CN1284133A - 赋予植物茅草枯抗性的dna分子和用该dna分子转化的植物 - Google Patents

Abstract

编码能降解除草剂茅草枯的脱卤酶、并具有适用于小型谷物的密码子使用和DNA分子,可将其用于转化小型谷物的植物细胞,并由所述转化的植物细胞再生能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷类植物。优选的小型谷物是小麦和稻。

Description

赋予植物茅草枯抗性的DNA分子和用该DNA分子转化的植物

发明领域

本发明涉及用能对除草剂茅草枯(2，2-二氯丙酸)解毒的脱卤酶的dehal基因转化诸如小麦、大麦、稻、燕麦、triticale、黑麦、高粱和粟的小型谷物的改进方法，该方法与茅草枯结合用于在改进的分段方法中筛选所述小型谷物的转化体，具有提高了的转化体再生效率。本发明还涉及重新设计过的dehal基因，并将其用于获得具有大田水平抗性的小型谷物的转化体，这种抗性使其能用除草剂茅草枯控制窄叶杂草。

发明背景

自从大约5000年以前作物被驯化以来，杂草一直是农业的主要限制因素。农民将其大量的时间浪费在阻止杂草与作物竞争天然和人工投入的光照、水和矿物质上。很多发达国家是用选择性除草剂除草来取代大部分的耕地、机械栽培，在很多发展中国家锄地和用手拔除仍然是主要手段。

绿色革命的到来，使亚洲的小麦和稻品种开始改变。绿色革命的基础是使用矮化品种来增加收获“指数”，即谷物与茎秆的比例。高秆品种和矮化品种的生物量生产相近，但矮化品种以牺牲长的茎秆来产生谷物。绿色革命将产量增加一倍，使得肥料的使用变得经济，因为在矮化品种上肥料能产生比茎秆更多的谷物。

绿色革命品种的改进与其繁殖的一样快。不过，现代高产半矮化和矮化小型谷物，特别是小麦、大麦、以及粟和高粱及稻对杂草的竞争力不如低产的高秆品种，并且，在不使用选择性除草剂的情况下在大部分地区种植是不经济的。化学工业在开发能杀死阔叶杂草的除草剂方面一直十分成功，不过，业已找到的能控制与小型谷物密切相关的窄叶杂草的除草剂(graminocides)很少。窄叶杂草和小型谷物之间的关系有利于产生对最好的graminocides抗性(Gressel，1988a，b；Moss，1992；Powles和Matthews，1992)。窄叶杂草对用于在小麦上控制窄叶杂草的除草剂的交叉抗性的原因可能是由于细胞色素P450混合功能氧化酶系统的产生，该系统类似于被小麦用于降解除草剂的系统(Gressel，1988a，b)。情况相当糟糕，超过1/3的澳大利亚麦田目前受到一年生黑麦草(Lolium rigidum)的侵害，这种杂草不能用最近出现的选择性除草剂控制。在印度的麦田也产生了对graminocides的抗性，并且抗性杂草已经侵害了数百万英亩的土地，并且对其他graminocides有少量的抗性(Gressel，1994；Malik和Singh，1995)。野生红稻和稗属是侵害稻田的主要杂草。

杂草控制处于波动状态，有很多新问题。除草剂占发达国家所使用农药总量的60％以上。由于生态原因和政治上的压力，很多除草剂已经从市场上消失，只有很少的新型除草剂销售。克服杂草控制问题的一个出路是生产抗除草剂作物，它能通过赋予新的选择性，扩展市场上仅存的化合物的使用范围。

业已有人提出，通过遗传工程方法赋予小型谷类作物新的抗性，优选使用非植物基因，可以制止危害世界粮食供应的进化趋势(Gressel1988a，b)。不过，这一点并不容易做到，因为缺乏用于小麦的有效的转化/再生系统，并且现有的选择标记较差，这种选择标记通常是抗生性的(例如，Li等，1993；Fujimoto，1993；Peng等，1992；Bercelo等，1994)，而现在的趋势是限制含有抗生素抗性的转基因材料在环境中的传播。

