CN1620506A - 利用d－氨基酸的选择性植物生长 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达异源D－氨基酸代谢酶并且因此可利用D－氨基酸作为氮源的植物和植物细胞。提供了应用D－氨基酸选择性调控此类植物的生长和逆境耐性的方法和手段。

Description

利用D-氨基酸的选择性植物生长
本发明涉及含有外源遗传物质的植物细胞、植物组织或维管植物的选择性生长。
植物需要大量的氮作为矿质营养素。植物生长，特别是在农业中，通常受到可获得氮量的限制。
传统上一直认为植物仅能利用铵和/或硝酸盐作为氮源。这些化合物要么由如有机氮的矿化和共生的原核生物固氮作用的自然过程提供，要么通过施用含有经工业固定的氮的肥料提供。
然而最近的研究表明，植物也可以利用某些有机氮化合物以及无机氮(Nholm，T.等(1998)，Nature，392：914-916；Nholm，T.等，(2000)，Ecology，81：1155-1161；Nholm，T.和Persson，J.(2001)，Physiol Plant，111：419-426；Lipson，D.和Nholm，T.(2001)，Oecologia 128：305-316)。特别是，从土壤中吸收和代谢氨基酸似乎是植物的普遍特征。
在所有用作构建蛋白质的氨基酸中，发现除一种氨基酸(甘氨酸)外所有的氨基酸均具有两种异构体形式，这两种异构体利用其旋转偏振光的能力进行区分。自然界中使光左旋的异构体的量最多，并将其命名为L-或左旋的，而较少见的异构体形式命名为D-或右旋的。
虽然在自然界中存在D-氨基酸，但它们仅以极低的浓度存在，并且仅存在于如细菌细胞壁蛋白质的特定化合物中(如在化合物肽葡聚糖中)。
尽管植物氨基酸转运蛋白介导D-和L-两种形式的氨基酸的运输(Soldal，T.和Nissen，P.(1978)，Physiol.Plant.43：181-188，Boorer，K.J.等.1996.J.Biol.Chem 271：2213-2220，Montamat等，1999，Plant Mol.Biol.41：259-268)，但是植物缺乏将D-氨基酸转换成在可用于植物体内合成反应的氮形式所必需的酶。因此植物不能利用D-氨基酸作为氮源。
然而细菌、真菌和动物中普遍存在着代谢D-氨基酸的能力。导致生物体内D-氨基酸分解代谢的几种反应已得到描述(参见图2)(Friedman，M(1999)J.Agric.Food Chem.47：3457-3479，Pilone，M.S.(2000)CMLS 57：1732-1747，Yurimoto等，(2000)Yeast 16(13)：1217-1227)。
本发明者已经发现，表达编码代谢D-氨基酸的酶的异源基因的植物能够利用该D-氨基酸作为氮源，并能够在不能使野生型植物生长的培养基上生长。
通常，仅需要一种D-氨基酸代谢酶即可将D-氨基酸转换成可参与普通植物氮代谢路径的化合物(即非右旋化合物)。例如，可应用D-丝氨酸脱水酶将D-丝氨酸转换成氨、丙酮酸和水，可应用D-氨基酸氧化酶将D-氨基酸转换成氨、酮酸(由D-氨基酸底物决定)和过氧化氢。因此，组成D-氨基酸的否则无法利用的氮能被酶促转化成植物可易于利用的形式。
本发明的一个方面是提供了一种包含有编码具D-氨基酸代谢活性的多肽的序列的分离核酸，该序列可操作地连接到一种或多种植物特异的调节元件。
在本发明的一些实施方案中，分离核酸可由编码具有D-氨基酸代谢活性的多肽的序列和一种或多种与该序列可操作地连接的植物特异的调节元件组成。
在一些实施方案中，D-氨基酸可用作选择性标记。上述的分离核酸可进一步包含编码目的多肽的异源核酸序列。例如，该多肽的表达可以有利方式改变植物的表型或产生其它有利的影响。具有D-氨基酸代谢活性的多肽的表达允许包含该异源核酸序列的转化株的有效筛选，如此处所描述的。
具有D-氨基酸代谢活性的多肽意指这样的多肽，所述多肽将D-氨基酸底物转化成的产物用作内源植物酶的底物(即该底物可由植物进行代谢)。由植物进行代谢的产物包括非右旋化合物，即非手性或L-化合物。因此，D-氨基酸代谢多肽催化D-氨基酸底物向产物的生物化学转化，所述产物如非右旋产物，这些产物可以被植物用作营养源，特别是用作氮源。
适宜的D-氨基酸代谢多肽可为真核生物酶，例如来于酵母(例如纤细红酵母(Rhodotorula Gracilis))、真菌或动物的酶，或为原核生物酶，例如来于细菌如大肠杆菌的酶。代谢D-氨基酸的适宜多肽的示例在表1和表2中显示。
如上所述，还未报道在植物内发现内源的D-氨基酸代谢活性。
用于D-氨基酸代谢多肽的底物可为D-arg、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-asn、D-phe、D-pro、D-ser、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
其它作为D-氨基酸代谢酶的适宜底物包括非蛋白的右旋氨基酸、右旋氨基酸前体及右旋氨基酸衍生物。此类底物仅在由D-氨基酸代谢酶使之转化成适宜的可代谢形式之后才可能被用作植物氮源。适宜的前体包括D-鸟氨酸和D-瓜氨酸。
优选地用于D-氨基酸代谢多肽的底物为D-ser，D-asn，D-ala，D-ile，D-glu，D-arg，D-lys，D-his或D-asp中的一种，更优选地为D-ala，D-ile或D-ser。
在D-氨基酸中非手性酰胺基团的存在可能导致少量的植物生长，这是由于该基团通常能够由植物代谢并用作氮源。例如，在含D-gln的培养基上，内源的谷氨酸合成酶作用于非手性酰胺基团并产生D-glu。因为该非手性活性的产物是其它的自身不能被内源的植物酶代谢的D-氨基化合物，利用这些D-氨基酸生长的生长速率很低，尽管一些氮是可用的。
D-氨基酸代谢多肽可为如氧化酶、消旋酶、脱羧酶、转氨酶、脱水酶(也称作氨裂解酶)。氧化酶催化D-氨基酸转化成NH4 +、酮酸(取决于D-氨基酸底物)和H2O2(参见图2)。消旋酶将D-氨基酸转化成相应的L-氨基酸形式。L-氨基酸可用作植物氮源。脱羧酶将D-氨基酸转化成可由植物代谢的γ-氨基酸。转氨酶将D-氨基酸转化成不同的L或D氨基酸形式。L-氨基酸能直接被代谢，而D-氨基酸则需进一步转化成可代谢的形式。脱水酶催化D-氨基酸转化成NH4 +、酮酸(取决于D-氨基酸底物)和H2O(参见图2)。适宜的氧化酶、消旋酶、脱羧酶、转氨酶和脱水酶的示例在表1和表2中显示。
在优选的实施方案中，D-氨基酸代谢多肽为脱水酶，例如D-ser氨裂解酶(以前称作D-ser脱水酶)，或为氧化酶，如D-氨基酸氧化酶。
采用常规技术，技术人员能够容易地确定多肽是否具有D-氨基酸代谢活性(即其为D-氨基酸代谢酶)，如上所述。
适宜的D-氨基酸代谢多肽也包括该多肽的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因，所述多肽在表1和表2进行示例。
适宜的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因保留了D-氨基酸代谢多肽的功能特性，即其催化D-氨基酸底物转化成植物可代谢形式的反应。产生突变体、变体或衍生物的序列变化可为核酸中一处或多处一个或多个核苷酸的添加、插入、缺失或替换，导致所编码多肽中出现一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或替换。当然，也包括不使所编码氨基酸的序列发生变化的核酸改变。
代谢D-氨基酸底物的多肽可包含与表1或表2中所示序列的同一性大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％、大于约55％、大于约65％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％的氨基酸序列。该序列与表1或表2中所示序列的相似性可大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％或大于约90％。
