進行すると思われるこ
とである（Ｆｒａｎｚ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
り、ある種の単子葉遺伝子型からのみ形成され得る（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ
ａｌ，１９８８，Ｉｎ，Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
，ｐｐ ３４５−３８７）。それは迅速に成長し、ほとんどか又は全く脈管要素
を含有せず、脆い胚形成性カルスと記述され得る（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓへの米国特許第５，６４１，６６４号）。ＩＩ型カルスの顕
著な特徴は、その表面上の胚柄−様構造に付着した多数の球状体細胞胚をそれが
含有し、それを介して明確に同定可能な段階で植物再生が進行すると思われるこ
とである（Ｆｒａｎｚ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
【００４６】 ＩＩＩ型カルスは最も近年に記述されたのみである。該カルスは非常にまれに
しか形成されず、液体中に容易に分散され、その表面上に明確な体細胞胚を有し
ていない。それは「脆い、非−粘着性」のカルスとも記述され（Ｓｈｉｌｌｉｔ
ｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８１−５
８７）、主に体細胞胚形成を介して再生可能な未分化組織から成る。ＩＩＩ型カ
ルスは形質転換及び再生のために理想的な組織と考えられ、それはその細胞が容
易に解離し、分散し、かくして容易に懸濁液培養を形成するからである。この型
のカルスは最も希少であり、ＩＩ型カルスと異なっており、ＩＩ型培養の継代培
養の各継代においてそれに関して視覚的に選択し、選択的に濃縮することによっ
てのみ生産することができる（ＷＯ９４／２８１４８；Ｚｅｎｅｃａ）。
しか形成されず、液体中に容易に分散され、その表面上に明確な体細胞胚を有し
ていない。それは「脆い、非−粘着性」のカルスとも記述され（Ｓｈｉｌｌｉｔ
ｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８１−５
８７）、主に体細胞胚形成を介して再生可能な未分化組織から成る。ＩＩＩ型カ
ルスは形質転換及び再生のために理想的な組織と考えられ、それはその細胞が容
易に解離し、分散し、かくして容易に懸濁液培養を形成するからである。この型
のカルスは最も希少であり、ＩＩ型カルスと異なっており、ＩＩ型培養の継代培
養の各継代においてそれに関して視覚的に選択し、選択的に濃縮することによっ
てのみ生産することができる（ＷＯ９４／２８１４８；Ｚｅｎｅｃａ）。
【００４７】 綿の場合、他の双子葉植物の場合と同様に、カルス型は典型的にＩ、ＩＩもし
くはＩＩＩ型と定義されない。さらに、綿からの胚軸−及び子葉−由来カルス培
養が形態及び再生能力に依存して非−胚形成性及び胚形成性に分類された（Ｓｈ
ｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３
：１７８−１８１）。非−胚形成性カルスは細胞のゆるくて脆い塊から成り、そ
れは強い細胞質染色反応を示さず、容易に植物を再生するために用いることがで
きない。しかしながら、胚形成性カルスは、体細胞胚形成を介する植物再生の可
能な固く密集した密度の高い細胞質の細胞の塊として現れる。それから生ずる体
細胞胚は最初に球状構造として現れ、それが徐々に長く伸び、次いで子葉発育を
示し始める。
くはＩＩＩ型と定義されない。さらに、綿からの胚軸−及び子葉−由来カルス培
養が形態及び再生能力に依存して非−胚形成性及び胚形成性に分類された（Ｓｈ
ｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３
：１７８−１８１）。非−胚形成性カルスは細胞のゆるくて脆い塊から成り、そ
れは強い細胞質染色反応を示さず、容易に植物を再生するために用いることがで
きない。しかしながら、胚形成性カルスは、体細胞胚形成を介する植物再生の可
能な固く密集した密度の高い細胞質の細胞の塊として現れる。それから生ずる体
細胞胚は最初に球状構造として現れ、それが徐々に長く伸び、次いで子葉発育を
示し始める。
【００４８】 本明細書に開示するカルス型の中で、単子葉植物に由来するＩ型及びＩＩ型カ
ルス培養が植物の生産及び再生において好ましい。ホイスカー−媒介形質転換を
介して作られる形質遺伝トウモロコシ植物はＩ型又はＩＩ型培養から最も好適に
作られるが；形質転換イネ植物の生産及び再生においてはＩ型カルス培養が最も
好ましい。さらに、子葉節誘導及び胚軸−誘導培養は形質転換綿植物の生産にお
いて好ましく、子葉組織から作られる培養は最も好ましい。
ルス培養が植物の生産及び再生において好ましい。ホイスカー−媒介形質転換を
介して作られる形質遺伝トウモロコシ植物はＩ型又はＩＩ型培養から最も好適に
作られるが；形質転換イネ植物の生産及び再生においてはＩ型カルス培養が最も
好ましい。さらに、子葉節誘導及び胚軸−誘導培養は形質転換綿植物の生産にお
いて好ましく、子葉組織から作られる培養は最も好ましい。
【００４９】 トウモロコシ、イネ及び綿を含む植物の苗条端は頂端分裂組織を含有し、そこ
で器官原基が頂端始原細胞及び表皮下細胞から形成される（Ｓｔｅｅｖｅｓ ａ
ｎｄ Ｓｕｓｓｅｘ，１９８９，Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）
。分裂組織を単離し、苗条増殖培地上に置き、多数の苗条を生産するように誘導
することができ、それから植物を再生することができる（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔａ １８７：４８３−４８９）。新しく単離された
か、又は苗条増殖を開始するように予備培養された分裂組織は、本発明において
記載するホイスカー−媒介形質転換のための受容組織として働くことができる。
分裂組織領域を含有する苗条端を好ましくは発育中の胚（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：６７７−６８２）又は発
芽中の実生（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．９５：４２６−４３４）から取り出し、浸透性予備処理を行って、又は行わ
ずにホイスカーを用いて形質転換し、選択試薬を含有する苗条増殖培地上に置い
てから、植物再生させる（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１０９７−１１０７）。
で器官原基が頂端始原細胞及び表皮下細胞から形成される（Ｓｔｅｅｖｅｓ ａ
ｎｄ Ｓｕｓｓｅｘ，１９８９，Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）
。分裂組織を単離し、苗条増殖培地上に置き、多数の苗条を生産するように誘導
することができ、それから植物を再生することができる（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔａ １８７：４８３−４８９）。新しく単離された
か、又は苗条増殖を開始するように予備培養された分裂組織は、本発明において
記載するホイスカー−媒介形質転換のための受容組織として働くことができる。
分裂組織領域を含有する苗条端を好ましくは発育中の胚（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：６７７−６８２）又は発
芽中の実生（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．９５：４２６−４３４）から取り出し、浸透性予備処理を行って、又は行わ
ずにホイスカーを用いて形質転換し、選択試薬を含有する苗条増殖培地上に置い
てから、植物再生させる（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１０９７−１１０７）。
【００５０】 本明細書で形質転換のために用いる異種ＤＮＡは円形、線状、２本鎖又は１本
鎖であることができる。一般に該ＤＮＡは組換えベクタープラスミドであり、問
題の異種遺伝子の発現を促進するように働き、ならびに該遺伝子を含有する組織
を同定できるようにする選択マーカーを与えるコード領域をその中に含有してい
る。好ましくはこれらの組換えベクターは植物ゲノム中に安定に組込まれること
ができ、ここで、形質転換された植物系の選択は、その中に含まれる構成的、組
織−特異的又は誘導プロモーターにより駆動される該選択マーカー発現を有して
いることにより可能になる。
鎖であることができる。一般に該ＤＮＡは組換えベクタープラスミドであり、問
題の異種遺伝子の発現を促進するように働き、ならびに該遺伝子を含有する組織
を同定できるようにする選択マーカーを与えるコード領域をその中に含有してい
る。好ましくはこれらの組換えベクターは植物ゲノム中に安定に組込まれること
ができ、ここで、形質転換された植物系の選択は、その中に含まれる構成的、組
織−特異的又は誘導プロモーターにより駆動される該選択マーカー発現を有して
いることにより可能になる。
【００５１】 異種ＤＮＡ中に存在する１つの可変要素（ｖａｒｉａｂｌｅ）はキメラ遺伝子
の選択である。センスもしくはアンチセンス配向におけるキメラ遺伝子は、構成
的、組織−特異的、発育的もしくは誘導プロモーターなどの調節下で植物細胞中
で発現される。特定のキメラ遺伝子を選ぶことは、専門家（ａｒｔｉｓａｎ）の
自由である；しかしながらキメラ遺伝子は植物から、動物から又はバクテリアか
らなどのものであることができるが、これらに限られず、非−形質転換細胞中に
存在しないか、あるいは形質転換細胞中に存在するタンパク質の発現のために用
いることができる。キメラ遺伝子を問題の内在性遺伝子のアップ−レギュレーシ
ョン又はダウン−レギュレーションにも用いることができるが、これらに限られ
ない。
の選択である。センスもしくはアンチセンス配向におけるキメラ遺伝子は、構成
的、組織−特異的、発育的もしくは誘導プロモーターなどの調節下で植物細胞中
で発現される。特定のキメラ遺伝子を選ぶことは、専門家（ａｒｔｉｓａｎ）の
自由である；しかしながらキメラ遺伝子は植物から、動物から又はバクテリアか
らなどのものであることができるが、これらに限られず、非−形質転換細胞中に
存在しないか、あるいは形質転換細胞中に存在するタンパク質の発現のために用
いることができる。キメラ遺伝子を問題の内在性遺伝子のアップ−レギュレーシ
ョン又はダウン−レギュレーションにも用いることができるが、これらに限られ
ない。
【００５２】 他の可変要素は選択マーカーの選択である。特定のマーカーを選ぶことは専門
家の自由であるが、選択マーカーとして機能することができるはずの本明細書に
は挙げない他のいずれかの遺伝子と共に、以下の選択マーカーのいずれをも用い
ることができる。そのような選択マーカーには、抗生物質カナマイシン、ネオマ
イシン及びＧ４１８に対する耐性をコードするトランスポゾン Ｔｎ５（Ａｐｈ
ＩＩ）のアミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼ遺伝子ならびにグリホ
セート；ハイグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓ
ｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）（ビアロフォス）；イミダゾリノン類、スルホニル
ウレア類及びトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロルスルフロン；ブロモキ
シニル、ダラポンなどに対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）もしくは耐性（ｔ
ｏｌｅｒａｎｃｅ）をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限られるわけで
はない。
家の自由であるが、選択マーカーとして機能することができるはずの本明細書に
は挙げない他のいずれかの遺伝子と共に、以下の選択マーカーのいずれをも用い
ることができる。そのような選択マーカーには、抗生物質カナマイシン、ネオマ
イシン及びＧ４１８に対する耐性をコードするトランスポゾン Ｔｎ５（Ａｐｈ
ＩＩ）のアミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼ遺伝子ならびにグリホ
セート；ハイグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓ
ｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）（ビアロフォス）；イミダゾリノン類、スルホニル
ウレア類及びトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロルスルフロン；ブロモキ
シニル、ダラポンなどに対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）もしくは耐性（ｔ
ｏｌｅｒａｎｃｅ）をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限られるわけで
はない。
【００５３】 選択マーカーの他にリポーター遺伝子を用いるのが望ましいかも知れない。い
くつかの場合には選択マーカーを用いて、又は用いずにリポーター遺伝子を用い
ることができる。リポーター遺伝子は、典型的には受容生物もしくは組織中に存
在せず、典型的には何らかの表現型変化又は酵素的性質を生ずるタンパク質をコ
ードする遺伝子である。そのような遺伝子の例はＫ．Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，４２１（１９８８）に示されて
おり、その記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。好ましいリポ
ーター遺伝子にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子座のベータ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）、Ｅ．コリのＴｎ９からのクロラムフェニコール アセ
チル トランスフェラーゼ遺伝子、生物発光クラゲ、アエクオレア・ビクトリア
（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）からの緑蛍光タンパク質ならびにホタ
ル、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）からのルシフ
ェラーゼ遺伝子が含まれる。次いでリポーター遺伝子発現の検出のためのアッセ
イを、該遺伝子が受容細胞中に導入されてから後の適した時点に行うことができ
る。好ましいそのようなアッセイは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１
９８７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１５，１７−１９）により記載
されているように、形質転換細胞の同定のためにＥ．コリのｕｉｄＡ遺伝子座の
ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子の使用を伴う。
くつかの場合には選択マーカーを用いて、又は用いずにリポーター遺伝子を用い
ることができる。リポーター遺伝子は、典型的には受容生物もしくは組織中に存
在せず、典型的には何らかの表現型変化又は酵素的性質を生ずるタンパク質をコ
ードする遺伝子である。そのような遺伝子の例はＫ．Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，４２１（１９８８）に示されて
おり、その記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。好ましいリポ
ーター遺伝子にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子座のベータ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）、Ｅ．コリのＴｎ９からのクロラムフェニコール アセ
チル トランスフェラーゼ遺伝子、生物発光クラゲ、アエクオレア・ビクトリア
（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）からの緑蛍光タンパク質ならびにホタ
ル、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）からのルシフ
ェラーゼ遺伝子が含まれる。次いでリポーター遺伝子発現の検出のためのアッセ
イを、該遺伝子が受容細胞中に導入されてから後の適した時点に行うことができ
る。好ましいそのようなアッセイは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１
９８７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１５，１７−１９）により記載
されているように、形質転換細胞の同定のためにＥ．コリのｕｉｄＡ遺伝子座の
ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子の使用を伴う。
【００５４】 他の可変要素はプロモーター調節要素である。植物のプロモーター調節要素の
他に、多様な源からのプロモーター調節要素を植物細胞において有効に用い、異
種遺伝子を発現させることができる。例えばバクテリア起源のプロモーター調節
要素、例えばオクトピン シンターゼ プロモーター、ノパリン シンターゼ
プロモーター、マンノピン シンターゼ プロモーター；ウィルス起源のプロモ
ーター、例えばカリフラワー モザイク ウィルス（３５Ｓ及び１９Ｓ）、３５
Ｔ（これは再−操作された（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）３５Ｓプロモーター
である、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６８２；１９９７年４月１７日に公開されたＷＯ
９７／１３４０２を参照されたい）などを用いることができる。植物のプロモ
ーター調節要素にはリブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ） カル
ボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニン プロモータ
ー、ファセオリン プロモーター、ＡＤＨ プロモーター、熱−ショック プロ
モーター及び組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限られるわけでは
ない。
他に、多様な源からのプロモーター調節要素を植物細胞において有効に用い、異
種遺伝子を発現させることができる。例えばバクテリア起源のプロモーター調節
要素、例えばオクトピン シンターゼ プロモーター、ノパリン シンターゼ
プロモーター、マンノピン シンターゼ プロモーター；ウィルス起源のプロモ
ーター、例えばカリフラワー モザイク ウィルス（３５Ｓ及び１９Ｓ）、３５
Ｔ（これは再−操作された（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）３５Ｓプロモーター
である、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６８２；１９９７年４月１７日に公開されたＷＯ
９７／１３４０２を参照されたい）などを用いることができる。植物のプロモ
ーター調節要素にはリブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ） カル
ボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニン プロモータ
ー、ファセオリン プロモーター、ＡＤＨ プロモーター、熱−ショック プロ
モーター及び組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限られるわけでは
ない。
【００５５】 マトリックス付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）領域、スカホールド付着領域、イ
ントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などのような他の要素が存在する
ことができ、かくして転写効率又はＤＮＡ組込みを向上させることができる。そ
のような要素はＤＮＡ機能に必要であり得るか、又は必要でないかも知れないが
、それらは転写、ｍＲＮＡの安定性などに影響することによりＤＮＡのより良い
発現もしくは機能達成（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）を与えることができる。植物
における形質転換されたＤＮＡの最適性能を得るために、そのような要素を所望
通りにＤＮＡ中に含むことができる。典型的な要素にはＡｄｈ−イントロン １
、アルファルファ モザイクウィルス コートタンパク質 リーダー配列、トウ
モロコシ ストリークウィルス コートタンパク質 リーダー配列ならびに熟練
専門家が利用できる他が含まれるが、これらに限られるわけではない。
ントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などのような他の要素が存在する
ことができ、かくして転写効率又はＤＮＡ組込みを向上させることができる。そ
のような要素はＤＮＡ機能に必要であり得るか、又は必要でないかも知れないが
、それらは転写、ｍＲＮＡの安定性などに影響することによりＤＮＡのより良い
発現もしくは機能達成（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）を与えることができる。植物
における形質転換されたＤＮＡの最適性能を得るために、そのような要素を所望
通りにＤＮＡ中に含むことができる。典型的な要素にはＡｄｈ−イントロン １
、アルファルファ モザイクウィルス コートタンパク質 リーダー配列、トウ
モロコシ ストリークウィルス コートタンパク質 リーダー配列ならびに熟練
専門家が利用できる他が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【００５６】 構成的プロモーター調節要素を用いることもでき、それによりすべての細胞型
において常に連続的な遺伝子発現を方向付ける（例えばアクチン、ユビキチン、
ＣａＭＶ ３５Ｓなど）。組織特異的プロモーター調節要素は葉又は種子のよう
な特定の細胞又は組織型における遺伝子発現を担っており（例えばゼイン、オレ
オシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）、それも用いることができる。
において常に連続的な遺伝子発現を方向付ける（例えばアクチン、ユビキチン、
ＣａＭＶ ３５Ｓなど）。組織特異的プロモーター調節要素は葉又は種子のよう
な特定の細胞又は組織型における遺伝子発現を担っており（例えばゼイン、オレ
オシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）、それも用いることができる。
【００５７】 プロモーター調節要素は植物の発育のある段階の間に活性であることができ、
ならびに特定の植物組織及び器官において活性であることができる。そのような
ものの例には花粉−特異的、胚特異的、トウモロコシの毛（ｃｏｒｎ ｓｉｌｋ
）特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子内乳特異的プロモーター調節要素など
が含まれるがこれらに限られるわけではない。ある状況下では特定の信号、例え
ば：物理的刺激（熱ショック遺伝子）；光（ＲＵＢＰ カルボキシラーゼ）；ホ
ルモン（Ｅｍ）；代謝；及びストレスに応答する遺伝子の発現を担う誘導プロモ
ーター調節要素を用いるのが望ましいかも知れない。植物において機能性の他の
望ましい転写及び翻訳要素も用いることができる。多数の植物−特異的遺伝子転
移ベクターが既知であり、熟練専門家が利用できる。
ならびに特定の植物組織及び器官において活性であることができる。そのような
ものの例には花粉−特異的、胚特異的、トウモロコシの毛（ｃｏｒｎ ｓｉｌｋ
）特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子内乳特異的プロモーター調節要素など
が含まれるがこれらに限られるわけではない。ある状況下では特定の信号、例え
ば：物理的刺激（熱ショック遺伝子）；光（ＲＵＢＰ カルボキシラーゼ）；ホ
ルモン（Ｅｍ）；代謝；及びストレスに応答する遺伝子の発現を担う誘導プロモ
ーター調節要素を用いるのが望ましいかも知れない。植物において機能性の他の
望ましい転写及び翻訳要素も用いることができる。多数の植物−特異的遺伝子転
移ベクターが既知であり、熟練専門家が利用できる。
【００５８】 異種ＤＮＡをホイスカー−媒介形質転換を介して再生可能な植物細胞培養中に
導入することができる。プロセスの一般的記述は、両方ともＺｅｎｅｃａへの米
国特許第５，３０２，５２３及び５，４６４，７６５号に見いだすことができる
が、Ｉ型、ＩＩ型、胚軸もしくは子葉の再生可能な植物細胞系のホイスカー−媒
介形質転換に関する案は今日まで公開されなかった。
導入することができる。プロセスの一般的記述は、両方ともＺｅｎｅｃａへの米
国特許第５，３０２，５２３及び５，４６４，７６５号に見いだすことができる
が、Ｉ型、ＩＩ型、胚軸もしくは子葉の再生可能な植物細胞系のホイスカー−媒
介形質転換に関する案は今日まで公開されなかった。
【００５９】 ホイスカー−媒介形質転換においては、植物材料中へのＤＮＡ吸収が生物学的
に不活性な材料から成る非常に小さく、長く伸びた針−様粒子により助長される
。該粒子をＤＮＡ及び植物細胞系の存在下で撹拌すると、１つもしくはそれより
多い粒子が再生可能な植物細胞凝集体中に小さい細孔を作り、それにより該凝集
体がＤＮＡを吸収するのを可能にする。ＤＮＡを吸収した細胞は形質転換された
と考えられる。いくつかの形質転換された細胞は導入されたＤＮＡを安定に保持
し、それを発現する。
に不活性な材料から成る非常に小さく、長く伸びた針−様粒子により助長される
。該粒子をＤＮＡ及び植物細胞系の存在下で撹拌すると、１つもしくはそれより
多い粒子が再生可能な植物細胞凝集体中に小さい細孔を作り、それにより該凝集
体がＤＮＡを吸収するのを可能にする。ＤＮＡを吸収した細胞は形質転換された
と考えられる。いくつかの形質転換された細胞は導入されたＤＮＡを安定に保持
し、それを発現する。
【００６０】 植物細胞の形質転換で用いられる長く伸びた針−様粒子は「ホイスカー」と呼
ばれ、好ましくは炭化ケイ素又は窒化ケイ素のような高密度材料で作られる；し
かしながら針−様構造を有し、該構造の寸法が形質転換されるべき細胞より小さ
いいずれの材料も本発明の範囲内である。さらに好ましくは、ホイスカーは炭化
ケイ素から作られ、本明細書に記載するＳｉｌａｒ ＳＣ−９又はＡｌｆａ Ａ
ｅｓａｒのいずれかである。
ばれ、好ましくは炭化ケイ素又は窒化ケイ素のような高密度材料で作られる；し
かしながら針−様構造を有し、該構造の寸法が形質転換されるべき細胞より小さ
いいずれの材料も本発明の範囲内である。さらに好ましくは、ホイスカーは炭化
ケイ素から作られ、本明細書に記載するＳｉｌａｒ ＳＣ−９又はＡｌｆａ Ａ
ｅｓａｒのいずれかである。
【００６１】 形質転換の前に、植物細胞系を好ましくは非浸透性（ａｎｏｓｍｏｔｉｃ）培
地上に置いてインキュベーションを許し、それにより非−浸透的に処理された細
胞より形質転換を強化する。最も好ましいのは、その中に約３６．４ｇ／Ｌのソ
ルビトール及び約３６．４ｇ／Ｌのマンニトールを有する浸透性培地である。こ
れらの組織を、ホイスカー−媒介形質転換の前に、該培地上に約４時間保持する
。形質転換後の浸透物質（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）を有する培地上におけるインキ
ュベーションは専門家の自由である。しかしながら、非−浸透的に処理された植
物細胞凝集体及び組織の形質転換も本発明の範囲内である。
地上に置いてインキュベーションを許し、それにより非−浸透的に処理された細