业已报道了5种抗除草剂小型谷物，即含有能产生对glufosinate的抗性的bar基因的小麦、稻、大麦、高粱和燕麦(Cao等，1992；Vasil等，1992；1993；Becker等，1994；Nehra等，1994；Weeks等，1993；Rathore等，1993；Somers，1992；Wan和Lemaux，1994；Rathus等，1997)。Glufosinate是一种昂贵的有机磷除草剂，其合成是危险的(通过光气)，使得它不适用于小型谷物，因为小型谷物的生产成本投入必须很低，并且，这种除草剂的合成是在使用它的发展中国家进行的。

业已将小麦转化成具有对廉价除草剂glyphosate的抗性，不过，在澳大利亚一年生黑麦草已经产生了对glyphosate的抗性(Gressel1996)，使得在小麦作物上单独使用这种除草剂是不明智的。

为了实用，小麦上的除草剂抗性系统应当具有下列特征：(1)有关抗性应当是针对能控制存在于麦田中的杂草的廉价除草剂的，例如，在印度的杂草是草芦属，而在澳大利亚是一年生黑麦草；(2)应当不太容易产生对这种除草剂的抗性，就像异丙隆在印度的情形；(3)该除草剂应当具有可接受的毒理学和生态学特征。

编码对所述廉价除草剂茅草枯的抗性的dehal基因很符合上述标准。这种除草剂目前能杀死大部分禾本科类，即小型谷物和侵害小型谷物的窄叶杂草。编码能降解茅草枯的脱卤酶的基因业已从假单胞菌属中分离，并被用于转化烟草，它在烟草中产生了略有差别的抗性(Buchanan-Wollaston等，1992)。几年以后又将该基因用于白三叶草中(Derek，White和Ian Gordon，Massey大学，Palmerston North，新西兰，个人通讯1997)。在任一种情况下它都未能充分表达，以便将其视为可用作选择性除草剂。因此，该研究小组试验该基因的工作受到了障碍，并由于缺乏商业价值而停止了他们的项目，尽管有大量的前期投入。

Nardi-Dei等1997披露了源于假单胞菌属的脱卤酶基因，业已对该基因进行了突变，以便研究在酶活性方面的结果。没有涉及与适用于小型谷类的密码子使用相关的突变的产生。US5780708披露了用非突变型假单胞菌属dehal基因转化玉米植物，据说转化过的植物对正常毒性水平的2，2-二氯丙酸有抗性。

上面提到的参考文献没有一个披露或暗示具有适用于小型谷物的密码子使用的编码能降解茅草枯的脱卤酶的分离的DNA分子，该DNA分子适用于转化小麦、稻和其他小型谷物。

获得除草剂抗性小麦的一个主要难题是不能转化小麦。单子叶植物的转化，尤其是小麦的转化所取得的进展很小(Potrikus，1990)，有关这种转化的少量的报导披露了由于再生问题而导致的低效率(Vasil等，1992；Weeks等，1993)。

发明概述

现在业已发现，根据本发明，较差的选择标记、小型谷物上的低效率再生系统、和需要新的选择性除草剂的问题可以通过将天然或合成形式的dehal基因作为选择标记用于新出现的小型谷物再生系统中而得到解决，并使用其合成形式，以便赋予小型谷物抗性，以便可以将茅草枯用于在小型谷物上选择性地控制窄叶杂草。

因此，一方面，本发明涉及编码能降解除草剂茅草枯的脱卤酶的分离的DNA分子，所述DNA具有适用于小型谷物的密码子使用。

为了获得本发明的DNA分子，可以通过传统方法从诸如假单胞菌属的微生物中获得茅草枯降解脱卤酶基因。一旦分离到DNA分子，用标准DNA操作对该基因进行鉴定，对开放读框(编码序列)进行测序，并对该基因进行修饰，以便能整合到小型谷物的植物中并在该植物中表达。所述修饰可以通过用小型谷物的优选密码子使用取代细菌基因的密码子，编码相同的细菌脱卤酶，或者编码具有大体上相同的氨基酸序列的脱卤酶，并且能使得该小型谷物抗茅草枯。

