KR100859991B1 - Ｄ－아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의선발 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의 선발 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 효모(Candida boidinii)에서 분리한 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용하여 D-아미노산이 함유된 배지에서 형질전환식물을 선발하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 D-아미노산 산화효소는 형질전환체, 특히 담배 및 토마토가 D-아미노산에 대하여 저항성을 가지도록 하며, 담배에 대해서는 과발현되어도 표현형에 있어서 결함을 보이지 않는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 D-아미노산 산화효소는 형질전환체, 특히 담배 및 토마토의 형질전환체의 선발용 마커로 사용할 수 있다.

D-아미노산 산화효소, 형질전환체, 담배, 토마토

Description

Ｄ－아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의 선발 방법{D-amino acid oxidase and method for selecting transformed plant using the same}

도 1a는 D-세린 및 D-알라닌의 농도에 따른 담배의 생장을 나타낸 것이다.

도 1b는 D-세린 및 D-알라닌의 농도에 따른 유채(탐라)의 생장을 나타낸 것이다.

도 1c는 D-세린 및 D-알라닌의 농도에 따른 유채(유달)의 생장을 나타낸 것이다.

도 1d는 D-세린의 농도에 따른 토마토의 생장을 나타낸 것이다.

도 2는 본원발명의 식물 형질전환용 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.(LB, Left boader; BAR, bialaphos acetyltransferase; T35S, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S terminator; CbDAO, Candida boidinii D-amino acid oxidase; 35S, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S promoter; EgfpER, green-fluorescent protein linked to the endoplasmic; RB, Right border)

도 3은 본원발명의 CbDAO 유전자로 형질전환된 담배의 배지내 생장을 나타낸 것(A) 및 온실 재배시 생장을 나타낸 것(B)이다.(A 좌측상단 : 형질전환된 담배의 캘러스 유도; 우측상단 : D-세린 첨가 배지에서 형질전환된 담배의 선발; 좌측하단 : 형질전환된 담배의 뿌리 유도; 우측하단 : 형질전환된 담배의 온실내 순화 및 생육)

도 4는 본원발명의 CbDAO 유전자로 형질전환된 담배에서 CbDAO 유전자의 발현을 노던 블럿으로 분석한 것이다.(C, 대조구, 레인 1 내지 레인 15, 형질전환된 담배의 개별 개체)

도 5는 본원발명의 CbDAO 유전자로 형질전환된 토마토의 배지내 생장을 나타낸 것이다.(좌측 : D-세린 첨가 배지에서 형질전환된 토마토의 선발, 우측 : 선발된 형질전환 토마토의 배지내 생육 모습)

도 6은 본원발명의 CbDAO 유전자로 형질전환된 담배의 후대종자의 D-세린 함유 배지내에서의 생장을 나타낸 것이다.(좌측 : 형질전환된 담배의 후대종자의 생장 모습(플레이트 좌측, 대조군; 우측, 형질전환된 담배의 후대종자); 우측 : 형질전환된 담배의 후대종자의 발아 및 생장 모습)

본 발명은 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의 선발 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 효모(Candida boidinii)에서 분리한 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용하여 D-아미노산이 함유된 배지에서 형질전환식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.

현재, 분자생물학과 유전공학의 발달로 다양한 형질전환 작물이 개발되고 있다. 1984년에 처음으로 TMV(tobacco mosaic virus) 저항성 담배 식물체가 개발된 이래로 제초제, 해충, 병 저항성을 지닌 형질전환 작물의 개발이 이루어지고 상업화되고 있다. 2005년 보고에 따르면 형질전환 작물은 21개국에서 재배되며, 재배면적은 9천만ha에 이르고 있고, 매년 그 면적이 증가되는 추세이다 (James (2005) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2005. ISAAA Briefs No. 34 - 2005). 형질전환 작물의 재배면적과 상업화가 증가되는 반면 대중과 몇몇 시민단체에서는 형질전환 작물 개발시 사용되는 항생제 혹은 제초제 저항성유전자가 인체와 환경에 해를 미칠 것에 대하여 우려를 나타내고 있다. 현재 사용되고 있는 항생제 또는 제초제 저항성유전자를 제거 또는 다른 유전자로 대체할 경우 형질전환 작물의 구입 및 승인에 찬성하겠다는 대중인식 변화보고가 잇따르고 있다(Gamble J, Gunson A (2002) The New Zealand public's attitudes regarding genetically modified food: May and October 2001. HortReserch Client Report No. 2003/35; Lusk JL, Sullivan P (2002) Consumer acceptance of genetically modified foods. Food Technol 56: 32-37.; Schaart JG (2004) Towardsconsumer-friendly cisgenic strawberries which are less susceptible to Botrytis cinerea. PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, the Netherlands; Small B (2004) Public perceptions about genetically engineered forage crops and resultant animal products. In: new directions for a diverse planet, proceedings of the 4th international crop science congress, Brisbane, Australia, 26 Sep-1 Oct 2004. T. Fisher, N. Tuner, J. Angus, L. McIntyre, M. Robertson, A. Borrell and D. Lioyd, eds. CD Rom. The Regional Institute Ltd, Gosford, Australia). 따라서 형질전환 작물을 개발하고 상업화하기 위해서는 이들 마커를 대체하기 위한 새로운 유전자의 개발이 요구된다.

