ES2347019T3 - Microorganismos como portadores de secuencias de nucleotidos que codifican antigenos y toxinas proteicas, procedimiento de preparacion y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un microorganismo como portador de secuencias de nucleótidos para antígenos y toxinas proteicas que comprende los siguientes componentes: (I) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada; y (II) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica; y (III) a) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o que codifica al menos una secuencia señal que permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o b) opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado; y (IV) al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más de los componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular; donde cualquiera de los componentes (I) a (IV) puede estar presente una vez o varias veces y si un componente de los componentes (I) a (IV) está presente varias veces puede ser independientemente idéntico o diferente; y donde el componente (I) y el componente (II) no son idénticos, esto es el componente (I) no codifica al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica.

Description

Microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos que codifican antígenos y toxinas proteicas, procedimiento de preparación y sus usos.

Campo técnico

La invención se refiere a microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos heterogéneas que codifican antígenos y toxinas proteicas, a un procedimiento para su fabricación así como a los correspondientes plásmidos o vectores de expresión. Estos microorganismos se pueden utilizar como medicamentos, en particular como vacunas para tumores para el tratamiento de diferentes tumores.

Técnica anterior

La inmunoterapia del cáncer representa una opción prometedora del tratamiento tumoral. Una multiplicidad de pruebas clínicas que utilizan diferentes enfoques se concentran en su eficacia en los pacientes. En principio, se establece una distinción entre la inmunoterapia pasiva y activa.

La inmunoterapia activa apunta a la inducción de una respuesta inmunitaria específica de un tumor relacionada con una vacuna. Esta última se está poniendo a prueba clínicamente en la actualidad utilizando varios enfoques diferentes. Por ejemplo existen las denominadas vacunas con células completas, cuya materia prima son células tumorales que o bien se obtienen directamente del paciente (autólogas) o derivadas de líneas celulares apropiadas (heterólogas). Estas células normalmente son desactivadas después, manipuladas diferencialmente y re(aplicadas) al paciente.

En contraste, las vacunas de antígeno específico contienen uno (o más) antígenos específicos de tumores, porciones del antígeno o el ADN que codifica el antígeno específico como también las vacunas denominadas anti-idiotipo. Normalmente estas vacunas no son aisladas, si no inyectadas combinadas con un portador apropiado. Por consiguiente, por una parte se utilizan diferentes adyuvantes clásicos, pero también combinaciones con inmunoestimuladores biológicos tales como las citoquinas.

Para la inmunoestimulación, se están aplicando enfoques, que contienen antígenos asociados con inmunoestimuladores, tales como la toxina del tétanos. Además, existen intentos de aplicar antígenos combinados con células dendríticas. Y finalmente existen varios intentos con vacunas vivas recombinantes con portadores virales o bacterianos.

Se han utilizado proteínas de fusión de toxinas bacterianas, tales como la toxina del tétanos, la toxina shiga, la toxina letal o la toxina del cólera, como coadyuvantes con un antígeno como vacunas especialmente contra infecciones durante bastante tiempo (Freytag y Clements, 1999). Adicionalmente, también se utilizan toxinas nativas, a menudo combinadas con una molécula específica de una célula diana, tal como una molécula de la superficie celular de células tumorales, con el fin de destruir células diana.

En esto, las proteínas de fusión con la toxina nativa, que generalmente comprenden una unidad enzimática y un dominio de unión a la proteína, desarrollan su efecto óptimo en su uso como coadyuvantes (Freytag y Clements, 1999). Por medio de estas vacunas se obtiene una respuesta inmunitaria satisfactoria incluso después de la inmunización mucosal y particularmente después de la oral. El problema de estas proteínas de fusión es que las toxinas nativas son muy tóxicas y por lo tanto no pueden ser establecidas en seres humanos (Holmgren et al., 2005).

Una línea completa de investigación esta por lo tanto ocupada con la destoxificación de toxinas que al mismo tiempo conservan el efecto coadyuvante. No obstante, puesto que en la mayoría de los casos el efecto coadyuvante coincide con la actividad enzimática, que es responsable del efecto tóxico (Lycke et al., 1992), la destoxificación no se puede realizar de una manera directa, ni siquiera cuando parece que sea posible para algunas toxinas que no pierdan su actividad enzimática, actividad coadyuvante (Hormozi et al., 1999; Lycke et al., 1992).

En el caso de la toxina del cólera (CT) se han llevado a cabo numerosos intentos de destoxificación (Agren et al., 1999; Byun et al., 2001; Eriksson et al., 2004; Kweon et al., 2002; Sanchez et al., 2002), para lo cual, no obstante, prevalece el uso de coadyuvantes mucosales (Freytag y Clements). Por lo tanto, por encima de todo, una inducción eficaz de una respuesta de anticuerpos (principalmente de IgA mucosal), que reciben una ayuda creciente de células T restringidas al MHC de clase II relacionado con toxinas, es el principal pre-requisito para un coadyuvante mucosal para una vacuna que consiste en un antígeno proteico y una toxina fusionada o aplicada simultáneamente (Freytag y Clements).

En cuanto a la toxina del cólera, especialmente su subunidad B (CtxB) se somete a ensayo como coadyuvante puesto que es responsable de la unión al receptor GM-1 y no muestra efectos tóxicos cuando se aísla (Holmgren et al.). Las proteínas que se fusionan con CtxB se caracterizan por una inducción primaria de las denominadas respuestas inmunitarias Th2. Estas son respuestas de las células T, que están caracterizadas principalmente por las citoquinas, tales como IL-4 o IL-6, y que principalmente ocasionan la inducción de los anticuerpos, pero que no inician en absoluto o a lo sumo inician restringidamente una respuesta inmunitaria celular, concretamente de las células T citotóxicas (CTL) (Holmgren et al.).

Además CtxB como coadyuvante mucosal induce una tolerancia generalizada al antígeno proteico. La tolerancia generalizada describe el agotamiento o inactivación de los linfocitos específicos del antígeno, en particular de las células T o las células B. Esta clase de enfoque no es aplicable por lo tanto a la inducción de una respuesta inmunitaria generalizada (Holmgren et al.).

Al contrario que la aplicación mucosal, la aplicación intraperitoneal o subcutánea de una proteína de fusión toxina-antígeno puede inducir respuestas generalizadas así como citotóxicas bajas. Por supuesto esto se ha utilizado para la vacunación de tumores en sistemas modelo (remitirse p. ej. a (Becerra et al., 2003)). Sin embargo semejante respuesta también es obtenida con el propio antígeno purificado y depende principalmente del coadyuvante utilizado. Aparte del hecho de que las respuestas de los CTL medidas en el modelo son bastante bajas, no existe evidencia de que la protección sea dependiente de estos efectos. Por otra parte, el antígeno no se aplicó oralmente, si no solamente por medio de una inyección directa (s.c., i.d., i.m., i.p.) del antígeno.

Las proteínas antigénicas fusionadas a una toxina destoxificada son generalmente ineficaces si se aplican en forma de una vacuna para un tumor. Las razones principales son, si se encuentran presentes, solamente la baja inducción de una respuesta inmunitaria generalizada o incluso, en el caso de CtxB, la inducción de tolerancia generalizada así como la inducción de anticuerpos restringidos mucosalmente y de las respuestas inmunitarias de tipo Th2.

McSorley et al., por ejemplo, demostraron que la inmunización nasal con una proteína de fusión CtxB (que para una vacuna contra un tumor representa el modo preferido de inducir una respuesta generalizada) preferiblemente tolera y por lo tanto inactiva las células Th1, mientras no influyen en las células Th2 (McSorley et al., 1998). Las respuestas Th2 están caracterizadas por las células T coadyuvantes que producen predominantemente IL-4 o IL-6. Estas citoquinas son particularmente responsables del inicio de la producción de anticuerpos por las células B, que proporcionan protección en el caso de la mayor parte de las vacunas convencionales. Por el contrario, las células T Th1 secretan principalmente IL-2 e IFN-gamma, citoquinas por lo tanto, que juegan un papel en la respuesta inmunitaria celular. Dependiendo del objetivo de la estrategia de inmunización es de crucial importancia que se inicie una respuesta inmunitaria Th2 dominada por anticuerpos (denominada predisposición Th2) o Th1 dominada por células (denominada predisposición Th1).

En contraste, la inducción generalizada de una respuesta inmunitaria celular dominada por Th1 con células T coadyuvantes productoras de IFN-gamma y la inducción de las células T citotóxicas (CTL) es indispensable para la inmunoterapia tumoral.

La técnica anterior muestra que las toxinas pueden funcionar como coadyuvantes. Especialmente la toxina del cólera (CT, por sus siglas en Inglés) muestra un fuerte efecto coadyuvante. Sin embargo, este efecto es significativamente atenuado tan pronto como la toxina es destoxificada. Con respecto a su subunidad CtxB, la aplicación oral induce incluso tolerancia generalizada. Este problema puede ser parcialmente evitado mediante aplicación nasal. No obstante, si se aplica la administración nasal, surgen otros problemas, en particular aquellos asociados con la subunidad CtxB concerniente a la expresión del receptor GM-1 en el cerebro (van Ginkel et al., 2000), que se reflejan en un riesgo creciente de efectos secundarios graves concretos (Mutsch et al., 2004).

Para superar estos problemas, puede ser posible generar vacunas vivas recombinantes que expresen simultáneamente toxinas y antígenos (heterólogos). Esta opción ya ha sido perseguida con respecto a vacunas para infecciones, esto es vacunas que están dirigidas contra un patógeno específico, por ejemplo el patógeno de la tuberculosis, y están destinadas a inducir inmunidad contra ese patógeno.

En el desarrollo de tales vacunas para infecciones, ya se han generado toxinas recombinantes fusionadas con antígenos (heterólogos) apropiados, utilizando varias cepas bacterianas recombinantes que se administran oralmente, en forma de una vacuna viva o inactivada. En la mayoría de los casos, las cepas generadas solamente expresaron una toxina recombinante. Por lo tanto, estos enfoques están dirigidos principalmente a inmunizar solamente contra la propia toxina (inducción de una respuesta de anticuerpos) y, por consiguiente, la cepa que expresa la toxina (patógeno). Estas clases de vacunas no son adecuadas para su uso como vacunas para tumores potenciales en la terapia tumoral y, no sorprendentemente, las correspondientes pruebas no hacen mención de ninguna de tales posibles aplicaciones (Reveneau et al., 2002) (Vertiev et al., 2001) (Freytag y Clements, 1999; Jackson et al., 1996).

Con respecto a tales vacunas para infecciones, en la inducción de una respuesta de anticuerpos la toxina no funciona como coadyuvante, es la inducción de una respuesta inmunitaria de anticuerpos mucosales la que prevalece. Estas pruebas de vacunas contra infecciones incluyen una respuesta inmunitaria generalizada nula o solo muy débil. Al contrario que las vacunas contra tumores, tales vacunas no persiguen una inducción de una respuestas inmunitaria celular, especialmente de células T citotóxicas. Los patógenos bacterianos que expresan las toxinas normalmente muestran un patrón vivo extracelular y por lo tanto no contribuyen a la activación de los CTL, esto es la protección conferida por tales vacunas contra infecciones es independiente de los CTL.

Las siguientes cepas bacterianas han sido utilizadas en las pruebas para vacunas contra infecciones mencionadas: Lactobacilli recombinantes (Reveneau et al., 2002), Listeria (Vertiev et al., 2001), Bacillus anthracis (Mendelson et al., 2005; Mesnage et al., 1999), Shigellae (Anderson et al., 2000; Tzschaschel et al., 1996b), E. coli (Walker et al., 1992), Vibrio (Butterton et al., 1995; Chen et al., 1998; Thungapathra et al., 1999) y Salmonella (Jackson et al., 1996).

Además, se intentó intensificar las respuestas inmunitarias mucosales mediante presentación sobre la superficie (Konieczny et al., 2000) o secreción de la toxina como antígeno heterólogo (Salmonella, Shigellae: (Garmory et al., 2003; Orr et al., 1999; Su et al., 1992; Tzschaschel et al., 1996a; Tzschaschel et al., 1996b), Yersinia: (Sory y Cornelis, 1990), Vibrio (Ryan et al., 1997a), E. coli: (Zhu et al., 2006)). Sin embargo, en estos casos adicionales las propias toxinas representan los antígenos a los cuales está dirigida la respuesta inmunitaria.

De este modo, se debe observar que las toxinas no funcionan como adyuvantes ni los estudios descriptivos pretendían expresar las toxinas como proteínas de fusión con un antígeno (heterólogo) separado adicional. Por otra parte, las proteínas de fusión con CT o CtxB no fueron generadas con estos sistemas ni fueron sugeridas.

Por consiguiente, las proteínas de fusión mencionadas en los documentos citados antes son proteínas de fusión de una señal de secreción peptídica, tal como HlyA, y una proteína toxina, pero no proteínas de fusión, que consisten en una toxina y un antígeno (heterólogo).

El principal objetivo de estos estudios fue simplemente obtener una respuesta inmunitaria mucosal óptima (Tzschaschel et al., 1996a). No se perseguía la inducción de una respuesta inmunitaria generalizada. Incluso si es que se medía, los análisis de las respuestas inmunitarias generalizadas estaban restringidos a los anticuerpos (concretamente IgA generalizada) solamente, puesto que la protección en estas clases de modelos está mediada principalmente por los anticuerpos (comparar p. ej. [31]). La inducción de una respuesta inmunitaria celular generalizada, en particular una respuesta de las células T citotóxicas, no ha sido descrita. La fusión con una señal de secreción se utilizó principalmente con el fin de incrementar la solubilidad de las toxinas y aumentar su estabilidad, respectivamente, puesto que una expresión fuerte, meramente citoplasmática a menudo da como resultado la formación de productos agregados insolubles (Gentschev et al., 2002a).

Con respecto a esto, algunos autores observan que las proteínas de fusión con una señal de secreción ocasionan una rápida degradación citoplasmática (Tzschaschel et al., 1996a), mientras otros observan una estabilización (Orr et al., 1999). Aquí la técnica anterior, es contradictoria. Hasta ahora, los experimentos previos con toxinas secretadas (toxina + señal de secreción) están destinados por encima de todo a aumentar la estabilidad, que obviamente no se logró en todos los casos.

Una razón se encuentra ciertamente en la intensidad de la expresión variable y la estabilidad del plásmido. Tzschaschel et al. describen, que el sistema plasmídico utilizado, es altamente inestable y sobre todo, sin selección, se encuentra simplemente en unas pocas bacterias. Como posible solución los autores utilizan la integración cromosómica a través de un mini-transposón (Tzschaschel et al., 1996a; Tzschaschel et al., 1996b).

No obstante, semejante sistema posee numerosas desventajas. Por un lado el punto de integración no está definido, lo que puede conducir a una alteración no deseada del fenotipo de la célula anfitriona (p. ej. aumento/disminución de la expresión de genes colindantes). Por otra parte el nivel de expresión esperado utilizando una única copia genómica solamente es bajo, lo que tiene un efecto negativo sobre la inmunogenicidad. Después de todo, la integración del transposón cromosómico es relativamente inestable, puesto que conduce frecuentemente a escisiones espontáneas a los lados de los elementos repetitivos.

Como se ha mencionado antes, la técnica anterior es contradictoria con respecto a la estabilidad de una toxina heteróloga secretada.

Garmory et al. suponen incluso que la secreción de un antígeno heterólogo no tiene una ventaja especial con respecto a la inmunogenicidad (Garmory et al., 2002; Roland et al., 2005). En otros casos se ha observado efectivamente el aumento de la respuesta de anticuerpos generalizada a una toxina secretada después de la administración intravenosa, pero no después de la aplicación oral. Por el contrario, la aplicación oral es incluso puesta en cuestión indirectamente (Roland et al., 2005).

Finalmente, los estudios con una cepa gram-positiva (Lactobacillus plantarum) que produce la toxina del tétanos no muestran una diferencia significativa en la inducción de una respuesta de anticuerpos generalizada en comparación con las cepas que secretan la toxina, la presentan unida a su membrana o contienen la toxina citoplásmicamente (Reveneau et al., 2002).

Las respuestas inmunitarias celulares generalizadas, en particular las respuestas de las células T citotóxicas, y la protección resultante, no se estudiaron ni se describieron.

La técnica anterior citada más arriba de las vacunas contra infecciones basadas en toxinas de este modo no puede establecer si la secreción de una toxina utilizada como coadyuvante representa una ventaja, con respecto a la inducción de una respuesta inmunitaria generalizada (celular). Todo lo contrario, los estudios citados más arriba apuntan más bien el problema de la estabilidad y mencionan la pérdida de las ventajas de una toxina heteróloga secretada. Las proteínas de fusión, que consisten en la señal de secreción, la toxina y el antígeno heterólogo, no son descritas o sugeridas en absoluto.

En los pasajes anteriores se presentó la técnica anterior, que describe portadores bacterianos que expresan toxinas heterólogamente y pueden ser utilizados como vacunas contra infecciones. En los ejemplos citados los autores de la presente invención llevaron a cabo principalmente modificaciones referentes a la expresión o estabilidad de las toxinas y su solubilidad, por ejemplo la inserción de un promotor fuerte de la expresión o la fusión de una toxina a una señal de secreción.

Otros autores también han estudiado fusiones genéticas a antígenos heterólogos en vacunas vivas. En estos casos la toxina se utilizó principalmente como coadyuvante. En algunos casos (p. ej. (Brossier et al., 2000)) el antígeno heterólogo funcionó como coadyuvante y la toxina como verdadero antígeno.

Sin embargo, es importante observar, que en los casos mencionados, la expresión del constructo de fusión génica de toxina-antígeno tuvo lugar exclusivamente citoplásmicamente o periplásmicamente. El constructo toxina-antígeno ni se fusionó a una señal de secreción adicional (lo que hubiera conducido a su secreción completa) ni fue secretado directamente.

En estos constructos de fusión génica de toxina-antígeno, se utilizaron cepas de E. coli (Clemens et al., 2004), Bacillus anthracis (Brossier et al., 2000), Shigella (Koprowski et al., 2000; Ranallo et al., 2005; Zheng et al., 2005) y Vibrio (Silva et al., 2003) recombinantes. Para Salmonella (resumido en (Garmory et al., 2002)), también se han descrito fusiones de variantes de CT con antígenos (Hajishengallis et al., 1996; Huang et al., 2000) u otras toxinas con antígenos (Barry et al., 1996; Cardenas y Clements, 1993; Chabalgoity et al., 1997; Chabalgoity et al., 1996; Chabalgoity et al., 2000; Chabalgoity et al., 1995; Chacon et al., 1996; Jagusztyn-Krynicka et al., 1993; Khan et al., 1994a; Khan et al., 1994b; Lee et al., 2000; Pogonka et al., 2003; Schodel et al., 1990; Smerdou et al., 1996; Ward et al., 1999; Wu et al., 2000).

En la mayoría de estos casos el foco principal estuvo en la inducción de una respuesta inmunitaria (de anticuerpos) mucosal y para la inducción de una respuestas inmunitaria generalizada, se eligió únicamente una aplicación subcutánea, pero no oral [36].

Ciertos trabajos con Salmonella como cepa de soporte están limitados a una mera caracterización de la cepa (Gomez-Duarte et al., 1995; Jagusztyn-Krynicka et al., 1993), otros analizan solamente la respuesta y/o protección de anticuerpos mucosal y/o generalizada (Barry et al., 1996; Cardenas y Clements, 1993; Dunstan et al., 2003; Hajishengallis et al., 1996; Harokopakis et al., 1997; Khan et al., 1994a; Khan et al., 1994b; Pogonka et al., 2003; Smerdou et al., 1996; Somner et al., 1999). En todos estos casos, en los que se utilizó a propósito una fusión entre el antígeno y la toxina del tétanos y que son utilizados exclusivamente como vacunas contra infecciones, no se han estudiado las respuestas inmunitarias celulares generalizadas, concretamente las respuestas de las Células T citotóxicas.

Por lo tanto, desde un punto de vista inmunológico, no se pueden sacar conclusiones a partir de estos estudios sobre un uso potencial como vacunas contra tumores, puesto que sus enfoques se fijaban en los efectos mediados por los anticuerpos como vacunas contra infecciones.

Las investigaciones que incluyen un análisis de isotipos de la respuesta inmunitaria estudiada parecen ser más relevantes. De hecho, las respuestas inmunitarias celulares no son medidas directamente en estos casos, sino que el perfil de isotipo de la respuesta de anticuerpos permite una conclusión sobre la predisposición Th1/Th2 de la respuesta inmunitaria. Los isotipos de anticuerpos como IgG1 están asociados a respuestas de tipo Th2 y los isotipos como IgG2a están asociados a respuestas Th1. Como ya se ha mencionado, las respuestas Th1 son respuestas inmunitarias dominadas por células, mientras las respuestas Th2 representan principalmente respuestas dirigidas por anticuerpos humo-
rales. Todavía, esos estudios no describen vacunas para tumores ni sugieren ningún uso como agente anti-tumoral.

