CN101205537A - 一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法，所述方法如下：在表达目的基因的同时，利用反义RNA或RNAi方法，抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒的基因的表达，得到所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。本发明的有益效果主要体现在：利用本发明方法获得的转基因禾本科农作物，在需要时可以被苯达松或者磺酰脲类除草剂选择性地杀灭，防止了它们的传播以及混入非转基因禾本科农作物，对今后的转基因作物研究具有重大意义。

Description

一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法

(一)技术领域

本发明涉及一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法，以及所用基因和质粒，属于植物基因工程领域。

(二)背景技术

转基因农作物目前已经在世界许多国家大量推广种植。例如转基因抗虫、抗除草剂玉米已经在北美大量推广，转基因棉花也已经在中国大量种植。进一步，利用转基因农作物作为生物反应器生产药物蛋白质、工业用酶等也正在广泛研究和开发(Larrick and Thomas，Current Opinion in Biotechnology，2001，12：411-418)。种植这些转基因农作物的重要顾虑是它们的环境中传播和不合适的转基因农作物混入我们的食物中。因此控制它们的传播、防止它们混入到非转基因农作物之中是种植转基因农作物的重要措施；而防止作为生物反应器生产药物蛋白质、工业蛋白质的转基因农作物品种混入用于生产粮食和饲料的品种更是非常重要。因此发明一种简便的方法帮助控制转基因农作物的传播具有重大应用价值。

细胞色素P450酶是一类利用NADPH所传递的电子去催化分子氧活化的血红素蛋白，在植物体内介导一序列的氧化反应，其功能涉及木质素、甾醇、类萜、生物碱、脂肪酸和许多起植保素功效的次生物质的合成代谢，以及天然和人工合成的许多外源抗生素如除草剂等成分的降解和脱毒代谢。研究表明，细胞色素P450酶是一个超级基因家族，植物中已命名的P450基因已超过1000个，水稻中可能的P450基因有528个。应用传统的反向遗传学手段包括EMS诱变、T-DNA和转座子插入等和基因过量表达技术、基因芯片技术及反义RNA或RNAi抑制技术来研究这类基因的生物学功能，往往因不同基因间大量错综复杂的同源序列的存在、单个基因表达丰度的偏低和基因表达产物在抽提液中的不稳定性而受阻。以至到目前为止，被确切验证其生物学功能的植物P450基因总共不到40个。

目前还没有能够选择性地消灭转基因农作物的方法。

(三)发明内容

本发明提供了一种能被选择性地消灭的转基因禾本科农作物的获得方法，并且进一步提供了产生可以被选择性地消灭的转基因水稻和玉米所用的基因的DNA序列及其质粒。本发明通过在转基因农作物中抑制其除草剂的降解和脱毒代谢酶的表达而达到选择性地消灭转基因农作物的目的。

本发明采用的技术方案是：

一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法，所述方法如下：在表达目的基因的同时，利用反义RNA或RNAi方法，抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒的基因(即解毒酶基因)的表达，得到所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

具体的，所述的目标除草剂为苯达松或磺酰脲类除草剂。苯达松和磺酰脲类除草剂是常用的农业除草剂。它们对许多宽叶杂草具有良好的杀草能力。禾本科农作物由于具有这些除草剂的解毒酶，因此对这些除草剂具有良好的抗性(Siminszky，Phytochemistry Reviews 5：445-458；Pan et al.，PlantMolecular Biology，2006，61：933-943；Werck-Reichhart et al.，Trends in PlantScience 5：116-123)。所以在转基因禾本科农作物中如果在表达目的基因的同时抑制了苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的表达，这些转基因农作物必要时就能够被苯达松或者磺酰脲类除草剂选择性地消灭。通过利用反义RNA或者RNAi的方法能够抑制禾本科农作物中苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的表达，从而使转基因农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感。用反义RNA和RNAi抑制基因表达的机理和技术已经有完整的描述，是已经有的技术(Casci，Nature Reviews Genetics 7：334-335；Smith et al.，Nature 334：724-726)。反义RNA表达抑制框可以由一个启动子和反方向的被抑制基因的全部或者片段功能性地连接而成。启动子可以选择玉米泛素启动子ZmUbi-1(Christensen and Quail，Transgenic Res.，5：213-8)，或者水稻泛素启动子(Wang and Oard，Plant Cell Reports，22：129-134)，或者水稻Actin启动子(McElroy et al.，Plant Cell 2：163-171)，或者是CaMV 35S启动子，或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子。终止子可以是广泛利用的CaMV35S终止子，Nos终止子。RNAi表达抑制框可以由一个启动子、一个被抑制基因DNA片段的反向对称序列和一个终止子功能性地连接而成。

