KR100802135B1

KR100802135B1 - 벼 유래 신규 탈인산화효소 유전자 및 상기 유전자로형질전환된 식물체

Info

Publication number: KR100802135B1
Application number: KR1020060138163A
Authority: KR
Inventors: 김도훈; 윤대진; 남재성; 이재헌; 정영수; 김경태; 은무영; 허경혜; 남민희; 이기환; 박순기
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-02-11

Abstract

본 발명은 벼 유래 신규 탈인산화효소 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인산이 결핍된 조건에서 발현되는 탈인산화효소를 코딩하는 벼 유래 신규 유전자 OsACP1, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체는 인산 결핍 스트레스 저항성을 가지므로 인산의 이용 효율을 증진시킬 수 있어 작물의 생산성 향상에 유용하다.

인산 결핍, 벼, 탈인산화효소, 형질전환 식물체, OsACP1

Description

벼 유래 신규 탈인산화효소 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체{Novel Gene Coding Phosphatase Isolated from Oryza sp. and Plants Transformed by the Gene}

도 1은 벼 탈인산화효소 유전자와 다른 식물체의 탈인산화효소 유전자 간의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 것이다 [토마토: LePS2; 애기장대: NP_173213, AAM63155; 벼: XP_464747, XP_463399].

도 2는 벼의 캘러스 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서 OsACP1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다 [A: 인산 농도의 변화에 따른 OsACP1 유전자의 발현량 측정; B: 시간별 인산 결핍 조건에서의 OsACP1 유전자의 발현 여부; C: 영양결핍 조건에서의 OsACP1 유전자의 발현 여부 측정; D: 인산 결핍 조건에서 벼 유식물체의 줄기(S)와 뿌리(R)의 OsACP1 유전자의 발현 여부 측정].

도 3은 OsACP1 유전자의 발현 여부를 베큘로바이러스 시스템(Baculovirus system)을 이용하여 웨스턴 블럿한 결과를 나타낸 것이다 [A: 곤충 세포에서 OsACP1 단백질의 발현량을 측정한 것; B: 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로 발현 단백질을 확인한 것].

도 4는 형질전환체의 OsACP1 유전자의 발현 여부 및 탈인산화효소의 활성을 나타낸 것이다 [A: 형질전환된 애기장대 식물체의 PCR 결과; B: 형질전환된 애기장대 식물체의 노던 블럿 결과; C: 형질전환된 애기장대 식물체의 웨스턴 블럿 결과; D: 형질전환된 애기장대 식물체의 탈인산화효소의 활성도].

발명의 분야

배경기술

인산은 인지질, 핵산, 에너지 대사, 효소 활성의 조절, 신호전달과정 등에서 필수적인 생물학적 기능을 하여 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 영양소 중의 하나이다.

지구의 암석권에는 인산이 많이 존재하나, 토양에서 80% 정도가 고정되어 있어 뿌리가 쉽게 이용할 수 없으므로 작물 생산성에 제한 인자로 작용한다. 따라서, 작물에 충분한 영양소를 공급하기 위해 시비를 많이 하게 되어 농업 비용이 증가하 게 되고, 미처 흡수되지 못한 인산질 비료는 빗물에 씻겨 내려가 지하수를 오염시키고 부영양화를 일으켜 환경오염을 야기하므로, 인산결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물 개발이 필요하다.

또한, 식물은 인산이 결핍된 조건에서 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고, 고친화성 인산 운반체, 탈인산화효소, 유기산 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 인산이 결핍된 조건에서 인산의 이용성을 향상시킬 수 있는 식물체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 인산 결핍 조건에서 발현하는 신규 탈인산화효소 유전자를 벼에서 분리하여, 상기 유전자로 형질전환된 식물체가 인산 결핍 조건에서 인산 결핍 스트레스 저항성을 가진다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsACP1), 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsACP1) 또는 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 탈인산화효소 OsACP1의 제조방법 및 탈인산화효소 OsACP1을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 벼(Oryza sp.) 유래 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsACP1), 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탈인산화효소 OsACP1을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 애기장대(Arabidopsis thaliana), 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 및 탈인산화효소 OsACP1을 회수하는 단계를 포함하는 탈인산화효소 OsACP1의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 곤충세포인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 곤충세포는 sf9(Gibco) 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsACP1), 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