所述小型谷物可以是小麦、大麦、稻、燕麦、triticale、黑麦、高粱和粟。在优选实施方案中，所述小型谷物是小麦或稻。

在一种实施方案中，所述DNA分子包括图1所示核苷酸序列，本发明还包括它的具有适用于小型谷物的密码子使用的遗传学变体。图1的DNA是一种合成基因，它是通过用优选的小型谷物密码子使用取代图4所示假单胞菌属衍生的dehal基因的密码子而获得的，这显著提高了其抗性水平。

如图4所示，假单胞菌属衍生的dehal基因含有若干密码子，如GGT(甘氨酸)、GTA(缬氨酸)、AGT(丝氨酸)、ATA(异亮氨酸)、AGC(苏氨酸)、CTT和TTA(亮氨酸)、CGA和CTT(精氨酸)、和CCT和CCC(脯氨酸)，本发明人根据对在GenBank数据库中找到的45个小麦基因进行的分析发现其使用频率在小麦中是很小的(0.11或更低)。

GenBank数据库中列举了很多细菌dehal基因，但没有植物的脱卤酶基因，因此没有已知的植物脱卤酶基因可用于与图1所示合成基因进行比较。

本发明还涉及含有本发明DNA分子的载体和表达框，所述载体适用于转化小型谷物的植物的植物细胞，以便使再生的植物获得在高于1kg茅草枯/英亩的大田使用水平上，优选2-4kg/英亩的水平上对茅草枯的抗性。

所述表达框含有受植物启动子片段和调控元件控制的DNA分子，使得该DNA分子能在植物细胞中表达。可将任何小型谷物有效的植物启动子(如，但不限于CaMV35S启动子，稻肌动蛋白启动子和遍在蛋白启动子)添加在所述DNA分子的编码序列上游，有可能具有诸如转录增强子序列的其他调控序列。所述5’区可以是所述小型谷物所固有的或者源于其他植物或者是化学合成的。在一种优选实施方案中，所述小型谷物有效的植物启动子是CaMV35S启动子，具有源于稻肌动蛋白1启动子基因的外显子1和源于玉米皱缩1基因的内含子1。

所述表达框还含有转录终止序列并可以包括添加在所述DNA分子下游的聚腺苷酸化信号序列。该3’区可以与所述5’序列源于相同的基因，或者源于不同的基因，或者是化学合成的，并且优选是章鱼氨酸合酶终止子(osc.ter.)。

用于将含有所述DNA分子的表达框导入植物细胞的载体的选择取决于转化方法的选择，而转化方法的选择又取决于宿主植物和植物组织来源的选择。根据本发明，可以使用任何类型的适用于小型谷物的转化方法，如(但不限于)使用电穿孔、微粒、显微注射、病毒系统、农杆菌属介导的转化。

在一种优选实施方案中，将含有所述DNA分子的质粒转入感受态大肠杆菌细胞中，培养所述细胞，然后从沉淀的细胞中提取质粒DNA并纯化，并通过粒子轰击方法用氦驱动的输送枪进行小麦细胞的转化。用于该方法的表达框含有图3所示pCJVW14质粒，其中，DEHAL是具有小型谷物密码子使用的DNA序列，它编码插入到B1uescript(KS+)克隆载体上的茅草枯降解脱卤酶。在其他方法中，所述表达框含有分别如图5和6所示的pDM804或pDM805质粒，其中，wss是具有小型谷物密码子使用的DNA序列，它编码茅草枯降解脱卤酶。

在另一方面，本发明涉及小型谷物特别是小麦的转化的植物细胞，含有具有适用于小型谷物的密码子使用的外源DNA分子，它编码能降解茅草枯的脱卤酶，由所述植物细胞再生的植物基本上能在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯。所述外源DNA优选编码具有序列1所示氨基酸序列的脱卤酶或其变体，能赋予小型谷物在所需的大田使用水平上对茅草枯的抗性。所述DNA分子优选包括图1所示编码核苷酸序列或其遗传学变体，它编码能赋予小型谷物在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的所需大田使用水平上对茅草枯的抗性。

另一方面，本发明涉及小型谷物，特别是小麦或稻的种子，该种子具有稳定整合在其基因组上的外源DNA分子，该DNA分子具有适用于小型谷物的密码子使用，能够在足于使该谷物在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯的水平上表达能够降解除草剂茅草枯的脱卤酶。