序列相似性和同一性，通常参考GAP(Genetics Computer Group，麦迪逊，WI)算法进行定义。GAP用Needleman和Wunsch算法进行两条完整序列的比对，以达到最大匹配数和最小化缺口(gap)数。通常应用默认参数，其缺口创建罚分＝12，缺口延伸罚分＝4。
尽管应用GAP为优选，但也可应用其它算法，例如BLAST(该算法应用Altschul等，(1990)J.Mol.Boil.215：405-410的方法)、FASTA(该算法应用Pearson和Lipman，(1988)PNAS USA 85：2444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol.Boil.147：195-197)或前述的Altschul等人(1990)的TBLASTN程序，所述程序通常应用默认参数。特别是，可应用psi-Blast算法(Nucl.AcidsRes.(1997)25 3389-3402)。
相似性允许“保守变异”，例如将如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的疏水残基替换为另一疏水残基，或将一极性残基替换为另一极性残基，如精氨酸替换为赖氨酸、谷氨酸替换为天冬氨酸或谷氨酰胺替换为天冬酰胺。特定的氨基酸序列变体可能与此处描述的已知多肽的序列不同，所述变体通过插入、添加、替换或缺失1、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50个氨基酸而形成。
植物特异的调控序列或元件是指相对于其它细胞类型而言优选地指导植物细胞内核酸表达(即转录)的序列。
例如，该序列在非植物细胞如细菌或哺乳动物细胞内的表达可降低或失效。例如，适宜的调控序列可来自植物病毒如花椰菜花叶病毒35(Cauliflower Mosaic Virus 35)。
调控序列优选地异源或外源于编码D-氨基酸代谢酶的基因。这种调控序列可在植物细胞内提供有效的表达。
术语“异源的”可用于指出所研究的核苷酸基因/序列已导入到该植物细胞或其祖先，所述导入利用基因工程或重组方法，也即通过人工干预进行。
对植物细胞而言异源的或外源的核苷序列在所述类型、品系或种类的细胞内可为非天然存在。例如，未见报道植物细胞内含有D-氨基酸代谢酶(即将D-氨基酸转化成植物可代谢形式的酶)，且因此编码具有该活性的多肽的核酸对于用其进行转化的植物细胞而言是“异源的”。
除了与编码D-氨基酸代谢多肽的基因异源的调控序列之外，核酸可包含一个或多个源自D-氨基酸代谢多肽的内源启动子的顺式元件。
“启动子”意指这样的核苷酸序列，即该序列可启动与其可操作地连接的下游(即双链DNA有意链上的3’方向)DNA的转录。
“可操作地连接”是指作为同一核酸分子的一部分进行连接、置于适宜的位置并正确导向以使其可由启动子启动而进行转录。可操作地连接到启动子的DNA置于启动子的“转录启动调节之下”。
适宜的调节元件可包括与核酸编码序列可操作地连接的诱导型启动子。本发明也提供了用该基因构建体转化的植物细胞和方法，所述方法包括将该构建体导入植物细胞和/或诱导构建体在植物细胞内表达，例如通过施用适宜的刺激而实现。
本领域内的技术人员充分理解用于启动子的术语“可诱导的”。本质上而言，对施加的刺激(该刺激可为细胞内产生或外源提供)作出响应时在诱导型启动子控制下的表达得以“打开”或增加。在不同启动子间刺激的本质存在差异。无论缺乏刺激时的表达水平如何，在恰当的刺激存在时，源自任何诱导型启动子的表达均得以提高。优选的情形是，在有效量的相关刺激存在下的表达水平提高改变了表型特征，即增强D-氨基酸的耐受。因此诱导型(或“可开启的”)启动子可用于在缺乏刺激时引起基础水平的表达，所述水平太低(且实际上有可能为零)以至于不能导致产生所需的D-氨基酸耐受表型。在施加刺激后，表达提高(或开启)到可引起D-氨基酸耐受增强的水平。
诱导型启动子的多种示例为本领域内的技术人员已知。
其它的适宜启动子可包括实际上在所有植物组织中均以高水平表达的花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)基因启动子(Benfey等，(1990)EMBO J9：1677-1684)；在蔬菜顶端分生组织及一些植物体的局限部位如内韧皮部、花原基、根和新芽的发枝点表达的花椰菜meri 5启动子(Medford，J.I.(1992)Plant Cell 4，1029-1039；Medford等，(1991)Plant Cell 3，359-370)，以及在花发育非常早期表达的鼠耳芥LEAFY启动子(Weigel等，(1992)细胞(Cell)69，843-859)。其它示例在下述出版物的第120页公开，Lindsey和Jones(1989)，“农学植物生物技术(PLANT BIOTECHNOLOGY inAGRICULTURE)”，OU Press出版，Milton Keynes，英国。
本发明提供了包含如上所述的核酸的载体，例如质粒或病毒表达载体。
如此处所描述的，从编码核酸表达具有D-氨基酸代谢活性的多肽可被用于筛选含有如此处描述的核酸构建体或载体的转化株。
在一些实施案例中，载体另外包括由嵌合基因组成的选择性遗传标记，所述嵌合基因赋予载体可选择的表型，例如抗生素的抗性，如卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、绿黄隆(chlorsulfuron)、氨甲蝶呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮类和草甘膦抗性。如果需要，除应用D-氨基酸代谢多肽的表达进行筛选之外，上述标记允许进行二级筛选。
本发明的另一方面提供了如此处所描述的核酸在产生转基因植物中的应用。该方法可允许进行下述转基因植物的筛选或选择性繁殖，所述转基因植物包含外源遗传物质或可用于提高植物对D-氨基酸的耐受。优选地通过将植物或植物细胞培养在下述的培养基中进行筛选，所述培养基具有包含D-氨基酸的详细定义的氮含量，即培养基中的氮全部或部分以D-氨基酸形式存在。
培养基中D-氨基酸的特性通过植物或植物细胞表达的异源D-氨基酸代谢多肽的专一性确定，即培养基含有异源D-氨基酸代谢多肽的D-氨基酸底物。例如，当植物表达异源D-丝氨酸脱水酶时，培养基中需存在D-丝氨酸。
根据本发明的核酸可提供为从自然环境中分离和/或纯化而获得的核酸，为相当纯的或均质的形式，或其不含或基本不含来源于该物种的其它核酸。这里用到的术语“分离的”包含所有的这些可能性。
当然，核酸可为双链或单链的cDNA、基因组DNA或RNA。因此可在适宜的条件下在适宜的宿主植物细胞内由编码核酸进行表达制备表达产物。
核酸分子可为全部或部分合成的分子。特别是，核酸分子可为重组体，其中在自然中并不共同存在(并非邻近存在)的核酸序列已经被连接或人工组合。备选地，可直接合成核酸分子，例如应用自动合成仪进行合成。
本领域内那些技术人员能够很好地构建载体，并为重组基因表达设计方案，特别是在植物细胞内中的表达。可选择或构建包含适宜调控序列的适宜载体，所述调控序列包括启动子序列、终止子片断、聚腺苷酸化序列、增强子顺序、标记基因和其它适宜的序列。更多的细节参见，例如分子克隆：实验手册：第三版，Sambrook和Russell，2001，冷泉海港实验室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