胞より形質転換を強化する。最も好ましいのは、その中に約３６．４ｇ／Ｌのソ
ルビトール及び約３６．４ｇ／Ｌのマンニトールを有する浸透性培地である。こ
れらの組織を、ホイスカー−媒介形質転換の前に、該培地上に約４時間保持する
。形質転換後の浸透物質（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）を有する培地上におけるインキ
ュベーションは専門家の自由である。しかしながら、非−浸透的に処理された植
物細胞凝集体及び組織の形質転換も本発明の範囲内である。
【００６２】 形質転換植物の生産のために本明細書で用いられるカルス培養は一般に、培養
型に依存して約３週令〜約２０週令でなければならない。典型的には、カルスは
転移期間の間の大体中間点にあり、かくして新しい培地への転移に伴い得る誘導
期を過ぎているか、又は長時間プレート上にある培養に典型的に伴う定常期への
到達の前でなければならない。しかしながら、植物材料を継代培養の前もしくは
後に採取することができる；従って収穫時機は一般に本明細書に開示する本発明
の実施に決定的であると思われない。それぞれの形質転換に用いられるカルス組
織の量は変わり得、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの量が好ましく、約１００ｍｇ
〜約２５０ｍｇがより好ましく、約２００ｍｇの組織が最も好ましい。
型に依存して約３週令〜約２０週令でなければならない。典型的には、カルスは
転移期間の間の大体中間点にあり、かくして新しい培地への転移に伴い得る誘導
期を過ぎているか、又は長時間プレート上にある培養に典型的に伴う定常期への
到達の前でなければならない。しかしながら、植物材料を継代培養の前もしくは
後に採取することができる；従って収穫時機は一般に本明細書に開示する本発明
の実施に決定的であると思われない。それぞれの形質転換に用いられるカルス組
織の量は変わり得、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの量が好ましく、約１００ｍｇ
〜約２５０ｍｇがより好ましく、約２００ｍｇの組織が最も好ましい。
【００６３】 形質転換のために、ホイスカーは典型的には円錐管（ｃｏｎｉｃａｌ）もしく
は微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）などのような小さい容器中に入
れられ、その中に問題のＤＮＡ構築物、液体培地及びカルス組織を含む混合物が
入れられる。材料を加える順序は本明細書に記載する本発明の実施に重要ではな
い。その後容器を密封し、撹拌する。植物組織のバイオリスチックスによる形質
転換に用いられる粒子と異なり（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，７９：２０６−２０９；及び米国特許第５
，１００，７１２号）、ホイスカーは使用前にＤＮＡ担体もしくは沈殿剤、例え
ばＣａＣｌ2、スペルミジン、シアリングされたサケ精子ＤＮＡなどを用いる特
別な予備処理を必要としない。
は微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）などのような小さい容器中に入
れられ、その中に問題のＤＮＡ構築物、液体培地及びカルス組織を含む混合物が
入れられる。材料を加える順序は本明細書に記載する本発明の実施に重要ではな
い。その後容器を密封し、撹拌する。植物組織のバイオリスチックスによる形質
転換に用いられる粒子と異なり（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，７９：２０６−２０９；及び米国特許第５
，１００，７１２号）、ホイスカーは使用前にＤＮＡ担体もしくは沈殿剤、例え
ばＣａＣｌ2、スペルミジン、シアリングされたサケ精子ＤＮＡなどを用いる特
別な予備処理を必要としない。
【００６４】 形質転換プロセスで用いられる撹拌時間は変わり得、典型的には約１０秒〜約
１６０秒である。形質転換当たりに加えられるホイスカーの量も管当たりに約１
ｍｇ〜約４ｍｇで変わり得る。加えられるホイスカーの量と最適形質転換を得る
ために必要な撹拌時間の間に逆比例関係（ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ
ｈｉｐ）が観察される。従って加えられるホイスカーの量及び形質転換を達成す
るために必要な撹拌時間は、当該技術分野における熟練者により決定され得る。
さらに、加えられる液体培地の容積は約２００μＬ〜約１０００μＬで変わり得
、約２００μＬが好ましい。さらに、加えられる異種ＤＮＡの量は約１０μＬの
好ましい量から約１００μＬの１ｍｇ／ｍＬの溶液で変わり得る。加えられるＤ
ＮＡの容積は、本明細書に開示する本発明にとって、最終的ＤＮＡ濃度ほど決定
的な因子ではない。しかしながら好ましい最終的ＤＮＡ濃度は約０．０３μｇ／
μＬ〜約０．１４μｇ／μＬである。本発明の範囲は、本明細書に開示する該容
器寸法、加えられる異種ＤＮＡの量もしくは濃度、加えられる異種ＤＮＡの容積
、加えられる液体培地の量、加えられるカルス材料の量又は加えられるホイスカ
ーの量に制限されるものではない。本発明の範囲は、混合物の撹拌のために用い
られる手段あるいは撹拌が手動により成されるか、又は機械的手段により成され
るかによって制限されるものでもない。
１６０秒である。形質転換当たりに加えられるホイスカーの量も管当たりに約１
ｍｇ〜約４ｍｇで変わり得る。加えられるホイスカーの量と最適形質転換を得る
ために必要な撹拌時間の間に逆比例関係（ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ
ｈｉｐ）が観察される。従って加えられるホイスカーの量及び形質転換を達成す
るために必要な撹拌時間は、当該技術分野における熟練者により決定され得る。
さらに、加えられる液体培地の容積は約２００μＬ〜約１０００μＬで変わり得
、約２００μＬが好ましい。さらに、加えられる異種ＤＮＡの量は約１０μＬの
好ましい量から約１００μＬの１ｍｇ／ｍＬの溶液で変わり得る。加えられるＤ
ＮＡの容積は、本明細書に開示する本発明にとって、最終的ＤＮＡ濃度ほど決定
的な因子ではない。しかしながら好ましい最終的ＤＮＡ濃度は約０．０３μｇ／
μＬ〜約０．１４μｇ／μＬである。本発明の範囲は、本明細書に開示する該容
器寸法、加えられる異種ＤＮＡの量もしくは濃度、加えられる異種ＤＮＡの容積
、加えられる液体培地の量、加えられるカルス材料の量又は加えられるホイスカ
ーの量に制限されるものではない。本発明の範囲は、混合物の撹拌のために用い
られる手段あるいは撹拌が手動により成されるか、又は機械的手段により成され
るかによって制限されるものでもない。
【００６５】 植物細胞系が穿孔され、異種ＤＮＡがその中に侵入したら、問題の異種ＤＮＡ
を含有するのみでなく、再生も可能である細胞を同定し、増殖させ、選択するこ
とが必要である。該細胞及びそれから再生する植物を、リポーター遺伝子発現の
評価を含むがこれに限られない種々の標準的方法により、異種ＤＮＡの存在もし
くは不在に関してスクリーニングすることができる。別の場合、異種ＤＮＡと一
緒の、又はその一部としての選択マーカー遺伝子の伝達が、選択試薬の使用によ
り該ＤＮＡを含有する細胞を同定することを可能にする。
を含有するのみでなく、再生も可能である細胞を同定し、増殖させ、選択するこ
とが必要である。該細胞及びそれから再生する植物を、リポーター遺伝子発現の
評価を含むがこれに限られない種々の標準的方法により、異種ＤＮＡの存在もし
くは不在に関してスクリーニングすることができる。別の場合、異種ＤＮＡと一
緒の、又はその一部としての選択マーカー遺伝子の伝達が、選択試薬の使用によ
り該ＤＮＡを含有する細胞を同定することを可能にする。
【００６６】 問題の異種ＤＮＡを含有し且つ発現する細胞のみの選択は、稔性形質転換植物
の生産において決定的な段階である。選択条件は、形質転換された細胞の成長を
許すが、初期にはずっとより豊富にある形質転換されない細胞の成長を阻害する
ような方法で選ばれねばならない。さらに、選択条件は形質転換された細胞にそ
の植物再生能、将来の生存力又は稔性を失わせるように働いてはならない。熟練
した専門家は、成長阻害曲線を得ることにより、特定の選択マーカーを発現する
形質転換細胞を選択するための適した条件を容易に決定することができる。成長
阻害曲線は、選択試薬濃度に対する細胞成長をプロットすることにより作られる
。典型的には、選択試薬濃度は、ほとんどすべての非−形質転換細胞が成長阻害
されるがまだ殺されないような濃度に設定される。好ましいのは、非−形質転換
細胞の９０〜９９％が成長阻害されるが、まだ殺されない選択試薬濃度である。
最も好ましいのは、非−形質転換細胞の９７〜９９％が成長阻害されるが、まだ
殺されない選択試薬濃度である。
の生産において決定的な段階である。選択条件は、形質転換された細胞の成長を
許すが、初期にはずっとより豊富にある形質転換されない細胞の成長を阻害する
ような方法で選ばれねばならない。さらに、選択条件は形質転換された細胞にそ
の植物再生能、将来の生存力又は稔性を失わせるように働いてはならない。熟練
した専門家は、成長阻害曲線を得ることにより、特定の選択マーカーを発現する
形質転換細胞を選択するための適した条件を容易に決定することができる。成長
阻害曲線は、選択試薬濃度に対する細胞成長をプロットすることにより作られる
。典型的には、選択試薬濃度は、ほとんどすべての非−形質転換細胞が成長阻害
されるがまだ殺されないような濃度に設定される。好ましいのは、非−形質転換
細胞の９０〜９９％が成長阻害されるが、まだ殺されない選択試薬濃度である。
最も好ましいのは、非−形質転換細胞の９７〜９９％が成長阻害されるが、まだ
殺されない選択試薬濃度である。
【００６７】 転移され、選択試薬に暴露された形質転換カルス組織は一般に、成長を支持す
ることができる固体培地上でインキュベーションされる。それぞれの型の組織に
好ましい培地は当該技術分野において十分に限定されている。選択試薬への最初
の暴露の後、選択試薬濃度を保持しながら、組織を周期的に新鮮な培地に転移さ
せる。形質転換細胞塊が本質的に倍の寸法になった後、最高の成長を示し、健康
に見える塊を選択し、非−形質転換細胞が殺されるであろう選択試薬濃度を有す
る新しい培地に転移させる。選択及び成長細胞の新鮮な培地への転移を繰り返す
と、結局、ほとんど問題の異種ＤＮＡを含有する形質転換細胞のみから成る選択
された細胞の群を生ずる。
ることができる固体培地上でインキュベーションされる。それぞれの型の組織に
好ましい培地は当該技術分野において十分に限定されている。選択試薬への最初
の暴露の後、選択試薬濃度を保持しながら、組織を周期的に新鮮な培地に転移さ
せる。形質転換細胞塊が本質的に倍の寸法になった後、最高の成長を示し、健康
に見える塊を選択し、非−形質転換細胞が殺されるであろう選択試薬濃度を有す
る新しい培地に転移させる。選択及び成長細胞の新鮮な培地への転移を繰り返す
と、結局、ほとんど問題の異種ＤＮＡを含有する形質転換細胞のみから成る選択
された細胞の群を生ずる。
【００６８】 再生は、本発明にとって重要であるが、熟練した専門家が利用できるいずれの
通常の方法においても行われ得る。細胞が選択マーカー遺伝子で形質転換された
場合、選択試薬を再生培地中に導入し、再生した苗木が形質転換されていること
をさらに確証することができる。続く数週間の培養の後、再生した選択試薬に対
して免疫性の苗木を土壌に移し、成木（ｍａｔｕｒｉｔｙ）に成長させることが
できる。
通常の方法においても行われ得る。細胞が選択マーカー遺伝子で形質転換された
場合、選択試薬を再生培地中に導入し、再生した苗木が形質転換されていること
をさらに確証することができる。続く数週間の培養の後、再生した選択試薬に対
して免疫性の苗木を土壌に移し、成木（ｍａｔｕｒｉｔｙ）に成長させることが
できる。
【００６９】 カルス及びそれに由来する植物を、表現型及び／又は遺伝子型分析により形質
転換株として同定することができる。例えば異種ＤＮＡにより酵素又はタンパク
質がコードされる場合、特定の酵素もしくはタンパク質に対して特異的な酵素も
しくは免疫学的アッセイを用いることができる。適したバイオアッセイ又は化学
アッセイを用いることにより、他の遺伝子産物を検定することができる。他の方
法はＳｏｕｔｈｅｒｎ（（１９７５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３
−５１７）により記載されている方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを
用いる植物のゲノム成分の分析を含む。
転換株として同定することができる。例えば異種ＤＮＡにより酵素又はタンパク
質がコードされる場合、特定の酵素もしくはタンパク質に対して特異的な酵素も
しくは免疫学的アッセイを用いることができる。適したバイオアッセイ又は化学
アッセイを用いることにより、他の遺伝子産物を検定することができる。他の方
法はＳｏｕｔｈｅｒｎ（（１９７５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３
−５１７）により記載されている方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを
用いる植物のゲノム成分の分析を含む。
【００７０】 形質転換カルスから再生する植物は、Ｒ０世代又はＲ０植物と呼ばれる。この
世代の植物から種々の有性交雑により生産される種子はＲ１子孫と呼ばれる。Ｒ
１種子は次いで発芽してＲ１植物を与える。異種ＤＮＡのＲ１植物へ、及びそれ
を越えての伝達及び遺伝の成功は、本明細書に記載する方法を用いて確証されね
ばならない。
世代の植物から種々の有性交雑により生産される種子はＲ１子孫と呼ばれる。Ｒ
１種子は次いで発芽してＲ１植物を与える。異種ＤＮＡのＲ１植物へ、及びそれ
を越えての伝達及び遺伝の成功は、本明細書に記載する方法を用いて確証されね
ばならない。
【００７１】 一般に形質転換されたトウモロコシ及びその子孫の商業的価値は、異種ＤＮＡ
を多様な雑種中に導入できる場合に、最大の価値となるであろう。これは、本明
細書に記載する通りに、親系の植物細胞凝集体を作り、該系をホイスカーを用い
て形質転換することにより、異種ＤＮＡを多数の親系中に直接導入することによ
り達成され得る。さらに、最初の形質転換稔性植物を正常な選択同系繁殖系に交
雑し、次いでその子孫を正常な親に戻し交雑することによってもこれを行うこと
ができる。この交雑からの子孫は、いくつかの植物が問題の異種ＤＮＡを含有し
、いくつかの植物が含有しないように分離するであろう。最初の正常な親が、問
題の異種ＤＮＡを含有し、その系に最初に伴った本質的にすべての属性も有する
遺伝的に改変された系に転換されてしまうまで、系の交雑を続ける。選択生殖細
胞質系及びその同系繁殖体を得るのに必要なトウモロコシ育種法は熟練した専門
家に周知である。
を多様な雑種中に導入できる場合に、最大の価値となるであろう。これは、本明
細書に記載する通りに、親系の植物細胞凝集体を作り、該系をホイスカーを用い
て形質転換することにより、異種ＤＮＡを多数の親系中に直接導入することによ
り達成され得る。さらに、最初の形質転換稔性植物を正常な選択同系繁殖系に交
雑し、次いでその子孫を正常な親に戻し交雑することによってもこれを行うこと
ができる。この交雑からの子孫は、いくつかの植物が問題の異種ＤＮＡを含有し
、いくつかの植物が含有しないように分離するであろう。最初の正常な親が、問
題の異種ＤＮＡを含有し、その系に最初に伴った本質的にすべての属性も有する
遺伝的に改変された系に転換されてしまうまで、系の交雑を続ける。選択生殖細
胞質系及びその同系繁殖体を得るのに必要なトウモロコシ育種法は熟練した専門
家に周知である。
【００７２】 実施例において本発明の特定の実施態様をさらに例示する。しかしながら、詳
述する特定の実験は単に本発明の例であり、本発明は前記の特許請求の範囲にも
っと十分に記載されていることが当該技術分野における熟練者に容易にわかるで
あろう。
述する特定の実験は単に本発明の例であり、本発明は前記の特許請求の範囲にも
っと十分に記載されていることが当該技術分野における熟練者に容易にわかるで
あろう。
【００７３】
実施例１ Ｉ型及びＩＩ型トウモロコシカルス組織の確立 Ｉ型カルスイニシェーションのために、遺伝子型 Ｈ９９、Ｐａ９１及び独占
的系（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｌｉｎｅ）、１３９／３９（米国特許第５，３
０６，８６４号）の接合体型胚（１．５〜３．０ｍｍ）を下記の通りに無菌的に
単離し、Ｎ６ 多量栄養素及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、Ｂ５
微量栄養素（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．５０
：１５１−１５８）、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、
１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解産物
、３７ｍｇ／Ｌの鉄−エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩（ＮａＦｅＥＤＴ
Ａ）、８ｍｇ／Ｌのジカンバ、０．８ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、４．９ｍｇ／Ｌの
ＡｇＮＯ3及び２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥから成るＩ型培地上に置いた。最
初の接合体型胚の小盾板領域からイニシェーションされたＩ型カルスは、小盾板
−様構造を示す密集した胚形成性組織及び苗条分裂組織から成った。２１〜２８
日の間隔で選択的継代培養を数回継代した後、本明細書に記載する形質転換実験
に培養を用いた。
的系（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｌｉｎｅ）、１３９／３９（米国特許第５，３
０６，８６４号）の接合体型胚（１．５〜３．０ｍｍ）を下記の通りに無菌的に
単離し、Ｎ６ 多量栄養素及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、Ｂ５
微量栄養素（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．５０
：１５１−１５８）、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、
１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解産物
、３７ｍｇ／Ｌの鉄−エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩（ＮａＦｅＥＤＴ
Ａ）、８ｍｇ／Ｌのジカンバ、０．８ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、４．９ｍｇ／Ｌの
ＡｇＮＯ3及び２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥから成るＩ型培地上に置いた。最
初の接合体型胚の小盾板領域からイニシェーションされたＩ型カルスは、小盾板
−様構造を示す密集した胚形成性組織及び苗条分裂組織から成った。２１〜２８
日の間隔で選択的継代培養を数回継代した後、本明細書に記載する形質転換実験
に培養を用いた。
【００７４】 ＩＩ型カルスのイニシェーションのために、Ｂ７３ ｘ Ａ１８８交雑に由来
する２つのＳ3系の相互交配により作られた雑種の植物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｎｅｗｓ Ｌｅ
ｔｔ．，６５：９２−９３）を標準的温室条件下で成長させ、自家−もしくは兄
姉−受粉させた（Ｐｅｔｏｌｉｎｏ ａｎｄ Ｇｅｎｏｖｅｓｉ，１９９４，Ｔ
ｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐｐ．７０１−７０４）。受粉から１０
〜１４日後（ＤＡＰ）に、発現する穂を取り、表面を７０％（ｖ／ｖ）エタノー
ルで２分間殺菌し、続いて数滴のＬＩＱＵＩ−ＮＯＸを含有する２０％（ｖ／ｖ
）市販漂白剤中に０．５時間浸し、次いで無菌Ｈ2Ｏで数回濯いだ。次いで未成
熟の胚（１．５〜３．０ｍｍ）を単離し、イニシェーション培地［ｐＨ５．８に
おけるＮ６ 基礎塩及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐ
ｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、２０ｇ／Ｌの
スクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌの酵素的カゼイン加
水分解産物（ＥＣＨ）、３７ｍｇ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ＬのＡｇＮ
Ｏ3、１ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）及び２．５
ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉ
ｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）］上に置いた。暗所で２８℃において２〜３週間の後、多
数の球状及び長く伸びた体細胞胚を有するＩＩ型カルスが得られた。Ｗｅｌｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：７２５−
７２９に記載されている通り、さらに２〜３回の選択的継代培養を行って所望の
形態を有するＩＩ型培養を濃縮した。ＩＩ型の形態が確立されたら（４〜６週間
）、カルスを保持培地（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）（６ｍＭのＬ
−プロリンを含有し、ＡｇＮＯ3を含有しないイニシェーション培地）に移した
。培養のイニシェーションから約１６〜２０週間後にＩＩ型カルスを形質転換に
用いた。
する２つのＳ3系の相互交配により作られた雑種の植物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｎｅｗｓ Ｌｅ
ｔｔ．，６５：９２−９３）を標準的温室条件下で成長させ、自家−もしくは兄
姉−受粉させた（Ｐｅｔｏｌｉｎｏ ａｎｄ Ｇｅｎｏｖｅｓｉ，１９９４，Ｔ
ｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐｐ．７０１−７０４）。受粉から１０
〜１４日後（ＤＡＰ）に、発現する穂を取り、表面を７０％（ｖ／ｖ）エタノー
ルで２分間殺菌し、続いて数滴のＬＩＱＵＩ−ＮＯＸを含有する２０％（ｖ／ｖ
）市販漂白剤中に０．５時間浸し、次いで無菌Ｈ2Ｏで数回濯いだ。次いで未成
熟の胚（１．５〜３．０ｍｍ）を単離し、イニシェーション培地［ｐＨ５．８に
おけるＮ６ 基礎塩及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐ
ｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、２０ｇ／Ｌの
スクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌの酵素的カゼイン加
水分解産物（ＥＣＨ）、３７ｍｇ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ＬのＡｇＮ
Ｏ3、１ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）及び２．５
ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉ
ｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）］上に置いた。暗所で２８℃において２〜３週間の後、多
数の球状及び長く伸びた体細胞胚を有するＩＩ型カルスが得られた。Ｗｅｌｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：７２５−
７２９に記載されている通り、さらに２〜３回の選択的継代培養を行って所望の
形態を有するＩＩ型培養を濃縮した。ＩＩ型の形態が確立されたら（４〜６週間
）、カルスを保持培地（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）（６ｍＭのＬ
−プロリンを含有し、ＡｇＮＯ3を含有しないイニシェーション培地）に移した
。培養のイニシェーションから約１６〜２０週間後にＩＩ型カルスを形質転換に
用いた。
【００７５】 実施例２ プラスミドｐＵＧＮ８１−３及びｐＤＡＢ４１８の構築 本明細書に開示する通り、β−グルコロニダーゼ遺伝子を駆動するユビキチン プロモーター調節要素を含有するトウモロコシ発現ベクター、ｐＵＧＮ８１−
３を用いた。プラスミドｐＵＧＮ８１−３は、時計回りの順序で以下の配列を含
む８７３０塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレオチド１〜１
７は配列ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＧ ＧＣＴＧＣＡＧを有するポリリンカーをコード
した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド１８〜２００３はトウモロコシ ユビキ
チン プロモーター及びその第１イントロンであり、トウモロコシ遺伝子型Ｂ７
３のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ
．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）。
ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド２００４〜２０２２は配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣ
Ｇ ＧＧＧＴＣＧＡＣＣを有するポリリンカーをコードした。ｐＵＧＮ８１−３
のヌクレオチド２０２３〜４１５４はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド２５５１〜４６８２に対応し、
それには配列ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴ ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴ ＧＣＣＴＧＣＡＧ
ＧＣ ＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴ ＴＡＡを有するポリリンカーが続き、それはｐＵ
ＧＮ８１−３の塩基４１５５〜４１９７に対応した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレ
オチド４１９８〜４２６４は：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ ＴＡＡＣＧＣＣＣＧＧ
ＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴ ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣ ＧＡＴＣＧＣＴＴＧＣ ＡＧＡ
ＴＣＴＧＣＡＴ ＧＧＧＴＧに対応した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４２
６５〜４７７６は二重−増強（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）３５Ｓ プロ
モーターを含み、ヌクレオチド４２６５〜４５１６はカリフラワー モザイクウ
ィルス ゲノムのヌクレオチド７０９３〜７３４４に対応した（Ｆｒａｎｃｋ
ｅｔ ａｌ．，（１９８０） Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４）。ｐＵＧＮ８
１−３のヌクレオチド４５２５〜４７７６はヌクレオチド４２６５〜４５１６の
重複であり、リンカーＣＡＴＣＧＡＴＧが重複遺伝子の間のヌクレオチド４５１
７〜４５２４を構成した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４７７７〜４８７１