벼 전체 게놈 서열이 규명되어 있기는 하나(Kikuchi, S. et al ., Science, 301:376, 2003), 본 발명에 따른 유전자의 기능에 대해서는 밝혀진 바 없었다. 본 발명에 따르면, 동진벼에서 게놈 DNA를 분리하여 벼 유래의 탈인산화효소 유전자(OsACP1)에 특이적인 프라이머를 제작하고, PCR 법에 의해 OsACP1 유전자를 증폭한 후, 상기 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합벡터를 제작한 다음, triparental mating 방법으로 아그로박테리움 투메파시앙스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 옮기고, in planta 형질전환 방법으로 애기장대에 형질도입하여 형질전환 식물체를 제작하였다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적 절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 유전자로 형질감염된 저온 및/또는 염 저항성 식물을 제공한다. 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 탈인산화효소 OsACP1의 제조방법 및 탈인산화효소 OsACP1에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, OsACP1 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 OsACP1 유전자가 도입된 재조합벡터로부터 OsACP1 유전자를 분리한 후, pBacPAK9 벡터의 AcNPV 폴리헤드린 프로모터의 하위 부분에 결합시켜 pBacPAK9-OsACP1 재조합벡터를 제작하고, 상기 재조합벡터를 AcNPV와 함께 곤충세포인 sf9 세포와 공배양시켜 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 곤충세포에서 발현된 OsACP1 재조합 단백질을 분리하여 OsACP1 재조합 단백질을 제조하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에 본 발명에 따른 OsACP1 유전자로 형질전환된 식물체로 애기장대만을 예시하였으나, 동일한 방법을 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자 등에 적용하여 인산 결핍에 의한 스트레스에 내성을 가지는 형질전환체를 제조하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1. 벼 유래의 탈인산화효소 유전자( OsACP1 )의 클로닝

동진벼(Oryza sativa cv . Dongjin)에서 게놈 DNA를 분리하여 전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 탈인산화효소 유전자 OsACP1에 특이적인 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작한 후, PCR 법에 의해 OsACP1 유전자를 증폭하였다.

서열번호 2: 5'-CCCGGGATGGCCGGGATCGTGGTGGTG

서열번호 3: 5'-CCCGGGTCAGTTCTTGATCCGGAGCGT

상기 증폭된 PCR 산물을 pBluescript(Stratagene, USA) 벡터에 클로닝한 후, sequencing을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다. 또한, 상기에서 분리된 OsACP1과 다른 식물체의 탈인산화효소 유전자와의 상동성을 CLUSTAL X 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 이들 유전자들 간에는 50% 정도의 아미노산 염기서열이 상동성을 나타내었다 (도 1).

실시예 2. 인산 결핍 조건에서의 OsACP1 유전자 발현 양상

유사 기능을 하는 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도 인자 특이적으로 조절되므로, 상기에서 분리된 OsACP1 유전자의 발현 양상을 RNA blot 방법으로 측 정하였다.

동진벼 종자에서 유도된 캘러스 세포를 인산이 충분한 배지(1mM) 및 인산이 결핍된 배지(10μM)에서 각각 2일간 배양한 후, Trizol reagent(Invitrogen,USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 상기에서 분리된 RNA 10㎍를 1.2%(W/V) 변성 포름알데히드 아가로오스 겔(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 전기영동하여 나일론 막(nylon membrane, Amersham)에 부착시켰다. 상기 RNA가 부착된 막은 [32P] dATP로 표지된 3' UTR DNA 단편(서열번호 4)을 프로브로 하고, 20%(W/V) SDS, 20X SSPE, 100g/L PEG(polyethyleneglycol, 8,000 mwt), 250 ㎎/L 헤파린 및 10㎖/L Hearing sperm DNA(10㎎/㎖, Sigma)가 포함된 용액에서 65℃, 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 OsACP1 유전자의 cDNA 클론은 전체 825bp의 염기서열(서열번호 5)을 가지고 있으며, 274개의 아미노산 서열(서열번호 1)을 암호화하고 있다.

그 결과, 인산농도의 변화에 따라 OsACP1 유전자의 발현량이 변하였으며, 저농도의 인산에서 발현량이 증가되었고(도 2의 A), 인산 결핍 조건을 시간별로 측정한 경우 3일째부터 발현량이 급격히 증가하였으며(도 2의 B), 영양결핍 조건에서 인산 결핍 처리시 가장 높은 발현을 보여 인산 결핍에 특이적으로 발현하였다 (도 2의 C).

또한, 벼 유식물체에 각각 인산결핍과 충분조건을 주어 지상부와 지하부로 나누어 OsACP1 유전자의 조직 특이적인 발현 여부를 조사한 결과, 인산이 결핍된 뿌리에서 OsACP1 유전자가 가장 많이 발현되었다 (도 2의 D). 이는 인산이 결핍된 환경에서 식물체의 뿌리는 수많은 뿌리털을 만들어 표면적을 넓혀주고, 뿌리로부터 탈인산화효소를 분비하여 토양에 고정된 인산을 유효화시켜 인산의 흡수를 돕는다는 기존의 연구결과로 미루어 볼 때, OsACP1 유전자가 토양 내 인산의 유효화에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