“载体”定义为其中包括双链或单链的线型或环型的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体，载体可是或不是可自身传递的或可移动的，且其可转化原核或真核宿主，特别是植物宿主，所述转化通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)实现。
特别地包括穿梭载体，该载体是指其天然具有或通过设计而具有在两种不同生物体内进行复制的能力的DNA载体，该载体可筛选自于放线菌及相关物种、细菌和真核(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌)细胞。
用于操纵核酸的多种已知技术和方法如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞以及基因表达和蛋白分析在以下中详细描述，分子生物学方法(Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等编辑，JOHN WILEY & SONS，1992。
Bevan等(Bevan等，核酸研究(Nucl Acids Res.)(1984)12，8711-8721)以及Guerineau和Mullineaux(Guerineau和Mullineaux(1993)植物转化与表达载体，在：Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD编辑)牛津，BIOS Scientific Publishers，121-148页)描述了之前已用于植物并获得广泛成功的具体方法和载体。
当将核酸构建体导入细胞时，必须考虑为本领域内技术人员所熟知的因素。必须有可将该构建体导入细胞的可用方法。一旦该构建体位于细胞膜内，将发生或不发生与内源染色体物质的整合。D-氨基酸代谢基因的表达产物可定向于细胞内的特定小室，例如过氧化物酶体或胞质，也或者产物在细胞的任何地方表达。最后，就植物而言，靶细胞类型必须是能够再生成整个植株的细胞。
可应用本领域内的技术人员熟知的技术将核酸构建体和载体导入植物细胞以产生具有适当D-氨基酸耐受表型的转基因植物。
农杆菌转化是本领域内的技术人员广泛应用的转化植物细胞特别是双子叶物种植物细胞的方法。对几乎所有的经济学相关的单子叶植物，其稳定、可繁殖的转基因植物的产生目前均为常规操作：(Toriyama等，(1988)BIO/TECHNOLOGY 6，1072-1074；Zhang等，(1988)Plant Cell Rep.7，379-384；Zhang等，(1988)Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto等，(1989)Nature 338，274-276；Datta等，(1990)BIO/TECHNOLOGY8，736-740；Christou等，(1991)BIO/TECHNOLOGY 9，957-962；Peng等，(1991)国际水稻研究所(International Rice Research Institute)，菲律宾马尼拉，563-574；Cao等，(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li等，(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore等，(1993)植物分子生物学(Plant Molecular Biology)21，871-884；Fromm等，(1990)BIO/TECHNOLOGY 8，833-839；Gordon-Kamm等，(1990)植物细胞(Plant Cell)2，603-618；D′Halluin等，(1992)植物细胞(Plant Cell)4，1495-1505；Walters等，(1992)植物分子生物学(Plant MolecularBiology)18，189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology 11，194-200；Vasil，I.K.，(1994)植物分子生物学(Plant Molecular Biology)25，925-937；Weeks等，(1993)植物生理学(Plant Physiology)102，1077-1084；Somers等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，1589-1594；WO92/14828)。特别是，农杆菌介导的转化目前是一种高效的用于单子叶植物的转化方法(Hiei等.(1994)植物学杂志(The Plant Journal)6，271-282)。
本发明的诸方面提供了用于该转化方法的表达载体和包含该表达载体的根瘤农杆菌，所述表达载体为卸甲农杆菌Ti质粒。
用此方法已在谷物大米、玉米、小麦、燕麦和大麦中产生了可繁殖的转基因植物(参见Shimamoto，K.(1994)Current Opinion in Biotechnology5，158-162.；Vasil等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，667-674；VAIN等，1995，Biotechnology Advances 13(4)：653-671；Vasil，1996，NatureBiotechnology 14，702页)。Wan和Lemaux(1994)植物生理学(PlantPhysiol.)104：37-48中描述了能够用于产生大量独立转化的可繁殖大麦植物的技术。
当农杆菌转化效率低或无效时，可优选应用其他方法，如微投射或粒子轰击(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)、电穿孔(EP 290395，WO 8706614)、显微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP175966，Green等.(1987)植物组织和细胞培养(Plant Tissue and CellCulture)，学院出版社(Academic Press)、直接的DNA摄入(DE 4005152，WO 9012096，US 4684611)、脂质体介导的DNA摄入(例如Freeman等，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol)，29：1353(1984))或涡旋方法(如Kindle，PNAS U.S.A.87：1228(1990d))。
特别地，可应用粒子轰击技术进行裸子植物如针叶树的转化(Clapham，D.等.2000.Scan.J.For.Res.15：151.160)。用于植物细胞转化的物理方法在Oard，(1991)Biotech.Adv.9：1-11中综述。
备选地，可应用不同技术的组合来提高转化方法的效率，例如用农杆菌包被的粒子轰击(EP-A-486234)或用微投射轰击来诱导产生伤口随后与农杆菌共培养(EP-A-486234)。
转化后，可由如单细胞、愈伤组织或叶盘进行植物再生，上述为领域内的表标准技术。几乎所有的植物均可通过其细胞、组织和器官获得完全再生。可应用的技术在以下中综述，Vasil等，植物的细胞培养与体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，第I、II和III卷，实验方法及其应用(Laboratory Procedures and TheirApplications，)，学院出版社，1984以及WEISSBACH与Weissbach，植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)，学院出版社，1989。