Una vacuna para infecciones basada en Salmonella como portador, que expresa una proteína de fusión antigénica con toxina del tétanos ha sido realizada en perros. Las respuestas con bajo contenido de anticuerpos que fueron inducidas en los perros, muestran una predisposición Th1, con respecto al perfil de anticuerpos, por lo tanto, una respuesta que se corresponde más bien con una respuesta inmunitaria de tipo celular (Chabalgoity et al., 2000). La verdad es que, la inmunología del perro apenas se ha investigado, y por lo tanto no está claro hasta qué punto el perfil de anticuerpos del perro puede proporcionar información acerca de la predisposición Th1.

Los estudios en ratones, realizados por el mismo grupo, utilizando constructos comparables, mostraron no obstante un perfil de anticuerpo con el mismo nivel para IgG1 que para IgG2a, lo que indicaría una respuesta Th1/Th2 mixta.

De manera interesante, una inmunidad existente contra la toxina del tétanos, como la que se encuentra en la mayor parte de los seres humanos debida a inmunizaciones previas, ocasiona otra inducción relativamente fuerte de IgG1 mientras IgG2a apenas es inducida. Esto indica claramente una clara predisposición Th2 (Chabalgoity et al., 1995). Por esta razón, una vacuna viva basada en la toxina del tétanos como vacuna contra tumores es bastante perjudicial para su uso en seres humanos. Por ello cabe esperar que sea inducida una fuerte respuesta dominada por anticuerpos Th2 en la mayoría de estos pacientes, que muestran una respuesta específica para la toxina del tétanos.

Solamente unos pocos estudios también analizan la respuesta inmunitaria celular y comparan constructos genéticos con y sin fusiones con toxinas. En un caso, por ejemplo, se ha comparado una fusión de un antígeno con y sin toxina del tétanos en Salmonella (Lee et al.). Allí, el constructo de fusión con el antígeno de la toxina del tétanos aumentaba principalmente el nivel de anticuerpos total, mientras el perfil Th1/Th2 apenas era alterado. Incluso la secreción por las células T CD4+ específicas del antígeno de citoquinas Th1 típicas, tales como el IFN-gamma y la IL-2, respectivamente, solamente mostraron una débil divergencia. En un estudio anterior por el mismo grupo, también se han medido los niveles de IFN-gamma. Sin embargo no se ha establecido comparación con los constructos sin toxina del tétanos (Chabalgoity et al.). Otros estudios con diferentes portadores bacterianos gram-negativos, como Shigella (Koprowski et al., Ranallo et al., Zheng et al.) o Vibrio (Campos et al., Ryan et al.), no analizaron tampoco los isotipos y las respuestas inmunitarias celulares, respectivamente.

En resumen, se puede establecer, que los estudios mencionados se centran claramente en la inducción de una respuesta inmunitaria humoral conducida por anticuerpos. En efecto, se utilizan constructos de toxina-antígeno genéticos, pero estos no se suministran con una señal de secreción ni son secretados directamente. De ningún modo, sin embargo, se analizaron las respuestas inmunitarias celulares generalizadas, en particular las respuestas de las células T citotóxicas. Lo que es más, tales respuestas de las células T citotóxicas celulares no pueden ser concluidas a partir de la respuesta de anticuerpos humorales y no pueden ser detectadas si la respuesta de anticuerpos es compuesta - Th1/Th2.

No obstante, son exactamente estas respuestas inmunitarias de las células T citotóxicas celulares las que son cruciales para su uso en la terapia de vacunación contra tumores.

Por consiguiente, en términos de fusiones toxina-antígeno que están restringidas a vacunas contra infecciones mucosales únicamente, el estado de la técnica no permite ninguna afirmación sobre el posible uso de cualquiera de tales constructos como vacunas contra tumores.

Como ya se ha mencionado, la expresión de los constructos de fusión genéticos se realiza sin ayuda de un sistema de secreción. Las toxinas y los constructos de antígeno-toxina, respectivamente, se localizan normalmente citoplásmicamente así como periplásmicamente, esto es, entre las dos membranas. Con el fin de inducir una respuesta inmunitaria celular eficaz la toxina debe estar libremente accesible para la célula presentadora de antígenos (CPA). Normalmente, la toxina nativa se produce en el periplasma de la bacteria gram-negativa. Esto es suficiente para simples respuestas inmunitarias mucosales, debido a que las toxinas periplásmicas pueden escapar del periplasma en el colon y por consiguiente son accesibles, también (Hunt y Hardy, 1991). Esto no cuenta, sin embargo, si el portador elige como diana células presentadoras de antígenos de fuera del colon, tales como p. ej. Placas de Peyer u órganos linfáticos como los nódulos linfáticos o el bazo.

En principio, dos factores son cruciales para la eficacia de una vacuna contra tumores: la inducción de una respuestas inmunitaria celular del tipo Th1 y la participación de componentes del sistema inmunitario innato, tales como las células NK, las células NKT y las células T gamma-delta, que juegan un importante papel en la eficacia de la terapia contra los tumores (Dunn et al., 2004).

La importancia de estos componentes de los sistemas inmunitarios innatos se encuentra en múltiples niveles. Las células T NK y gamma-delta activadas apropiadamente son capaces de producir localmente grandes cantidades de IFN-gamma. Este interferón, que también es producido por células T polarizadas Th1 específicas, tiene múltiples funciones, relevantes en la terapia tumoral. Una de estas funciones centrales es la inhibición de la angiogénesis, que interrumpe el suministro de oxígeno y nutrientes al tumor y de facto extenúa el tumor. Además, las células NK poseen receptores, que reconocen las moléculas del MHC de clase I. Si estas moléculas están presentes en una célula, las células NK están inhibidas.

Como para una vacuna, que induce a las células T citotóxicas específicas, las células tumorales pueden ser eliminadas por estos CTL. Si la célula tumoral pierde su capacidad para expresar las moléculas del MHC de clase I, lo que ocurre bastante frecuentemente en tumores, las células T citotóxicas específicas son ineficaces. Por consiguiente, en este caso, la inhibición de las células NK se detiene, y éstas son capaces de eliminar las células tumorales directamente.

Por consiguiente, sería ideal que una vacuna contra tumores indujera ambos componentes eficazmente. Existen datos contradictorios concernientes a la predisposición a Th1-Th2 de un coadyuvante con toxina fusionada. Como se ha comentado antes, los constructos de fusión de toxina-antígeno aplicados de una manera aislada inducen obviamente una fuerte respuesta inmunitaria polarizada de Th2. Algunos autores todavía describen una baja predisposición a Th2 para los portadores vivos; otros autores ven una ligera predisposición a Th1.

No obstante, estos datos de nuevo se basan exclusivamente en constructos no secretados. La inducción de inmunidad innata por medio de tales clases de vacunas contra infecciones nunca se ha comparado ni contemplado.

Como ya se ha mencionado, la razón principal es que las vacunas existentes son vacunas contra infecciones mucosales, no vacunas contra tumores. Por lo tanto, la inducción de respuestas inmunitarias Th1, respuestas inmunitarias CTL y respuestas del sistema inmunitario innato no se encontraba en el enfoque. Por el contrario, con respecto a las vacunas contra tumores, la inducción de estas respuestas inmunitarias es indispensable.

De manera interesante, en la biología celular comúnmente se utilizan toxinas nativas como inhibidores de las rutas de señalización. Así que entre otros se ha demostrado, que la toxina pertussis nativa, pero no la toxina del cólera, es capaz de inhibir un patrón de apoptosis concreto de las células NK (Ramirez et al., 1994). Un estudio de investigación diferente fue capaz de demostrar que la toxina del cólera, pero no su subunidad B, bloquea las funciones de las células NK específicas (Poggi et al., 1996). La toxina pertussis nativa se utiliza para inhibir la quimiotaxis de los linfocitos (Spangrude et al., 1985). Incluso si estos estudios no trataran sobre la vacunación contra tumores, un experto en la técnica concluiría, que el uso de toxinas como vacunas contra tumores sería nocivo, puesto que la respuesta del sistema inmunitario innato, crucial para la terapia tumoral, es inhibida en lugar de inducida.

Otros estudios de investigación fueron capaces de demostrar que las toxinas como la toxina pertussis nativa (pero no la toxina pertussis inactiva) inducen eficazmente los componentes del sistema inmunitario innato. Con respecto a la inmunoterapia contra tumores, esto significaría que, si fuera necesario, se podría necesitar emplear toxinas nativas. Sin embargo, debido a razones de toxicidad esta clase de administración es inviable. Adicionalmente, semejante inducción conduciría inevitablemente a una respuesta inmunitaria secundaria dirigida por Th2, que a su vez sería deletérea para la terapia tumoral (Boyd et al., 2005). Por consiguiente, respecto a la inducción de una respuesta inmunitaria innata, la técnica anterior no describe ni contempla la vacunación contra tumores. Por el contrario, el análisis crítico de la literatura incluso milita contra el uso de toxinas en la terapia tumoral.

Sin embargo, es interesante un análisis del efecto sinérgico de las toxinas o sus subunidades con otros estimulantes, tales como oligonucleótidos de ADN inmuno-estimuladores con motivos hipometilados CpG (CpG ODN) (Holmgren et al., 2005) o liposacáridos (LPS). En el caso de los LPS fundamentalmente la inducción de los monocitos parece estar incrementada principalmente por medio de la subunidad B de las toxinas, a la vez que es inhibida por la toxina en su totalidad (holotoxina) (Hajishengallis et al., 2004). No obstante, estos estudios cuentan exclusivamente con el uso de constructos de fusión de toxina purificada-antígeno, a los cuales se añaden sustancias como LPS o CpG como coadyuvantes. Además, el análisis solamente se lleva a cabo en macrófagos, que inducen una respuesta inmunitaria adaptativa, pero no atacan a los tumores directamente. Por consiguiente, estos estudios no tienen trascendencia con respecto a la inducción de componentes del sistema inmunitario innato, en particular células NK, que pueden atacar a los tumores directamente.

Otros estudio, no obstante, demuestran que las células NK pueden ser activadas y atraídas quimiotácticamente por toxinas como la Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (Muhlen et al., 2004). Dependiendo del sistema experimental, también se pueden inducir respuestas Th1, aunque de ese modo se produce normalmente una supresión de las respuestas de las células NK y Th1 (Michalkiewicz et al., 1999). Sin embargo, estos análisis apuntan fundamentalmente al análisis de la hepatotoxicidad de la Enterotoxina A y no hacen referencia a la vacunación de tumores. De manera interesante, los efectos dependen mucho de la dosis, y solamente un ligero cambio de dosis puede invertir los efectos. Sin embargo, los autores no pudieron revelar qué respuesta se produce eficazmente in vivo. Como consecuencia, los datos no proporcionan una predicción de qué efectos se pueden producir si se utiliza como coadyuvante una toxina o incluso una toxina destoxificada.

En general, la respuesta inmunitaria depende fuertemente del sistema concreto aplicado. En la mayoría de los casos, una vacuna anti-infección mucosal pretende conseguir la manipulación local del sistema inmunitario en la mucosa, con el fin de inducir una respuesta inmunitaria mucosal eficaz (Lycke, 2005). Sin embargo, estos estudios no incluyen el desarrollo de una vacuna contra tumores. Además, esos estudios carecen de información sobre la inducción de respuestas inmunitarias celulares generalizadas, particularmente respuestas de células T citotóxicas, que son esenciales para la vacunación contra tumores.

Ya se ha demostrado, que la secreción de un antígeno heterólogo confiere ventajas para una respuesta inmunitaria generalizada (Hess et al., 1996). Sin embargo, los antígenos secretados descritos no eran constructos toxina-antígeno secretados; las toxinas o sus subunidades no se utilizaron. Las respuestas inmunitarias obtenibles de ese modo en un modelo de tumor transgénico también estaban muy limitadas (Gentschev et al., 2005). En efecto, en este caso pudieron ser inducidas respuestas de anticuerpos y células T citotóxicas débiles, que protegieron parcialmente del progreso del tumor. Sin embargo, no solamente las propias respuestas inmunitarias, si no la propia protección estuvieron limitadas. Del mismo modo, estos estudios de vacunación contra tumores carecen de una comparación con los constructos no secretados. Además, los estudios comparativos no se llevaron a cabo en el contexto de la vacunación contra tumores (Hess et al., 1996) y contrastan con estudios adicionales, que no observan ninguna ventaja con respecto a la secreción (Garmory et al., 2002; Roland et al., 2005).

En resumen y como se ha mencionado antes, la técnica anterior es muy contradictoria con respecto a la secreción y, en general, no proporciona ninguna pista sobre las potenciales ventajas de los constructos toxina-antígeno secretados en la terapia tumoral. Por el contrario, el análisis crítico de las publicaciones existentes más bien discrepa con semejante clase de uso.

Toxinas Bacterianas (Todar, 2002): A nivel químico, existen dos tipos de toxinas bacterianas, lipopolisacáridos, que están asociados con las paredes celulares de las bacterias gram-negativas, y proteínas, que son liberadas de las células bacterianas y pueden actuar en lugares de tejidos remotos con respecto al crecimiento bacteriano. Las toxinas lipopolisacáridas (LPS) asociadas a las células son referidas como endotoxinas y las toxinas difusibles extracelulares son referidas como exotoxinas.

Las exotoxinas son típicamente proteínas solubles secretadas por bacterias vivas durante el crecimiento exponencial pero en algunos casos son liberadas por la lisis de la célula bacteriana. La producción de la toxina es generalmente específica para una especie bacteriana concreta que produce la enfermedad asociada con la toxina (p. ej. solamente Clostridium tetani produce la toxina del tétanos; solamente Corynebacterium diphtheriae produce la toxina de la difteria). Las bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas producen toxinas proteicas solubles.

En general existen tres clases de (exo-)toxinas proteicas: (i) toxina de tipo I (superantígenos), que se unen a la superficie de la célula anfitriona y modulan la respuesta inmunitaria pero no son translocadas al interior de la célula, (ii) toxinas de tipo II (toxinas formadoras de poros), que actúan sobre la membrana de la célula anfitriona y hacen que la célula tenga escapes y muera, y (iii) toxinas de tipo III (toxinas A-B), que se unen a la célula anfitriona por medio de un receptor específico, son translocadas al interior de la célula, se vuelvan activas allí y modifiquen las proteínas u otros componentes de la célula anfitriona.

Como se ha indicado antes, las toxinas de tipo III, que actúan intracelularmente con respecto a las células anfitrionas, consisten en dos componentes: un componente (subunidad A) es responsable de la actividad enzimática de la toxina; el otro componente (subunidad B) está relacionado con la unión a un receptor específico sobre la membrana de la célula anfitriona y la transferencia de la enzima a través de la membrana. El componente enzimático no es activo hasta que es liberado de la toxina nativa (A+B). Las subunidades A aisladas son enzimáticamente activas pero carecen de capacidad de unión y entrada en la célula. Las subunidades B aisladas se pueden unir a células diana (e incluso bloquear la unión de la toxina nativa), pero no son tóxicas.

Existen una variedad de formas en las que pueden ser sintetizadas y reordenadas las subunidades de las toxinas: A + B indica que la toxina es sintetizada y secretada en forma de dos subunidades de proteína separadas que interaccionan en la superficie de la célula diana; A-B o A-5B o AB5 indica que las subunidades A y B son sintetizadas por separado, pero asociadas por enlaces no covalentes durante la secreción y la unión a su diana; 5B o B5 indica que el dominio de unión de la proteína está compuesto por 5 subunidades idénticas. AB o A/B indica una toxina sintetizada en forma de un único polipéptido, dividido en dominios A y B, que pueden ser separados por escisión proteolítica. Son ejemplos de toxinas AB o A/B la Toxina de la Difteria, la Exotoxina A, la toxina de Botulinum y la Toxina del Tétanos. Son ejemplo de toxinas A-5B o AB5 la Toxina del Cólera y la Toxina Shiga, mientras la Toxina LF del Ántrax y la Toxina EF del Ántrax son ejemplos de toxinas A-B.

Los documentos de la técnica anterior relevantes adicionales comprenden los siguientes:

Michl et al. describen el uso de bacterias y toxinas bacterianas como agentes terapéuticos para tumores sólidos. Se describen los constructos de fusión de Toxina-Antígeno así como el redireccionamiento bacteriano de semejante constructo. Se estudia el uso de la toxina de la difteria (TD), la exotoxina A de pseudomonas (EP) y la enterotoxina de Clostridium perfringens (ECP). Sin embargo, los autores no mencionan el uso de la toxina del cólera ni demuestran o hacen que resulte obvia la secreción de constructos de fusión de toxina-antígeno liberados por bacterias (Michl y Gress, 2004).

Lahiri proporciona una visión general acerca de las diferentes toxinas bacterianas y comenta sus múltiples usos. Aunque el autor menciona proteínas de fusión de toxina-antígeno guarda silencio acerca de la toxina del cólera y el redireccionamiento bacteriano de los constructos de fusión de toxina-antígeno secretados (Lahiri, 2000).

Lavelle et al. describen moléculas de agentes infecciosos como fármacos inmunomoduladores. Los autores también mencionan proteínas de fusión de toxina del cólera-antígeno, pero tales constructos solamente se aplican directamente como proteínas y no como medios para vacunas vivas modificadas genéticamente (Lavelle et al., 2004).

El documento WO 01/74383 está dirigido a inmunógenos mucosales de antígeno-enterotoxina quiméricos y también menciona el uso de las subunidades A2 y B de la toxina del cólera. Tales inmunógenos quiméricos, no obstante, comprenden siempre las subunidades A2 y B al mismo tiempo y están destinados al uso en la inmunización mucosal pero no en la terapia tumoral.

El documento WO 02/077249 describe cepas mutantes enterocolíticas de Yersinia no virulentas para la liberación de proteínas heterólogas en células diana mutadas específicas. También se menciona el uso de la subunidad A1 de la toxina del cólera pero el documento de patente guarda silencio acerca de la secreción y hace referencia solamente al tratamiento de infecciones y estados infecciosos.

El documento WO 2004/018630 describe fagos con ARN de doble hebra recombinantes que codifican una casete de expresión eucariótica de doble hebra. Aunque se menciona la subunidad A de la toxina del cólera, el documento no tiene mayor relevancia.

Holmgren et al. proporcionan una breve visión general sobre el campo de la inmunización mucosal y los coadyuvantes. Comentan, entre otros, los efectos de la toxina del cólera como coadyuvante mucosal pero no describen información sobre los sistemas de expresión genética o las vacunas vivas y también guardan silencio acerca de la terapia tumoral (Holmgren et al., 2003).

Holmgren y Czerkinsky también proporcionan una visión general sobre inmunidad mucosal y vacunas. Sin embargo, este artículo está restringido a anti-infecciosos solamente y no comenta ni hace que resulten obvios posibles usos en el campo de la terapia tumoral (Holmgren y Czerkinsky, 2005).

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Otra revisión de Freytag y Clements comenta los coadyuvantes mucosales para su aplicación en la inmunoterapia anti-infecciosa. Aunque se menciona la toxina del cólera como coadyuvante mucosal los autores guardan silencio acerca de los constructos de toxina-antígeno secretados y la terapia tumoral como posible campo de administración (Freytag y Clements, 2005).

Shaw y Starnbach describen el uso de toxinas bacterianas modificadas para liberar antígenos para vacunas. Sin embargo, el artículo no menciona la toxina del cólera y adicionalmente se limita a la aplicación directa de proteínas de fusión de toxina-antígeno para la vacunación (Shaw y Starnbach, 2003).

El documento WO 03/072789 está dirigido a microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos que codifican antígenos celulares utilizados para el tratamiento de tumores. Aunque el documento de patente menciona su secreción y uso en el campo de la terapia tumoral, guarda un silencio absoluto acerca de las toxinas bacterianas y las proteínas de fusión.

Gentschev, Dietrich y Goebel así como Gentschev et al. describen el redireccionamiento bacteriano y su uso en el desarrollo de vacunas contra tumores. No obstante, estos dos documentos no mencionan el uso de toxinas bacterianas y proteínas de fusión en la terapia tumoral (Gentschev et al., 2002a; Gentschev et al., 2002b).

El documento WO 98/23763 describe células de Vibrio cholerae que expresan las subunidades B y D de la hemolisina de E. coli junto con un polipéptido de fusión que incluye un antígeno heterólogo fusionado a hylA. Adicionalmente se describe una cepa de vacuna de Vibrio cholerae que expresa la subunidad B de la toxina del cólera y un polipéptido de fusión de una secuencia señal secretora, un antígeno heterólogo y la subunidad A2 de la toxina del cólera. Por último, se describe un polipéptido de fusión que incluye la subunidad B de la toxina del cólera fusionada a una porción antigénica de la subunidad de la toxina A o la toxina B de C. difficile. Sin embargo, la solicitud de patente no menciona el uso de una proteína de fusión de toxina proteica más un antígeno de toxina no proteica heterólogo en la terapia tumoral.