실시예 3. OsACP1 재조합 단백질 및 OsACP1의 항체 제조

OsACP1 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 OsACP1 유전자가 클로닝된 pBluescript 벡터를 제한효소 XbaⅠ 및 NotⅠ로 처리하여 OsACP1 유전자를 분리한 후, 동일 제한효소로 처리한 pBacPAK9(Clontech) 벡터의 AcNPV 폴리헤드린 프로모터(AcNPV polyhedrin promoter)의 하위 부분에 OsACP1 유전자를 결합시켜 pBacPak9-OsACP1을 제작하였다. AcNPV(서울대학교) DNA 100ng과 상기 pBacPak9-OsACP1 500ng을 sf9(Gibco) 세포와 5시간 동안 공배양시켜 형질전환한 후, 상기 형질전환된 세포를 TC 100(Gibco) 배지에서 5일 동안 배양하여 OsACP1 재조합 단백질을 수득하였다.

또한, OsACP1의 항체를 제조하기 위하여, 상기에서 제조된 OsACP1 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 분리하고, Freund's complete adjuvant(Sigma)와 같은 양으로 섞어 Balb/c 마우스에 접종한 후, 상기 접종된 마우스로부터 피를 뽑아낸 다음, 원심분리하여 OsACP1의 항체를 수득하였다.

상기에서 제조된 OsACP1의 항체를 이용하여 상기에서 제조된 OsACP1 재조합 단백질에 대해 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 야생형에서는 OsACP1의 발현이 나타나지 않았지만 OsACP1이 재조합된 조건에서는 강하게 발현되므로, 목적 단백질인 OsACP1이 정상적으로 만들어진 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

실시예 4. OsACP1 유전자가 도입된 형질전환체의 제작

벼는 대부분 물속에서 생활하기 때문에 밭작물에 비해 상대적으로 약한 인산 결핍 스트레스를 받으므로, 벼에서 분리한 탈인산화효소 유전자를 밭작물에 응용할 수 있는지 확인하고, 식물체 내에서 그 기능을 조사하기 위하여 쌍떡잎식물의 대표적인 모델 식물체인 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용하여 OsACP1 유전자를 대량 발현하는 형질전환체를 제작하였다.

즉, 상기 OsACP1 유전자의 코딩 영역을 pCAMBIA1300-35S(CAMBIA, Australia) 벡터의 XbaI 사이트에 클로닝하여, OsACP1 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 재조합벡터를 제작한 후, triparental mating 방법으로 아그로박테리움 투메파시앙스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 옮긴 다음, in planta 형질전환 방법(Clough and Bent, Plant J. 16:735, 1998)으로 애기장대에 도입하였다.

상기 형질전환된 애기장대 T1 식물체에서 수확한 종자를 무균 살균처리하여 카베니실린(carbenicillin, 100㎎/L)과 하이그로마이신(hygromycin, 20㎎/L)이 첨가된 B5 배지(Duchefa)에서 발아시켜서 형질전환된 식물체를 선택하고, OsACP1 유전자의 발현량을 RNA BLOT 방법으로 확인한 후, 다음 세대에서 순종 식물체를 얻었다. 상기 T1 및 T2 식물체의 OsACP1 유전자의 발현량을 PCR, 노던 블럿 및 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 야생형(wild-type)에 비하여 형질전환된 애기장대 식물체에 서 OsACP1 유전자의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 4의 A, 도 4의 B 및 도 4의 C).

또한, 탈인산화효소 활성을 측정하기 위하여, 애기장대의 야생형 및 상기 형질전환된 애기장대로부터 단백질을 분리하여 100mM 아세트산 나트륨(sodium acetate, pH 5.6)을 처리하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 2N NaOH를 가하여 반응을 멈춘 다음, 7.5mM p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)로부터 니트로페놀(nitrophenol)이 방출되는 정도를 410㎚에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 정량하였다. 그 결과, 야생형에 비해 형질전환된 애기장대에서 탈인산화효소의 활성도가 높게 나타났다 (도 4의 D).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 탈인산화효소를 코딩하는 신규 유전자(OsACP1) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 인산 결핍시 야생종보다 효율적으로 영양결핍에서 오는 스트레스를 극복할 수 있고, 식물의 인산 흡수 능력을 향상시켜 농가의 비료 양에 따른 농업 비용 감소는 물론, 환경오염 방지와 작물의 생산량 및 생산의 질을 향상시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 벼(Oryza sp.) 유래 탈인산화효소를 코딩하는 유전자 (OsACP1).
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탈인산화효소 OsACP1.
제1항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제3항의 재조합벡터로 형질전환된 미생물.
제1항의 유전자 또는 제3항의 재조합벡터로 형질전환된 애기장대(Arabidopsis thaliana).
삭제
제4항의 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 및 탈인산화효소 OsACP1을 회수하는 단계를 포함하는 탈인산화효소 OsACP1의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 곤충세포는 sf9(Gibco) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.