최근에 이러한 요구에 부응하기 위하여 항생제 마커를 사용하지 않는 방법들이 개발되고 있다. 예를 들면, 식물체가 탄수화물 대사상에 이용할 수 없는 물질들을 이용하여 형질전환된 식물체를 선발하는 시스템이 개발되었으며(A. Haldrup .A, Petersen S.G. and Okkels F.T. 1998. The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using

-xylose as the selection agent. Plant Mol. Biol. 37 : 287296; Privalle L. 2002. Phosphomannose isomerase, a novel plant selection system. Potential allergenicity assessment. Ann. N. Y. Acad. Sci. 964: 129138.; Reed J, Privalle L, Powell M.L., Meghji M., Dawson J., Dunder E., Suttie J, Wenck A., Launis K, Kramer C., Chang Y.-F., Hansen G., and M. Wright. 2001. Phosphomannose isomerase: an efficient selectable marker for plant transformation. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 37: 127132.; Privalle, L.S., Wright, M., Reed, J., Hansen, G., Dawson, J., Dunder, E.M., Chang, Y.F., Powell, M.L., Meghji, M., 2000. Phosphomannose isomerasea novel system for plant selection: mode of action and safety assessment. In: Fairburn, C., Scoles, G., McHughen, A. (Eds.), Proceedings of the 6th International Symposium on The Biosafety of Genetically Modified Organisms. pp. 171178), 식물체가 이용할 수 없는 탄소원인 D-자일로스(D-xylose)를 이용하여 형질전환된 식물체를 선발하는 방법은 담배, 토마토, 감자 등과 같은 식물체에서 이용성이 입증되었다. 이외에도 만노스-6-인산(mannose 6-phosphate)를 과당-6-인산(fructose-6-phosphtate)로 전환하는 포스포만노이소머라제(phosphomannoisomerase)를 사용한 기술이 신젠타에 의해 Positech^TM 방법으로 옥수수, 밀, 보리와 수박 등과 같은 작물에서 기존의 항생제 마커인 카나마이신(kanamycin)과 동등한 수준의 형질전환율을 보임을 밝혔다(Joersbo M, Donaldson I, Kreibeg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol Breed 4: 111-117; Lucca P., Ye X., and Potrykus I. (2001) Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent. Mol. Breeding 7: 4349. ; Reed J, Privalle L, Powell M.L., Meghji M., Dawson J., Dunder E., Suttie J, Wenck A., Launis K, Kramer C., Chang Y.-F., Hansen G., and M. Wright. (2001) Phosphomannose isomerase: an efficient selectable marker for plant transformation. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 37: 127132.). 이외에 표현형에서의 변이를 이용하여 형질전환된 개체를 선발하는 방법 등이 개발되고 있다. 식물호르몬 유전자인 이소펜테닐 트랜스퍼라제(isopentenyl transferase)를 이용하여 형질전환을 수행하여 재분화시 슈트 형(shooty) 표현형을 나타내는 개체들을 이용하여 형질전환을 수행한 보고도 있으나 이 경우 내재 시토키닌(cytokinin)의 농도가 높아져서 정아우세의 손실 및 뿌리발달의 부재 등 비정상적인 표현형을 나타내는 경우가 보고되어서 이들 유전자의 발현을 부위 또는 화학물질에 의해 유도되도록 조절하여 이용하고 있다(Endo S., Kasahara T., Sugita K., Matsunaga E., and Ebinuma H. (2001) The isopentyl transferase gene is effective as a selectable marker gene for plant transformation in tobacco (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1). Plant Cell. Rep. 20: 6066.; Takei K., Skakibara H, and Sugiyama T. (2001) Identification of genes encoding adenylate isopentyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem .276: 2640526410; Zuo J., Niu Q.-W., Ikeda Y., and Chua N.-H. (2002) Marker-free transformation: increasing transformation frequency by the use of regeneration-promoting genes. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 73180.). 또한 헤어리 루트(hairy root) 유도 유전자인 rol을 이용하여 형질전환하여 항생제 없는 형질전환체를 선발하는 연구도 수행되고 있다(Ebinuma H., and Komamine A. (2001) MAT (multi-auto-transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 37:103113.)