在本发明中，为使得到转基因作物能稳定传代，目的基因表达框与苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的表达抑制框紧密连锁。这种连锁在本发明中是通过插入DNA片段的构建来实现：即将目的基因表达框和目标除草剂的解毒酶基因表达抑制框连接在同一个载体上，并且在转化时它们在同一个DNA片段上导入植物。例如在利用农杆菌转化时，则是连接在同一个T-DNA片断中；在使用“基因枪方法”时，则在连接同一个载体上的同一个DNA插入片断中。

进一步，禾本科农作物中二个或者二个以上的苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因可以同时被抑制表达。为了达到同时抑制二种或者二种以上目标除草剂解毒酶基因的表达，可以组建二个或者二个以上紧密连锁的分别抑制不同的解毒酶基因的表达抑制框。本发明还提供了利用一个表达抑制框同时抑制不同的解毒酶的基因的方法：将来自不同解毒酶基因的DNA片段连接成一个杂合片段，再利用这个杂合片段构建反义RNA或者RNAi表达抑制框，从而达到同时抑制二个或者二个以上的解毒酶基因的目的(例如SEQNO ID：10)。

具体的，所述禾本科农作物为水稻或者玉米。所述禾本科农作物为水稻时，所述的被抑制表达的目标除草剂的解毒酶至少有一种由下列核苷酸序列编码：①SED ID No：1(水稻)；②SED ID No：2(玉米)。所述转基因水稻或玉米中，上述基因中其中至少一个基因的表达被抑制，从而使转基因水稻或玉米对至少一种除草剂敏感。本发明中，SED ID No：2为首次披露具有参与除草剂解毒的作用，也是本发明的发明点之一。

根据水稻基因序列SED ID No：1和玉米基因序列SED ID No：2，以及它们的3’端和5’端非编码区域序列，可以构建不同的表达抑制框分别抑制水稻和玉米的参与除草剂代谢的细胞色素P450基因的表达。

本发明还进一步提供了根据水稻和玉米中参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒的细胞色素P450基因进行设计而获得的可以用来构建表达抑制框的反向对称序列：①SED ID No：3(水稻)；②SED ID No：4(玉米)。

更进一步，所述的目标除草剂为下列除草剂及其他们的类似物中的一种或者多种：苯达松，苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、甲磺隆、绿磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆和噻磺隆。

具体的，所述方法如下：

(1)将抑制禾本科农作物中参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒的细胞色素P450基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框与目的基因表达框构建在同一个转化导入DNA片段中；

(2)将步骤(1)所得转化导入DNA片段导入禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

或者，也可将禾本科农作物中多个参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒的细胞色素P450基因的DNA片段连接成一个杂合片段，再根据杂合片段构建反义RNA或者RNAi抑制框，将所述反义RNA或RNAi抑制框与目的基因表达框构建在同一个转化导入DNA片段中，将所述DNA片段导入相应禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

在必要时，则可选用一种或者多种除草剂对禾本科农作物进行常规的喷洒处理，选择性地杀灭上述转基因禾本科植物。除草剂可以是苯达松或磺酰脲类除草剂。因此利用本发明的方法而获得的转基因禾本科农作物必要时就能被苯达松或者磺酰脲类除草剂选择性地杀灭。从而防止了它们的传播以及混入非转基因禾本科农作物。