具体转化技术的选择由其转化靶植物种的效率以及掌握特定方法的使用者的经验及偏爱决定。对技术人员而言显而易见的是，将核酸导入植物细胞的转化系统的特定选择并非本发明的关键或限制，对植物再生技术的选择也是如此。
本发明的另一方面提供了产生细胞特别是产生植物细胞的方法，该方法包括应用转化方法将分离的核酸或含该核酸的载体掺入细胞，所述核酸包含与植物特异调控序列可操作地连接的编码D-氨基酸代谢多肽的序列。这种产生细胞的方法可包括该核酸与细胞基因组核酸的重组以将该核酸稳定掺入其中。植物可由此处描述一个或更多个经转化细胞中再生。
D-氨基酸代谢多肽、编码核酸和/或包含核酸的载体可与用其转染的细胞异源，即为外源的。
产生植物细胞的方法可包括表达核酸以及引起或允许由其表达的D-氨基酸代谢多肽在该植物细胞的胞质、过氧化物酶体、叶绿体和/或其它胞内小室内进行积聚。
制备该植物细胞的方法可包括将该核酸序列或包括该核酸的适宜载体导入植物细胞并引起或允许在载体与植物细胞基因组间发生重组以将核酸序列导入基因组内。
方法还可进一步包括有性或无性繁殖或产生由上述植物细胞再生的植物的下一代或后裔。
本发明进一步包含经上述的核酸序列或载体转化的宿主细胞，即细胞包含以上描述的核酸或载体，宿主细胞特别地为植物细胞如高等植物细胞，或微生物植物细胞。因此，提供了包含如此处所述的核苷酸序列的宿主细胞，如植物细胞。在细胞内，核苷酸序列可整合到染色体，也可能位于染色体之外。每个单倍染色体可能存在不只一种的异源核苷酸序列。例如，与内源水平相比前述情形可提高基因产物的表达，如下所述。植物细胞内包含编码序列的核酸可位于植物特异的调控元件的调控之下，例如所述调控元件为外部可诱导的基因启动子以将表达置于使用者的控制之下。
D-氨基酸代谢多肽可存在于植物细胞的胞质、过氧化物酶体或其它细胞内小室。通过下述方法可获得D-氨基酸代谢多肽的小室区域化，所述方法将编码D-氨基酸代谢多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合以产生融合蛋白。不含有该转运肽的基因表达产物通常在胞质内积聚。
稳定整合到植物基因组上的核酸一代又一代地遗传给植物后代，后代细胞可表达所编码的D-氨基酸代谢多肽，并因此可增强对D-氨基酸的耐受。
将核酸序列导入祖先细胞的结果是，植物细胞可包含与植物特异调控元件可操作地连接的编码D-氨基酸代谢多肽的核酸序列。
此处所描述的植物细胞可包含在植物、植物部分、植物繁殖体、植物提取物或衍生物之内，如下所述。
本发明也提供了包含如此处所描述的植物细胞的植物，以及提供了该植物的任何部分或繁殖体、种子、自花受精或杂交的后代及后裔。本发明特别提供了转基因单子叶植物、双子叶植物、裸子植物以及藻类、蕨类和藓类。其中值得关注的是转基因高等植物尤其是农作物和森林作物，例如谷类、树木和观赏花卉，这些植物均经过改造以携带有上述的核酸构建体。
适宜的植物的示例包括烟草、葫芦、胡萝卜、蔬菜芸苔、瓜类、辣椒、葡萄藤、莴苣、草莓、油种芸苔、甜菜、小麦、大麦、玉米、大米、大豆、豌豆、高粱属植物、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊、香石竹、白杨、桉树、棉花、亚麻籽、大麻、云杉、桦树、花生、黑麦和松树。
根据本发明的植物可在一种或多种特性上不为纯育。可将一些植物变种排除在外，特别是根据植物繁殖条款(Plant Breeders Rights)可注册的植物变种。有人指出，不应仅因为植物基因组内稳定含有由于导入植物细胞或其祖先而存在的转基因就将该植物判定为“植物变种”。
除了植物，本发明提供了该植物、种子、自花受精体或杂交后代及后裔的任意克隆，以及上述任何一项中的任意部分或繁殖体如插条及种子，可用于有性或无性的繁殖或再生。本发明也包含由该植物、该植物的任意部分或繁殖体、后代、克隆或后裔经有性或无性繁殖而获得的后代、克隆或后裔。
本发明的其它方面提供了应用D-氨基酸选择性地培养、再生或繁殖包含如上所述的异源D-氨基酸代谢多肽的转基因植物细胞、植物组织或维管植物。
产生转基因植物的方法可包括：用包含编码多肽的序列的核酸或载体转化植物细胞，所述多肽代谢如这里所述的D-氨基酸底物；以及在包含特定氮源的培养基上将细胞再生为植物，其中所述的特定性氮源包含该D-氨基酸底物或由其组成。
经转化的植物细胞能够利用存在于培养基中的D-氨基酸作为氮源。未经转化或不含具有D-氨基酸代谢活性多肽的细胞不能利用这种氮源，且因此细胞的生长受到限制。此外，培养基中的D-氨基酸对未转化的植物(该植物不具有D-氨基酸代谢活性)可能具有毒性作用。
培养基中适合用作D-氨基酸代谢酶底物的适宜D-氨基酸可包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ALA、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr和D-val。优选地应用D-ser、D-ala、D-glu、D-asn、D-arg、D-lys、D-His或D-asp其中之一，更优选地应用D-ala或D-ser。这些D-氨基酸对于不含有适宜D-氨基酸代谢酶的植物来说具有毒性。
用于D-氨基酸代谢酶的其它适宜底物包括非蛋白氨基酸、氨基酸前体及氨基酸衍生物。
氮通常是农业系统中限制植物生长的元素。对于表达代谢D-氨基酸的酶的转基因植物而言，应用下述组合物作为优选的或可选择的肥料，所述组合物中的部分或全部氮含量以一种或多种D-氨基酸的形式存在(即肥料的氮含量部分或全部为一种或多种D-氨基酸的形式)。不表达该酶的非转基因植物从该肥料组合物中的获益将降低。在一些实施方案中，D-氨基酸对该植物具有毒性并明显阻碍或限制其生长。例如，D-ser对野生型植物具有毒性(图3)。
本发明的另一个方面提供了用作下述转基因植物的选择性培育的组合物；所述转基因植物包含此处描述的代谢D-氨基酸底物的多肽；所述组合物包含该D-氨基酸底物。
组合物中氮含量的全部或部分可为D-氨基酸底物形式(即其为组合物中的唯一氮源或多种氮源之一)。组合物中以D-氨基酸形式存在的可用氮的比例可为0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
适合用于组合物中的D-氨基酸底物包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
优选地应用D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asn或D-asp其中之一，更优选地应用D-ala或D-ser。这些D-氨基酸对于不含有代谢该D-氨基酸的异源多肽的植物来说具有毒性，因而起到既促进目标植物的生长又抑制不需要的植物生长的“双重”作用。
用于D-氨基酸代谢多肽的其它适宜底物包括非蛋白D-氨基酸、D-氨基酸前体和D-氨基酸衍生物。
产生如上所述的肥料的方法可包括提供缺乏或实质上缺乏氮源的植物肥料组合物，以及将该组合物与此处描述的D-氨基酸底物混合。
本发明的另一个方面提供了含有如上所述的D-氨基酸的选择性除草剂组合物。
该除草剂将抑制或限制不含有适宜D-氨基酸代谢酶的植物的生长，而能够代谢D-氨基酸的转基因植物的生长将不会受到影响，或优选地，生长得到提高或促进。
组合物可包含0.1％(w/w)或更多、1％(w/w)或更多、5％(w/w)或更多、10％(w/w)或更多、15％(w/w)或更多、20％(w/w)或更多、25％(w/w)或更多、30％(w/w)或更多的D-氨基酸。
该除草剂组合物可用于控制植物生长的方法中，所述方法包括应用该组合物处理一种或多种植物。
产生该除草剂组合物的方法可包括将D-氨基酸与基质、载体或赋形剂混合物。
用于农业特别是除草剂组合物中的适宜基质、载体或赋形剂为本领域内公知。
D-氨基酸通过氨基酸氧化酶代谢产生过氧化氢(H2O2)。该化合物用作植物中诱导防御反应的信号。该反应通常由环境压力引发，所述环境压力如过量光线、寒冷或病原体感染。