하지만, 이러한 종래의 형질전환 마커의 개발 노력에도 불구하고, 대다수의 마커는 형질전환체에서의 과다발현시 유전적 또는 표현형적인 결함을 일으키고 있다. 아울러, 동일한 마커라고 하더라도 형질전환 대상을 달리하는 경우 그 효과가 상이하게 나타나 개별적인 형질전환체에 따라서 적절한 마커를 선택하는 것은 어려운 일이 되고 있다. 따라서, 특정의 형질전환체에서 안정적으로 발현하며, 야생형에 비해 유전적 또는 표현형적인 결함을 일으키지 않는 마커를 개발하기 위한 노력이 더욱 더 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 식물체의 표현형에 영향을 주지 않는 형질전환 식물의 선발 방법에 대한 연구를 거듭하던 중, 효모인 캔디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 D-아미노산 산화효소를 분리하였고, 상기 D-아미노산 산화효소가 형질전환식물, 특히 담배 및 토마토의 선발을 위하여 이용할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의 선발 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모로부터 분리한 D-아미노산 산화효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균으로 형질전환된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 D-아미노산 산화효소로 식물체를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체를 D-아미노산 포함 배지에서 재배하는 단계를 포함하는 형질전환식물을 선발(selection)하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 효모인 캔디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 분리된 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase, DAO)를 제공한다.

본 발명의 D-아미노산 산화효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 D-아미노산 산화효소와 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, 실질적으로 동질의 생리활성이란 DNA 내에서 D-아미노산을 산화시키는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 D-아미노산 산화효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 D-아미노산 산화효소의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른　단백질과　융합으로　만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 또는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다. 그러나 바람직하게는 효모로부터 분리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 캔디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 분리될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 재조합 벡터를 이룰 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 형질전환 기술에 의해 숙주세포를 형질전환 할 수 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 본 발명의 D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 도입방법은 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법을 이용할 수 있다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스( Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 방법에 따라 형질전환된 식물을 제공한다. 본 발명에 따른 형질전환 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　보다 구체적으로 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　즉, D-아미노산 산화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리 를 유도한다.　뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 개화시기가 촉진된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 이에 한정되지는 않으나 담배 또는 토마토 일 수 있으며, 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 효모 D-아미노산 산화효소로 식물체를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체를 D-아미노산 포함 배지에서 재배하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환식물을 선발(selection)하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법에서의 형질전환은 상기에서 기재한 바와 같으며, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 담배 또는 토마토일 수 있다.