はカリフラワー モザイクウィルス ゲノムの塩基７３４５〜７４３９に対応し
た（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８０） Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２
９４）。ヌクレオチド４８７２〜４８９１はリンカーＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ Ｇ
ＡＧＧＡＴＣＣＡＧを含んだ。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４８９２〜５０
０１は、塩基１８７が不在のトウモロコシ ストリークウィルス ゲノムのヌク
レオチド１６７〜２７７に対応した（Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（
１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ．３：３０６３−３０６８）。ヌクレオチド５００２
〜５２２３はトウモロコシ アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ａｄｈ１−Ｓ
）の改変第１イントロンに対応した（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４
） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）。改変
は３４３個のヌクレオチド（塩基１３１３〜１６５６）の除去を生じ、トウモロ
コシＡｄｈ１−Ｓ遺伝子の塩基１２２２〜１３１２（イントロン５’末端）及び
ヌクレオチド１６５７〜１７７５（イントロン３’末端）は残った。ｐＵＧＮ８
１−３のヌクレオチド５２２４〜５２５７はトウモロコシ ストリークウィルス
（ＭＳＶ）ヌクレオチド２７９〜３１２に対応した。下記でＭＳＶと呼ぶトウモ
ロコシ ストリークウィルスの配列の両方の部分はＭＳＶコートタンパク質Ｖ２
遺伝子の非翻訳リーダーを含み、プラスミドｐＵＧＮ８１−３においては改変さ
れたＡｄｈ１イントロンにより分断されていた。プラスミドｐＵＧＮ８１−３の
ヌクレオチド５２５８〜５８１４はストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のホスフィノトリシ
ン アセチル トランスフェラーゼ（ＢＡＲ）遺伝子のヌクレオチド２９〜５８
５に対応した（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２）。クローニングを容易にするために、公開
された配列のヌクレオチド３４及び５７５をＡ及びＧからそれぞれＧ及びＡに変
更した。この配列は選択マーカーとして働いた。ヌクレオチド５８１５〜５８１
９はリンカーＧＡＴＣＴを含んだ。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド５８２０〜
６０８９はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）のヌクレオチド４４１４〜４６８３に対応し、それにリンカー配列ＡＴＣ
ＧＧが続いた。ｐＵＧＮ８１−３の残りの配列（ヌクレオチド６０９５〜８７３
０）はｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）
Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）の逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔ）に対応した。
３を用いた。プラスミドｐＵＧＮ８１−３は、時計回りの順序で以下の配列を含
む８７３０塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレオチド１〜１
７は配列ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＧ ＧＣＴＧＣＡＧを有するポリリンカーをコード
した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド１８〜２００３はトウモロコシ ユビキ
チン プロモーター及びその第１イントロンであり、トウモロコシ遺伝子型Ｂ７
３のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ
．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）。
ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド２００４〜２０２２は配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣ
Ｇ ＧＧＧＴＣＧＡＣＣを有するポリリンカーをコードした。ｐＵＧＮ８１−３
のヌクレオチド２０２３〜４１５４はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド２５５１〜４６８２に対応し、
それには配列ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴ ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴ ＧＣＣＴＧＣＡＧ
ＧＣ ＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴ ＴＡＡを有するポリリンカーが続き、それはｐＵ
ＧＮ８１−３の塩基４１５５〜４１９７に対応した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレ
オチド４１９８〜４２６４は：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ ＴＡＡＣＧＣＣＣＧＧ
ＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴ ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣ ＧＡＴＣＧＣＴＴＧＣ ＡＧＡ
ＴＣＴＧＣＡＴ ＧＧＧＴＧに対応した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４２
６５〜４７７６は二重−増強（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）３５Ｓ プロ
モーターを含み、ヌクレオチド４２６５〜４５１６はカリフラワー モザイクウ
ィルス ゲノムのヌクレオチド７０９３〜７３４４に対応した（Ｆｒａｎｃｋ
ｅｔ ａｌ．，（１９８０） Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４）。ｐＵＧＮ８
１−３のヌクレオチド４５２５〜４７７６はヌクレオチド４２６５〜４５１６の
重複であり、リンカーＣＡＴＣＧＡＴＧが重複遺伝子の間のヌクレオチド４５１
７〜４５２４を構成した。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４７７７〜４８７１
はカリフラワー モザイクウィルス ゲノムの塩基７３４５〜７４３９に対応し
た（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８０） Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２
９４）。ヌクレオチド４８７２〜４８９１はリンカーＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ Ｇ
ＡＧＧＡＴＣＣＡＧを含んだ。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド４８９２〜５０
０１は、塩基１８７が不在のトウモロコシ ストリークウィルス ゲノムのヌク
レオチド１６７〜２７７に対応した（Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（
１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ．３：３０６３−３０６８）。ヌクレオチド５００２
〜５２２３はトウモロコシ アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ａｄｈ１−Ｓ
）の改変第１イントロンに対応した（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４
） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）。改変
は３４３個のヌクレオチド（塩基１３１３〜１６５６）の除去を生じ、トウモロ
コシＡｄｈ１−Ｓ遺伝子の塩基１２２２〜１３１２（イントロン５’末端）及び
ヌクレオチド１６５７〜１７７５（イントロン３’末端）は残った。ｐＵＧＮ８
１−３のヌクレオチド５２２４〜５２５７はトウモロコシ ストリークウィルス
（ＭＳＶ）ヌクレオチド２７９〜３１２に対応した。下記でＭＳＶと呼ぶトウモ
ロコシ ストリークウィルスの配列の両方の部分はＭＳＶコートタンパク質Ｖ２
遺伝子の非翻訳リーダーを含み、プラスミドｐＵＧＮ８１−３においては改変さ
れたＡｄｈ１イントロンにより分断されていた。プラスミドｐＵＧＮ８１−３の
ヌクレオチド５２５８〜５８１４はストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のホスフィノトリシ
ン アセチル トランスフェラーゼ（ＢＡＲ）遺伝子のヌクレオチド２９〜５８
５に対応した（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２）。クローニングを容易にするために、公開
された配列のヌクレオチド３４及び５７５をＡ及びＧからそれぞれＧ及びＡに変
更した。この配列は選択マーカーとして働いた。ヌクレオチド５８１５〜５８１
９はリンカーＧＡＴＣＴを含んだ。ｐＵＧＮ８１−３のヌクレオチド５８２０〜
６０８９はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）のヌクレオチド４４１４〜４６８３に対応し、それにリンカー配列ＡＴＣ
ＧＧが続いた。ｐＵＧＮ８１−３の残りの配列（ヌクレオチド６０９５〜８７３
０）はｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）
Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）の逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔ）に対応した。
【００７６】 いくつかの発現研究においては、β−グルクロニダーゼ遺伝子を駆動するユビ
キチン プロモーター調節要素を含有するトウモロコシ発現ベクター、ｐＤＡＢ
４１８を用いた。さらにこのプラスミドは植物選択マーカーとして働く第２の遺
伝子を有した。プラスミドｐＤＡＢ４１８は時計回りの順序で以下の配列を含む
１０，１４９塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレオチド１〜
３１はヌクレオチド配列ＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡ ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡ ＡＧＣ
ＴＴＣＣＧＣＧ Ｇを有した。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド３２〜２０２３は
トウモロコシ ユビキチン（Ｕｂｉｌ）プロモーター及び第１イントロンであり
、トウモロコシ遺伝子型Ｂ７３のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された（Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１８：６７５−６８９）。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド２０２４〜２０４２
はリンカー配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧ ＧＧＧＴＣＧＡＣＣを含んだ。ｐＤＡＢ
４１８のヌクレオチド２０４３〜３８９４は、プラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド２５５１〜４４０２に
対応し、それにリンカー配列ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧ（塩基３８９５〜３９０４）
が続いた。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド３９０５〜４１７４はｐＢＩ１０１の
４４１４〜４６８３に対応した。ヌクレオチド４１７５〜４１９２はリンカー配
列ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴ ＡＡＧＣＴＴＧＧから成った。塩基４１９３〜６１８
４は上記のトウモロコシ ユビキチン プロモーター及び第１イントロンの第２
の複製から成った。この配列にリンカー配列ＧＴＣＧＧＧＧＡＴＣ ＴＡ（６１
８５〜６１９６）が続いた。プラスミドｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド６１９７
〜６７５３はストレプトマイセス・ハイグロスコピクスのホスフィノトリシン
アセチル トランスフェラーゼ（ＢＡＲ）遺伝子のヌクレオチド２９〜５８５に
対応した（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２）。クローニングを容易にするために、公開され
た配列のヌクレオチド３４及び５７５をＡ及びＧからそれぞれＧ及びＡに変更し
た。この配列は選択マーカーとして働き、トウモロコシ ユビキチン プロモー
ターにより調節された。ヌクレオチド６７５４〜６７５８はリンカーＴＡＡＣＣ
から成った。ヌクレオチド６７５９〜７４７２は３’ポリアデニル化配列として
機能し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）オクトピン Ｔｉ プラスミド ｐＴｉ１５９５５
（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２，３３５−３５０からの塩基２１７２８〜２２４４１を含んだ。配列７４７３
〜７５０４はポリリンカーＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣ ＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡ ＴＧ
ＴＣＧＡＧＣＴＣ ＧＧから成った。ｐＤＡＢ４１８の残りの配列（ヌクレオチ
ド７５０５〜１０１４９）はｐＵＣ１９に由来するプラスミド バックボーンか
らのヌクレオチドの逆相補配列に対応した（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）。
キチン プロモーター調節要素を含有するトウモロコシ発現ベクター、ｐＤＡＢ
４１８を用いた。さらにこのプラスミドは植物選択マーカーとして働く第２の遺
伝子を有した。プラスミドｐＤＡＢ４１８は時計回りの順序で以下の配列を含む
１０，１４９塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレオチド１〜
３１はヌクレオチド配列ＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡ ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡ ＡＧＣ
ＴＴＣＣＧＣＧ Ｇを有した。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド３２〜２０２３は
トウモロコシ ユビキチン（Ｕｂｉｌ）プロモーター及び第１イントロンであり
、トウモロコシ遺伝子型Ｂ７３のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された（Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１８：６７５−６８９）。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド２０２４〜２０４２
はリンカー配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧ ＧＧＧＴＣＧＡＣＣを含んだ。ｐＤＡＢ
４１８のヌクレオチド２０４３〜３８９４は、プラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド２５５１〜４４０２に
対応し、それにリンカー配列ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧ（塩基３８９５〜３９０４）
が続いた。ｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド３９０５〜４１７４はｐＢＩ１０１の
４４１４〜４６８３に対応した。ヌクレオチド４１７５〜４１９２はリンカー配
列ＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴ ＡＡＧＣＴＴＧＧから成った。塩基４１９３〜６１８
４は上記のトウモロコシ ユビキチン プロモーター及び第１イントロンの第２
の複製から成った。この配列にリンカー配列ＧＴＣＧＧＧＧＡＴＣ ＴＡ（６１
８５〜６１９６）が続いた。プラスミドｐＤＡＢ４１８のヌクレオチド６１９７
〜６７５３はストレプトマイセス・ハイグロスコピクスのホスフィノトリシン
アセチル トランスフェラーゼ（ＢＡＲ）遺伝子のヌクレオチド２９〜５８５に
対応した（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２）。クローニングを容易にするために、公開され
た配列のヌクレオチド３４及び５７５をＡ及びＧからそれぞれＧ及びＡに変更し
た。この配列は選択マーカーとして働き、トウモロコシ ユビキチン プロモー
ターにより調節された。ヌクレオチド６７５４〜６７５８はリンカーＴＡＡＣＣ
から成った。ヌクレオチド６７５９〜７４７２は３’ポリアデニル化配列として
機能し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）オクトピン Ｔｉ プラスミド ｐＴｉ１５９５５
（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２，３３５−３５０からの塩基２１７２８〜２２４４１を含んだ。配列７４７３
〜７５０４はポリリンカーＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣ ＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡ ＴＧ
ＴＣＧＡＧＣＴＣ ＧＧから成った。ｐＤＡＢ４１８の残りの配列（ヌクレオチ
ド７５０５〜１０１４９）はｐＵＣ１９に由来するプラスミド バックボーンか
らのヌクレオチドの逆相補配列に対応した（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）。
【００７７】 実施例３ ホイスカー調製、最適化及びＩ型トウモロコシカルスの形質転換 種々の同系繁殖系からＩ型カルスを作った。試験のために、それぞれのＩ型カ
ルスの約２５０ｍｇの試料を２．０ｍＬの微量遠心管（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）中に入れ、Ｎ６ 多
量栄養素及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、Ｂ５ 微量栄養素（Ｇａ
ｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅ．． Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８
）、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌの
ミオ−イノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解産物、３７ｍｇ／Ｌの
ＮａＦｅＥＤＴＡ、８ｍｇ／Ｌのジカンバ、０．８ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、４．
９ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ3］、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＤＡＢ４１８］及び４０μ
ｇ／μＬの（ＳＣ−９）ホイスカー懸濁液の２００μＬから成る３００ｍＬのＩ
型培地を加えた。次いでそれぞれの管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用い
て２０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させたＩ型培地
にカルスを移し戻し、１６時間のインキュベーションを許した。後にカルスを下
記に記載する通りにＧＵＳ発現に関して検定し、結果を表１にまとめた。
ルスの約２５０ｍｇの試料を２．０ｍＬの微量遠心管（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）中に入れ、Ｎ６ 多
量栄養素及びビタミン（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．４３−５６）、Ｂ５ 微量栄養素（Ｇａ
ｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅ．． Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８
）、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．９ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌの
ミオ−イノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解産物、３７ｍｇ／Ｌの
ＮａＦｅＥＤＴＡ、８ｍｇ／Ｌのジカンバ、０．８ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、４．
９ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ3］、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＤＡＢ４１８］及び４０μ
ｇ／μＬの（ＳＣ−９）ホイスカー懸濁液の２００μＬから成る３００ｍＬのＩ
型培地を加えた。次いでそれぞれの管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用い
て２０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させたＩ型培地
にカルスを移し戻し、１６時間のインキュベーションを許した。後にカルスを下
記に記載する通りにＧＵＳ発現に関して検定し、結果を表１にまとめた。
【００７８】
【表１】
【００７９】 ホイスカー処理に続くＩ型カルスにおける過渡的ＧＵＳ発現が、調べたすべて
の遺伝子型において観察された。
の遺伝子型において観察された。
【００８０】 実施例４ ホイスカー調製、最適化及びＩＩ型トウモロコシカルスの形質転換 約４０ｍｇの乾燥ホイスカー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａ
ｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣからのＳｉｌａｒ ＳＣ−９；
Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡからのＡｌｆａ
Ａｅｓａｒ）を取り、それをあらかじめ秤量された２．０ｍＬのポリプロピレン
管中に入れることにより、炭化ケイ素ホイスカーの殺菌懸濁液を調製した。次い
で管を再秤量して加えられたホイスカーの量を決定し、続いてオートクレーブに
かけた。使用の直前に上記の保持培地を加えることにより４０ｍｇ／ｍＬのホイ
スカー懸濁液を作り、高速で１分間渦動させた。
ｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣからのＳｉｌａｒ ＳＣ−９；
Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡからのＡｌｆａ
Ａｅｓａｒ）を取り、それをあらかじめ秤量された２．０ｍＬのポリプロピレン
管中に入れることにより、炭化ケイ素ホイスカーの殺菌懸濁液を調製した。次い
で管を再秤量して加えられたホイスカーの量を決定し、続いてオートクレーブに
かけた。使用の直前に上記の保持培地を加えることにより４０ｍｇ／ｍＬのホイ
スカー懸濁液を作り、高速で１分間渦動させた。
【００８１】 形質転換実験においては、種々の未成熟胚−由来系からのＩＩ型カルスの２０
０ｍｇ又は５００ｍｇの試料を１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）
中に入れた。それぞれの中に５００μＬの液体保持培地［ＧＥＬＲＩＴＥなし］
、８０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
中の０．５μｇ／μＬのｐＤＡＢ４１８］及び４０ｍｇ／ｍＬの（ＳＣ−９）ホ
イスカー懸濁液の５０μＬを加えた。次いでＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用い
て各管を２０秒間撹拌した。負の標準実験も行った。１つの場合にはカルス組織
をＤＮＡの不在下でホイスカーを用いて処理した。他の場合には、ホイスカーの
不在下でカルス組織をＤＮＡで処理した。処理にかかわらず、カルスを次いで２
．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを有する固体保持培地に移し戻し、暗所で２８℃に
おいて１６時間のインキュベーションを許した。後にカルスをＧＵＳアッセイ溶
液［０．２Ｍのリン酸ナトリウム ｐＨ８．０、それぞれ０．１ｍＭのフェリシ
アン酸カリウム及びフェロシアン酸カリウム、１．０ＭのナトリウムＥＤＴＡ、
０．５ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルク
ロニド及び０．６％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００］中に入れた。３７℃で
暗所において４８時間インキュベーションした後に、試料当たりの青い区画のカ
ウントとして定義されるＧＵＳ発現を測定し、それを表２にまとめる。
０ｍｇ又は５００ｍｇの試料を１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）
中に入れた。それぞれの中に５００μＬの液体保持培地［ＧＥＬＲＩＴＥなし］
、８０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
中の０．５μｇ／μＬのｐＤＡＢ４１８］及び４０ｍｇ／ｍＬの（ＳＣ−９）ホ
イスカー懸濁液の５０μＬを加えた。次いでＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用い
て各管を２０秒間撹拌した。負の標準実験も行った。１つの場合にはカルス組織
をＤＮＡの不在下でホイスカーを用いて処理した。他の場合には、ホイスカーの
不在下でカルス組織をＤＮＡで処理した。処理にかかわらず、カルスを次いで２
．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを有する固体保持培地に移し戻し、暗所で２８℃に
おいて１６時間のインキュベーションを許した。後にカルスをＧＵＳアッセイ溶