含D-氨基酸氧化酶的植物对添加的D-氨基酸作出响应，产生增加的H2O2并由此触发防御反应。这就提供这样的一种机制，即通过该机制植物的防御反应可由培养者特异地触发。将D-氨基酸添加到表达D-氨基酸氧化酶基因的植物内，导致内源的H2O2产物突现，该产物在这些植物内诱导产生正常的防御反应。当将植物从户内移动到户外环境时培养者可引发该防御反应以提高植物的逆境耐性，当存在霜冻害危险时可引发该防御反应以增加植物的冰冻耐性，当已知害虫和病原体积聚或处于其它的情况时，植物体内积极防御反应具有潜在好处。
产生具有可诱导的应激反应的转基因植物的方法可包括：将编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列转化植物细胞；以及由该植物细胞再生转基因植物。
刺激转基因植物的逆境耐性的方法可包括：在该植物内表达氧化D-氨基酸底物的多肽；以及用D-氨基酸底物处理该植物。
适宜的D-氨基酸氧化酶多肽在以上描述并在表1和表2中示例。
适当剂量的D-氨基酸刺激应激反应而不引起永久的细胞损害。尽管精确剂量根据植物类型、生长阶段、土壤类型、温度和气候条件的不同而存在差异，但也可容易地由技术人员应用常规方法学测定出用于特定情形的剂量。
在一些优选实施方案中，可应用高水平的D-氨基酸诱导逆境耐性，例如培养基中的D-氨基酸浓度为从0.1到50mM，更优选地从1到10mM。
与正常的、未处理的植物相比，逆境耐性的改善可提高或增强对环境压力的耐性，所述环境压力如紫外线UV辐射、极端温度、辐射和/或病原体感染，如细菌或真菌感染，特别是引起坏死的病原体的感染。
如果存在下述情况则如上所述的由D-氨基酸氧化酶产生的H2O2或D-氨基酸代谢产物的积聚对转基因植物可能是有害的，即如果产率高和/或如果产物产生在对H2O2或其它代谢产物敏感的细胞小室内时。
因此本发明的方法可用于从混合群体中选择性地移除转基因植物，或甚至从天然群体中移除转基因植物与野生型间的杂合体。
如此处描述的使表达氧化D-氨基酸底物的多肽的转基因植物的生长或生存能力受到抑制的方法可包括：用D-氨基酸底物处理该植物。
D-氨基酸氧化酶在过氧化物酶体内的定位表达使得产生的H2O2能够可迅速由H2O2降解酶即过氧化氢酶代谢掉。因此需要高水平的D-氨基酸以产生破坏性水平的H2O2。在过氧化氢酶活性较低的胞质内，D-氨基酸氧化酶的表达降低了所需的产生有破坏性水平H2O2的D-氨基酸的量。
可通过移除编码核酸序列中的过氧化酶体靶向信号或转运肽来获得D-氨基酸氧化酶在胞质内的表达。
因此添加D-氨基酸可用于抑制或降低其胞质内具有D-氨基酸氧化酶活性的转基因植物的生长或生存能力。
在此描述的使得表达氧化D-氨基酸底物的多肽的转基因植物的生长或生存能力受到抑制的方法可包括：引起或允许在该植物胞质内积聚该多肽；以及用D-氨基酸底物处理该植物。
下述D-氨基酸特别适用于该方法，即该D-氨基酸对野生型植物呈现出低毒性，但当其在含有外源D-氨基酸氧化酶的转基因植物内进行代谢之后导致产生H2O2产物或其它的有毒代谢产物，所述D-氨基酸如D-ile、D-asn或D-gln。
可在此处描述的方法中进行适宜的对照试验。本领域内的技术人员具有足够的能力来进行适宜的对照试验。
由本公开来看，本发明的多种进一步的方面和实施方案对于那些领域内的技术人员而言是显而易见的。本说明书中所有提及的文件在此全部引入作为参考。
本发明的某些方面和实施方案将通过以下描述的实施例和图的参考进行阐述。
图1显示鼠耳芥植物在无菌琼脂培养基上且提供以不同的N源生长20天的鲜重。对照植物不提供任何氮源进行培养。
图2显示生物体内D-氨基酸的潜在代谢转化的示例。
图3显示野生型植物(Wt；黑色柱)和经编码细菌酶D-丝氨酸脱水酶的细菌基因转化的植物(dsdA21，浅灰色柱)的鲜重，前述植物培养在无菌琼脂上并提供以带有(MS)或不带有(MS-N)标准氮源、硝酸盐的不同浓度(2.5，30，3和0.3mM)的D-丝氨酸。
图4显示萌芽后培养14天所收获的鼠耳芥的生物量(a)与氮含量(b)。植物培养于除了D-丝氨酸外不含其它氮源的半强度MS培养基上。空白柱为表达dsdA的转基因植物，阴影柱为野生型植物。柱代表平均值±标准差，n＝4。
图5显示萌芽后培养鼠耳芥14天所收获的生物量(a)与氮含量(b)。植物培养在3mM硝酸盐作为基本N源并以不同的D-丝氨酸浓度作为改良的半强度MS培养基上。空白柱为表达dsdA的转基因植物，阴影柱为野生型植物。柱代表平均值±标准差，n＝4。
表1和表2显示具有可根据本发明使用的具有D-氨基酸代谢活性的多肽的例子。
实验
方法
鼠耳芥属转化
应用引物5’-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGG和5’-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG通过PCR扩增大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18]NCBI编号J01603)。将PCR产物亚克隆到pT-easy(Promega)中并用DYEnamics循环测序试剂盒(Amersham Pharmacia biotech)进行测序。应用数据库序列进行的比对分析确认成功获得了dsdA的全长克隆。随后将克隆连接到双元载体pPCV702Km的CAMV 35S表达盒的BamH1位点以产生载体pPCV702：dsdA，其中所述双元载体为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的卸甲Ti-质粒。用核酸内切酶对该载体的限制性分析确定了插入方向。
鼠耳芥植物，生态型Col-0，用根瘤农杆菌菌株(GV3101：pMP90 RK)通过真空浸润转化(Clough，S.J.和Bent，A.F.植物杂志(Plant Journal)，16，735-743(1998))。在含卡那霉素的平板上筛选转化子，并应用Northern印迹在分子水平上进行确认。应用转基因特性纯合的品系进行所有的分析。
表达D-氨基酸氧化酶的转基因植物的构建与上述dsdA植物基本相同，改变之处在于：以下述cDNA文库作为模板通过PCR克隆源自酵母菌中纤细红酵母(Rhodosporidium toruloides)的daol基因(EC：1.4.3.3：NCBIU60066)，所述文库从在含D-丙氨酸培养基上进行培养以诱导靶基因表达的酵母中进行制备。PCR引物为5’-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG和5’-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA。
用另一套引物进行PCR扩增，其中的一条引物位于如上列出的开放读码框5’末端的外侧且和3′引物不包括最后6个核苷酸。后9个核苷酸编码信号肽SKL，该信号肽将蛋白质引导到过氧化物酶体亚细胞器上。
产生的扩增序列所编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列在其在细胞内的定位不同。不带有信号肽的截短多肽在胞质中表达，而全长多肽在过氧化物酶体表达。
植物培养
来自未经转化植物和经D-丝氨酸氨裂解酶转化的植物鼠耳芥种子用70％乙醇和0.1％吐温80进行10分钟的表面消毒并用95％乙醇快速漂洗。每个平板上接种10粒种子，而后培养皿用空气透过型带密封。生长培养基为半强度MS(Murashige，T.和Skoog，F.Physiol Plant 15，310-313(1962))(含0.5％(W/V)蔗糖和0.8％(W/V)琼脂)，培养基加有或不加有3mM硝酸盐作为氮源。培养基高压蒸汽灭菌后，将过滤除菌的D-丝氨酸加入到培养基中。植物萌芽后以16小时光周期于24℃培养14天。从培养皿中取出植物，在0.5mM的CaCl2中漂洗3次，然后于40℃干燥48小时，之后测干重。干燥植物的N含量用元素分析仪(PerkinElmer 2400CHN)进行测定。测量基于每个平板的生物量和氮含量，且每个平板有10株植物。对6种单独的转基因品系在D-丝氨酸上的生长能力进行评估，尽管根据RNA印迹分析发现dsdA转录水平存在相当大的变化，但未在品系间发现实质性差异。