具体的，所述禾本科农作物为水稻，根据SED ID No：1设计抑制除草剂的解毒酶基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框，将所述反义RNA或RNAi抑制框和目的基因表达框连接在同一转化导入DNA片段中，将所述DNA片段导入水稻中，得到转基因水稻。

具体的，所述禾本科农作物为玉米，根据SED ID No：2设计抑制除草剂的解毒酶基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框，将所述RNA或RNAi抑制框和目的基因表达框连接在同一转化导入DNA片段中，将所述DNA片段导入玉米中，得到转基因玉米。

所述禾本科农作物为水稻时，所述反义RNA或RNAi表达抑制框含有核苷酸序列片段SED ID No：3。

所述禾本科农作物为玉米时，所述反义RNA或RNAi表达抑制框含有核苷酸序列片段SED ID No：4。

本发明中，目的基因的选择并不受限制，本发明关键是采用将抑制目标除草剂的解毒酶基因表达的抑制框与目的基因表达框构建在同一转化导入DNA片段中、再将该DNA片段导入禾本科植物中的方法，从而获得能被目标除草剂选择性消灭的转基因农作物，这种方法对于今后的转基因作物研究具有重要意义。

本发明所述的目的基因包括但是不限于抗虫基因、抗除草剂基因、药物蛋白质基因或工业用蛋白质基因。抗虫基因包括但是不限于Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1Ca，Cry1F，Cry2Ab，Cry3A，Cry3B，Cry9A，Vip3等；抗除草剂基因包括但是不限于抗草甘膦基因，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)。药物蛋白质基因包括但是不限于治疗用的药物蛋白质如人生长因子、抗体等，免疫用的抗原蛋白质，诊断用的蛋白质等。工业用蛋白质基因包括但是不限于各种工业用酶。在植物中表达各种用途的蛋白质是已有的技术(Franken et al.，Current Opinion in Biotechnlogy，8：411-416)。

本发明中所述的目的基因可以是一个或者多个。它们可以同时与解毒酶基因表达抑制框连接在一个转化DNA片段中。

优选的，上述目的标基因中的一个为抗草甘膦基因。抗草甘膦基因已有描述(例如，Park et al.，Molecular Microbiology 51：963-971；Eschenburg et al.，Planta 216：129-135；US Pat.No.4,769,061；US Pat.No.4,940,835)。这种方法获得的转基因农作物对草甘膦除草剂具有高抗性而对苯达松或者磺酰脲类除草剂敏感，因此这样获得的转基因植物可以利用草甘膦进行筛选和杂草防治，同时也可以利用苯达松和磺酰脲类除草剂防止转基因禾本科农作物的扩散。

本发明中所述的的转基因的方法包括但是不限于基因枪方法、农杆菌介导方法，花粉管导入方法。基因枪方法、农杆菌介导方法，花粉管导入方法是已有的技术(Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres and Park(1994)CriticalReviews in Plant Science 13：219-239；Bommineni and Jauhar(1 997)Maydica42：107-120；孔青等，分子植物育种3：113-116)。

本发明还涉及一种导入水稻或者玉米后能够抑制禾本科农作物中苯达松或磺酰脲类除草剂解毒酶表达的质粒。所述质粒含有根据①SED ID No：1(用于水稻)；②SED ID No：2(用于玉米)；而设计的在导入水稻或者玉米后能够产生反义RNA或双链RNA。所述质粒还可同时包含一个或多个目的基因。

目的基因为抗草甘膦基因时，所述质粒同时包含抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的表达抑制框。

本发明提供了一种获得能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的方法，本发明的有益效果主要体现在：利用本发明方法获得的转基因禾本科农作物，在需要时可以被苯达松或者磺酰脲类除草剂选择性地杀灭，防止了它们的传播以及混入非转基因禾本科农作物，对今后的转基因作物研究具有重大意义。

(四)附图说明

图1为本发明水稻转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i的示意图；

图2为本发明玉米转化

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols inMolecular Biology，和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)出版的Molecular Cloning：A Labortory Manual，3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1：水稻转化T-DNA载体的构建