液［０．２Ｍのリン酸ナトリウム ｐＨ８．０、それぞれ０．１ｍＭのフェリシ
アン酸カリウム及びフェロシアン酸カリウム、１．０ＭのナトリウムＥＤＴＡ、
０．５ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルク
ロニド及び０．６％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００］中に入れた。３７℃で
暗所において４８時間インキュベーションした後に、試料当たりの青い区画のカ
ウントとして定義されるＧＵＳ発現を測定し、それを表２にまとめる。
【００８２】
【表２】
【００８３】 ＧＵＳ発現は、カルスの存在下でホイスカーとＤＮＡの両方を撹拌した時のみ
に観察された。管当たりに５００ｍｇと比較して管当たりに２００ｍｇのカルス
を用いた時にわずかに高い過渡的ＧＵＳ発現が観察された。
に観察された。管当たりに５００ｍｇと比較して管当たりに２００ｍｇのカルス
を用いた時にわずかに高い過渡的ＧＵＳ発現が観察された。
【００８４】 種々のＤＮＡ濃度の影響を調べるために、種々の未成熟胚−由来系からのＩＩ
型カルスの約２００ｍｇの試料を１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２
０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ
）中に入れた。それぞれの中に、２５０μＬの液体保持培地、１０、２５又は５
０μＬのＤＮＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．
０μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３）及び４０ｍｇ／ｍＬの（ＳＣ−９）ホイスカ
ー懸濁液の５０μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用い
て２０秒間撹拌した。次いでカルスを半−固体保持培地に移し戻し、暗所で２８
℃において１６時間インキュベーションを許した。後にカルスを前に記載した通
りにＧＵＳ発現に関して検定し、表３に示す結果を得た。
型カルスの約２００ｍｇの試料を１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２
０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ
）中に入れた。それぞれの中に、２５０μＬの液体保持培地、１０、２５又は５
０μＬのＤＮＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．
０μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３）及び４０ｍｇ／ｍＬの（ＳＣ−９）ホイスカ
ー懸濁液の５０μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用い
て２０秒間撹拌した。次いでカルスを半−固体保持培地に移し戻し、暗所で２８
℃において１６時間インキュベーションを許した。後にカルスを前に記載した通
りにＧＵＳ発現に関して検定し、表３に示す結果を得た。
【００８５】
【表３】
【００８６】 約２００ｍｇのカルスを含有する管当たりに１０μｇもの少量のＤＮＡ（０．
０３２μｇ／μＬ）が過渡的ＧＵＳ発現を生じた。ＤＮＡの量の増加は過渡的Ｇ
ＵＳ発現を有意に増加させるとは思われない。
０３２μｇ／μＬ）が過渡的ＧＵＳ発現を生じた。ＤＮＡの量の増加は過渡的Ｇ
ＵＳ発現を有意に増加させるとは思われない。
【００８７】 種々の未成熟胚−由来系に相当するＩＩ型カルスの約５００ｍｇの試料を本明
細書に記載する通りに調製し、１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）
中に入れた。それぞれの中に、５００μＬの液体保持培地及び５０μＬのＤＮＡ
溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の０．５μｇ／μ
ＬのｐＤＡＢ４１８］を加えた。次いでカルス／ＤＮＡ混合物を室温で、又は氷
上で１時間インキュベーションした。負の標準としてカルスをＤＮＡの不在下で
インキュベーションした。後に４０μｇ／μＬの（ＳＣ−９）ホイスカー懸濁液
の５０μＬを加え、本明細書に記載する通りに渦動させた。次いで２．５ｇ／Ｌ
のＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させた保持培地にカルスを移し戻し、暗所で２８
℃において１６時間インキュベーションした。後に、カルスを前に記載した通り
にＧＵＳ発現に関して検定した。結果を表４にまとめる。
細書に記載する通りに調製し、１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）
中に入れた。それぞれの中に、５００μＬの液体保持培地及び５０μＬのＤＮＡ
溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の０．５μｇ／μ
ＬのｐＤＡＢ４１８］を加えた。次いでカルス／ＤＮＡ混合物を室温で、又は氷
上で１時間インキュベーションした。負の標準としてカルスをＤＮＡの不在下で
インキュベーションした。後に４０μｇ／μＬの（ＳＣ−９）ホイスカー懸濁液
の５０μＬを加え、本明細書に記載する通りに渦動させた。次いで２．５ｇ／Ｌ
のＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させた保持培地にカルスを移し戻し、暗所で２８
℃において１６時間インキュベーションした。後に、カルスを前に記載した通り
にＧＵＳ発現に関して検定した。結果を表４にまとめる。
【００８８】
【表４】
【００８９】 ホイスカー撹拌の前にＤＮＡと一緒にカルスをインキュベーションすると、特
に室温でインキュベーションした時に、より低い過渡的ＧＵＳ発現を生ずる。Ｄ
ＮＡをホイスカー処理の直前に加えた時に最も良い結果が観察された。
に室温でインキュベーションした時に、より低い過渡的ＧＵＳ発現を生ずる。Ｄ
ＮＡをホイスカー処理の直前に加えた時に最も良い結果が観察された。
【００９０】 種々の未成熟胚−由来系に相当するＩＩ型カルスの約２００ｍｇの試料を浸透
性培地［３６．４ｇ／Ｌのソルビトール及び３６．４ｇ／Ｌのマンニトールを含
有する保持培地］上に置き、４時間インキュベーションを許すか、あるいは保持
培地上に保った。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２
０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ
）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性培地又は液体保持培地のい
ずれか、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０中の１．０μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μｇ／μＬの（Ａｌ
ｆａ）ホイスカー懸濁液の５０μＬを加えた。各管を次いでＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅ
ｎｉｅ ２TMを用いて２０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて
固化させた浸透性培地又は保持培地にカルスを移し戻し、暗所で２８℃において
１６時間インキュベーションを許した。次いで前に記載した通りにカルスをＧＵ
Ｓ発現に関して調べた。結果を表５にまとめる。
性培地［３６．４ｇ／Ｌのソルビトール及び３６．４ｇ／Ｌのマンニトールを含
有する保持培地］上に置き、４時間インキュベーションを許すか、あるいは保持
培地上に保った。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２
０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ
）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性培地又は液体保持培地のい
ずれか、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０中の１．０μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μｇ／μＬの（Ａｌ
ｆａ）ホイスカー懸濁液の５０μＬを加えた。各管を次いでＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅ
ｎｉｅ ２TMを用いて２０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて
固化させた浸透性培地又は保持培地にカルスを移し戻し、暗所で２８℃において
１６時間インキュベーションを許した。次いで前に記載した通りにカルスをＧＵ
Ｓ発現に関して調べた。結果を表５にまとめる。
【００９１】
【表５】
【００９２】 ホイスカー撹拌の前に浸透的処理を含んだ培養において過渡的ＧＵＳ発現が最
も高かった。
も高かった。
【００９３】 種々の細胞系に相当するＩＩ型カルスの約２００ｍｇの試料を浸透性培地上に
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性
培地［ＧＥＬＲＩＴＥなし］、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＵＧＮ８１−３］及び２
５、５０もしくは１００μＬのいずれかの４０μｇ／μｌの（Ａｌｆａ）ホイス
カー懸濁液を加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて２
０秒間又は６０秒間撹拌した。次いでカルスを液体浸透性培地に移し戻し、暗所
で２８℃において１６時間インキュベーションを許し、次いで前に記載した通り
にＧＵＳ発現に関して検定した。結果を表６にまとめる。
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性
培地［ＧＥＬＲＩＴＥなし］、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＵＧＮ８１−３］及び２
５、５０もしくは１００μＬのいずれかの４０μｇ／μｌの（Ａｌｆａ）ホイス
カー懸濁液を加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて２
０秒間又は６０秒間撹拌した。次いでカルスを液体浸透性培地に移し戻し、暗所
で２８℃において１６時間インキュベーションを許し、次いで前に記載した通り
にＧＵＳ発現に関して検定した。結果を表６にまとめる。
【００９４】
【表６】
【００９５】 すべてのホイスカー量に及んで平均すると、２０秒間に比べて６０秒間の撹拌
の後に最高のＧＵＳ発現が観察された。しかしながら６０秒間の撹拌はカルスに
実質的に損傷を与えると思われる。１００μＬのホイスカー懸濁液を用いた場合
にも高いＧＵＳ発現が観察された（管当たりに４ｍｇのホイスカー）。我々のデ
ータは、ホイスカー量の増加が撹拌時間を補うことができ、その逆もできること
を示している。最も好ましい条件は、２０秒間渦動される１００μＬのホイスカ
ーであった。
の後に最高のＧＵＳ発現が観察された。しかしながら６０秒間の撹拌はカルスに
実質的に損傷を与えると思われる。１００μＬのホイスカー懸濁液を用いた場合
にも高いＧＵＳ発現が観察された（管当たりに４ｍｇのホイスカー）。我々のデ
ータは、ホイスカー量の増加が撹拌時間を補うことができ、その逆もできること
を示している。最も好ましい条件は、２０秒間渦動される１００μＬのホイスカ
ーであった。
【００９６】 種々の細胞系に相当するＩＩ型カルスの約５００ｍｇの試料を浸透性培地上に
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、それぞれの中に１０００μＬの液体浸透
性培地、２７．７μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ８．０中の０．７２μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３］及びＳｉｌａｒ ＳＣ
−９（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣ）又はＡｌｆ
ａ Ａｅｓａｒ（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ
）ホイスカーを用いている４０μｇ／μｌのホイスカー懸濁液の２００μＬを加
えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて２０秒間撹拌し、
２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化された浸透性培地にカルスを移し戻
し、２８℃において１６時間インキュベーションを許した。、後に、前に記載し
た通りにＧＵＳ発現に関してカルスを検定し、表７にまとめる結果を得た。
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、それぞれの中に１０００μＬの液体浸透
性培地、２７．７μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ８．０中の０．７２μｇ／μＬのｐＵＧＮ８１−３］及びＳｉｌａｒ ＳＣ
−９（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣ）又はＡｌｆ
ａ Ａｅｓａｒ（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ
）ホイスカーを用いている４０μｇ／μｌのホイスカー懸濁液の２００μＬを加
えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて２０秒間撹拌し、
２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化された浸透性培地にカルスを移し戻
し、２８℃において１６時間インキュベーションを許した。、後に、前に記載し
た通りにＧＵＳ発現に関してカルスを検定し、表７にまとめる結果を得た。
【００９７】
【表７】
【００９８】 両方とも働くが、Ａｌｆａ ＡｅｓａｒホイスカーよりＳｉｌａｒ ＳＣ−９
ホイスカーを用いて、より良い過渡的ＧＵＳ発現が観察された。
ホイスカーを用いて、より良い過渡的ＧＵＳ発現が観察された。
【００９９】 種々の細胞系に相当するＩＩ型カルスの約５００ｍｇの試料を浸透性培地上に
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中、又は１５ｍＬの円錐遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ
２５３１９−１５，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に入れた。それぞれの中に１００
０μＬの液体浸透性培地、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μ
ｇ／μｌのホイスカー懸濁液の２００μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ
−Ｇｅｎｉｅ又はＣａｕｌｋ Ｖａｒｉ−Ｍｉｘ ＩＩ［Ｅｓｔｒａｄａ Ｄｅ
ｎｔａｌ，Ｒａｎｃｈｏ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）を用いて２０秒間撹拌し
た。次いで固体浸透性培地にカルスを移し戻し、１６時間インキュベーションを
許し、次いで前に記載した通りにＧＵＳ活性（表８）に関して検定した。Ｖｏｒ
ｔｅｘ及びＶａｒｉ−Ｍｉｘの両方を用いる撹拌の後に高いレベルの過渡的ＧＵ
Ｓ発現が観察された；しかしながら、渦動のほうがいくらか良いと思われる。
置き、４時間インキュベーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの
培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中、又は１５ｍＬの円錐遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ
２５３１９−１５，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に入れた。それぞれの中に１００
０μＬの液体浸透性培地、２０μＬのＤＮＡ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０ｍｇ／ｍＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μ
ｇ／μｌのホイスカー懸濁液の２００μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ
−Ｇｅｎｉｅ又はＣａｕｌｋ Ｖａｒｉ−Ｍｉｘ ＩＩ［Ｅｓｔｒａｄａ Ｄｅ
ｎｔａｌ，Ｒａｎｃｈｏ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）を用いて２０秒間撹拌し
た。次いで固体浸透性培地にカルスを移し戻し、１６時間インキュベーションを
許し、次いで前に記載した通りにＧＵＳ活性（表８）に関して検定した。Ｖｏｒ
ｔｅｘ及びＶａｒｉ−Ｍｉｘの両方を用いる撹拌の後に高いレベルの過渡的ＧＵ
Ｓ発現が観察された；しかしながら、渦動のほうがいくらか良いと思われる。
【０１００】
【表８】
【０１０１】 実施例５ 安定に形質転換された形質転換トウモロコシ植物の生産及び再生 ＩＩ型カルスの約２００ｍｇの試料を浸透性培地上に置き、４時間インキュベ
ーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ
２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，Ｎ
Ｊ）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性培地、２０μＬのＤＮＡ
溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０μｇ／μ
ＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μｇ／μｌの（Ａｌｆａ）ホイスカー懸濁液の
１００μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TNを用いて２
０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化された浸透性培地に
カルスを移し戻し、約４８時間回復させてから選択した。
ーションを許した。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍの培養管（Ｆａｌｃｏｎ
２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，Ｎ
Ｊ）中に入れ、それぞれの中に２００μＬの液体浸透性培地、２０μＬのＤＮＡ
溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０μｇ／μ
ＬのｐＵＧＮ８１−３］及び４０μｇ／μｌの（Ａｌｆａ）ホイスカー懸濁液の
１００μＬを加えた。次いで各管をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TNを用いて２
０秒間撹拌し、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化された浸透性培地に
カルスを移し戻し、約４８時間回復させてから選択した。
【０１０２】 ホイスカー−処理されたカルスを選択培地［３０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａTM（Ｈ
ｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を有し、酵素的カゼイン
加水分解産物もしくはＬ−プロリンを含まない保持培地］上に置き、約３〜４カ
月の間、４週間毎に新しい選択培地に転移させた。１０〜２０週間後、活発に成
長するコロニーを単離し、２週間毎に新しい選択培地上で継代培養してカルスを
増量してから再生させた。
ｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を有し、酵素的カゼイン
加水分解産物もしくはＬ−プロリンを含まない保持培地］上に置き、約３〜４カ
月の間、４週間毎に新しい選択培地に転移させた。１０〜２０週間後、活発に成
長するコロニーを単離し、２週間毎に新しい選択培地上で継代培養してカルスを
増量してから再生させた。
【０１０３】 植物再生のために、カルスを下記に示す誘導培地に転移させ、２８℃において
弱光（１３ｍＥ／ｍ2／秒）中の１６時間／８時間の明／暗光周期で１週間イン
キュベーションし、続いて２８℃で冷白蛍光ランプ（ｃｏｏｌ ｗｈｉｔｅ ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｍｐｓ）により与えられる強光（４０ｍＥ／ｍ2／
秒）中の１６時間／８時間明暗光周期において１週間インキュベーションした。
誘導培地はＭＳ塩及びビタミン（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１
９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７）、３０ｇ／Ｌの
スクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミ
ノプリン、０．０２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを
含み、ｐＨ５．７に調整された。この２週間の誘導期に続き、カルスを再生培地
に転移させ、強光（４０ｍＥ／ｍ2／秒）中で２８℃においてインキュベーショ
ンした。再生培地はＭＳ塩及びビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース及び２．５ｇ
／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを含み、ｐＨ５．７に調整された。苗木が現れるまで約２
週間毎にカルスを新しい再生培地に継代培養した。誘導培地及び再生培地の両方
とも３０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａTMを含有した。苗木を約０．１ｋｇの乾燥Ｍｅｔ
ｒｏ−Ｍｉｘ ３６０（Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｓ Ｃｏ，Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，
ＯＨ）を含有する１０ｃｍの鉢に移し、温室内に置き、十分に水を与え、２〜４
日間透明プラスチックカップで覆った。３〜５葉段階に植物を土壌を含有する５
−ガロンの鉢に移し、成長させて成木とした。
弱光（１３ｍＥ／ｍ2／秒）中の１６時間／８時間の明／暗光周期で１週間イン
キュベーションし、続いて２８℃で冷白蛍光ランプ（ｃｏｏｌ ｗｈｉｔｅ ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｍｐｓ）により与えられる強光（４０ｍＥ／ｍ2／
秒）中の１６時間／８時間明暗光周期において１週間インキュベーションした。
誘導培地はＭＳ塩及びビタミン（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１
９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７）、３０ｇ／Ｌの
スクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミ
ノプリン、０．０２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを
含み、ｐＨ５．７に調整された。この２週間の誘導期に続き、カルスを再生培地
に転移させ、強光（４０ｍＥ／ｍ2／秒）中で２８℃においてインキュベーショ
ンした。再生培地はＭＳ塩及びビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース及び２．５ｇ
／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを含み、ｐＨ５．７に調整された。苗木が現れるまで約２
週間毎にカルスを新しい再生培地に継代培養した。誘導培地及び再生培地の両方
とも３０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａTMを含有した。苗木を約０．１ｋｇの乾燥Ｍｅｔ
ｒｏ−Ｍｉｘ ３６０（Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｓ Ｃｏ，Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，
ＯＨ）を含有する１０ｃｍの鉢に移し、温室内に置き、十分に水を与え、２〜４
日間透明プラスチックカップで覆った。３〜５葉段階に植物を土壌を含有する５
−ガロンの鉢に移し、成長させて成木とした。
【０１０４】 実施例６ 形質転換されたカルス及び植物組織のサザン分析 ＢＡＳＴＡ耐性系を、問題の遺伝子のコード領域に関して特異的なＤＮＡプロ
ーブを用いるサザン分析により特性化し、形質転換遺伝子の存在を確証した。カ
ルス及び葉の材料の両方からのＤＮＡを分析した。
ーブを用いるサザン分析により特性化し、形質転換遺伝子の存在を確証した。カ
ルス及び葉の材料の両方からのＤＮＡを分析した。
【０１０５】 カルスの場合、材料を蒸留水中に３０分間浸し、新しいペトリ皿に移してから
凍結乾燥した。植物からの葉の材料は６〜８葉段階に収穫された。Ｓａｇｈａｉ
−Ｍａｒｏｏｆ ｅｔ．ａｌ．（（１９８４） Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：８０１４−８０１８）により記載されている通り
に、凍結乾燥された組織からゲノムＤＮＡを調製した。８μｇの各ＤＮＡを、各
プラスミド構築物に関して特異的な制限酵素を用い、製造者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により示唆されている
条件を用いて消化し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。次
いでＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎ（（１９７５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８
：５０３−５１７）により記載されている通りにナイロン膜上にブロッティング
した。Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、５０ｍＣｉの［ａ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ
ｔｓ，ＩＬ）を用いてＧＵＳコード領域に関して特異的な１．９ｋｂのＤＮＡプ
ローブを調製した。次いで放射性プローブを４５ｍＬの最小ハイブリッド形成緩
衝液［１０％ ポリエチレングリコール、７％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、０．６ｘ ＳＳＣ、ここで１Ｘ ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０
１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び１００μｇ／ｍＬ 変性サケ精子ＤＮＡ］中で、ブロット上の
ゲノムＤＮＡに、６０℃において終夜ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形
成の後、ブロットを０．２５Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳ中で６０℃におい