用于云杉转化时，表达载体具有含35S表达盒的pUC8骨架，所述表达盒具有dsdA和用于basta筛选目的的pUbi-Bar(泛素启动子，具有赋予basta抗性的Bar基因)盒。应用的转化方法为细胞悬液的粒子轰击法。
结果
D-氨基酸对野生型植物生长的影响
观察野生型鼠耳芥植物应用不同氮源在无菌琼脂培养基中的生长。结果在图1中显示。观察到培养于D-氨基酸培养基上的植物很少或没有生长。
对来自茄(Solanum esculentum)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、山杨(Populus tremuloides)、烟草(Nicotiana tabacum)和鼠耳芥的种子进行表面消毒，并在琼脂培养基上生长2到3周，其中所述的琼脂培养基与上述无硝酸盐培养基完全相同并补充以0、0.3、3和30mM的D-丝氨酸。观察到番茄(Lycopersicon esculentum)、山杨、烟草和鼠耳芥的生长在培养基中D-丝氨酸浓度为3mM时受抑制，而玉米和大麦的生长则在30mM时受抑制。
观察了D-丝氨酸和几种其它的D-氨基酸对野生型鼠耳芥和其它物种的生长抑制。对于鼠耳芥，生长培养基中D-丝氨酸浓度为0.3mM时观察到明显的生长抑制，且浓度为3mM时生长完全受到抑制(图2)。
欧洲云杉(Picea abies)的体胚细胞悬浮培养物应用其浓度范围为0、0.3、3和30mM的D-丝氨酸进行培养。D-丝氨酸在3mM及高于3mM对细胞是致死性的。发现在含3mM D-丝氨酸的D-丝氨酸培养基上筛选经dsdA-转化的胚芽是可能的。
这些结果证明了D-氨基酸对于野生型植物的除草剂特性。
表达大肠杆菌D-丝氨酸氨裂解酶的鼠耳芥
用大肠杆菌基因dsdA转化鼠耳芥，所述基因编码D-丝氨酸氨裂解酶[EC：4.3.1.18]并位于CAMV 35S启动子控制之下。D-丝氨酸氨裂解酶将D-丝氨酸转化成容易被植物利用的产物铵、丙酮酸和水，且经转化的植物能够以D-丝氨酸作为其唯一N源进行生长。
表达编码D-丝氨酸脱水酶的基因的转基因鼠耳芥植物在无菌琼脂上与野生型植物一同培养20天，所述琼脂培养基为标准MS培养基并补充以不同浓度D-丝氨酸(30mM、3mM、0.3mM)作为唯一N源，对照则不含任何氮源。
观察到在缺乏氮的对照培养基上转基因和野生型植物均为最小生长。观察到转基因植物的生长和N含量随着D-丝氨酸浓度增加都显著提高(方差分析，p＜0.0001)(图4a，b)。未观察到野生型植物生长的提高(图3)。在存在基础水平硝酸盐的情况下，转基因植物的生长和N含量随着D-丝氨酸浓度的增加也得以显著提高(P＜0.0001)，而野生型植物存在相反的反应(图5)。这表明D-丝氨酸对于野生型植物具有毒性作用，而对转基因植物则无毒。在观察的D-Ser范围内，转基因植物未表现出中毒症状。
无论转基因植物是否施加基础供应量的硝酸盐，其对于增加D-丝氨酸浓度所作出的相关生长反应是类似的(图4a和5a)。然而，在既提供D-丝氨酸又提供硝酸盐的植物中，植物N含量的相应反应提高(图4b和5b)。在相同浓度时，植物在硝酸盐上的生长显著高于在D-丝氨酸上的生长(图4a和5a)。然而，在3mM的D-丝氨酸上生长的植物的N浓度显著低于在3mM硝酸盐上生长的植物(ANOVA，p＜0.0001)。在D-丝氨酸上较低生长的原因还不清楚，但D-丝氨酸培养植物的N浓度相对较低可能提示与硝酸盐相比该N形式的吸收率较低。
通过在一周内往土壤中生长的鼠耳芥种苗上喷洒3次30mM的D-丝氨酸，也成功筛选出转基因鼠耳芥植物。
表达大肠杆菌D-谷氨酸消旋酶的鼠耳芥
表达大肠杆菌D-谷氨酸消旋酶的鼠耳芥植物的制备方法与上述方法基本相同。NCBI编号为AAC76949的基因murI编码消旋酶EC：5.1.1.3。根据数据库序列设计用于克隆基因的引物，并将引物设计为位于开放读码框两侧。
观察转基因植物在常规培养基和常规氮源上的生存与生长。
代谢D-氨基酸并同时产生过氧化氢的鼠耳芥
制备出表达纤细红酵母D-氨基酸氧化酶两个变种的鼠耳芥植物，所述制备按如上所述方法进行。
观察这些转基因植物在常规培养基和常规氮源上的生存和生长。
当在鼠耳芥中表达编码酵母(纤细红酵母)D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)的基因时，获得了与描述表达D-丝氨酸氨裂解酶的植物相似的结果，即在含有D-氨基酸的培养基上转基因植物的生长和N含量与野生型植物相比有所增加。
D-氨基酸氧化酶存在多种D-氨基酸底物，且以D-丙氨酸和D-丝氨酸进行的试验证实D-氨基酸氧化酶也能将这些N形式转换成可接受的N源，并因此减轻由D-丙氨酸和D-丝氨酸所引起的毒性。
观察到30mM D-Asn有效地终止了表达D-氨基酸氧化酶的植物在无菌琼脂培养基上的生长。未观察到表达D-氨基酸氧化酶的植物出现萌芽，表明其生长受到完全抑制。观察到野生型植物萌芽并缓慢长出细小绿枝。因此，野生型植物的生长仅部分地受到抑制，然后将野生型植物置于土壤中并进行恢复救治。
发现D-ile对于抑制表达dao1的转基因植物的生长甚至更为有效，而对野生型植物则无明显的抑制作用。发现在检测的浓度范围(0.3到30mM)内，野生型鼠耳芥的生长随着D-ile浓度的增加而增加。
尽管未观察到由胞质和过氧化物酶所表达D-氨基酸氧化酶存在有显著差异，但对于抑制D-氨基酸氧化酶植物在30mM D-Asn条件下的萌芽而言，发现过氧化物酶体构建体较之胞质构建体或多或少更为有效。然而，这两种构建体比野生型植物受到更显著的抑制，因此可用于条件性阴性筛选。
表达大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶)的白杨和烟草
应用与以上描述的用于转化鼠耳芥的相同载体和转化方法进行白杨和烟草的转化。
观察到，当将白杨和烟草置于根诱导培养基上时，3mM和30mM的D-Ser足以分别终止野生型白杨和烟草所有根系的形成。然而，发现经dsdA转化的烟草和白杨在D-Ser浓度超过30mM时产生了D-Ser抗性。
如此处描述而产生的转基因植物，其代谢的N形式为其它植物无法获得的N形式。这就允许将N靶向添加给混合植物环境中的该植物。所施用的D-氨基酸有着双重作用，即促进转基因植物生长并抑制其它植物的生长，当其用于农业时可产生协同作用。直接控制N源可降低良好生长所需要的N量，潜在地降低了由不需要的高N载量所引起的环境压力。此外，在作物植物具有竞争优势的农业系统中，通过使用特异的N源可减少杂草控制的需求，并降低除草剂的总需要量。
表1
酶 编号(Brenda蛋白质数据库) 来源生物体 底物
脱水酶
D-丝氨酸氨裂解酶(也称为D-丝氨酸脱水酶) EC-编号4.3.1.18 -弗氏柠檬酸杆菌(E.intermedia)-大肠杆菌(E.coli)-肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella penumoniae)-鸡 -D-Ser-D-Thr-D-别苏氨酸
氧化酶
D-氨基酸氧化酶 EC-编号1.4.3.3 -猪-人-大鼠-热带假丝酵母(Candida tropocalis)-三角酵母(Trigonopsis variabilis)-粗糙脉孢菌(Neuspora crassa)-普通小球藻(Chlorella vulgaris)-纤细红酵母 -多数D-氨基酸
D-谷氨酸氧化酶 EC-编号1.4.3.7 -普通章鱼(Octopus vulgaris)-淤泥叉肢螯虾(Orconectes limosus) -D-Asp-D-Glu