1)水稻T-DNA转化载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i的构建：

水稻细胞色素P450基因CYP81A6(SEQ ID NO：1，Pan et al.，PlantMolecular Biology，61：933-943)片断是通过PCR的方法从水稻(Oryza sativajaponicaL.)总基因组DNA扩增获得。

其中一个207bp的片断——R450FR，是利用PCR引物450F(5’CTCGAGCAG TGC ACC AGA GTC ACA GAA ACA CAT CAC AC，下横线是XHoI位点)  和450R(5’AGA CTC CT TCT TGA CGA GGT GGA GGT GT，下横线是BglII位点)获得的，它是基因CYP81A6的cDNA的5’端1～207bp的片断；

另一片断——R450FR2，长327bp，它是利用引物450F(5’CTCGAG CAGTGC ACC AGA GTC ACA GAA ACA CAT CAC AC，下横线是XhoI位点)和450R2(5’AGA TCT CGG TGA AGC ACT CCC TGG CGC AC，下横线是BglII位点)通过PCR而获得的。它是细胞色素P450基因CYP81A6的cDNA的5’端1～327 bp的片断。这二个片断分别被克隆到T载体(上海生工)中，分别获得载体T-vector-R450FR1和T-vector-R450FR2。片断R450FR1和R450FR2然后分别从T载体中用XhoI和BglII双酶切而获得，并进一步同时连接到经过XhoI切除了抗潮霉素基因并去磷酸化了的T-DNA载体pCambia1300载体(Cambia，Australia)，获得p1300-450i。

质粒p1300-450i含有CaMV 35S启动子控制下的能够产生双链RNA(dsRNA)通过RNA干扰(RNAi)抑制解毒酶CYP81A6表达的基因序列(其核苷酸序列是SEQ ID NO.3)。

抗草甘膦基因G6(gb：EU169459，包括叶绿体信号肽，烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶和终止子)，由上海生工公司(上海，中国)人工合成。G6可以从载体中用BamHI和EcoRI双酶切而获得。玉米(Zea mays)启动子ZmUbi-1，通过PCR从玉米基因组DNA扩增而获得。PCR的引物分别是ZmUbiF (5’GCG AAG CTT GCA TGC CTA CAG TGC AGC GTG ACC CGGTCG TGC，下横线是HindIII位点)和ZmUbiR(5’GTG GGA TCC TCTAGA GTC GAC CTG CAG AAG TAA CAC CAA ACA ACA G，下横线是BamHI位点)。通过PCR扩增得到的启动子ZmUbi-1经过HindIII和BamHI双酶切后与抗草甘膦基因G6(BamHI和EcoRI双酶切而获得)及T-DNA载体p1300-450i(预先经过HindIII和EcoRI双酶切)同时连接，从而获得水稻转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i。这个载体T-DNA中同时含有抗草甘膦基因G6表达框和抑制解毒酶基因CYP81A6表达的结构(图1)。

实施例2：  对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感的抗草甘膦转基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌 龚祖埙 1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水110”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。通过电击方法T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i被导入农杆菌LBA4404。取含T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD660为0.6的农杆菌液中(含乙酰丁香酮，40mg/L)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含2 mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2～3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。

T-DNA的插入及其基因的表达可以通过PCR和western印迹分析检测。基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生植株和非转化禾本科农作物中提取。

实施例3：利用除草剂对转基因水稻的正选择和负选择

获得的转化了pCAMB1300Rice-GlyR-450i的T0转基因水稻植株和没有转化的水稻植株分别在培养溶液中单株培养。这些植株分为3个处理，每个处理包括来自不同转化事件的二种转基因各30个植株和10个非转基因植株。处理1：喷10mM草甘膦；处理2：喷2500mg/L苯达松；处理3：喷水。每个处理喷80mL/平方米，处理后10天记录植株的成活率。  结果如下表1。