D-아미노산은 D-세린 또는 D-알라닌일 수 있으며, 선발을 위한 바람직한 농도는 대상 식물에 따라 상이하나, 예를 들어 담배의 경우 3mM 내지 10mM의 D-세린 또는 2mM 내지 10mM의 D-알라닌의 농도로 배지내에 포함시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 담배, 유채 및 토마토에 대해서 D-세린 및 D-알라닌에 대한 선발농도를 확인하였다. 그 결과, 담배의 경우 3mM의 D-세린 및 2mM의 D-알라닌에서, 유채의 경우 유달 품종에 대해서는 0.4mM D-세린 및 0.6mM D-알라닌에서, 탐라 품종에 대해서는 0.6mM D-세린 및 1mM D-알라닌에서, 토마토의 경우 3mM D-세린에서 생장이 억제되어 선발이 가능함을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 효모로부터 D-아미노산 산화효소를 PCR로 클로닝하여 이를 포함하는 형질전환용 벡터를 제조하였다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기 형질전환용 벡터를 이용하여 담배 및 토마토 형질전환체를 제조하고, 이들에서 본원발명의 D-아미노산 산화효소가 안정적으로 발현됨을 확인하고, 상기 형질전환체가 D-아미노산의 존재하에서 잘 생장하여 형질전환체의 선발이 가능함을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 D-아미노산 산화효소를 이용한 형질전환이 후대에서도 안정적으로 유지, 발현되는지를 알아보고, 기존의 마커시스템처럼 후대에서도 유전분리비를 검정하는 것이 가능한지 알아보기 위해서 상기 형질전환체의 후대종자(F1)을 수확하여 이들의 D-세린 첨가 배지에서의 생육을 조사하였다. 그 결과, 후대 종자에서도 도입한 D-아미노산 산화효소 유전자가 안정적으로 발현되어 형질전환 담배 후대종자가 D-세린 함유 배지에서 살아남았고, 이들의 분리비는 기존에 사용된 항생제 또는 제초제 저항성에서 나타난 분리비와 비슷한 경향을 보였다. 따라서, 본원발명의 형질전환 방법이 D-세린 배지에서 후대검정을 수행할 수 있을 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명은 D-아미노산 산화효소 및 이를 이용한 형질전환식물의 선발 방법을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

담배, 유채, 토마토의 D-아미노산 선발농도 확인

<1-1> 담배의 D-아미노산 선발농도 확인

담배종자를 70%(v/v) 에탄올에서 2분간 표면 살균한 다음, 2.5% (v/v) 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog, 1962, Physiol Plant 15: 473-497)에 파종하여 26℃, 16L/8D 광주기에서 배양하고, 파종후 4주된 기내 배양된 담배식물체의 엽절편체를 실험재료로 사용하였다. 적정 D-아미노산 선발농도를 조사하고자 1 mg/L BA(6-benzyladenine), 1 mg/L NAA(naphthaleneacetic acid), 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS배지에 D-세린(D-serine)과 D-알라 닌(D-alanine)을 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 mM로 첨가하여 실험하였다. 엽절편체는 5 mm X 5 mm의 크기로 준비하여 plate당 10개씩 치상하여 5회 반복하였으며, 배양후 4주 뒤에 절편체의 생체중을 조사하였다.

그 결과, 도 1a에서 보듯이 각각 3 mM D-세린 및 2 mM D-알라닌 이상의 농도를 첨가한 배지에서 담배의 생장이 억제되어 담배에서는 상기 농도 이상의 농도에 대해서 선발효과가 나타남을 알 수 있었다.

<1-2> 유채의 D-아미노산 선발농도 확인

유채종자(탐라 및 유달)를 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 파종하여 5일간 암배양을 하여 하배축의 신장을 유도한 다음 하배축을 실험재료로 사용한 것 및 D-아미노산의 농도를 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3mM로 사용한 것 외에는 상기 실시예 <1-1>에서와 동일한 방법으로 하여 유채의 D-아미노산 선발농도를 확인하였다.

그 결과, 도 1b 및 도 1c에서 보듯이 탐라의 경우 0.6 mM D-세린 및 1 mM D-알라닌이상, 유달의 경우 각각 0.4 mM D-세린 및 0.6 mM D-알라닌이상의 농도를 첨가한 배지에서 유채의 생장이 억제되어 유채에서는 상기 농도 이상의 농도에 대해서 선발효과가 나타남을 알 수 있었다.

<1-3> 토마토의 D-아미노산 선발농도 확인

토마토종자를 1/2 MS 기본배지에 파종하여 파종후 14일된 떡잎을 이용한 것 및 1 mg/L 제아틴(zeatine), 1 mg/L NAA, 10 g/L 설탕(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS배지에 D-세린을 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 mM로 첨가한 배지에서 배양한 것 이외에는 상기 실시예 <1-1>과 동일하게 하여 토마토의 D-아미노산 선발농도를 확인하였다.

그 결과, 도 1d에서 보듯이 3 mM D-세린이상의 농도를 첨가한 배지에서 토마토의 생장이 억제되어 토마토에서는 상기 농도 이상의 농도에 대해서 선발효과가 나타남을 알 수 있었다.