て４５分間洗浄し、乾燥ブロッティングし（ｂｌｏｔｔｅｄ ｄｒｙ）、ＸＡＲ
−５フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２つの強化スクリー
ン（ＤｕＰｏｎｔ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）上で終夜露出した。
凍結乾燥した。植物からの葉の材料は６〜８葉段階に収穫された。Ｓａｇｈａｉ
−Ｍａｒｏｏｆ ｅｔ．ａｌ．（（１９８４） Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：８０１４−８０１８）により記載されている通り
に、凍結乾燥された組織からゲノムＤＮＡを調製した。８μｇの各ＤＮＡを、各
プラスミド構築物に関して特異的な制限酵素を用い、製造者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により示唆されている
条件を用いて消化し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。次
いでＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎ（（１９７５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８
：５０３−５１７）により記載されている通りにナイロン膜上にブロッティング
した。Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、５０ｍＣｉの［ａ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ
ｔｓ，ＩＬ）を用いてＧＵＳコード領域に関して特異的な１．９ｋｂのＤＮＡプ
ローブを調製した。次いで放射性プローブを４５ｍＬの最小ハイブリッド形成緩
衝液［１０％ ポリエチレングリコール、７％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、０．６ｘ ＳＳＣ、ここで１Ｘ ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０
１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び１００μｇ／ｍＬ 変性サケ精子ＤＮＡ］中で、ブロット上の
ゲノムＤＮＡに、６０℃において終夜ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形
成の後、ブロットを０．２５Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳ中で６０℃におい
て４５分間洗浄し、乾燥ブロッティングし（ｂｌｏｔｔｅｄ ｄｒｙ）、ＸＡＲ
−５フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２つの強化スクリー
ン（ＤｕＰｏｎｔ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）上で終夜露出した。
【０１０６】 形質転換カルス系から再生した植物をサザン分析を介して調べ、すべてが４．
２ｋｂのハイブリッド形成産物を有することがわかった。ハイブリッド形成産物
はユビキチン−１ プロモーター／イントロン、ＧＵＳコード配列及びｎｏｓ
３’非翻訳領域を含有することが予想された。１つの与えられた培養から再生し
たそれぞれの植物はすべて同じハイブリッド形成パターンを示した。
２ｋｂのハイブリッド形成産物を有することがわかった。ハイブリッド形成産物
はユビキチン−１ プロモーター／イントロン、ＧＵＳコード配列及びｎｏｓ
３’非翻訳領域を含有することが予想された。１つの与えられた培養から再生し
たそれぞれの植物はすべて同じハイブリッド形成パターンを示した。
【０１０７】 実施例７ 胚形成性Ｉ型イネカルス組織の確立 イネ胚形成性Ｉ型カルス培養のイニシェーションのために、オリザ・サチバ
Ｌ．ｃｖ．ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）、タイペイ（Ｔａｉｐｅｉ） ３０
９の成熟種子を脱穀し、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中で２〜５分間表面−殺
菌し、続いて数滴のＬＩＱＵＩ−ＮＯＸ（Ａｌｃｏｎｏｘ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含有する５０％（ｖ／ｖ）市販漂白剤中に３０〜４５分間浸
した。次いで種子を無菌Ｈ2Ｏ中で３回濯ぎ、濾紙上に置いてから誘導培地［Ｎ
６ 多量栄養素（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｐｒｅｓｓ，ｐ ４３−５６）、Ｂ５
微量栄養素及びビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｅｘｐ
．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８）、３００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水
分解産物、５００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、５００ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、
３０ｇ／Ｌ スクロース、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ及び２．５ｇ／Ｌ ＧＥＬＲ
ＩＴＥ、ｐＨ５．８］に移した。種子を誘導培地上で培養し、暗所で２８℃にお
いて３週間インキュベーションした。後に、小盾板領域に由来する発芽初代カル
スをさらなる保持のために新鮮な誘導培地に転移させた。一般に胚性（ｅｍｂｒ
ｙｏｎｉｃ）カルスは、それぞれの継代培養の後にその形態に基づいて選択され
た。イネＩ型胚形成性カルスの一般的形態は、堅く、密集した節状構造として現
れ、胚−様に見え、そしていくつかの場合には見えなかった。この材料はＩ型と
呼ばれた。
Ｌ．ｃｖ．ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）、タイペイ（Ｔａｉｐｅｉ） ３０
９の成熟種子を脱穀し、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中で２〜５分間表面−殺
菌し、続いて数滴のＬＩＱＵＩ−ＮＯＸ（Ａｌｃｏｎｏｘ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含有する５０％（ｖ／ｖ）市販漂白剤中に３０〜４５分間浸
した。次いで種子を無菌Ｈ2Ｏ中で３回濯ぎ、濾紙上に置いてから誘導培地［Ｎ
６ 多量栄養素（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｐｒｅｓｓ，ｐ ４３−５６）、Ｂ５
微量栄養素及びビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｅｘｐ
．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８）、３００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水
分解産物、５００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、５００ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、
３０ｇ／Ｌ スクロース、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ及び２．５ｇ／Ｌ ＧＥＬＲ
ＩＴＥ、ｐＨ５．８］に移した。種子を誘導培地上で培養し、暗所で２８℃にお
いて３週間インキュベーションした。後に、小盾板領域に由来する発芽初代カル
スをさらなる保持のために新鮮な誘導培地に転移させた。一般に胚性（ｅｍｂｒ
ｙｏｎｉｃ）カルスは、それぞれの継代培養の後にその形態に基づいて選択され
た。イネＩ型胚形成性カルスの一般的形態は、堅く、密集した節状構造として現
れ、胚−様に見え、そしていくつかの場合には見えなかった。この材料はＩ型と
呼ばれた。
【０１０８】 実施例８ ホイスカー調製、最適化及びイネＩ型カルス形質転換 ＤＮＡ送達の直前に、炭化ケイ素ホイスカー（Ｓｉｌａｒ ＳＣ−９）の無菌
の５０μｇ／μＬ懸濁液を前に記載した通りに水中で調製した。４月令未満の約
１２５〜５００ｍｇのＩ型イネ胚形成性カルスを選択し、約２５０μＬの液体イ
ニシェーション培地（ＧＥＬＲＩＴＥを含まないイニシェーション培地）が加え
られている１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ円錐遠心管又は１．５ｍＬの微量遠心管中
に移した。次いで、可能な最高速度でＶｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて
１５〜１２０秒間渦動させる直前に、５０μｇ／μＬのホイスカー溶液の約１０
〜１６０μＬを１μｇ／μＬのｐＤＡＢ４１８ ＤＮＡ溶液の２５μＬと一緒に
加えた。後にカルスを高浸透物質［０．２Ｍ マンニトール及び０．２Ｍ ソル
ビトール；Ｖａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ
．１２：８４−８８］を含む、及び含まないイニシェーション培地に移し、暗所
で２８℃において約２４時間インキュベーションしてからＧＵＳ活性に関して調
べた。
の５０μｇ／μＬ懸濁液を前に記載した通りに水中で調製した。４月令未満の約
１２５〜５００ｍｇのＩ型イネ胚形成性カルスを選択し、約２５０μＬの液体イ
ニシェーション培地（ＧＥＬＲＩＴＥを含まないイニシェーション培地）が加え
られている１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ円錐遠心管又は１．５ｍＬの微量遠心管中
に移した。次いで、可能な最高速度でＶｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２TMを用いて
１５〜１２０秒間渦動させる直前に、５０μｇ／μＬのホイスカー溶液の約１０
〜１６０μＬを１μｇ／μＬのｐＤＡＢ４１８ ＤＮＡ溶液の２５μＬと一緒に
加えた。後にカルスを高浸透物質［０．２Ｍ マンニトール及び０．２Ｍ ソル
ビトール；Ｖａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ
．１２：８４−８８］を含む、及び含まないイニシェーション培地に移し、暗所
で２８℃において約２４時間インキュベーションしてからＧＵＳ活性に関して調
べた。
【０１０９】 Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ ６：３９０
１−３９０７）に従って、そして本明細書に記載する通りに、ＧＵＳ組織化学的
アッセイを行った。ウェル当たりに５００μＬのアッセイ緩衝液を含有する２４
−ウェル ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ
）中に組織を入れた。アッセイ緩衝液は０．２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ フェリシアン酸カリウム、０．１ｍＭフェロシアン酸カリウ
ム、１．０Ｍ ナトリウムＥＤＴＡ、１．９ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド及び０．０６％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０から成った。プレートを暗所で３７℃において１〜２日間インキュベーション
してから組織を発現に関して顕微鏡で調べた。炭化ケイ素ホイスカー−媒介ＤＮ
Ａ送達をＧＵＳ過渡的発現、すなわち試料当たりのＧＵＳ発現単位（青い点）に
よって測定した。
１−３９０７）に従って、そして本明細書に記載する通りに、ＧＵＳ組織化学的
アッセイを行った。ウェル当たりに５００μＬのアッセイ緩衝液を含有する２４
−ウェル ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ
）中に組織を入れた。アッセイ緩衝液は０．２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ フェリシアン酸カリウム、０．１ｍＭフェロシアン酸カリウ
ム、１．０Ｍ ナトリウムＥＤＴＡ、１．９ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド及び０．０６％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０から成った。プレートを暗所で３７℃において１〜２日間インキュベーション
してから組織を発現に関して顕微鏡で調べた。炭化ケイ素ホイスカー−媒介ＤＮ
Ａ送達をＧＵＳ過渡的発現、すなわち試料当たりのＧＵＳ発現単位（青い点）に
よって測定した。
【０１１０】 多様な形質転換パラメーターを調べて形質転換に必要な最適条件を決定した。
調べたパラメーターのいくつかは：渦動時間、加えられる５０μｇ／μＬホイス
カー溶液の量、ホイスカー処理の前及び／又は後の高浸透物質を用いる処理、形
質転換当たりに用いられる組織の量ならびの容器の寸法を含んだ。これらの実験
のすべてにおいて、本明細書に記載する案は、他のように言及しなければ本質的
に同じであった。
調べたパラメーターのいくつかは：渦動時間、加えられる５０μｇ／μＬホイス
カー溶液の量、ホイスカー処理の前及び／又は後の高浸透物質を用いる処理、形
質転換当たりに用いられる組織の量ならびの容器の寸法を含んだ。これらの実験
のすべてにおいて、本明細書に記載する案は、他のように言及しなければ本質的
に同じであった。
【０１１１】 渦動時間（１５〜６０秒）の影響をイネ胚形成性Ｉ型カルス中へのＤＮＡ送達
に関して研究した。この実験では、ホイスカーを用いる形質転換の前に約４時間
、及びホイスカー処理の後に約１６時間、カルスを高浸透物質を用いて処理した
。２５０ｍｇのカルスを１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ 円錐遠心管中に入れ、１０
００μＬの液体イニシェーション培地、１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４
１８）の２５μＬ及び５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液の１００μＬを加えるこ
とにより、カルスを形質転換した。複数の試料の組を１５−、３０−、６０−及
び１２０秒間渦動させ、表９に示す通りに結果を定量した。
に関して研究した。この実験では、ホイスカーを用いる形質転換の前に約４時間
、及びホイスカー処理の後に約１６時間、カルスを高浸透物質を用いて処理した
。２５０ｍｇのカルスを１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ 円錐遠心管中に入れ、１０
００μＬの液体イニシェーション培地、１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４
１８）の２５μＬ及び５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液の１００μＬを加えるこ
とにより、カルスを形質転換した。複数の試料の組を１５−、３０−、６０−及
び１２０秒間渦動させ、表９に示す通りに結果を定量した。
【０１１２】
【表９】
【０１１３】 わかる通り、イネＩ型胚形成性カルスの堅くて密集した形態にかかわらず、１
５秒という短時間の渦動の場合にＤＮＡ送達及びカルス形質転換が可能であった
。
５秒という短時間の渦動の場合にＤＮＡ送達及びカルス形質転換が可能であった
。
【０１１４】 液体イニシェーション培地の一定の容積（１０００μＬ）を保ちながら、加え
られるホイスカーの量の変動の影響を調べた。カルス試料をホイスカー−媒介形
質転換の前及び後に高浸透物質で処理した。約２５０ｍｇのカルス組織を選択し
、１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ円錐遠心管に移し、それにＧＥＬＲＩＴＥを含まな
い１，０００μＬの液体イニシェーション培地を加えた。Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎ
ｉｅ ２TMを用いて６０秒間渦動させる前に、種々の量の５０μｇ／μＬのホイ
スカー溶液（１０、２０、４０、８０及び１６０μＬ）を１μｇ／μＬのＤＮＡ
溶液（ｐＤＡＢ４１８）の２５μＬと一緒に加えた。次いで試料を高浸透物質を
含むイニシェーション培地上に終夜移し戻してから組織化学的ＧＵＳアッセイを
行った。結果を表１０に記載する。ＧＵＳ発現は、加えられるホイスカーの存在
量の増加と相関することがわかった。
られるホイスカーの量の変動の影響を調べた。カルス試料をホイスカー−媒介形
質転換の前及び後に高浸透物質で処理した。約２５０ｍｇのカルス組織を選択し
、１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ円錐遠心管に移し、それにＧＥＬＲＩＴＥを含まな
い１，０００μＬの液体イニシェーション培地を加えた。Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎ
ｉｅ ２TMを用いて６０秒間渦動させる前に、種々の量の５０μｇ／μＬのホイ
スカー溶液（１０、２０、４０、８０及び１６０μＬ）を１μｇ／μＬのＤＮＡ
溶液（ｐＤＡＢ４１８）の２５μＬと一緒に加えた。次いで試料を高浸透物質を
含むイニシェーション培地上に終夜移し戻してから組織化学的ＧＵＳアッセイを
行った。結果を表１０に記載する。ＧＵＳ発現は、加えられるホイスカーの存在
量の増加と相関することがわかった。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】 形質転換効率への高浸透物質の影響を研究し、表１１にまとめる結果を得た。
この実験では、カルス組織を高浸透物質処理に供しないか、又はホイスカー−媒
介形質転換の後に高浸透物質処理に供した。約２５０ｍｇのカルス組織を１．５
ｍＬの微量遠心管に移した。約２５０μＬの液体イニシェーション培地を加え、
続いて１２５μＬの５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液及び２５μＬの１μｇ／μ
Ｌ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４１８）を加えた。試料を６０秒間渦動させ、高浸透
物質を含む、又は含まないイニシェーション培地上に終夜移し戻してからＧＵＳ
アッセイを行った。
この実験では、カルス組織を高浸透物質処理に供しないか、又はホイスカー−媒
介形質転換の後に高浸透物質処理に供した。約２５０ｍｇのカルス組織を１．５
ｍＬの微量遠心管に移した。約２５０μＬの液体イニシェーション培地を加え、
続いて１２５μＬの５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液及び２５μＬの１μｇ／μ
Ｌ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４１８）を加えた。試料を６０秒間渦動させ、高浸透
物質を含む、又は含まないイニシェーション培地上に終夜移し戻してからＧＵＳ
アッセイを行った。
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】 ホイスカー形質転換後に高浸透物質処理をされないカルス組織は、高浸透物質
処理を行った場合の発現レベルと比較して、より高い発現レベルを生じた。
処理を行った場合の発現レベルと比較して、より高い発現レベルを生じた。
【０１１９】 加えられるカルス組織の量及び用いられる容器寸法（１．５ｍＬの微量遠心管
対２．０ｍＬの微量遠心管）を研究した。この実験では、液体イニシェーション
培地の一定の容積、すなわち２５０μＬを保ちながら、１２５又は２５０ｍｇの
カルス組織を用いた。すべての場合に、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２TMを用い
て６０秒間渦動させる前に１２５μＬの５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液を２５
μＬの１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４１８）と一緒に加えた。形質転換
に続き、カルス試料を高浸透物質を含むイニシェーション培地上で終夜インキュ
ベーションしてからＧＵＳアッセイを行った。結果を表１２にまとめる。
対２．０ｍＬの微量遠心管）を研究した。この実験では、液体イニシェーション
培地の一定の容積、すなわち２５０μＬを保ちながら、１２５又は２５０ｍｇの
カルス組織を用いた。すべての場合に、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２TMを用い
て６０秒間渦動させる前に１２５μＬの５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液を２５
μＬの１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（ｐＤＡＢ４１８）と一緒に加えた。形質転換
に続き、カルス試料を高浸透物質を含むイニシェーション培地上で終夜インキュ
ベーションしてからＧＵＳアッセイを行った。結果を表１２にまとめる。
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】 １．５ｍＬの微量遠心管及び管当たりの２５０ｍｇのカルス組織の使用が最も
高い過渡的発現を生じた。
高い過渡的発現を生じた。
【０１２２】 実施例９ ｐＵｂｉＨｙｇに関するプラスミドの記述 イネ発現ベクター、ｐＵｂｉＨｙｇは、Ｇｒｉｔｚ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，
（１９８３） Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８に記載されている通りハイグロ
マイシン Ｂ ホスホトランスフェラーゼ（耐性）遺伝子を駆動するユビキチン
遺伝子（Ｕｂｉ１）調節要素からのトウモロコシ ユビキチン プロモーター及
び第１イントロンを含有した。プラスミドｐＵｂｉＨｙｇは時計回りの順序で以
下の配列を含む５９９１塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレ
オチド１〜４２は配列ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴ ＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴ ＣＴＧＣ
ＧＧＣＣＧＣ ＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣ ＧＧを有した。ｐＵｂｉＨｙｇのヌクレ
オチド４３〜２０３４はトウモロコシ ユビキチン プロモーター及び第１イン
トロンであり、トウモロコシ遺伝子型 Ｂ７３（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８
９）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された。ｐＵｂｉＨｙｇのヌクレオチド２０
３５〜２０５２は配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧ ＧＧＴＡＧＡＣＣを有した。ｐＵ
ｂｉＨｙｇのヌクレオチド２０５３〜３０７８はハイグロマイシン Ｂ ホスホ
トランスフェラーゼ（耐性）遺伝子配列（受け入れ番号 Ｋ０１１９３）のヌク
レオチド２１１〜１２３６に対応し、将来のクローニングを容易にするためにｐ
ＵｂｉＨｙｇの塩基２０５６及び２０５７がＡＡからＧＴに改変された。塩基３
０７９〜３０９７はリンカーＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧ ＡＡＴＴＴＣＣＣＣから成
った。塩基３０９８〜３３５１はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド４４３０〜４６８３に対応した。ｐ
ＵｂｉＨｙｇの残りの配列（ヌクレオチド３３５２〜５９９１）はプラスミド
バックボーン（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｇ
ｅｎｅ ３３：１０３−１１９）からのヌクレオチドに対応した。
（１９８３） Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８に記載されている通りハイグロ
マイシン Ｂ ホスホトランスフェラーゼ（耐性）遺伝子を駆動するユビキチン
遺伝子（Ｕｂｉ１）調節要素からのトウモロコシ ユビキチン プロモーター及
び第１イントロンを含有した。プラスミドｐＵｂｉＨｙｇは時計回りの順序で以
下の配列を含む５９９１塩基対の２本鎖植物形質転換ベクターであった。ヌクレ
オチド１〜４２は配列ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴ ＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴ ＣＴＧＣ
ＧＧＣＣＧＣ ＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣ ＧＧを有した。ｐＵｂｉＨｙｇのヌクレ
オチド４３〜２０３４はトウモロコシ ユビキチン プロモーター及び第１イン
トロンであり、トウモロコシ遺伝子型 Ｂ７３（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８
９）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された。ｐＵｂｉＨｙｇのヌクレオチド２０
３５〜２０５２は配列ＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧ ＧＧＴＡＧＡＣＣを有した。ｐＵ
ｂｉＨｙｇのヌクレオチド２０５３〜３０７８はハイグロマイシン Ｂ ホスホ
トランスフェラーゼ（耐性）遺伝子配列（受け入れ番号 Ｋ０１１９３）のヌク
レオチド２１１〜１２３６に対応し、将来のクローニングを容易にするためにｐ
ＵｂｉＨｙｇの塩基２０５６及び２０５７がＡＡからＧＴに改変された。塩基３
０７９〜３０９７はリンカーＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧ ＡＡＴＴＴＣＣＣＣから成
った。塩基３０９８〜３３５１はプラスミドｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヌクレオチド４４３０〜４６８３に対応した。ｐ
ＵｂｉＨｙｇの残りの配列（ヌクレオチド３３５２〜５９９１）はプラスミド
バックボーン（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｇ
ｅｎｅ ３３：１０３−１１９）からのヌクレオチドに対応した。
【０１２３】 実施例１０ 安定に形質転換されたイネＩ型カルス組織の生産及び形質転換植物の再生 安定なイネ形質転換植物の生産のために、本明細書に記載する通りにイネＩ型
カルス組織を作り、ホイスカー−媒介形質転換に供した。典型的には、２５０ｍ
ｇのイネＩ型カルスを、４時間の高浸透物質処理を行って、又は行わずに、１．
５微量遠心管に加えた。２５０μＬの液体イニシェーション培地、１２５μＬの
５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液及び２５μＬの１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（１
：１の比率におけるｐＤＡＢ ３０５及びＵｂｉＨｙｇ）も加えた。前に記載し
た通りに渦動を６０秒間行い、ＤＮＡ送達を確実にした。ホイスカー−媒介ＤＮ
Ａ送達に続き、カルスを前に記載した通りにイニシェーション培地に移し、２４
時間の高浸透物質処理の後に選択培地に移した。選択培地は３０ｍｇ／Ｌのハイ