另一方面，本发明涉及小型谷物特别是小麦的植物，这种植物能在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯，该植物具有稳定整合在其基因组上的外源DNA分子，该DNA分子具有适用于小型谷物的密码子使用，它编码能降解茅草枯的脱卤酶。

另一方面，本发明提供了一种使小型谷物，特别是小麦或稻的植物在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗除草剂茅草枯的方法，该方法包括：

(a)用具有小型谷物密码子使用、编码茅草枯降解脱卤酶的DNA分子转化小型谷物的植物细胞；

(b)筛选其生长抗茅草枯的转化细胞；和

(c)由步骤(b)的所述植物细胞再生能在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯的小型谷类植物。

用于转化的合适的植物组织来源包括，但不限于愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、和胚胎等，所述组织是具有在转化之后再生完整的、可育的小型谷类植物能力的组织。

所述转化是在如下条件下进行的，即缓冲液、培养基、和培养时间适用于所选择的组织。在用质粒DNA处理之后，可以将植物细胞或组织在筛选之前培养不同的时间，或者可以作为选择标记马上用茅草枯处理。在存在正常抑制浓度的茅草枯的条件下生长的细胞或愈伤组织被推测为转化过的并且用已知的植物再生方法进行处理，并在相同的培养基上继代若干次之后去除非抗性部分。再生分若干步骤在合适的培养基中在有各种浓度的茅草枯和诸如吲哚乙酸(IAA)和玉米醇溶蛋白的植物生长激素的条件下进行。

根据本发明该方面的一种优选实施方案，将具有小型谷物密码子使用的一个推测的dehal基因用于转化诸如小麦的小型谷物的胚胎发生盾片培养物，放置在含有从0.1-0.4mM浓度逐渐提高的培养基上，随着组织生长与每一种物种区别，并根据是采用液体或固体培养基进行定义。

从一种培养基向具有不同的除草剂、激素和生长调节剂浓度的另一种培养基上的转移是通过使用漂浮在液体培养基上的浮筏轻微振荡实现的。因此，根据本发明方面的另一种实施方案，一种提高小型谷物的转化植物的再生效率的方法包括通过逐渐提高的一系列植物激素和茅草枯浓度转移最初的再生体，其中，所述再生体漂浮在液体培养基上的膜筏上。

在另一方面，本发明涉及在有能在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物，特别是小麦的大田中将茅草枯用作除草剂的用途，并涉及用除草剂茅草枯在大田中保护小型谷类植物并杀死杂草的方法，该方法包括将茅草枯用于小型谷物的大田，所述小型谷物含有外源DNA，该外源DNA具有适用于小型谷物分子的密码子使用，并稳定整合到其基因组中，它能在足于使得所述小型谷物在高于1kg/英亩，优选2-4kg/英亩的大田使用水平上抗茅草枯的水平表达降解茅草枯的脱卤酶。

在另一方面涉及用茅草枯取代常用的抗生素作为选择标记用于由外源基因对植物进行遗传转化，所述外源基因能赋予所述植物需要的性状，并涉及将需要的性状导入植物的方法，该方法包括：

(a)用编码能赋予所述植物需要的性状的蛋白的DNA分子和编码能降解除草剂茅草枯的脱卤酶的DNA分子一起转化植物细胞；

(b)选择其生长对茅草枯有抗性的转化细胞；和

(c)用来自步骤(b)的所述植物细胞再生抗茅草枯的植物，因此，所述植物细胞还含有表达所需性状的DNA。

为此，可以使用天然的茅草枯降解微生物脱卤酶基因，如源于假单胞菌属的dehal基因，其序列如图1所示，并且它可以连续地或不连续地存在于所述初级转化植物细胞的再生过程的大部分阶段。