<실시예 2>

효모 D-아미노산 산화효소( CbDAO ) 유전자의 클로닝

효모(Candida boidinii, KCTC7944)를 30 mM D-알라닌이 첨가된 YM배지에서 액체배양한 후, 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 Superscriptase II (Life Technologies, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

D-아미노산 산화효소 유전자(CbDAO)는 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 서열번호 3의 정방향 프라이머(5'-ACAAAATGGGTGATCAAATTGTTG-3') 및 서열번호 4의 역 방향 프라이머(5'-CATCAATCTAAAGTTTAGCTTTAACT-3')를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 증폭은 94℃에서 3분간 전변성(pre-denaturation), 94℃에서 45초, 57℃에서 45초, 72℃에서 1분 30초를 1 싸이클로 하여 30 싸이클 및 72℃에서 5분간 최종연장반응(final extension)에 의해 수행되었다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다.

염기서열분석 결과 클로닝된 CbDAO 유전자는 총 1,038 bp의 코딩 부위(coding region)로 구성되었고 ORF(open reading frame)는 345 a.a로 구성되었다. 데이터베이스(NCBI, BLAST)를 이용한 상동성 분석결과 클로닝된 CbDAO 유전자는 기존의 보고된 CbDAO1(AB042032)과 뉴클레오타이드 염기서열에서 10개의 차이가 나타났고, 단백질 염기서열에서는 5개의 염기서열의 차이가 나타났으나 단백질의 활성부위의 변이는 발생하지 않음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

CbDAO 유전자 과발현 식물발현용 운반체 제작

상기 실시예 2에서 클로닝된 CbDAO 유전자를 식물체에서 과발현시켰을때 식물 선발마커(plant selective marker)로서 기능을 할 수 있을지를 알아보기 위해서 Bar저항성을 지니는 pB7WG2D의 식물발현 벡터(invitrogen, 미국)의 35S promoter와 35S terminator사이에 CbDAO의 전체 ORF가 삽입된 벡터를 제작하였다(도 2 참조).

< 실시예 4>

CbDAO 유전자 과발현에 의한 작물형질전환 효과

<4-1> 담배 형질전환체의 제조

실시예 3에서 제작한 식물발현벡터를 이용하여 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)<H, R. and Willmitzer, L., 1988, Nucleic Acids Res., 16: 9877)을 담배(Nicotiana tabaccum cv Xanthi) 잎 절편과 공동 배양하여 담배를 형질전환하였다.

형질전환체 및 대조군으로서 야생형 담배를 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 10 g/L 수크로스(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS배지에서 2일간 공동배양한 후, 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L 카르베니실린(carbenicillin), 3 mM D-세린, 10 g/L 수크로스, 8 g/L 아가가 첨가된 MS배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L 카르베니실린, 3 mM D-세린, 10 g/L 수크로스, 8 g/L 아가가 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 배양은 26℃, 16광주기/8암주기의 조건에서 배양하였고, 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 평균기온 26℃이상의 조건에서 생육시켰다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 본 발명의 CbDAO 유전자가 도입된 형질전환 담배의 경우 D-세린이 첨가된 배지에서 잘 생장하지만, CbDAO 유전자가 도입되지 않은 야생형 담배의 경우 생장하지 못함을 알 수 있었다(도 3A 참조). 아울러, D-세린이 첨가된 배지에서 선발된 형질전환 담배의 온실 재배 결과 형질전환된 담배식물체의 외형적인 형태는 대조구인 야생형 담배(WT)와 동일하여 CbDAO 유전자가 과발현되어도 담배의 생장에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 3B 참조).

<4-2> 형질전환 담배의 CbDAO 발현 분석

상기 실시예 <4-1>에서 선발된 형질전환 담배가 CbDAO 유전자를 안정적으로 발현하는지 확인하기 위하여 노던 블럿(Northern blot) 분석을 수행하였다(Sambrook J and Russell D.W., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold spring harbor laboratory press)

그 결과, 도 4에서 보듯이, D-세린이 포함된 배지에서 선발된 형질전환 담배식물은 모두 CbDAO 유전자를 발현하고 있음을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 종합하면, CbDAO 유전자는 담배에서 안정적으로 형질전환되어 발현되며 형질전환된 작물을 D-세린이 첨가된 배지에서 선발할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 토마토 형질전환체의 제조