Dietrich y colaboradores comentan dos herramientas de liberación de vacunas - hemolisina A y listeriolisina -que se pueden utilizar para la inmunidad mediada por células. Sin embargo, no se menciona ninguna proteína de fusión de toxina proteica- antígeno heterólogo ni expresión simultánea (Dietrich et al., 2003).

Gentschev et al. describen el uso del sistema de secreción de alfa-hemolisina de Escherichia coli para la liberación de antígenos en la cepa para vacuna de Salmonella typhi Ty21 a. No obstante, los autores no mencionan el uso de toxinas bacterianas ni proteínas de fusión en la terapia tumoral (Gentschev et al., 2004).

El documento WO 02/47727 está dirigido a agentes terapéuticos que comprenden una toxina proteica. El documento solamente describe proteínas de fusión de CtxB y EtxB con antígeno viral. No se menciona la vacuna bacteriana ni la liberación de vacuna bacteriana.

Cheng-hua S y colaboradores describen una fusión génica de la subunidad B de la toxina del cólera y el epítopo PreS2 de VHB y la antigenicidad de la proteína de fusión en estudios de inmunización directa. Sin embargo, no se menciona la vacuna bacteriana ni la liberación de la vacuna bacteriana (Cheng-hua et al., 1995).

Sanchez et al. describen que el gen de la subunidad B de la toxina del cólera intensifica las respuestas citotóxicas de la inmunoglobulina A mucosal, tipo Th1 y CD8^{+} cuando se administra simultáneamente intradérmicamente con una vacuna de ADN (Sánchez et al., 2004). Sin embargo, en este enfoque los autores utilizan ADN como portador que actúa como un coadyuvante promotor de Th1 por sí solo. Además, las proteínas son producidas por células anfitrionas y no liberadas directamente o por medio de un portador bacteriano y por lo tanto están directamente disponibles para las células eucarióticas.

El documento WO 01/29233 está dirigido a composiciones inmunogénicas quiméricas y a ácidos nucleicos que las codifican. Sin embargo, no se menciona la vacuna bacteriana o la liberación de la vacuna bacteriana.

El documento WO 2007/044406 hace referencia a métodos para estimular una respuesta inmunitaria utilizando un sistema de liberación de antígeno bacteriano que está basado en SopE que porta una señal de secreción de tipo III. Sin embargo, la solicitud de patente no menciona el uso de toxinas bacterianas ni proteínas de fusión en la terapia tumoral.

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En resumen, se puede concluir a partir de la técnica anterior que las toxinas nativas no pueden ser establecidas para su uso en seres humanos debido a su fuerte toxicidad. Adicionalmente, su aplicación en la terapia tumoral sería perjudicial debido a que la respuesta del sistema inmunitario innato, en particular la de las células NK, resultaría inhibida. Sin embargo, es esta respuesta inmunitaria la que es crucial para una terapia tumoral satisfactoria puesto que las células tumorales muy frecuentemente pierden su capacidad para expresar las moléculas del MHC de clase I y por lo tanto son resistentes al reconocimiento y ataque por los CTL.

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El uso de las subunidades de toxina destoxificadas, por otra parte, solas o fusionadas a proteínas antigénicas (heterólogas) da como resultado un efecto coadyuvante fuertemente atenuado y/o incluso una tolerancia generalizada inducida del sistema inmunitario así como respuestas inmunitarias de anticuerpos y de tipo Th2 mucosalmente restringidas.

Además, se dice que la secreción de proteínas de fusión de antígeno (heterólogo)-toxina, que solamente se describe en las vacunas anti-infección (esto es, dirigiendo el antígeno o incluso la propia toxina), no solamente no presenta ventajas sobre la expresión citoplásmica, si no que son generalmente bastante inadecuadas.

En general, ni se presenta un enfoque terapéutico tumoral ni se describieron o lograron la inducción generalizada de una respuesta inmunitaria celular dominada por Th1 con células T coadyuvantes productoras de IFN-gamma, la inducción de los CTL ni la activación del sistema inmunitario innato, todas las cuales son indispensables para la terapia tumoral.

Descripción de la invención

La presente invención tiene el objeto de proporcionar vacunas contra tumores novedosas por medio de las cuales se induce una fuerte respuesta generalizada del sistema inmunitario celular y se puede lograr una terapia tumoral eficaz.

El objeto de la presente invención ha sido resuelto sorprendentemente en un aspecto proporcionando un microorganismo como portador de secuencias de nucleótidos que codifican antígenos y toxinas proteicas que comprenden los siguientes componentes:

(I)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada; y

(II)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica; y

(III)

a)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie más externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o que codifica al menos una secuencia señal que permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o

b)

opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado; y

(IV)

al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más de los componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular'';

donde cualquiera de los componentes (I) a (IV) puede estar presente una vez o varias veces y si un componente de los componentes (I) a (IV) está presente varias veces puede ser independientemente idéntico o diferente; y

donde el componente (I) y el componente (II) no son idénticos, esto es el componente (I) no codifica al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina
proteica.

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El término "específico de célula tisular" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son activadas específicamente en células tisulares diana, tales como promotores dependientes de hormonas en tejidos prostáticos por ejemplo.

El término "específico de célula tumoral" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son específicamente activadas en células tumorales, tales como elementos promotores activados por la acción de oncogenes específicos de tumores.

El término "específico de macrófagos" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son específicamente activadas en macrófagos, tales como elementos promotores que codifican genes específicos de macrófagos, por ejemplo el gen que codifica F4/80.

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El término "específico de dendritas" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son activadas específicamente en células dendríticas, tales como los elementos promotores que controlan la expresión de B7.1. Los términos "específico de dendritas" y "específico de células dendríticas" son equivalentes, esto es tienen el mismo significado y ambos hacen referencia a células dendríticas.

El término "específico de linfocitos" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a elementos que son activados específicamente en células de linaje linfocítico como elementos promotores que regulan la expresión de moléculas CD3 en células T o elementos promotores que regulan la expresión de CD20 en células B maduras.

El término "específico de la función" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son activadas específicamente en el contexto celular, p. ej., en células tumorales que han perdido la expresión de p53, o una o varias secuencias de activación que están activadas dentro de bacterias dependiendo del contexto, p. ej. localización celular o presión de oxígeno.

El término "sin especificidad celular" con respecto al componente (IV) en la presente invención hace referencia a una o varias secuencias de activación que son ubícuamente activas, tales como promotores bacterianos constitutivamente activos.

El término "secuencia de nucleótidos" en la presente invención hace referencia a ADNds, ADNss, ARNds, ARNss o híbridos de ADN/ARNds. Se prefiere el ADNds.

El término "antígeno" en la presente invención hace referencia a moléculas que reaccionan con anticuerpos, esto es, que son capaces de generar anticuerpos. Algunos antígenos no logran, por sí mismos, la producción de anticuerpos; solamente aquellos que pueden inducir la producción de anticuerpos son denominados inmunógenos. Para los fines de la presente invención, se pretende que estén incluidas todas las clases de antígenos conocidos. El experto en la técnica sabe la recabar información necesaria a cerca de antígenos potenciales por medio de bases de datos y/o escrutinio experimental sin molestias indebidas. Los ejemplos de los antígenos son entre otros los antígenos celulares, los antígenos específicos de células tisulares (p. ej. células tisulares de las cuales deriva un tumor), antígenos proteicos celulares, antígenos virales, antígenos proteicos virales y similares. Se prefieren los antígenos proteicos. Son adicionalmente preferidos los antígenos heterólogos o los antígenos foráneos, esto es los antígenos que no son endógenos con respecto al microorganismo respectivo de la invención o los antígenos que no son expresados por el organismo respectivo de la invención por naturaleza, pero son introducidos en él por medio de métodos biotecnológicos moleculares convencionales.

El término "antígeno completo" en la presente invención hace referencia a moléculas completas que reaccionan con anticuerpos de acuerdo con la definición anterior. Los ejemplos de los antígenos completos son por ejemplo las proteínas completas, que también son las preferidas.

El término "antígeno parcial" en la presente invención hace referencia a porciones específicas de moléculas que reaccionan con los anticuerpos de acuerdo con la definición anterior. Los antígenos parciales pueden ser por ejemplo motivos proteicos tales como bucles de aminoácidos dentro de las proteínas, dominios proteína quinasa, epítopos y similares. Son preferidos los dominios proteína quinasa y los epítopos, de los cuales los últimos son sitios específicos de un antígeno reconocido por un anticuerpo (también referidos como determinantes antigénicos).

Los términos "tipo salvaje" y "mutada" con respecto a una "proteína" en la presente invención hacen referencia a proteínas que consisten en su secuencia de aminoácidos dominante "natural" (codificada por la respectiva secuencia de nucleótidos) y proteínas que tienen una o más mutaciones en su secuencia de aminoácidos (codificada por la respectiva secuencia de nucleótidos) en comparación con la secuencia de tipo salvaje, respectivamente. Preferiblemente las proteínas de tipo salvaje y/o mutadas derivan de células tumorales. Como para los antígenos parciales se prefiere adicionalmente que la secuencia incluya mutaciones, esto es, se selecciona un epítopo que contiene preferiblemente una o más mutaciones, por ejemplo el epítopo V660E de B-Raf.

Los microorganismos en el sentido de la invención son bacterias, bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas y células eucarióticas, de las cuales las últimas comprenden parásitos unicelulares, levaduras, células tumorales y células de líneas celulares, tales como Sacharomyces cerevisiae, Leishmania spp., células tumorales y líneas de células tumorales autólogas derivadas de pacientes. Tales microorganismos se utilizan normalmente como portadores para la transferencia de secuencias de nucleótidos que son foráneas (heterólogas o heterogéneas) para el microorganismo. Preferiblemente, se utilizan bacterias, que tiene la virulencia atenuada, por ejemplo bacterias que portan un gen aroA, aro, asd, gal, pur, cya, crp, phoP/Q, omp suprimidos o inactivados o son mutantes sensibles a la temperatura o mutantes dependientes de antibióticos (Cardenas y Clements, 1992). Adicionalmente se prefiere como microorganismo que comprende los componentes (I) a (IV) anteriores una bacteria intracelular facultativa, atenuada, gram-negativa como portador, que sea capaz de superar la mucosa intestinal (p. ej. Salmonella spp. o Shigella spp.).

En una realización preferida, se proporciona un microorganismo que comprende los componentes (I) a (IV) anteriores, donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en "una bacteria, una bacteria gram-positiva, una bacteria gram-negativa, una célula eucariotica" y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en "Escherichia spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio spp., Vibrio cholerae, Listeria spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Shigella flexneri", donde preferiblemente la virulencia del microorganismo está atenuada. Adicionalmente se prefiere excluir Vibrio cholerae de los microorganismos definidos antes.

Se pretende que el término "spp." con respecto a cualquier microorganismo comprenda para los fines de la presente invención todos los miembros de un género dado, incluyendo especies, subspecies y otros. Se pretende que el término "Salmonella spp." por ejemplo comprenda todos los miembros del género Salmonella, tales como Salmonella typhi y Salmonella typhimurium.

En otra realización preferida, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "receptor; porción extracelular, transmembrana o intracelular de un receptor; molécula de adherencia; porción extracelular, transmembrana o intracelular de una molécula de adherencia; proteína transductora de la señal; proteína del ciclo celular; factor de transcripción; proteína de diferenciación; proteína embrionaria; proteína viral; alergeno; proteína de patógeno microbiano; proteína de patógeno eucariótico; proteína antigénica de cáncer de testículo; proteínas antigénicas de tumores; y/o proteínas específicas de células tisulares",

donde la célula tisular se selecciona del grupo que consiste en "glándula tiroidea, glándula mamaria, glándula salivar, nódulo linfoide, glándula mamaria, túnica de la mucosa gástrica, riñón, ovario, próstata, cérvix, túnica serosa de la vejiga urinaria y lunares".

Como para la proteína mutada, la mutación ha podido ser oncogénica y puede haber causado una pérdida o una ganancia de sus funciones celulares originales.

Tales antígenos realizan en la célula el control del crecimiento celular y de la división celular y se presentan sobre la membrana celular de las células normales, por ejemplo por medio de la molécula del MHC de clase I. En las células tumorales, estos antígenos son frecuentemente expresados en exceso o mutados específicamente. Tales mutaciones pueden tener como consecuencia limitaciones de la función de los supresores oncogénicos o la activación de los proto-oncogenes a oncogenes y pueden estar implicadas solas o en común en las expresiones en exceso en el crecimiento tumoral. Tales antígenos celulares se presentan sobre la membrana de las células tumorales y de este modo representan antígenos sobre las células tumorales, sin causar no obstante una reacción inmunitaria que afecte a la enfermedad tumoral del paciente. Rapp (documento US 5.156.841) ya ha descrito el uso de oncoproteínas, esto es productos de expresión de los oncogenes, como inmunógeno para las vacunas contra tumores.

Los ejemplos de los antígenos y sus mutaciones (oncogénicas) de acuerdo con la invención son i) receptores, tales como Her-2/neu, receptores de andrógenos, receptores de estrógenos, receptores de lactoferrina, receptores de midquinas, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta; ii) proteínas de transducción de la señal, tales como c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A1, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IAO2, XIAP, ML-IAP LIVIN, survivina, APAF-1; iii) proteínas de control del ciclo celular, tales como ciclina D(1-3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1-5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, p53 y homólogos; iv) factores de transcripción, tales como C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Spl; v) proteínas embrionarias, tales como antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA; vi) antígenos de diferenciación, tales como MART, Gp100, tirosinasa, GRP, TCF-4, mielina básica, alfa-lactalbúmina, GFAP, antígeno específico de próstata (ASP), proteína ácida fibrilar, tirosinasa, EGR-1, MUC1; vii) antígenos virales, tales como los siguientes virus: HIV, HPV, HCV, HPV, VEB, CMV, VHS, virus de la influenza, virus de la influenza de tipo A, virus de la influenza de tipo A (H5N1) y (H3N2), virus de la influenza tipo B, virus de la influenza tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferiblemente del virus de la influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente del virus de la Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente del virus de la Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), neuramidasa, antígenos microbianos: p60, LLO, ureasa etc. Antígenos de patógenos eucarióticos: CSP (malaria), calflagina (tripanosoma), CPB (Leishmania major) etc.

En otra realización preferida más, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "Her-2/neu, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos, receptor de midquina, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta, receptor de lactoferrina, mielina básica, alfa-lactoalbúmina, GFAP, proteína ácida fibrilar, tirosinasa, EGR-1, MUC1, c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, N-Ras, K-Ras, H-Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A1, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IAO2, XIAP, ML-IAP LIVIN, survivina, APAF-1, ciclina D(1-3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1-5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, Akt, PI3K, mTOR, p53 y homólogos, C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Sp1, antígeno específico de próstata (ASP), antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, PAP; PSMA; STEAP; MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA, MART, Gp100, tirosinasa, GRP, TCF-4, antígenos virales de los virus HIV, HPV, HCV, HPV, VEB, CMV, VES, virus de la influenza, virus de la influenza de tipo A, virus de la influenza de tipo A (H5N1) y (H3N2), virus de la influenza de tipo B, virus de la influenza de tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferiblemente del virus de la Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente del virus de la Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente del virus de la Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), neuramidasa, p60, LLO, ureasa, CSP, calflagina y/o CPB".