附图的简要说明

图1表示具有小麦密码子使用、编码茅草枯降解脱卤酶的合成dehal基因的核苷酸序列及其所编码的脱卤酶的氨基酸序列。

图2表示用于构建合成茅草枯降解脱卤酶基因的框pCJ14(左)和pVW264(右)。

图3表示含有图1所示合成的茅草枯降解脱卤酶(dehal)基因的茅草枯抗性框pCJVW14。

图4表示编码茅草枯降解脱卤酶的荧光假单胞属dehal基因的核苷酸序列及其所编码的脱卤酶的氨基酸序列。在小麦上罕见的密码子下面划线并加粗。

图5表示含有图1所示合成的茅草枯降解脱卤酶(dehal)基因的茅草枯抗性框pDM840。

图6表示含有图1所示合成的茅草枯降解脱卤酶(dehal)基因以及超氧化物歧化酶(SOD)的基因的抗茅草枯框pDM805。

发明详述

通过下面的非限定性实施例对本发明进行说明。

例1．含有天然dehal基因的转基因小麦

(ⅰ)分离未成熟的胚胎。从开花后11天的未成熟的谷粒中分离小麦(Triticum aestivum cv.Deganit)的未成熟胚胎。对整个麦穗进行表面消毒，其做法是：在3％的四氯酸钠溶液中连续搅拌24分钟，然后用无菌水洗涤3次。在双目显微镜下从所述谷粒上分离胚胎，并将盾片侧放在盛在培养皿中的固化(含有0.6％琼脂，pH5.8)添加了2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基(Murashige和Skoog，1962)上。

(ⅱ)轰击之前的预培养。在25℃下在黑暗中培养未成熟的胚胎5-7天。在轰击之前将盾片组织开始增殖的胚胎转移到渗透处理培养基上，该培养基在含有0.25M甘露糖醇的补充了2mg/L 2，4-D的MS上。

(ⅲ)构建抗茅草枯框-pCJVW14。通过用DraⅢ和BamHⅠ裂解从pCJ14(图2)上分离调节单体表达启动子。该1.6Kb DNA片段含有35S CaMV启动子，源于稻肌动蛋白1启动子基因的外显子1，和源于玉米皱缩基因的内含子1。Maas等(1993)报导该启动子单独在大麦原生质体中诱导标记基因CAT的表达比常用的35S启动子强100倍。通过用BagⅡ和SphⅠ裂解从质粒pVW264中分离编码能降解茅草枯的脱卤酶的从假单胞菌属中分离的天然dehal基因的DNA片段(图4)(由Buchanan-Wollaston等，1992技露，并由V.Buchanan-Wollaston博士馈赠，伦敦大学)。使用章鱼氨酸合酶终止子。然后将所述DNA片段插入克隆载体pBluescript(KS+)。用SalⅠ和PstⅠ从所述新的载体上切除一个片段，并将其插入用SalⅠ和PstⅠ裂解过的pCJ14上。将所得到的质粒pCJVW14转入感受态大肠杆菌细胞(图3)中，例如品系DH5α。用标准方法在LB培养基(Difco实验室，美国)上培养转化细胞。

(ⅳ)用质粒制备DNA。将大约1.00D的100ml转化感受态细胞的过夜培养物放在冰上冷却，并通过低速离心使细胞沉淀。按照生产商的说明用Qiagen质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒DNA。

(Ⅴ)转化。使用杜邦PDS1000氦Biolistic输送轰击系统。在1ml 100％乙醇中将钨颗粒(60毫克，直径1.0微米)中消毒过夜，然后用无菌水洗涤钨颗粒3次，并保存在1ml 50％的无菌甘油中。将钨颗粒(60毫克，直径1.0微米)保存在1ml 100％乙醇中过夜，然后用无菌水洗涤3次，并保存在1ml 50％的无菌甘油中。

用于轰击的混合物包含：1)50微升颗粒悬浮液；(2)10微升质粒DNA(1微克/微升)；3)25微升2.5M氯化钙；4)20微升0.1M亚精胺。在室温下培养所述悬浮液10分钟。在离心5秒钟之后弃上清液，并用140微升70％乙醇洗涤该混合物。在经过短暂离心之后除去上清液，然后加入50微升100％乙醇，制备最终悬浮液。将一滴6微升的该悬浮液放在塑料大型轰击仪中心。将40-50个胚胎放置在每一个板的1厘米直径的孔中，位于直挡网的下面9厘米处，使用1100p.s.i.(磅/平方英寸)的压力，并对胚胎轰击3次，在黑暗中在高渗透培养基上放置24小时。