형질전환 토마토를 생산하기 위해서 상기 실시예 3에서 제작한 식물발현벡터 로 토마토(Lycopersicon esculentum)를 형질전환하고, 1 mg/L 제아틴(zeatine), 1 mg/L NAA, 10 g/L 수크로스, 8 g/L 아가, 3mM D-세린이 첨가된 MS배지에 이용하여 형질전환체를 선발한 것을 제외하고 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 토마토를 형질전환하고, 이를 배지에서 선발하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, CbDAO 유전자가 도입된 형질전환 토마토의 경우 D-세린이 포함된 배지에서 잘 생장하지만, CbDAO 유전자가 도입되지 않은 야생형 토마토의 경우에는 생장하지 못함을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

CbDAO 유전자 과발현에 의한 후대 작물선발 효과

CbDAO 유전자가 과발현된 형질전환 담배의 후대종자(F1)를 수확하여 이들 종자의 후대검정을 다음과 같이 수행하였다. 형질전환 담배의 후대종자 및 야생형 담배의 종자를 각각 70% (v/v) 에탄올에서 2분간 표면살균한 다음, 2.5% (v/v) 차아염소산염 나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 10 mM D-세린이 첨가된 1/2 MS 기본배지(Murashige and Skoog, 1962)에 파종하여 26도, 16L/8D 광주기에서 배양하여 생육상태를 조사하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이 본원발명의 형질전환 담배의 종자는 10mM D-세린이 첨가된 배지에서도 발아하여 생장하였으나, 야생형 담배의 경우 그 생육이 억제됨을 알 수 있었다.

식물발현운반체내에는 기존에 사용되고 있는 제초제 저항성유전자인 BAR를 지니고 있어서 PPT(DL-phosphinothricin)를 첨가하여 선발된 유전분리비와 D-serine으로 선발할 경우의 유전분리비를 비교하여 기존의 방법과 동일한지 알아보기 위하여 다음과 같이 종자발아율을 확인하였다. 즉, 유전자도입 및 발현이 확인된 담배식물체와 야생형 담배를 자가수정하여 얻은 종자를 표면살균하여 10 mM D-serine이 첨가된 1/2 MS 배지와 10 mg/L PPT(DL-phosphinothricin)가 첨가된 1/2 MS 배지에 각각 파종하였다. 파종된 종자는 26도, 16L/8D 광주기에서 2주간 배양하여 저항성 개체와 감수성 개체의 분리비를 x2 검정에 준하여 추정하였다.

그 결과, 양쪽 배지에서 선발된 유식물체의 표현형은 크게 다르지 않았고, 후대 종자의 분리비도 동일하게 나타났으며, 이러한 결과는 D-serine 배지를 이용하여도 후대 유전분리비를 확인할 수 있음을 나타내는 것이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 D-아미노산 산화효소는 형질전환체, 특히 담배 및 토마토가 D-아미노산에 대하여 저항성을 가지도록 하며, 담배에 대해 서는 과발현되어도 표현형에 있어서 결함을 보이지 않는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 D-아미노산 산화효소는 형질전환체, 특히 담배 및 토마토의 형질전환체의 선발용 마커로 사용할 수 있다.