En otra realización preferida más, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo de quinasas que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos (números de acceso entre paréntesis): AAK1 (NM 014911), AATK (NM 004920), ABL1 (NM 005157), ABL2 (NM 005158), ACK1 (NM 005781), ACVR1 (NM 001105), ACVR1 B (NM 020328), ACVR2 (NM 001616), ACVR2B (NM 001106), ACVRL1 (NM 000020), ADCK1 (NM 020421), ADCK2 (NM 052853), ADCK4 (NM 024876), ADCK5 (NM 174922), ADRBK1 (NM 001619), ADRBK2 (NM 005160), AKT1 (NM 005163), AKT2 (NM 001626), AKT3 (NM 005465), ALK (NM 004304), ALK7 (NM 145259), ALS2CR2 (NM 018571), ALS2CR7 (NM 139158), AMHR2 (NM 020547), ANKK1 (NM 178510), ANKRD3 (NM 020639), APEG1 (NM 005876), ARAF (NM 001654), ARK5 (NM 014840), ATM (NM 000051), ATR (NM 001184), AURKA (NM 003600), AURKB (NM 004217), AURKC (NM 003160), AXL (NM 001699), BCKDK (NM 005881), BCR (NM 004327), BIKE (NM 017593), BLK (NM 001715), BMPR1 A (NM 004329), BMPR1 B (NM 001203), BMPR2 (NM 001204), BMX (NM 001721), BRAF (NM 004333), BRD2 (NM 005104), BRD3 (NM 007371), BRD4 (NM 014299), BRDT (NM 001726), BRSK1 (NM 032430), BRSK2 (NM 003957), BTK (NM 000061), BUB1 (NM 004336), BUB1 B (NM 001211), CABC1 (NM 020247), CAMK1 (NM 003656), CaMKIb (NM 198452), CAMK1 D (NM 020397), CAMK1 G (NM 020439), CAMK2A (NM 015981), CAMK2B (NM 001220), CAMK2D (NM 001221), CAMK2G (NM 001222), CAMK4 (NM 001744), CAMKK1 (NM 032294), CAMKK2 (NM 006549), CASK (NM 003688), CCRK (NM 012119), CDC2 (NM 001786), CDC2L1 (NM 001787), CDC2L5 (NM 003718), CDC42BPA (NM 014826), CDC42BPB (NM 006035), CDC7L1 (NM 003503), CDK10 (NM 003674), CDK11 (NM 015076), CDK2 (NM 001798), CDK3 (NM 001258), CDK4 (NM 000075), CDK5 (NM 004935), CDK6 (NM 001259), CDK7 (NM 001799), CDK8 (NM 001260), CDK9 (NM 001261), CDKL1 (NM 004196), CDKL2 (NM 003948), CDKL3 (NM 016508), CDKL4 (NM 001009565), CDKL5 (NM 003159), CHEK1 (NM 001274), CHUK (NM 001278), CIT (NM 007174), CLK1 (NM 004071), CLK2 (NM 003993), CLK3 (NM 003992), CLK4 (NM 020666), CRK7 (NM 016507), CSF1 R (NM 005211), CSK (NM 004383), CSNK1A1 (NM 001892), CSNK1 D (NM 001893), CSNK1E (NM 001894), CSNK1G1 (NM 022048), CSNK1G2 (NM 001319), CSNK1G3 (NM 004384), CSNK2A1 (NM 001895), CSNK2A2 (NM 001896), DAPK1 (NM 004938), DAPK2 (NM 014326), DAPK3 (NM 001348), DCAMKL1 (NM 004734), DCAMKL2 (NM 152619), DCAMKL3 (XM 047355), DDR1 (NM 013993), DDR2 (NM 006182), DMPK (NM 004409), DMPK2 (NM 017525.1), DYRK1 A (NM 001396), DYRK1 B (NM 006484), DYRK2 (NM 006482), DYRK3 (NM 003582), DYRK4 (NM 003845), EEF2K (NM 013302), EGFR (NM 005228), EIF2AK3 (NM 004836), EIF2AK4 (NM_001013703), EPHA1 (NM 005232), EPHA10 (NM 001004338), EPHA2 (NM 004431), EPHA3 (NM 005233), EPHA4 (NM 004438), EPHA5 (NM 004439), EPHA6 (XM 114973), EPHA7 (NM 004440), EPHA8 (NM 020526), EPHB1 (NM 004441), EPHB2 (NM 017449), EPHB3 (NM 004443), EPHB4 (NM 004444), EPHB6 (NM 004445), ERBB2 (NM 004448), ERBB3 (NM 001982), ERBB4 (NM 005235), ERK8 (NM 139021), ERN1 (NM 001433), ERN2 (NM 033266), FASTK (NM 025096), FER (NM 005246), FES (NM 002005), FGFR1 (NM 000604), FGFR2 (NM 022970), FGFR3 (NM 000142), FGFR4 (NM 022963), FGR (NM 005248), FLJ23074 (NM 025052), FLJ23119 (NM 024652), FLJ23356 (NM 032237), FLT1 (NM 002019), FLT3 (NM 004119), FLT4 (NM 002020), FRAP1 (NM 004958), FRK (NM 002031), FYN (NM 002037), GAK (NM 005255), GPRK5 (NM 005308), GPRK6 (NM 002082), GPRK7 (NM 139209), GRK4 (NM 005307), GSG2 (NM 031965), GSK3A (NM 019884), GSK3B (NM 002093), GUCY2C (NM 004963), GUCY2D (NM 000180), GUCY2F (NM 001522), H11 (NM 014365), HAK (NM 052947), HCK (NM 002110), HIPK1 (NM 152696), HIPK2 (NM 022740), HIPK3 (NM 005734), HIPK4 (NM 144685), HRI (NM 014413), HUNK (NM 014586), ICK (NM 016513), IGF1R (NM 000875), IKBKB (NM 001556), IKBKE (NM 014002), ILK (NM 004517), INSR (NM 000208), INSRR (NM 014215), IRAK1 (NM 001569), IRAK2 (NM 001570), IRAK3 (NM 007199), IRAK4 (NM 016123), ITK (NM 005546), JAK1 (NM 002227), JAK2 (NM 004972), JAK3 (NM 000215), KDR (NM 002253), KIS (NM 144624), KIT (NM 000222), KSR (XM 290793), KSR2 (NM 173598), LAK (NM 025144), LATS1 (NM 004690), LATS2 (NM 014572), LCK (NM 005356), LIMK1 (NM 016735), LIMK2 (NM 005569), LMR3 (XM 055866), LMTK2 (NM 014916), LOC149420 (NM 152835), LOC51086 (NM 015978), LRRK2 (XM 058513), LTK (NM 002344), LYN (NM 002350), MAK (NM 005906), MAP2K1 (NM 002755), MAP2K2 (NM 030662), MAP2K3 (NM 002756), MAP2K4 (NM 003010), MAP2K5 (NM 002757), MAP2K6 (NM 002758), MAP2K7 (NM 005043), MAP3K1 (XM 042066), MAP3K10 (NM 002446), MAP3K11 (NM 002419), MAP3K12 (NM 006301), MAP3K13 (NM 004721), MAP3K14 (NM 003954), MAP3K2 (NM 006609), MAP3K3 (NM 002401), MAP3K4 (NM 005922), MAP3K5 (NM 005923), MAP3K6 (NM 004672), MAP3K7 (NM 003188), MAP3K8 (NM 005204), MAP3K9 (NM 033141), MAP4K1 (NM 007181), MAP4K2 (NM 004579), MAP4K3 (NM 003618), MAP4K4 (NM 145686), MAP4K5 (NM 006575), MAPK1 (NM 002745), MAPK10 (NM 002753), MAPK11 (NM 002751), MAPK12 (NM 002969), MAPK13 (NM 002754), MAPK14 (NM 001315), MAPK3 (NM 002746), MAPK4 (NM 002747), MAPK6 (NM 002748), MAPK7 (NM 002749), MAPK8 (NM 002750), MAPK9 (NM 002752), MAPKAPK2 (NM 032960), MAPKAPK3 (NM 004635), MAPKAPK5 (NM 003668), MARK (NM 018650), MARK2 (NM 017490), MARK3 (NM 002376), MARK4 (NM 031417), MAST1 (NM 014975), MAST205 (NM 015112), MAST3 (XM 038150), MAST4 (XM 291141), MASTL (NM 032844), MATK (NM 139355), MELK (NM 014791), MERTK (NM 006343), MET (NM 000245), MGC33182 (NM 145203), MGC42105 (NM 153361), MGC43306 (C9orf96), MGC8407 (NM 024046), MIDORI (NM 020778), MINK (NM 015716), MKNK1 (NM 003684), MKNK2 (NM 017572), MLCK (NM 182493), MLK4 (NM 032435), MLKL (NM 152649), MOS (NM 005372), MST1 R (NM 002447), MST4 (NM 016542), MUSK (NM 005592), MYLK (NM 053025), MYLK2 (NM 033118), MYO3A (NM 017433), MYO3B (NM 138995), NEK1 (NM 012224), NEK10 (NM 152534), NEK11 (NM 024800), NEK2 (NM 002497), NEK3 (NM 002498), NEK4 (NM 003157), NEK5 (MGC75495), NEK6 (NM 014397), NEK7 (NM 133494), NEK8 (NM 178170), NEK9 (NM 033116), NLK (NM 016231), NPR1 (NM 000906), NPR2 (NM 003995), NRBP (NM 013392), NRBP2 (NM 178564), NRK (NM 198465), NTRK1 (NM 002529), NTRK2 (NM 006180), NTRK3 (NM 002530), OBSCN (NM 052843), OSR1 (NM 005109), PACE-1 (NM 020423), PAK1 (NM 002576), PAK2 (NM 002577), PAK3 (NM 002578), PAK4 (NM 005884), PAK6 (NM 020168), PAK7 (NM 020341), PASK (NM 015148), PCTK1 (NM 006201), PCTK2 (NM 002595), PCTK3 (NM 212503), PDGFRA (NM 006206), PDGFRB (NM 002609), PDK1 (NM 002610), PDK2 (NM 002611), PDK3 (NM 005391), PDK4 (NM 002612), PDPK1 (NM 002613), PFTK1 (NM 012395), PHKG1 (NM 006213), PHKG2 (NM 000294), PIK3R4 (NM 014602), PIM1 (NM 002648), PIM2 (NM 006875), PIM3 (NM 001001852), PINK1 (NM 032409), PKE (NM 173575), PKMYT1 (NM 004203), pknbeta (NM 013355), PLK (NM 005030), PLK3 (NM 004073), PRKAA1 (NM 006251), PRKAA2 (NM 006252), PRKACA (NM 002730), PRKACB (NM 002731), PRKACG (NM 002732), PRKCA (NM 002737), PRKCB1 (NM 002738), PRKCD (NM 006254), PRKCE (NM 005400), PRKCG (NM 002739), PRKCH (NM 006255), PRKCI (NM 002740), PRKCL1 (NM 002741), PRKCL2 (NM 006256), PRKCM (NM 002742), PRKCN (NM 005813), PRKCQ (NM 006257), PRKCZ (NM 002744), PRKD2 (NM 016457), PRKDC (NM 006904), PRKG1 (NM 006258), PRKG2 (NM 006259), PRKR (NM 002759), PRKWNK1 (NM 018979), PRKWNK2 (NM 006648), PRKWNK3 (NM 020922), PRKWNK4 (NM 032387), PRKX (NM 005044), PRKY (NM 002760), PRPF4B (NM 003913), PSKH1 (NM 006742), PSKH2 (NM 033126), PTK2 (NM 005607), PTK2B (NM 004103), PTK6 (NM 005975), PTK7 (NM 002821), PTK9 (NM 002822), PTK9L (NM 007284), PXK (NM 017771), QSK (NM 025164), RAD53 (NM 007194), RAF1 (NM 002880), RAGE (NM 014226), RET (NM 020975), RHOK (NM 002929), RIOK1 (NM 031480), RIOK2 (NM 018343), RIPK1 (NM 003804), RIPK2 (NM 003821), RIPK3 (NM 006871), RIPK5 (NM 015375), RNASEL (NM 021133), ROCK1 (NM 005406), ROCK2 (NM 004850), ROR1 (NM 005012), ROR2 (NM 004560), ROS1 (NM 002944), RPS6KA1 (NM 002953), RPS6KA2 (NM 021135), RPS6KA3 (NM 004586), RPS6KA4 (NM 003942), RPS6KA5 (NM 004755), RPS6KA6 (NM 014496), RPS6KB1 (NM 003161), RPS6KB2 (NM 003952), RPS6KC1 (NM 012424), RPS6KL1 (NM 031464), RYK (NM 002958), SBK (XM 370948), SCYL1 (NM 020680), SCYL2 (NM 017988), SGK (NM 005627), SgK069 (SU SgK069), SgK085 (XM 373109), SgK110 (SU SgK110), SGK2 (NM 016276), SgK223 (XM 291277), SgK269 (XM 370878), SgK424 (CGP SgK424), SgK493 (SU_SgK493), SgK494 (NM 144610), SgK495 (NM 032017), SGKL (NM 013257), SK681 (NM 001001671), SLK (NM 014720), SMG1 (NM 015092), SNARK (NM 030952), SNF1 LK (NM 173354), SNF1 LK2 (NM 015191), SNK (NM 006622), SNRK (NM 017719), SRC (NM 005417), SRMS (NM 080823), SRPK1 (NM 003137), SRPK2 (NM 003138), SSTK (NM 032037), STK10 (NM 005990), STK11 (NM 000455), STK16 (NM 003691), STK17A (NM 004760), STK17B (NM 004226), STK18 (NM 014264), STK19 (NM 032454), STK22B (NM 053006), STK22C (NM 052841), STK22D (NM 032028), STK23 (NM 014370), STK24 (NM 003576), STK25 (NM 006374), STK3 (NM 006281), STK31 (NM 031414), STK32B (NM 018401), STK33 (NM 030906), STK35 (NM 080836), STK36 (NM 015690), STK38 (NM 007271), STK38L (NM 015000), STK39 (NM 013233), STK4 (NM 006282), STLK5 (NM 001003787), STYK1 (NM 018423), SUDD (NM 003831), SYK (NM 003177), TAF1 (NM 138923), TAF1 L (NM 153809), TAO1 (NM 004783), TAOK1 (NM 020791), TAOK3 (NM 016281), TBCK (NM 033115), TBK1 (NM 013254), TEC (NM 003215), TEK (NM 000459), TESK1 (NM 006285), TESK2 (NM 007170), TEX14 (NM 031272), TGFBR1 (NM 004612), TGFBR2 (NM 003242), TIE (NM 005424), TIF1 (NM 003852), TLK1 (NM 012290), TLK2 (NM 006852), TNIK (NM 015028), TNK1 (NM 003985), TOPK (NM 018492), TP53RK (NM 033550), TRAD (NM 007064), TRIB1 (NM 025195), TRIB2 (NM 021643), TRIB3 (NM 021158), TRIM28 (NM 005762), TRIM33 (NM 015906), TRIO (NM 007118), TRPM6 (NM 017662), TRPM7 (NM 017672), TRRAP (NM 003496), TSSK4 (NM 174944), TTBK1 (NM 032538), TTBK2 (NM 173500), TTK (NM 003318), TTN (NM 003319), TXK (NM 003328), TYK2 (NM 003331), TYRO3 (NM 006293), ULK1 (NM 003565), ULK2 (NM 014683), ULK3 (NM 015518), ULK4 (NM 017886), VRK1 (NM 003384), VRK2 (NM 006296), VRK3 (NM 016440), WEE1 (NM 003390), Wee1B (NM 173677), YANK1 (NM 145001), YES1 (NM 005433), ZAK (NM 016653), y/o ZAP70 (NM 001079)''.

El término "alergeno" en la presente invención hace referencia a antígenos parciales o completos según se definen en la presente memoria que logran reacciones de hipersensibilidad y/o alérgicas. Los ejemplos son Der p 5 (ácaro), Bet v 1 (polen de abedul), Phl p 1 (polen de césped), Asp f I/a (Aspergillus), PLA 2 (abeja), Hev b (látex) (Schmid-Grendelmeier y Crameri, 2001).

Los antígenos de patógenos microbianos y eucarióticos y de antígenos de cáncer de testículo están incluidos en la lista anterior.

En la presente invención, las toxinas proteicas y/o sus subunidades de acuerdo con el componente (II) son preferiblemente toxinas proteicas bacterianas, más preferiblemente exotoxinas. Los ejemplos de las exotoxinas bacterianas son las toxinas de tipo I (superantígenos), toxinas de tipo II (toxinas formadoras de poros) y (iii) las toxinas de tipo III (toxinas A-B).

En una realización preferida, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en ``toxina bacteriana, enterotoxina, exotoxina, toxina de tipo I, toxina de tipo II, toxina de tipo III, toxina de tipo IV, toxina de tipo V, toxina RTX, toxina AB, toxina A-B, toxina A/B, toxina A+B, toxina A-5B y/o toxina AB5.

En otra realización preferida más, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en "toxina Adenilato ciclasa, toxina de Ántrax, toxina de Ántrax (EF), toxina de Ántrax (LF), toxina de Botulinum, toxina de Cólera (CT, Ctx), subunidad B de la toxina de Cólera (CTB, CtxB), toxina de Difteria (DT, Dtx), toxina LT de E. coli, enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina ST de E. coli, enterotoxina estable al calor de E. coli (ST), toxina Eritrogénica, toxina Exfoliatina, Exotoxina A, enterotoxina de Perfringens, toxina de Pertussis (PT, Ptx), toxina Shiga (ST, Stx), subunidad B de la toxina Shiga (STB, StxB), toxina de tipo Shiga, enterotoxinas de Staphylococcus, toxina del Tétanos (TT), toxina del Síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina Vero (VT), Toxina A (AT) y Toxina B (BT) de Clostridium difficile, Toxina Letal (LT) y Toxina Hemorrágica (HT) de Clostridium sordellii, Toxina alfa (AT) de Clostridium novyi".

Sin embargo, si se utilizan como toxinas la Toxina del Cólera o su subunidad CtxB de acuerdo con el componente (II) de la invención, se prefiere no emplear Vibrio cholerae como portador bacteriano (microorganismo).

En una realización preferida, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el componente (I) y el componente (II) están unidos entre sí para permitir la expresión y/o secreción de una proteína de fusión codificada por ambos componentes. Más preferiblemente, esta proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD ("muerte de quinasa")), dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E, dominio quinasa (muerte de quinasa) CtxB-B-Raf V600E KD, CtxB-B-Raf, CtxB B-Raf KD (muerte de quinasa), dominio quinasa CtxB-B-Raf KD (muerte de quinasa), CtxB-HA1 (subunidad 1 una hemaglutinina un virus influenza), CtxB-HA12C".

La secreción es el procedimiento de segregación, elaboración, y liberación de productos químicos a partir de una célula, o la sustancia química o la cantidad de sustancia secretada. La secreción no es única sólo para los eucariotas; también está presente en bacterias y arqueas. Los transportadores de tipo casete de unión a ATP (ABC) son comunes a los tres dominios de vida. El sistema Sec es otro sistema de secreción conservado que es homólogo al translocón del retículo endoplásmico eucariótico que consiste en el complejo del translocón Sec 61 en levaduras y el complejo Sec Y-E-G en bacterias. Las bacterias Gram-negativas tienen dos membranas, haciendo de ese modo la secreción topológicamente más compleja. De modo que hay cinco sistemas de secreción especializados en las bacterias Gram negativas:

(1)

sistema de secreción de Tipo I: Es el mismo que los transportadores de la casete de unión a ATP mencionados antes.

(2)

sistema de secreción de Tipo II: Depende del sistema SEC para que una proteína atraviese la membrana interna y de otro sistema especial para cruzar la membrana externa. Los pili bacterianos utilizan modificaciones del sistema sec, pero son diferentes del sistema de tipo I.

(3)

sistema de secreción de Tipo III (T3SS): Es homólogo al cuerpo basal flagelar bacteriano. Es como una jeringa molecular a través de la cual una bacteria (p. ej. Shigella o Yersinia) puede inyectar proteínas en células eucarióticas. La baja concentración de Ca^{2+} en el citosol abre la compuerta que regula T3SS. El sistema Hrp en patógenos vegetales inyecta horquillas a través de mecanismos similares en las plantas.

(4)

sistema de secreción de Tipo IV: Es homólogo a la maquinaria de conjugación de las bacterias (y flagelos arqueales). Es capaz de transportar tanto ADN como proteínas. Se descubrió en Agrobacterium tumefaciens, que utiliza este sistema para introducir el plásmido Ti y las proteínas en el anfitrión que desarrolla la agalla de corona (tumor). Helicobacter pylori utiliza un sistema de secreción de tipo IV para inyectar Cag A en células epiteliales gástricas. Bordetella pertussis, el agente causante de la tosferina, secreta la toxina pertussis parcialmente a través del sistema de tipo IV.

(5)

sistema de secreción de Tipo V, también denominado sistema auto-transportador: Este utiliza el sistema sec para cruzar la membrana interna. Las proteínas que utilizan esta ruta tienen la capacidad de formar un barril beta en su extremo C e insertarlo en la membrana externa para transportar el resto del péptido hacia fuera. Finalmente el barril beta puede ser escindido y dejado atrás en la membrana externa. Algunas personas piensan que estos remanentes de los auto-transportadores dan lugar a las porinas que son similares a los barriles beta.

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Las bacterias así como las mitocondrias y los cloroplastos también utilizan muchos otros sistemas de transporte especiales tales como la ruta de translocación de la doble arginina (Tat) que, en contraste con la exportación dependiente de Sec, transporta la proteína completamente plegada a través de la membrana. El nombre del sistema viene del requerimiento de dos argininas consecutivas en la secuencia señal requerida para dirigirla a este sistema. La secreción en bacterias gram-negativas implica superar la membrana interna y externa por medio de un sistema de secreción adecuado, como p. ej. el sistema de secreción de tipo I Hly o de tipo II o el autotransportador AIDA. En las bacterias gram-positivas el sistema de secreción tiene que superar la membrana interna y la pared celular, lo que, en la mayoría de las cepas, se puede lograr mediante la fusión con una señal de secreción adecuada.

El componente (III) a) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I), y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II). El respectivo componente puede, como opción, ser secretado o expresado sobre la membrana del microorganismo, esto es, unido a la membrana. Tales sistemas de transporte son por ejemplo i) el sistema de secreción de tipo I, el sistema de secreción de tipo II, el sistema de secreción de tipo III, el sistema de secreción de tipo IV, el sistema de secreción de tipo V, ii) el sistema de transporte de hemolisina (señal) de E. coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly); se van a utilizar las siguientes señales de transporte: para la secreción - la señal de transporte de HlyA C-terminal, en presencia de las proteínas HlyB y HlyD; para la expresión unida a la membrana - la señal de transporte de HlyA C-terminal, en presencia de la proteína HlyB, iii) el sistema de transporte de la hemolisina (señal) de E. coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico de hly), iv) la señal de transporte para la proteína de la capa S (Rsa A) de Caulobacter crescentus; se van a utilizar las siguientes señales de transporte: para la secreción y la expresión unida a la membrana - la señal de transporte RsaA C-terminal RsaA, v) la señal de transporte para la proteína TolC de Escherichia coli; se van a utilizar las siguientes señales de transporte: para la expresión unida a la membrana - la señal de transporte N-terminal de TolC (la proteína integrante de la membrana ToIC de E. coli es una proteína formadora de poro multi-funcional de la membrana externa de E. coli, que sirve - además de para funciones tales como la recepción de colicina E1 (Morona et al., 1983) y la secreción de colicina V (Fath et al., 1991) también como receptor del fago U3 (Austin et al., 1990); esta proteína no solo se encuentra en E. coli, también en una multitud de bacterias gram-negativas (Wiener, 2000); la localización en la membrana externa y la amplia incidencia hacen de ToIC un candidato ideal para presentar antígenos heterólogos, con el fin p. ej. de ocasionar una reacción inmunitaria.

Las bacterias gram positivas no incluyen una membrana externa. La secreción en estos casos es más simple y normalmente no requiere una maquinaria de secreción dedicada al transporte a través de la membrana celular y la pared celular. En el caso de las bacterias gram positivas, las señales de secreción fusionadas N-terminalmente a la proteína heteróloga son normalmente necesarias y suficientes para la secreción. Las proteínas, para las cuales se han descrito estas secuencias señal, comprenden principalmente proteínas bacterianas secretadas. Los ejemplos para listeria son las señales de secreción derivadas de Listeriolysina, p60 o ActA. En general, se aplica un enfoque similar para las células eucarióticas, donde es necesaria y suficiente para la secreción una secuencia señal (por ejemplo la señal de secreción ubicua Vtgss) que dirige la proteína al retículo endoplasmático en ausencia de una señal de retención.

El componente opcional (III) b) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado. Tales proteínas líticas (endolisinas) son por ejemplo proteínas de lisis específica de Listeria, tales como PLY551 (Loessner et al., 1995) y/o holina específica de Listeria bajo el control de un promotor listeriano. Una realización preferida de esta invención es la combinación de diferentes componentes (III) b), por ejemplo la combinación de una proteína de lisis y la holina.

Ambos componentes (III) a) y/o (III) b) pueden ser independientemente entre sí constitutivamente activos.

En una realización preferida, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en "el sistema de secreción de tipo I, el sistema de secreción de tipo II, el sistema de secreción de tipo III, el sistema de secreción de tipo IV, el sistema de secreción de tipo V, el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly), el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico de hly), la señal de transporte para la proteína la capa S (Rsa A) de Caulobacter crescentus, la señal de transporte para la proteína ToIC de Escherichia coli, la señal de secreción Vtgss y/o las señales de secreción derivadas de listeriolisina, p60 y/o ActA" y donde el componente (III) b) se selecciona del grupo que consiste en "endolisinas, proteína lítica de bacterias gram positivas, proteína lítica de Listeria monocytogenes, PLY551 de Listeria monocytogenes y/o holina de Listeria monocytogenes".

En una realización adicionalmente preferida, el mismo componente (III) a) permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II). Esto es, en esta realización preferida el componente (III) a) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica solamente un sistema de transporte, que permite la expresión concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II), donde semejante componente (III) a) preferido es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema de transporte de la hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly) o el sistema de transporte de la hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico de hly).