D-天冬氨酸氧化酶 EC-编号1.4.3.1 -兔-人-猪-牛-黄牛(bos taurus) -D-Asp-D-Glu-N-甲基-D-Asp-内消旋-2，3-二氨基琥珀酸(相关性未知)-顺-四氢噻唑-2，4-二羧酸(相关性未知)
消旋酶
D-谷氨酸消旋酶 EC-编号5.1.1.3 -乳杆菌属的某些种(Lactobacillus sp)-戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)-大肠杆菌(E.coli) -D/L-Glu
转氨酶
D-蛋氨酸转氨酶 EC-编号2.6.1.21 -芸苔属的某些种(Brassica sp)线粒体 -D-蛋氨酸
D-丙氨酸转氨酶 EC-编号2.6.1.21 -芽孢杆菌属的某些种(Bacillus sp)-单核细胞增生杆菌(Listeriamonocytogenes)-嗜热菌(Thermophilic bacterium) -D-Arg-D-Ala-D-Asp-D-Glu-D-Leu-D-Lys-D-Met-D-Phe-D-正缬氨酸
表2
D-氨基酸转移酶/D-氨基酸转氨酶
P54692  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DAT
P54693  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)DAT
P19938  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)芽孢杆菌属的某些种(YM-1株)DAT
007597  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DAT
085046  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)单核细胞增生杆菌DAT。
P54694  D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)溶血葡萄球菌(Staphylococcus heamolyticus)DAT
D-天冬氨酸氧化酶
P31228  D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Bos taurus(牛)DDO
Q99489  D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Homo sapiens(人)DDO
Q9UJ09  DJ 261 KS.2(D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1))Homo sapiens(人)DDO
Q9TRA3  D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(片段)Bos taurus(牛)
D-丝氨酸脱水酶
P54555  可能的D-丝氨酸脱水酶(EC4.2.1.14)(D-丝氨酸脱氨酶)枯草芽孢杆菌YQJR
P00926  D-丝氨酸脱水酶(EC4.2.1.1 4)(D-丝氨酸脱氨酶)大肠杆菌.DSDA
Q9KL72  D-丝氨酸脱水酶霍乱弧菌(Vibrio cholerae)VCA0875
Q9KC12  D-丝氨酸脱水酶(EC4.2.1.14)Bacillus halodurans.DSDA
D-氨基酸氧化酶
Q19564  推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Caenorhabditis elegans F18E3.7
P24552  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)腐皮镰孢(亚种，豌豆)(Fuarium solani(subsp.pisi))(Nectriahaematococca)
P14920  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Homo apiens(人)DAO或DAMOX
P18894  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Mus musculus(小鼠)DAO或DAO1
P00371  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Sus scrofa(猪)DAO
P22942  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Oryctolagus cuniculus(兔)DAO
O35078  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Rattus norvegicus(大鼠)DAO
P80324  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(酵母)(纤细红酵母)DAO
Q99042  D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)三角酵母(Trigonopsis variabilis)DAO1
Q9Y7N4  推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAAO)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)SPCC1450
O01739  类似于D-氨基酸氧化酶Caenorhabditis elegans F20H11.5
Q28382  D-氨基酸氧化酶(片段)Sus scrofa(猪)DAO
O33145  推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leprae)AAO
Q9X7P6  推定的D-氨基酸氧化酶天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)SC5F2A.23C
Q9JXF8  推定的D-氨基酸氧化酶黄素蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌(B血清组)(Neisseria meningitidis(serogroup B))NMB2068
Q9Z302  D-氨基酸氧化酶Cricetulus griseus(中国仓鼠)
Q9Z1M5  D-氨基酸氧化酶Cavia porcellus(豚鼠)
消旋酶
O68006  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)地衣芽孢杆菌BACA
Q9L870  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)鱼腥藻属的某些种(Anabaena sp)(PCC 7120株)MURI
O66662  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex aeolicus MURI或AQ 325
P56868  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex pyrophilus MURI
O31332  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MURI或GLR