<110> Republic of Korea <120> D-amino acid oxidase and method for selecting transformed plant using the same <130> NP07-0021 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Candida boidinii <400> 1 Met Gly Asp Gln Ile Val Val Leu Gly Ser Gly Ile Ile Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Thr Tyr Cys Leu Ile Tyr Glu Ala Gly Phe Asp Pro Ala Lys Ile 20 25 30 Thr Ile Val Ala Glu Phe Leu Pro Gly Asp Gln Ser Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Ala Gly Gly Asn Phe Ser Cys Ile Ser Pro Ala Asp Asp 50 55 60 Thr Thr Leu Ala Tyr Asp Lys Phe Thr Tyr Leu Asn Leu Phe Lys Ile 65 70 75 80 Gln Lys Lys Leu Gly Gly Pro Glu Cys Gly Leu Asp Asn Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Glu Tyr Trp Asp Phe Tyr Pro Gly Asp Glu Lys Val Asn Ser Leu 100 105 110 Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Val Ile Pro Lys Ser Glu Leu Pro 115 120 125 Glu Gly Val Glu Tyr Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Trp Asn Phe Asn Cys 130 135 140 Pro Val Phe Leu Gln Asn Met Ala Asn Phe Val Asn Lys Arg Asn Val 145 150 155 160 Thr Ile Ile Arg Lys His Leu Thr His Ile Ser Gln Ala Tyr Leu Thr 165 170 175 Val Asn Thr Lys Val Val Phe Asn Cys Thr Gly Ile Gly Ala Ala Asp 180 185 190 Leu Gly Gly Val Lys Asp Glu Lys Val Tyr Pro Thr Arg Gly Gln Val 195 200 205 Val Val Val Arg Ala Pro His Ile Gln Glu Asn Lys Met Arg Trp Gly 210 215 220 Lys Asp Tyr Ala Thr Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Tyr Ser Asn Gly Glu 225 230 235 240 Leu Val Leu Gly Gly Phe Leu Gln Lys Asp Asn Trp Thr Gly Asn Thr 245 250 255 Phe Gly Phe Glu Thr Asp Asp Ile Val Ser Arg Thr Thr Ser Leu Leu 260 265 270 Pro Lys Ile Leu Asp Glu Pro Leu His Ile Ile Arg Val Ala Ala Gly 275 280 285 Leu Arg Pro Ser Arg His Gly Gly Pro Arg Ile Glu Ala Glu Val Cys 290 295 300 Glu Glu Gly Lys Leu Thr Ile His Asn Tyr Gly Ala Ser Gly Tyr Gly 305 310 315 320 Tyr Gln Ala Gly Tyr Gly Met Ser Tyr Glu Ala Val Lys Leu Leu Val 325 330 335 Asp Asn Gln Lys Val Lys Ala Lys Leu 340 345 <210> 2 <211> 1038 <212> DNA <213> Candida boidinii <400> 2 atgggtgatc aaattgttgt tcttggttcc ggtattattg gtttatatac tacatactgt 60 ttaatctatg aggctggatt tgatccagct aaaattacta ttgttgctga atttttacca 120 ggtgatcaat ctacattata tacatctcca tgggcaggtg gtaatttttc ttgtatttca 180 ccggctgatg atacaacctt ggcttatgat aaattcacat atcttaattt attcaagatt 240 caaaaaaaat taggtggacc agaatgtgga ttagataata agccaagtac tgaatattgg 300 gatttttatc ctggtgatga aaaagtcaat tctttaaaac aatatcttaa agattttaaa 360 gttattccaa aatcagaatt accagaaggt gttgaatatg gtattagtta tactacatgg 420 aatttcaact gtcctgtttt cttacaaaat atggctaatt ttgtaaataa aagaaatgtt 480 accattatta ggaaacattt gacacatatt tcccaagctt atttgacagt taatacaaaa 540 gttgttttca actgtacagg tattggtgct gctgatttag gtggtgttaa agatgaaaaa 600 gtttatccaa ctagaggaca agttgttgtt gttagagctc cacatattca agaaaataaa 660 atgagatggg gtaaagacta tgctacttat attattccaa gaccatattc taatggtgaa 720 ttagtcttag gtggtttctt acaaaaggat aattggacag gtaatacttt tggtttcgaa 780 actgatgata ttgttagtag aactacatct ttattaccaa agattttaga tgaaccactt 840 catattatta gagttgcagc tggtttaaga ccaagtagac atggtggtcc aagaattgaa 900 gctgaagttt gtgaagaagg taaattaact attcataatt atggtgcttc tggatatggt 960 tatcaagctg gttatggtat gtcttatgaa gctgtcaaac ttttagttga taaccaaaaa 1020 gttaaagcta aactttag 1038 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CbDAO forward primer <400> 3 acaaaatggg tgatcaaatt gttg 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CbDAO reverse primer <400> 4 catcaatcta aagtttagct ttaact 26

Claims (13)

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10. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 효모(Candida boidinii) D-아미노산 산화효소(CbDAO)로 담배 또는 토마토를 형질전환하는 단계; 및

    (b) 상기 (a) 단계에서 형질전환된 담배 또는 토마토를 3mM 내지 10mM의 D-세린 또는 D-알라닌 포함 배지에서 재배하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환식물을 선발(selection)하는 방법.
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