(ⅵ)再生。在轰击24小时之后，将所述胚胎转移到新的含有2mg/l2，4-D和60mg/l茅草枯(0.36mM，能抑制转化过的愈伤组织在固体培养基上在这一阶段生长的最低浓度的茅草枯)的新鲜的MS固体培养基上，在25℃下在黑暗中培养。让所述胚胎在该选择培养基上保持2-4周，并且每2周更换培养基。在此阶段，培养的胚胎产生愈伤组织。在选择期间，分离并分裂存活的愈伤组织。然后将疏松浅颜色愈伤组织转移到含有10微克/毫升玉米醇溶蛋白和60微克/毫升茅草枯的固体MS培养基上，在25℃下给以16小时光照。

在绿色幼苗达到0.5厘米长之后，将愈伤组织转移到装有含有10微克/毫升玉米醇溶蛋白和20微克/毫升茅草枯(0.12mM，能抑制未转化过的愈伤组织在固体培养基上生长的最低浓度的茅草枯)的液体MS培养基的筏(Osmotek公司，Rehovot76120，以色列)上，并在16小时光照和缓慢摇动(50rpm)条件下保持。14天之后，将同一种选择培养基中的玉米醇溶蛋白的浓度降低到6微克/毫升，然后用含有1微克/毫升玉米醇溶蛋白、1微克/毫升IAA(吲哚乙酸)和20微克/毫升茅草枯的液体MS培养基培养14天，然后将IAA的浓度降低到0.2微克/毫升，将茅草枯降低到10微克/毫升。当幼苗和根足够健壮(大约5厘米长)时，将小植株转移到含有20微克/毫升茅草枯的0.5 MS固体培养基上。当植株达到大约10厘米高度(植株达到容器顶部)时，将其转移到Jiffy花盆中，在小盒子中用少量水在室温和弱光照条件下培养2天，用塑料袋盖住所述盒。最后将植物种植在花盆中，用一个放置在温室中的塑料盒覆盖直到植株健壮。

(ⅶ)用转基因花粉对非转基因小麦授粉。在开花之后2天收集推测为转化小麦植株的花粉。在开花之前将未转化过的小麦品种Deganit植株去雄。用推测为转化植株的花粉对非转化小麦植株授粉。在杂交之后用袋覆盖麦穗。然后同样对推测的转化体进行套袋以便自交。

(ⅷ)转基因后代的生物学分析。将来自自交R0转化植株的R1转基因谷粒播种到花盆中。在每一个花盆中播种3个谷粒。同时播种非转化小麦的谷粒作为对照植物的谷粒。在第一个叶片出现3周之后，用几种浓度对R1推测的转基因后代植物进行喷雾。用浓度范围在0.12-1．2mM之间的茅草枯(添加0.2％Tween20)喷洒所述植物。用0.24mM茅草枯或更高浓度喷洒的非转基因植物在处理之后2周死亡。用0.24-1.2mM茅草枯喷雾的大多数推测的转基因植物在茅草枯处理之后2周是绿色的并存活下来。在3-4周之后，除了用0.24mM茅草枯处理过的植物之外几乎所有植株都死亡。因此，我们用该处理处理授粉的后代。R1自交后代中抗性与易感植株的比例接近3∶1(表1)。回交后代用0.24mM茅草枯喷雾，作为鉴别浓度。在用0.24mM茅草枯喷洒杂交后代之后出现接近1∶1的分离比例(表2)。

表1．在R1自花授粉后代中茅草枯抗性的分离

 0mM       0.12mM   0.24mM   0.40mM   0.75mM   1.2mM

  pN^a S^b   PN^a  S^b  PN^aS^b  PN^a S^b  PN^a S^b  Pn^a S^b411  8    8     9     8    9    6    8    1    9    0    7    O412  9    9     8     7    9    5    9    0    8    O    9    O413  9    9     -     -    -    -    -    -    9    O    9    0414  9    9     8     7    9    7    9    2    9    1    8    04161 1O   9     -     -    -    -    -    -    10   0    8    O4162 8    8     -     -    -    -    -    -    9    0    9    042   12   11    10    8    11   7    1O   1    12   O    10   0总计 65   64    35    30   38   25   36   4    66   1    60   OCK   5    5     6     2    6    0    6    0    6    0    6    O