En otra realización preferida más, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde de acuerdo con el componente (III) a) se secretan los productos de expresión de los componentes (I) y el componente (II). Más preferiblemente, el componente (I) y el componente (II) se conectan entre sí, se expresan juntos y se secretan como una proteína de fusión codificada por ambos componentes. Muy preferiblemente, esta proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD (muerte de quinasa), dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E, dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E KD (muerte de quinasa), CtxB-B-Raf, CtxB-B-Raf KD (muerte de quinasa), dominio quinasa CtxB B-Raf KD (muerte de quinasa), CtxB-HA1 (subunidad 1 de una hemaglutinina de un virus influenza), CtxB-HA12C".

En la presente invención, el término "secreción" hace referencia a la secreción de un antígeno proteico, toxina proteica y/o proteína de fusión de toxina-antígeno a través de ambas membranas de una bacteria gram negativa o a través de la membrana interna y la pared celular de una bacteria gram positiva en el entorno circundante, por medio de un sistema de secreción apropiado, tal como los ilustrados más arriba.

Como se sabe que utilizando un sistema de secreción, tal como el sistema de secreción de tipo I de hemolisina de E. coli, el producto de secreción se encuentra normalmente en todas las fracciones celulares: citoplásmicamente, asociado a la membrana, localizado en las vesículas de la auto-membrana y completamente secretado en el entorno circundante (Balsalobre et al., 2006), no se necesita que la secreción en la presente invención sea completa. No obstante, se desea y se prefiere una secreción completa o casi completa, esto es, una cantidad mayoritaria de producto de secreción completamente secretado.

El componente (IV) representa al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular.

Si la expresión está unida a la membrana sobre la superficie externa del microorganismo, la secuencia de activación tiene que ser seleccionada preferiblemente de manera que sea susceptible de ser activada en el microorganismo. Tales secuencias de activación son por ejemplo: i) las regiones promotoras constitutivamente activas, tales como la región promotora con el "sitio de unión al ribosoma" (RBS, por sus siglas en Inglés) del gen de la beta-lactamasa de E. coli o el gen tetA (Busby y Ebright, 1994), el promotor endógeno del locus hly de E. coli; ii) promotores, que son susceptibles de ser inducidos, preferiblemente promotores, que se vuelven activos después de la recepción en la célula. A estos pertenecen el promotor actA de L. monocytogenes (Dietrich et al., 1998) o el promotor pagC de S. typhimurium (Bumann, 2001).

Si los plásmidos son liberados del microorganismo después de su lisis en el citosol de la célula de mamífero, la secuencia de activación no es específica de la célula, si no específica de la célula tisular, específica del ciclo celular o específica de la función. Preferiblemente, se seleccionan tales secuencias de activación, que son activadas concretamente en macrófagos, células dendríticas y linfocitos.

En una realización preferida adicional, se proporciona un microorganismo de acuerdo con las definiciones anteriores, donde el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en B-Raf V600E, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD (muerte de quinasa), dominio quinasa B-Raf V600E KD (muerte de quinasa), B-Raf KD (muerte de quinasa), dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD (muerte de quinasa), antígeno específico de próstata (PSA), hemaglutinina HA1 (preferiblemente de virus Influenza A (AIThailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1)'';

el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en la "subunidad B de la toxina del Cólera (CTB, CtxB), subunidad B de enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina del tétanos (TT)";

el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en la "señal de transporte de hemolisina HlyA de Escherichia coli junto con componentes del sistema de secreción Hly (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly)";

el componente (IV) se selecciona del grupo que consiste en el "promotor endógeno del locus hly de E. coli";

donde el componente (I) y el componente (II) están conectados entre sí para permitir la expresión de una proteína de fusión codificada por ambos componentes y donde la proteína de fusión es secretada.

Los microorganismos ilustrados antes de acuerdo con los componentes (I) a (IV) así como las realizaciones preferidas son referidos aquí más adelante como microorganismos de la invención.

Los microorganismos de la invención se adaptan ventajosamente para su uso en la terapia tumoral, como vacunas vivas en el redireccionamiento al tumor. Esto es, por medio de los microorganismos de la invención, que funcionan como portadores de información genética, los antígenos heterólogos junto con las toxinas proteicas son transportados al sitio del tumor, expresados como proteínas de fusión y secretados in situ.

Los microorganismos de la invención se caracterizan sorprendentemente y ventajosamente por una expresión y secreción eficaz y superior de las proteínas de fusión de toxina-antígeno transportadas, codificadas y expresadas, esto es no se producen agregados citoplásmicos y/o periplásmicos.

Por otra parte, mediante la administración de los microorganismos de la invención se logra sorprendentemente una respuesta generalizada del sistema inmunitario celular en comparación con las vacunas de proteínas administradas oralmente que en contraste inducen una tolerancia generalizada del sistema inmunitario.

Muy notablemente, además de la inducción de una respuesta generalizada del sistema inmunitario celular de tipo Th1, los microorganismos de la invención inducen la activación de las células T citotóxicas CD8^{+} restringidas al MHC de clase I (CTL) e intensifican fuertemente esta respuesta inmunitaria de los CTL.

Adicionalmente, además de la inducción y/o potenciación de las respuestas generalizadas celulares fuertes del sistema inmunitario de Th1 y CTL, el sistema inmunitario innato, p. ej. las células NK, las células NKT y/o las células T gamma-delta, también son sorprendentemente activadas por los microorganismos de la invención de una manera sinérgica.

Si se utiliza la Toxina del Cólera como componente toxina, los microorganismos de la invención poseen la ventaja de que en seres humanos no hay normalmente una inmunidad pre-existente contra la toxina (en contraste con la toxina del tétanos por ejemplo debido a vacunaciones anti-tétanos durante la infancia). Por consiguiente se prefiere el uso de la Toxina del Cólera y/o sus subunidades, en particular CtxB.

Los microorganismos de la invención son particularmente adecuados para la administración oral en la terapia tumoral (inmunitaria) dirigida basada en vacunas vivas. De ese modo se puede lograr una mejor conformidad del paciente.

No obstante, los microorganismos de la invención no están limitados al uso en la terapia tumoral solamente. Principalmente, los microorganismos de la invención también son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de todas estas enfermedades que requieren una terapia en la cual es obligatoria la inducción de una respuesta generalizada del sistema inmunitario Th1 celular. Los ejemplos de tales enfermedades infecciosas incluyen, pero no están limitadas a, HIV, influenza, HCV y otras enfermedades virales, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes y otras enfermedades bacterianas.

Los microorganismos de la invención están perfectamente adaptados para el tratamiento de enfermedades como la influenza, que requieren una protección óptima mediante la combinación de una respuesta del sistema inmunitario mucosal y una respuesta inmunitaria celular generalizada. Además, podrían ser útiles para la inducción específica de la inmunidad de tipo Th1 en enfermedades alérgicas, p. ej. rinitis alérgica. En tal caso, el antígeno sería un alergeno que se fusionaría al componente toxina proteica y el principio de acción de la respectiva vacuna sería el cambio de la respuesta inmunitaria desde una respuesta inmunitaria dominada por Th2 contra el alergeno en las reacciones alérgicas (enfermedades) hacia una respuesta inmunitaria Th1.

Un modo de aplicación preferido es la aplicación oral. En una realización preferida, una cepa de Salmonella de acuerdo con esta invención se hace fermentar en un medio apropiado, se cosecha y se lava mediante centrifugación y con posterioridad se formula y se estabiliza utilizando sustancias apropiadas y se liofiliza. La sustancia liofilizada se carga en cápsulas resistentes al estómago que contienen un número de células vivas preferiblemente entre 10^{9} y 10^{10} bacterias. Las cápsulas se consumen oralmente con líquido.

Alternativamente, las bacterias liofilizadas como se ha descrito antes se distribuyen junto con saquitos que contienen tampón que es capaz de neutralizar el ácido del estómago (kit farmacéutico). En una realización preferida, este tampón es un tampón carbonato. Inmediatamente antes de su uso, se prepara el tampón con agua y se recoge, inmediatamente después las bacterias liofilizadas se consumen mezcladas con agua.

Otra alternativa más es el uso de bacterias congeladas. En este caso, después del lavado las bacterias son estabilizadas por medio de un estabilizador, preferiblemente sacarosa o glicerina, y con posterioridad congeladas y almacenadas a -80ºC preferiblemente a concentraciones entre 10^{9} y 10^{10} bacterias por dosis. Esta preparación se utiliza preferiblemente en un kit farmacéutico como se ha descrito antes junto con tampón carbonato.

En una realización preferida, se proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un microorganismo de la invención, preferiblemente al menos un microorganismo liofilizado de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cápsulas.

Los componentes (I) a (IV) de acuerdo con la presente invención se introducen en los microorganismos de la invención mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Si los microorganismos representan bacterias, los componentes se insertan en plásmidos o vectores de expresión, y los plásmidos o vectores de expresión se transfieren a las bacterias. Las técnicas de clonación y transformación biológica molecular adecuadas para la fabricación de los plásmidos, vectores de expresión y microorganismos de la invención son bien conocidas por los expertos en la técnica y representan un trabajo experimental rutinario.

Otro tema de la invención es la administración de una preparación de medicamento que contiene los microorganismos de la invención. La administración se realiza localmente o de forma generalizada, por ejemplo oralmente peroralmente, rectalmente, en la epidermis, en el subcutis, en la musculatura, en una cavidad corporal, en un órgano, en el tumor o en la circulación sanguínea.

Tales preparaciones de medicamento son por ejemplo suspensiones de los microorganismos de la invención en soluciones familiares para el farmacéutico, adecuadas para inyectables.

Un tema concreto de esta invención es la administración peroral o rectal de un medicamento de acuerdo con la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades. La administración se puede realizar una vez o varias veces. En cada administración, se administran aproximadamente de 10 a 10^{11} microorganismos de la invención. Si la administración de este número de microorganismos de la invención no produce una reacción inmunitaria suficiente, se debe incrementar el número a inyectar.

Después de la administración de los microorganismos de la invención, la tolerancia para un componente de presentación celular (I), por ejemplo una célula tumoral, o una célula tisular, a partir de la cual se origina el tumor, se interrumpe, y se desencadena una fuerte respuesta inmunitaria generalizada dirigida contra las células del tumor y/o sus células tisulares. Dependiendo de la selección del componente (I), esta reacción inmunitaria celular está dirigida o bien exclusivamente contra el tumor o bien también contra las células tumorales incluyendo las células tisulares, a partir de las cuales se originan las células tumorales.

En otro aspecto, el objeto de la presente invención ha sido resuelto proporcionando un medicamento que comprende al menos un microorganismo de la invención que comprende los componentes genéticos (I) a (IV) ilustrados antes o al menos una composición farmacéutica como se define en la presente memoria.

En una realización preferida, se pueden utilizar los microorganismos de la invención para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de las condiciones fisiológicas y/o patofisiológicas seleccionadas del grupo que consiste en "división celular incontrolada, tumores malignos, tumores benignos, tumores sólidos, sarcomas, carcinomas, trastornos hiperproliferativos, carcinoides, sarcomas de Ewing, sarcomas de Kaposi, tumores cerebrales, tumores que se originan en el cerebro y/o el sistema nervioso y/o las meninges, gliomas, neuroblastomas, cáncer de estómago, cáncer de riñón, carcinomas de células de riñón, cáncer de próstata, carcinomas de próstata, tumores de tejido conectivo, sarcomas de tejidos blandos, tumores de páncreas, tumores de hígado, tumores de cabeza, tumores de cuello, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, osteosarcomas, retinoblastomas, timoma, cáncer testicular, cáncer de pulmón, carcinomas bronquiales, cáncer de mama, carcinomas de mama, cáncer intestinal, tumores colorrectales, carcinomas de colon, carcinomas de recto, tumores ginecológicos, tumores de ovario/tumores ováricos, cáncer uterino, cáncer cervical, carcinomas de cérvix, cáncer del corpus del útero, carcinomas del corpus, carcinomas endometriales, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer de piel, basaliomas, espinaliomas, melanomas, melanomas intraoculares, leucemia, leucemia crónica, leucemia aguda, linfomas, infección, infección viral o bacteriana, influenza, inflamación crónica, rechazo de órganos y/o enfermedades autoinmunitarias".

Las infecciones bacterianas comprenden, pero no están limitadas a, ántrax, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, enfermedad por rasguño de gato, cólera, difteria, tifus epidémico, impétigo, legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, infección por MRSA, nocardiosis, pertusis (tosferina), peste, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas (RMSF, por sus siglas en Inglés), salmonelosis, escarlatina, shigelosis, sífilis, tétanos, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus, infecciones del tracto urinario, enfermedades del corazón causadas por bacterias.

Las infecciones bacterianas comprenden, pero no están limitadas a, SIDA, complejo relacionado en el SIDA (ARC, por sus siglas en Inglés), viruela del pollo (varicela), catarro común, infección por citomegalovirus, fiebre de la garrapata de Colorado, fiebre Dengue, fiebre hemorrágica Ébola, enfermedad de manos, pies y boca, hepatitis, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV, influenza (gripe), fiebre Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica Marburg, mononucleosis infecciosa, paperas, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, rabia, rubeola, SRAS, viruela (variola), encefa-
litis viral, gastroenteritis viral, meningitis viral, pneumonia viral, enfermedad del Nilo Occidental, fiebre Amarilla.

Las inflamaciones crónicas o las enfermedades inflamatorias crónicas comprenden, pero no están limitadas a, colecistitis crónica, bronquiectasia, artritis reumatoide, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn), silicosis y otras pneumoconiosis.

Las enfermedades autoinmunitarias comprenden, pero no están limitadas a, síndromes generalizados tales como el SLE, síndrome de Sjögren, esclerodermia, artritis reumatoide y polimiositis así como síndromes locales, tales como IDDM, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, pénfigo vulgar, psoriasis, dermatitis atópica, síndrome atópico, asma, anemia hemolítica autoinmunitaria, esclerosis múltiple.

Los medicamentos correspondientes que comprenden al menos un microorganismo como se define en la presente memoria o al menos una composición farmacéutica como se define en la presente memoria de acuerdo con todas las realizaciones descritas en la presente memoria para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de las afecciones fisiológicas y/o patofisiológicas descritas y definidas en la presente memoria también están incluidos en la presente invención.

En otro aspecto, el objeto de la presente invención se ha resuelto proporcionando plásmidos o vectores de expresión que comprenden los componentes (I) a (IV) como se ilustra en la presente memoria. Se prefieren los microorganismos de la invención que portan al menos un plásmido o vector de expresión que comprende los componentes (I) a (IV) como se ilustra en la presente memoria.

En otro aspecto, el objeto de la presente invención se ha resuelto proporcionando un procedimiento para la producción de un microorganismo de la invención, donde se produce un plásmido o vector de expresión como se ilustra en la presente memoria, y se transforma un microorganismo con este plásmido o vector de expresión.

En otro aspecto, el objeto de la presente invención se ha resuelto proporcionando un kit farmacéutico que comprende al menos un microorganismo de la invención o una composición farmacéutica como se ha descrito antes o un medicamento como se ha descrito antes y un tampón farmacológicamente aceptable, preferiblemente un tampón carbonato.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') de la señal de secreción de hemolisina A (hlyA) de E. coli. El sitio NsiI está subrayado.

La Figura 2 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') de hemolisina B de E. coli (hlyB) del sistema de transporte de tipo I de hemolisina de E. coli.

La Figura 3 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') de hemolisina D de E. coli (hlyD) del sistema de transporte de tipo I de hemolisina de E. coli.

La Figura 4 representa la secuencia de nucleótidos (5'-3') del antígeno específico de próstata humana (PSA) sin péptido señal, número de acceso M26663 (ARNm de antígeno específico de próstata de Homo sapiens, cds completa), región 100-807 (péptido correspondiente: AA 26-261).

La Figura 5 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') de la subunidad B de la Toxina de Cólera (CtxB) sin péptido señal que abarque la región 204-494, número de acceso K01170 (genes toxA y toxB de Vibrio cholerae para las subunidades A2 (gamma) de enterotoxina de cólera.

La Figura 6 representa la secuencia de nucleótidos (5'-3') del dominio quinasa B-Raf (B-Raf KD) de la proteína B-raf humana (BRAF), número de acceso M95712 (ARNm de proteína B-raf de Homo sapiens (BRAF), cds completa), región 1403-2359 sin la región 1448-1477 (péptido correspondiente: AA 448-766 sin AA 463-472) que contiene la mutación V600E.

La Figura 7 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') del epítopo B-raf V600E restringido a HLA B27 humano.

La Figura 8 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') del constructo de fusión genética de CtxB-PSA-
HlyA.

La Figura 9 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') del constructo de fusión genética de Ctx-B-Raf V600E-HlyA.

La Figura 10 representa la secuencia de nucleótidos (5'\rightarrow3') del constructo de fusión genética de CtxB-dominio quinasa B-Raf V600E KD-HlyA.

La Figura 11 representa la expresión funcional y la secreción de proteínas de fusión PSA-CtxB en diferentes especies bacterianas recombinantes para pMKhly-PSA-CtxB.

La Figura 12 representa esplenocitos secretores de IFN-gamma como medida para las respuestas de las células T CD8^{+} y del sistema inmunitario innato (células NK) en ratones inmunizados con diferentes portadores para vacunas vivas.

La Figura 13 representa la reducción del volumen tumoral en respuesta a la inmunización con diferentes portadores de vacunas.

La Figura 14 representa esplenocitos secretores de IFN-gamma como medida de las respuestas de las células T CD8^{+} y del sistema inmunitario innato (células NK) en ratones inmunizados con diferentes vacunas vivas que portan diferentes coadyuvantes inmunológicos con constructos de fusión CtxB-OVA.

La Figura 15 representa la expresión eficaz y la secreción funcional de proteínas de fusión de hemaglutinina H11 de influenza de pollo - CtxB en una cepa de vacuna veterinaria que incluye la secuencia completa de la hemaglutinina H5N1 (HA1+HA2, representada, HA12), sin la región transmembrana (HA12c). Salmonella enterica serovar Typhimurium vacT (gyrA D87G) atenuada viva y Salmonella enterica serovar Enteritidis vacE, (cepa Sm24/Rif12/Ssq) atenuada viva, ambas de LOHMANN ANIMAL HEALTH GMBH & CO KG.

La Figura 16 representa la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CtxB-HA12c-HlyA.

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La Figura 17 representa la expresión y la secreción de la proteína de fusión utilizando el vector pMBKDC electroporado en la cepa Salmonella typhi Ty21 a y otras cepas bacterianas:

A)

calles A1-A3: Análisis de sobrenadante de acuerdo con TP StMoBKDC utilizando anticuerpo anti-B-Raf para la detección. Calle A1: S. typhi Ty21a pMoBKDC, A2: S. typhi Ty21a, A3: S. typhimurium aroA. La proteína de fusión BRaf-V600E KD-CtxB está marcada con la flecha superior y tiene el tamaño esperado de aprox. 48 kDa. Marcador de Proteína: Invitrogen BenchMark Pre-Stained Protein Ladder, núm. 10748-010.

B)

análisis equivalente al del apartado A, utilizando anticuerpo anti-HlyA recién producido como anticuerpo de detección. Calle 1, 2: constructos StMoPC, calle 3: S. typhi Ty21 a MoBKDC; calle 4: E. coli MoBKDC, calle 5: S. typhi Ty21 a, calle 6: S. typhimurium aroA. Marcador de Proteína: Invitrogen BenchMark Pre-Stained Protein Ladder, Núm. 10748-010, Lot. 1315592.

La Figura 18 representa la secuencia de nucleótidos completa (5'\rightarrow3') del vector vacío pMKhly1.

La invención se explica con más detalle por medio de los siguientes ejemplos.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción, expresión y secreción de proteínas de fusión PSA-CtxB en diferentes cepas de portadores bacterianos

Para probar la viabilidad y demostrar la eficacia del sistema de secreción de hemolisina de tipo I de E. coli para secretar proteínas de fusión de antígeno tumoral, en la presente antígeno específico de próstata (PSA), y componentes de toxina proteica, en la presente CtxB, como coadyuvante, se construyó una proteína de fusión PSA-CtxB como se describe en la presente memoria. Se sometieron a ensayo la expresión y la secreción en diferentes cepas bacterianas gram-negativas, que son potencialmente útiles como cepas de vacuna vivas en la terapia tumoral. La clonación biológica molecular se basa en el plásmido/vector de expresión pMOhly1, que ha sido descrito previamente (Gentschev et al., 2005; Gentschev et al., 1996, documento WO 03/072789).

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1A Construcción de derivado del vector de expresión pMOhly1 resistente a kanamicina

La sustitución de la casete de resistencia a ampicilina de pMOhly1 se realizó como se describe (Datsenko y Wanner, 2000).

En resumen, se utilizaron un cebador efector P1 (5'-GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT
TGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3') y un cebador antisentido P2 (5'-GCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAG
TTGCCTGACTCCCCATATGAATATCCTCCTTA-3') y el plásmido pKD4 como molde para la PCR para producir un fragmento que portaba el gen de resistencia a kanamicina (Kan^{R}) flanqueado por regiones homólogas al gen de resistencia a ampicilina (subrayado).