表1：转基因水稻对草甘膦和苯达松的敏感性。

	草甘膦	苯达松	水
				pCAMB1300Rice-GlyR-450i转基因水稻	100％成活	0％成活	100％成活
非转基因水稻	0％成活	100％成活	100％成活

T1转基因水稻的选择性杀灭。

pCAMB1300Rice-GlyR-450i转基因水稻的二个转化事件(450i-2和450i-4)的T1阳性植株各100株和200株非转基因常规水稻混合种植，在4～5叶期间喷80mL/平方米的2500mg/L苯达松。10天后二个转化事件的阳性植株均100％被杀灭，而全部非转基因常规水稻生长正常。

实施例3、抑制玉米细胞色素P450基因表达的玉米转化载体的构建

玉米转化T-DNA载体pCAMB 1300Com-GlyR-450i-AMY的构建：

玉米中苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因的两个片断是从玉米基因组中通过PCR的方法扩增获得。片断T-ZM450-1，259bp长，PCR引物分别为ZmSac731F  (5’TCGAC GAGCTC G TGC CGT ACA TCG G)，  和ZmXho1R(5’AGCG CTCGAG TT TAG AGC AGT GAT CAC AGT GTCAG)。片断T-R450-2，147bp长，PCR引物分别为ZmBgl2-80F(5’GCTTAGATCT CG TAC ATC GGC ACG GCC AAC CGC T)和Zm880R(5’AGCG CTCGAG CCAGCCTCCGCCGCTCCCCGT)。  这二个PCR产物分别克隆入T载体(上海生工)中。通过通常的分子生物学方法将这二个片断连接获得一个片断，其DNA序列为SEQ ID NO：4。然后，将SEQ ID NO：4与玉米泛素启动子(ZmUbi-1)功能性连接，获得玉米苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达抑制框。这个利用RNAi方法的解毒酶基因表达抑制框被进一步克隆到含有抗草甘膦基因的T-DNA载体pCAMB 1300-GlyR(基于pCAMB1300)中，得到同时含解毒酶基因表达抑制框和抗抗草甘膦基因表达框的T-DNA质粒载体(pCAMB1300Corn-GlyR-450i)。将pCAMB1300Corn-GlyR-450i利用HindIII进行酶切，得到15.8kb的载体片段，然后去磷酸化，进一步将α-淀粉酶表达框(水稻启动子Gt1控制的经过玉米密码子优化的人工合成α-淀粉酶基因((gb：245490))克隆到T-DNA质粒载体，获得T-DNA载体pCAMB 1300Corn-GlyR-450i-AMY(图1f)，用于玉米的转化。因此，pCAMB 1300Corn-GlyR-450i-AMY的T-DNA包含：1)一个抑制苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达的基因，2)一个抗草甘膦基因，和3)一个淀粉酶基因(图2)。

实施例4、苯达松和磺酰脲类除草剂敏感的转基因玉米的产生

取授粉后8～10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)。将含有pCAMB1300Com-GlyR-450i-AMY的农杆菌与未成熟胚共培育共培养2～3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/L的Timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10～14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。

转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，并且镇定它们的抗除草剂能力。

实施例5：pCAMB1300Corn-GlyR-450i-AMY转化的玉米愈伤组织对苯达松敏感性的测定

将经过农杆菌感染的在草甘膦的筛选培养基上筛选培养56天的20个成活玉米愈伤组织，和20个未经农杆菌感染未经筛选的20个成活玉米愈伤组织，分别在2mM草甘膦的筛选培养基和5mg/L苯达松培养基培养，10天后观察愈伤组织的生长情况。pCAMB1300Corn-GlyR-450i转化的愈伤组织明显抗草甘膦(100％愈伤组织明显生长)，但是75％在苯达松(5mg/L)培养基上死亡。相反，未经农杆菌感染转化的愈伤组织明显不抗草甘膦，但抗苯达松。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>一种能被选择性消灭的转基因农作物的获得方法