注：Pn^a-种植在花盆中的植株数；S^b-存活植株数量；CK-未转化过的植株数。

表2.通过用喷洒0.24mM茅草枯的未转化过的植株回交R0证实基因的整合。

授粉	植株数	死亡植株数	存活植株数
412XDeganit413XDeganit4161XDeganit4162XDeganit42XDeganit处理总数DeganitXDeganit(CK)	8771011439	53465238	34346201

例2

由于例1中的转基因植株不能承受2kg/ha的茅草枯(正如本文前面所披露的现有技术中烟草和白三叶草的情形)，我们通过RNA印迹分析了该基因是否充分转录，并证实是这样。然后我们又分析了假单胞菌属产生的dehal基因(由Buehanan-Wollaston博士提供)的密码子序列，并将其与小麦的45个基因的平均密码子使用进行比较，后者是从GenBank 63中的数据计算的。很多密码子使用明显不是优选的或者在小麦中十分罕见。在图4中通过加粗的方法标出了基因中分布的超过30个小麦罕见密码子。

然后我们根据小麦的优选密码子使用重新设计了该基因，并添加了制备结构所必须的限制裂解位点，以及其他改变，并具有委托合成的(Operon技术公司，Alameda，CA，美国)图1所示的合成的脱卤酶基因序列。

然后按照例1所述方法连接具有适合于小型谷物的密码子使用的新的合成dehal基因，以便形成分别如图5和6所示的新的结构pDM804和pDM805。然后通过诸如披露于例1中的标准方法或通过农杆菌属介导的转化将所述结构转入小麦或其他小型谷物中，以便产生对大田使用量的茅草枯(2-4kg/ha)的足够的抗性。

质粒pDM804具有下列特征：质粒大小-9.28kb；在质粒内部对所述基因进行标记，并说明如下：actin-源于稻的肌动蛋白启动子；gus-β-葡糖醛酸酶；内含子1-源于玉米皱缩基因的内含子；nos3’-胭脂氨酸合酶终止子；rbcs3’-rubiSco小亚基终止子；Ubil-玉米遍在蛋白启动子；wss-合成脱卤酶基因。该质粒的限制位点表示在外侧。

质粒pDM805具有下列特征：质粒大小-8.15kb；在质粒内部对所述基因进行标记，并说明如下：actin-源于稻的肌动蛋白启动子；gus-β-葡糖醛酸酶；内含子1-源于玉米皱缩基因的内含子；nos3’-胭脂氨酸合酶终止子；rbcs3’-rubisco小亚基终止子；Sod-Cu、Zn超氧化物歧化酶；Ubil-玉米遍在蛋白启动子；wss-合成脱卤酶基因。该质粒的限制位点表示在外侧。

例3

将含有图1的合成dehal基因(wss)的质粒pDM804(图5)用于按例1所述方法转化小麦，但最初的再生培养基含有0.6mM茅草枯，该用量对含有天然假单胞菌属dehal基因的转化体有毒性并能阻止芽的形成(图4)。在该用量下在转化的愈伤组织上开始出现大量新芽。

参考文献

1．Becker，D_Brettschneider，R和Lorz，H.1994。源于盾片组织的微粒轰击的可育转基因小麦，植物杂志5：299-307。

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Claims (31)

1．一种编码能降解除草剂茅草枯的脱卤酶的分离的DNA分子，所述DNA分子具有适合于小型谷物的密码子使用。

2．如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述茅草枯降解脱卤酶具有大体上如图1所示的氨基酸序列，及其具有适于在小型谷物中表达的密码子使用的合成变体。