Se hizo crecer la cepa BW25114 de E. coli, que albergaba el plásmido pKD46 y el plásmido diana pMOhly1 a 37ºC en medio LB (Difco) con un suplemento de L-(+)-arabinosa al 0,2% durante 3-4 horas antes de la transformación del fragmento de la PCR.

Después de la transformación las células bacterianas se diseminaron sobre placas de agar LB que contenían 25 \mug/mL de kanamicina y se incubaron a 37ºC durante la noche.

Al día siguiente, se escogieron los clones de Kan^{R} y se incubaron durante 48 horas más en medio LB que contenía 50 \mug/mL de kanamicina para deshacerse de todos los plásmidos que conferían resistencia a ampicilina.

Finalmente, se seleccionaron los clones con un fenotipo sensible a Kan^{R} y ampicilina. El remplazo del gen Ap^{R} por la casete Kan^{R} se confirmó mediante PCR y secuenciación. El plásmido resultante se denominó pMKhly1.

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1B Clonación del plásmido pMKhly-PSA

Se utilizaron un cebador efector PSA-Nsi1 (5'-GATTGGTGATGCATCCCTCAT-3'; los sitios de restricción NsiI están subrayados) y un cebador anti-sentido PSA-Nsi2 (5'-GGTGCTCATGCATTGGCCACG-3') para amplificar un fragmento de ADN que codifica PSA mediante PCR. Las PCR se realizaron en un Ciclador Térmico 60 (Biometra, Göttingen, Alemania) durante 30 ciclos a 94ºC durante 1 min, 54ºC durante 1 min, y 72ºC durante 2 min.

Tras la digestión con la enzima de restricción NsiI, el fragmento de ADN, que portaba el gen psa, se insertó en el único sitio NsiI del vector de exportación pMKhly1. El plásmido resultante pMKhly-PSA se aisló de E. coli DH5alfa (Invitrogene, Alemania), se analizó mediante análisis de restricción y se secuenció.

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1C Clonación del plásmido pMKhly-PSA/CtxB

Se utilizaron el cebador efector Ptac-SalI (5'-AAAAAAGTCGACGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGC-3') y el cebador anti-sentido Ptac-NotI (5'-AAAAAAGCGGCCGCGAAATTGTTATCCGCT CACAATTCC-3') para amplificar mediante PCR un Fragmento de ADN de 201 pb que codificaba el promotor Ptac del Plásmido pGEX-6p-1 (Amersham Bioscience, Alemania). La PCR se realizó en el ciclador térmico T3 (Biometra, Alemania): durante 30 ciclos a 95ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, y 72ºC durante 90 s. Se utilizaron el cebador efector Rbs-NotI-directo (5'-AAAAAAGCGGCC GCTAAGGATGAATTATGATTAAATTAAAATTTGG-3') y el cebador anti-sentido ctb-SalI-inverso (5'-TTTATAGTCGACTTAATTTGCCATACT AATTGCGGCAATCGC-3') para amplificar mediante PCR el Fragmento de ADN de 413 pb que codifica el sitio de unión al ribosoma y la secuencia codificante completa de CtxB de V. cholerae EI tor. La PCR se realizó en un Ciclador Térmico T3 (Biometra, Alemania): etapa1: 30 ciclos a 95ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s, y 72ºC durante 2 min. Tras la purificación con el Kit de Purirficación por PCR Qiaquick (Qiagen, Alemania) y la digestión de ambos fragmentos con la enzima de restricción NotI, se ligaron los dos fragmentos dando como resultado el fragmento Ptac-ctxB de 594 pb. El fragmento resultante también se purificó y después de la digestión con la enzima de restricción SalI, se insertó el Fragmento Ptac-ctxB en el único sitio SalI del vector de exportación pMKhly-PSA. El plásmido resultante pMKhly-PSA/CtxB se aisló de E. coli DH5alfa (Invitrogene, Alemania), se analizó y se secuenció.

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1D Clonación del constructo de fusión PSA-CtxB-HlyAs

Se utilizaron el cebador efector 5'ctxB NsiI (5'-GCATATGCACA TGCATCACCTCAAAATATTACTGAT-3') y el cebador anti-sentido 3' ctxB SrfI NsiI (5'-GGCTTTTTTATATCTTATGCATGCCC GGGC ATTGCGGCAATCGC-3') (el sitio SrfI está en negrita) para amplificar mediante PCR un fragmento de ADN \sim300pb que representa el gen ctxB de V. cholerae EI tor. Tras la purificación con el Kit de Purificación por PCR QIAquick (Qiagen, Alemania) y la digestión con la enzima de restricción NsiI, se insertó el fragmento de ADN, que portaba el gen ctxB completo sin la secuencia señal N-terminal, en el sitio NsiI del vector de exportación pMKhly1. El plásmido resultante pMKhly-CtxB se aisló de E. coli DH5alfa (Life Technologies), se analizó y se secuenció. El gen psa humano se amplificó del plásmido pCDNA3PSA mediante PCR con los cebadores 5-PSA-Blunt (5'-GTGGGAGGCTGGGAGTGC-3') y 3-PSA-Blunt (5'-GGGGTTGGCCACGATGGT-3'). La PCR se llevó a cabo en un Ciclador Térmico 60 (Biometra, Göttingen, Alemania) durante 30 ciclos a 94ºC durante 1 min, 56ºC durante 1 min, y 72ºC durante 2 min. El ADN de 0,7 kb producto se clonó con posterioridad en el sitio SrfI de pMKhly-CtxB. El plásmido resultante pMKhly-CtxB-PSA se verificó mediante análisis de restricción y secuenciación.

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1E Expresión y secreción de proteínas de fusión en diferentes especies bacterianas

Utilizando procedimientos de electroporación convencionales, se transformó el plásmido pMKhly-CtxB-PSA en diferentes cepas bacterianas electro-competentes. Se escogieron colonias individuales resistentes a kanamicina y se hicieron crecer en medio BHI (Beckton Dickinson, USA: Cerebros de Ternera, Infusión a partir de 200 g, 6,0 g/L; Corazón de Vaca, Infusión a partir de 250 g, 9,8 g/L; Proteosa Peptona 10,0 g/L; Cloruro de Sodio 5,0 g/L; Dextrosa 2,0 g/L; Fosfato Disódico 2,5 g/L) a una densidad de 1x10^{9} células por ml. Después del crecimiento se centrifugaron 20 ml de cultivo durante 30 min a 4000 rpm (3000 g) en una centrífuga Heraeus a 4ºC. Se transfirieron 18 ml del sobrenadante a un tubo nuevo. Con posteriorirdad, se añadieron 1,8 ml de ATC (ácido tricloroacético, Applichem, Alemania), el líquido se mezcló y se incubó durante al menos 1 hora sobre hielo. Tras la incubación, la suspensión se centrifugó durante 30 minutos a 4000 rpm (3000 g) en una centrífuga Heraeus a 4ºC. El sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 1 ml de acetona p.a. (Applichem, Alemania). El producto precipitado se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm (3000 g) en una centrífuga Heraeus a 4ºC. El sedimento se secó al aire y se recogió en 150 \mul 5x de tampón Laemmli (Tris-HCl 70 mM, pH 6,8, glicerol del 40% (v/v), dodecilsulfato de sodio al 3% (v/v), 2-mercaptoetanol al 5% (v/v) y azul bromofenol al 0,05% (p/v)) con o sin beta-mercaptoetanol (Laemmli, 1970). Se utilizaron 20 \mul de solución para cada calle en SDS PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente (Transferencia Western) a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, Reino Unido) y se bloquearon durante la noche con PBS (Cloruro de Potasio 0,20 g/l, Dihidrógenofosfato de Potasio 0,20 g/l, Cloruro de Sodio 8,00 g/l, Dihidrogenofosfato de disodio anhidro 1,15 g/l) que contiene BSA al 1%. La membrana se lavó en PBS-Tween al 0,05%, se incubó con anticuerpo anti-PSA de conejo policlonal (1:750, DAKO, Dinamarca), anticuerpo contra CtxB (1:1000, Zytomed, Berlin, Alemania) o anticuerpo contra HlyAs (Gentschev et al., 1996)) y con posterioridad se incubó con anti-IgG de conejo acoplado a HRP (1/2.000; Dianova, Hamburg, Alemania) durante 1 h. La transferencia Western se desarrolló con el kit de aumento de la quimioluminiscencia (GE Healthcare Life Science, Alemania).

La Figura 11 representa la expresión funcional y la secreción de proteínas de fusión PSA-CtxB en una variedad de cepas bacterianas, incluyendo Escherichia coli spp., Salmonella dublin, Citrobacter spp, Salmonella typhi Ty21a, Salmonella typhimurium spp, Erwinia spp y Shigella flexneri spp.

La cepa de Salmonella typhi Ty21 a que expresaba y secretaba la proteína de fusión PSA-CtxB se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) como DSM 19244.

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Ejemplo 2 Respuesta inmunitaria y protección contra la sensibilización con células tumorales en ratones inmunizados con cepas de Salmonella que secretaban proteínas de fusión de antígenos tumorales y CtxB o CtxB sola

Por medio de los siguientes experimentos se demostró la eficacia protectora superior de las proteínas de fusión secretadas de antígenos tumorales y toxinas proteicas en un modelo de tumor en animal. Para este modelo, se comparó la cepa Salmonella typhimurium aroA (SL7207) pMKhly-CtxB-PSA, que expresaba y secretaba la proteína de fusión de CtxB-PSA con otras cepas de control.

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2A Procedimientos de Inmunización

Se inmunizaron ratones DBA/2 tres veces con un intervalo de 3 semanas. Para la inmunización con bacterias, los animales se pre-trataron aplicando 50 \mul de NaHCO_{3} al 7% intragástricamente para incrementar el pH intragástrico. De 5 a 10 minutos después del pre-tratamiento, se aplicaron 5x10^{8} bacterias insensibles a la kanamicina vivas en un volumen de 100 \mul de PBS intragástricamente. Como control, se inmunizaron ratones intramuscularmente con ADN plasmídico desnudo que codificaba PSA (pcDNA-PSA) como se describe (Fensterle et al., 2005).

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2B Respuestas de células T

Siete días después de la última inmunización, se prepararon los esplenocitos de los ratones inmunizados como se ha publicado previamente (Fensterle et al., 1999) haciendo pasar el bazo a través de una malla seguido de lisis de los eritrocitos. Se realizó el análisis ELISPOT para la detección de células T CD8^{+} específicas de PSA de acuerdo con un protocolo publicado por (Fensterle et al., 1999).

En resumen, para el análisis ex-vivo de las células T CD8^{+} específicas de PSA se recubrieron placas de nitrocelulosa de 96 pocillos (Millititer HA; Millipore, Bedford, MA) con 5 \mug/ml del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-IFN-gamma de ratón R4 (PharMingen) en 100 \mul de tampón carbonato (Fensterle et al., 1999), pH 9,6. Después de incubar durante la noche a 4ºC y bloquear con BSA al 1% en PBS, se añadieron 1x10^{5} esplenocitos de ratones vacunados en 100 \mul de RP10 (Fensterle et al., 1999) por pocillo.

Para el análisis de la respuesta de las células T CD8^{+} se utilizó el clon celular P815 que expresaba PSA, PPSA 24; en resumen, este clon expresa el PSA completo vía promotor de CMV codificado por el plásmido pCDNA3 (Fensterle et al., 2005). Después de la incubación durante 20-22 h a 37ºC, CO_{2} al 5% en presencia de 30 U/ml de IL-2, se lavaron las placas y se incubaron durante 2 h más con 100 \mul de mAb anti-IFN-gamma de ratón XMB1.2 biotinilado (0,25 \mug/ml, PharMingen). Las placas se lavaron y se incubaron durante 1 hora a 37ºC en presencia de 100 \mul de una dilución 1/20.000 de estreptavidina acoplada a fosfatasa alcalina (PharMingen). Las transferencias se visualizaron añadiendo 50 \mul de sustrato BCIP/NBT listo para su uso (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en agua. Las transferencias se contaron en un microscopio de disección con 3 aumentos.

La frecuencia de las células T específicas del péptido (CTL) se expresa como el número de células secretoras de IFN-gamma por 10^{5} esplenocitos. Para el análisis de las respuestas de las células T después de la re-estimulación, se re-estimularon 2,5 x 10^{7} esplenocitos con PSA irradiado con 2x10^{6} células P815 que expresaban PSA (Fensterle et al., 2005) en medio RP10 (Fensterle et al., 1999) en presencia de 60 U/ml de IL-2 recombinante durante 5 días. Se realizó el análisis ELISPOT como se ha descrito antes utilizando diferentes cantidades de células re-estimuladas (10^{5}, 3x10^{4}, 10^{4} o 3x10^{3} por pocillo) mezcladas con 4x10^{5} células alimentadoras (= esplenocitos recién preparados a partir de ratones DBA/2 no sometidos a tratamiento previo) y 10^{5} células PPSA24.

La inducción de una respuesta inmunitaria celular, especialmente de células T citotóxicas CD8^{+}, juega un importante papel para la eficacia de la terapia tumoral (Boon et al., 2006; Rosenberg, 2001). Por lo tanto, se sometió a ensayo primero la eficacia de la cepa bacteriana recombinante Salmonella typhimurium (SL7207) que porta un vector de expresión pMKhly-CtxB-PSA para inducir una respuesta inmunitaria de células T CD8^{+} específicas de
PSA.

Para este fin se inmunizaron 64 ratones DBA-2 hembra de 10-14 semanas de edad p.o. con SL7207/pMKhly-CtxB (n=10), SL7207/pMKhly-CtxB-PSA (n=10), SL7207/pMKhly-PSA (n=10), SL7207/pMKhly-PSA/CxtB (n=10),
SL7207/pMKhly1 (n=7) recombinantes y pcDNA3-PSA desnudo (n=10) como control positivo como se describe en la presente memoria.

La Figura 12 muestra los datos del ELISPOT que revelan que los ratones inmunizados con ADN mostraron profundas respuestas de las células T CD8^{+}. Después de la re-estimulación, se detectaron respuestas inmunitarias marcadas en los animales vacunados con Salmonella que secretaba proteína PSA fusionada a CtxB, pero no en las cepas que secretaban PSA solo o PSA y CtxB por separado. De manera interesante, los animales vacunados con Salmonella que secretaba la toxina CtxB sola también mostraron respuestas inmunitarias significativas después de la re-estimulación. Estas respuestas se deben muy probablemente a las células NK u otras células del sistema inmunitario innato, que no reconocen específicamente la línea celular diana. Por lo tanto, a partir de los datos para CtxB secretado solo se puede concluir que la respuesta inmunitaria observada para la proteína de fusión CtxB-PSA secretada (esplenocitos secretores de IFN-gamma) está compuesta por una respuesta de las células T CD8^{+} así como de una profunda respuesta del sistema inmunitario innato (muy probablemente células NK).

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2C Protección contra la sensibilización con células tumorales

Para analizar la capacidad protectora de la inmunización, se inmunizaron 6-7 ratones por grupo de acuerdo con el programa anterior. Dos semanas después de la tercera inmunización, los ratones fueron sensibilizados con PPSA 24 (véase más arriba) por medio de dos inyecciones s.c. de 1x10^{6} células en cada flanco de piel abdominal afeitado. Los ratones fueron controlados a lo largo de un período de 14 días en busca de la aparición de tumores y el volumen del tumor fue evaluado midiendo el diámetro mayor (a) y menor (b) del tumor. El volumen del tumor se calculó como el elipsoide de rotación utilizando la siguiente fórmula:

V = \frac{\pi}{6} * a * b^{2},

\hskip0.3cm

a >b.

Los resultados se analizaron en cuanto a la significación mediante un ANOVA de una vía y un post-ensayo de comparación múltiple de Dunnett utilizando el soporte lógico Graph Pad Prism. El post-ensayo se realizó solamente cuando el ANOVA reveló significación.

La Figura 13 presenta los resultados como las medias +/- DT. Los días 6, 9, 12 y 14 se observaron efectos protectores significativos. Como se esperaba, la vacunación con ADN desnudo incluyó como control ratones completamente protegidos frente al crecimiento tumoral. Sin embargo, la vacunación con ADN desnudo muestra a lo sumo una eficacia moderada en seres humanos. Con respecto a los constructos bacterianos, la cepa de vacuna SL7207/pMKhly-CtxB-PSA (que expresaba y secretaba la proteína de fusión CtxB-PSA) resultó ser la más eficaz. Ésta redujo significativamente el volumen tumoral el día 9, 12 y 14 después de la sensibilización tumoral. A destacar, también la cepa SL7207/pMKhly-CtxB redujo el crecimiento tumoral con valores comparables a SL7207/pMKhly-CtxB-PSA el día 14. Aunque no fue significativo, este efecto retardado es bastante compatible con la respuesta celular que se midió en el análisis ELISPOT. Además, también la cepa SL7207/pMKhly-PSA logró una protección significativa el día 14 lo que indica, que también esta cepa inducía una respuesta de las células T que estaba por debajo del umbral de detección. En contraste, la cepa SL7207/pMKhly-PSA/CxtB no indujo un efecto relevante y permaneció en el mismo intervalo que SL7207/pMKhly1 sola.

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Ejemplo 3 Expresión y secreción de una proteína de fusión de oncogén-toxina en S. typhi Ty21 a

De un modo análogo al ejemplo 1, se utilizó otro antígeno tumoral, el dominio quinasa del oncogén B-Raf V600E con una deleción de 10 aa en el dominio quinasa (dominio de muerte de quinasa (KD) de la quinasa BRaf V600E, o brevemente BRaf* KD, más brevemente BKD). Se construyó una proteína de fusión BKD-CtxB de este oncogén y los componentes de toxina proteica, aquí CtxB, como coadyuvante, como se describe en la presente memoria. Se demostraron la expresión y secreción en la cepa de vacuna humana S. typhi Ty21 a. La clonación molecular se basa en el plásmido/vector de expresión pMOhly1, que ha sido descrito previamente (Gentschev et al., 2005; Gentschev et al., 1996) y el procedimiento de clonación es análogo al del ejemplo 1 de esta solicitud. El vector resultante se denomina pMBKDC. La secuencia de la proteína de fusión se proporciona en la Figura 10.

La Figura 17 representa la expresión y secreción de la proteína de fusión utilizando el vector pMBKDC electroporado en la cepa Salmonella typhi Ty21 a y otras cepas bacterianas.

La cepa Salmonella typhi Ty21 a que expresa y secreta la proteína de fusión BKD-CtxB fue depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) como DSM 19245.

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Ejemplo 4 Comparación de un constructo de fusión OVA-CtxB con diferentes coadyuvantes inmunológicos codificados genéticamente

Para comparar la eficacia inmunológica de las proteínas de fusión de toxina-antígeno secretadas por vacunas vivas, se construyó una proteína de fusión que incluía un antígeno ampliamente utilizado para estudios inmunológicos, ovalbúmina (OVA) y CtxB.

Se utilizaron el cebador efector NsiI-OVA-directo 5'-CAT GTA TGC ATT AGC CAT GGT ATA CCT GG-3' y el cebador anti-sentido NsiI-OVA-inverso 5'-TTT TTT ATG CAT AAG GG AAA CAC CAC ATC TGC C-3' para amplificar mediante PCR un fragmento de ADN de 1033 pb que representaba el gen ova (NM205152). Tras la purificación con el Kit de Purificación por PCR QlAquick (Qiagen, Alemania) y la digestión con la enzima de restricción NsiI, se insertó el fragmento de ADN, que portaba el gen ova completo sin la secuencia señal N-terminal, en el único sitio NsiI del vector de exportación pMKhly1. El plásmido resultante pMKhly-Ova se aisló a partir de E. coli DH5alfa (Life Technologies), se analizó y se secuenció.

Se utilizaron el cebador efector 5' ctxB NsiI (5'-GCATATGCACATGCATCACCTCAAAATATTACTGAT-3') y el cebador anti-sentido 3' ctxB SrfI NsiI (5'-GGCTTTTTTATATCTTATGCATGCCC GGGC ATTGCGGCAATCGC-3') (el sitio SrfI está en negrita) para amplificar mediante PCR un fragmento de \sim300 pb que representaba el gen ctxB de V. cholerae El tor. Tras la purificación con el Kit de Purificación por PCR QlAquick (Qiagen, Alemania) y la digestión con la enzima de restricción NsiI, se insertó el fragmento de ADN, que portaba el gen ctxB completo sin la secuencia señal N-terminal, en el único sitio NsiI del vector de exportación pMKhly1. El plásmido resultante pMKhly-CtxB se aisló a partir de E. coli DH5alpha (Life Technologies), se analizó y se secuenció. Se amplificó el gen ova a partir del plásmido pCl-OVA mediante PCR utilizando los cebadores 5-OVA-SfrI GCC ATC ATG TCA GCT CTA y 3-OVA-SfrI AGG GGA AAC ACA TCT GCC. La PCR se llevó a cabo en un Ciclador Térmico 60 (Biometra, Göttingen, Alemania) durante 30 ciclos de 1 min a 94ºC, de 1 min a 49ºC, y de 2 min. 30 seg a 72ºC. El producto de ADN de 1,1 kb se clonó con posterioridad en el sitio SrfI de pMKhly-CtxB. El plásmido pMKhly-CtxB-OVA resultante se examinó mediante análisis de restricción y secuenciación.