<130>

<160>13

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1598

<212>DNA

<213>Orvza sativa

<400>1

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<210>2

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<212>DNA

<213>Zea mays

<400>2

atggataagg cctacatcgc cgccctctcc gccgccgccc tcttcttgct ccactacctc      60

ctgggccgcc gggccggcgg cgagggcaag gccaaggcca agggctcgcg gcggcggctc     120

ccgccgagcc ctccggcgat cccgttcctg ggccacctcc acctcgtcaa ggccccgttc     180

cacggggcgc tggcccgcct cgcggcgcgc cacggcccgg tgttctccat gcgcctgggg     240

acccggcgcg ccgtggtcgt gtcgtcgccg gactgcgcca gggagtgctt cacggagcac     300

gacgtgaact tcgcgaaccg gccgctgttc ccgtcgatgc ggctggcgtc cttcgacggc     360

gccatgctct ccgtgtccag ctacggcccg tactggcgca acctgcgccg cgtcgccgcc     420

gtgcagctcc tctccgcgca ccgcgtcggg tgcatggccc ccgccatcga agcgcaggtg     480

cgcgccatgg tgcggaggat ggaccgcgcc gccgcggccg gcggcggcgg cgtcgcgcgc     540

gtccagctca agcggcggct gttcgagctc tccctcagcg tgctcatgga gaccatcgcg     600

cacaccaaga cgtcccgcgc cgaggccgac gccgactcgg acatgtcgac cgaggcccac     660

gagttcaagc agatcgtcga cgagctcgtg ccgtacatcg gcacggccaa ccgctgggac     720

tacctgccgg tgctgcgctg gttcgacgtg ttcggcgtga ggaacaagat cctcgacgcc     780

gtgggcagaa gggacgcgtt cctggggcgg ctcatcgacg gggagcggcg gaggctggac     840

gctggcgacg agagcgaaag taagagcatg attgcggtgc tgctcactct gcagaagtcc     900

gagccagagg tctacactga cactgtgatc actgctctaa agaacctatt cggcgccgga     960

acggagacca cgtccaccac gacggaatgg gccatgtcac tgctgctgaa ccaccgggag    1020

gcgctcaaga aggcgcaggc cgagatcgac gcggcggtgg gcacctcccg cctggtgacc    1080

gcggacgacg tgccccacct cacctacctg cagtgcatcg tcgacgagac gctgcgcctg    1140

cacccggccg cgccgctgct gctgccgcac gagtccgccg cggactgcac ggtcggcggc    1200

tacgacgtgc cgcgcggcac gatgctgctg gtcaacgtgc acgcggtcca cagggacccc    1260

gcggtgtggg aggacccgga caggttcgtg ccggagcggt tcgagggcgc cggcggcaag    1320

gccgaggggc gcctgctgat gccgttcggg atggggcggc gcaagtgccc cggggagacg    1380

ctcgcgctgc ggaccgtcgg gctggtgctc gccacgctgc tccagtgctt cgactgggac    1440

acggttgatg gagctcaggt tgacatgaag gctagcggcg ggctgaccat gccccgggcc    1500

gtcccgttgg aggccatgtg caggccgcgt acagctatgc gtggtgttct taagaggctc    1560

tgaaaacctc atggatcgaa ttgctggcat cgtctgaagg gtgtatgacg tagcttccga    1620

<210>3

<211>543

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

gcagtgcacc agagtcacag aaacacatca cacattcgtg agctcagctt agccatggat      60

aacgcctaca ttattgccat tctctctgta gctatcctct tcttgctcca ctactacctc     120

ctcggccgcg gcaatggcgg ggcggcgcgg ctgccgccgg gtccaccggc cgtcccgatc     180

ctgggacacc tccacctcgt caagaagccg atgcacgcca ccatgtcccg cctcgccgag     240

cggtacgggc cggtgttctc gctgcgcctc gggtcgcggc gcgccgtggt ggtgtcgtcg     300

ccggggtgcg ccagggagtg cttcaccgag atctgcttct tgacgaggtg gaggtgtccc     360

aggatcggga cggccggtgg acccggcggc agccgcgccg ccccgccatt gccgcggccg    420

aggaggtagt agtggagcaa gaagaggata gctacagaga gaatggcaat aatgtaggcg    480

ttatccatgg ctaagctgag ctcacgaatg tgtgatgtgt ttctgtgact cctggtgcac    540

tgc                                                                  543

<210>4

<211>640

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

tcgagggggg gcccggtacc cactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata    60

gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agttctgcac aaagtggagt agtcagtcat    120

cgatcaggaa ccagacacca gacttttatt catacagtga agtgaagtga agtgcagtgc    180

agtgagttgc tggtttttgt acaacagatc ttgagctcgt gccgtacatc ggcacggcca    240

accgctggga ctacctgccg gtgctgcgct ggttcgacgt gttcggcgtg aggaacaaga    300

tcctcgacgc cgtgggcaga agggacgcgt tcctgaggcg gctcatcgac ggggagcggc    360

ggaggctgga cgctggcgac gacagcgaaa gtaagagcat gattgcggtg ctgctcactc    420

tgcagaagtc cgagccagag gtctacactg acactgtgat cactgctcta aactcgagcc    480

agcctccgcc gctccccgtc gatgagccgc cccaggaacg cgtcccttct gcccacggcg    540

tcgaggatct tgttcctcac gccgaacacg tcgaaccagc gcagcaccgg caggtagtcc    600

cagcggttgg ccgtgccgat gtacgagatc ctctagagtc                          640

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

ctcgagcagt  gcaccagagt cacagaaaca catcacac                           38

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

agactccttc ttgacgaggt ggaggtgt                                       28

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

agatctcggt gaagcactcc ctggcgcac                                      29

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

gcgaagcttg catgcctaca gtgcagcgtg acccggtcgt gc          42

<210>9

<211>46

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

gtgggatcct ctagagtcga cctgcagaag taacaccaaa caacag      46

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>10

tcgacgagct cgtgccgtac atcgg                             25

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>11

agcgctcgag tttagagcag tgatcacagt gtcag                  35

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>12

gcttagatct cgtacatcgg cacggccaac cgct                   34

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>13

agcgctcgag ccagcctccg ccgctccccg t                      31

Claims (9)

1.一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法，其特征在于，在表达目的基因的同时，利用反义RNA或RNAi方法，抑制转基因禾本科农作物中参与目标除草剂解毒的基因的表达，得到所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的目标除草剂为苯达松或磺酰脲类除草剂，所述的方法为：1)将抑制禾本科农作物中参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒的细胞色素P450基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框与目的基因表达框构建在同一个转化导入DNA片段中；2)将步骤(1)所得转化导入DNA片段导入禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将禾本科农作物中多个参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒的细胞色素P450基因的DNA片段连接成一个杂合片段，再根据杂合片段构建反义RNA或者RNAi抑制框，将所述反义RNA或RNAi抑制框与目的基因表达框构建在同一个转化导入DNA片段中，将所述DNA片段导入相应禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭的转基因禾本科农作物。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述禾本科农作物为水稻，根据SED ID No：1设计抑制除草剂的解毒酶基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框，将所述反义RNA或RNAi抑制框和目的基因表达框连接在同一转化导入DNA片段中，将所述DNA片段导入水稻中，得到转基因水稻。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述禾本科农作物为玉米，根据SED ID No：2设计抑制除草剂的解毒酶基因的表达的反义RNA或RNAi抑制框，将所述RNA或RNAi抑制框和目的基因表达框连接在同一转化导入DNA片段，将所述DNA片段导入玉米中，得到转基因玉米。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述禾本科农作物为水稻，所述反义RNA或RNAi抑制表达框含有核苷酸序列片段SED ID No：3。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述禾本科农作物为玉米，所述反义RNA或RNAi抑制表达框含有核苷酸序列片段SED ID No：4。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述目的基因为下列一种或一种以上：抗除草剂基因、抗虫基因、药物蛋白基因、工业霉基因。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的基因为抗草甘膦基因。

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