O82826  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草杆菌变种natto(Bacillus subtilis var.Natto)MURI或GLR
P52972  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus.)MURI或GLR。
P94556  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草杆菌，RACE
O51127  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Borrelia burgdorferi(莱姆病螺旋菌)MURI或BB0100
Q9XDZ7  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)MURI
P57619  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Buchnera aphidicola(subsp.Acyrthosiphon pisum)Acyrthosipmupi或BU554
Q9PM24  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Campylobacter jejuni.MURI或CJ1652
Q9L4V5  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)棒杆菌的某些种(Carnobacterium sp.)(ST2株)MURI或GLR
Q9RU10  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Deinococcus radiodurans.MURI或DR1586。
P22634  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)大肠杆菌.MURI或DGA或GLR
P52973  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)流感嗜血杆菌MURI或HI1739.2
Q9ZLTO  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽门螺旋杆菌J99(Helicobacter pylori J99)(幽门弯曲杆菌J99(Campylobacter pylori J99))MURI或GLR或HP0549
P56068  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽门螺旋杆菌(幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori))MURI或GLR或HP0549
P48797  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)短乳杆菌(Lactobacillus brevis)MURI
Q03469  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)MURI
P46705  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leprae)MURI或B1549_C2_210
Q10626  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis.)MURI或RV1338或MTCY130.23或MTCY02B10.02
Q9RQW7  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)脑膜炎奈瑟氏球菌(A血清组)和MURI或GLR或NMA2026或NMB0458
Q08783  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)戊糖片球菌MURI
P40723  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)(片段)  鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium.)MURI
P52974  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)MURI或DGA.
P73737  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)集胞藻属的某些种(Synechocystis sp.)(PCC 6803株)MURI或SLR1746
O83421  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)苍白密螺旋体(Treponema pallidum.)MURI或TP0406
Q9KVI7  谷氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)霍乱弧菌(Vibrio cholerae.)MURI或VC0158

Claims (19)

1.分离的核酸，其包含编码具有D-氨基酸代谢活性的多肽的核苷酸序列，所述序列被可操作地连接至植物特异的调控元件。
2.根据权利要求1的核酸，其中D-氨基酸代谢活性选自氧化酶、消旋酶、羧化酶、转氨酶和脱水酶活性。
3.根据权利要求2的核酸，其中多肽在表1或表2中显示。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的核酸，其中所述D-氨基酸选自D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asp、D-asn或D-gln。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的核酸，其还包含编码异源多肽的核苷酸序列。
6.根据权利要求1到5中任意一项所述的核酸，其中具有D-氨基酸代谢活性的所述多肽包含转运肽，所述转运肽指导所述酶在所述植物细胞的胞内小室中进行积聚。
7.表达载体，其包含根据权利要求1到6中任意一项所述的核酸。
8.包含根据权利要求7的表达载体的植物细胞。
9.包含根据权利要求8的植物细胞的植物。
10.根据权利要求9的植物，其为单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、藻类、蕨类或藓类。
11.产生转基因植物的方法，该方法包括：用根据权利要求7的表达载体转化植物细胞；以及，在包含D-氨基酸的培养基上由所述细胞再生出所述植物。
12.根据权利要求11的方法，其中培养基包含唯一氮源，所述氮源由D-氨基酸组成。
13.用于对根据权利要求9或10的植物进行选择性施肥的肥料组合物；所述肥料包含D-氨基酸。
14.具有除草剂活性且包含一种或多种D-氨基酸的组合物。
15.控制植物生长的方法，该方法包括应用根据权利要求13的组合物处理植物。
16.刺激植物的逆境耐性的方法，其包括：在所述植物中表达氧化D-氨基酸底物的多肽；以及用所述D-氨基酸底物处理所述植物。
17.抑制表达氧化D-氨基酸底物的氧化酶多肽的转基因植物生长的方法；该方法包括允许所述多肽在植物胞质溶胶中积聚；以及用D-氨基酸底物处理植物。
18.根据权利要求17的方法，其中D-氨基酸底物为D-ile或D-asn。
19.根据权力要求1到6中任意一项所述核酸的用途，用在筛选经转化的植物细胞的方法中。
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