グロマイシンを有するイニシェーション培地（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａ
ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から成っ
た。２週間後、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを有する新しい選択培地（Ｌｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：２５０−２
５５）に培養を移した。選択培地上に培養を置くと、３０〜４５日後に、密集し
た白−黄色の胚形成性カルス培養が形成された。これらの培養を次いで５０ｍｇ
／Ｌのハイグロマイシンを有する再生−前（ｐｒｅ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
）（ＰＲ）培地に移し、暗所において２８℃に保った。ＰＲ培地は２ｍｇ／Ｌの
ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び
５ｍｇ／Ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）を有するイニシェーション培地から成った
。２週間後、培養を次いで再生（ＲＮ）培地に移し、ここでＲＮ培地は３ｍｇ／
ＬのＢＡＰ及び０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡを有するイニシェーション培地であった
。ＲＮ培地上の培養を、２８℃において高い蛍光灯（３２５−フィート−キャン
ドル）の下で、苗木が発芽するまでインキュベーションした。苗木の苗条が約２
ｃｍに達したら、水を用いて１：１に希釈されたＢ５ ビタミンと一緒のＭＳ
多量及び微量栄養素（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８）、１０ｇ／Ｌのスクロース、０．０５ｍ
ｇ／ＬのＮＡＡ、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩ
ＴＥから成り、ｐＨ５．８に調整された培地を含有するＭａｇｅｎｔａ ＧＡ７
ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）にそれを移し
た。苗木に十分に発育した根系が確立されたら、土壌／ｍｅｔｒｏｍｉｘ ３６
０（１：１）にそれを移し、温室（２９o／２４℃ 昼／夜サイクル、５０〜６
０％湿度、１２時間の光周期）中で成木となるまで育てた。これらの植物のサザ
ン分析はハイグロマイシン遺伝子の存在を明らかにし、それらが実際に形質転換
されたことを示した。これらの植物を温室内で成木まで成長させることに成功し
た。
カルス組織を作り、ホイスカー−媒介形質転換に供した。典型的には、２５０ｍ
ｇのイネＩ型カルスを、４時間の高浸透物質処理を行って、又は行わずに、１．
５微量遠心管に加えた。２５０μＬの液体イニシェーション培地、１２５μＬの
５０μｇ／μＬ ホイスカー溶液及び２５μＬの１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（１
：１の比率におけるｐＤＡＢ ３０５及びＵｂｉＨｙｇ）も加えた。前に記載し
た通りに渦動を６０秒間行い、ＤＮＡ送達を確実にした。ホイスカー−媒介ＤＮ
Ａ送達に続き、カルスを前に記載した通りにイニシェーション培地に移し、２４
時間の高浸透物質処理の後に選択培地に移した。選択培地は３０ｍｇ／Ｌのハイ
グロマイシンを有するイニシェーション培地（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａ
ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から成っ
た。２週間後、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを有する新しい選択培地（Ｌｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：２５０−２
５５）に培養を移した。選択培地上に培養を置くと、３０〜４５日後に、密集し
た白−黄色の胚形成性カルス培養が形成された。これらの培養を次いで５０ｍｇ
／Ｌのハイグロマイシンを有する再生−前（ｐｒｅ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
）（ＰＲ）培地に移し、暗所において２８℃に保った。ＰＲ培地は２ｍｇ／Ｌの
ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び
５ｍｇ／Ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）を有するイニシェーション培地から成った
。２週間後、培養を次いで再生（ＲＮ）培地に移し、ここでＲＮ培地は３ｍｇ／
ＬのＢＡＰ及び０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡを有するイニシェーション培地であった
。ＲＮ培地上の培養を、２８℃において高い蛍光灯（３２５−フィート−キャン
ドル）の下で、苗木が発芽するまでインキュベーションした。苗木の苗条が約２
ｃｍに達したら、水を用いて１：１に希釈されたＢ５ ビタミンと一緒のＭＳ
多量及び微量栄養素（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８）、１０ｇ／Ｌのスクロース、０．０５ｍ
ｇ／ＬのＮＡＡ、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン、２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩ
ＴＥから成り、ｐＨ５．８に調整された培地を含有するＭａｇｅｎｔａ ＧＡ７
ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）にそれを移し
た。苗木に十分に発育した根系が確立されたら、土壌／ｍｅｔｒｏｍｉｘ ３６
０（１：１）にそれを移し、温室（２９o／２４℃ 昼／夜サイクル、５０〜６
０％湿度、１２時間の光周期）中で成木となるまで育てた。これらの植物のサザ
ン分析はハイグロマイシン遺伝子の存在を明らかにし、それらが実際に形質転換
されたことを示した。これらの植物を温室内で成木まで成長させることに成功し
た。
【０１２４】 実施例１１ ｐＳＭＧＮ１７９−３に関するプラスミドの記述 発現ベクター、ｐＳＭＧＮ１７９−３は、β−グルクロニダーゼ遺伝子を駆動
するＧｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｈａｕｐｔｍａｎｎ，（１９９５） 特許ＷＯ ９
５／１４０９８により記載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス
オパインシンターゼ遺伝子からのキメラ調節領域の改変誘導体を含有した。プラ
スミドｐＳＭＧＮ１７９−３は時計回りの順序で以下の配列から成る５５４１塩
基対２本鎖植物形質転換ベクターであった：ヌクレオチド１〜１６はプラスミド
バックボーン、ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（
１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）からの多重クローニング配列Ａ
ＡＴＴＣＧＡＧＣＴ ＣＧＧＴＡＣを有した。ｐＳＭＧＮ１７９−３のヌクレオ
チド１７〜５７は配列ＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣ ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧ ＡＣＧＧ
ＴＡＴＣＧＡ ＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴ Ｃを有するリンカーフラグメントを含ん
だ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基５８〜２７７はアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−ＤＮＡ（Ｂａｒｋｅｒ ｅ
ｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５
０）の塩基１３７７４〜１３９３３の逆相補配列に対応した。これらの塩基はオ
クトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子からの上流活性化配列に対応した。塩基２
７８〜３０４は配列ＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡ ＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧ ＣＡＧＧＴ
ＣＡを有するリンカーＤＮＡに対応した。塩基３０５〜３５０はアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−ＤＮＡ（Ｂ
ａｒｋｅｒ ｅｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
：３３５−３５０）の塩基２１４７５〜２１５２０の逆相補配列に対応した。ｐ
ＳＭＧＮ１７９−３の塩基３５１〜７３７はアグロバクテリウム ｂ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子 ツメファシエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−
ＤＮＡ（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２：３３５−３５０）からの塩基２０１２８〜２０５１４の逆相補配列
を含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の３０５〜７３７の配列はＧｅｌｖｉｎ ａｎ
ｄ Ｈａｕｐｍａｎ，（１９９５） 特許ＷＯ ９５／１４０９８により記載さ
れたΔＭＡＳプロモーターを含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基７３８〜７６
３はリンカー配列ＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴ ＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧ ＴＣＧＡＣＣ
を含有した。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基５８〜７６３は配列番号：１に示す通
り、プロモーター及び非翻訳リーダー調節融合を含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３
のヌクレオチド７６４〜２６１５は、β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする
プラスミドｐＢＩ１０１のヌクレオチド２５５１〜４４０２に対応した（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．
，（１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８３（２２）：８４
４７−８４５１）。塩基７６７〜７６９はＴＴＡからＧＴＣに改変された。β−
グルクロニダーゼ遺伝子にポリリンカー配列ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧが続き、それ
はｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基２６１６〜２６２５に対応した。塩基２６２６〜
２８９５はｐＢＩ１０１の４４１４〜４６８３に対応し、それはノパリンシンタ
ーゼ３’非翻訳領域からの配列を含有した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８３（２２）：８４４７−８４５１）。ｐＳＭＧ
Ｎ１７９−３の残りの配列（ヌクレオチド４６８４〜５５４１）は、ｐＵＣ１９
に由来するプラスミド バックボーンからのヌクレオチドの逆相補配列に対応し
た（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｇｅｎｅ ３
３：１０３−１１９）。
するＧｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｈａｕｐｔｍａｎｎ，（１９９５） 特許ＷＯ ９
５／１４０９８により記載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス
オパインシンターゼ遺伝子からのキメラ調節領域の改変誘導体を含有した。プラ
スミドｐＳＭＧＮ１７９−３は時計回りの順序で以下の配列から成る５５４１塩
基対２本鎖植物形質転換ベクターであった：ヌクレオチド１〜１６はプラスミド
バックボーン、ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（
１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）からの多重クローニング配列Ａ
ＡＴＴＣＧＡＧＣＴ ＣＧＧＴＡＣを有した。ｐＳＭＧＮ１７９−３のヌクレオ
チド１７〜５７は配列ＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣ ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧ ＡＣＧＧ
ＴＡＴＣＧＡ ＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴ Ｃを有するリンカーフラグメントを含ん
だ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基５８〜２７７はアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−ＤＮＡ（Ｂａｒｋｅｒ ｅ
ｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５
０）の塩基１３７７４〜１３９３３の逆相補配列に対応した。これらの塩基はオ
クトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子からの上流活性化配列に対応した。塩基２
７８〜３０４は配列ＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡ ＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧ ＣＡＧＧＴ
ＣＡを有するリンカーＤＮＡに対応した。塩基３０５〜３５０はアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−ＤＮＡ（Ｂ
ａｒｋｅｒ ｅｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
：３３５−３５０）の塩基２１４７５〜２１５２０の逆相補配列に対応した。ｐ
ＳＭＧＮ１７９−３の塩基３５１〜７３７はアグロバクテリウム ｂ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子 ツメファシエンス Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５ Ｔ−
ＤＮＡ（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ Ｇａｌ．（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２：３３５−３５０）からの塩基２０１２８〜２０５１４の逆相補配列
を含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の３０５〜７３７の配列はＧｅｌｖｉｎ ａｎ
ｄ Ｈａｕｐｍａｎ，（１９９５） 特許ＷＯ ９５／１４０９８により記載さ
れたΔＭＡＳプロモーターを含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基７３８〜７６
３はリンカー配列ＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴ ＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧ ＴＣＧＡＣＣ
を含有した。ｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基５８〜７６３は配列番号：１に示す通
り、プロモーター及び非翻訳リーダー調節融合を含んだ。ｐＳＭＧＮ１７９−３
のヌクレオチド７６４〜２６１５は、β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする
プラスミドｐＢＩ１０１のヌクレオチド２５５１〜４４０２に対応した（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．
，（１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８３（２２）：８４
４７−８４５１）。塩基７６７〜７６９はＴＴＡからＧＴＣに改変された。β−
グルクロニダーゼ遺伝子にポリリンカー配列ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧが続き、それ
はｐＳＭＧＮ１７９−３の塩基２６１６〜２６２５に対応した。塩基２６２６〜
２８９５はｐＢＩ１０１の４４１４〜４６８３に対応し、それはノパリンシンタ
ーゼ３’非翻訳領域からの配列を含有した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８３（２２）：８４４７−８４５１）。ｐＳＭＧ
Ｎ１７９−３の残りの配列（ヌクレオチド４６８４〜５５４１）は、ｐＵＣ１９
に由来するプラスミド バックボーンからのヌクレオチドの逆相補配列に対応し
た（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｇｅｎｅ ３
３：１０３−１１９）。
【０１２５】 実施例１２ 胚形成性綿カルスの形質転換 種々の実生−由来の系からの約２５０ｍｇの綿カルスを浸透性培地［保持培地
プラス３６．４ｇ／Ｌのソルビトール及び３６．４ｇ／Ｌのマンニトール］上に
置き、暗所で４時間インキュベーションした。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍ
の培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉ
ｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、その中に２５０μＬの液体浸透性培地
［ＧＥＬＲＩＴＥなし］、２０μＬのＤＮＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０μｇ／μＬのｐＳＭＧＮ１７９−３）及び４０ｍ
ｇ／ｍＬの（Ａｌｆａ）ホイスカー懸濁液の５０μＬを加えた。次いで各管をＶ
ｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用いて４０、８０又は１６０秒間撹拌した。次いで
カルスを２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させた浸透性培地に移し戻
し、２８℃において暗所で１６時間インキュベーションを許した。後にそれを前
に記載した通りにＧＵＳ発現に関して検定し、表１３に示す結果を得た。
プラス３６．４ｇ／Ｌのソルビトール及び３６．４ｇ／Ｌのマンニトール］上に
置き、暗所で４時間インキュベーションした。次いでカルスを１７ｘ１００ｍｍ
の培養管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉ
ｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に入れ、その中に２５０μＬの液体浸透性培地
［ＧＥＬＲＩＴＥなし］、２０μＬのＤＮＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０中の１．０μｇ／μＬのｐＳＭＧＮ１７９−３）及び４０ｍ
ｇ／ｍＬの（Ａｌｆａ）ホイスカー懸濁液の５０μＬを加えた。次いで各管をＶ
ｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２TM（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用いて４０、８０又は１６０秒間撹拌した。次いで
カルスを２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥを用いて固化させた浸透性培地に移し戻
し、２８℃において暗所で１６時間インキュベーションを許した。後にそれを前
に記載した通りにＧＵＳ発現に関して検定し、表１３に示す結果を得た。
【０１２６】
【表１３】
【０１２７】 ホイスカー−処理綿カルスにおいてＧＵＳ発現が観察された。４０秒から１６
０秒への撹拌時間の増加は発現を有意に増加させるように見えなかった。
０秒への撹拌時間の増加は発現を有意に増加させるように見えなかった。
【０１２８】 実施例１３ プラスミドｐＤＡＢ ３０５の調製 プラスミドｐＤＡＢ３０５は、カリフラワー モザイクウィルス ３５Ｓ エ
ンハンサー（３５Ｓ）の縦列コピーを含有するプロモーター、Ａｄｈ１ イント
ロン １の欠失変異形及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子に融合したトウモロコシ
ストリークモザイクウィルス コートタンパク質からの非翻訳リーダーを保有
し、次いでそれにｎｏｓ ３’ＵＴＲが続いている５８００ｂｐプラスミドであ
った。それは以下の通りに作られた： 出発材料はＯｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１
０−８１２）に記載されているプラスミドｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）であ
った。このプラスミドはｐＵＣ１３のＳｍａ Ｉ部位の３’末端において出発し
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｙｚｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｗｕ，Ｒ．Ｅｄ．１０１：２０−７８）、ｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝子の
非コード鎖に隣接する鎖をと続き（ｒｅａｄｉｎｇ ｏｎ）、ＣａＭＶのヌクレ
オチド６４９５〜６９７２を含み、それにリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ（これ
はＣｌａ Ｉ 認識部位をコードする）が続き、ＣａＭＶ ヌクレオチド７０８
９〜７４４３が続き、リンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴＧが続き、後者の配列はＨｉ
ｎｄ ＩＩＩに関する認識配列を含んでおり、それに次いでｐＵＣ１３プラスミ
ドの残りが続いた。
ンハンサー（３５Ｓ）の縦列コピーを含有するプロモーター、Ａｄｈ１ イント
ロン １の欠失変異形及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子に融合したトウモロコシ
ストリークモザイクウィルス コートタンパク質からの非翻訳リーダーを保有
し、次いでそれにｎｏｓ ３’ＵＴＲが続いている５８００ｂｐプラスミドであ
った。それは以下の通りに作られた： 出発材料はＯｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１
０−８１２）に記載されているプラスミドｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）であ
った。このプラスミドはｐＵＣ１３のＳｍａ Ｉ部位の３’末端において出発し
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｙｚｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｗｕ，Ｒ．Ｅｄ．１０１：２０−７８）、ｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝子の
非コード鎖に隣接する鎖をと続き（ｒｅａｄｉｎｇ ｏｎ）、ＣａＭＶのヌクレ
オチド６４９５〜６９７２を含み、それにリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ（これ
はＣｌａ Ｉ 認識部位をコードする）が続き、ＣａＭＶ ヌクレオチド７０８
９〜７４４３が続き、リンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴＧが続き、後者の配列はＨｉ
ｎｄ ＩＩＩに関する認識配列を含んでおり、それに次いでｐＵＣ１３プラスミ
ドの残りが続いた。
【０１２９】 プラスミドｐＵＣ１３／３５Ｓ（−３４３）ＤＮＡをＣａｌ Ｉ及びＮｃｏ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により６６ｂｐの小フラグメントから３４
２９塩基対（ｂｐ）の大フラグメントが現れ、次いで標準的方法により精製した
。ＤＮＡをＣｌａ Ｉで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理により
突出末端を平滑化した。平滑−末端ＤＮＡを次いで、Ｎｃｏ Ｉ認識部位を含む
配列ＣＣＣＡＴＧＧＧを有する合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。連
結反応を感応性Ｅ．コリ細胞中に形質転換し、前のＣｌａ Ｉ部位に位置するＮ
ｃｏ Ｉ部位を有するプラスミド（ｐＯＯ＃１と命名）を含有する形質転換細胞
を同定した。ｐＯＯ＃１のＤＮＡをＮｃｏ Ｉで消化し、大フラグメントの適合
末端を再連結してｐＯＯ＃１からの７０ｂｐの欠失を生じ、中間プラスミド ｐ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により６６ｂｐの小フラグメントから３４
２９塩基対（ｂｐ）の大フラグメントが現れ、次いで標準的方法により精製した
。ＤＮＡをＣｌａ Ｉで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理により
突出末端を平滑化した。平滑−末端ＤＮＡを次いで、Ｎｃｏ Ｉ認識部位を含む
配列ＣＣＣＡＴＧＧＧを有する合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。連
結反応を感応性Ｅ．コリ細胞中に形質転換し、前のＣｌａ Ｉ部位に位置するＮ
ｃｏ Ｉ部位を有するプラスミド（ｐＯＯ＃１と命名）を含有する形質転換細胞
を同定した。ｐＯＯ＃１のＤＮＡをＮｃｏ Ｉで消化し、大フラグメントの適合
末端を再連結してｐＯＯ＃１からの７０ｂｐの欠失を生じ、中間プラスミド ｐ
【０１３０】
【外１】
【０１３１】 名した。次いでこのＤＮＡをＣｌａ Ｉ及びＮｃｏ Ｉで消化し、小（２６８ｂ
ｐ）フラグメントをアガロースゲルから精製した。このフラグメントを次いで上
記の通りに調製したｐＵＣ／３５Ｓ（−３４３）の３４２９ｂｐ Ｃｌａ Ｉ／
Ｎｃｏ Ｉフラグメントに連結し、Ｃｌａ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉフラグメント ３４
２９及び２６８ｂｐを有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定
した。このプラスミドをｐＵＣ１３／３５Ｓ Ｅｎと命名した。
ｐ）フラグメントをアガロースゲルから精製した。このフラグメントを次いで上
記の通りに調製したｐＵＣ／３５Ｓ（−３４３）の３４２９ｂｐ Ｃｌａ Ｉ／
Ｎｃｏ Ｉフラグメントに連結し、Ｃｌａ Ｉ／Ｎｃｏ Ｉフラグメント ３４