3．如权利要求2的分离的DNA分子，包括图1所示核苷酸序列。

4．如权利要求1-3中任一项的分离的DNA分子，其中，所述小型谷物是小麦、大麦、稻、triticale、燕麦、黑麦、高粱或粟。

5．如权利要求4的分离的DNA分子，具有小麦密码子使用。

6．一种载体，它含有如权利要求1-5中任一项所述的DNA分子。

7．一种表达框，包括如权利要求1-5中任一项所述的DNA分子或如权利要求6所述的载体，该表达框适于转化小型谷物的植物细胞和植物，并赋予所再生的植株茅草枯抗性。

8．如权利要求7的表达框，其中，所述DNA分子受一个植物启动子区和调控元件的控制，使得所述DNA分子能在小型谷物的植物细胞中表达。

9．如权利要求8的表达框，其中，将一种小型谷物有效的植物启动子添加在图1所示DNA分子的编码序列的上游，并将一个终止子片段添加在其下游。

10．如权利要求9的表达框，其中，所述小型谷物有效的植物启动子是CaMV35S启动子，具有源于稻肌动蛋白1启动子基因的外显子1和源于玉米皱缩1基因的内含子1。

11．如权利要求10的表达框，如图3、5或6所示。

12．一种小型谷物的转化植物细胞，含有外源DNA分子，该DNA分子具有适于在小型谷物中表达的密码子使用，它编码能降解茅草枯的脱卤酶，所述植物细胞基本上能在大田使用水平上抗茅草枯。

13．如权利要求11的转化的植物细胞，其中，所述外源DNA编码具有图1所示氨基酸序列的脱卤酶或具有小型谷物密码子使用的其变体，它能赋予小型谷物在大田使用水平上对茅草枯的抗性。

14．如权利要求13的转化的植物细胞，其中，所述DNA分子包括图1所示编码核苷酸序列或其遗传变体，它编码能赋予小型谷物在大田水平上对茅草枯抗性的脱卤酶。

15．如权利要求12-14中任一项的转化植物细胞，其中，所述小型谷物是小麦。

16．小型谷物的种子，它具有稳定整合在其基因组上的外源DNA分子，该DNA分子具有小型谷物密码子使用，并表达能够降解除草剂茅草枯的脱卤酶，其表达水平足于使该小型谷物在大田使用水平上抗茅草枯。

17．如权利要求16的种子，其中，所述DNA分子包括图1所示编码核苷酸序列或其遗传学变体，该变体具有小型谷物密码子使用，并编码能赋予小型谷物在大田水平上对茅草枯抗性的脱卤酶。

18．如权利要求16或17的种子，其中，所述小型谷物是小麦。

19．在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物，它具有稳定整合在其基因组上的外源DNA分子，该DNA分子具有小型谷物密码子使用并编码能降解茅草枯的脱卤酶。

20．如权利要求19的小型谷物植物，其中，所述DNA分子包括图1所示编码核苷酸序列或其遗传学变体，该变体具有小型谷物密码子使用，并编码能赋予小型谷物在大田水平上对茅草枯抗性的脱卤酶。

21．如权利要求19或20的小型谷物植物，其中，所述小型谷物是小麦。

22．一种使小型谷物植物在大田使用水平上抗除草剂茅草枯的方法，该方法包括：

(a)用权利要求1-5中任一项所述的DNA分子或如权利要求7-11中任一项所述的表达框转化小型谷物的植物细胞；

(b)选择其生长抗茅草枯的转化细胞；和

(c)由源于所述步骤(b)的转化植物细胞再生能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物。

23．如权利要求21的方法，其中，在再生步骤(c)中转移原始再生体，使其通过阶梯式的一系列植物激素和茅草枯浓度，其中将所述再生体漂浮在液体培养基中的一个膜筏上。

24．如权利要求23的方法，其中，茅草枯的浓度从0.1到0.4mM增加。

25．如权利要求21-24中任一项的方法，其中，所述小型谷物是小麦。

26．将茅草枯作为选择性除草剂用于含有能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物的大田中的用途。

27．如权利要求26的用途，其中，所述在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物是权利要求19-21中任一项所述的转化的植物。

28．将茅草枯作为选择性除草剂用于含有茅草枯抗性小麦的大田中的用途。

29．一种用除草剂茅草枯在大田中保护小型谷物植物并杀死杂草的方法，包括将茅草枯喷洒到含有外源DNA分子的小型谷物的大田中，所述外源DNA分子具有适于在小型谷物中表达的密码子使用，并稳定整合到其基因组上，所述外源DNA能表达茅草枯降解脱卤酶，其表达水平足于使得所述小型谷物在大田使用水平上抗茅草枯。

30．如权利要求29的方法，其中，所述大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物业已用含有图1所示编码核苷酸序列的DNA分子或其遗传学变体转化过，所述DNA分子或其遗传变体编码赋予小型谷物能在大田使用水平上抗茅草枯的脱卤酶。

32．如权利要求30或31的方法，其中，所述小型谷物是小麦。

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