La capacidad de esta proteína de fusión para lograr las respuestas inmunitarias Th1 se comparó con las del vector pMKhly codificado que secretaba OVA sola combinado con plásmidos de liberación de ADN (que codificaban las proteínas bajo el control de un promotor eucariótico) que codificaba los interferones (IFN-gamma), las interleuquinas (IL-12) y las quimioquinas (IP-10).

Los procedimientos de inmunización y los análisis ELISPOT se realizaron como se ha descrito más arriba. En resumen, se inmunizaron oralmente ratones C57BU6 tres veces con las diferentes cepas. Siete días después de la inmunización final, los esplenocitos se separaron, se re-estimularon durante 5 días y se analizaron en un análisis ELISPOT. Para la estimulación de los esplenocitos, se utilizaron células pulsadas con el péptido SIINFEKL (las letras representan los aminoácidos), el epítopo de la ovoalbúmina del MHC-I restringido a H-2^{b}.

La Figura 14 muestra la superior eficacia de la proteína de fusión que comprendía ovalbúmina de pollo (OVA) y CtxB en la inducción de respuestas de las células T CD8+ específicas de OVA y las respuestas del sistema inmunitario potencialmente innato en comparación con los constructos que liberaban simultáneamente IFN-gamma o IP-10. Ésta muestra una eficacia similar a la de la cepa con el constructo IL-12 liberado simultáneamente.

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Ejemplo 5 Expresión y secreción de antígenos virales

La idoneidad de los microorganismos de la invención para la expresión y secreción de cualquier antígeno (no tumoral) se demostró por medio de la expresión de la proteína hemaglutinina H1 del virus de la influenza de pollo H5N1 fusionada a CtxB en una cepa de vacuna veterinaria, Salmonella typhimurium VacT.

Se utilizaron el cebador efector 5'-HA-G: 5'- ATC TGT CAA ATG GAG AAA -3' y el cebador anti-sentido 3-HA12C: 5'-TAC TCC ACT TAT TTC CTC TCT-3' en la PCR, amplificando un fragmento de ADN que codificaba la H5 sin el dominio de membrana C-terminal (H12C). El producto de la PCR se clonó con posterioridad en el sitio SrfI de pMKhly-CtxB. El plásmido pMKhly-CtxB-H12C resultante se examinó mediante análisis de restricción y secuenciación. La cepa S. typhimurium VacT/pMKhly-CtxB-H12C expresó y secretó eficazmente la proteína H5 híbrida, como se muestra mediante inmunotransferencia con anticuerpos policlonales originados contra CtxB y HlyA (Fig. 2). La cantidad de H5 secretada fue de 2-3 \mug de proteína/ml de sobrenadante en las condiciones experimentales.

Las bacterias se hicieron crecer en medio BHI a una densidad de 1x10^{9} células por ml. Se centrifugaron 20 ml del cultivo durante 30' a 4000 rpm (3000 g) y 4ºC en una centrífuga Hereaus. Se transfirieron 18 ml del sobrenadante a un tubo nuevo. Con posterioridad, se añadieron 1,8 ml de TCA (ácido tricloroacético, Applichem, Alemania); el líquido se mezcló y se incubó sobre hielo durante al menos 1 hora. Tras la incubación, la suspensión se centrifugó durante 30' a 4000 rpm (3000 g) y 4ºC en una centrífuga Hereaus. El sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 1 ml de Aceton p.a. (Applichem, Alemania); el producto precipitado se centrifugó durante 10' a 4000 rpm (3000 g) y 4ºC en una centrífuga Hereaus. El sedimento se secó al aire y se recogió en 150 \mul 5x tampón de Laemmli. Se utilizaron 20 \mul de la solución para cada calle de la SDS PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, Reino Unido) y se bloquearon durante la noche con PBS que contenía BSA al 1%. La membrana se lavó en PBS-Tween al 0,05%, se incubó con anticuerpo anti-CtxB de conejo policlonal (1:1000, Zytomed, Berlin, Alemania) o anticuerpo HlyAs (Gentschev et al., 1996) y con posterioridad se incubó con anti-IgG de conejo acoplado a HRP (1/2.000; Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 1 h. La transferencia Western se llevó a cabo utilizando el kit de aumento de la quimioluminiscencia (GE Healthcare Life Science, Alemania).

La Figura 15 representa la expresión eficaz y la secreción funcional de la proteína de fusión HA12C-CtxB en la cepa de vacuna veterinaria, Salmonella typhimurium VacT.

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Ejemplo 6 Expresión y secreción de proteínas de fusión de coadyuvantes de toxina y antígenos tumorales por medio de sistemas de secreción de tipo III

Numerosas bacterias Gram negativas portan sistemas de secreción de tipo III que pueden ser explotados para la secreción de antígenos. Normalmente, estos sistemas pueden ser explotados para inyectar directamente antígenos heterólogos en las células. En este ejemplo, un componente de toxina de Yersinia que sirve como señal de secreción (YopE) es fusionado genéticamente al fragmento de la subunidad B de la enterotoxina lábil al calor (LT-B) como coadyuvante y un antígeno tumoral, PSA. Este constructo va a ser expresado en cepas de Yersinia preferiblemente atenuadas, adecuadas, lo que conduce a la secreción de la proteína de fusión por la maquinaria de secreción de tipo III endógena por medio de la secuencia señal YopE.

En este ejemplo, se clona la fusión genética YopE18-LT-B-PSA en el sitio EcoRI del plásmido paCYC184, para utilizar el constructo con la misma orientación que se utiliza el gen cat proporcionando un producto expresado por el promotor cat codificado por el plásmido (http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/mappacyc184.htm). Para intensificar la expresión, se puede utilizar cualquier promotor adecuado.

A continuación, se ilustra un procedimiento de clonación. Se amplifica el ADN cromosómico de E. coli que incluye la subunidad B de la enterotoxina lábil al calor o un vector que incluye esta secuencia (número de acceso GenBank AF242418) utilizando los siguientes cebadores en una reacción de PCR: Eco-yope18-f (que incluye el sitio EcoRI + la secuencia señal YopE18):

5'-CTGAATTCATGAAAATATCATCATTTATTTCTACATCACTGCCCCTGCCGGCA TCAGTGTCAAATAAA
GTAAAATGTTATGTTTTAT3'

(5' región en negro: sitio EcoRI + 3 bases 5', en rojo: secuencia que codifica la señal de secreción para la secreción de tipo III de la proteína YopE (aa 1-18), Acceso GenBank M92066; región en cursiva: región de homología del gen LT-B (acceso GB AF242418), bases 4-28). Cebador inverso fosforilado LT-B-r:

5' GTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTGAATTGG-3' (hebra inversa 372-341 de GB AF242418).

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Paralelamente, se amplifica la secuencia de PSA como se describe en esta solicitud a partir del vector pMK CtxB-PSA utilizando los siguientes cebadores:

cebador directo fosforilado psa-f: 5'-GTGGGAGGCTGGGAGTGCGAG-3'

cebador inverso psa-eco-r: 5' CCTGAATTCTTAGACGTGATACCTTGAAGCAC

(5' en negro: sitio EcoRI + 3 bases 5', en azul: codón de terminación, en negro: región 3' de la secuencia PSA, esta solicitud).

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Con posterioridad, los dos fragmentos se ligan con una ADN Ligasa en las condiciones apropiadas. Tras la ligación, el nuevo fragmento se amplifica en una segunda reacción de PCR utilizando los cebadores Eco-yope18-f y PSA-Eco-R descritos antes.

El fragmento resultante se purifica utilizando un kit de purificación por PCR adecuado para separar el tampón y los oligonucleótidos y con posterioridad se digiere con la enzima EcoRI en condiciones de reacción adecuadas. El fragmento de 1040 pb resultante se purifica utilizando la electroforesis en gel de agarosa y se liga en el vector paCYC184 digerido con EcoRI. Después de secuenciar los clones sensibles a cm, resistentes a tetraciclina, se selecciona un clon que tiene la secuencia correcta integrada en la misma orientación que el gen cm y se transforma en una cepa de Yersinia adecuada utilizando la electroporación. Esta cepa de vacuna secretará la fusión LT-B-PSA por medio de su sistema de secreción de tipo III endógeno.

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Ejemplo 7 Expresión y secreción de fusiones de Toxina-Antígeno en bacterias Gram positivas

Las bacterias Gram positivas y negativas tienen diferentes pre-requisitos para la secreción. Las bacterias Gram negativas poseen dos membranas y por lo tanto es obligatoria una maquinaria de secreción además de las señales de secreción para una secreción completa. En el caso de las bacterias Gram positivas, es suficiente una secuencia de una señal de secreción.

En este ejemplo se describe un sistema para la secreción de una fusión de Toxoide del Tétanos-PSA en Listeria utilizando la señal de secreción p60.

En una primera etapa, se digiere el vector pUC18(PS)actAOVATinlA (Loeffler et al., 2006) utilizando NsiI y con posterioridad se trata con Exonucleasa 3'-5' en las condiciones apropiadas. Finalmente, el fragmento se purifica mediante electroforesis en gel de agarosa.

Paralelamente, se amplifica el fragmento C del toxoide del tétanos (núm. de acceso GenBankM12739) a partir de una fuente adecuada, p. ej. ADN genómico de una cepa de Clostridium tetanii utilizando los siguientes cebadores fosforilados:

tetc directo: 5'-TAAAAATCTGGATTGTTGGGTTG-3', mientras la base adicional subrayada es para asegurar el correcto marco de la fusión.

tetc inverso: 5'-ATCATTTGTCCATCCTTCATCTG-3'.

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El fragmento BRAF KD se amplifica a partir del plásmido pMO BKDC descrito en la solicitud utilizando los siguientes cebadores fosforilados:

br directo: 5'-GATTGGGAGATTCCTGATG-3'

br inverso: 5'-CCCGTGGACAGGAAACGCACC-3'.

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Ambos fragmentos se purifican utilizando un kit de purificación por PCR adecuado y con posterioridad se ligan con ADN ligasa en las condiciones adecuadas. Tras la ligación, el fragmento se purifica de nuevo utilizando un kit de purificación por PCR adecuado y se amplifica utilizando el cebador tetc directo y el br inverso. Tras la amplificación, el fragmento de 2280 pb resultante se purifica mediante electroforesis en gel de agarosa y se liga en el fragmento de pUC18(PS)actAOVATinlA obtenido con la exonucleasa 3'-5' NsiI. Después de la ligación y transformación en E. coli, se selecciona un clon que porta el fragmento en marco. Con posterioridad, el plásmido se corta utilizando PstI y SacI y el fragmento de 2837 pb se purifica utilizando la electroforesis en gel y se liga en el vector pSP118 digerido con PstI y SacI y purificado (Loeffler et al., 2006). El vector resultante, pSP118-act-TetC-BRaf*KD es transformado en una cepa de Listeria que porta una deleción trpS p. ej. Listeria monocytogenes delta trps delta aroA/B (Loeffler et al., 2006). En este entorno, el plásmido es estabilizado por medio del plásmido basado en trpS ("Sistema letal equilibrado") y el plásmido codifica una lisina de fago lo que conduce a la lisis intracelular de la cepa. La casete act-TetC-BRaf*KD es expresada principalmente en células anfitrionas eucarióticas bajo el control del promotor actA, que tiene cierta pérdida extracelular (Loeffler et al., 2006). La secuencia señal actA de la casete conduce a la secreción de la proteína de fusión TetC-BRaf*KD.

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Ejemplo 8 Células eucarióticas que secretan fusiones de toxina-antígeno

En este ejemplo, se construye una línea celular eucariótica, p. ej. una línea celular tumoral, que secreta una proteína de fusión CtxB-PSA. Para este fin, se emplea una señal de secreción universal (documento U.S. 6.733.997), que, en principio, permite la secreción de la correspondiente casete de expresión en células de diferente origen, incluyendo células de mamífero, levadura y células procarióticas.

En una primera etapa, se amplifica la fusión CtxB-BRaf* KD a partir del plásmido pMO BKDC (esta solicitud) utilizando los siguientes cebadores:

CB-directo: 5'-atcGGATCCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGC-3' (minúsculas: espaciador, subrayado: sitio BamHI, mayúsculas: CtxB 5')

CB-inverso: 5'-tagGGATCC TTAGTGGACAGGAAACGCACCATATCC-3' (minúsculas: espaciador, subrayado: sitio BamHI, cursiva: codón de terminación, mayúsculas: BRaf* KD 3').

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Con posterioridad, el producto de la PCR se purifica utilizando un kit de purificación por PCR adecuado y con posterioridad se digiere parcialmente (el fragmento contiene un sitio BamHI interno) con BamHI. El fragmento de 1231 pb del producto digerido parcial se aísla por medio de electroforesis en gel de agarosa y con posterioridad se liga en el plásmido pVtgEGFP digerido con BamHI y purificado en gel (Solicitud de Patente de los Estados Unidos 6733997). Posteriormente, se selecciona un clon que porta la orientación en marco con Vtgss y se denomina pVtgCtxBRAf. Este plásmido se puede transformar por medio de electroporación en una línea celular eucariótica, que se puede seleccionar por medio de la casete de selección kan/neo. Las líneas celulares pueden ser líneas celulares establecidas como líneas de cáncer para su uso como vacunas para el cáncer heterólogas o células tumorales derivadas de pacientes para su uso como vacunas contra el cáncer autólogas.

\newpage

En cualquier caso, la señal de secreción Vtgss codificada por el vector pVtgEGFP fusionado genéticamente a CtxB-BRaf* KD dará como resultado la secreción de la proteína de fusión.

Utilizando un enfoque similar, también se pueden expresar proteínas de fusión en levaduras. Como ejemplo, se demuestra una estrategia de clonación modificada como la representada en la fig. 11 del documento U.S. 6.733.997. En la primera etapa, se escinde la casete que contiene la fusión Vtgss-CtxB-BRaf*KD del plásmido pVtgCtxBRAf descrito antes por medio de EagI y Eco47III y se inserta en el vector pBSPGK (documento U.S. 6.733.997, fig. 11). Posteriormente, el vector resultante se digiere con SacI y HindIII y el fragmento que incluye el elemento PGK y la fusión Vtgss-CtxB-BRaf*KD se integra en la región correspondiente del vector pYEX-S1 análoga a la descripción del documento U.S. 6.733.997 (fig. 11). El plásmido resultante se puede transformar mediante electroporación en cepas de levadura como Saccharomyces cerevisiae. La levadura expresará y secretará la proteína de fusión y se puede utilizar para la vacunación.

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Abreviaturas

ABC

casete de unión a ATP

AIDA

adhesina implicada en la adherencia difusa

APC

célula presentadora de antígenos

aroA

gen aroA

AT

Toxina alfa

ATP

adenosina trifosfato

B-Raf KD

dominio quinasa B-Raf

BSA

albúmina de suero bovino

Cag A

proteína de virulencia asociada a la enfermedad principal de Helicobacter pylori

CPE

enterotoxina de Clostridium perfringens

CpG

secuencias de ADN que contienen secuencias de ADN inmunoestimuladoras hipometiladas que incluyen motivos CpG

CT/Ctx

Toxina del Cólera

CTB/CtxB

subunidad B de la Toxina del Cólera

CTL

células T CD8^{+} citotóxicas (células T asesinas)

CMV

Citomegalovirus

ADN

ácido desoxirribonucleico

ds

doble hebra

DT/Dtx

Toxina de la Difteria

E. coli

Escherichia coli

EBV

Virus de Epstein Barr

Receptor GM-1

Receptor 1 de Monosialogangliósido

HA

hemaglutinina

HCV

Virus de la Hepatitis C

HIV

virus de la inmunodeficiencia humana

Hly

hemolisina

HPV

virus del Papiloma Humano

HT

Toxina Hemorrágica

i.d.

intradérmicamente

i.m.

intramuscularmente

i.p.

intraperitonealmente

IFN

interferón

IgA

Inmunoglobulina isotipo A

IgG

Inmunoglobulina isotipo G

IL

interleuquina

KD

dominio de muerte quinasa

LPS

lipopolisacárido

LT

enterotoxina lábil al calor de E. coli

LT

toxina Letal

LTB

subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli

mAb

anticuerpo monoclonal

MHC

complejo principal de histocompatibilidad

célula NK

célula asesina natural

célula NKT

célula T asesina natural

PAGE

electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS

solución salina tamponada con fosfato

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PE

Exotoxina A de Pseudomonas

PSA

antígeno específico de próstata

PT/Ptx

Toxina Pertussis

ARN

ácido ribonucleico

s.c.

subcutáneamente

SDS

dodecilsulfato de sodio

Sec

ruta secretora (Sec) general

ss

hebra sencilla

ST

enterotoxina estable al calor de E. coli

ST/Stx

Toxina Shiga

STB/StxB

subunidad B de la Toxina Shiga

T3SS

sistema de secreción de tipo III

Tat

translocación de la doble arginina

TCA

ácido tricloroacético

Th1 (célula)

células T CD4^{+} inflamatorias

Th2 (célula)

células T CD4^{+} coadyuvantes

TSST-1

Toxina de síndrome de choque tóxico

TT

Toxina del Tétanos

VT

Toxina Vero

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Literatura

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 708

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 927

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 1302

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> secuencia de ADN artificial

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<400> 36

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37

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<210> 37

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<211> 684

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> secuencia de ADN artificial

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<400> 37

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38

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<210> 38

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<211> 1521

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> secuencia de ADN artificial

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<400> 38

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39

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<210> 39

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<211> 2169

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> secuencia de ADN artificial

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<400> 39

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40

41

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<210> 49

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<211> 12672

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> secuencia de ADN artificial

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<400> 40

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42

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47

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49

Claims (19)

1. Un microorganismo como portador de secuencias de nucleótidos para antígenos y toxinas proteicas que comprende los siguientes componentes:

(I)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada; y

(II)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica; y

(III)

a)

al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o que codifica al menos una secuencia señal que permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o

b)

opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado; y

(IV)

al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más de los componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular;

donde cualquiera de los componentes (I) a (IV) puede estar presente una vez o varias veces y si un componente de los componentes (I) a (IV) está presente varias veces puede ser independientemente idéntico o diferente; y

donde el componente (I) y el componente (II) no son idénticos, esto es el componente (I) no codifica al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica.

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2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en "bacterias, bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, células eucarióticas" y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en "Escherichia spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio spp., Vibrio cholerae, Listeria spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Shigella flexneri, Yersinia spp, Pseudomonas spp", donde preferiblemente la virulencia del microorganismo está atenuada.

3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 2, donde Vibrio cholerae se excluye como microorganismo.

4. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "receptores; porción extracelular, transmembrana o intracelular de un receptor; molécula de adherencia; porción extracelular, transmembrana o intracelular de una molécula de adherencia; proteína transductora de la señal; proteína del ciclo celular; factor de transcripción; proteína de diferenciación; proteína embrionaria; proteína viral; alergeno; proteína de patógeno microbiano; proteína de patógeno eucariótico; proteína antigénica de cáncer de testículo; proteína antigénica tumoral; y/o proteína específica de células tisulares",

donde la célula tisular se selecciona del grupo que consiste en "glándula tiroidea, glándula mamaria, glándula salivar, nódulo linfoide, glándula mamaria, mucosa de la túnica gástrica, riñón, ovario, próstata, cérvix, túnica serosa de la vesícula urinaria y lunares".