２９及び２６８ｂｐを有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定
した。このプラスミドをｐＵＣ１３／３５Ｓ Ｅｎと命名した。
【０１３２】 プラスミドｐＵＣ１３／３５Ｓ Ｅｎ ＤＮＡをＮｃｏ Ｉで消化し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理により突出末端を平滑化した。処理されたＤＮ
Ａを次いでＳｍａ Ｉを用いて切断し、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢｇｌ
ＩＩリンカーに連結した。４１６ ｂｐ Ｓｍａ Ｉ／ＮｃｏＩフラグメントが
Ｂｇｌ ＩＩリンカーの少なくとも２つのコピーで置き換えられているプラスミ
ドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐ３５Ｓ Ｅｎ2と命名した。ｐ
３５Ｓ Ｅｎ2のＤＮＡ構造は以下の通りであった：ｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝
子の非コード鎖に隣接する鎖上のＳｍａ Ｉ部位の第３Ｃ残基に続くヌクレオチ
ドで始まり；リンカー配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡ ＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧ ＧＧ
ＣＣＡＴＧ、それにＣａＭＶヌクレオチド７０９０〜７３４４が続き、Ｃｌａ
Ｉリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧが続き、ＣａＭＶヌクレオチド７０８９〜７４
４３が続き、Ｈｉｎｄ ＩＩＩリンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴが続き、ｐＵＣ１３
配列の残りが続いた。この構造は、ウィルスゲノムのＥｃｏＲ Ｖ部位の上流の
領域（塩基７０９０〜７３４４）に置かれたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのエ
ンハンサー配列が重複しているという特徴を有した。このプロモーター構築物に
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位の第１Ａ残基から１１ヌクレオチド上流の本来の３５Ｓ
転写開始部位が導入された。
ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理により突出末端を平滑化した。処理されたＤＮ
Ａを次いでＳｍａ Ｉを用いて切断し、配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢｇｌ
ＩＩリンカーに連結した。４１６ ｂｐ Ｓｍａ Ｉ／ＮｃｏＩフラグメントが
Ｂｇｌ ＩＩリンカーの少なくとも２つのコピーで置き換えられているプラスミ
ドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐ３５Ｓ Ｅｎ2と命名した。ｐ
３５Ｓ Ｅｎ2のＤＮＡ構造は以下の通りであった：ｐＵＣ１３のｌａｃＺ遺伝
子の非コード鎖に隣接する鎖上のＳｍａ Ｉ部位の第３Ｃ残基に続くヌクレオチ
ドで始まり；リンカー配列ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡ ＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧ ＧＧ
ＣＣＡＴＧ、それにＣａＭＶヌクレオチド７０９０〜７３４４が続き、Ｃｌａ
Ｉリンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧが続き、ＣａＭＶヌクレオチド７０８９〜７４
４３が続き、Ｈｉｎｄ ＩＩＩリンカー配列ＣＡＡＧＣＴＴが続き、ｐＵＣ１３
配列の残りが続いた。この構造は、ウィルスゲノムのＥｃｏＲ Ｖ部位の上流の
領域（塩基７０９０〜７３４４）に置かれたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのエ
ンハンサー配列が重複しているという特徴を有した。このプロモーター構築物に
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位の第１Ａ残基から１１ヌクレオチド上流の本来の３５Ｓ
転写開始部位が導入された。
【０１３３】 ３５Ｓ プロモーター及びアグロバクテリウム ＮＯＳ Ｐｏｌｙ Ａ 配列
を用いるプラスミドの場合、第１の構築物のための出発材料はＣＬＯＮＴＥＣＨ
（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したプラスミド ｐＢＩ２２１であった
。このプラスミドはＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターのわずかに改変されたコピ
ーを含有した。ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９
８５ Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）のＰｓｔ Ｉ部位の３’末端において
始まり、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子をコードする鎖と同じ鎖と続き、配列はリ
ンカーヌクレオチドＧＴＣＣＣＣを含み、ＣａＭＶヌクレオチド６６０５〜７４
３９が続き、それにリンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣ
ＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＣＣＣＴＴが続いた。次いでこれらの塩基にβ−グ
ルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパク質をコードするＥ．コリ ｕｉｄＡ遺伝子の
コード配列を含む１８０９ｂｐ及びＥ．コリ ゲノムに由来する５５ｂｐの３’
フランキング塩基（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８３：８４４７−８４５１）が続き、Ｓａｃ Ｉ リンカー配列
ＧＡＧＣＴＣが続き、それに次いでリンカー配列ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣが続く。
これらの塩基にアグロバクテリウム・ツメファシエンス ノパリン シンターゼ
（ＮＯＳ）遺伝子に由来し、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２ Ｊ．
Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３）のヌクレオチド１２
９８〜１５５４に対応する２５６ｂｐ Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメントを含むＲＮ
Ａ転写停止／ポリアデニル化シグナル配列が続き、２つのＣ残基、Ｅｃｏ ＲＩ
認識配列ＧＡＡＴＴＣ及びｐＵＣ１９の残りが続く。
を用いるプラスミドの場合、第１の構築物のための出発材料はＣＬＯＮＴＥＣＨ
（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したプラスミド ｐＢＩ２２１であった
。このプラスミドはＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターのわずかに改変されたコピ
ーを含有した。ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９
８５ Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）のＰｓｔ Ｉ部位の３’末端において
始まり、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子をコードする鎖と同じ鎖と続き、配列はリ
ンカーヌクレオチドＧＴＣＣＣＣを含み、ＣａＭＶヌクレオチド６６０５〜７４
３９が続き、それにリンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣ
ＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＣＣＣＴＴが続いた。次いでこれらの塩基にβ−グ
ルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパク質をコードするＥ．コリ ｕｉｄＡ遺伝子の
コード配列を含む１８０９ｂｐ及びＥ．コリ ゲノムに由来する５５ｂｐの３’
フランキング塩基（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８３：８４４７−８４５１）が続き、Ｓａｃ Ｉ リンカー配列
ＧＡＧＣＴＣが続き、それに次いでリンカー配列ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣが続く。
これらの塩基にアグロバクテリウム・ツメファシエンス ノパリン シンターゼ
（ＮＯＳ）遺伝子に由来し、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２ Ｊ．
Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３）のヌクレオチド１２
９８〜１５５４に対応する２５６ｂｐ Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメントを含むＲＮ
Ａ転写停止／ポリアデニル化シグナル配列が続き、２つのＣ残基、Ｅｃｏ ＲＩ
認識配列ＧＡＡＴＴＣ及びｐＵＣ１９の残りが続く。
【０１３４】 プラスミドｐＢＩ２２１ ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化し、
３５０７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。プラスミドｐＲＡＪ
２７５（ＣＬＯＮＴＥＣＨ） ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉで消化し、
１８６２ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。これらの２つのフラ
グメントを一緒に混合し、配列ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ ＣＧ及びＴＣＧＡＣＧＧ
ＡＴＣ ＣＧを有する相補的合成オリゴヌクレオチドを加えた。フラグメントを
一緒に連結し、適したＤＮＡ構造を有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転
換細胞を制限酵素分析により同定した。ｐＫＡ８８１と命名されたこのプラスミ
ドのＤＮＡをＢａｌ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化し、４１４８ｂｐフラグメント
をアガロースゲルから単離した。ｐＢＩ２２１のＤＮＡを同様に消化し、１５１
７ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ／Ｂａｌ Ｉフラグメントをゲル精製し、上記のｐＫＡ８
８１フラグメントに連結し、プラスミドｐＫＡ８８２を生成させた。次いでｐＫ
Ａ８８２ ＤＮＡをＳａｃ Ｉで消化し、突出末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いる処理により平滑化し、フラグメントを配列ＣＧＧＡＴＣＣＧを有する合
成ＢａｍＨ Ｉリンカーに連結した。３７８４及び１８８５ｂｐのＢａｍＨ Ｉ
フラグメントを有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐ
ＫＡ８８２Ｂと命名した。続いてｐＫＡ８８２Ｂ ＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化
し、フラグメントの混合物を連結した。ＢａｍＨ Ｉで消化すると１つの３７８
３ｂｐフラグメントを与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定
し、ｐ３５Ｓ／ＮＯＳと命名した。このプラスミドは、ＧＵＳ遺伝子のコード配
列が欠失していた以外は、ｐＢＩ２２１の必須の（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）ＤＮＡ
構造を有した。従ってＣａＭＶ ヌクレオチド６６０５〜７４３９にリンカー配
列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧ ＡＡＴＴＴＣＣＣＣが続いて
いた。リンカー配列に次いでＮＯＳ ポリアデニル化配列及びｐＢＩ２２１の残
りが続いていた。
３５０７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。プラスミドｐＲＡＪ
２７５（ＣＬＯＮＴＥＣＨ） ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉ及びＳａｌ Ｉで消化し、
１８６２ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。これらの２つのフラ
グメントを一緒に混合し、配列ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣ ＣＧ及びＴＣＧＡＣＧＧ
ＡＴＣ ＣＧを有する相補的合成オリゴヌクレオチドを加えた。フラグメントを
一緒に連結し、適したＤＮＡ構造を有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転
換細胞を制限酵素分析により同定した。ｐＫＡ８８１と命名されたこのプラスミ
ドのＤＮＡをＢａｌ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化し、４１４８ｂｐフラグメント
をアガロースゲルから単離した。ｐＢＩ２２１のＤＮＡを同様に消化し、１５１
７ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ／Ｂａｌ Ｉフラグメントをゲル精製し、上記のｐＫＡ８
８１フラグメントに連結し、プラスミドｐＫＡ８８２を生成させた。次いでｐＫ
Ａ８８２ ＤＮＡをＳａｃ Ｉで消化し、突出末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いる処理により平滑化し、フラグメントを配列ＣＧＧＡＴＣＣＧを有する合
成ＢａｍＨ Ｉリンカーに連結した。３７８４及び１８８５ｂｐのＢａｍＨ Ｉ
フラグメントを有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐ
ＫＡ８８２Ｂと命名した。続いてｐＫＡ８８２Ｂ ＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化
し、フラグメントの混合物を連結した。ＢａｍＨ Ｉで消化すると１つの３７８
３ｂｐフラグメントを与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定
し、ｐ３５Ｓ／ＮＯＳと命名した。このプラスミドは、ＧＵＳ遺伝子のコード配
列が欠失していた以外は、ｐＢＩ２２１の必須の（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）ＤＮＡ
構造を有した。従ってＣａＭＶ ヌクレオチド６６０５〜７４３９にリンカー配
列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧ ＡＡＴＴＴＣＣＣＣが続いて
いた。リンカー配列に次いでＮＯＳ ポリアデニル化配列及びｐＢＩ２２１の残
りが続いていた。
【０１３５】 プラスミドｐ３５Ｓ／ＮＯＳ ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｖ及びＰｓｔ Ｉで消化し
、３０３７ｂｐフラグメントを精製し、ｐ３５Ｓ Ｅｎ2 ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｖ及びＰｓｔ Ｉで消化して得られた５３４ｂｐフラグメントに連結した。Ｅｃ
ｏＲ Ｖ及びＰｓｔ Ｉで消化すると３０３１及び５３４ｂｐのフラグメントを
与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、プラスミドをｐ３
５Ｓ Ｅｎ2／ＮＯＳと命名した。このプラスミドはｐ３５Ｓ Ｅｎ2の場合に記
載した重複３５Ｓ プロモーター エンハンサー領域を含有し、プロモーター配
列はユニークＸｂａ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ部位を含むリンカー配列によりＮＯＳ
ポリアデニル化配列から隔てられていた。
、３０３７ｂｐフラグメントを精製し、ｐ３５Ｓ Ｅｎ2 ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｖ及びＰｓｔ Ｉで消化して得られた５３４ｂｐフラグメントに連結した。Ｅｃ
ｏＲ Ｖ及びＰｓｔ Ｉで消化すると３０３１及び５３４ｂｐのフラグメントを
与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、プラスミドをｐ３
５Ｓ Ｅｎ2／ＮＯＳと命名した。このプラスミドはｐ３５Ｓ Ｅｎ2の場合に記
載した重複３５Ｓ プロモーター エンハンサー領域を含有し、プロモーター配
列はユニークＸｂａ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ部位を含むリンカー配列によりＮＯＳ
ポリアデニル化配列から隔てられていた。
【０１３６】 ＭＳＶ ゲノム配列はＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８４ Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．３：３０６３−３０６８）及びＨｏｗｅｌｌ（１９８４ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７４５９−７３７５）により公開されてお
り、転写物はＦｅｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．７：１５
８９−１５９６）により記載されている。全配列は１５４ｂｐを含み、合成オリ
ゴヌクレオチドのブロックを組み立てることにより３段階で構築された。第１に
、配列ＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧ ＡＡＧＧＣＴＣＧＡＣ ＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣ
ＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧ ＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧ ＧＴＧＧＡＣＡ及びＡＧＣＴＴ
ＧＴＣＣＡ ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＡ ＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴ ＧＧＡＴＣＴＧＣ
ＣＴ ＴＧＴＣＧＡＧＣＣＴ ＴＣＡＧＣＴＧを有する相補的オリゴヌクレオチ
ドを標準的方法により合成し、精製した。これらのヌクレオチドを２本−鎖構造
にアニーリングすると、分子の１つの末端上にＢａｍＨ Ｉにより形成された末
端と適合性の（ＧＡＴＣ）、及び分子の他の末端上にＨｉｎｄ ＩＩＩ−形成の
１本鎖末端と適合性の（ＡＧＣＴ）４−塩基の１本鎖突出末端が残る。そのよう
なアニーリングされた分子をＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたプ
ラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）［下記ではｐＢＳＫと呼ぶ；Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
］中に連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれＢａｍＨ Ｉ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩ粘着末端上に連結されるとそれぞれの認識部位の配列が保
持されるような配列であった。オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミドを
保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素分析により同定し、ｐＭＳＶ Ａと命
名した。
ＭＢＯ Ｊ．３：３０６３−３０６８）及びＨｏｗｅｌｌ（１９８４ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７４５９−７３７５）により公開されてお
り、転写物はＦｅｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．７：１５
８９−１５９６）により記載されている。全配列は１５４ｂｐを含み、合成オリ
ゴヌクレオチドのブロックを組み立てることにより３段階で構築された。第１に
、配列ＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧ ＡＡＧＧＣＴＣＧＡＣ ＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣ
ＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧ ＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧ ＧＴＧＧＡＣＡ及びＡＧＣＴＴ
ＧＴＣＣＡ ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＡ ＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴ ＧＧＡＴＣＴＧＣ
ＣＴ ＴＧＴＣＧＡＧＣＣＴ ＴＣＡＧＣＴＧを有する相補的オリゴヌクレオチ
ドを標準的方法により合成し、精製した。これらのヌクレオチドを２本−鎖構造
にアニーリングすると、分子の１つの末端上にＢａｍＨ Ｉにより形成された末
端と適合性の（ＧＡＴＣ）、及び分子の他の末端上にＨｉｎｄ ＩＩＩ−形成の
１本鎖末端と適合性の（ＡＧＣＴ）４−塩基の１本鎖突出末端が残る。そのよう
なアニーリングされた分子をＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたプ
ラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）［下記ではｐＢＳＫと呼ぶ；Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
］中に連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれＢａｍＨ Ｉ
及びＨｉｎｄ ＩＩＩ粘着末端上に連結されるとそれぞれの認識部位の配列が保
持されるような配列であった。オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミドを
保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素分析により同定し、ｐＭＳＶ Ａと命
名した。
【０１３７】 配列ＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴ ＡＧＧＡＧＣＡＡＣＣ ＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡ
ＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡ ＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣ ＡＧＧＧＣＡＡＴＣＣ ＣＧＧ
Ｇ及びＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ ＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡ ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧ
ＣＴＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＧＧＧＡＴＡＧＧＧ ＴＴＧＣＴＣＣＴＡＴ ＣＣＡ
Ｃを有する相補的オリゴヌクレオチドを標準的方法により合成し、精製した。こ
れらのヌクレオチドを２本−鎖構造にアニーリングすると４−塩基の粘着末端が
残り、それは分子の１つの末端上ではＨｉｎｄ ＩＩＩにより形成された末端と
適合性であり（ＡＧＣＴ）、分子の他の末端上ではＳａｌ Ｉ−形成の粘着末端
と適合性であった（ＴＣＧＡ）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ粘着末端上に連結されるとＨｉｎｄ ＩＩＩに関する認識配列が破壊
されるような配列であった。
ＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡ ＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣ ＡＧＧＧＣＡＡＴＣＣ ＣＧＧ
Ｇ及びＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ ＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡ ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧ
ＣＴＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＧＧＧＡＴＡＧＧＧ ＴＴＧＣＴＣＣＴＡＴ ＣＣＡ
Ｃを有する相補的オリゴヌクレオチドを標準的方法により合成し、精製した。こ
れらのヌクレオチドを２本−鎖構造にアニーリングすると４−塩基の粘着末端が
残り、それは分子の１つの末端上ではＨｉｎｄ ＩＩＩにより形成された末端と
適合性であり（ＡＧＣＴ）、分子の他の末端上ではＳａｌ Ｉ−形成の粘着末端
と適合性であった（ＴＣＧＡ）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ粘着末端上に連結されるとＨｉｎｄ ＩＩＩに関する認識配列が破壊
されるような配列であった。
【０１３８】 ｐＭＳＶ ＡのＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉで消化し、上記のア
ニーリングされたオリゴヌクレオチドに連結した。新しいオリゴヌクレオチドを
含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素部位マッピング
により同定し、ｐＭＳＶ ＡＢと命名した。
ニーリングされたオリゴヌクレオチドに連結した。新しいオリゴヌクレオチドを
含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素部位マッピング
により同定し、ｐＭＳＶ ＡＢと命名した。
【０１３９】 配列ＣＣＧＧＧＣＣＡＴＴ ＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣ ＡＣＧＧＧＡＴＡＡＧ
ＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡ ＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣ ＣＣ及
びＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣ ＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴ ＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ ＴＧ
ＡＡＴＧＣＴＴＡ ＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴ ＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧ ＧＣを有す
る相補的オリゴヌクレオチドを標準的方法により合成し、精製した。これらのオ
リゴヌクレオチドにはＮｃｏ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍ
Ｈ Ｉに関する認識部位を含む塩基が導入されている。これらのヌクレオチドの
２本−鎖構造へのアニーリングは４−塩基粘着末端を残し、それは分子の１つの
末端上でＸｍａ Ｉにより形成される末端と適合性であり（ＣＣＧＧ）、分子の
他の末端上ではＸｈｏ Ｉ−形成粘着末端と適合性であった（ＴＣＧＡ）。その
ようなアニーリングされた分子をＸｍａ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化されたｐＭＳ
Ｖ ＡＢ ＤＮＡ中に連結した。オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミド
を保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素分析により同定し、ＤＮＡ構造を配
列分析により確証した。該プラスミドをｐＭＳＶ ＣＰＬと命名した。一緒にこ
れらはＭＳＶ コートタンパク質（「ＣＰ」）遺伝子の５’非翻訳リーダー配列
（「Ｌ」）を含んだ。これらはＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）のＭＳＶ配列のヌクレオチド１６７〜１８６及び１８８〜３１７に対応し、
５’末端においてＢａｍＨ Ｉリンカー配列ＧＧＡＴＣＣＡＧにより、そして３
’末端においてリンカー配列ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣ ＴＴＧＧＡＴＣＣＣにより
フランキングされていた。野生型ＭＳＶ配列の塩基１８７に対応するＡ残基は、
不注意にもクローニングの間に欠失した。
ＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡ ＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣ ＣＣ及
びＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣ ＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴ ＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ ＴＧ
ＡＡＴＧＣＴＴＡ ＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴ ＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧ ＧＣを有す
る相補的オリゴヌクレオチドを標準的方法により合成し、精製した。これらのオ
リゴヌクレオチドにはＮｃｏ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍ
Ｈ Ｉに関する認識部位を含む塩基が導入されている。これらのヌクレオチドの
２本−鎖構造へのアニーリングは４−塩基粘着末端を残し、それは分子の１つの
末端上でＸｍａ Ｉにより形成される末端と適合性であり（ＣＣＧＧ）、分子の
他の末端上ではＸｈｏ Ｉ−形成粘着末端と適合性であった（ＴＣＧＡ）。その
ようなアニーリングされた分子をＸｍａ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化されたｐＭＳ
Ｖ ＡＢ ＤＮＡ中に連結した。オリゴヌクレオチド配列を含有するプラスミド
を保有するＥ．コリ形質転換細胞を制限酵素分析により同定し、ＤＮＡ構造を配
列分析により確証した。該プラスミドをｐＭＳＶ ＣＰＬと命名した。一緒にこ
れらはＭＳＶ コートタンパク質（「ＣＰ」）遺伝子の５’非翻訳リーダー配列
（「Ｌ」）を含んだ。これらはＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）のＭＳＶ配列のヌクレオチド１６７〜１８６及び１８８〜３１７に対応し、
５’末端においてＢａｍＨ Ｉリンカー配列ＧＧＡＴＣＣＡＧにより、そして３
’末端においてリンカー配列ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣ ＴＴＧＧＡＴＣＣＣにより
フランキングされていた。野生型ＭＳＶ配列の塩基１８７に対応するＡ残基は、
不注意にもクローニングの間に欠失した。
【０１４０】 プラスミドｐＭＳＶ ＣＰＬ ＤＮＡをＭＳＶゲノム配列の塩基２７７に対応
するＳｍａ Ｉ部位において消化し、ＤＮＡを配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢ
ｇｌ ＩＩリンカーに連結した。前のＳｍａ Ｉ部位の位置にユニークＢｇｌ
ＩＩ部位を有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ＤＮＡ
配列分析により確証し、該プラスミドをｐＣＰＬ−Ｂｇｌと命名した。
するＳｍａ Ｉ部位において消化し、ＤＮＡを配列ＣＡＧＡＴＣＴＧを有するＢ
ｇｌ ＩＩリンカーに連結した。前のＳｍａ Ｉ部位の位置にユニークＢｇｌ
ＩＩ部位を有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ＤＮＡ
配列分析により確証し、該プラスミドをｐＣＰＬ−Ｂｇｌと命名した。
【０１４１】 トウモロコシ アルコール デヒドロゲナーゼ １（Ａｄｈ１） イントロン
１の欠失変異形の構築における出発材料はプラスミド ｐＶＷ１１９であり、
それはＶ．Ｗａｌｂｏｔ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎ
ｆｏｒｄ，ＣＡから入手した。このプラスミドはイントロン １、ヌクレオチド
１１９〜６７２［Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）の番号付け］を含むトウモロコ
シ Ａｄｈ１．Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列を含有し、Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（
１９８７ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｏｐ．１：１１８３−１２００）に
より記載された。ｐＶＷ１１９において、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８
４）の塩基６７２に続く配列はＧＡＣＧＧＡＴＣＣであった。エキソン １の１
４個の塩基及びエキソン ２の９個の塩基を有する全イントロン １配列を５５
６ｂｐフラグメント上にこのプラスミドから、Ｂｃｌ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉを用
いる消化に続いて得た。
１の欠失変異形の構築における出発材料はプラスミド ｐＶＷ１１９であり、
それはＶ．Ｗａｌｂｏｔ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎ
ｆｏｒｄ，ＣＡから入手した。このプラスミドはイントロン １、ヌクレオチド
１１９〜６７２［Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３−４０００）の番号付け］を含むトウモロコ
シ Ａｄｈ１．Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列を含有し、Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（
１９８７ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｏｐ．１：１１８３−１２００）に
より記載された。ｐＶＷ１１９において、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８
４）の塩基６７２に続く配列はＧＡＣＧＧＡＴＣＣであった。エキソン １の１
４個の塩基及びエキソン ２の９個の塩基を有する全イントロン １配列を５５
６ｂｐフラグメント上にこのプラスミドから、Ｂｃｌ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉを用
いる消化に続いて得た。
【０１４２】 プラスミドｐＳＧ３５２５ａ（Ｐｓｔ） ＤＮＡをＢａｍＨ Ｉ及びＢｃｌ
Ｉを用いて消化し、３４３０ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。
プラスミドｐＶＷ１１９のＤＮＡをＢａｍＨ Ｉ及びＢｃｌ Ｉで消化し、ゲル
精製された５４６ｂｐのフラグメントを３４３０ｂｐフラグメントに連結した。
ＢａｍＨ Ｉ及びＢｃｌ Ｉで消化すると３４３０及び５４６のフラグメントを
与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定した。このプラスミド
をｐＳＧ ＡｄｈＡ１と命名した。
Ｉを用いて消化し、３４３０ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製した。
プラスミドｐＶＷ１１９のＤＮＡをＢａｍＨ Ｉ及びＢｃｌ Ｉで消化し、ゲル
精製された５４６ｂｐのフラグメントを３４３０ｂｐフラグメントに連結した。
ＢａｍＨ Ｉ及びＢｃｌ Ｉで消化すると３４３０及び５４６のフラグメントを
与えるプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定した。このプラスミド
をｐＳＧ ＡｄｈＡ１と命名した。
【０１４３】 ｐＳＧ ＡｄｈＡ１のＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳｔｕ Ｉで消化した。
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理により末端を平滑化し、次いで連結した。Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位及びＳｔｕ Ｉ部位のないプラスミドを保有するＥ．コリ形質転
換細胞を同定し、ＤＮＡ構造を配列分析により確証した。該プラスミドをｐＳＧ
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理により末端を平滑化し、次いで連結した。Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位及びＳｔｕ Ｉ部位のないプラスミドを保有するＥ．コリ形質転
換細胞を同定し、ＤＮＡ構造を配列分析により確証した。該プラスミドをｐＳＧ
【０１４４】
【外２】
【０１４５】 いる消化ならびに３７３ｂｐフラグメントの精製により、ＭＳＶ リーダー／イ
ントロン 配列が得られた。
ントロン 配列が得られた。
【０１４６】 増強された３５Ｓ プロモーター、ＭＳＶ ＣＰＬ及びＡｄｈ１ イントロン
１の欠失変異形に基づく植物発現ベクターの構築は以下の通りであった。プラ
スミド ｐ３５Ｓ Ｅｎ2／ＮＯＳのＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化し、３５６２
ｂｐの線状のフラグメントをＢａｍＨ Ｉで消化されたｐＭＳＶ ＣＰＬ ＤＮ
Ａから調製された１７１ｂｐフラグメントに連結した。このフラグメントは全Ｍ
ＳＶ ＣＰＬ配列を含有した。Ｎｃｏ Ｉ部位がＮＯＳ Ｐｏｌｙ Ａ 配列の
近くに位置する配向でこれらの配列を含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形
質転換細胞を制限酵素部位マッピングにより同定した。このプラスミドをｐ３５
Ｓ Ｅｎ2 ＣＰＬ／ＮＯＳと命名した。それはＭＳＶ リーダー配列に直接隣
接して３５Ｓ プロモーターの増強変異形を含有し、誘導される転写物はＭＳＶ
配列をその５’非翻訳部分に含んだ。
１の欠失変異形に基づく植物発現ベクターの構築は以下の通りであった。プラ
スミド ｐ３５Ｓ Ｅｎ2／ＮＯＳのＤＮＡをＢａｍＨ Ｉで消化し、３５６２
ｂｐの線状のフラグメントをＢａｍＨ Ｉで消化されたｐＭＳＶ ＣＰＬ ＤＮ
Ａから調製された１７１ｂｐフラグメントに連結した。このフラグメントは全Ｍ
ＳＶ ＣＰＬ配列を含有した。Ｎｃｏ Ｉ部位がＮＯＳ Ｐｏｌｙ Ａ 配列の
近くに位置する配向でこれらの配列を含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形
質転換細胞を制限酵素部位マッピングにより同定した。このプラスミドをｐ３５
Ｓ Ｅｎ2 ＣＰＬ／ＮＯＳと命名した。それはＭＳＶ リーダー配列に直接隣
接して３５Ｓ プロモーターの増強変異形を含有し、誘導される転写物はＭＳＶ
配列をその５’非翻訳部分に含んだ。
【０１４７】 プラスミドｐＫＡ８８２のＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏ Ｉで消化し
、大きな４７７８ｂｐフラグメントをｐ３５Ｓ Ｅｎ2 ＣＰＬ／ＮＯＳからの
増強３５Ｓ プロモーター配列及びＭＳＶ リーダー配列を含有する８０２ｂｐ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｃｏ Ｉフラグメントに連結した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及
びＮｃｏ Ｉを用いる消化の後に４７７８及び８０２ｂｐのフラグメントを含有
するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐＤＡＢ３１０と命
名した。このプラスミドにおいては、３５Ｓ プロモーターの増強変異形がＧＵ
Ｓ遺伝子の発現を調節するために用いられた。転写物の５’非翻訳リーダー部分
はＭＳＶコートタンパク質遺伝子のリーダー配列を含有した。
、大きな４７７８ｂｐフラグメントをｐ３５Ｓ Ｅｎ2 ＣＰＬ／ＮＯＳからの
増強３５Ｓ プロモーター配列及びＭＳＶ リーダー配列を含有する８０２ｂｐ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｃｏ Ｉフラグメントに連結した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及
びＮｃｏ Ｉを用いる消化の後に４７７８及び８０２ｂｐのフラグメントを含有
するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞を同定し、ｐＤＡＢ３１０と命
名した。このプラスミドにおいては、３５Ｓ プロモーターの増強変異形がＧＵ
Ｓ遺伝子の発現を調節するために用いられた。転写物の５’非翻訳リーダー部分
はＭＳＶコートタンパク質遺伝子のリーダー配列を含有した。
【０１４８】 プラスミドｐＤＡＢ３１０のＤＮＡをＮｃｏ Ｉ及びＳａｃ Ｉで消化した。
大きな３７１７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製し、配列ＣＧＧＴＡ
ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣ及びＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡ
ＧＣＴを有する相補的合成オリゴヌクレオチドに連結した。これらのオリゴヌク
レオチドは、２本鎖構造にアニーリングすると、分子の１つの末端上にＳａｃ
Ｉにより残されるものと適合する粘着末端及び分子の他の末端上にＮｃｏ Ｉと
適合する粘着末端を有する分子を生成した。これらの２つの酵素に関する認識部
位の配列の復帰の他に、酵素Ｋｐｎ Ｉ（ＧＧＴＡＣＣ）、Ｘｈｏ Ｉ（ＣＴＣ
ＧＡＧ）及びＨｐａ Ｉ（ＧＴＴＡＡＣ）に関する新しい部位が形成された。こ
れらの酵素に関する部位を含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞
を同定し、ＤＮＡ構造を配列分析により確証した。このプラスミドをｐＤＡＢ１
１４８と命名した。
大きな３７１７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製し、配列ＣＧＧＴＡ
ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣ及びＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡ
ＧＣＴを有する相補的合成オリゴヌクレオチドに連結した。これらのオリゴヌク
レオチドは、２本鎖構造にアニーリングすると、分子の１つの末端上にＳａｃ
Ｉにより残されるものと適合する粘着末端及び分子の他の末端上にＮｃｏ Ｉと
適合する粘着末端を有する分子を生成した。これらの２つの酵素に関する認識部
位の配列の復帰の他に、酵素Ｋｐｎ Ｉ（ＧＧＴＡＣＣ）、Ｘｈｏ Ｉ（ＣＴＣ
ＧＡＧ）及びＨｐａ Ｉ（ＧＴＴＡＡＣ）に関する新しい部位が形成された。こ
れらの酵素に関する部位を含有するプラスミドを保有するＥ．コリ形質転換細胞
を同定し、ＤＮＡ構造を配列分析により確証した。このプラスミドをｐＤＡＢ１
１４８と命名した。
【０１４９】 プラスミドｐＤＡＢ１１４８のＤＮＡをＢａｍ ＨＩ及びＮｃｏ Ｉで消化し
、大きな３５７７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製し、Ｂａｍ ＨＩ
、大きな３５７７ｂｐフラグメントをアガロースゲルから精製し、Ｂａｍ ＨＩ
【０１５０】
【外３】
【０１５１】 ３ｂｐフラグメントに連結した。ＢａｍＨ Ｉ及びＮｃｏ Ｉを用いる消化の後
に３５７７及び３７３ｂｐのフラグメントを与えるプラスミドを保有するＥ．コ
リ形質転換細胞を同定し、該ブラスミドをｐＤＡＢ３０３と命名した。このプラ
スミドは以下のＤＮＡ構造を有する：ｐＵＣ１９のＰｓｔ Ｉ部位の最後のＧ残
基の後の塩基で始まり（塩基４３５）、ｌａｃＺ遺伝子のコード鎖に隣接する鎖
、リンカー配列ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧ ＧＴＧ、ＣａＭＶ ＤＮＡのヌクレオチ
ド７０９３〜７３４４、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチ
ド７０９３〜７４３９、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣ
ＡＧ、ＭＳＶのヌクレオチド１６７〜１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８〜２
７７、Ｃ残基及び続くＡｄｈ１．Ｓのヌクレオチド１１９〜２０９、トウモロコ
シ Ａｄｈ１．Ｓのヌクレオチド５５５〜６７２、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴ
ＣＴＧ、ＭＳＶのヌクレオチド２７８〜３１７、Ｈｐａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｋｐ
ｎ Ｉ及びＳａｃ Ｉに関する認識部位を含有するポリリンカー配列ＧＴＴＡＡ
ＣＴＣＧＡ ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣ ＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣ ＣＣ、ＮＯＳのヌ
クレオチド１２９８〜１５５４ならびにＧ残基及び続くｐＵＣ１９配列の残り（
ＥｃｏＲ Ｉ部位を含有する）と続く。
に３５７７及び３７３ｂｐのフラグメントを与えるプラスミドを保有するＥ．コ
リ形質転換細胞を同定し、該ブラスミドをｐＤＡＢ３０３と命名した。このプラ
スミドは以下のＤＮＡ構造を有する：ｐＵＣ１９のＰｓｔ Ｉ部位の最後のＧ残
基の後の塩基で始まり（塩基４３５）、ｌａｃＺ遺伝子のコード鎖に隣接する鎖
、リンカー配列ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧ ＧＴＧ、ＣａＭＶ ＤＮＡのヌクレオチ
ド７０９３〜７３４４、リンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチ
ド７０９３〜７４３９、リンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣ
ＡＧ、ＭＳＶのヌクレオチド１６７〜１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８〜２
７７、Ｃ残基及び続くＡｄｈ１．Ｓのヌクレオチド１１９〜２０９、トウモロコ
シ Ａｄｈ１．Ｓのヌクレオチド５５５〜６７２、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴ
ＣＴＧ、ＭＳＶのヌクレオチド２７８〜３１７、Ｈｐａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｋｐ
ｎ Ｉ及びＳａｃ Ｉに関する認識部位を含有するポリリンカー配列ＧＴＴＡＡ
ＣＴＣＧＡ ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣ ＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣ ＣＣ、ＮＯＳのヌ
クレオチド１２９８〜１５５４ならびにＧ残基及び続くｐＵＣ１９配列の残り（
ＥｃｏＲ Ｉ部位を含有する）と続く。
【０１５２】 プラスミドｐＤＡＢ３０３のＤＮＡをＮｃｏ Ｉ及びＳａｃ Ｉで消化し、３
９３９ｂｐフラグメントを同様に消化されたｐＫＡ８８２のＤＮＡから調製され
たＧＵＳコード領域を含有する１８６６ｂｐフラグメントに連結した。適したプ
ラスミドを制限酵素部位マッピングにより同定し、ｐＤＡＢ３０５と命名した。
このブラスミドは、ＧＵＳ遺伝子の発現を調節するように位置するｐＤＡＢ３０
３の増強されたプロモーター、ＭＳＶリーダー及びＡｄｈ１ イントロン配置を
有した。
９３９ｂｐフラグメントを同様に消化されたｐＫＡ８８２のＤＮＡから調製され
たＧＵＳコード領域を含有する１８６６ｂｐフラグメントに連結した。適したプ
ラスミドを制限酵素部位マッピングにより同定し、ｐＤＡＢ３０５と命名した。
このブラスミドは、ＧＵＳ遺伝子の発現を調節するように位置するｐＤＡＢ３０
３の増強されたプロモーター、ＭＳＶリーダー及びＡｄｈ１ イントロン配置を
有した。
【０１５３】 プラスミドｐＤＡＢ３０５は、追加の３’配列を有し、ＣａＭＶ ＤＮＡのヌ
クレオチド７０９３〜７３４４として包含された増強３５Ｓ プロモーター、リ
ンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３〜７４３９、リ
ンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ、ＭＳＶのヌクレオチ
ド１６７〜１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８〜２７７、Ｃ残基及び続くトウ
モロコシ Ａｄｈ１．Ｓのヌクレオチド１２０〜２１０、トウモロコシ Ａｄｈ
１．Ｓのヌクレオチド５５５〜６７２、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧ、Ｍ
ＳＶのヌクレオチド２７８〜３１７ならびにＮｃｏ Ｉ認識配列ＣＣＡＴＧＧの
最後の塩基に相当するＧ残基を含有した。上記の通り、ＧＵＳ翻訳開始コドンは
Ｎｃｏ Ｉ部位の一部であった。このプロモーターからの転写物は５’非翻訳リ
ーダーとして本質的にＭＳＶコートタンパク質リーダー配列を含有し、その中に
トウモロコシ Ａｄｈ１．Ｓ イントロン １の欠失変異形が挿入されていた。
クレオチド７０９３〜７３４４として包含された増強３５Ｓ プロモーター、リ
ンカー配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、ＣａＭＶのヌクレオチド７０９３〜７４３９、リ
ンカー配列ＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ、ＭＳＶのヌクレオチ
ド１６７〜１８６、ＭＳＶのヌクレオチド１８８〜２７７、Ｃ残基及び続くトウ
モロコシ Ａｄｈ１．Ｓのヌクレオチド１２０〜２１０、トウモロコシ Ａｄｈ
１．Ｓのヌクレオチド５５５〜６７２、リンカー配列ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧ、Ｍ
ＳＶのヌクレオチド２７８〜３１７ならびにＮｃｏ Ｉ認識配列ＣＣＡＴＧＧの
最後の塩基に相当するＧ残基を含有した。上記の通り、ＧＵＳ翻訳開始コドンは
Ｎｃｏ Ｉ部位の一部であった。このプロモーターからの転写物は５’非翻訳リ
ーダーとして本質的にＭＳＶコートタンパク質リーダー配列を含有し、その中に
トウモロコシ Ａｄｈ１．Ｓ イントロン １の欠失変異形が挿入されていた。
【０１５４】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パレツデイ，ダヤカー・アール アメリカ合衆国インデイアナ州46033カー メル・ウツドバインドライブイースト665 (72)発明者 ホプキンス，ニコル・エル アメリカ合衆国インデイアナ州46268イン デイアナポリス・チエイスウエイコート 2518 (72)発明者 アームストロング，キヤサリン アメリカ合衆国インデイアナ州46077ザイ オンズビル・ブライドルウツドトレイル 11202 Ｆターム(参考） 2B030 AA07 CA14 CA16 CA17 CA19 CD09 CD17 4B024 AA08 AA20 CA20 DA01 EA04 GA11 4B065 AA01Y AA88X AA88Y AA89X AB01 BA02 CA53
Claims (11)
- 【請求項１】 （ａ）Ｉ型、ＩＩ型、胚軸−由来もしくは子葉−由来カルス
培養から、又は分裂組織、花粉、子葉もしくは胚細胞組織から少なくとも１種の
細胞を選択し； （ｂ）ホイスカー媒介形質転換により該細胞中にＤＮＡを挿入する ことを含む植物細胞の形質転換のための方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法により生産される細胞の再生を含む稔性形質
転換植物の生産のための方法。 - 【請求項３】 （ｉ）形質転換されるべき植物から再生可能なカルス培養を
確立し、ここで該カルス培養はＩ型、ＩＩ型、胚軸−由来及び子葉−由来カルス
培養から成る群より選ばれ；（ｉｉ）形質転換のための植物細胞凝集体をそこか
ら選択し；（ｉｉｉ）ホイスカー−媒介形質転換によりＤＮＡを用いて該植物細
胞凝集体を形質転換し；（ｉｖ）そこから形質転換された細胞系を同定し；そし
て（ｉｖ）そこから稔性形質転換植物を再生させる段階を含む稔性形質転換植物
の生産のための方法。 - 【請求項４】 該Ｉ型カルス培養をゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）又は
オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）から確立する請求項３の方法。 - 【請求項５】 該ＩＩ型カルス培養をゼア・メイズから確立する請求項３の
方法。 - 【請求項６】 該胚軸−由来培養をゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐ
ｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）から確立する請求項３の方法。 - 【請求項７】 該子葉−由来培養をゴシピウム・ヒルスツムから確立する請
求項３の方法。 - 【請求項８】 該植物細胞凝集体を固体培地上でイニシェーションする請求
項３の方法。 - 【請求項９】 請求項３〜８のいずれか１つの方法により生産される稔性形
質転換植物。 - 【請求項１０】 植物細胞において機能性で配列番号：１に従うＤＮＡ配列
を有する転写調節領域ならびにセンスもしくはアンチセンス配向のいずれかにあ
る問題の遺伝子を転写の５’から３’への方向で含む植物細胞中で機能性のＤＮ
Ａ構築物。 - 【請求項１１】 配列番号：１のＤＮＡ配列を含む請求項１０に従う転写調
節領域。
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