5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 4, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "Her-2/neu, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos, receptor de midquinas, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta, receptor de lactoferrina, mielina básica, alfa-lactalbúmina, GFAP, proteína ácida fibrilar, tirosinasa, EGR-1, MUC1, c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, N-Ras, K-Ras, H-Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A1, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IAO2, XIAP, ML-IAP LIVIN, survivina, APAF-1, ciclina D(1-3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1-5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, Akt, P13K, mTOR, p53 y homólogos, C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Sp1, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, PAP; PSMA; STEAP; MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA, MART, Gp100, tirosinasa, GRP, TCF-4, antígenos virales de los virus HIV, HPV, HCV, HPV, VEB, CMV, VES, virus influenza, virus influenza de tipo A, virus influenza de tipo A (H5N1) y (H3N2), virus influenza de tipo B, virus influenza de tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), neuramidasa, p60, LLO, ureasa, CSP, calflagina y/o CPB" o donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo de quinasas que consisten en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos (números de acceso entre paréntesis): AAK1 (NM 014911), AATK (NM 004920), ABL1 (NM 005157), ABL2 (NM 005158), ACK1 (NM 005781), ACVR1 (NM 001105), ACVR1B (NM 020328), ACVR2 (NM 001616), ACVR2B (NM 001106), ACVRL1 (NM 000020), ADCK1 (NM 020421), ADCK2 (NM 052853), ADCK4 (NM 024876), ADCK5 (NM 174922), ADRBK1 (NM 001619), ADRBK2 (NM 005160), AKT1 (NM 005163), AKT2 (NM 001626), AKT3 (NM 005465), ALK (NM 004304), ALK7 (NM 145259), ALS2CR2 (NM 018571), ALS2CR7 (NM 139158), AMHR2 (NM 020547), ANKK1 (NM 178510), ANKRD3 (NM 020639), APEG1 (NM 005876), ARAF (NM 001654), ARK5 (NM 014840), ATM (NM 000051), ATR (NM 001184), AURKA (NM 003600), AURKB (NM 004217), AURKC (NM 003160), AXL (NM 001699), BCKDK (NM 005881), BCR (NM 004327), BIKE (NM 017593), BLK (NM 001715), BMPR1A (NM 004329), BMPR1B (NM 001203), BMPR2 (NM 001204), BMX (NM 001721), BRAF (NM 004333), BRD2 (NM 005104), BRD3 (NM 007371), BRD4 (NM 014299), BRDT (NM 001726), BRSK1 (NM 032430), BRSK2 (NM 003957), BTK (NM 000061), BUB1 (NM 004336), BUB1B (NM 001211), CABC1 (NM 020247), CAMK1 (NM 003656), CaMK1b (NM 198452), CAMK1D (NM 020397), CAMK1G (NM 020439), CAMK2A (NM 015981), CAMK2B (NM 001220), CAMK2D (NM 001221), CAMK2G (NM 001222), CAMK4 (NM 001744), CAMKK1 (NM 032294), CAMKK2 (NM 006549), CASK (NM 003688), CCRK (NM 012119), CDC2 (NM 001786), CDC2L1 (NM 001787), CDC2L5 (NM 003718), CDC42BPA (NM 014826), CDC42BPB (NM 006035), CDC7L1 (NM 003503), CDK10 (NM 003674), CDK11 (NM 015076), CDK2 (NM 001798), CDK3 (NM 001258), CDK4 (NM 000075), CDK5 (NM 004935), CDK6 (NM 001259), CDK7 (NM 001799), CDK8 (NM 001260), CDK9 (NM 001261), CDKL1 (NM 004196), CDKL2 (NM 003948), CDKL3 (NM 016508), CDKL4 (NM 001009565), CDKL5 (NM 003159), CHEK1 (NM 001274), CHUK (NM 001278), CIT (NM 007174), CLK1 (NM 004071), CLK2 (NM 003993), CLK3 (NM 003992), CLK4 (NM 020666), CRK7 (NM 016507), CSF1R (NM 005211), CSK (NM 004383), CSNK1A1 (NM 001892), CSNK1D (NM 001893), CSNK1E (NM 001894), CSNK1G1 (NM 022048), CSNK1G2 (NM 001319), CSNK1G3 (NM 004384), CSNK2A1 (NM 001895), CSNK2A2 (NM 001896), DAPK1 (NM 004938), DAPK2 (NM 014326), DAPK3 (NM 001348), DCAMKL1 (NM 004734), DCAMKL2 (NM 152619), DCAMKL3 (XM 047355), DDR1 (NM 013993), DDR2 (NM 006182), DMPK (NM 004409), DMPK2 (NM 017525.1), DYRK1A (NM 001396), DYRK1B (NM 006484), DYRK2 (NM 006482), DYRK3 (NM 003582), DYRK4 (NM 003845), EEF2K (NM 013302), EGFR (NM 005228), EIF2AK3 (NM 004836), EIF2AK4 (NM_001013703), EPHA1 (NM 005232), EPHA10 (NM 001004338), EPHA2 (NM 004431), EPHA3 (NM 005233), EPHA4 (NM 004438), EPHA5 (NM 004439), EPHA6 (XM 114973), EPHA7 (NM 004440), EPHA8 (NM 020526), EPHB1 (NM 004441), EPHB2 (NM 017449), EPHB3 (NM 004443), EPHB4 (NM 004444), EPHB6 (NM 004445), ERBB2 (NM 004448), ERBB3 (NM 001982), ERBB4 (NM 005235), ERK8 (NM 139021), ERN1 (NM 001433), ERN2 (NM 033266), FASTK (NM 025096), FER (NM 005246), FES (NM 002005), FGFR1 (NM 000604), FGFR2 (NM 022970), FGFR3 (NM 000142), FGFR4 (NM 022963), FGR (NM 005248), FLJ23074 (NM 025052), FLJ23119 (NM 024652), FLJ23356 (NM 032237), FLT1 (NM 002019), FLT3 (NM 004119), FLT4 (NM 002020), FRAP1 (NM 004958), FRK (NM 002031), FYN (NM 002037), GAK (NM 005255), GPRK5 (NM 005308), GPRK6 (NM 002082), GPRK7 (NM 139209), GRK4 (NM 005307), GSG2 (NM 031965), GSK3A (NM 019884), GSK3B (NM 002093), GUCY2C (NM 004963), GUCY2D (NM 000180), GUCY2F (NM 001522), H11 (NM 014365), HAK (NM 052947), HCK (NM 002110), HIPK1 (NM 152696), HIPK2 (NM 022740), HIPK3 (NM 005734), HIPK4 (NM 144685), HRI (NM 014413), HUNK (NM 014586), ICK (NM 016513), IGF1R (NM 000875), IKBKB (NM 001556), IKBKE (NM 014002), ILK (NM 004517), INSR (NM 000208), INSRR (NM 014215), IRAK1 (NM 001569), IRAK2 (NM 001570), IRAK3 (NM 007199), IRAK4 (NM 016123), ITK (NM 005546), JAK1 (NM 002227), JAK2 (NM 004972), JAK3 (NM 000215), KDR (NM 002253), KIS (NM 144624), KIT (NM 000222), KSR (XM 290793), KSR2 (NM 173598), LAK (NM 025144), LATS1 (NM 004690), LATS2 (NM 014572), LCK (NM 005356), LIMK1 (NM 016735), LIMK2 (NM 005569), LMR3 (XM 055866), LMTK2 (NM 014916), LOC149420 (NM 152835), LOC51086 (NM 015978), LRRK2 (XM 058513), LTK (NM 002344), LYN (NM 002350), MAK (NM 005906), MAP2K1 (NM 002755), MAP2K2 (NM 030662), MAP2K3 (NM 002756), MAP2K4 (NM 003010), MAP2K5 (NM 002757), MAP2K6 (NM 002758), MAP2K7 (NM 005043), MAP3K1 (XM 042066), MAP3K10 (NM 002446), MAP3K11 (NM 002419), MAP3K12 (NM 006301), MAP3K13 (NM 004721), MAP3K14 (NM 003954), MAP3K2 (NM 006609), MAP3K3 (NM 002401), MAP3K4 (NM 005922), MAP3K5 (NM 005923), MAP3K6 (NM 004672), MAP3K7 (NM 003188), MAP3K8 (NM 005204), MAP3K9 (NM 033141), MAP4K1 (NM 007181), MAP4K2 (NM 004579), MAP4K3 (NM 003618), MAP4K4 (NM 145686), MAP4K5 (NM 006575), MAPK1 (NM 002745), MAPK10 (NM 002753), MAPK11 (NM 002751), MAPK12 (NM 002969), MAPK13 (NM 002754), MAPK14 (NM 001315), MAPK3 (NM 002746), MAPK4 (NM 002747), MAPK6 (NM 002748), MAPK7 (NM 002749), MAPK8 (NM 002750), MAPK9 (NM 002752), MAPKAPK2 (NM 032960), MAPKAPK3 (NM 004635), MAPKAPK5 (NM 003668), MARK (NM 018650), MARK2 (NM 017490), MARK3 (NM 002376), MARK4 (NM 031417), MAST1 (NM 014975), MAST205 (NM 015112), MAST3 (XM 038150), MAST4 (XM 291141), MASTL (NM 032844), MATK (NM 139355), MELK (NM 014791), MERTK (NM 006343), MET (NM 000245), MGC33182 (NM 145203), MGC42105 (NM 153361), MGC43306 (C9orf96), MGC8407 (NM 024046), MIDORI (NM 020778), MINK (NM 015716), MKNK1 (NM 003684), MKNK2 (NM 017572), MLCK (NM 182493), MLK4 (NM 032435), MLKL (NM 152649), MOS (NM 005372), MST1R (NM 002447), MST4 (NM 016542), MUSK (NM 005592), MYLK (NM 053025), MYLK2 (NM 033118), MYO3A (NM 017433), MYO3B (NM 138995), NEK1 (NM 012224), NEK10 (NM 152534), NEK11 (NM 024800), NEK2 (NM 002497), NEK3 (NM 002498), NEK4 (NM 003157), NEK5 (MGC75495), NEK6 (NM 014397), NEK7 (NM 133494), NEK8 (NM 178170), NEK9 (NM 033116), NLK (NM 016231), NPR1 (NM 000906), NPR2 (NM 003995), NRBP (NM 013392), NRBP2 (NM 178564), NRK (NM 198465), NTRK1 (NM 002529), NTRK2 (NM 006180), NTRK3 (NM 002530), OBSCN (NM 052843), OSR1 (NM 005109), PACE-1 (NM 020423), PAK1 (NM 002576), PAK2 (NM 002577), PAK3 (NM 002578), PAK4 (NM 005884), PAK6 (NM 020168), PAK7 (NM 020341), PASK (NM 015148), PCTK1 (NM 006201), PCTK2 (NM 002595), PCTK3 (NM 212503), PDGFRA (NM 006206), PDGFRB (NM 002609), PDK1 (NM 002610), PDK2 (NM 002611), PDK3 (NM 005391), PDK4 (NM 002612), PDPK1 (NM 002613), PFTK1 (NM 012395), PHKG1 (NM 006213), PHKG2 (NM 000294), PIK3R4 (NM 014602), PIM1 (NM 002648), PIM2 (NM 006875), PIM3 (NM 001001852), PINK1 (NM 032409), PKE (NM 173575), PKMYT1 (NM 004203), pknbeta (NM 013355), PLK (NM 005030), PLK3 (NM 004073), PRKAA1 (NM 006251), PRKAA2 (NM 006252), PRKACA (NM 002730), PRKACB (NM 002731), PRKACG (NM 002732), PRKCA (NM 002737), PRKCB1 (NM 002738), PRKCD (NM 006254), PRKCE (NM 005400), PRKCG (NM 002739), PRKCH (NM 006255), PRKCI (NM 002740), PRKCL1 (NM 002741), PRKCL2 (NM 006256), PRKCM (NM 002742), PRKCN (NM 005813), PRKCQ (NM 006257), PRKCZ (NM 002744), PRKD2 (NM 016457), PRKDC (NM 006904), PRKG1 (NM 006258), PRKG2 (NM 006259), PRKR (NM 002759), PRKWNK1 (NM 018979), PRKWNK2 (NM 006648), PRKWNK3 (NM 020922), PRKWNK4 (NM 032387), PRKX (NM 005044), PRKY (NM 002760), PRPF4B (NM 003913), PSKH1 (NM 006742), PSKH2 (NM 033126), PTK2 (NM 005607), PTK2B (NM 004103), PTK6 (NM 005975), PTK7 (NM 002821), PTK9 (NM 002822), PTK9L (NM 007284), PXK (NM 017771), QSK (NM 025164), RAD53 (NM 007194), RAF1 (NM 002880), RAGE (NM 014226), RET (NM 020975), RHOK (NM 002929), RIOK1 (NM 031480), RIOK2 (NM 018343), RIPK1 (NM 003804), RIPK2 (NM 003821), RIPK3 (NM 006871), RIPK5 (NM 015375), RNASEL (NM 021133), ROCK1 (NM 005406), ROCK2 (NM 004850), ROR1 (NM 005012), ROR2 (NM 004560), ROS1 (NM 002944), RPS6KA1 (NM 002953), RPS6KA2 (NM 021135), RPS6KA3 (NM 004586), RPS6KA4 (NM 003942), RPS6KA5 (NM 004755), RPS6KA6 (NM 014496), RPS6KB1 (NM 003161), RPS6KB2 (NM 003952), RPS6KC1 (NM 012424), RPS6KL1 (NM 031464), RYK (NM 002958), SBK (XM 370948), SCYL1 (NM 020680), SCYL2 (NM 017988), SGK (NM 005627), SgK069 (SU SgK069), SgK085 (XM 373109), SgK110 (SU SgK110), SGK2 (NM 016276), SgK223 (XM 291277), SgK269 (XM 370878), SgK424 (CGP SgK424), SgK493 (SU_SgK493), SgK494 (NM 144610), SgK495 (NM 032017), SGKL (NM 013257), SK681 (NM 001001671), SLK (NM 014720), SMG1 (NM 015092), SNARK (NM 030952), SNF1 LK (NM 173354), SNF1 LK2 (NM 015191), SNK (NM 006622), SNRK (NM 017719), SRC (NM 005417), SRMS (NM 080823), SRPK1 (NM 003137), SRPK2 (NM 003138), SSTK (NM 032037), STK10 (NM 005990), STK11 (NM 000455), STK16 (NM 003691), STK17A (NM 004760), STK17B (NM 004226), STK18 (NM 014264), STK19 (NM 032454), STK22B (NM 053006), STK22C (NM 052841), STK22D (NM 032028), STK23 (NM 014370), STK24 (NM 003576), STK25 (NM 006374), STK3 (NM 006281), STK31 (NM 031414), STK32B (NM 018401), STK33 (NM 030906), STK35 (NM 080836), STK36 (NM 015690), STK38 (NM 007271), STK38L (NM 015000), STK39 (NM 013233), STK4 (NM 006282), STLK5 (NM 001003787), STYK1 (NM 018423), SUDD (NM 003831), SYK (NM 003177), TAF1 (NM 138923), TAF1L (NM 153809), TAO1 (NM 004783), TAOK1 (NM 020791), TAOK3 (NM 016281), TBCK (NM 033115), TBK1 (NM 013254), TEC (NM 003215), TEK (NM 000459), TESK1 (NM 006285), TESK2 (NM 007170), TEX14 (NM 031272), TGFBR1 (NM 004612), TGFBR2 (NM 003242), TIE (NM 005424), TIF1 (NM 003852), TLK1 (NM 012290), TLK2 (NM 006852), TNIK (NM 015028), TNK1 (NM 003985), TOPK (NM 018492), TP53RK (NM 033550), TRAD (NM 007064), TRIB1 (NM 025195), TRIB2 (NM 021643), TRIB3 (NM 021158), TRIM28 (NM 005762), TRIM33 (NM 015906), TRIO (NM 007118), TRPM6 (NM 017662), TRPM7 (NM 017672), TRRAP (NM 003496), TSSK4 (NM 174944), TTBK1 (NM 032538), TTBK2 (NM 173500), TTK (NM 003318), TTN (NM 003319), TXK (NM 003328), TYK2 (NM 003331), TYRO3 (NM 006293), ULK1 (NM 003565), ULK2 (NM 014683), ULK3 (NM 015518), ULK4 (NM 017886), VRK1 (NM 003384), VRK2 (NM 006296), VRK3 (NM 016440), WEE1 (NM 003390), Wee1B (NM 173677), YANK1 (NM 145001), YES1 (NM 005433), ZAK (NM 016653), y/o ZAP70 (NM 001079).

6. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en "toxina bacteriana, enterotoxina, exotoxina, toxina de tipo I, toxina de tipo II, toxina de tipo III, toxina de tipo IV, toxina de tipo V, toxina RTX, toxina AB, toxina A-B, toxina A/B, toxina A+B, toxina A-5B y/o toxina AB5 ".

7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en "toxina de Adenilato ciclasa, toxina de Ántrax, toxina de Ántrax (EF), toxina de Ántrax (LF), toxina Botulinum, toxina de Cólera (CT, Ctx), subunidad B de toxina de Cólera (CTB, CtxB), toxina de Difteria (DT, Dtx), toxina LT de E. coli, enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina ST de E. coli, enterotoxina estable al calor de E. coli (ST), toxina Eritrogénica, toxina Exfoliatina, Exotoxina A, enterotoxina de Perfringens, toxina de Pertussis (PT, Ptx), toxina Shiga (ST, Stx), subunidad B de toxina Shiga (STB, StxB), toxina de tipo Shiga, enterotoxinas de Staphylococcus, toxina del Tétanos (TT), toxina del Síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina Vero (VT), Toxina A (TA) y Toxina B (TB) de Clostridium difficile, Toxina Letal (LT) y Toxina Hemorrágica (HT) de Clostridium sordellii, Toxina alfa (AT) de Clostridium novyi".

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8. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el componente (I) y el componente (II) se conectan entre sí para permitir la expresión y/o secreción de una proteína de fusión codificada por ambos componentes.

9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 8, donde la proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD, dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E, dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E KD, CtxB-B-Raf, CtxB-B-Raf KD, dominio quinasa CtxB B-Raf KD, CtxB-HA1, CtxB-HA12C".

10. El microorganismo de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 1 a 9, donde el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en "sistema de secreción de tipo I, sistema de secreción de tipo II, sistema de secreción de tipo III, sistema de secreción de tipo IV, sistema de secreción de tipo V, sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de del promotor específico de hly), sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico hly), señal de transporte para la proteína de la capa S (Rsa A) de Caulobacter crescentus, señal de transporte para la proteína ToIC de Escherichia coli, señal de secreción Vtgss y/o señales de secreción derivadas de de listeriolisina, p60 y/o ActA"

y

donde el componente (III) b) se selecciona del grupo que consiste en "endolisinas, proteína lítica de bacterias gram-positivas, proteína lítica de Listeria monocytogenes, PLY551 de Listeria monocytogenes y/o holina de Listeria monocytogenes".

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11. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 10, donde el componente (III) a) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica solamente un sistema de transporte, que permite la expresión concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II), donde semejante componente (III) a) es preferiblemente al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly) o el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico de hly).

12. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde de acuerdo con el componente (III) a) los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) son secretados.

13. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde

el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en B-Raf V600E, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, antígeno específico de próstata (PSA), hemaglutinina HA1 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1);

el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en la "subunidad B de toxina del Cólera (CTB, CtxB), subunidad B de enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina del tétanos (TT)";

el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en la "señal de transporte de hemolisina HlyA de Escherichia coli junto con componentes del sistema de secreción de Hly (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly)";

el componente (IV) se selecciona del grupo que consiste en "el promotor endógeno del locus hly de E. coli";

donde el componente (I) y el componente (II) se conectan entre sí para permitir la expresión de una proteína de fusión codificada por ambos componentes y donde la proteína de fusión es secretada.

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14. Una composición farmacéutica que comprende al menos un microorganismo, preferiblemente al menos un microorganismo liofilizado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cápsulas.

15. Un medicamento que comprende al menos un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14.

16. El uso de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de estados fisiológicos y/o patofisiológicos seleccionados del grupo que consiste en "división celular incontrolada, tumores malignos, tumores benignos, tumores sólidos, sarcomas, carcinomas, trastornos hiperproliferativos, carcinoides, sarcomas de Ewing, sarcomas de Kaposi, tumores cerebrales, tumores que se originan en el cerebro y/o el sistema nervioso y/o las meninges, gliomas, neuroblastomas, cáncer de estómago, cáncer de riñón, carcinomas de células renales, cáncer de próstata, carcinomas de próstata, tumores de tejido conectivo, sarcomas de tejidos blandos, tumores de páncreas, tumores de hígado, tumores de cabeza, tumores de cuello, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, osteosarcomas, retinoblastomas, timoma, cáncer testicular, cáncer de pulmón, carcinomas bronquiales, cáncer de mama, carcinomas de mama, cáncer intestinal, tumores colorrectales, carcinomas de colon, carcinomas de recto, tumores ginecológicos, tumores de ovario/tumores ováricos, cáncer uterino, cáncer cervical, carcinomas de cérvix, cáncer del cuerpo del útero, carcinomas del corpus, carcinomas endometriales, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer de piel, basaliomas, espinaliomas, melanomas, melanomas intraoculares, leucemia, leucemia crónica, leucemia aguda, linfomas, infección, infección viral o bacteriana, influenza, inflamación crónica, rechazo de órganos y/o enfermedades autoinmunitarias".

17. Un plásmido o vector de expresión que comprende los componentes (I) a (IV) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. Un procedimiento para la producción de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde se produce un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 17, y se transforma un microorganismo con este plásmido o vector de expresión.

19. Un kit farmacéutico que comprende al menos un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 o un medicamento de acuerdo con la reivindicación 15 y un tampón farmacológicamente aceptable, preferiblemente un tampón carbonato.